專利名稱：纈沙坦或其代謝物用于抑制血小板凝集的用途的制作方法
背景技術(shù)：
纈沙坦可選擇性地阻斷血管緊張素II與AT1受體的結(jié)合，引起血管擴(kuò)張，并減少醛固酮分泌。最近的臨床研究表明纈沙坦在急性血管事件后的患者群體中具有額外的益處。由于血小板活化在冠狀血管和腦血管閉塞中起關(guān)鍵作用，并且AT1受體存在于血小板表面，因此評(píng)價(jià)了纈沙坦及其主要肝代謝物4-羥基戊?；i沙坦在具有罹患血管疾病的多重危險(xiǎn)因素的個(gè)體中對(duì)血小板的體外作用。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明以下附圖描述了本發(fā)明的某些實(shí)施方案。它們僅用于闡述本發(fā)明，但不限制在此所公開(kāi)的發(fā)明。
附

圖1A-C為基線時(shí)(A)、用100μM纈沙坦溫育后(B)以及用1μM4-羥基戊?；i沙坦溫育后(C)所研究患者的實(shí)際掃描的血小板凝集曲線。高濃度的纈沙坦顯著抑制ADP-誘導(dǎo)的凝集(B)，對(duì)腎上腺素-誘導(dǎo)的凝集沒(méi)有影響，而其代謝物則在治療濃度范圍內(nèi)阻斷腎上腺素-誘導(dǎo)的凝集(C)。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明涉及抑制血小板凝集的方法，該方法包括向有需要的患者施用治療有效量的血管緊張素II受體阻斷劑(“ARB”)，優(yōu)選纈沙坦或其可藥用鹽，任選存在可藥用載體。
在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抑制血小板凝集的方法，該方法包括向有需要的患者施用治療有效量的ARB代謝物，尤其是纈沙坦的代謝物4-羥基戊酰基纈沙坦，任選存在可藥用載體。
另一方面，本發(fā)明提供了治療與血小板凝集相關(guān)的病癥的方法，該方法包括向有需要的患者施用ARB或ARB代謝物。與血小板凝集相關(guān)的病癥包括急性心肌梗死、缺血性卒中、心絞痛、急性冠狀動(dòng)脈綜合征、TIA(短暫性腦缺血發(fā)作或急性腦血管綜合征)、心力衰竭、缺血性胸痛、X綜合征、血栓栓塞、肺動(dòng)脈高壓、糖尿病、外周血管疾病、深靜脈血栓形成、任何血管的動(dòng)脈血栓形成、導(dǎo)管血栓性閉塞或再閉塞。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及包含ARB或ARB代謝物以及可藥用載體的藥物組合物。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述AT1-受體拮抗劑(又稱為血管緊張素II受體拮抗劑)是指那些能夠與血管緊張素II受體的AT1-受體亞型結(jié)合但不導(dǎo)致受體活化的活性成分。作為其抑制AT1-受體的結(jié)果，這些拮抗劑可例如用于預(yù)防血小板凝集和治療與此相關(guān)的病癥。
AT1-受體拮抗劑類包括具有不同結(jié)構(gòu)特征的化合物，特別優(yōu)選的是非肽類化合物。本發(fā)明范圍內(nèi)的ARB包括纈沙坦，其為式(I)的AT1-受體拮抗劑，即(S)-N-(1-羧基-2-甲基-丙-1-基)-N-戊?；?N-[2’-(1H-四唑-5-基)聯(lián)苯-4-基-甲基]胺， 其在EP 0443983 A和美國(guó)專利5,399,578中公開(kāi)，在此將其公開(kāi)的內(nèi)容全文引入作為參考，就如同在此列出一樣。其它的ARB化合物包括但不限于氯沙坦、坎地沙坦、依普沙坦、依貝沙坦、沙普立沙坦、他索沙坦、替米沙坦、奧美沙坦、佐拉沙坦(1-[[3-溴-2-[2-(1H-四唑-5-基)苯基]-5-苯并呋喃基]甲基]-2-丁基-4-氯-1H-咪唑-5-甲酸和3-(3-溴-2-[2-(1H-四唑-5-基)-苯基]-苯并呋喃-5-基甲基)-2-丁基-5-氯-3H-咪唑-4-甲酸)、又稱為L(zhǎng)R-B/081的2-[[4-丁基-2-甲基-6-氧代-5-[[2′-(1H-四唑-5-基)[1，1′-聯(lián)苯]-4-基]甲基]-1(6H)-嘧啶基]甲基]-3-噻吩甲酸甲酯，以及又稱為3k，LR-B/081的在3位上引入了(羧基雜芳基)甲基部分的2-[[4-丁基-2-甲基-6-氧代-5-[[2′-(1H-四唑-5-基)[1，1′-聯(lián)苯]-4-基]甲基]-1-(6H)-嘧啶基]甲基]-3-噻吩甲酸甲酯(Lusofarmaco)、Biol Pharm Bull 2000年2月；23(2)174-81中公開(kāi)的又稱為YM 358的2，7-二乙基-5-[[2′-(1H-四唑-5-基)聯(lián)苯-4-基]甲基]-5H-吡唑并[1，5-b][1，2，4]-三唑鉀鹽(Yamanouchi)、Thromb Res 2002年3月15日；105(6)531-6中公開(kāi)的L-158，809、J Cardiovasc Pharmacol 1995年1月；25(1)22-9中公開(kāi)的KT3 671、J Cardiovasc Pharmacol 1998年4月；31(4)568-75中公開(kāi)的TA 606、Fundam Clin Pharmacol 1997；11(5)395-401中公開(kāi)的TH 142177、Br J Pharmacol 1997年2月；120(3)488-94中公開(kāi)的UP 269-6、名稱為E-1477的下式化合物 名稱為SC-52458的下式化合物
以及名稱為化合物ZD-8731的下式化合物 或其各自的可藥用鹽。
另外，已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)ARB代謝物也顯著減少血小板凝集。ARB代謝物包括氯沙坦代謝物，即J Pharmacol Exp Ther 1990年10月；255(1)211-7中公開(kāi)的又稱為EXP-3174的2-正丁基-4-氯-1-[(2′-(1H-四唑-5-基)-聯(lián)苯-4-基)甲基]咪唑-5-甲酸鹽酸鹽以及J Chromatogr 1992年1月17日；573(2)295-301中公開(kāi)的代謝物EXP-3174(II)；依貝沙坦代謝物，即(1)依貝沙坦的四唑N2-β-葡糖苷酸綴合物，(2)丁基側(cè)鏈ω-1氧化產(chǎn)生的單羥基化代謝物，(3，4)螺環(huán)戊烷(spirocylcopentane)環(huán)氧化產(chǎn)生的兩種不同的單羥基化代謝物，(5)丁基側(cè)鏈ω-1氧化和螺環(huán)戊烷環(huán)氧化產(chǎn)生的二醇，(6)ω-1單羥基化代謝物進(jìn)一步氧化產(chǎn)生的酮代謝物，(7)二醇的ω-1羥基進(jìn)一步氧化產(chǎn)生的酮-醇，和(8)Drug Metab Dispos 1998年5月；26(5)408-17中公開(kāi)的丁基側(cè)鏈的末端甲基氧化產(chǎn)生的羧酸代謝物；坎地沙坦西酯代謝物，即坎地沙坦(2-乙氧基-1-[[2′-(1H-四唑-5-基)聯(lián)苯-4-基]甲基]-1H-苯并咪唑-7-甲酸)，又稱為CV 11974和CV-15959，在ClinPharmacokinet 2002；41(1)7-17、J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1999年8月20日；731(2)411-7和J Hum Hypertens 1997年9月；11增刊2S19-25中公開(kāi)；替米沙坦代謝物，即Drug Metab Dispos 1999年10月；27(10)1143-9中公開(kāi)的替米沙坦1-O-?；咸擒账幔粖W美沙坦酯(olmesartan medoxomil)代謝物，即奧美沙坦或CS866，在JHypertens Suppl 2001年6月；19增刊1S21-32中公開(kāi)；依普沙坦代謝物，即Pharmacotherapy 1999年4月；19(4 Pt 2)73S-78S中公開(kāi)的葡糖苷酸；他索沙坦代謝物，即J Pharmacol Exp Ther 2000年11月；295(2)649-54中公開(kāi)的烯醇他索沙坦以及J.Med.Chem.1998年10月22日，41(22)，4251-60中公開(kāi)的五種其它代謝物；佐拉沙坦代謝物，即J Pharm Biomed Anal 1994年9月；12(9)1181-7和JPharm Biomed Anal 1994年9月；12(9)1181-7中公開(kāi)的葡糖苷酸綴合物及五種相關(guān)的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，三種在脂族側(cè)鏈上羥基化、一種進(jìn)一步氧化為酮、一種在苯環(huán)上羥基化；ZD-8731代謝物；5-[(3，5-二丁基-1H-1，2，4-三唑-1-基)甲基]-2-[2-(1H-四唑-5-基苯基)]吡啶代謝物，又稱為SC-52458，在J Cardiovasc Pharmacol 1993年10月；22(4)617-25中公開(kāi)；以及以下ARB的代謝物ZD-8731(Zeneca)、又稱為L(zhǎng)R-B/081的2-[[4-丁基-2-甲基-6-氧代-5-[[2′-(1H-四唑-5-基)[1，1′-聯(lián)苯]-4-基]甲基]-1(6H)-嘧啶基]甲基]-3-噻吩甲酸甲酯和又稱為3k，LR-B/081的在3位引入了(羧基雜芳基)甲基部分的2-[[4-丁基-2-甲基-6-氧代-5-[[2′-(1H-四唑-5-基)[1，1′-聯(lián)苯]-4-基]甲基]-1-(6H)-嘧啶基]甲基]-3-噻吩甲酸甲酯(Lusofarmaco)、BiolPharm Bull 2000年2月；23(2)174-81中公開(kāi)的又稱為YM 358的2，7-二乙基-5-[[2′-(1H-四唑-5-基)聯(lián)苯-4-基]甲基]-5H-吡唑并[1，5-b][1，2，4]-三唑鉀鹽(Yamanouchi)、Thromb Res 2002年3月15日；105(6)531-6中公開(kāi)的L-158，809、J Cardiovasc Pharmacol 1995年1月；25(1)22-9中公開(kāi)的KT3671、J Cardiovasc Pharmacol 1998年4月；31(4)568-75中公開(kāi)的TA 606、Fundam Clin Pharmacol 1997；11(5)395-401中公開(kāi)的TH 142177以及BrJ Pharmacol 1997年2月；120(3)488-94中公開(kāi)的UP 269-6。
優(yōu)選纈沙坦代謝物，即具有下式結(jié)構(gòu)的4-羥基戊?；i沙坦 其在Waldmeier F.等人，Xenobiotica，1997，27卷，第1期，59-71中公開(kāi)，在此將其全文引入作為參考，就如同在此完整列出一樣。
在此將ARB及其代謝物稱為“本發(fā)明的化合物”。根據(jù)取代基的性質(zhì)，本發(fā)明的化合物可以含有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱中心。形成的非對(duì)映異構(gòu)體、對(duì)映體和幾何異構(gòu)體均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
根據(jù)所選擇的起始原料和方法，所述化合物可以是可能的異構(gòu)體之一或其混合物形式，例如為基本上純的幾何(順式或反式)異構(gòu)體、旋光異構(gòu)體(對(duì)映體)、外消旋物或它們的混合物。上述可能的異構(gòu)體或其混合物均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
根據(jù)各組分的物理化學(xué)性質(zhì)差異，可將得到的任何異構(gòu)體混合物拆分成純的幾何或旋光異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體、外消旋物，例如通過(guò)色譜法和/或分級(jí)結(jié)晶進(jìn)行拆分。
可將得到的任何終產(chǎn)物或中間體外消旋物通過(guò)已知方法拆分成旋光對(duì)映體，例如通過(guò)分離用光學(xué)活性的酸或堿獲得的其非對(duì)映體鹽，并釋放出光學(xué)活性的酸或堿化合物。因此可將羧酸中間體拆分成其旋光對(duì)映體，例如通過(guò)分級(jí)結(jié)晶D-或L-(α-甲基芐胺、辛可尼定、辛可寧、奎寧、奎尼定、麻黃堿、脫氫樅胺、番木鱉堿或士的寧)-鹽進(jìn)行拆分。外消旋產(chǎn)物還可以通過(guò)手性色譜、例如使用手性吸附劑的高壓液相色譜進(jìn)行拆分。
最后，本發(fā)明的化合物可以以游離形式或者如果存在成鹽基團(tuán)以其鹽形式被獲得。
可以將本發(fā)明的酸性化合物用可藥用堿例如堿金屬氫氧化物水溶液轉(zhuǎn)變成鹽，有利的是存在醚或醇溶劑，如低級(jí)鏈烷醇。可以用醚例如乙醚由后者的溶液中沉淀出所述鹽。通過(guò)用酸處理可將得到的鹽轉(zhuǎn)變成游離化合物。這些或其它的鹽也可用于純化所獲得的化合物。
可以將具有堿性基團(tuán)的本發(fā)明的化合物轉(zhuǎn)變成酸加成鹽，尤其是可藥用鹽。所述的鹽可以例如用以下的酸形成無(wú)機(jī)酸，如礦物酸，例如硫酸、磷酸或氫鹵酸；或有機(jī)羧酸，如未取代或被鹵素取代的(C1-C4)-鏈烷羧酸，例如乙酸，如飽和或不飽和的二元羧酸，例如草酸、琥珀酸、馬來(lái)酸或富馬酸，如羥基-羧酸，例如乙醇酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸或檸檬酸，如氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；或有機(jī)磺酸，如(C1-C4)-烷基-磺酸(例如甲磺酸)或未取代或取代(例如被鹵素取代)的芳基磺酸。優(yōu)選與鹽酸、甲磺酸和馬來(lái)酸形成的鹽。
鑒于游離化合物和其鹽形式的化合物之間的密切關(guān)系，因此無(wú)論何時(shí)在本文中提及某化合物，也意指其相應(yīng)的鹽，條件是在這種情況下所述的鹽是可能的或適合的。
包括其鹽在內(nèi)的所述化合物也可以以其水合物形式被獲得，或包含其結(jié)晶所用的其它溶劑。
本發(fā)明的另一方面包括包含治療有效量的本發(fā)明的化合物以及可藥用載體的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)本身已知的方法制備，并且適于經(jīng)腸如口服或直腸以及經(jīng)胃腸外施用于包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物(溫血?jiǎng)游?，其包含單獨(dú)的或與一種或多種可藥用載體、尤其是適于經(jīng)腸或經(jīng)胃腸外應(yīng)用的可藥用載體組合的治療有效量的藥理學(xué)活性化合物。典型的口服制劑包括片劑、膠囊劑、糖漿劑、酏劑和混懸劑。典型的注射用制劑包括溶液劑和混懸劑。所述藥物組合物可用于治療由血小板凝集介導(dǎo)的病癥，特別是急性心肌梗死、缺血性卒中、心絞痛、急性冠狀動(dòng)脈綜合征、TIA(短暫性腦缺血發(fā)作或急性腦血管綜合征)、心力衰竭、缺血性胸痛、X綜合征、血栓栓塞、肺動(dòng)脈高壓、糖尿病、外周血管疾病、深靜脈血栓形成、任何血管的動(dòng)脈血栓形成、導(dǎo)管血栓性閉塞或再閉塞。
可用于上述制劑的典型的可藥用載體可舉例如下糖如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；淀粉如玉米淀粉、木薯淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；磷酸鈣如磷酸二鈣和磷酸三鈣；硫酸鈉；硫酸鈣；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯醇；硬脂酸；堿土金屬的硬脂酸鹽如硬脂酸鎂和硬脂酸鈣；硬脂酸；植物油如花生油、棉子油、芝麻油、橄欖油和玉米油；非離子、陽(yáng)離子和陰離子表面活性劑；乙二醇聚合物；β-環(huán)糊精；脂肪醇；和水解的谷類固體(hydrolyzed cerealsolid)，以及其它無(wú)毒的相容性填充劑、粘合劑、崩解劑、緩沖劑、防腐劑、抗氧劑、潤(rùn)滑劑、矯味劑等常用于藥物制劑的物質(zhì)。
這些藥物制劑可經(jīng)腸如口服和直腸或經(jīng)胃腸外施用于溫血?jiǎng)游?，所述制劑包含單?dú)的或與常規(guī)的藥用輔料一起的藥理學(xué)活性化合物。例如，藥物制劑包含約0.1％至90％、優(yōu)選約1％至約80％的活性化合物。經(jīng)腸或經(jīng)胃腸外施用的藥物制劑可以是例如單位劑量形式，如包衣片劑、片劑、膠囊劑或栓劑以及安瓿劑。這些制劑可通過(guò)本身已知的方法制備，例如用常規(guī)的混合、制粒、包衣、溶解或凍干方法制備。因此，用于口服使用的藥物制劑可通過(guò)以下方法獲得將活性化合物與固體賦形劑混合，如果需要將所獲得的混合物制粒，并且如果需要或必要，加入適宜的輔料后將混合物或顆粒加工成片劑或包衣片芯。
ARB、尤其是纈沙坦以及ARB代謝物、尤其是4-羥基戊?；i沙坦可以與其它治療劑組合使用，例如各自以本領(lǐng)域報(bào)道的有效治療劑量組合使用。所述的治療劑包括肝素、華法林、t-PA、尿激酶、鏈激酶、阿司匹林、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔單抗、表非替得和替羅非班、抗高血壓藥和抗糖尿病藥。
活性化合物的劑量取決于多種因素，如施用方式、溫血?jiǎng)游锏姆N類、年齡和/或個(gè)體狀況。
本發(fā)明的活性成分的優(yōu)選劑量為治療有效劑量，尤其是纈沙坦的市售可得的劑量。
通常，當(dāng)口服施用本發(fā)明的化合物時(shí)，據(jù)估計(jì)，例如用于重約75kg的患者的大約日劑量為約0.1mg至約360mg。
纈沙坦可以以適宜的劑量單位形式、例如膠囊劑或片劑提供給患者，所述的劑量單位形式包含可施用于患者的治療有效量例如約20至約320mg的纈沙坦?；钚猿煞值氖┯每梢悦刻觳怀^(guò)三次，例如以20mg或40mg纈沙坦的日劑量開(kāi)始，增加至每天80mg，并進(jìn)一步增加至每天160mg直至每天320mg。優(yōu)選將纈沙坦分別以80mg或160mg的劑量每天一次或每天兩次施用于患者。相應(yīng)的劑量可以例如在早晨、中午或晚上施用。
對(duì)于4-羥基戊酰基纈沙坦，優(yōu)選的劑量單位形式是例如片劑或膠囊劑，其包含例如用于約50至70kg的哺乳動(dòng)物的約1mg至約1000mg、優(yōu)選約5mg至約500mg、甚至更優(yōu)選約20mg至約320mg的所述化合物，每天施用一次。
以上的劑量均包含治療有效量的本發(fā)明的活性成分。
已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)ARB、尤其是纈沙坦以及ARB代謝物、尤其是4-羥基戊酰基纈沙坦均對(duì)人血小板顯示出顯著的體外抑制作用。
本發(fā)明的化合物可抑制血小板凝集，因此可用于治療由血小板凝集介導(dǎo)的病癥，特別是急性心肌梗死、缺血性卒中、心絞痛、急性冠狀動(dòng)脈綜合征、TIA(短暫性腦缺血發(fā)作或急性腦血管綜合征)、心力衰竭、缺血性胸痛、X綜合征、血栓栓塞、肺動(dòng)脈高壓、糖尿病、外周血管疾病、深靜脈血栓形成、任何血管的動(dòng)脈血栓形成、導(dǎo)管血栓性閉塞或再閉塞。
此外，本發(fā)明還涉及用于預(yù)防、延緩發(fā)展或治療由血小板凝集介導(dǎo)的疾病或病癥的本發(fā)明的化合物，所述的病癥或病癥特別是急性心肌梗死、缺血性卒中、心絞痛、急性冠狀動(dòng)脈綜合征、TIA(短暫性腦缺血發(fā)作或急性腦血管綜合征)、心力衰竭、缺血性胸痛、X綜合征、血栓栓塞、肺動(dòng)脈高壓、糖尿病、外周血管疾病、深靜脈血栓形成、任何血管的動(dòng)脈血栓形成、導(dǎo)管血栓性閉塞或再閉塞。
此外，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的化合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于預(yù)防、延緩發(fā)展或治療由血小板凝集介導(dǎo)的疾病和病癥，特別是急性心肌梗死、缺血性卒中、心絞痛、急性冠狀動(dòng)脈綜合征、TIA(短暫性腦缺血發(fā)作或急性腦血管綜合征)、心力衰竭、缺血性胸痛、X綜合征、血栓栓塞、肺動(dòng)脈高壓、糖尿病、外周血管疾病、深靜脈血栓形成、任何血管的動(dòng)脈血栓形成、導(dǎo)管血栓性閉塞或再閉塞。
上述性質(zhì)已通過(guò)以下方法得到證實(shí)由20名具有已知的血管危險(xiǎn)因素的志愿者獲得用于血小板凝集、流式細(xì)胞儀研究以及盒式(cartridge-based)血小板測(cè)定分析儀的血液樣品。如果研究參加者具有出血素質(zhì)史、中風(fēng)史、在過(guò)去六個(gè)月內(nèi)有大的手術(shù)或顯著創(chuàng)傷以及超過(guò)200/110mm的高血壓，則將其剔除。他們當(dāng)中任何人均未接受阿司匹林或任何其它抗血小板藥。所有受試者均在休息至少30分鐘并禁食2小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間后進(jìn)行血液采樣。為了避免任何日間活動(dòng)影響，在8至10a.m.之間采集血液，并且在棄去前1.5ml自由流動(dòng)的血液后，用含有3.8％檸檬酸鈉(體積比1∶9)的21號(hào)蝴蝶針由肘前靜脈采集血液。用11支Vacutainer管(4.5ml)由每名研究參加者身上采集共計(jì)49ml全血-檸檬酸鹽混合物。將一支管作為內(nèi)部對(duì)照并用緩沖液進(jìn)行溫育。五支管用纈沙坦在37℃下溫育60分鐘，以達(dá)到10nM、100nM、1μM、10μM和100μM的化合物終濃度。剩余的五支管類似地用遞增量的4-羥基戊酰基纈沙坦進(jìn)行溫育，以達(dá)到10nM、100nM、1μM、10μM和100μM的濃度。纈沙坦和4-羥基戊?；i沙坦的濃度處于低于治療血漿水平至顯著高于治療血漿水平的范圍內(nèi)，所述的治療血漿水平通過(guò)對(duì)進(jìn)行纈沙坦治療的患者觀察得到。攝入160mg纈沙坦后，其峰值血漿濃度可高達(dá)7.5μM，而血漿中的4-羥基戊?；i沙坦僅為纈沙坦?jié)舛鹊?0％。在進(jìn)行血小板研究的當(dāng)天早晨臨時(shí)配制新鮮的纈沙坦和4-羥基戊?；i沙坦溶液。為了避免可能的觀察者偏倚，將血液樣品編號(hào)并使用盲法。采樣操作和血小板研究均由不知曉研究方案的人員進(jìn)行。
血小板凝集A.富血小板血漿將檸檬酸鹽和全血混合物在1200g下離心5分鐘，以獲得富血小板血漿(PRP)，將其保存在室溫下以便在1小時(shí)內(nèi)使用。用庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器ZM(Coulter公司，Hialeah，F(xiàn)L)對(duì)每個(gè)PRP樣品進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)。用同源的貧血小板血漿將血小板數(shù)調(diào)整至3.50×108/ml。用5μM ADP和5μM腎上腺素誘導(dǎo)血小板凝集(PA)。所有激動(dòng)劑均得自Chronolog公司(Havertown，PA)。用4道Chronolog發(fā)光凝集計(jì)(Lumi-Aggregometer，型號(hào)560-Ca)進(jìn)行凝集研究。凝集以記錄時(shí)間結(jié)束時(shí)偏離基線的透光率變化最大百分?jǐn)?shù)(％max)表示，用貧血小板血漿作為參比。對(duì)凝集曲線記錄6分鐘，并根據(jù)國(guó)際上制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析，參見(jiàn)Ruggeri ZM，Semin Hemat1994；31229-239。
B.全血該方法在Abbate R等人，Amer J Clin Pathol 1986；8691-96中有詳細(xì)描述。簡(jiǎn)言之，將全血-檸檬酸鹽混合物用0.5ml TBS按1∶1的比例稀釋，然后溫和地進(jìn)行渦旋振蕩。將帶有攪拌棒的比色杯放置在溫育孔中，并將其加溫至37℃達(dá)5分鐘。然后，將樣品轉(zhuǎn)移至測(cè)定孔中。電極放置在樣品比色杯中。用1μg/ml膠原蛋白刺激血小板凝集。血小板凝集研究用使用Aggrolink″軟件的Chrono-Log全血凝集計(jì)進(jìn)行。血小板凝集性以電阻抗變化表示，并以歐姆給出。
全血流式細(xì)胞術(shù)通過(guò)使用以下單克隆抗體測(cè)定血小板受體的表達(dá)CD31(血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘著分子(PECAM-1))、CD41(糖蛋白[GP]IIb/IIIa，(IIb(3))、CD42b(GP Ib)、CD51/CD61((v(3，或玻連蛋白受體)、CD62p(P-選擇蛋白)、CD107a(與溶酶體相關(guān)的膜蛋白-1；LAMP-1)、CD107b(LAMP-2)、CD151(血小板/內(nèi)皮tetraspan抗原-3；PETA-3)，以及針對(duì)纖維蛋白原-血小板的PAC-1(PharMingen，San Diego，CA)。血小板-白細(xì)胞的相互作用通過(guò)使用針對(duì)泛血小板標(biāo)記物的雙重抗體(CD151)以及CD14、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行評(píng)估。將血-檸檬酸鹽混合物(50μl)用450μl Tris緩沖的鹽水(TBS)(10mmol/L Tris，0.15mol/L氯化鈉)進(jìn)行稀釋，并通過(guò)溫和地顛倒Eppendorf管2次進(jìn)行混合。然后，向每個(gè)溶液中加入5μl相應(yīng)抗體，并將樣品溫育30分鐘。溫育后，加入400μl 2％的緩沖的低聚甲醛進(jìn)行固定。如Gurbel PA等人，J Am Coll Cardiol.1998；311466-1473中所述，用設(shè)定用于測(cè)定熒光燈散射的Becton Dickinson FACScan流式細(xì)胞儀分析樣品。將數(shù)據(jù)集中在列表式文件中并加以分析。如Gurbel PA等人，AmHeart J 2000；139320-328中所述，P-選擇蛋白以陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)表示。其它抗原以平均熒光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)值表示。
盒式血小板分析儀血小板功能分析儀(PFA-100′，Dade Behring，Deerfield，IL)是一種在流動(dòng)狀態(tài)下模擬小血管損傷后初步止血的變化的裝置，參見(jiàn)Kundu SK等人，Semin Thromb Hemost 1995；21(增刊2)106-112。對(duì)傷口閉合所需時(shí)間進(jìn)行數(shù)字式記錄作為切應(yīng)力誘導(dǎo)的血小板凝集的量度。閉合時(shí)間測(cè)定一式兩份地進(jìn)行。
使用帶有凍干人纖維蛋白原包衣微粒的聚苯乙烯珠包衣的小盒(cartridge)進(jìn)行快速血小板功能分析盒式試驗(yàn)(RPFA-ASA，Ultegra(r)Accumetrics公司，San Diego，CA，USA)，并用棓酸丙酯作為激動(dòng)劑。將全血-檸檬酸鹽混合物加入小盒中，記錄血小板和包衣珠之間的凝集。數(shù)據(jù)反映出血小板凝集的濁度并反映出血小板前列腺素阻斷的程度。參見(jiàn)SmithJW等人，Circulation 1999；99620-625。Ultegra(r)測(cè)定一式兩份地進(jìn)行。在對(duì)任何一名受試者的樣品進(jìn)行測(cè)定前，每天對(duì)所用的每臺(tái)設(shè)備進(jìn)行電子質(zhì)量控制檢驗(yàn)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有比較均用t-檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算，以確定基線和纈沙坦/4-羥基戊?；i沙坦溫育后的血小板凝集、Ultegra(r)結(jié)果、Dade-PFA 100(tm)和受體表達(dá)的具體差異。使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析非參數(shù)性數(shù)據(jù)。正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均值±SE表示，偏斜數(shù)據(jù)則用中位數(shù)(范圍)表示。概率值p＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性。通過(guò)使用用于進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的SPSS 9.0版程序(SPSS公司Chicago，Illinois)，對(duì)所有研究參加者的正態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析。
富血小板血漿中的血小板凝集用遞增劑量的纈沙坦預(yù)溫育僅在超過(guò)高于水平的濃度100μM下產(chǎn)生對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板凝集的抑制作用，但不影響腎上腺素誘導(dǎo)的血小板凝集。相反，用4-羥基戊?；i沙坦溫育則在1μM和10μM的濃度下抑制腎上腺素誘導(dǎo)的凝集，但對(duì)ADP誘導(dǎo)的凝集沒(méi)有任何影響。5μM ADP和5μM腎上腺素刺激的凝集的代表性數(shù)據(jù)如表1所示。
表1.PRP血小板凝集
5μM ADP誘導(dǎo)的富血小板血漿凝集(％)
5μM腎上腺素誘導(dǎo)的富血小板血漿凝集(％)
全血中的血小板凝集纈沙坦和4-羥基戊?；i沙坦在治療活性范圍內(nèi)抑制全血中1μM膠原蛋白誘導(dǎo)的人血小板凝集。對(duì)于兩個(gè)化合物均觀察到劑量依賴性作用，但用4-羥基戊酰基纈沙坦進(jìn)行預(yù)溫育導(dǎo)致血小板凝集性顯著降低。膠原蛋白誘導(dǎo)的血小板凝集的結(jié)果如表2所示。
表2.全血血小板凝集
1mg/ml膠原蛋白誘導(dǎo)的全血阻抗血小板凝集(歐姆)
盒式血小板功能分析儀(PFA-100TM和Ultegra)觀察到隨著血小板凝集單位(Ultegra)的減少，閉合時(shí)間(PFA)發(fā)生恒定的劑量依賴性延遲，顯示了高切應(yīng)力條件下的血小板抑制作用。與全血凝集和腎上腺素誘導(dǎo)的凝集類似，4-羥基戊酰基纈沙坦較纈沙坦具有更強(qiáng)的抗血小板性質(zhì)。表3給出了用盒式分析儀進(jìn)行的代表性實(shí)驗(yàn)。
表3.盒式分析儀
用腎上腺素/膠原蛋白盒*的PFA-100TM閉合時(shí)間(秒)
Ultegra(血小板活化單位)分析儀
全血流式細(xì)胞術(shù)用纈沙坦和4-羥基戊?；i沙坦溫育輕微地降低GP IIb/IIIa(CD 41)和纖維蛋白原結(jié)合物(fibrinogen bingding，PAC-1)的表達(dá)，并且4-羥基戊?；i沙坦在治療濃度下即可達(dá)到該效果，而纈沙坦只有在高劑量下才降低CD41的表達(dá)。兩種物質(zhì)均顯著減少血小板表面的P-選擇蛋白濃度，并適度降低玻連蛋白受體的表達(dá)，但在纈沙坦和4-羥基戊?；i沙坦之間該效果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。用纈沙坦和4-羥基戊?；i沙坦溫育對(duì)PECAM-1(CD31)、GP Ib(CD42)和LAMP-2(CD107b)、PETA-3(CD151)以及血小板-白細(xì)胞微粒(CD151+14)沒(méi)有任何影響。流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果如表4所示。
表4.纈沙坦和4-羥基戊?；i沙坦對(duì)主要血小板受體表達(dá)的影響
血小板/內(nèi)皮細(xì)胞粘著分子-1(PECAM-1，CD31，logMFI)的表達(dá)
血小板糖蛋白IIb/IIIa抗原(GPIIb，CD41，logMFI)的表達(dá)
糖蛋白Ib(GPIb，CD42b，logMFI)的表達(dá)
血小板玻連蛋白受體(CD51/CD61，logMFI)的表達(dá)
表17B
實(shí)施例18在實(shí)施例18中，制備2.0mg鹽酸納曲酮和10.0mg氫可酮的組合物，它具有下表18A所列的組成表18A
*在最終產(chǎn)物中不存在。
方法1.制粒將鹽酸納曲酮、重酒石酸氫可酮和povidone K30溶解/分散在水中。將所述溶液/分散液加入微晶纖維素中，同時(shí)在室溫下在高剪切制粒機(jī)(Colette)中混合；2.干燥在進(jìn)口溫度為50-75℃的流化床干燥器(Glatt)中將所述顆粒干燥至在室溫下水分大致平衡；3.研磨使用篩分研磨機(jī)(CoMil)將顆粒研磨；4.壓制使用單沖壓片機(jī)(Manesty F3)壓制所述研磨的顆粒。
糖蛋白IIb/IIIa(纖維蛋白原結(jié)合物，PAC-1，logMFI)的活性
以下實(shí)施例用于舉例說(shuō)明上述發(fā)明；然而，這些實(shí)施例并不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1合成纈沙坦代謝物的方法(S)-2-{(4-羥基-戊?；?-[2′-(1H-四唑-5-基)-聯(lián)苯-4-基甲基]氨基}-3-甲基-丁酸
將6.7g(S)-3-甲基-2-{(4-氧代-戊?；?-[2′-(1H-四唑-5-基)-聯(lián)苯-4-基甲基]-氨基}-丁酸溶解在60ml甲醇中并冷卻至0℃。分小份加入2.25g硼氫化鈉以保持?jǐn)嚢柘碌姆磻?yīng)混合物溫度低于27℃(猛烈起泡)。將混合物在室溫下攪拌1小時(shí)、真空濃縮、溶于二氯甲烷并用2N鹽酸水溶液萃取兩次。將有機(jī)相干燥、真空濃縮，通過(guò)色譜分離(快速色譜柱，240g硅膠60，KG40-62微米，使用二氯甲烷、甲醇、濃氨水(30∶10∶1 v/v)的混合溶劑)得到產(chǎn)物。將含有產(chǎn)物的級(jí)分濃縮、溶于二氯甲烷、用2N鹽酸水溶液萃取并用硫酸鈉干燥。濃縮后將殘余物真空干燥(60℃)3天，得到(S)-2-{(4-羥基-戊?；?-[2′-(1H-四唑-5-基)-聯(lián)苯-4-基甲基]氨基}-3-甲基-丁酸，為白色泡沫([α]D20＝-58°(c＝1，甲醇)。TLC-Rf0.18(甲苯/乙酸乙酯/二氯甲烷/甲酸16∶40∶40∶4))。
起始原料(S)-3-甲基-2-{(4-氧代-戊酰基)-[2′-(1H-四唑-5-基)-聯(lián)苯-4-基甲基]-氨基}-丁酸可如下制備(S)-2-{(2′-氰基-聯(lián)苯-4-基甲基)-[3-(2-甲基-[1，3]二氧戊環(huán)-2-基)-丙?；鵠-氨基}-3-甲基-丁酸芐酯 將13.8g(S)-2-[(2′-氰基-聯(lián)苯4-基甲基)-氨基]-3-甲基-丁酸芐酯鹽酸鹽(在EP 443983中有描述)溶解在50ml二氯甲烷中，冷卻至0℃，并用23.8ml乙基二異丙胺(Hünig堿)處理。在0℃下向該混合物中加入3-(2-甲基-[1，3]二氧戊環(huán)-2-基)-丙酰氯溶液，該溶液由在40ml二氯甲烷中的8.9g 3-(2-甲基-[1，3]二氧戊環(huán)-2-基)-丙酸(Tetrahedron 37，307，1981)和10.31ml(1-氯-2-甲基-丙烯基)-二甲基-胺(Tetrahedron 54，9207，1998)制備得到。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌3-4天，這取決于轉(zhuǎn)化的進(jìn)展。優(yōu)選在2天中分3-4份加入3-(2-甲基-[1，3]二氧戊環(huán)-2-基)-丙酰氯。將反應(yīng)混合物真空濃縮、溶于乙酸乙酯、用水、1N鹽酸水溶液、水洗滌、用硫酸鈉干燥并真空濃縮。經(jīng)快速色譜柱分離(240g硅膠60，40-63微米，石油醚/乙酸乙酯2∶1至1∶1)并將產(chǎn)物在50℃下真空干燥后，得到純的(S)-2-{(2′-氰基-聯(lián)苯-4-基甲基)-[3-(2-甲基-[1，3]二氧戊環(huán)-2-基)-丙酰基]-氨基}-3-甲基-丁酸芐酯，為金色、粘性殘?jiān)?。TLC-Rf0.23(石油醚/乙酸乙酯2∶1)。
(S)-2-[(2′-氰基-聯(lián)苯-4-基甲基)-(4-氧代-戊酰基)-氨基]-3-甲基-丁酸芐酯 將9.8g(S)-2-{(2′-氰基-聯(lián)苯-4-基甲基)-[3-(2-甲基-[1，3 ]二氧戊環(huán)-2-基)-丙酰基]-氨基}-3-甲基-丁酸芐酯溶解在100ml四氫呋喃中，并用50ml 1N鹽酸水溶液處理。將混合物在室溫下攪拌6.5小時(shí)、真空濃縮并用二氯甲烷萃取。將有機(jī)相用水洗滌、用硫酸鈉干燥、真空濃縮、蒸發(fā)并在50℃下真空干燥1小時(shí)。得到(S)-2-[(2′-氰基-聯(lián)苯-4-基甲基)-(4-氧代-戊酰基)-氨基]-3-甲基-丁酸芐酯，為橙色粘性的油。TLC-Rf0.18(石油醚/乙酸乙酯2∶1)。
(S)-3-甲基-2-{(4-氧代-戊酰基)-[2′-(1H-四唑-5-基)-聯(lián)苯-4-基甲基]-氨基}-丁酸芐酯 將在20ml二甲苯中的8.64g(S)-2-[(2′-氰基-聯(lián)苯-4-基甲基)-(4-氧代-戊?；?-氨基]-3-甲基-丁酸芐酯和12.71g Tributyltinazid(Aldrich)回流28小時(shí)。用0.5N氫氧化鈉水溶液處理混合物，將水相用醚洗滌，并將醚相用水萃取一次。合并的水相用濃鹽酸水溶液酸化、用二氯甲烷萃取、用水洗滌、混懸入活性炭、過(guò)濾、用硫酸鈉干燥、濃縮并真空干燥。得到產(chǎn)物(S)-3-甲基-2-{(4-氧代-戊?；?-[2′-(1H-四唑-5-基)-聯(lián)苯-4-基甲基]-氨基}-丁酸芐酯，為棕色泡沫。TLC-Rf0.36(甲苯/二氯甲烷/甲醇/甲酸40∶40∶40∶4)。
(S)-3-甲基-2-{(4-氧代-戊?；?-[2′-(1H-四唑-5-基)-聯(lián)苯-4-基甲基]-氨基}-丁酸 將在160ml四氫呋喃中的7.9g(S)-3-甲基-2-{(4-氧代-戊酰基)-[2′-(1H-四唑-5-基)-聯(lián)苯-4-基甲基]-氨基}-丁酸芐酯在常壓、室溫下、于1.5g披批鈀碳(10％)存在下進(jìn)行氫化，直至達(dá)到飽和。將混合物過(guò)濾并真空濃縮，得到(S)-3-甲基-2-{(4-氧代-戊?；?-[2′-(1H-四唑-5-基)-聯(lián)苯-4-基甲基]-氨基}-丁酸，為幾乎白色的泡沫。TLC-Rf0.1(甲苯/二氯甲烷/甲醇/甲酸40∶40∶40∶4)。
雖然根據(jù)其某些優(yōu)選方案非常詳細(xì)地闡述了本發(fā)明，但不背離本發(fā)明所包括的優(yōu)選方案的精神和范圍的其它方案也是可能的。
在此提及的所有出版物和專利均全文引入作為參考，就如同將其在此完整列出一樣。
權(quán)利要求
1.抑制血小板凝集的方法，該方法包括向有需要的患者施用治療有效量的ARB或其可藥用鹽，任選存在可藥用載體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中的ARB是纈沙坦。
3.抑制血小板凝集的方法，該方法包括向有需要的患者施用治療有效量的ARB代謝物或其可藥用鹽，任選存在可藥用載體。
4.權(quán)利要求3的方法，其中的代謝物是4-羥基戊?；i沙坦。
5.治療由血小板凝集介導(dǎo)的病癥的方法，該方法包括向有需要的患者施用治療有效量的ARB。
6.權(quán)利要求5的方法，其中的ARB是纈沙坦。
7.權(quán)利要求5的方法，其中由血小板凝集介導(dǎo)的病癥是急性心肌梗死、缺血性卒中、心絞痛、急性冠狀動(dòng)脈綜合征、TIA(短暫性腦缺血發(fā)作或急性腦血管綜合征)、心力衰竭、缺血性胸痛、X綜合征、血栓栓塞、肺動(dòng)脈高壓、糖尿病、外周血管疾病、深靜脈血栓形成、任何血管的動(dòng)脈血栓形成、導(dǎo)管血栓性閉塞或再閉塞。
8.治療由血小板凝集介導(dǎo)的病癥的方法，該方法包括向有需要的患者施用治療有效量的ARB代謝物。
9.權(quán)利要求8的方法，其中的代謝物是4-羥基戊?；i沙坦。
10.權(quán)利要求8的方法，其中由血小板凝集介導(dǎo)的病癥是急性心肌梗死、缺血性卒中、心絞痛、急性冠狀動(dòng)脈綜合征、TIA(短暫性腦缺血發(fā)作或急性腦血管綜合征)、心力衰竭、缺血性胸痛、X綜合征、血栓栓塞、肺動(dòng)脈高壓、糖尿病。
11.外周血管疾病、深靜脈血栓形成、任何血管的動(dòng)脈血栓形成、導(dǎo)管血栓性閉塞或再閉塞。
12.包含治療有效量的ARB代謝物以及可藥用載體的藥物組合物。
13.權(quán)利要求11的藥物組合物，其中的代謝物是4-羥基戊?；i沙坦。
14.ARB或其可藥用鹽在制備藥物中的用途，所述藥物用于預(yù)防、延緩發(fā)展或治療由血小板凝集介導(dǎo)的疾病和病癥，特別是急性心肌梗死、缺血性卒中、心絞痛、急性冠狀動(dòng)脈綜合征、TIA(短暫性腦缺血發(fā)作或急性腦血管綜合征)、心力衰竭、缺血性胸痛、X綜合征、血栓栓塞、肺動(dòng)脈高壓、糖尿病、外周血管疾病、深靜脈血栓形成、任何血管的動(dòng)脈血栓形成、導(dǎo)管血栓性閉塞或再閉塞。
15.ARB代謝物或其可藥用鹽在制備藥物中的用途，所述藥物用于預(yù)防、延緩發(fā)展或治療由血小板凝集介導(dǎo)的疾病和病癥，特別是急性心肌梗死、缺血性卒中、心絞痛、急性冠狀動(dòng)脈綜合征、TIA(短暫性腦缺血發(fā)作或急性腦血管綜合征)、心力衰竭、缺血性胸痛、X綜合征、血栓栓塞、肺動(dòng)脈高壓、糖尿病、外周血管疾病、深靜脈血栓形成、任何血管的動(dòng)脈血栓形成、導(dǎo)管血栓性閉塞或再閉塞。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制血小板凝集的方法，該方法包括施用治療有效量的ARB或其代謝物，尤其是纈沙坦或其代謝物4－羥基戊?；i沙坦?？赏ㄟ^(guò)抑制血小板凝集治療的病癥包括急性心肌梗死、缺血性卒中、心絞痛、急性冠狀動(dòng)脈綜合征、TIA(短暫性腦缺血發(fā)作或急性腦血管綜合征)、心力衰竭、缺血性胸痛、X綜合征、血栓栓塞、肺動(dòng)脈高壓、糖尿病、外周血管疾病、深靜脈血栓形成、任何血管的動(dòng)脈血栓形成、導(dǎo)管血栓性閉塞或再閉塞。
文檔編號(hào)A61K31/4184GK1652774SQ03810864
公開(kāi)日2005年8月10日 申請(qǐng)日期2003年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月14日
發(fā)明者A·馬利寧, V·L·謝列布魯安尼, R·L·韋布 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司