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      利用l-fmau聯(lián)合治療乙型肝炎病毒感染的制作方法

      文檔序號:1040150閱讀:881來源:國知局
      專利名稱:利用l-fmau聯(lián)合治療乙型肝炎病毒感染的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明描述了治療或預(yù)防宿主乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法和組合物,包括給予有效劑量的L-FMAU、FTC和干擾素。
      背景技術(shù)
      雖然存在有效的疫苗,乙型肝炎病毒(HBV)感染仍然是一個(gè)嚴(yán)重的公眾健康問題,全世界的慢性攜帶者達(dá)4億。這些感染者有發(fā)生肝硬化和肝細(xì)胞癌的危險(xiǎn)(Lee,W.M.1997,N.Engl.J.Med.3371733-1745)。目前估計(jì)美國境內(nèi)慢性乙型肝炎病毒攜帶者約有125萬,每年有20萬人通過接觸血液或體液新發(fā)感染。
      乙型肝炎病毒(HBV)是僅次于煙草的導(dǎo)致人類發(fā)生癌癥的原因。雖然有假說認(rèn)為HBV可直接引發(fā)腫瘤的發(fā)生或通過慢性炎癥、肝硬化和感染相關(guān)的細(xì)胞再生間接引發(fā)腫瘤的發(fā)生,但是HBV導(dǎo)致癌癥的機(jī)制還不清楚。
      感染HBV的人數(shù)已經(jīng)達(dá)到了流行病的水平。在2-6個(gè)月的無癥狀潛伏期后,HBV感染可導(dǎo)致急性肝炎和肝臟損傷,表現(xiàn)為腹痛、黃疸、血液中某些酶水平升高。HBV可導(dǎo)致爆發(fā)型肝炎,一種急進(jìn)性并常常是致死性的疾病,此時(shí)肝臟發(fā)生大面積壞死。急性病毒性肝炎后患者一般會痊愈。而某些患者在之后更長的時(shí)間內(nèi)或無限期的,在血液中持續(xù)出現(xiàn)高水平的病毒抗原,導(dǎo)致慢性感染。慢性感染可導(dǎo)致慢性持續(xù)性肝炎。感染慢性持續(xù)性HBV的患者最常見于發(fā)展中國家。慢性持續(xù)性肝炎可導(dǎo)致疲乏、肝硬化和肝細(xì)胞癌,一種原發(fā)性肝癌。在西方工業(yè)化國家,HBV感染的高危人群包括那些接觸HBV攜帶者或其血樣的人群。事實(shí)上,HBV的流行病學(xué)與獲得性免疫缺陷綜合征非常相似,事實(shí)上,HBV感染在患AIDS或HIV-相關(guān)感染的患者中很常見。但HBV較HIV更易傳染。
      到目前為止,F(xiàn)DA只通過了3種治療慢性HBV感染的藥物α干擾素、3TC(Epivir,拉米夫定)和阿德福韋二叔戊酰氧甲酯(HepseraGilead Sciences)。
      FDA批準(zhǔn)用于治療HBV的藥物
      α干擾素干擾素的一種制成品被用于治療乙型肝炎。該治療包括注射大約4個(gè)月的干擾素。
      并非所有的患者都對干擾素有反應(yīng),有時(shí)需進(jìn)行再次治療。臨床研究顯示,因乙型肝炎接受A(重組α-2b干擾素,Schering公司)注射治療的患者中,隨著時(shí)間進(jìn)展,只有45%的患者血液中檢測不出乙型肝炎病毒的存在。另外,大多數(shù)患者耐受干擾素治療有困難,干擾素治療可導(dǎo)致嚴(yán)重的流感樣癥候群、體重下降及乏力和抵抗力降低。
      3TCBCH-189(2′,3′-雙脫氧-3′-硫代胞苷)的(一)一對映體,亦稱為3TC(Epivir,拉米夫定)是一種具有抗HIV和HBV活性的抗病毒藥。它屬于核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI)種類的藥物,通過阻斷HIV和HBV復(fù)制需要的逆轉(zhuǎn)錄酶的產(chǎn)生以發(fā)揮作用。3TC最初用于治療HIV,但是,研究人員發(fā)現(xiàn)3TC對B型肝炎病毒也有治療作用。1998年12月,美國食品與藥物管理局(FDA)證明了Epivir HBV對于B型肝炎病毒感染有治療效果。
      盡管3TC可以有效抑制HBV復(fù)制,3TC治療中滅活病毒的緩慢的動(dòng)力學(xué)(Nowak,M.,S.Bonhoeffer,et al.1996.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 934398-4402)和自發(fā)的病毒基因組變異導(dǎo)致了抗藥突變株的產(chǎn)生,它具有逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)區(qū)的變異(Mason,W.S.,J.Cullen,et al.1998.Virology 24518-32.Nafa,S.,S.Ahmed,et al.2000.Hepatology 321078-1088;Melegari,M.,P.P.Scaglioni,and J.R.Wands.1998 Hepatology 27628-633.;Seigneres,B.,C.Pichoud,et al.2000.J.Infect.Dis.1811221-1233)。大約有50%接受治療的病人在接受3TC治療3年后產(chǎn)生了病毒的抗性(Leung,N.W.,C.L.Lai,et al.2001.Hepatology 331527-1532)。對核苷類似物的抗性與導(dǎo)致HBV RT氨基酸序列發(fā)生改變的多聚酶基因的核酸序列被替換有關(guān),尤其是在催化位置的YMDD基序。最為常見的聚合酶變異是rtL180M-加-M204V改變(根據(jù)最近的對HBV抗藥突變株的基因型-非依賴性命名法)(Stuyver,L.J.,S.A.Locarnini,et al.2001.Hepatology 33751-757),此改變與催化位點(diǎn)(rtM204V)的變異有關(guān),同時(shí)在RT(rtL180M)的B區(qū)的補(bǔ)償性變異使催化位點(diǎn)的變異提供更高的復(fù)制能力(Allen,M.I.,M.Deslauriers,et al.1998.Hepatology 271670-1677.Chayama,K.,Y.Suzuki,et al.1998.Hepatology 271711-1716.Melegari,M.,P.P.Scaglioni,and J.R.Wands.1998.Hepatology 27628-633.Ono,S.K.,N.Kato,et al.2001.J.Clin.Investig.107449-455.Seigneres,B.,S.Aguesse-Germon,et al.2001.J.Hepatol.34114-122)。
      阿德福韋二叔戊酰氧甲酯(Hepsera)2002年9月20日,美國食品與藥物管理局證明阿德福韋二叔戊酰氧甲酯可以治療慢性B型肝炎。HEPSERATM是阿德福韋二叔戊酰氧甲酯的商品名稱,是adefovir的二酯藥物前體。Adefovir是腺苷單磷酸鹽的無環(huán)核苷酸類似物,可以通過競爭天然底物脫氧腺苷三磷酸鹽和插入病毒DNA導(dǎo)致DNA鏈終止來抑制B型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶。阿德福韋二叔戊酰氧甲酯的化學(xué)名稱是9-[2-[雙[(新戊酰氧基)甲氧基]氧膦基]甲氧基]-乙基]腺嘌呤。阿德福韋被細(xì)胞激酶磷酸化成活性代謝物,阿德福韋二磷酸鹽。參見,例如,美國專利號5,641,763 and 5,142,051,名為,N-氧膦基甲氧基烷基的嘧啶和嘌呤基衍生物和其治療學(xué)組合物,從此具有抗病毒活性。
      (-)-FTCβ-L-FTC((β-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1,3-草酰硫酸,Emtriva;emtricitabine)被證明可以用于治療HIV并且目前人類臨床試驗(yàn)中可治療B型肝炎病毒感染。這種化合物在鴨和土撥鼠模型中表現(xiàn)出了強(qiáng)大的抗B型肝炎病毒活性(Aguesse-Germon,S.,S.-H,Liu,et al.Afatimicrob.Agents Chefnother.1998,42,369-376;Seigneres,B.,C.Pichoud,et al.2000)。在HBV的土撥鼠模型中,F(xiàn)TC被發(fā)現(xiàn)可以抑制病毒復(fù)制但是不能誘導(dǎo)病毒的清除(Cullen,J.M.,S.L.Smith,et al.Antimicrob.Agents Chemother.1997,41,2076-2082;Korba,B.E.,R.F.Schinazi,P.,et al.Antimicrob.Agents Chemother.2000,44,1757-60)。
      L-FMAUL-FMAU(clevudine)代表另一種用于治療B型肝炎病毒感染有潛力的候選藥物(酶學(xué)分析和組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)),根據(jù)基于HBV感染的體外模型,以及B型肝炎感染的試驗(yàn)性感染動(dòng)物模型,例如鴨和土撥鼠(Aguesse-Germon,S.,S.-H,Liu,et al.Antimicrob.AgentsChenaother.1998,42,369-376;Seigneres,B.,C.Pichoud,et al.,2000)。在土撥鼠模型中,發(fā)現(xiàn)L-FMAU可以迅速降低受感染肝細(xì)胞的數(shù)量(Zhu,Y.,T.Yamamoto,et al.J.Virol.2001,75,311-22)。Yung Chi Cheng,Chung K.Chu等于1994年首先報(bào)道了1-(2’-脫氧-2’-氟-β-L-阿糖呋喃)-胸腺嘧啶(L-FMAU)對B型肝炎病毒和Epstein Barr病毒具有超強(qiáng)的活性。參見美國專利號5,587,362;5,567,688;5,565,438和5,808,040及國際專利申請出版號為WO 95/20595。國際專利出版號WO 01/72294公開了使用2’-脫氧-2’-氟-β-L-阿糖呋喃-胸腺嘧啶(L-FMAU)治療丁型肝炎感染。
      干擾素干擾素是一種由人體天然合成的用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和其它細(xì)胞功能的蛋白質(zhì)。干擾素的主要種類有干擾素α、干擾素β、干擾素γ、干擾素ω和干擾素τ。干擾素可以通過修飾以增強(qiáng)其在體內(nèi)的穩(wěn)定性,例如聚乙二醇化等修飾,或其他可以增強(qiáng)分子穩(wěn)定性的方法。
      干擾素α家族的干擾素包括干擾素α-2a,干擾素α-2b,聚乙二醇化干擾素α-2a,聚乙二醇化干擾素α-2b ROFERON-A(干擾素α-2a,Roche),PEGASYS(聚乙二醇化干擾素α-2a,Roche),INTRONA(干擾素α-2b,Schering Corporation),PEG-INTRON(聚乙二醇化干擾素α-2b,Schering Corporation),一致(consensus)干擾素,InterMun的INFERGEN(干擾素alpha con-1),Viragen的OMNIFERON(天然干擾素),Human Genome Sciences的ALBUFERON,Amarillo Biosciences的口服干擾素A,和SuperFeron(天然人多亞型IFN-α,Genetrol,Inc.)。
      其它類型的干擾素包括干擾素β,干擾素γ,干擾素τ,干擾素ω,Ares-Serono的REBIF(干擾素β-la),BioMedicine的干擾素ω,InterMune的干擾素γ-lb,和HuFeron(人IFN-β,Genetrol,Inc.)。
      聯(lián)合治療為了更好的控制病毒復(fù)制和推遲病毒-抗藥性突變株的出現(xiàn),發(fā)展基于聯(lián)合治療的抗病毒策略非常重要(Zoulim,F(xiàn).2001.Antivir.Chez.Chemother.12(Suppl.1)131-142),這將可以同時(shí)阻止交叉-耐藥突變株的選擇,如同人類免疫缺陷病毒所顯示(Chow,Y.K.,M.S.Hirsch,et al.1993.Nature 361650-654;Snyder,S.,D.Z.D′Argenio,et al. 2000.Antimicrob.Agents Cher10ther.441051-1058.Villahermosa,M.L.,et al..1997.Biochemistry 3613223-13231)。少數(shù)研究已著重于檢驗(yàn)聯(lián)合使用聚合酶抑制劑用于治療慢性肝DNA病毒感染的抗病毒效果,使用了一些試驗(yàn)?zāi)P?Korba,et al.2000.Antivir.Res.4519-32;Colledge,D.,S.Locarnini,and T.Shaw.1997.Hepatology 26216-225;Colledge,et al.2000.Antimicrob.AgentsChemother.44551-560)。發(fā)展用于B型肝炎病毒感染的聯(lián)合治療是當(dāng)今一種必需的策略,將會降低慢性B型肝炎病毒感染的發(fā)病率和死亡率。
      在鴨B型肝炎病毒感染模型中某種嘧啶和嘌呤核苷聯(lián)合治療的效果由Seigneres等評估,Antimicrobial Agents和Chemotherapy,47(6)1842-1852(2003)。Amdoxovir(DAPD)、emtricitabine((-)-FTC)和clevudine(L-FMAU)的聯(lián)合治療已經(jīng)有了增強(qiáng)的抗病毒效果。
      Lok和McMahon,AASLD Practice Guidelines,pp.1225-1241(2001)亦描述了B型肝炎病毒感染的治療,包括使用包括干擾素的治療。土撥鼠肝炎病毒(WHV)慢性感染東方土撥鼠被作為HBV感染模型研究1-(2-氟-5-甲基-β-L-阿糖呋喃)-尿嘧啶(L-FMAU)和WHV表面抗原疫苗的抗病毒效果。與L-FMAU和疫苗聯(lián)合治療相關(guān)的體液和細(xì)胞免疫類似于在自限性WHV感染中所觀察到的(Menneet al.,J.Virology,76(11)5305-5314(2002))。
      Jacquard等發(fā)表了使用L-FMAU和FTC,連同腺病毒傳送重組干擾素γ多藥治療慢性B型肝炎病毒的研究。(Jacquard etal.,″Evaluation and Combination of Clevudine and Emtricitabine withAdenovirus Mediated Delivery of Interferon Г in the WoodchuckModel of GBV Infection″,Poster presented at the Boston AASLDmeeting,Nov.2-5,2002.See also the Asilomar meeting″The MolecularBiology of Hepatitis B Virus″Sept 29-Oct 3,2002.)這項(xiàng)研究表明干擾素不會增強(qiáng)L-FMAU和FTC的效果,但是,該研究限于土撥鼠中的土撥鼠肝炎病毒,而不是人體中的人B型肝炎病毒。
      美國專利號5,808,040,喬治亞大學(xué)研究基金會和耶魯大學(xué)公開了L-FMAU可以與FTC,3TC,卡波弗,阿昔洛韋,干擾素,AZT,DDI(2’,3’-雙脫氧次黃苷),DDC(2’,3’-雙脫氧次黃苷),L-DDC,L-F-DDC,和D4T聯(lián)合使用。
      國際專利申請?zhí)柎aPCT/US99/25673,出版號WO 00/25797公開了在人體中用于治療HBV感染和相關(guān)病癥的聯(lián)合用藥和方法。特別是,這些組合物包括增效量的β-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1,3-草酰硫酸(FTC)和噴昔洛維(2-氨基-1,9-二氫-9-[4-羥-3-(羥甲基)丁基]-6H-嘌呤-6-酮,也稱為″PCV″)、法昔洛韋或9-[2-(磷霉素甲氧基)乙基]6-氨基嘌呤(PMEA,以下也稱為雙-POM-PMEA或BP-PMEA)中的一種?;蛘?,組合物包括增效量的2′-氟-5-甲基-p-L-阿糖呋喃尿嘧啶(L-FMAU)和噴昔洛維、9-[2-(膦-甲氧基)乙基]6-氨基嘌呤(PMEA)或β-D-1,3-二氧戊環(huán)核苷,例如DAPD中的一種?;蛘撸M合物包括增效量的β-D-1,3-二氧戊環(huán)核苷,例如DAPD和PMEA。
      PCT出版號WO 98/23285公開了一種治療或預(yù)防B型肝炎病毒感染患病人類或動(dòng)物的方法,該方法包括給予病人有效量或預(yù)防量的噴昔洛維(或其生物前體例如法昔洛韋)和α-干擾素。
      美國專利號5,990,093和國際專利出版號WO 95/07086與WO96/40164,轉(zhuǎn)讓給Emory University,公開了治療HBV的方法,包括給予β-L-2′,3′-雙脫氧腺苷聯(lián)合或交替使用2-羥基-甲基-5-(5-氟胞苷-1-基)-1,3-草酰硫酸;2-羥甲基-5-(胞苷-1-基)-1,3-草酰硫酸;2′-氟-5-碘-阿糖尿嘧啶(FIAU);2′-氟-5-乙基-阿糖尿嘧啶(FEAU)、卡波佛或干擾素。
      美國專利號5,703,058,5,905,070和6,232,300和國際專利出版號WO 96/22778公開了(5-carboximido或5-氟)-(2′,3′-不飽和或3′-修飾的)嘧啶核苷用于治療HIV或HBV。特別是,此專利和國際專利出版公開了聯(lián)合治療HIV或HBV的方法,包括(5-carboximido或5-氟)-(2′,3′-不飽合或3′-修飾)嘧啶核苷聯(lián)合2-羥-甲基-5-(5-氟胞苷-1-基)-1,3-草酰硫酸、2-羥甲基-5-(胞苷-l-基)-1,3-草酰硫酸;9->4-(羥甲基)-2-環(huán)戊-1-基-鳥嘌呤(卡波佛)、9-(2-羥基-乙氧基)甲基-鳥嘌呤(阿昔洛韋)、干擾素,3′-脫氧-3′-疊氮胸腺嘧啶(AZT)、2′,3′-雙脫氧次黃苷(DDI)、2′,3′-雙脫氧胞嘧啶(DDC)、(-)-2′-氟-5-甲基-β-L-ARA尿嘧啶(L-(-)-FMAU)和2′,3′-雙脫氫-2′,3′-雙脫氧胸腺嘧啶(D4T)中的一種或多種。
      盡管在治療B型肝炎和聯(lián)合治療方面已經(jīng)有了進(jìn)步,目前仍然不了解哪種聯(lián)合治療可以最有效的降低或終止人B型肝炎病毒在宿主中的載量。據(jù)觀察盡管某些B型肝炎病毒藥物和聯(lián)合可以通過添加治療而增加療效,在其他的情況下,添加的治療沒有提供更多的益處,并且實(shí)際上對病人的健康有害。因此,提供健康保健者需要了解有益的和有利的聯(lián)合治療B型肝炎的信息以使他或她可以進(jìn)行對病人最佳的治療。
      考慮到B型肝炎病毒已經(jīng)達(dá)到全球流行程度的現(xiàn)狀,并且對受到感染的病人具有嚴(yán)重和常常是不幸的影響,一直強(qiáng)烈需要新的、并且對宿主的毒性較低的有效的藥學(xué)方法、用途和聯(lián)合以治療感染病毒的人。
      另外,慢性B型肝炎病毒需要長期給予核苷類似物以清除感染肝細(xì)胞,這將容易導(dǎo)致抗藥性病毒株的產(chǎn)生。由于抗藥性突變株的選擇性,治療慢性B型肝炎病毒需要新的策略。
      因此,這是現(xiàn)有發(fā)明的另外一個(gè)目標(biāo),即提供組合物和方法以治療人類病人或者其他感染HBV的宿主。
      本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供方法和組合物,以治療HBV耐藥性菌株感染。
      發(fā)明概述L-FMAU與FTC聯(lián)合和/或輪流與干擾素,例如干擾素α或干擾素γ聯(lián)合/或輪流給藥可在人體中產(chǎn)生對B型肝炎病毒的超強(qiáng)療效。在一種實(shí)施方案中,干擾素以蛋白質(zhì)的形式給藥,典型方式是直接輸入靜脈或動(dòng)脈。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中,干擾素通過核酸、基因或及其基因片段的形式給藥以使之在宿主中表達(dá)。干擾素核酸可“裸體”輸入宿主體內(nèi),即,不需要載體,或者另外可以通過載體,包括但不限于包括腺病毒載體的病毒載體。
      在一種優(yōu)選實(shí)施方案中,β-L-FTC和L-FMAU中至少有90%不是它們的相對的β-D-對映體。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中,β-L-FTC和L-FMAU獨(dú)立地至少有95%、98%或99%不是它們的相對的β-D-對映體。
      在一種實(shí)施方案中,干擾素是干擾素α,任選地,聚乙二醇化干擾素α。在另一種實(shí)施方案中,干擾素α選自包括但是不限于如下的組干擾素α-2a、干擾素α-2b,聚乙二醇化干擾素α-2a,聚乙二醇化干擾素α-2b ROFERON-A(干擾素α-2a,Roche),PEGASYS(聚乙二醇化干擾素α-2a,Roche),INTRONA(干擾素α-2b,Schering Corporation),PEG-INTRON(聚乙二醇化干擾素α-2b,Schering Corporation),一致干擾素,InterMune的INFERGEN(干擾素αcon-1),Viragen的OMNIFERON(天然干擾素),HumanGenome Sciences的ALBUFERON,Amarillo Biosciences的口服干擾素A,和SuperFeron(天然人多亞型IFN-α,Genetrol,Inc.)。在另一種實(shí)施方案中,干擾素為干擾素γ。還有另一種實(shí)施方案中,干擾素為干擾素β、干擾素ω或者干擾素τ。在另一種實(shí)施方案中,從以下選擇干擾素,包括,但不限于Ares-Serono的REBIF(干擾素β-la),BioMedicine的ω干擾素,InterMune的干擾素γ-lb,和HuFeron(人IFN-β,Genetrol,Inc.)。
      另外,提供了用于治療和/或預(yù)防宿主中HBV感染的組合物和方法,優(yōu)選哺乳動(dòng)物,甚至更優(yōu)選人類,包含給予有效劑量的如下式的β-L-核苷 或其藥用可接受的鹽或藥物前體,其中R是H、烴基、芳基、?;⒘姿猁},包括單磷酸鹽,二磷酸鹽或三磷酸鹽或穩(wěn)定的磷酸鹽部分,包括磷脂,或醚-脂,任選處于藥用可接受的載體或稀釋液中,聯(lián)合和/或交替使用如下式的β-L-核苷 或其藥用可接受的鹽或藥物前體,其中R1是H、烴基、芳基、酰基、磷酸鹽,包括單磷酸鹽,二磷酸鹽或三磷酸鹽或穩(wěn)定的磷酸鹽部分,包括磷脂,或醚-脂,R2和R3獨(dú)立地為氫、烷基或者環(huán)烷基(例如環(huán)丙基),在任選藥用可接受的載體中,聯(lián)合和/或交替使用免疫調(diào)節(jié)劑,例如TH1細(xì)胞因子,特別是干擾素,例如在這里描述的干擾素。
      在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中,干擾素以蛋白質(zhì)的形式遞送。在另一種實(shí)施方案中,干擾素以表達(dá)免疫調(diào)節(jié)蛋白的核酸、基因或其基因片段的形式遞送。在一種特殊的實(shí)施方案中,干擾素通過核酸、基因或基因片段的形式以“裸體”或通過載體輸送。
      通常,在交替治療中,每種藥物按照有效劑量順次給藥,然而在聯(lián)合治療中,兩種或更多藥物按有效劑量一起給藥。這些藥物的劑量將根據(jù)每種藥物吸收、生物-分布、代謝和排泄率等情況以及其它本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的因素確定。應(yīng)當(dāng)指出劑量值也要根據(jù)需要緩解的情況的嚴(yán)重程度而調(diào)整。更應(yīng)當(dāng)指出對于每種特殊情況,藥物特定的劑量和計(jì)劃將根據(jù)個(gè)體的需要和管理或監(jiān)督組合物使用者的專業(yè)判斷而被隨時(shí)調(diào)整。合適的劑量范圍的例子可以在科學(xué)文獻(xiàn)和醫(yī)師案頭參考中找到。在這里提及的很多其它化合物的合適劑量范圍的例子也可以在公共文獻(xiàn)中找到或可以使用已知的程序鑒定。這些劑量范圍可以根據(jù)需要取得的結(jié)果做調(diào)整。
      附圖簡述

      圖1圖解的非-限制性例子為用于遞送包括土撥鼠干擾素γ的腺病毒載體。對編碼區(qū)進(jìn)行了描繪和定義。
      圖2為給予代表性土撥鼠的治療模式的非限制性示意圖,內(nèi)容為使用1-(2-氟-5-甲基-β-L-阿糖基)尿嘧啶(L-FMAU),和β-2-羥甲基-5-(5-氟胞苷-1-基)-1,3-草酰硫酸(FTC),注射或不注射表達(dá)土撥鼠干擾素γ(Ad IFN)的腺病毒載體或者表達(dá)綠色熒光蛋白(Ad GFP)的腺病毒載體。
      圖3使用四個(gè)圖形描述了在土撥鼠中注射不同劑量(pfu)表達(dá)土撥鼠干擾素γ(Ad IFN)的腺病毒載體前和后隨時(shí)間變化(天)的土撥鼠B型肝炎(WHV)病毒DNA的數(shù)量(拷貝/ml)。箭頭指示接種時(shí)間和活檢時(shí)間。在左邊的Y軸,顯示了用內(nèi)源性多聚酶分析測量(EPA,dpm/ml)的病毒正鏈DNA的數(shù)量,如例3所描述的,對時(shí)間作圖。
      圖4使用5個(gè)圖形描述了在土撥鼠中注射3×109pfu表達(dá)土撥鼠干擾素γ(Ad IFN GFP)的完全腺病毒載體前和后隨時(shí)間變化(天)的土撥鼠B型肝炎(WHV)病毒DNA的數(shù)量(拷貝/ml)。箭頭指示接種時(shí)間和活檢時(shí)間。在左邊的Y軸上,顯示了病毒正鏈DNA的數(shù)量,如例3所描述的,用內(nèi)源性多聚酶分析(EPA,dpm/ml),對時(shí)間作圖。在例5中更詳細(xì)的描述了此數(shù)據(jù)。
      圖5的3個(gè)圖形描述了在土撥鼠中注射3×109pfu表達(dá)綠色熒光蛋白(Ad GFP)的腺病毒載體前和后(頂部兩圖型)或未經(jīng)治療的對照(底部圖形)隨時(shí)間變化(天)的土撥鼠B型肝炎(WHV)病毒DNA的數(shù)量(拷貝/ml)。箭頭指示接種時(shí)間和活檢時(shí)間。在左邊的Y軸,顯示了病毒正鏈DNA的數(shù)量,如例3所描述的,用內(nèi)源性多聚酶分析(EPA,dpm/ml),對時(shí)間作圖。在例5中更詳細(xì)的描述了此數(shù)據(jù)。
      圖6是病毒DNA的southern印跡的拷貝,此病毒DNA是在感染了土撥鼠B型肝炎(WHV)的土撥鼠的肝活檢中取得的,取得的時(shí)間為治療前1月(M-1)和距離注射表達(dá)土撥鼠干擾素γ(Ad IFN GFP)的完全腺病毒載體、表達(dá)綠色熒光蛋白(Ad GFP)的腺病毒載體、或未經(jīng)治療后第5天(D5)。底部圖形為共價(jià)閉合的環(huán)狀病毒形式的DNA(CCC)DNA。圖形下的數(shù)字說明了在D5/M-1的DNA之百分比。
      圖7描繪的圖形為例6所描述的用1-(2-氟-5-甲基-p-L-阿糖基)尿嘧啶(L-FMAU),和p-2-羥甲基-5-(5-氟胞苷-l-基)-1,3-草酰硫酰,Emtriva;emtricitabine(FTC)治療土撥鼠中和治療土撥鼠后,注射或未注射表達(dá)土撥鼠干擾素γ(Ad IFN)的腺病毒載體隨時(shí)間變化(天)的土撥鼠B型肝炎(WHV)病毒的濃度(拷貝/ml)。結(jié)果使用例3中描述的點(diǎn)印跡分析取得。
      圖8顯示了例6中所描述的注射土撥鼠干擾素γ(Ad IFN)或者注射表達(dá)綠色熒光蛋白(Ad GFP)的腺病毒載體治療中和治療動(dòng)物后隨時(shí)間變化(天)的土撥鼠B型肝炎(WHV)病毒的濃度(拷貝/ml)。此結(jié)果使用例3中描述的點(diǎn)印跡分析取得。對照土撥鼠僅使用Ad IFN治療而病毒血癥沒有出現(xiàn)明顯變化。
      圖9的圖形為例6中描述的未經(jīng)治療的動(dòng)物隨時(shí)間變化(天)的土撥鼠B型肝炎(WHV)病毒的濃度(拷貝/ml)。此結(jié)果使用例3中描述的點(diǎn)印跡分析取得。
      圖10描繪的三個(gè)圖形為例6中所描述的用1-(2-氟-5-甲基-p-L-阿糖基)尿嘧啶(L-FMAU),和p-2-羥甲基-5-(5-氟胞苷-l-基)-1,3-草酰硫酸,Emtriva;emtricitabine(FTC)對土撥鼠進(jìn)行治療中和治療后,注射或未注射表達(dá)土撥鼠干擾素γ(IFN)的腺病毒載體,隨時(shí)間變化(天)的土撥鼠B型肝炎(WHV)病毒DNA載量(拷貝/ml),使用例3中描述的實(shí)時(shí)PCR計(jì)量。
      圖11是分析病毒DNA的southern印跡的拷貝,此病毒DNA是在感染了土撥鼠B型肝炎(WHV)的土撥鼠的肝活檢中取得的,取得的時(shí)間為用1-(2-氟-5-甲基-p-L-阿糖基)尿嘧啶(L-FMAU),和p-2-羥甲基-5-(5-氟胞苷-l-基)-1,3-草酰硫酸,Emtriva;emtricitabine(FTC)、表達(dá)土撥鼠干擾素γ(Ad IFN)的腺病毒載體、表達(dá)綠色熒光蛋白的腺病毒載體(Ad GFP)治療前(TO),治療1月(M1)和治療2月(M2),或未治療。底部圖形為共價(jià)閉合的環(huán)狀病毒形式的DNA(CCC)DNA。圖形下的數(shù)字說明了在D5/M-1的DNA之百分比。
      圖12的圖形描述了在使用1-(2-氟-5-甲基-p-L-阿糖基)尿嘧啶(L-FMAU),和p-2-羥甲基-5-(5-氟胞苷-l-基)-1,3-草酰硫酸,Emtriva;emtricitabine(FTC),或者表達(dá)土撥鼠干擾素γ(Ad IFN)的腺病毒載體治療的動(dòng)物體內(nèi)土撥鼠B型肝炎(WHV)病毒DNA和共價(jià)閉合的環(huán)狀病毒形式的DNA(CCC)DNA的百分比,顯示了病毒的減少。MO指樣本恰好取自治療前,MI指樣本取自治療開始后1個(gè)月,M2指樣本取自治療開始后2個(gè)月。
      圖13的圖形描述了在使用1-(2-氟-5-甲基-p-L-阿糖基)尿嘧啶(L-FMAU),和p-2-羥甲基-5-(5-氟胞苷-l-基)-1,3-草酰硫酸,Emtriva;emtricitabine(FTC)治療的動(dòng)物體內(nèi)土撥鼠B型肝炎(WHV)病毒DNA和共價(jià)閉合的環(huán)狀病毒形式的DNA(CCC)DNA的百分比,顯示了病毒的減少。T0指樣本恰好取自治療前,MI指樣本取自治療開始后1個(gè)月,M2指樣本取自治療開始后2個(gè)月。
      圖14的圖形描述了經(jīng)過注射表達(dá)土撥鼠干擾素γ(Ad IFN)的腺病毒載體,表達(dá)綠色熒光蛋白(Ad GFP)的腺病毒載體治療或未經(jīng)治療的動(dòng)物體內(nèi)土撥鼠B型肝炎(WHV)病毒DNA和共價(jià)閉合的環(huán)狀病毒形式的DNA(CCC)DNA的百分比,顯示了病毒的減少。T0指樣本恰好取自治療前,MI指樣本取自治療開始后1個(gè)月,M2指樣本取自治療開始后2個(gè)月。
      圖15的圖形描述了在例2中的炎癥活動(dòng)性的數(shù)值(Metavir評分),治療使用了1-(2-氟-5-甲基-p-L-阿糖基)尿嘧啶(L-FMAU),和p-2-羥甲基-5-(5-氟胞苷-l-基)-1,3-草酰硫酸,Emtriva;emtricitabine(FTC)、注射表達(dá)土撥鼠干擾素γ(Ad IFN)的腺病毒載體和表達(dá)綠色熒光蛋白(Ad GFP)的腺病毒載體,或未經(jīng)治療的對照。
      發(fā)明詳述L-FMAU與FTC聯(lián)合和/或輪流、與干擾素,例如干擾素α或干擾素γ聯(lián)合/或輪流給藥可在人體中產(chǎn)生對B型肝炎病毒的超強(qiáng)療效。在一種實(shí)施方案中,干擾素以蛋白質(zhì)的形式給藥,典型方式是直接輸入靜脈或動(dòng)脈。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中,干擾素通過核酸、基因或其基因片段的形式給藥以使之在宿主中表達(dá)。干擾素核酸可“裸體”或通過載體被輸送到宿主體內(nèi),使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解的技術(shù)。
      在一種優(yōu)選實(shí)施方案中,β-L-FTC和L-FMAU至少有90%不是它們的相對的β-D-對映體。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中,β-L-FTC和L-FMAU獨(dú)立地至少有95%、98%或99%不是它們的對應(yīng)的β-D-對映體。
      在優(yōu)選的實(shí)施方案中,免疫調(diào)節(jié)劑是干擾素。在一種實(shí)施方案中,干擾素是干擾素α,任選地,聚乙二醇化干擾素α。在另一種實(shí)施方案中,從其中選擇干擾素α,包括,但是不限于干擾素α-2a、干擾素α-2b,聚乙二醇化干擾素α-2a,聚乙二醇化干擾素α-2bROFERON-A(干擾素α-2a,Roche),PEGASYS(聚乙二醇化干擾素α-2a,Roche),INTRONA(干擾素α-2b,ScheringCorporation),PEG-INTRON(聚乙二醇化干擾素α-2b,ScheringCorporation),一致干擾素,InterMune的INFERGEN(干擾素alphacon-1),Viragen的OMNIFERON(天然干擾素),Human GenomeSciences的ALBUFERON,Amarillo Biosciences的口服干擾素A,和SuperFeron(天然人多亞型IFN-α,Genetrol,Inc.)。在另一種實(shí)施方案中,干擾素為干擾素γ。還有另一種實(shí)施方案中,干擾素為干擾素β、干擾素ω或者干擾素ι。在另一種實(shí)施方案中,從以下選擇干擾素,包括,但不限于Ares-Serono的REBIF(干擾素β-la),BioMedicine的ω干擾素,InterMune的干擾素γ-lb,和HuFeron(人IFN-β,Genetrol,Inc.)。
      另外,用于治療和/或預(yù)防宿主中HBV感染的組合物和方法,優(yōu)選哺乳動(dòng)物,甚至更優(yōu)選人類,包含給予有效劑量的如下式的β-L-核苷 或它的藥用可接受的鹽或藥物前體,其中R是H、烴基、芳基、?;⒘姿猁},包括單磷酸鹽,二磷酸鹽或三磷酸鹽或穩(wěn)定的磷酸鹽分子,包括磷脂,或醚-脂,任選藥用可接受的載體或稀釋液,聯(lián)合和/或交替使用此化學(xué)式的β-L-核苷 或它的藥用可接受的鹽或藥物前體,其中R1是H、烴基、芳基、酰基、磷酸鹽,包括單磷酸鹽,二磷酸鹽或三磷酸鹽或穩(wěn)定的磷酸鹽部分,包括磷脂,或醚-脂,R2和R3獨(dú)立地為氫、烷基或者環(huán)烷基(例如環(huán)丙基),在任選藥用可接受的載體中,聯(lián)合和/或交替使用免疫調(diào)節(jié)劑,例如TH1細(xì)胞因子,特別是干擾素,例如在這里描述的干擾素。
      在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中,干擾素以蛋白質(zhì)的形式遞送。在另一種實(shí)施方案中,干擾素以表達(dá)免疫調(diào)節(jié)蛋白的核酸、基因或其基因片段的形式遞送。在一種特殊的實(shí)施方案中,干擾素通過核酸、基因片段的形式輸送,輸送是通過病毒載體或者“裸體”完成的。
      通常,在交替治療中,每種藥物按照有效劑量順次給藥,然而在聯(lián)合治療中,兩種或更多藥物按有效劑量一起給藥。這些藥物的劑量將根據(jù)每種藥物吸收、生物-分布、代謝和排泄率等情況以及其它本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的因素確定。應(yīng)當(dāng)指出劑量值也要根據(jù)需要緩解的情況的嚴(yán)重程度而調(diào)整。更應(yīng)當(dāng)指出對于每種特殊情況,藥物特定的劑量和計(jì)劃將根據(jù)個(gè)體的需要和管理或監(jiān)督組合物使用者的專業(yè)判斷而被隨時(shí)調(diào)整。合適的劑量范圍的例子可以在科學(xué)文獻(xiàn)和醫(yī)師案頭參考中找到。在這里提及的很多其它化合物的合適劑量范圍的例子也可以在公共文獻(xiàn)中找到或可以使用已知的程序鑒定。這些劑量范圍可以根據(jù)需要取得的結(jié)果做調(diào)整。
      I.定義此處所用名詞“烷基”,如果沒有其它特殊情況,指含有飽和的直的、分支的或者環(huán)狀的,第一、第二或第三烴基的典型情況下C1到C10,特定情況下包括甲基,三氟甲基,CCl3,CFCL2,CF2Cl,乙基,CH2CF3,CF2CF3,丙基、異丙基、環(huán)丙基、丁基、異丁基、t-丁基、戊基、環(huán)戊基、異戊基、新戊基、己基、異己基、環(huán)己基、環(huán)己基甲基、3-甲基戊基,2,2-二甲基丁基和2,3-二甲基丁基。此名詞包括取代和未取代的烷基基團(tuán)。烷基可被替換的部分是從包含鹵素的基團(tuán)(氟、氯、溴或碘),羥基、氨基、氨基烷基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸基、硫酸基、磷酸基、磷酸鹽或者膦酸鹽,未保護(hù)或者進(jìn)行必要保護(hù)的,正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的,例如,Greene等所述,有機(jī)合成中的保護(hù)性基團(tuán),John Wiley and Sons,Second Edition,1991,在此引入作為參考。
      名詞“低級烷基”,在此使用的,如果沒有其它特殊情況,指的是飽和直的,分支的C1到C4,或者如果適宜,環(huán)狀的(例如,環(huán)丙基)烷基,包括取代和未取代形式。除非在此應(yīng)用中特別說明,當(dāng)烷基為合適的部分時(shí),優(yōu)選低級烷基。類似的,當(dāng)烷基或低級烷基是合適的部分時(shí),優(yōu)選未取代烷基或低級烷基。
      名詞“芳基”,在此使用的,如果沒有其它特殊情況,指的是苯基、聯(lián)苯或萘基,優(yōu)選苯基。此名詞包括取代和未取代部分。芳基基團(tuán)可以用選自以下基團(tuán)的一個(gè)或者更多部分取代,包括鹵素(氟、氯、溴或碘)、羥基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、硝基、磺酸基、硫酸基、磷酸基、磷酸鹽或者膦酸鹽,未保護(hù)或者進(jìn)行必要保護(hù)的,正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的,例如,Greene等所述,有機(jī)合成中的保護(hù)性基團(tuán),John Wiley and Sons,Second Edition,1991。
      名詞“酰基”指的是一種羧酸酯,其中酯基基團(tuán)的非羰基部分選自直鏈的、支鏈的或環(huán)狀烷基或低級烷基,烷氧基包括甲氧基甲基、芳烷基包括芐基、芳氧基烷基如苯氧基甲基、芳基包括苯基優(yōu)選的由鹵素(例如F,Cl,Br或I),C1到C4烷基或者C1到C4烷氧基,磺酸酯如烷基或芳烷基磺?;淄榛酋;瑔?、二或三磷酸鹽酯,三苯甲基或單甲氧基三苯甲基,取代的苯甲基,三烷基甲硅烷基(例如二甲基-t-丁硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。酯中的芳基優(yōu)選地包括苯基。名詞“低級?;敝傅氖欠囚驶糠质堑图壨榛孽;?。
      名詞“基本純凈形式”的使用貫穿本說明書以描述一種化合物包括大約90%或更高,或至少95%、96%、97%、98%或99%或更多這種化合物的單一對映體。當(dāng)一種特殊構(gòu)造的核苷(D或L)用這種規(guī)格表示時(shí),意味著此核苷用基本純凈的形式給藥。
      名詞“免疫調(diào)節(jié)劑”,如這里使用的,指的是一種直接或間接調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的化學(xué)因子或者細(xì)胞因子。免疫調(diào)節(jié)劑的非限制性的例子包括TII1細(xì)胞因子,特別是,干擾素,干擾素-α,純化干擾素-α,干擾素-α2a,干擾素-α2b,干擾素-β,干擾素-γ,一致(consensus)干擾素,聚乙二醇化干擾素,聚乙二醇化干擾素-α,粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子,白細(xì)胞介素,白細(xì)胞介素-2,和白細(xì)胞介素-12。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,免疫調(diào)節(jié)因子是干擾素,甚至更優(yōu)選干擾素-γ。
      名詞“宿主”,如這里使用的,指的是一種單細(xì)胞的或者多細(xì)胞的生物體,病毒可在其中復(fù)制,包括細(xì)胞系和動(dòng)物,優(yōu)選人類。備選地,宿主可以攜帶一部分病毒基因組,其復(fù)制或功能可以隨本發(fā)明的化合物而改變。名詞宿主特指感染的細(xì)胞,此細(xì)胞轉(zhuǎn)染了所有或一部分病毒基因組和動(dòng)物,尤其是,靈長類(包括黑猩猩)和人類。在大多數(shù)本發(fā)明的動(dòng)物應(yīng)用中,宿主是人類病人。然而獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用,在某些情況下,很可能利用本發(fā)明。
      II.藥用可接受的鹽和藥物前體在這里公開的每一種化合物都具有足夠的堿性或酸性以形成穩(wěn)定的非毒性酸或堿性鹽,將化合物以藥用可接受的鹽的形式給藥可能是適宜的。藥用可接受的鹽的例子是與酸一同形成的有機(jī)酸加成鹽,它形成生理上可以接受的陰離子,例如,甲苯磺酸鹽,甲磺酸鹽,醋酸鹽,檸檬酸鹽,丙二酸鹽,酒石酸鹽,琥珀酸鹽,苯酸鹽,抗壞血酸鹽,α-酮戊二酸,和α-甘油磷酸鹽。適合的無機(jī)鹽也可以形成,包括,硫酸鹽,硝酸鹽,碳酸氫鹽和碳酸鹽。
      藥用可接受的鹽可以通過使用在本領(lǐng)域中熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法取得,例如使用足夠堿性的化合物例如氨與提供生理上可接受的陰離子的適合的酸反應(yīng)。也可以制造羧酸的堿金屬(例如,鈉,鉀或者鋰)或者堿土金屬(例如鈣)鹽。
      “藥用可接受的藥物前體”指的是化合物經(jīng)過代謝,例如水解或者氧化,在宿主中形成目前發(fā)明中的化合物。藥物前體的典型的例子包括在活性化合物的功能部分具有生理上不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)的化合物。藥物前體包括可以被氧化、降解、氨基化、去氨基化、羧化、脫羧化、水解、去水、烷基化、去烷基、?;?、去?;⒘姿峄?、去磷酸化以生產(chǎn)活性化合物。藥用可接受的鹽包括那些起源于藥用可接受的無機(jī)或者有機(jī)堿或酸的鹽。合適的鹽包括那些起源于堿金屬例如鉀和鈉,堿土金屬例如鈣和鎂,在制藥學(xué)領(lǐng)域中熟知的的眾多種其它的酸。本發(fā)明的化合物可以具有抗病毒活性,或者經(jīng)代謝成為可以有此活性的化合物。
      任何一種在此描述的核苷可以當(dāng)作一種核苷藥物前體給藥以增加活性、生物利用度、穩(wěn)定性或者也可改變核苷的性質(zhì)。大量的核苷藥物前體配體是已知的。一般來說,對化合物的羥基或者核苷的單、二或三磷酸鹽進(jìn)行烷基化、酰化或者其它親脂性修飾將增加核苷的穩(wěn)定性。可以取代一個(gè)或多個(gè)磷酸部分上氫的取代基的例子是烷基、芳基、類固醇、碳水化和物,包括糖、1,2-二?;视秃痛碱悺.Jones和N.Bischofberger,Antiviral Research,27(1995)1-17描述了許多例子。任何這些都可以與公開的核苷結(jié)合使用以取得預(yù)想的效果。
      任何這里所描述的用于聯(lián)合和/或交替治療的化合物都可以作為一種?;幬锴绑w給藥,在這里名詞?;傅氖囚人狨ィ渲絮セ姆囚驶糠质菑闹辨湹?、分支的或者環(huán)狀的烷基或者低級烷基、烷氧烷基包括甲氧基甲基,芳烷基包括芐基,芳氧基烷基例如苯氧基甲基,芳基包括苯基,可選地被鹵素(例如F,Cl,Br或I),C1到C4烷基或者C1到C4烷氧基,磺酸酯例如烷基或者芳烷基磺?;淄榛酋;?,單、二或三磷酸鹽酯,三苯甲基或單甲氧基三苯甲基,取代的苯甲基,三烷基甲硅烷基(例如二甲基-t-丁硅烷基)取代。
      活性的核苷或者其它含羥基的化合物也可以作為醚酯提供(特別是核苷的5′-醚酯或者5′-磷醚酯),如以下參考所公開的,具體可以參考Kucera,L.S.,N.Iyer,et al.AIDS Res.Hum.Retro Viruses.6491-501;Piantadosi,C.,J.Marasco C.J.,et al.J.Med.Chenu.341408.1414;Hosteller,K.Y.,D.D.Richman,et al.Antimicrob.AgentsChenzotlaer. 362025.2029;Hostetler,K.Y.,L.M.Stuhmiller,et al.J.Biol.Chem.26561127。
      美國專利公開的合適的可以共價(jià)的引入含有核苷或者其它羥基或者氨基的化合物的親脂性取代基的非限制性例子,優(yōu)選核苷或親脂性制劑的5’-OH位點(diǎn),包括美國專利號5,149,794(Sep.22,1992,Yatvin etal.);5,194,654(Mar.16,1993,Hostetler et al.,5,223,263(June29,1993,Hostetler et al.);5,256,641(Oct.26,1993,Yatvin et al.);5,411,947(May 2,1995,Hostetler et al.);5,463,092(Oct.31,1995,Hostetler et al.);5,543,389(Aug.6,1996,Yatvin et al.);5,543,390(Aug.6,1996,Yatvin et al.);5,543,391(Aug.6,1996,Yatvin et al.);and 5,554,728(Sep.10,1996;Basava et al.),所有以上專利在此引入作為參考。公開了可以連接到當(dāng)前發(fā)明的核苷上的親脂性取代基,或者親脂性制劑的外國專利應(yīng)用,包括WO 89/02733,WO 90/00555,WO91/16920,WO 91/18914,WO 93/00910,WO 94/26273,WO 96/15132,EP 0 350 287,EP 93917054.4,和WO 91/19721。
      核苷藥物前體的非限制性例子在以下參考中描述Ho,D.H.W.(1973) Cancer Res.33,2816-2820;Holy,A.(1993)Isopolarphosphorous-modified nucleotide analogues,″InDe Clercq(Ed.),Advances in Antiviral Drug Design,Vol.I,JAI Press,pp.179-231;Hong,C.I.,Nechaev,A.,and West,C.R.(1979a)Biochein.Biopliys.Rs.Comniun.88,1223-1229;Hong,C.I.,Nechaev,A.,etal.(1980)J.Med.Cliein.28,171-177;Hosteller,K.Y.,Stuhmiller,L.M.et al.J.Biol.Chem.265,6112-6117;Hosteller,K.Y.,Carson,D.A.andRichman,D.D.(1991)J.Biol Claem.266,11714-11717;Hosteller,K.Y.,Korba,B.et al.(1994a)Antiviral Res.24,59-67;Hosteller,K.Y.,Richman,D.D.,et al.(1994b)Antimicrobial Agents Chemother.38,2792-2797;Hunston,R.N.,Jones,A.A.et al.(1984)J.Med.Chez.27,440-444;Ji,Y.H.,et al.(1990);J.Med.Chem.33 2264-2270;Jones,A.S.,McGuigan,C.,et al.(1984)J.Chem.Soc.Pef-kin Trafzs.1,1471-1474;Juodka,B.A.and Smrt,J.(1974)Coll.Czecla.Chem.Conafn.39,363-968;Kataoka,S.,Imai,J.,et al.(1989)Nucleic AcidsRes.Sym.Ser.21,1-2;Kataoka,S.,Uchida,Heterocycles 32,1351-1356;Kinchington,D.,Harvey,J.J.,et al.(1992)Antiviral Chez.Chemother.3,107-112;Kodama,K.,Morozumi,M.,et al.(1989)Jpn.J.Cancer Res.80,679-685;Korty,M.and Engels,J.(1979)Naunyn-Schmiedeberg′s Arch.P7zarmacol.310,103-111;Kumar,A.,Goe,P.L.,et al.(1990)J.Med.Chenu,33,2368-2375;LeBec,C.,and Huynh-Dinh,T.(1991)Tetrahedron Lett.32,6553-6556;Lichtenstein,J.,Barner,H.D.and Cohen,S.S.(1960)J.Biol.Chem.235,457-465;Lucthy,J.,Von Daeniken,A.,et al.(1981)Mitt.Geg.Lebensmittelunters.Hyg.72,131-133(Chem.Abstr.95,127093);McGigan,C.Tollerfield,S.M.and Riley,P.a.(1989)Nucleic Acids Res.17,6065-6075;McGuigan,C.,Devine,K.G.,et al.(1990a)Antiviral Chem.Chemother.1 107-113;McGuigan,C.,O’Connor,et al.(1990b)Antiviral Chem.Chemother.1,355-360;McGuigan,C.,Nicholls,S.R.,et al.(1990c)Antiviral Chem.Chemother.1,25-33;McGuigan,C.,Devin,K.G.,et al.(1991)“Antiviral Res.15,255-263;McGuigan,C.,Pathirana,R.N.,Balzarini,J.and DeClercq,E.(1993b)J.Med Chem.36,1048-1052.Antiviral Chem.Chemother.5,271-277;Meyer,R.B.,Jr.,Shuman,D.A.and Robins,R.K.(1973)Tetrahedron Lett.269-272;Nagyvary,J.Gohil,R.N.,Kirchner,C.R.and Stevens,J.D.(1973)BioChem.Biophys.Res.Commun.55,1072-1077;Namane,A.Gouyette,C.,etal.(1992)J.Med.Chem.35,3039-3044;Nargeot,J.Nerbonne,et al.(1983)Natl.Acad.Sci.U.S.A.80,2395-2399;Nelson,K.A.,Bentrude,W.G.et al.(1987)J.Am.Chem.Soc.109,4058-4064;Nerbonne,J.M.,Richard,S.,Nargeot,J.and Lester,H.A.(1984)Nature301,74-76;Neumann,J.M.,Herv,M.,et al.(1989)J.Am.Chem.Soc.111,4270-4277;Ohno,R.,Tatsumi,N.,et al.(1991)Oncology 48,451-455.Palomino,E.,Kessle,D.andHorwitz,J.P.(1989)J.Med.Chem.32,22-625;Perkins,R.M.,Barney,S.et al.(1993)Antiviral Res.20(Suppl.I).84;Piantadosi,C.,Marasco,C.J.,Jr.,et al.(1991)J.Med.Chem.34,1408-1414;Pompon,A.,Lefebvre,I.,Imbach,J.L.,Kahn,S.and Farquhar,D.(1994).Antiviral Chem Chemother.5,91-98;Postemark,T.(1974)Annu.Rev.Pharmacol.14,23-33;Prisbe,E.J.,Martin,J.C.M.,et al.(1986)J.Med.Chem.29,671-675;Pucch,F(xiàn).,Gosselin,G.,et al.(1993)Antiviral Res.22,155-174;Pugaeva,V.P.,Klochkeva,S.I.,Mashbits,F(xiàn).D.and Eizengart,R.S.(1969)Gig.Trf.Prof.Zabol.14,47-48(Chem.Abstr.72,212);Robins,R.K.(1984)Pharm.Res.11-18;Rosowsky,A.,Kim.S.H.,Ross and J.Wick,M.M.(1982)J.Med.Chem.25,171-178;Ross,W.(1961)BioChem.Pharm.8,235-240;Ryu,E.K.,Ross,R.J.Matsushita,T.,et al.(1982).J.Med.Chem.25,1322-1329;Saffhill,R.and Hume,W.J.(1986)Chem.Biol.Interact.57,347-355;Saneyoshi,M.,Morozumi,M.,et al.(1980)Chem Pharm.Bull.28,2915-2923;Sastry,J.K.,Nehete,P.N.,et al.(1992)Mol.Pharmacol.41,441-445;Shaw,J.P.,Jones,R.J.et al.(1994)“Oral bioavailability of PMEA from PMEA prodrugs in male Sprague-Dawley rats.”9th Annual AAPS Meeting.San Diego,CA(Abstract).Shuto,S.,Ueda,S.,Imamura,S.,F(xiàn)ukukawa,K.Matsuda,A.and Ueda,T.(1987)Tetrahedron Lett.28,199-202;Shuto,S.Itoh,H.,et al..(1988)Pharm.Bull.36,209-217.一個(gè)有用的磷酸藥物前體基團(tuán)的例子是S-酰基-2-硫代乙基,也可稱為“SATE”。
      III.藥用組合物宿主,特別是,遭受HBV帶來的痛苦或者暴露在B型肝炎病毒下的人們,可以給予有效劑量的L-FMAU和β-L-FTC治療,與某種免疫調(diào)節(jié)劑,例如TH1細(xì)胞因子,包括任何一種在此描述的干擾素,或者藥用可接受的鹽或其酯,聯(lián)合和/或者交替治療,任何一種可以單獨(dú)或者與藥用載體或稀釋劑聯(lián)合使用。活性物質(zhì)可以采用任何合適的途徑給藥,例如,經(jīng)口、腸外、腸內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、局部、經(jīng)鼻、經(jīng)直腸,用液相或固相。
      活性化合物被包含在藥用可接受載體或者稀釋劑內(nèi)以治療有效劑量給予病人,治療學(xué)有效劑量的化合物抑制病毒在體內(nèi)復(fù)制,特別是HBV復(fù)制,而不會在接受治療的病人引起嚴(yán)重的毒性效果。使用“抑制劑量”指的是活性成分足以產(chǎn)生在此描述的抑制效果的量,例如,這里描述的劑量。
      對于所有以上提到的條件,化合物的一個(gè)優(yōu)選的劑量都將在約1至50mg/kg的范圍內(nèi),優(yōu)選的為1至20mg/kg體重每天,更常用0.1mg至約100mg/kg接受者體重每天。藥用可接受的衍生物的有效劑量范圍可以基于目前需給予核苷的質(zhì)量計(jì)算出來。如果衍生物本身產(chǎn)生功效,有效劑量可以根據(jù)上述使用衍生物的質(zhì)量估計(jì),或者根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)人員的其他方法確定。
      化合物可以方便的根據(jù)任何合適的劑量形式為單位給藥,包括但不限于一個(gè)單位包含7到3000mg,優(yōu)選70到1400mg有效成分每單位劑量形式??诜┝繛?0到1000mg通常比較方便。
      理想地,至少一種有效成分,盡管優(yōu)選使用活性成分聯(lián)合治療,應(yīng)該給予可以取得大約0.2到70mM的活性化合物峰值血漿濃度的量,大約1.0到10mM為優(yōu)選。這可以通過,例如,通過靜脈注射0.1到10%活性成分的溶液,任選的生理鹽水取得,或者以活性藥物的藥丸給藥。
      此藥物組合物中的活性化合物的濃度將依賴于藥物的吸收、分布、代謝和排泄率以及本領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解的其它因素。應(yīng)當(dāng)指出劑量值也將根據(jù)需要醫(yī)治的情況的嚴(yán)重程度而變動(dòng)。另外應(yīng)當(dāng)指出的是出于任何特殊的目的,特殊的劑量計(jì)劃應(yīng)當(dāng)根據(jù)個(gè)體需要和管理或者監(jiān)督組合物給藥者的職業(yè)判斷隨時(shí)調(diào)整,此處提出的濃度范圍僅為典型的并且不建議限制所述組合物的范圍或者使用?;钚猿煞挚梢砸淮谓o藥,或者可以分為更小劑量在不同時(shí)間間隔給藥。
      一種FTC和L-FMAU的優(yōu)選的給藥方式為口服??诜M合物一般包括惰性稀釋劑和可食用的載體。它們可以被封閉在明膠膠囊中或者壓縮為片劑。為了達(dá)到口服治療性給藥的目的,活性化合物可以與賦形劑合并并以片劑、錠劑、或者膠囊的形式使用。藥用相容性結(jié)合藥劑,和/或佐劑材料可以作為組合物的一部分包括在內(nèi)。
      片劑、藥丸、膠囊、錠劑和類似物可以包含任何以下成分,或者近似天然的化合物結(jié)合劑例如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠;賦形劑例如淀粉或者乳糖,裂解劑例如藻酸、Primogel、或者谷物淀粉;潤滑劑例如硬脂酸鎂或者Sterotes;助流劑例如二氧化硅膠體;甜味劑例如蔗糖或者糖精;或者調(diào)味劑例如胡椒粉、甲基水楊酸、或者桔味香料。當(dāng)劑量單位形式為膠囊時(shí),它可以包含,作為上述類型材料的補(bǔ)充,液相載體例如脂肪油。另外,劑量單位形式可以包含不同其它可以塑造劑量單位物理形狀的材料,例如,糖衣、蟲膠、或者其它腸劑。
      化合物可以用酏劑、懸液、糖漿、包藥干糊片、口香糖或者類似方式給藥。糖漿可能包含,作為活性化合物的補(bǔ)充,蔗糖作為甜味劑和某種防腐劑、染料和色素和香味劑。
      化合物或者它們的藥用可接受的衍生物或者其鹽也可以與其它不會破壞預(yù)定活性的活性材料混合,或者與補(bǔ)充預(yù)定活性的材料合用,例如抗生素、抗真菌藥、抗炎癥藥、蛋白酶抑制劑,或者其它核苷或者非-核苷抗病毒劑,如上更詳細(xì)描述的。用于胃腸外的、皮內(nèi)的、皮下的、或者局部應(yīng)用的溶液或者懸液可以包括以下成分無菌稀釋劑例如注射用水、生理鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙烯二醇或者其它合成溶劑;抗菌劑例如苯甲醇或者甲基苯甲酸酯類;抗氧化劑例如抗壞血酸或者硫酸氫鈉;螯合劑例如乙烯基二氨基四乙酸;緩沖劑例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或者磷酸鹽和調(diào)節(jié)張性的試劑例如氯化鈉或者葡萄糖。胃腸外制劑可以裝入安瓿、一次性注射器或者多種劑量的玻璃或塑料小瓶中。如果靜脈內(nèi)給藥,優(yōu)選的載體為生理鹽水或者磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。
      如果使用鼻腔氣霧劑或吸入給藥,這些組合物根據(jù)制藥學(xué)制劑領(lǐng)域中熟知的技術(shù)準(zhǔn)備并可以通過以下形式準(zhǔn)備鹽水溶液、溶于苯甲醇或者其它合適的防腐劑,使用吸收增強(qiáng)劑以提高生物利用度,碳氟化合物、和/或其它本領(lǐng)域中已知的溶解劑或分散劑。
      如果以栓劑形式直腸給藥,這些組合物可以與合適的非起始賦形劑混合而制備,例如可可油、常溫下為固體但是在直腸腔內(nèi)放置會液化和/或溶解的聚乙二醇的合成甘油酯。
      在一種實(shí)施方案中,一種或多種活性化合物可以用可保護(hù)這些組合物防止其從體內(nèi)迅速清除的載體制備,例如控釋配方,包括植入和微膠囊輸送系統(tǒng)??梢允褂蒙锟山到獾?、生物相容性多聚物,例如乙烯乙酸乙烯酯、多酐、聚乙二醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這些配方的方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。材料也可以通過商業(yè)途徑從Alza Corporation取得。
      脂質(zhì)體懸液(包括具有抗病毒病毒抗原單克隆抗體、靶向感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)作為藥用可接受的載體亦為優(yōu)選。這些可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的方法制備,例如,美國專利號4,522,811所描述的(在此全部引入作為參考)。例如,脂質(zhì)體制劑可以用以下方法制備在無機(jī)溶劑中溶解合適的脂類(例如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰膽堿、arachadoyl卵磷脂、和膽固醇)的方法,溶劑蒸發(fā)后在容器表面留下一層干脂薄膜。然后在容器中加入活性化合物或者其單磷酸鹽、二磷酸鹽、和/或三磷酸鹽衍生物的水溶液。然后手工旋轉(zhuǎn)容器以使脂質(zhì)從容器壁上脫落并使聚集的脂粒分散,由此形成脂質(zhì)體懸液。
      本發(fā)明的組合物可以與一種或更多以下物質(zhì)聯(lián)合和/或交替使用其它抗病毒、抗HIV、抗HBV、抗HCV或者抗皰疹試劑或干擾素、抗癌、抗增生或抗細(xì)菌劑,包括本發(fā)明的其它化合物。本發(fā)明的某些化合物可能會通過降低代謝作用、分解代謝或者其它化合物的失活增強(qiáng)本發(fā)明的某些化合物的活性,因此照此用藥以取得更好療效。
      通常,在交替治療中,每種藥物按照有效劑量順次給藥,然而在聯(lián)合治療中,兩種或更多藥物按有效劑量一起給藥。這些藥物的劑量將根據(jù)每種藥物吸收、生物-分布、代謝和排泄率等情況以及其它本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的因素確定。應(yīng)當(dāng)指出劑量值也要根據(jù)需要緩解的情況的嚴(yán)重程度而調(diào)整。更應(yīng)當(dāng)指出對于每種特殊情況,藥物特定的劑量和計(jì)劃將根據(jù)個(gè)體的需要和管理或監(jiān)督組合物使用者的專業(yè)判斷而被隨時(shí)調(diào)整。合適的劑量范圍的例子可以在科學(xué)文獻(xiàn)和醫(yī)師案頭參考中找到。在這里提及的很多其它化合物的合適劑量范圍的例子也可以在公共文獻(xiàn)中找到或可以使用已知的程序鑒定。這些劑量范圍可以根據(jù)需要取得的結(jié)果做調(diào)整。
      IV.基因治療該項(xiàng)發(fā)明的另一個(gè)方面是應(yīng)用體內(nèi)基因治療方法以導(dǎo)入免疫調(diào)節(jié)劑與兩種或更多的抗HBV藥物聯(lián)合和/或交替作用,以不同的作用方式和/或協(xié)同效應(yīng)來治療HBV?;蛑委煼椒ㄉ婕皩⒑怂?DNA,RNA和反義DNA或RNA)序列可操作地連接于啟動(dòng)子和/或某個(gè)能使靶組織表達(dá)該序列的基因成分上并導(dǎo)入宿主,如某個(gè)動(dòng)物,尤其是人體內(nèi),以增加免疫調(diào)節(jié)劑的表達(dá)。這樣的基因治療和導(dǎo)入技術(shù)和方法在本領(lǐng)域中是較為普遍的,參見例子,WO 90/11092,WO 98/11779;U.S.Pat.No.5,693,622,5,705,151,5,580,859;Tabata H.et al.(1997)Cardiovasc.Res.35(3)470-479,Chao J et al.(1997)Pharmacol.Res.35(6)517-522,Wolff J.A.(1997)Neuromuscul.Disord.7(5)314-318,Schwartz B.et al.(1996)Gene Ther.3(5)405-411,Tsurumi Y.et al.(1996)Circulation 94(12)3281-3290。
      用于基因治療方法的多肽載體構(gòu)建體優(yōu)選不會整合入宿主的基因組,也不包括可復(fù)制序列。任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉的強(qiáng)啟動(dòng)子都可用于啟動(dòng)DNA的表達(dá)。
      多肽構(gòu)建體可通過任何可將可注射物質(zhì)導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的方法導(dǎo)入,如注入組織間隙(心臟、肌肉、皮膚、肺、肝臟、腸道等)。多肽結(jié)構(gòu)載體可通過藥用可接受的液體或液相載體遞送。
      多肽結(jié)構(gòu)載體可導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)的組織間隙,包括肌肉、皮膚、腦、肺、肝臟、脾臟、骨髓、胸腺、心臟、淋巴、血液、骨、軟骨、胰腺、腎臟、膽囊、胃、腸道、睪丸、卵巢、子宮、直腸、神經(jīng)系統(tǒng)、眼、腺體和結(jié)締組織。組織間隙包括細(xì)胞間液,組織器官網(wǎng)狀纖維間的粘多糖基質(zhì),血管或小室壁的彈性纖維,纖維組織的膠原纖維,或與包裹肌細(xì)胞的結(jié)締組織或骨陷窩中相同的基質(zhì)。類似的,該間隙充滿循環(huán)中的血漿和淋巴管中的淋巴液。它們可以很方便的注入包含這些細(xì)胞的組織中。它們優(yōu)先被導(dǎo)入并表達(dá)于持久的、不分裂的、已經(jīng)分化的細(xì)胞中,雖然在未分化和分化較不完全的細(xì)胞中也可導(dǎo)入并表達(dá),如血液中的干細(xì)胞或皮膚中的纖維母細(xì)胞。
      在該發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中,將基因改造表達(dá)免疫調(diào)節(jié)劑的細(xì)胞注入人體內(nèi)。這樣的細(xì)胞可來自患者或MHC相容的供者,可包括但又不限于纖維母細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、血細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞)、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。這些細(xì)胞在體外通過重組DNA技術(shù)改造以產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)多肽的編碼序列,或者通過轉(zhuǎn)導(dǎo)(使用病毒載體,并且優(yōu)先使用可將轉(zhuǎn)導(dǎo)基因整合入基因組的載體)或轉(zhuǎn)染操作,包括但不僅限于使用質(zhì)粒、粘粒、YACs、裸露DNA、電穿孔、脂質(zhì)體等。免疫調(diào)節(jié)劑的編碼序列受控于一個(gè)強(qiáng)的組成性或誘導(dǎo)性表達(dá)的啟動(dòng)子或啟動(dòng)/增強(qiáng)子,以實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)劑的表達(dá)及優(yōu)先實(shí)現(xiàn)其分泌。經(jīng)過改造的表達(dá)并優(yōu)先分泌免疫調(diào)節(jié)劑的細(xì)胞可導(dǎo)入患者全身,如經(jīng)過循環(huán)系統(tǒng)或腹腔內(nèi)注射。
      另外也可將細(xì)胞植入基質(zhì)埋于人體內(nèi),如基因改造的內(nèi)皮細(xì)胞可作為淋巴或血管移植物的一部分植入。(參見,例如,Anderson et al.U.S.Pat.No.5,399,349;and Mulligan &amp; Wilson,U.S.Pat.No.5,460,959)。
      當(dāng)注入細(xì)胞為非自體或MHC不相容的細(xì)胞時(shí),可通過使用熟知的技術(shù)避免宿主產(chǎn)生針對導(dǎo)入細(xì)胞的免疫反應(yīng)。例如,可以膠囊的形式導(dǎo)入細(xì)胞,這樣既使得其內(nèi)容物可以和周圍的細(xì)胞外環(huán)境發(fā)生交換,又避免了導(dǎo)入細(xì)胞被宿主的免疫系統(tǒng)所識別。
      可通過包含核酸、基因或基因片段的感染性病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)免疫調(diào)節(jié)劑的真核細(xì)胞包括,但不僅限于原始細(xì)胞,如原始有核血細(xì)胞,如白細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(包括T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞)、全能干細(xì)胞和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL細(xì)胞);骨髓細(xì)胞;內(nèi)皮細(xì)胞;上皮細(xì)胞;角質(zhì)形成細(xì)胞;干細(xì)胞;肝細(xì)胞,包括肝細(xì)胞前體細(xì)胞;纖維母細(xì)胞;間充質(zhì)細(xì)胞;間皮細(xì)胞;和實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
      在一個(gè)實(shí)施方案中,細(xì)胞被導(dǎo)入一個(gè)特定的部位,由此細(xì)胞在這樣的部位發(fā)揮治療作用?;蛘卟粚⒓?xì)胞導(dǎo)入特定部位,而令其發(fā)揮全身性的治療作用。
      轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞可用于,例如,通過導(dǎo)入宿主細(xì)胞治療HBV,如從患者取出的血細(xì)胞在體外培養(yǎng)擴(kuò)增,與本發(fā)明一致的包含編碼免疫調(diào)節(jié)劑基因的感染性病毒顆粒。細(xì)胞可以在含有目的基因的感染性病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)前或后進(jìn)行數(shù)量上的擴(kuò)增。這樣,該操作方式在向患者體內(nèi)注入轉(zhuǎn)化細(xì)胞時(shí),這些細(xì)胞會在患者體內(nèi)產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)劑。
      轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞攜帶的基因或核酸特異性的包含編碼免疫調(diào)節(jié)劑的序列,但還可能包含任何直接或間接增強(qiáng)細(xì)胞的治療作用的序列。轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞攜帶的基因還可以包括使轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生它一般情況下不可能具有的治療作用的序列,如編碼對于治療血友病有益的凝集因子的基因。該基因可編碼一個(gè)或多個(gè)有治療作用的產(chǎn)物。適宜基因或核酸的例子包括那些編碼細(xì)胞因子如TNF、白介素(白介素1-14)、干擾素(α、β、γ-干擾素)、T細(xì)胞受體蛋白和抗體的抗原結(jié)合區(qū)Fc受體,如免疫球蛋白。其他的適宜基因的例子還包括改造細(xì)胞將其導(dǎo)入一般情況下該細(xì)胞不會進(jìn)入的部位的基因,由此使在該部位利用細(xì)胞的治療性質(zhì)成為可能。例如,血細(xì)胞如TIL細(xì)胞可加以改造,例如,通過向細(xì)胞內(nèi)引入一個(gè)單克隆抗體的Fab部分,使細(xì)胞能夠識別特定的抗原。
      通常使用載體將核酸導(dǎo)入細(xì)胞,但這并不是必需的?;蛑委熤凶畛S玫妮d體類型為病毒??茖W(xué)家利用病毒作為載體因?yàn)樗鼈兙哂羞M(jìn)入細(xì)胞DNA的獨(dú)特能力?;蛑委熤杏米鬏d體的病毒是基因滅活的,它們不能進(jìn)行自我復(fù)制。絕大多數(shù)基因治療臨床研究依賴鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入目的基因。其他作為載體的病毒包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、痘病毒和皰疹病毒。
      例如,從患者取出細(xì)胞并在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)。將細(xì)胞暴露于攜帶目的基因的病毒。病毒進(jìn)入細(xì)胞,目的基因成為細(xì)胞DNA的一部分。繼續(xù)在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)細(xì)胞,然后將其轉(zhuǎn)回患者體內(nèi)。這一類的基因治療叫做體外基因治療,即“在身體外進(jìn)行”?;虮晦D(zhuǎn)入患者的細(xì)胞而該細(xì)胞卻在患者的體外。在其他一些研究中,載體或脂質(zhì)體(脂肪顆粒)被用于在患者體內(nèi)將目的基因?qū)爰?xì)胞。這一類的基因治療叫做體內(nèi)基因治療,因?yàn)榛蛟诨颊唧w內(nèi)被轉(zhuǎn)入細(xì)胞。
      當(dāng)使用病毒載體攜帶基因?qū)塍w內(nèi)時(shí),它們可能影響比預(yù)期更多的細(xì)胞。另一個(gè)危險(xiǎn)是新的基因可能插入DNA中錯(cuò)誤的位置,可能導(dǎo)致癌癥或其他的危險(xiǎn)。另外,當(dāng)直接注入DNA時(shí),或當(dāng)使用脂質(zhì)體導(dǎo)入系統(tǒng)時(shí),DNA可能被導(dǎo)入生殖細(xì)胞中,產(chǎn)生可遺傳性的改變。
      其他需要關(guān)注的方面包括轉(zhuǎn)入基因“過表達(dá)”的可能性,產(chǎn)生過多的缺失蛋白以致于產(chǎn)生危害;病毒載體可能引起炎癥或免疫反應(yīng);以及病毒可能從患者傳播到其他個(gè)體或環(huán)境中。
      本領(lǐng)域中已知有許多種載體。任何已知載體都可用于本發(fā)明。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中,載體可攜帶特異的基因進(jìn)入特定類型的細(xì)胞。
      腺病毒載體任何腺病毒載體可被用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞和/或細(xì)胞系以表達(dá)和/或分泌免疫調(diào)節(jié)劑。腺病毒為無包膜病毒,基因組為線性雙鏈DNA。雖然腺病毒的血清型超過40種,其中絕大多數(shù)引起人類良性呼吸道感染,但C亞群血清型2或5主要被用作載體。生命周期一般不涉及整合入宿主基因組,而是它們作為附加成分在宿主細(xì)胞核中復(fù)制,因此沒有產(chǎn)生插入突變的危險(xiǎn)。野生型腺病毒基因組大約35kb長,其中約30kb可為外來DNA代替(Smith,1995,Verma and Somia,1997)。有四個(gè)早期轉(zhuǎn)錄單位(E1、E2、E3和E4)具有調(diào)節(jié)功能,還有一個(gè)晚期轉(zhuǎn)錄單位編碼結(jié)構(gòu)蛋白。原始載體的E1或E3基因失活,缺失基因以反式由輔助病毒、質(zhì)?;蛘先胼o助細(xì)胞基因組提供(人類胚胎腎細(xì)胞,293細(xì)胞系,Graham,F(xiàn).L.,Smiley,J.,Russell,W.L.and Nairn,R.(1997).General Virology 3659-72.)。第二代載體另外還利用了E2a溫度敏感變異株(Engelhardt,J.F.,Litsky,L.,and Wilson,J.M.(1994).Human Gene Therapy 51217-1229.)或E4缺失變異株(Armentano,D.,Zabner,J.,et al.(1997).Journal of Virology 712408-2416.)。最近的“無腺病毒”載體只包含反向末端重復(fù)序列(ITRs)和圍繞轉(zhuǎn)基因的組裝序列,所有必需的病毒基因都以反式由輔助病毒提供(Chen,H.,Mack,L.M.,Kelly,R.,et al.(1997).Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the U.S.A.941645-1650.)。
      腺病毒載體對于在體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞非常有效,并能以高滴度產(chǎn)生(>1011/mL).除了Geddes,B.J.,Harding,T.C.,Lightman,S.L.and Uney,J.B.(1997).Nature Medicine 31402-1404以外.),他報(bào)道了利用E1缺失載體使大鼠腦內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)間延長,原始載體體外表達(dá)轉(zhuǎn)基因傾向于是瞬時(shí)的(Verma,I.M.and Somia,N.(1997).Gene therapy-promises,problems and prospects.Nature 389239-242.)。靜脈內(nèi)注射后,注入載體中90%通過非免疫調(diào)節(jié)方式在肝內(nèi)降解(Worgall,S.,Wolff,G.,F(xiàn)alckPedersen,E.and Crystal R.G.(1997).Human Gene Therapy 837-44.)。此后,產(chǎn)生MHC I類分子限制性免疫反應(yīng),利用CD8+CTLs消除病毒感染細(xì)胞,CD4+細(xì)胞分泌α-干擾素,導(dǎo)致抗腺病毒抗體的產(chǎn)生(Yang,Y.and Wilson,J.M.(1995).Journal of Immunology 1552564-2569.)。腺病毒載體的改變可消除一些CTL表位,但識別的表位與宿主MHC單體型不同(Sparer,T.E.,Wynn,S.G.,Clarket al.(1997).Journal of Virology 712277-2284.Jooss,K.,Ertl,H.C.J.and Wilson,J.M.(1998).Journal of Virology 722945-2954.)。在那些未被破壞的細(xì)胞中的其余的載體,其啟動(dòng)子失活(Armentano,D.,Zabner,J.,et al.(1997).Journal of Virology 712408-2416.)并且持續(xù)存在的抗體阻止了接下來載體的注入。
      避免免疫反應(yīng)的涉及瞬時(shí)免疫抑制療法的方法在延長基因表達(dá)和實(shí)現(xiàn)次級基因轉(zhuǎn)移方面已取得成功(Jooss,K.,Yang,Y.and Wilson,J.M.(1996).Human Gene Therapy 71555-1566.Kay,M.A.,Meuse,L.,et al.(1997).Proceedings of tlte National Academy of Sciences of the U.S.A.944686-4691)。另一種干涉較少的方法通過給宿主服用紫外線滅活的載體產(chǎn)生口服耐藥性(Kagami,H.,Atkinson,J.C.,et al.(1998).Human Gene Therapy 9305-313.)。然而,人們更希望能夠操縱載體而不是宿主。雖然只使用復(fù)制缺陷載體,仍有很低水平的病毒蛋白表達(dá)并被提呈給免疫系統(tǒng)。發(fā)展包含更少基因的載體,以至于不包含任何病毒編碼序列的“無腺病毒”載體,使肝組織內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)間延長(Schiedner,G.,Morral,N.,et al.(1998).Nature Genetics 18180-183.)。最初的導(dǎo)入是利用腺病毒蛋白包裹大量的DNA,其中絕大部分被降解并提呈給免疫系統(tǒng),從而影響了臨床研究。另外,人群MHC單體型具有異質(zhì)性,并且人群中的一部分已經(jīng)暴露于該腺病毒株(Gahry-Sdard,H.,Molinier-Frenkel,V.,et al.(1997).Journal ofClinical Investigation 1002218-2226.)直到最近,對腺病毒選擇性作用于宿主細(xì)胞的機(jī)制的認(rèn)識仍然很少。因此只有通過使用細(xì)胞啟動(dòng)子/增強(qiáng)子,如肌球蛋白輕鏈1啟動(dòng)子(Shi,Q.,Wang,Y.and Worton,R.(1997).Human gene therapy 8403-410.)和平滑肌細(xì)胞SM22a啟動(dòng)子(Kim,S.,Lin,H.,et al.(1997).Jounzal of clinical investigation 1001006-1014),或通過直接導(dǎo)入特定部位(Rome,J.J.,Shayani,V.,et al.(1994).Human Gene therapy 51249-1258)來實(shí)現(xiàn)組織特異性表達(dá)。已知腺病毒顆粒的攝取過程分為兩步,包括最初的腺病毒內(nèi)的纖維膜(coat)蛋白和某個(gè)或某些細(xì)胞受體相互作用,其中包括MHC I類分子(Hong,S.S.,Karayan,L.,et al.(1997).EMBO Journal 162294-2306.)和柯薩奇病毒-腺病毒受體(Bergelson,J.M.,Cunningham J.A.,et al.(1997).Science 2751320-1323.)。接下來,腺病毒顆粒的五聚體堿性蛋白結(jié)合整合素家族細(xì)胞表面異二聚體(Wickliam,T.J.,Mathias,P.,et al.(1993).Cell 73309-319.),通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用實(shí)現(xiàn)內(nèi)化。雖然絕大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)腺病毒纖維膜蛋白的原始受體,但內(nèi)化過程是更有選擇性的(Harris,J.D.and Lemoine,N.R.(1996).Trends in Genetics 12400-404.)。增加病毒攝取的方法包括刺激靶細(xì)胞表達(dá)合適的整合素(Davison,E.,Diaz,R.M.,et al.(1997)Journal of Virology 716204-6207.)及與腺病毒特異性靶細(xì)胞的抗體偶聯(lián)(Wickhain,T.J.,Lee,G.M,et al.(1997b).Journal of Virology 717663-7669.Goldman,C.K.,Rogers,B.E.,et al.(1997).Cancer Research 571447-1451)。但抗體的使用增加了載體生產(chǎn)的困難及激活補(bǔ)體系統(tǒng)的潛在危險(xiǎn)性。通過向纖維膜蛋白插入受體結(jié)合基序,Wickham等人(Wickham,T.J.,Tzeng,E.,et al.(1997a).Journal of Virology 718221-8229.)得以將病毒重新導(dǎo)向與受損內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞表達(dá)的整合素,或許多細(xì)胞類型都表達(dá)的硫酸肝素受體結(jié)合。
      任何腺相關(guān)病毒載體都可被用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞和/或細(xì)胞系以表達(dá)和/或分泌免疫調(diào)節(jié)劑。腺相關(guān)病毒(AAV)為非致病性人類細(xì)小病毒,依賴于輔助病毒,通常為腺病毒,進(jìn)行增殖。它們可感染分裂和不分裂細(xì)胞,無需輔助病毒即可以很高的頻率整合進(jìn)入宿主基因組的特定位置(19q 13-qter)(Kotin,R.M.,Siniscalco,M.,et al.(1990).Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A.872211-2215.)。野生型基因組為單鏈DNA分子,由兩個(gè)基因構(gòu)成;rep編碼控制病毒復(fù)制、結(jié)構(gòu)基因表達(dá)和整合入宿主基因組的蛋白質(zhì),而cap編碼衣殼結(jié)構(gòu)蛋白。在基因組的任一端為145bp的末端重復(fù)序列,包含了啟動(dòng)子。
      當(dāng)用作載體時(shí),rep和cap基因由轉(zhuǎn)基因及其相關(guān)調(diào)節(jié)序列代替。插入序列的總長度不能超過4.7kb很多,即野生型基因組的長度(Smith,A.E.(1995).Annual Review of Microbiology 49807-838.)。重組載體的產(chǎn)生要求rep和cap反式排列,同時(shí)還需有輔助病毒基因產(chǎn)物(腺病毒基因組的E1a、E1b、E2a、E4和VA RNA)。常規(guī)方法為共轉(zhuǎn)染兩個(gè)質(zhì)粒,一個(gè)提供載體,另一個(gè)提供rep和cap基因,到感染了腺病毒的細(xì)胞293中(Samulski,R.J.,Chang,L.,and Shenk,T.(1989).Journal of Virology 633822-3828.)。然而這種方法非常麻煩,其產(chǎn)率很低(<104病毒顆粒/ml)并易于被腺病毒和野生型AAV污染。低產(chǎn)率的原因之一為rep基因產(chǎn)物對腺病毒復(fù)制的抑制效應(yīng)(Vincent,K.A,Piraino,S.T.and Wadsworth,S.C.(1997).Journal of Virology711897-1905.)。新的方法去除了所有腺病毒結(jié)構(gòu)基因并使用抗rep質(zhì)粒(Xiao,X.,Li,J.and Samulski,R.J.(1998)Journal of Virology 722224-2232.)或于感染前將表達(dá)rep的質(zhì)粒連接于成熟病毒(Fisher,K.J.,Kelley,W.M,Burda,J.F.and Wilson,J.M.(1996)Human GeneTherapy 72079-2087.)。
      一旦末端重復(fù)序列被輕度降解,無rep基因的AAV載體只能作為單一前病毒或頭尾連環(huán)體發(fā)生隨機(jī)整合(Rutledge,E.A.and Russell,D.W.(1997).Journal of Virology 718429-8436.)。對AAV載體的關(guān)注源自其整合入宿主基因組后使轉(zhuǎn)基因的表達(dá)時(shí)間延長。已經(jīng)報(bào)道當(dāng)轉(zhuǎn)基因來自非同種屬時(shí),基因轉(zhuǎn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞(Maeda,Y.,Ikeda,U.,et al.(1997).Cardiovascular Research 35514-521.)、橫紋肌細(xì)胞(Fisher,K.J.,Jooss,K.,et al.(1997).Nature Medicine 3306-316.Herzog,R.W.,et al.(1997).Proceedings of the National Academy ofSciences of the U.S.A.945804-5809.)和肝細(xì)胞(Snyder,R.O.,Miao,C.H.,et al.(1997).Nature Genetics 16270-275.)后表達(dá)時(shí)間延長。AAV衣殼的中和抗體可能可檢測到,但并不阻止再次施用載體或關(guān)閉啟動(dòng)子活性??赡苡捎诓《疽職さ暮唵涡?,引發(fā)的免疫反應(yīng)很弱。AAV抗體在人群中的出現(xiàn)需要進(jìn)一步的研究。除了局部載體導(dǎo)入外沒有其他選擇性作用于特定細(xì)胞類型的嘗試。
      特別的,在美國專利號為5,693,531的專利中公開的腺相關(guān)病毒載體,在此引入作為參考,可被使用,包括AAVp5neo;pSV-β-半乳糖苷酶;TRF169;LZ11;pSP72;pSP72nLacZ;pAdRSV4;pAdRSVnLacZ;AAVrnLac;SV40;pBluescriptSK;pSV40 ori AAV1;和pKMT11。
      逆轉(zhuǎn)錄病毒載體任何逆轉(zhuǎn)錄病毒可被用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞和/或細(xì)胞系以表達(dá)和/或分泌免疫調(diào)節(jié)劑。逆轉(zhuǎn)錄病毒是一類包膜病毒,含有單鏈RNA分子作為基因組。感染后,病毒基因組逆轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA,并整合入宿主基因組,表達(dá)為蛋白。病毒基因組約為10kb,包括至少三個(gè)基因gag(編碼核心蛋白),pol(編碼逆轉(zhuǎn)錄酶)和env(編碼病毒包膜蛋白)。基因組的任何一端為長末端重復(fù)序列(LTRs),其中包括啟動(dòng)子/增強(qiáng)子區(qū)和涉及整合的序列。另外還有包裝病毒DNA(psi)所需序列和env基因中的RNA剪切位點(diǎn)。一些逆轉(zhuǎn)錄病毒包括原癌基因,這些基因發(fā)生突變時(shí)可導(dǎo)致癌癥的發(fā)生,但在制備載體時(shí),這些基因都將被去除。逆轉(zhuǎn)錄病毒可通過整合入細(xì)胞原癌基因附近并促進(jìn)LTR的不適宜表達(dá),或干擾抑癌基因而轉(zhuǎn)化細(xì)胞。這一事件,稱為插入突變,雖然非常罕見,但在使用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體時(shí)仍有可能發(fā)生。
      逆轉(zhuǎn)錄病毒常在莫洛尼氏白血病毒(Mo-MLV)的基礎(chǔ)上構(gòu)建,后者為兩生性病毒,同時(shí)能感染小鼠細(xì)胞(使載體能在小鼠模型中發(fā)展)和人類細(xì)胞(使針對人類的治療成為可能)。病毒基因(gag、pol和env)由人們感興趣的轉(zhuǎn)基因替代并表達(dá)于包裝細(xì)胞系中的質(zhì)粒。因?yàn)榉潜匦杌蛉狈Πb序列(psi),他們不包括于病毒顆粒中。為了避免重組形成具有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒,所有與載體骨架同源的區(qū)域都應(yīng)被去除,并且非必需基因應(yīng)被至少兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位表達(dá)(Markowitz,D.,Goff,S.and Bank,A.(1988).A safe packaging linefor gene transferseparating viral genes on two differentplasmids.Journal of Virology 621120-1124.)。即便如此,仍有很低頻率的具有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒產(chǎn)生。
      必需區(qū)域包括5’和3’LTRs,包裝序列位于5’LTR的下游。轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可由5’LTR內(nèi)的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子區(qū)或選擇性的由病毒(如巨細(xì)胞病毒,Rous肉瘤病毒)或細(xì)胞(如β肌動(dòng)蛋白,酪氨酸)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。突變分析顯示在不影響病毒包裝或轉(zhuǎn)基因表達(dá)的條件下,幾乎整個(gè)gag編碼區(qū)和鄰接的上游區(qū)域都可被去除(Kim,S.H.,Yu,S.S.,et al.(1998).Journal of Virology 72994-1004.)。但轉(zhuǎn)基因起始密碼子的具體位置及5’LTR的小的改變都會影響轉(zhuǎn)基因的表達(dá)(Rivire,I.,Brose,K.and Mulligan,R.C.(1995).Proceedings of the NationalAcade7ny of Sciences of t7ze U.S.A.926733-6737.)。為了協(xié)助發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞,篩選標(biāo)記(如新霉素和β半乳糖苷酶)可被包括入并且轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可通過加入內(nèi)部核糖體位點(diǎn)而增加(Saleh,M.(1997).Human Gene Tlterapy 8979-983.)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可實(shí)現(xiàn)的攜帶能力約為7.5kb(Verma,I.M.and Somia,N.(1997).Nature 389239-242.),而即使是在使用cDNA的情況下,這一攜帶能力對于很多基因來說仍然太小。
      逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜與特定的細(xì)胞蛋白反應(yīng)來確定靶細(xì)胞的范圍。已經(jīng)證實(shí)改變env基因或其產(chǎn)物可成功操控這一范圍。具體方法包括對包膜蛋白和細(xì)胞受體結(jié)合部位的直接修飾,但這些步驟似乎會影響接下來的病毒顆粒內(nèi)化(Harris,J.D.and Lemoine,N.R.(1996).Trendsin Genetics 12400-404.)。通過以紅細(xì)胞生成素蛋白(EPO)的150個(gè)密碼子替代env基因的一部分,Kasahara等人(Kasahara,N.,Dozy,A.M.and Kan,Y.W.(1994).Science 2661374-1376.)構(gòu)建的病毒顆粒能以很高的親和力作用于具有EPO受體的細(xì)胞。連接抗體于病毒顆粒,抗體通過鏈親和素橋?qū)Φ诙€(gè)細(xì)胞特異性抗體產(chǎn)生親和力,增加了病毒的攝取,但內(nèi)化傾向于導(dǎo)致病毒降解(Roux,P.,Jeanteur,P.,and Piechaczyk,M.(1989).Proceedings of the National Academy ofSciences USA 869079-9083.)。Neda等人(Neda,H.,Wu,C.H.,andWu.G.Y.(1991)The Journal of Biological Chenaistry 26614143-14146.)以乳糖處理病毒顆粒導(dǎo)致表達(dá)唾液酸糖蛋白受體的細(xì)胞攝取病毒顆粒,主要為肝細(xì)胞。接下來病毒轉(zhuǎn)基因高效表達(dá),可能由于內(nèi)涵體的酸化使病毒包膜與內(nèi)涵體膜得以相互融合。
      病毒根據(jù)其趨化性不同而不同,因此在一種叫做假型的技術(shù)中以另一種病毒的env基因取代一種病毒的env基因?qū)U(kuò)展其宿主范圍。皰疹性口炎病毒G蛋白被包括入Mo-MLV衍生載體(Burns,J.C.,Matsubara,T.,et al.(1994).Developmental Biology 165285-289.),該載體同樣在以超離心方法純化更為穩(wěn)定。最近,Qing(Qing,K.,Bachelot,T.,Mukherjee,P.,et al.(1997).Journal of Virology 715663-5667.)通過首先以表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白的細(xì)胞受體的腺相關(guān)病毒載體(討論如下)處理受體細(xì)胞改良了向許多細(xì)胞系轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法。
      逆轉(zhuǎn)錄病毒整合和表達(dá)病毒基因需要靶細(xì)胞進(jìn)行分裂。這就將基因治療限制于體內(nèi)或體外的增殖細(xì)胞,由此細(xì)胞從體內(nèi)移出,處理以刺激復(fù)制,然后用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo),最后轉(zhuǎn)回患者體內(nèi)。由于暴露于高滴度的病毒和生長因子,細(xì)胞在體外能夠更為有效的被轉(zhuǎn)導(dǎo)(Glimm,H.,Kiem,H.P.,et al.(1997).Human Gene T7zerapy 82079-2086.)。此外,體外處理的腫瘤細(xì)胞會與腫瘤結(jié)合并發(fā)揮腫瘤殺傷效應(yīng)(Oldfield,E.H.and Ram,Z.(1995).Human Gene Therapy655-85.;Abdel-Wahab,Z.,Weltz,C.,et al.(1997).Cancer 80401-412.)。
      慢病毒為逆轉(zhuǎn)錄病毒的一個(gè)亞類,可感染增殖和非增殖細(xì)胞。它們較簡單逆轉(zhuǎn)錄病毒更為復(fù)雜,還包含其他6個(gè)蛋白,tat、rev、vpr、vpu、nef和vif。目前包裝細(xì)胞系已將質(zhì)粒分離為假分型env基因、轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體和以反式提供結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)基因的包裝構(gòu)建體(Naldini,L.,Blmer,U.,et al.(1996).Scienee 272263-267)。利用標(biāo)記基因的早期結(jié)果很有價(jià)值,顯示在體內(nèi)肌肉、肝臟和神經(jīng)組織中的表達(dá)時(shí)間延長(Blmer,U.,Naldini,L.,et al.(1997).Journal of Virology 716641-6649.;Miyoshi,H.,Takahashi,M.,Gage,F(xiàn).H.and Verma,1.M.(1997).Proceedingsof the National Academy of Sciences of the U.S.A.9410319-10323.;Kafri,T.,Blmer,U.,et al.(1997).Nature Genetics17314-317)。有趣的是,轉(zhuǎn)基因由內(nèi)部設(shè)計(jì)的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng),而不像在MoMLV載體中,是未經(jīng)滅活的。這可能是由于對載體注入的有限的炎癥反應(yīng),炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度與鹽水對照組相同(Blmer,U.,Naldini,L.,Kafri,T.,Trono,D.,Verma,1.M.and Gage,F(xiàn).H.(1997).Journal of Virology 716641-6649)。
      使用的慢病毒載體來自人類免疫缺陷病毒(HIV)并已經(jīng)過安全性評測,去掉了其中一些非必需調(diào)節(jié)基因。Vpr和vif突變株可以較低的效率感染神經(jīng)元細(xì)胞,但不能感染肌肉或肝細(xì)胞(Blmer,U.,Naldini,L.,Kafri,T.,Trono,D.,Verma,I.M.and Gage,F(xiàn).H.(1997).Journal of Virology 716641-6649;Kafri,T.,Blmer,U.,et al.(1997).Nature Genetics 17314-317.)。
      在一個(gè)具體的實(shí)施方案中,使用了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXIN、pSIR、pLXSH、pLNCX、pLAPSN、pFB和pFB-Neo。
      單純皰疹病毒載體任何單純皰疹病毒載體可被用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞和/或細(xì)胞系以表達(dá)和/或分泌免疫調(diào)節(jié)劑。單純皰疹病毒1型(HSV-1)為人類嗜神經(jīng)性病毒,因此人們主要關(guān)注如何將HSV-1作為載體向神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)入基因。野生型HSV-1病毒能感染神經(jīng)元細(xì)胞并進(jìn)入溶細(xì)胞生命周期或持續(xù)作為核內(nèi)附加體存在進(jìn)入潛伏狀態(tài)。潛伏感染的神經(jīng)元細(xì)胞可正常行使功能并不被免疫系統(tǒng)所排斥。雖然潛伏的病毒在轉(zhuǎn)錄水平幾乎是靜止的,它卻具有神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子,可在潛伏期內(nèi)啟動(dòng)。針對HSV-1的抗體在人群中很常見,然而皰疹感染的并發(fā)癥,如腦炎,非常罕見。
      病毒基因組為152kb的線性雙鏈DNA分子。它有兩個(gè)獨(dú)特的區(qū)域,長區(qū)域和短區(qū)域(叫做UL和US),二者由內(nèi)部重復(fù)序列(IRL和IRS)以任何方向連接。在獨(dú)特區(qū)域的無連接端為末端重復(fù)序列(TRL和TRS)。有將近81個(gè)基因(Marconi,P.,Krisky,D.,et al.(1996).Proceedings of the National Academy of Sciences USA 9311319-11320.),其中約半數(shù)對于在細(xì)胞培養(yǎng)中生長是非必需的。一旦去掉這些非必需基因,該病毒可插入40-50kb的外源性DNA(Glorioso,J.C.,DeLuca,N.A.and Fink,D.J(1995).Annual Review of Microbiology49675-710.)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)三種主要類型的HSV-1基因,叫做即刻早期基因(IE或α)基因、早期(E或β)基因和晚期(L或γ)基因。
      易感細(xì)胞感染后,溶解性復(fù)制由基因轉(zhuǎn)錄暫時(shí)性調(diào)整序列調(diào)節(jié)。Vmw65(被膜結(jié)構(gòu)蛋白)激活即刻早期基因(IP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP477),后者為反式激活因子,允許早期基因的產(chǎn)生。早期基因?yàn)楹塑沾x和DNA復(fù)制編碼基因。晚期基因被早期基因激活并編碼結(jié)構(gòu)蛋白。整個(gè)周期耗時(shí)小于10小時(shí)并不可避免的導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
      導(dǎo)致潛伏狀態(tài)的分子事件還未完全確定。潛伏期內(nèi)的基因表達(dá)由基因組IRL區(qū)的潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄子(LATs)驅(qū)動(dòng)。兩個(gè)LATs(2.0kb和1.5kb)以IE基因ICP0相反的方向轉(zhuǎn)錄。LATs在HSV-1從潛伏期內(nèi)再次活化(Steiner,I.,Spivack,J.G.,et al.(1989).EMBO Journal 8505-511.)和進(jìn)入潛伏狀態(tài)中起作用(Sawtell,N.M.and Thompson,R.L.(1992).Journal of Virology 662157-2169.).已經(jīng)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)驅(qū)動(dòng)LATs表達(dá)的潛伏活化啟動(dòng)子(Marconi,P.,Krisky,D.,et al.,(1996).Proceedings of the National Acadenzy of Sciences USA 9311319-11320.)并可能對于載體轉(zhuǎn)基因表達(dá)有作用。
      兩種基本方法被用于產(chǎn)生HSV-1載體,即擴(kuò)增子和重組HSV-1病毒。擴(kuò)增子為從細(xì)菌中產(chǎn)生的質(zhì)粒,含有col E1 ori(大腸桿菌來源的復(fù)制),OriS(HSV-1來源的復(fù)制),HSV-1包裝序列,轉(zhuǎn)基因受控于即刻早期啟動(dòng)子和一個(gè)可選擇性標(biāo)記(Federoff,H.J.,Geschwind,M.D.,Geller,A.I.and Kessle r,J.A.(1992).Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 891636-1640.)。擴(kuò)增子轉(zhuǎn)染入含有輔助病毒(溫度敏感變異株)的細(xì)胞系,輔助病毒以反式提供所有缺失的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)基因。將輔助病毒和包含病毒顆粒的擴(kuò)增子導(dǎo)入受體。最近的擴(kuò)增子包括來源于EB病毒的序列以維持質(zhì)?;虻挠坞x狀態(tài)(Wang,S.and Vos,J.(1996).Journal ofVirology 708422-8430.)。
      重組病毒通過去掉一個(gè)即刻早期基因如ICP4,以反式提供,而失去復(fù)制能力。雖然它們的致病性減弱并可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因在腦組織中的表達(dá),但在細(xì)胞培養(yǎng)中它們對神經(jīng)元是有毒性的(Marconi,P.,Krisky,D.,et al..(1996).Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 9311319-11320.)。去掉數(shù)個(gè)即刻早期基因可相當(dāng)大的降低細(xì)胞毒性,并使得在野生型潛伏病毒中靜止的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)成為可能。這些啟動(dòng)子也許對于介導(dǎo)長期基因表達(dá)是有用的。
      復(fù)制條件變異株只能在特定的細(xì)胞系中復(fù)制。這些細(xì)胞系都處于增殖狀態(tài)中并且可提供一種細(xì)胞酶來補(bǔ)足病毒缺陷。變異株包括胸苷激酶(During,M.J.,Naegele,J.R.,OMalley,K.L.and Geller,A.1.(1994).Science 2661399-1403.)、核糖核酸酶還原酶(Kramm,C.M.,Chase,M.,et al.(1997).Hiiniaii Gene Therapy 82057-2068.)、UTPase或神經(jīng)毒性因子g34.5(Kesari,S.,Randazzo,B.P.,et al.(1995).Laboratory Investigation 73636-648.)。
      非病毒載體病毒載體都將引起某種程度的免疫反應(yīng)并且可能有安全性方面的危險(xiǎn)(如插入突變和毒性問題)。此外,它們的容量有限并且很難實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。因此,在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,使用了基因轉(zhuǎn)移的非病毒方法,該方法只要求很少數(shù)的蛋白,其實(shí)際容量是無限的,無感染或基因突變能力,并且通過使用藥物學(xué)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。有三種非病毒DNA轉(zhuǎn)移方法,即裸DNA、脂質(zhì)體和分子耦聯(lián)體。
      裸核酸裸DNA或核酸可被用于向宿主導(dǎo)入免疫調(diào)節(jié)劑。例如,它可以可直接注入肌細(xì)胞的質(zhì)粒形式導(dǎo)入(Wolff,J.A.,Malone,R.W.,Williams,P.,Chong,W.,Acsadi,G.,Jani,A.and Felgner P.L.(1990).Science 2471465-1468.)或粘附于轟擊入組織中的金顆粒上(Cheng,L.,Ziegelhoffer,P.R.and Yang,N.S.(1993).Proceedings of theNational Academy of Sciences of the U.S.A.904455-4459.)?!奥恪焙怂幔珼NA或RNA這一術(shù)語指游離于任何具有輔助、增強(qiáng)或輔助進(jìn)入細(xì)胞功能的輸送載具的序列,包括病毒序列、病毒顆粒、脂質(zhì)體制劑、陽離子脂質(zhì)體或沉淀劑等。雖然不是非常有效,但可導(dǎo)致體內(nèi)低水平表達(dá)時(shí)間延長。不像其他基因治療技術(shù),向靶細(xì)胞引入裸核酸序列的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)為細(xì)胞內(nèi)免疫調(diào)節(jié)劑合成的瞬時(shí)特點(diǎn)。研究表明非復(fù)制DNA序列可導(dǎo)入細(xì)胞生產(chǎn)所需得到的免疫調(diào)節(jié)劑長達(dá)六個(gè)月。這一方法的簡單性,和持續(xù)表達(dá)導(dǎo)致DNA疫苗的發(fā)展。與常規(guī)減毒和以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的疫苗相比,它們不受既存免疫(如來源于母親的抗體)的影響,相對便宜,并可通過單個(gè)質(zhì)粒提供多個(gè)病原體抗原(Manickan,E.,Karem,K.L.,and Rouse,B.T.(1997).CriticalReviews in Immunology 17139-154.)。正在發(fā)展針對那些目前還沒有疫苗的病原體,如HIV(Lekutis,C.,Shiver,J.W.,Liu,M.A.,andLetvin,L.N.(1997).The Journal of Inan uyzology 1584471-4477.)或目前的疫苗不是非常有效,如流感(Macklin,M.D.,McCabe,D.,etal.(1998).Journal of Virology 721491-1496.)的DNA疫苗.利用一個(gè)高度保守基因,Ulmer等人(Ulmer,J.B.,Donnelly,J.J.,et al.(1993).science 2541745-1749.)免疫小鼠抵抗兩種不同血清型流感病毒株。然而,大多數(shù)情況下,DNA疫苗并未顯示優(yōu)于現(xiàn)有疫苗(Macklin,M.D.,McCabe,D.,et al.(1998).Journal of virology 721491-1496)。免疫反應(yīng)的具體類型可通過共轉(zhuǎn)化一個(gè)編碼合適細(xì)胞因子的基因控制(Xiang,Z.and Ertl,H.C.(1995).Immunity 2129-135.)并且這一方法可能對改變不適宜的免疫反應(yīng)有作用(Manickan,E.,Karem,K.L.,and Rouse,B.T.(1997).Critical Reviews in Immunology 17139-154.).裸DNA的其他利用包括癌癥的免疫強(qiáng)化(討論如下,Corr.M.,Tighe,H.,Lee.D.,Dudler,J.,et al.(1997).The Journal ofLaboratory Investigation 1594999-5004.),修復(fù)胰腺的胰島素功能(Goldfine.1.D.,German,M.S.,Tseng,H.,et al.(1997).NatureBiotechnology 151378-1382.),及刺激側(cè)支血管形成(Takeshita,S.,Tsurumi,Y.,et al.(1996).Laboratory Investigation 75487-501.)。肌肉組織內(nèi)基因產(chǎn)物的表達(dá)可通過同時(shí)注入膠原酶、罌粟堿和創(chuàng)造缺血環(huán)境而增加(Budker,V.,Zhang,G.,Danko,I.,Williams,P.AndWOLFF,J.(1998).Gene therapy5272-276)。使用肌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子(Skarli,M.Kiri,A.,et al.(1998)Gene Thearapy 5514-520.)和其他基因內(nèi)調(diào)控序列,如多聚A和轉(zhuǎn)錄終止序列(Hartikka,J.,Sawdey,M.,et al.(1996).Huamn Gene Therapy 71205-1217.)也可增加轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
      對于裸多肽注射,有效DNA或RNA劑量在0.05g/kg體重到大約50mg/kg體重的范圍內(nèi)。優(yōu)選劑量為0.005mg/kg到大約20mg/kg,更加適宜的劑量范圍為0.05mg/kg到大約5mg/kg。當(dāng)然,正如一般技術(shù)人員所意識到的那樣,這一劑量將隨著注射組織的不同而不同。適宜和有效劑量的核酸序列可很容易的由本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員確定,并可能隨著治療情況和給藥途徑而發(fā)生改變。給藥途徑為胃腸外途徑,將藥物注入組織間隙,也可使用其他胃腸外途徑,如,吸入氣霧劑,尤其當(dāng)需要向肺部或氣管組織,咽喉或鼻粘膜給藥時(shí)。另外,裸多肽結(jié)構(gòu)可在血管成形術(shù)中通過術(shù)中使用的導(dǎo)管向血管內(nèi)給藥。
      免疫調(diào)節(jié)劑還可以脂質(zhì)體的形式輸送(如Feigner P.L.et al.(1995)Ann.NY Acad.Sci.772126-139 and Abdallah B.et al.(1995)Biol.CelJ 85(1)1-7),脂質(zhì)體的制備方法在本領(lǐng)域的技術(shù)人員中是眾所周知的。脂質(zhì)體為雙層脂肪夾著一部分水樣液體。DNA會自動(dòng)與陽離子的脂質(zhì)體(根據(jù)其電荷)的外表面結(jié)合,這些脂質(zhì)體會與細(xì)胞膜作用(Felgner,J.H.,Kumar,R.,et al.(1994).Journal of BiologicalChemistry 2692550-2561.)。在體外,一些特定細(xì)胞系的高達(dá)90%可被轉(zhuǎn)染。通過在陽離子脂質(zhì)體中加入少量陰離子脂質(zhì),DNA可被加入脂質(zhì)體的內(nèi)表面,從而保護(hù)其免于酶解。(Crespo et al,1996,citedin Alio,S.F.(1997).Biochemical Pharmacology 549-13.)。為了協(xié)助作為內(nèi)涵體攝入細(xì)胞,目標(biāo)蛋白被包入脂質(zhì)體中,如抗MHC抗體(Wang,C.,and Huang,L.(1987).Proceediugs of the NationalAcademy of Sciences USA 847851-7855.)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Stavridis,J.C.,Deliconstantinos,G.,et al.(1986).Experimeiztal Cell Research164568-572.)和仙臺病毒或其F蛋白(Dzau,J.V.,Mann,M.J,Morishita,R.and Kaneda,Y.(1996).Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 9311421-11425)。仙臺病毒另外還允許質(zhì)粒DNA逃離內(nèi)涵體到胞質(zhì)中,從而避免了降解。加入DNA結(jié)合蛋白(28kDa高移動(dòng)性組蛋白1)通過將質(zhì)粒帶進(jìn)核內(nèi)而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)錄()。
      分子耦聯(lián)體由蛋白或合成配體組成,其上連接DNA結(jié)合劑。通過使用與脂質(zhì)體中類似的技術(shù)可改善向細(xì)胞內(nèi)的輸送過程。目標(biāo)蛋白包括唾液酸糖蛋白(Wagner,E.,Cotten,M.,F(xiàn)oisner,R.and Birnstiel,M.L.(1991).Proceedings of the National Academy of Sciences USA 884255-4259.)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Wu,C.H.,Wilson,J.M.and Wu.,G.Y.(1989).Journal of Biological Chemistry.26416985-16987,)、多聚IgA(Ferkol,T.,Kaetzel,C.S.and Davis,P.B.(1993).Journal of ClinicalInvestigation 922394-2400.)和腺病毒(Madon,J.and Blum,H.E.(1996).Hepatology 24474-481)。轉(zhuǎn)基因表達(dá)傾向于為瞬時(shí)的并受制于內(nèi)涵體/溶酶體降解。
      本發(fā)明的說明性和非限制性的例子提供如下。這些例子并非用于限制本發(fā)明的適用范圍。
      實(shí)施例此處使用的縮寫意義如下Ad IFN表達(dá)土撥鼠γ干擾素的腺病毒載體Ad RFP無土撥鼠γ干擾素基因的腺病毒載體CCC DNA 共價(jià)閉環(huán)病毒形DNADNA 脫氧核糖核酸FTC 5-氟-1-(2R,5S)-1,3-氧硫雜戊環(huán)-5-基]胞嘧啶GFP 綠色熒光蛋白HBV 乙型肝炎病毒IFN 干擾素L-FMAU1-(2-氟-5-甲基-,L-阿糖呋喃基)胸腺嘧啶M1,M2開始治療后第一個(gè)或第二個(gè)月PCNA 增殖細(xì)胞核抗原
      PCR多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Pfu空斑形成單位RFP紅色熒光蛋白RI 復(fù)制中間產(chǎn)物RT 逆轉(zhuǎn)錄TUNEL 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記分析WHV土撥鼠乙型肝炎病毒實(shí)施例1L-FMAU和β-L-FTC給藥總體上,β-L-FTC按照Cullen等人之前描述的模型給藥(Cullen etal.Antimicrob.Agents Chemother.1997,41,2076-2082)。具體的,β-L-FTC以30mg/kg腹腔給藥。
      在使用L-FMAU的試驗(yàn)中,該化合物通過腹腔給藥,藥物濃度如Peek等人的描述(Peek et al.Hepatology 2001,33,254-66)and Zhuet al.(Zhu et al.J.Virol.2001,75,311-22)(10mg/kg)。
      動(dòng)物土撥鼠乙型肝炎病毒感染模型代表了一個(gè)評價(jià)抗病毒藥物的有用模型,因?yàn)樗M了慢性乙型肝炎感染患者中觀察到的病毒感染過程。幾項(xiàng)研究顯示這一動(dòng)物模型用于研究新的核苷類似物是可靠的,尤其是抗病毒效力和毒性。
      捕獲的土撥鼠繁殖的12頭約1歲的土撥鼠(Marmotta donax)慢性感染W(wǎng)HV被用于體內(nèi)試驗(yàn)。治療從2000年6月開始持續(xù)到12月。
      當(dāng)注入腺病毒后,在腺病毒注入后的10天內(nèi)每天收集血樣,此后每周兩次。這些血樣將如下述進(jìn)一步接受病毒標(biāo)記物檢測。干擾素基因輸送系統(tǒng)(Dr.Nassal,F(xiàn)reiburg,Germany)腺病毒載體按照He等人介紹的方法獲得(He,T.C.,et al.ProcNatl Acad Sci U.S.A.1998,95,2509-14)。腺病毒載體因?yàn)槿サ袅薊1和E3區(qū)而發(fā)生復(fù)制缺陷。重組盒,其前-γ干擾素基因的編碼盒(aa1-143)受控于CMV啟動(dòng)子,與受控于SV40啟動(dòng)子的eCFP報(bào)告基因一起,插入最初的E1區(qū)(454-3500)(圖1)。活性土撥鼠γ干擾素產(chǎn)生效率通過其保護(hù)土撥鼠細(xì)胞系WCH17免于感染VSV的能力評價(jià)。
      只含有pSV40-eCFP盒的相同腺病毒載體作為對照。腺病毒載體通過靜脈注射方式給藥并作用于肝臟。注入載體濃度為3×107到3×1011pfu/動(dòng)物,以磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋。
      實(shí)施例2評價(jià)L-FMAU+β-L-FTC+Ad IFN從Northeastern Wildlife(南普利茅斯,紐約)購進(jìn)18頭試驗(yàn)性感染W(wǎng)HV的土撥鼠(Marmota monax)。土撥鼠為慢性感染,并被用于體內(nèi)試驗(yàn)。
      β-L-FTC(30mg/kg)和L-FMAU(10mg/kg)腹腔給藥。第一周內(nèi)每天注射,接下來7周,隔日注射。
      土撥鼠γ干擾素(IFN)基因的一個(gè)新的重組盒受控于CMV啟動(dòng)子,與受控于SV40啟動(dòng)子的eRFPnuc基因一起,插入最初的腺病毒載體E1區(qū)(Ad IFN)。只含有pSV40控制的eGFPnuc的相同腺病毒載體作為對照(AdGFP)(由Dr.Michael Nassal,University ofFreiburg,Germany提供)。
      對于這些試驗(yàn),以3×1010pfu/動(dòng)物的濃度靜脈注射表達(dá)土撥鼠γ干擾素的重組腺病毒載體兩次(在第4周和第8周時(shí))。病毒接種在之前2001年8月美國麻省Amherst舉行的HBV大會公布的研究中被證實(shí)(見圖2)。
      在治療過程中,每兩天留取血樣,注射Ad IFN后的5天每天一次留取血樣。停藥后,每兩天收集血樣直到病毒負(fù)荷量開始上升,然后每周一次,然后每月兩次。
      實(shí)施例3肝臟活檢手術(shù)肝臟活檢于治療前(TO)在全身麻醉下,行腹腔鏡后進(jìn)行,治療中進(jìn)行兩次(M1、M2)和停藥后4個(gè)月(M3)一次。治療中活檢在每次注射腺病毒4天后進(jìn)行。每份樣本的一部分貯存于-80℃以備進(jìn)行病毒DNA分析。另一部分以福爾馬林固定并包埋于石蠟中行肝臟組織學(xué)和免疫染色。最后一部分以1%的四氧化鋨固定行電鏡分析(TO和M2)。在手術(shù)時(shí)還需進(jìn)行大體肝臟檢查。
      肝內(nèi)病毒DNA合成分析來自感染的土撥鼠的肝內(nèi)病毒DNA在行肝臟活檢時(shí)提出。在10mM Tris-HCl(pH7.5),10mMEDTA中勻漿化后,肝臟標(biāo)本被分為兩部分,一部分用于分離總病毒DNA(在蛋白激酶K消化后,酚-氯仿抽提后乙醇沉淀),另一部分用于分離非蛋白結(jié)合共價(jià)閉環(huán)(CCC)病毒DNA(在SDS-KCl沉淀蛋白結(jié)合DNA后,酚-氯仿抽提,然后乙醇沉淀)。為了使每一用作Southern印跡分析的標(biāo)本中的DNA含量標(biāo)準(zhǔn)化,DNA濃度由紫外分光光度計(jì)確定并與之前瓊脂糖凝膠電泳分析后的定量DNA比較。5微克的相當(dāng)于總DNA或CCCDNA的核酸標(biāo)本用于在1.2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析,堿轉(zhuǎn)移印跡到尼龍膜上,病毒DNA通過上述特異性雜交方法檢測。
      肝臟組織學(xué)分析福爾馬林固定的肝臟活檢組織切片以蘇木精-伊紅-番紅(HES)染色并以光學(xué)顯微鏡檢查。利用Metavir評分半定量評價(jià)肝細(xì)胞壞死程度(嗜酸性小體),門管及小葉內(nèi)部炎癥程度和纖維化分期(Hepatology.1994;20(1 Pt1)15-20)。肝臟活檢切片還用于評價(jià)脂肪變性、小管增生、肝細(xì)胞異型增生和肝細(xì)胞癌。
      肝臟組織學(xué)檢查顯示在接受Ad IFN或Ad GFP載體的兩組動(dòng)物中類似的肝炎急性惡化,而在未經(jīng)治療動(dòng)物中觀察到輕度炎癥反應(yīng)。
      多克隆抗WHV抗體注射前和注射后第5天的肝臟活檢切片免疫染色研究顯示在土撥鼠A37和A36中,感染肝細(xì)胞數(shù)量明顯減少。
      實(shí)施例4病毒血癥分析斑點(diǎn)雜交分析病毒血癥通過定量檢測土撥鼠乙型肝炎病毒(WHV)DNA評價(jià)。利用HighPure PCR模板DNA抽提試劑盒(Roche Daignostics)從血清中提出WHV DNA,以WHV DNA標(biāo)準(zhǔn)的系列稀釋液將相當(dāng)于50μL血清的樣本點(diǎn)于膜上(Biodyne B,0.45uM,Merek Eurolab)。在經(jīng)過固定后,濾器與32P標(biāo)記的全長WHV DNA探針雜交。利用ImageQuant軟件進(jìn)行磷光影像(phosphoImager)掃描儀(AmershamPharmacia Biotech)的比較分析。該試驗(yàn)的檢測閾值為6.107拷貝/mL(200pg/mL)。
      內(nèi)源性聚合酶分析(EPA)利用WHV顆粒以內(nèi)源性聚合酶分析方法(EPA)確定Ad IFN對于病毒正鏈DNA合成的作用。為了比較,DNA依賴性DNA聚合酶抑制劑、膦甲酸(PFA)作為對照。內(nèi)源性聚合酶活性與含有松環(huán)DNA的成熟顆粒中病毒正鏈DNA的完成相關(guān)。WHV相關(guān)DNA聚合酶活性通過混合50μL部分純化的病毒顆粒和25μL含有(i)dATP,dCTP,dGTP(每種100μL)and3H-dTTP(0.17uM)的反應(yīng)緩沖液((Tris-HCl50mM pH7.6,MgCl240mM,NH4Cl 60mM,NP40 0.5%,β-巰基乙醇10mM)測定。酶檢測按照Hantz等人介紹的方法進(jìn)行(HantzO,et al.1992 Virology.Sep;190(1)193-200)。簡要的說,酶反應(yīng)在37℃孵育3小時(shí)并點(diǎn)于GF/C纖維玻璃濾膜(Whatman)上,以5%的三氯醋酸充分洗滌。摻入3H-dTTP的量以Beckman LS 6000SC閃爍計(jì)數(shù)器測定。該試驗(yàn)的檢測閾值為1,000cpm/mL。
      實(shí)時(shí)PCR分新(Light Cycler)對于病毒滴度太低不易以斑點(diǎn)雜交方法檢測的病例,可使用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)(參見例如Dandri等人,Hepatology 2000,32,139-46)。已知實(shí)時(shí)PCR技術(shù)可以檢測少到10個(gè)拷貝的人類HBV DNA。因此,為了完成病毒血癥的分析,實(shí)時(shí)PCR用于檢測6×107拷貝/ml(200pg/ml)以下的WHV DNA。相同的WHV DNA標(biāo)準(zhǔn)被用于斑點(diǎn)雜交分析和實(shí)時(shí)PCR分析。對斑點(diǎn)雜交陽性的標(biāo)本行PCR檢測獲得相似的數(shù)值。該方法檢測的下限為25WHV拷貝/μl。
      3只土撥鼠病毒清除和反跳動(dòng)力學(xué)實(shí)時(shí)PCR研究的初步結(jié)果在圖10中給出。病毒滴度顯示達(dá)到低值0.320pg/ml,代表平均為9×104拷貝/ml。該技術(shù)還可進(jìn)一步用于動(dòng)物標(biāo)本,確定β-L-FTC單獨(dú)或與免疫調(diào)節(jié)劑,如Ad IFN,聯(lián)合使用的療效。
      實(shí)施例5確定接種物滴度為了確定抗病毒療效及對腺病毒載體接種物的耐受性,4只動(dòng)物接受靜脈內(nèi)注射Ad-IFN,濃度分別為3.107(A33)、3×109(A30)和3×1011pfu(A32和A34)。
      最高接種物滴度(3.1011pfu)引起病毒載量的顯著下降,然而,全部2只動(dòng)物分別于注射后第2天和第5天死亡(WHV DNA在0天到死亡之日間下降分別為147ng/ml到70ng/ml及1067ng/ml到265ng/ml)。3×109pfu接種物引起持續(xù)6天的瞬時(shí)下降,從70ng/ml降至約30ng/ml。最低接種物濃度未引起病毒血癥的明顯下降(圖3)。
      實(shí)施例6療效研究評價(jià)Ad IFN載體的抗病毒效果五只土撥鼠(A35,A36,A37,A38,A42)接受3×109pfu完全Ad IFN載體。對照組有2只土撥鼠(A39,A40)接受3×109pfu Ad GFP載體,1只土撥鼠(A41)未接受任何治療(圖4和5)。
      在Ad IFN治療組中,在接種腺病毒后,在5只動(dòng)物中的3只中觀察到瞬時(shí)WHV DNA下降(A35從46ng/ml到20ng/ml;A37從76到20ng/ml;A42從20到5ng/ml)。WHV DNA結(jié)果還以EPA評價(jià)(圖4和5)。肝內(nèi)WHV DNA Southern印跡雜交顯示病毒DNA(從16到76%,除了A42)及CCC DNA水平(從2到76%)明顯下降(圖6)。
      實(shí)施例7評價(jià)L-FMAU和β-L-FTC結(jié)果顯示病毒血癥顯著受抑,降低約4到5個(gè)對數(shù)單位,在所有接受β-L-FTC、L-FMAU和Ad IFN治療的動(dòng)物中降至斑點(diǎn)雜交分析的檢測閾值(6.107拷貝/ml)(圖7)。然而,對照組(未經(jīng)治療,Ad GFP)或單獨(dú)以Ad IFN治療的土撥鼠顯示病毒血癥無顯著變化(圖8和9)。
      治療引起的病毒載量的下降非???。病毒血癥在治療開始的一到兩周內(nèi)降至檢測不出的水平(<6.107/ml)。
      接受β-L-FTC、L-FMAU和Ad IFN治療的動(dòng)物的病毒血癥在治療停止后持續(xù)抑制不同長度的一段時(shí)間。此外,治療動(dòng)物的病毒載量不會恢復(fù)到治療前水平。兩只接受L-FTC、L-FMAU和Ad IFN治療的土撥鼠(A52和A49)的病毒血癥水平在第28周時(shí)仍然檢測不到(藥物治療停止后6個(gè)月)。
      與免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)合治療的結(jié)果顯示病毒血癥水平快速、顯著降低(兩周內(nèi)平均降低5log10)。相對于只使用β-L-FTC和L-FMAU的結(jié)果,其下降更為顯著。在之前的研究中,血清中病毒滴度在相同的時(shí)間框內(nèi)分別降低約56和1,000倍。這一觀察結(jié)果顯示當(dāng)與免疫調(diào)節(jié)劑結(jié)合時(shí),β-L-FTC和L-FMAU的抗病毒活性增強(qiáng)。另外,這種抗病毒效應(yīng)隨時(shí)間延長,病毒反跳延遲。在斑點(diǎn)雜交分析中(<6.107拷貝/ml),病毒血癥在停藥后6到7個(gè)月,在兩只動(dòng)物(A49和A52)血清中仍然測不出。這種延長的效應(yīng)與CCC DNA水平的下降一致(分別為-69%和-75%)。治療停止后病毒復(fù)制反跳的延遲反映了通過重新感染新的肝細(xì)胞和/或重新擴(kuò)增感染細(xì)胞內(nèi)現(xiàn)存細(xì)胞內(nèi)CCC DNA池而重建CCC DNA池所需的時(shí)間。
      肝內(nèi)CCC DNA肝內(nèi)病毒DNA Southern印跡分析(圖11)顯示肝內(nèi)WHV復(fù)制中間產(chǎn)物水平的改變,后者與病毒血癥模式相一致。β-L-FTC和L-FMAU治療組都觀察到病毒DNA合成水平顯著降低,相對于治療前水平,肝內(nèi)病毒DNA中間產(chǎn)物水平降低了82到93%(圖12和13)。雖然CCC DNA在M1和M2時(shí)在肝臟中持續(xù)存在,其他WHV DNA復(fù)制中間產(chǎn)物下降十分顯著。
      此外,在L-FMAU/β-L-FTC雙藥治療中,CCC DNA也降低了24到47%。然而,L-FMAU/β-L-FTC對WHV復(fù)制的抑制并不導(dǎo)致肝內(nèi)病毒CCC DNA的清除,如southern印跡分析所示。
      然而在未經(jīng)治療的土撥鼠中,總的或CCC DNA隨時(shí)間而分別增加+64%和+77%(圖14)。
      與Cullen等人(Cullen et al.Antimicrob.Agents Chemother.1997,41,2076-2082)、Zhu等人(Zhu et al.J.Virol.2001,75,311-22)和Peek等人(Peek et al.Hepatology 2001,33,254-66)的結(jié)果相比較,β-L-FTC與IFN和L-FMAU聯(lián)合使用有顯著的抗病毒效應(yīng)。治療開始一個(gè)月后,肝內(nèi)復(fù)制中間產(chǎn)物降至無法測出的水平。相對的,肝內(nèi)CCC DNA水平相對復(fù)制DNA的下降速度低許多。聯(lián)合應(yīng)用β-L-FTC和L-FMAU降低病毒CCC DNA 40%(DNA復(fù)制中間產(chǎn)物降低98%)。這一效應(yīng)可能由于L-FMAU單獨(dú)使用的抗病毒效應(yīng),如Peek等人說明的那樣(Peek et al.Hepatology 2001,33,254-66),who showed anaverage 10-fold decrease in CCC DNA)。然而,單藥L-FMAU治療后8到9個(gè)月,將出現(xiàn)WHV耐藥株(Zhou,T.,et al.J.Vison.2000,74,11754-63)。L-FMAU與β-L-FTC聯(lián)合使用可避免出現(xiàn)耐藥株,以實(shí)現(xiàn)長期治療消除CCC DNA殘余池。
      實(shí)施例8肝內(nèi)WHV DNA合成與聯(lián)合治療的結(jié)果不同,Ad IFN單獨(dú)不會影響肝內(nèi)總病毒和CCCDNA水平(相對于Ad GFP組總DNA的+43%分別為+44%和-6%)(圖15)。
      實(shí)施例9評價(jià)重組腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細(xì)胞為了確定被腺病毒感染的肝細(xì)胞的數(shù)目,以針對綠色熒光蛋白(GFP)的商用抗體進(jìn)行免疫染色。然而,當(dāng)與對照組比較時(shí),觀察到的熒光并不特異,這可能是因?yàn)楦渭?xì)胞或膽色素產(chǎn)生自然熒光。
      實(shí)施例10組織學(xué)檢查接受β-L-FTC聯(lián)合治療的動(dòng)物肝臟活檢切片顯示肝內(nèi)炎癥反應(yīng)及小葉損傷。接受Ad IFN治療組的所有土撥鼠顯示炎癥活動(dòng)度增加(圖15)。在該組的6份活檢標(biāo)本中觀察到Metavir評分表示的最大炎癥活動(dòng)度。與之相比,接受L-FMAU和β-L-FTC治療組并未顯示類似的結(jié)果。該組的6只土撥鼠中只有3只顯示炎癥活動(dòng)度增高。對照組中,甚至在單獨(dú)接受Ad IFN治療組中,Metavir評分穩(wěn)定。
      實(shí)施例11病毒血癥分析病毒血癥可以斑點(diǎn)雜交分析WHV DNA方法分析并在病毒血癥恢復(fù)到治療前水平前以射線影像分析儀定量分析。
      如需確認(rèn)病毒已被清除,在PCR條件下從血清中抽提的DNA以斑點(diǎn)雜交分析方法應(yīng)該測不出(病毒血癥在6.107拷貝/ml以下)。此外,DNA必須通過實(shí)時(shí)PCR(Light Cycler)檢測。在這些例子中,對實(shí)時(shí)PCR檢測方法進(jìn)行了改進(jìn)以利用特異性引物對WHV檢測DNA。
      實(shí)施例12肝內(nèi)病毒DNA合成分析對治療后5個(gè)月時(shí)的肝臟活檢標(biāo)本切片利用southern印記雜交進(jìn)行分析,分析肝內(nèi)病毒DNA合成。
      實(shí)施例13WHV聚合酶基因測序可在PCR擴(kuò)增PreS和RT區(qū)后對循環(huán)病毒的基因組序列進(jìn)行分析,以確定抗病毒方法是否已經(jīng)篩選出逃逸變異株。
      在治療末期或動(dòng)物死亡前的最佳時(shí)期收集血清,通過PCR擴(kuò)增WHV DNA。血清中的DNA以Taq聚合酶和特異性引物對(5′-AGATTGGTTGGTGCACTTCT-3’(核苷酸385到403)和5′-ATTGTCAGTGCCCAACA-3′(核苷酸1468到1461)擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)((94℃ 1min,50℃ 1min,72℃ 1min),引物相當(dāng)于逆轉(zhuǎn)錄酶基因的B和C區(qū),參考此前發(fā)表的序列。為了確認(rèn)無病毒DNA存在,對第一輪擴(kuò)增中陰性的標(biāo)本以另一對引物對進(jìn)行巢式PCR,在此處為5′-GGATGTATCTGCGGCGTTT-3′(核苷酸510到528)和5′-CCCAAATCAAGAAAAACAGAACA-3′(核苷酸953到931)。
      實(shí)施例14電鏡檢查肝線粒體以溶于150mM二甲基胂酸鈉HCI(pH7.4)的1%四氧化鋨固定肝臟活檢切片,在不同濃度的乙醇中脫水,包埋于甲醇乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛中,以1200EX透射電鏡分析,以排除β-L-FTC聯(lián)合治療的線粒體毒性。
      實(shí)施例15GFP或RFP顯影感染腺病毒載體的細(xì)胞數(shù)可通過使用合適濾波片的共聚焦顯微鏡直接觀察5微米厚的脫蠟肝臟組織切片監(jiān)控。
      實(shí)施例16評價(jià)WHV感染的肝細(xì)胞數(shù)目WHV感染細(xì)胞數(shù)可通過表面和衣殼蛋白免疫染色進(jìn)行監(jiān)控。具體步驟為將5微米厚的脫蠟肝臟組織切片與含有針對WHV核心或前S蛋白的多克隆抗體的兔血清孵育過夜。之后切片與生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG共同孵育。抗原抗體復(fù)合物以鏈親和素-辣根過氧化物酶顯示。表達(dá)病毒蛋白的感染肝細(xì)胞定量檢測在肝臟切片有代表性的區(qū)域進(jìn)行。
      實(shí)施例17肝細(xì)胞更新分析發(fā)生凋亡的肝細(xì)胞數(shù)可通過TUNEL(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記)法確定(Kerr,J.F.R.,Wyllie,A.H.andCurrie,A.R.1972 Br.J.Cancer 26239-257)。細(xì)胞有絲分離周期中的肝細(xì)胞數(shù)目可通過PCNA免疫染色確定。
      本發(fā)明參考其優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行了介紹。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說,根據(jù)本發(fā)明前述的詳細(xì)說明對本發(fā)明進(jìn)行改變和修改是顯而易見的。所有這些改變和修改都包括于本發(fā)明的范圍中。
      權(quán)利要求
      1.一種治療或預(yù)防人類感染乙型肝炎病毒的方法,其包括聯(lián)合或交替給予獨(dú)立地任選地處于藥用可接受載體中的有效劑量的β-L-FTC;L-FMAU;和干擾素;或它們的藥用可接受的鹽或藥物前體。
      2.權(quán)利要求1的方法,其中β-L-FTC為基本純的形式。
      3.權(quán)利要求1的方法,其中按β-L-異構(gòu)體的重量β-L-FTC至少占90%。
      4.權(quán)利要求1的方法,其中按β-L-異構(gòu)體的重量β-L-FTC至少占95%。
      5.權(quán)利要求1的方法,其中干擾素選自干擾素α、聚乙二醇化干擾素、干擾素α-2a、干擾素α-2b、聚乙二醇化干擾素α-2a、聚乙二醇化干擾素α-2b ROFERON-A(干擾素α-2a)、PEGASYS(聚乙二醇化干擾素α-2a)、INTRONA(干擾素α-2b)、PEG-INTRON(聚乙二醇化干擾素α-2b)、干擾素β、干擾素γ、干擾素ι、干擾素ω、一致干擾素、INFERGEN(干擾素alphacon-1)、OMNIFERON(天然干擾素)、REBIF(干擾素β-1a)、ω干擾素、口服干擾素α、干擾素γ-1b、SuperFeron(天然人多亞型IFN-α)和HuFeron(人IFN-β)。
      6.權(quán)利要求5的方法,其中干擾素為干擾素α。
      7.權(quán)利要求5的方法,其中干擾素為干擾素γ。
      8.權(quán)利要求5的方法,其中干擾素為干擾素β。
      9.獨(dú)立地任選地處于藥用可接受載體中的β-L-FTC、L-FMAU和干擾素或它們的藥用可接受的鹽或前體的聯(lián)合在治療感染乙型肝炎病毒的宿主中的用途。
      10.權(quán)利要求9的用途,其中β-L-FTC為基本純的形式。
      11.權(quán)利要求9的用途,其中按β-L-異構(gòu)體的重量β-L-FTC至少占90%。
      12.權(quán)利要求9的用途,其中按β-L-異構(gòu)體的重量β-L-FTC至少占95%。
      13.權(quán)利要求9的用途,其中干擾素選自干擾素α、聚乙二醇化干擾素、干擾素α-2a、干擾素α-2b、聚乙二醇化干擾素α-2a、聚乙二醇化干擾素α-2b ROFERON-A(干擾素α-2a)、PEGASYS(聚乙二醇化干擾素α-2a)、INTRONA(干擾素α-2b)、PEG-INTRON(聚乙二醇化干擾素α-2b)、干擾素β、干擾素γ、干擾素ι、干擾素ω、一致干擾素、INFERGEN(干擾素alphacon-1)、OMNIFERON(天然干擾素)、REBIF(干擾素β-1a)、ω干擾素、口服干擾素α、干擾素γ-1b、SuperFeron(天然人多亞型IFN-α)和HuFeron(人IFN-β)。
      14.權(quán)利要求13的用途,其中干擾素為干擾素α。
      15.權(quán)利要求13的用途,其中干擾素為干擾素γ。
      16.權(quán)利要求13的用途,其中干擾素為干擾素β。
      全文摘要
      L-FMAU與FTC及干擾素,如干擾素α或干擾素γ聯(lián)合/或輪流使用治療乙型肝炎病毒感染療效更優(yōu)。
      文檔編號A61K38/21GK1681518SQ03821877
      公開日2005年10月12日 申請日期2003年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月15日
      發(fā)明者P·A·福爾曼 申請人:基利得科學(xué)公司
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