專利名稱：診斷結(jié)腸癌和胃癌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)腸癌或胃癌的診斷方法。
背景技術(shù)：
在世界范圍內(nèi)，結(jié)腸直腸癌和胃癌是癌癥造成的死亡的主要原因。盡管近來在診斷和治療策略上取得進(jìn)展，但晚期癌患者的預(yù)后仍非常差。雖然分子研究已揭示出腫瘤抑制基因和/或癌基因的改變與其致癌作用有關(guān)，但精確機(jī)制仍需要詳細(xì)闡明。
cDNA微陣列技術(shù)已使得可獲得正常和惡性細(xì)胞中基因表達(dá)的廣泛表達(dá)分布圖，以及惡性和相應(yīng)正常細(xì)胞中基因表達(dá)的比較(Okabe等，CancerRes 612129-37(2001)；Kitahara等，Cancer Res 613544-9(2001)；Lin等，Oncogene 214120-8(2002)；Hasegawa等，Cancer Res 627012-7(2002))。該方法能夠揭示癌細(xì)胞的復(fù)雜性質(zhì)，并能幫助理解致癌機(jī)理。鑒定在腫瘤中去調(diào)節(jié)(deregulate)的基因能導(dǎo)致對個體癌癥更為精準(zhǔn)的診斷，并能發(fā)展新的治療靶(Bienz和Clevers，Cell 103311-20(2000))。為了從基因組的角度揭示腫瘤的潛在機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)用于診斷和發(fā)展新的治療藥的靶分子，本發(fā)明人采用23040個基因的cDNA微陣列分析了腫瘤細(xì)胞的表達(dá)分布圖(Okabe等，Cancer Res 612129-37(2001)；Kitahara等，Cancer Res 613544-9(2001)；Lin等，Oncogene 214120-8(2002)；Hasegawa等，Cancer Res627012-7(2002))。
意在揭示致癌機(jī)理的研究已促進(jìn)了對抗腫瘤劑分子靶的鑒定。例如，法尼酰轉(zhuǎn)移酶(farnexyltransferase)(FTI)的抑制劑已被有效用于在動物模型中治療Ras依賴性腫瘤，所述抑制劑最初被發(fā)展用于抑制與Ras相關(guān)的生長信號通路，Ras的激活依賴翻譯后法尼基化(posttranslational farnesylation)(He等，Cell 99335-45(1999))。已聯(lián)合利用抗癌藥及抗HER2單克隆抗體trastuzumab對人類進(jìn)行了臨床試驗，用以拮抗原癌基因受體HER2/neu；并已獲得乳癌患者的臨床反應(yīng)和總生存率的改善(Lin等，Cancer Res616345-9(2001))。選擇性滅活bcr-abl融合蛋白質(zhì)的酪氨酸激酶抑制劑(STI-571)已被發(fā)展用于治療慢性髓細(xì)胞性白血病，在該疾病中，bcr-abl酪氨酸激酶的組成性激活(constitutive activation)在白細(xì)胞轉(zhuǎn)化中發(fā)揮決定性作用。這類藥劑意在抑制特定基因產(chǎn)物的致癌活性(Fujita等，Cancer Res617722-6(2001))。因此，在癌性細(xì)胞中通常被上調(diào)的基因產(chǎn)物可作為發(fā)展新抗癌劑的潛在靶點。
已經(jīng)證實，CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)能識別在MHCI類分子上呈遞的來源于腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)的表位肽，并溶解腫瘤細(xì)胞。自從MAGE家族作為第一例TAA被發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)采用免疫學(xué)方法發(fā)現(xiàn)了許多其它TAA(Boon，Int J Cancer 54177-80(1993)；Boon和van der Bruggen，J Exp Med183725-9(1996)；van der Bruggen等，Science 2541643-7(1991)；Brichard等，J Exp Med 178489-95(1993)；Kawakami等，J Exp Med 180347-52(1994))。所發(fā)現(xiàn)的某些TAA現(xiàn)已作為免疫治療靶點而處于臨床開發(fā)階段。到目前為止發(fā)現(xiàn)的TAA包括MAGE(van der Bruggen等，Science 2541643-7(1991))，gp100(Kawakami等，J Exp Med 180347-52(1994))，SART(Shichijo等，J Exp Med 187277-88(1998))，和NY-ESO-1(Chen等，Proc Natl Acad Sci USA 941914-8(1997))。另一方面，已被證實在腫瘤細(xì)胞中特異性過表達(dá)的基因產(chǎn)物已顯示出可被識別為誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的靶點。所述基因產(chǎn)物包括p53(Umano等，Brit J Cancer 841052-7(2001))，HER2/neu(Tanaka等，Brit J Cancer 8494-9(2001))，CEA(Nukaya等，Int JCancer 8092-7(1999))，等。
盡管關(guān)于TAA的基礎(chǔ)和臨床研究已取得顯著進(jìn)展(Rosenbeg等，NatureMed 4321-7(1998)；Mukherji等，Proc Natl Acad Sci USA 928078-82(1995)；Hu等，Cancer Res 562479-83(1996))，但用于治療腺癌(包括結(jié)腸直腸癌)的可用候補(bǔ)(candidate)TAA的數(shù)量是有限的。在癌細(xì)胞中大量表達(dá)，同時其表達(dá)限于癌細(xì)胞的TAA應(yīng)該是免疫治療靶的有希望的候補(bǔ)物(candidate)。此外，對誘導(dǎo)有效且特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)的新型TAA的鑒定被預(yù)期能夠促進(jìn)肽接種策略在多種類型癌中的臨床使用(Boon和can der Bruggen，J ExpMed 183725-9(1996)；van der Bruggen等，Science 2541643-7(1991)；Brichard等，J Exp Med 178489-95(1993)；Kawakami等，J Exp Med 180347-52(1994)；Shichijo等，J Exp Med 187277-88(1998)；Chen等，Proc NatlAcad Sci USA 941914-8(1997)；Harris，J Natl Cancer Inst 881442-5(1996)；Butterfield等，Cancer Res 593134-42(1999)；Vissers等，Cancer Res 595554-9(1999)；van der Burg等，J Immunol 1563308-14(1996)；Tanaka等，Cancer Res 574465-8(1997)；Fujie等，Int J Cancer 80169-72(1999)；Kikuchi等，Int J Cancer 81459-66(1999)；Oiso等，Int J Cancer 81387-94(1999))。
已有報道重復(fù)指出，來自具體健康供體的肽刺激的外周血單核細(xì)胞(PBMC)對該肽產(chǎn)生響應(yīng)而產(chǎn)生顯著水平的IFN-γ，但在鉻-51釋放試驗中幾乎不以HLA-A24或-A0201限制性圖譜發(fā)揮針對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用(Kawano等，Cance Res 603550-8(2000)；Nishizaka等，Cancer Res 604830-7(2000)；Tamura等，Jpn J Cancer Res 92762-7(2001))。但是，HLA-A24和HLA-A0201均為一種在日本人以及高加索人中常見的HLA等位基因(Date等，Tissue Antigens 4793-101(1996)；Kondo等，J Immunol 1554307-12(1995)；Kubo等，J Immunol 1523913-24(1994)；Imanishi等，Proceeding of the eleventh International Hictocompatibility Workshop andConference Oxford University Press，Oxford，1065(1992)；Williams等，TissueAntigen 49129(1997))。因此，由這些HLA所呈遞的癌抗原肽特別適用于治療日本人和高加索人中的癌癥。此外，已知在體外誘導(dǎo)低親和力CTL通常是使用高濃度肽的結(jié)果，所述高濃度肽的使用在抗原呈遞細(xì)胞(APC)上生成高水平特異性肽/MHC復(fù)合物，所述復(fù)合物將有效激活這些CTL(Alexander-Miller等，Proe Natl Acad Sci USA 934102-7(1996))。
發(fā)明概述本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)，即基因的表達(dá)圖譜與癌性狀態(tài)，例如，結(jié)腸癌或胃癌相關(guān)。在結(jié)腸癌或胃癌中差異性表達(dá)的基因在本文中被統(tǒng)稱為“CGX核酸”或“CGX多核苷酸”，而編碼的相應(yīng)多肽被稱為“CGX多肽”或“CGX蛋白質(zhì)”。
由此，本發(fā)明描述了診斷或測定個體中患結(jié)腸癌或胃癌傾向性的方法的特征，所述方法通過測定來源于患者的生物樣品諸如組織樣品中的結(jié)腸癌或胃癌關(guān)聯(lián)基因(colon and gastric cancer associated gene)的表達(dá)水平而進(jìn)行。結(jié)腸癌或胃癌關(guān)聯(lián)基因是指特征在于在結(jié)腸癌或胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平與正常(或非結(jié)腸癌或胃癌)細(xì)胞不同的基因。例如，結(jié)腸癌或胃癌關(guān)聯(lián)基因包括例如CGX 1-8?；虮磉_(dá)水平相對于基因正常對照水平的改變(例如增加或降低)提示該個體患有或易患結(jié)腸癌或胃癌。
正常對照水平是指在正常、健康個體或已知未患結(jié)腸癌或胃癌的個體的群體中檢測到的基因表達(dá)水平。對照水平是從單一對照群或多個表達(dá)圖譜中得到的單一表達(dá)圖譜。例如，對照水平可以是來自以前檢測的細(xì)胞的表達(dá)圖譜數(shù)據(jù)庫。
被驗樣品中所檢測的CGX 1-8水平相對于正常對照水平的增加表明所述個體(從該個體中獲得樣品)患有或易患結(jié)腸癌或胃癌。
或者，將樣品中各種結(jié)腸癌或胃癌關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)與相同基因種類的結(jié)腸癌或胃癌對照水平進(jìn)行比較。結(jié)腸癌或胃癌對照水平是指在患有結(jié)腸癌或胃癌的群體中發(fā)現(xiàn)的結(jié)腸癌或胃癌關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)分布圖。
基因表達(dá)比對照水平增加了10％、25％、50％?；蛘撸虮磉_(dá)比對照水平增加了1、2、5或更多倍。表達(dá)可通過在例如陣列上檢測結(jié)腸癌或胃癌關(guān)聯(lián)基因探針與來源于患者的組織樣品的基因轉(zhuǎn)錄物的雜交進(jìn)行測定。
來源于患者的組織樣品是來自試驗個體，例如，已知患有或疑似患有結(jié)腸癌或胃癌的患者的任何組織。例如，該組織包含腫瘤細(xì)胞。例如，該組織是來自結(jié)腸或胃的腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了兩種或多種CGX 1-8的基因表達(dá)水平的結(jié)腸癌或胃癌對照表達(dá)分布圖?；蛘?，本發(fā)明提供了兩種或多種CGX 1-8表達(dá)水平的結(jié)腸癌或胃癌對照表達(dá)分布圖。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了鑒定抑制結(jié)腸癌或胃癌關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)或活性的藥劑的方法，其通過將表達(dá)結(jié)腸癌或胃癌關(guān)聯(lián)基因的被驗細(xì)胞與被驗藥劑接觸以及測定結(jié)腸癌或胃癌關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)水平而實施。所述被驗細(xì)胞是上皮細(xì)胞諸如來自結(jié)腸或胃的上皮細(xì)胞。所述水平相對于基因正常對照水平的降低表明該被驗藥劑是結(jié)腸癌或胃癌關(guān)聯(lián)基因的抑制劑。此外，酵母雙雜交篩選實驗(yeast two hybrid screening assay)揭示出分別與Zyxin、MGC10334或CENPC1、BRD8和nCLU相關(guān)的ARHCL1、NFXL1、C20orf20，和CCPUCC1蛋白質(zhì)。結(jié)腸癌可經(jīng)由對蛋白質(zhì)相關(guān)性的抑制可被治療。由此，本發(fā)明提供了篩選用于治療結(jié)腸癌的化合物的方法，其中該方法包括在存在被驗化合物的情況下與所述蛋白質(zhì)接觸，并選擇抑制所述蛋白質(zhì)結(jié)合的被驗化合物。
本發(fā)明還提供了含有檢測試劑的試劑盒，該檢測試劑與兩種或多種CGX核酸序列結(jié)合或與該核酸序列編碼的基因產(chǎn)物結(jié)合。還提供了與兩種或多種CGX核酸結(jié)合的核酸的陣列。
治療方法包括通過對個體施用反義組合物而治療或預(yù)防個體中結(jié)腸癌或胃癌的方法。該反義組合物降低特異性靶基因的表達(dá)，例如，該反義組合物包含核苷酸，所述核酸與選自CGX 1-8的序列互補(bǔ)。其它方法包括對個體施用短干擾RNA(siRNA)組合物的步驟。siRNA組合物降低選自CGX1-8的核酸的表達(dá)。而在另一方法中，治療或預(yù)防個體中結(jié)腸癌或胃癌通過對個體施用核酶組合物來實施。核酸特異性核酶組合物降低選自CGX 1-8的核酸的表達(dá)。
本發(fā)明還包括疫苗和疫苗接種方法。例如，治療或預(yù)防個體中結(jié)腸癌或胃癌的方法通過對個體施用疫苗來實施，所述疫苗包含由選自CGX 1-8的核酸編碼的多肽或所述多肽的免疫活性片段。免疫活性片段是長度短于全長天然存在的蛋白質(zhì)并能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的多肽。例如，免疫活性片段的長度至少為8個殘基，且能刺激免疫細(xì)胞諸如T細(xì)胞或B細(xì)胞。通過檢測細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子(例如，IL-2)的加工(elaboration)，或抗體的生成可檢測免疫細(xì)胞的刺激。
此外，本發(fā)明提供了分離的新基因，ARHCL1，NFXL1，C20orf20，LEMD1，和CCPUCC1，其是用于結(jié)腸直腸癌診斷標(biāo)記的候補(bǔ)物和發(fā)展診斷新策略和有效抗癌劑的有希望的潛在靶點。此外，本發(fā)明提供了這些基因所編碼的多肽，及其制備和用途。更具體地，本發(fā)明提供了以下內(nèi)容本申請?zhí)峁┝诵滦腿祟惗嚯?，ARHCL1，NFXL1，C20orf20，LEMD1，和CCPUCC1，或其功能等價物，所述多肽或其功能等價物能促進(jìn)細(xì)胞增殖，且在結(jié)腸直腸癌中被上調(diào)。
在優(yōu)選的實施方案中，ARHCL1多肽包括推定的514個氨基酸的蛋白質(zhì)，其與人類假定蛋白質(zhì)DKFZp434P1514.1具有約68.7％的同一性，與小鼠RIKEN cDNA 2310008J22具有61.45％的同一性。采用Simple ModularArchitecture Research Tool(SMART，http//smart.embl-heidelberg.de)對蛋白質(zhì)基序的研究揭示出該預(yù)測的蛋白質(zhì)包含絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶(2C家族)催化區(qū)(密碼子68-506)(圖3b)。ARHCL1多肽優(yōu)選包括SEQ ID NO2中所示氨基酸序列。本申請還提供了分離的蛋白質(zhì)，其由至少部分ARHCL1多核苷酸序列，或由與SEQ ID NO1所示序列至少70％，和更優(yōu)選至少80％互補(bǔ)的多核苷酸序列所編碼。ARHCL1與Zyxin相結(jié)合。Zyxin是包含N末端富脯氨酸區(qū)(proline-rich region)和C末端區(qū)中的三個LIM區(qū)域的磷蛋白(Macalma，T.等J.Biol.Chem.27131470-31478，1996)。通過Northern印跡分析發(fā)現(xiàn)Zyxin是遍在表達(dá)的，且該蛋白質(zhì)在具有肌動蛋白絲束的局部粘著斑(focal adhesion plaque)濃聚，Zyxin在有絲分裂細(xì)胞中有絲分裂細(xì)胞器集中的細(xì)胞質(zhì)中廣泛地分布，(Hirota，T.等J.Cell Biol.1491073-1086，2000)。Zyxin被CDC2激酶磷酸化，并與LATS1腫瘤抑制物相互作用。因此，Zyxin可通過與LATS1的相互作用而調(diào)節(jié)肌動蛋白絲和靶有絲分裂細(xì)胞器的組裝。
在優(yōu)選的實施方案中，C20orf20多肽包括推定的204個氨基酸的蛋白質(zhì)，其與小鼠RIKEN cDNA 1600027N09(XM_110403)具有約96.6％的同一性。采用Simple Modular Architecture Research Tool對蛋白質(zhì)基序的研究未預(yù)測出任何已知的保守結(jié)構(gòu)域(

圖16b)。C20orf20多肽優(yōu)選包括SEQ ID NO4中所列氨基酸序列。本申請還提供了分離的蛋白質(zhì)，其由至少部分C20orf20多核苷酸序列編碼，或由與SEQ ID NO3所示序列至少97％，和更優(yōu)選至少99％互補(bǔ)的多核苷酸序列所編碼。C20orf20與BRD8相結(jié)合。BRD8蛋白質(zhì)包含位于其C末端的溴結(jié)構(gòu)域(bromodomain)，許多酸性殘基，和一些富脯氨酸區(qū)段(Nielsen，M.S.等Biochim.Biophys.Acta 130614-16，1996)。BRD8是細(xì)胞核受體激動劑，其與甲狀腺激素受體和雄激素受體相互作用并激活其轉(zhuǎn)錄活性(Monden，T.等J.Biol.Chem.27229834-29841，1997)。
在優(yōu)選的實施方案中，CCPUCC1多肽包括推定的413個氨基酸的蛋白質(zhì)，其具有與小鼠RIKEN cDNA 2610111M03(AK011846)約89％的同一性。由于采用Simple Modular Architecture Research Tool對蛋白質(zhì)基序的研究揭示了該預(yù)測的蛋白質(zhì)包含卷曲螺旋區(qū)(coiled-coil region)(密碼子195-267)，我們將其基因命名為CCPUCC1(在結(jié)腸癌中被上調(diào)的卷曲螺旋蛋白質(zhì))。CCPUCC1多肽優(yōu)選包括SEQ ID NO6中所示氨基酸序列。本申請還提供了分離的蛋白質(zhì)，其由至少部分CCPUCC1多核苷酸序列編碼，或由與SEQID NO5中所示序列至少90％，和更優(yōu)選至少95％互補(bǔ)的多核苷酸序列所編碼。CCPUCC1與nCLU相結(jié)合。核叢生蛋白(nCLU)是CLU基因的選擇性剪接轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)物。外顯子I和III通過外顯子II遺漏(skipping)(其產(chǎn)生外顯子III中AUG的第一個可得的翻譯起始位點)而被剪接在一起。該較短mRNA產(chǎn)生49-kDa前體nCLU蛋白質(zhì)(Leskov K.S.等J.Biol.Chem.27811590-11600，2003)。核叢生蛋白(nCLU)是與Ku70結(jié)合的蛋白質(zhì)。電離輻射(IR)誘導(dǎo)nCLU，其過表達(dá)在MCF-7細(xì)胞中觸發(fā)凋亡。
在優(yōu)選的實施方案中，LEMD1多肽包括推定的29個氨基酸的蛋白質(zhì)(LEMD1S)。采用Simple Modular Architecture Research Tool對蛋白質(zhì)基序的研究揭示了該預(yù)測的蛋白質(zhì)包含LEM基序(密碼子1-27)，我們將其基因命名為LEMD1(包含1的LEM域)(圖38a)。LEMD1多肽優(yōu)選包括SEQ ID NO8中所示氨基酸序列。此外，在優(yōu)選的實施方案中，LEMD1多肽包括其選擇性剪接形式。因此，LEMD1多肽包括推定的67個氨基酸的蛋白質(zhì)(LEMD1L)。LEMD1多肽優(yōu)選包括SEQ ID NO10中所列氨基酸序列。預(yù)測的LEMD1蛋白質(zhì)的氨基酸序列顯示出與人類假定蛋白質(zhì)的62％的同一性，所述人類假定蛋白質(zhì)與GenBank登錄號XM_050184的胸腺生成素(thymopoietin)相似。
本申請還提供了分離的蛋白質(zhì)，其由至少部分LEMD1多核苷酸序列編碼，或由與SEQ ID NO7或9所示序列至少70％，和更優(yōu)選至少80％互補(bǔ)的多核苷酸序列所編碼。
在優(yōu)選的實施方案中，NFXL1多肽包括推定的911個氨基酸的蛋白質(zhì)，其具有與人類NFX1(核轉(zhuǎn)錄因子，X-盒結(jié)合1)的約36.5％的同一性。采用簡單模塊結(jié)構(gòu)研究工具(Simple Modular Architecture Research Tool)對蛋白質(zhì)基序的研究揭示了該預(yù)測的蛋白質(zhì)包含環(huán)指結(jié)構(gòu)域(密碼子160-219)，12NFX型Zn指域(密碼子265-794)，卷曲螺旋區(qū)(密碼子822-873)，和跨膜區(qū)(密碼子889-906)(圖9b)。NFXL1多肽優(yōu)選包括SEQ ID NO12中所示氨基酸序列。本申請還提供了分離的蛋白質(zhì)，其由至少部分NFXL1多核苷酸序列或與SEQ ID NO11所示序列至少40％，和更優(yōu)選至少50％互補(bǔ)的多核苷酸序列所編碼。NFXL1與MGC10334或CENPC1相結(jié)合。免疫電子顯微術(shù)將CENPC1定位于內(nèi)動粒板(inner kinetochore plate)(Saitoh，H.等Cell 70115-125，1992)。
除非另有所述，本文所使用的所有技術(shù)術(shù)語和科技術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的相同。雖然與本文所述相似或相等的方法和材料均可用于本發(fā)明的實施或試驗中，但下面描述了適宜的方法和材料。本文所提及的所有出版物、專利申請、專利，和其它參考文件均為全文引入作為參考。假使沖突，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。此外，材料、方法，和實施例僅為說明性的，而并非意在進(jìn)行限制。
從以下詳述的說明中，以及從權(quán)利要求中可顯而易見地得出本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢。
附圖簡述圖1(a-g)是柱形圖，顯示在cDNA微陣列上，結(jié)腸癌組織中B6647，D7610，C4821，A8108，B9223，C3703，和D9092的相對表達(dá)率(癌/非癌)，其中的Cy3或Cy5信號強(qiáng)度高于各選擇基準(zhǔn)強(qiáng)度(cut-off intensity)。圖1(a)B6647；圖1(b)D7610；圖1(c)C4821；圖1(d)A8108；圖1(e)B9223；圖1(f)C3703；圖1(g)D9092。
圖2(a-g)是凝膠，顯示采用另外的結(jié)腸癌病例，通過半定量RT-PCR對(a)B6647，(b)D7610，(c)C4821，(d)A8108(e)B9223，(f)Ly6E，和(g)Nkd1的表達(dá)進(jìn)行分析。T，腫瘤組織；N，正常組織。將GAPDH的表達(dá)作為內(nèi)部對照。
圖3(a-b)顯示了ARHCL1的結(jié)構(gòu)。圖3(a)顯示了ARHCL1的多組織Northern印跡分析；圖3(b)是ARHCL1的基因組結(jié)構(gòu)和預(yù)測的ARHCL1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的示意圖。在上部圖形中，用具有ARHCL1 cDNA序列的核苷酸序號的空心方框來表示外顯子。
圖4(a-b)描述了標(biāo)記的ARHCL1蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。圖4(a)顯示了cMyc標(biāo)記的或Flag標(biāo)記的ARHCL1蛋白質(zhì)；圖4(b)描述了HCT15細(xì)胞中標(biāo)記的蛋白質(zhì)的免疫組織化學(xué)染色，通過FITC使之顯示，核用DAPI復(fù)染。
圖5(a-b)描述了ARHCL1(AS1)的反義S-寡核苷酸在SNU-C4或LoVo細(xì)胞中的生長抑制作用。圖5(a)顯示了通過半定量RT-PCR進(jìn)行檢測，與對照ARHCL1-R1(R1)相比，ARHCL1-AS1(AS1)降低ARHCL1表達(dá)的凝膠圖；圖5(b)是ARHCL1-AS1(AS1)或ARHCL1-R1(R1)轉(zhuǎn)染的存活SNU-C4和LoVo細(xì)胞的圖，用姬姆薩氏溶液進(jìn)行染色。
圖6顯示了在大腸桿菌細(xì)胞中制備與GST融合的ARHCL1蛋白質(zhì)。圖6(A)顯示了ARHCL1的結(jié)構(gòu)，以及表達(dá)與GST融合的N末端(ARHCL1-N)或C末端ARHCL1(ARHCL1-C)蛋白質(zhì)的質(zhì)粒的構(gòu)建。圖6(B)顯示了與GST融合的ARHCL1-N或ARHCL1-C蛋白質(zhì)的表達(dá)。上部圖形CBB染色。下部圖形采用抗GST抗體的免疫印跡分析。
圖7描述了通過酵母雙雜交系統(tǒng)鑒定與ARHCL1相互作用的蛋白質(zhì)。圖7(A)和(B)顯示了在酵母細(xì)胞中ARHCL1蛋白質(zhì)的N末端區(qū)和C末端區(qū)的相互作用以及鑒定的克隆。
圖8描述了體內(nèi)ARHCL1和Zyxin間的相互作用。圖8(A)顯示了Flag標(biāo)記的ARHCL1與HA標(biāo)記的Zyxin的免疫共沉淀結(jié)果。將從用pFlag或pFLAG-ARHCL1與pCMV-HA或pCMV-HA-Zyxin一起轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中提取的蛋白質(zhì)用抗Flag M2抗體進(jìn)行免疫沉淀。隨后，采用抗HA抗體進(jìn)行免疫印跡。圖8(B)顯示了ARHCL1和Zyxin在細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。細(xì)胞核用DAPI染色。
圖9(a-b)描述了NFXL1的結(jié)構(gòu)。圖9(a)顯示了NFXL1的多組織Northern印跡；圖9(b)描述了NFXL1基因組結(jié)構(gòu)和預(yù)測的NFXL1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的示意圖。在上部圖形中用空心方框表示外顯子。
圖10顯示了用NFXL1-AS(AS)或NFXL1-R(R)轉(zhuǎn)染的存活SW480和SNU-C4細(xì)胞，采用姬姆薩氏溶液染色。
圖11(A)描述了NFXL1-siRNA對NFXL1在SNU-C4細(xì)胞中表達(dá)的影響。(B)上部圖形經(jīng)對照-siRNA或NFXL1-siRNA處理的存活HCT116、SW480，或SNU-C4細(xì)胞的姬姆薩染色。下部圖形通過一式三份的MMT試驗檢測對EGFP-siRNA或NFXL1-siRNAs有響應(yīng)的存活細(xì)胞。
圖12描述了HA標(biāo)記的NFXL1蛋白質(zhì)在HCT116、SW480和COS7細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。
圖13描述了在大腸桿菌細(xì)胞中制備His標(biāo)記的NFXL1蛋白質(zhì)。圖13(A)描述了NFXL1的結(jié)構(gòu)，構(gòu)建表達(dá)His標(biāo)記的N末端(NFXL1-N)或C末端(NFXL1-C2)NFXL1的質(zhì)粒。圖13(B)和(C)描述了His標(biāo)記的NFXL1-N或NFXL1-C2蛋白質(zhì)的表達(dá)。左側(cè)圖形CBB染色。右側(cè)圖形用抗His-tag抗體免疫印跡。
圖14顯示了通過酵母雙雜交系統(tǒng)鑒定與NFXL1相互作用的蛋白質(zhì)。14(A)和(B)顯示，在酵母細(xì)胞中通過共轉(zhuǎn)化而證實NFXL1的N末端區(qū)或C末端區(qū)與所鑒定的克隆的相互作用。
圖15顯示了Flag標(biāo)記的NFXL1與HA標(biāo)記的MGC10334或CENPC1在體內(nèi)的免疫共沉淀結(jié)果。將從用pFlag或pFLAG-NFXL1與pCMV-HA-FLJ25348、pCMV-HA-MGC10334、pCMV-HA-CENPC1、pCMV-HA-SOX30或pCMV-HA-DKFZp564J047一起轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中提取的蛋白質(zhì)用抗Flag M2抗體進(jìn)行免疫沉淀。隨后，采用抗HA抗體進(jìn)行免疫印跡(1pCMV-HA-FLJ25348，2pCMV-HA-MGC10334，3pCMV-HA-CENPC1，4pCMV-HA-SOX30和5pCMV-HA-DKFZp564J047)。
圖16(a-b)描述了C20orf20的結(jié)構(gòu)。圖16(a)多種人類組織中C20orf20多組織Northern印跡；圖16(b)是描述C20orf20基因組結(jié)構(gòu)和預(yù)測的C20orf20蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的示意圖。在上部圖形中用空心方框表示外顯子。
圖17(a-b)描述了標(biāo)記的C20orf20蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。圖17(a)顯示了cMyc-或Flag標(biāo)記的C20orf20蛋白質(zhì)的免疫印跡；圖17(b)描述了COS7細(xì)胞中標(biāo)記的蛋白質(zhì)的免疫組織化學(xué)染色，通過FITC使之顯示，細(xì)胞核用DAPI復(fù)染。
圖18是用C20orf20-AS1(AS1)、C20orf20-AS2(AS2)、C20orf20-R1(R1)，或C20orf20-R1(R2)轉(zhuǎn)染的存活SNU-C4細(xì)胞用姬姆薩氏溶液染色的圖像。
圖19(A)顯示了C20orf20-siRNA對C20orf20的表達(dá)的影響結(jié)果。圖19(B)顯示了C20orf20-siRNA對HCT116和SW480細(xì)胞的存活力的影響結(jié)果。
圖20描述了在酵母雙雜交系統(tǒng)中C20orf20和BRD8間的相互作用。圖20(A)顯示了保守溴結(jié)構(gòu)域(Bromo domain)和BRD8的相互作用區(qū)。用條帶(bar)顯示負(fù)責(zé)相互作用的區(qū)域。圖20(B)顯示了在酵母細(xì)胞中C20orf20與BRD8的相互作用。圖20(C)顯示了C20orf20和BRD8在體內(nèi)的相互作用。來自用單獨的Flag-C20orf20或與Flag-C20orf20以及pCMV-HA-BRD8一起轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的提取物用抗FLAG M2抗體進(jìn)行免疫沉淀。用抗HA抗體進(jìn)行Western印跡分析。
圖21(a-b)描述了CCPUCC1的亞細(xì)胞定位。圖21(a)顯示了cMyc-或Flag標(biāo)記的CCPUCC1蛋白質(zhì)的免疫印跡；圖21(b)描述了COS7細(xì)胞中標(biāo)記的蛋白質(zhì)的免疫組織化學(xué)染色，通過FITC使之顯示，細(xì)胞核用DAPI復(fù)染。
圖22(a-c)顯示了CCPUCC1的反義S-寡核苷酸(CCPUCC1-AS3)在LoVo細(xì)胞中的生長抑制作用。圖22(a)是凝膠，顯示通過半定量RT-PCR檢測，CCPUCC1-AS3(AS3)與對照CCPUCC1-S3(S3)相比降低CCPUCC1的表達(dá)；圖22(b)是用CCPUCC1-AS3(AS3)或-S3(S3)轉(zhuǎn)染的存活LoVo細(xì)胞和未經(jīng)處理的細(xì)胞(模擬)，用姬姆薩氏溶液染色的圖像；圖22(c)是柱形圖，顯示通過MTT測定法檢測，用CCPUCC1-AS3(AS3)或CCPUCC1-S3(S3)轉(zhuǎn)染的LoVo細(xì)胞的存活力。
圖23(A)CCPUCC1-siRNA對CCPUCC1在SNU-C4細(xì)胞中表達(dá)的影響。(B)CCPUCC1-siRNA對SNU-C4細(xì)胞存活力的影響。
圖24(A)CCPUCC1-siRNA對CCPUCC1在HCT116細(xì)胞中表達(dá)的影響。(B)CCPUCC1-siRNA對HCT116細(xì)胞存活力的影響。
圖25顯示了結(jié)腸癌細(xì)胞中CCPUCC1的western印跡分析。
圖26顯示了HCT116細(xì)胞中CCPUCC1蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。
圖27(A)顯示了結(jié)腸癌組織中CCPUCC1的免疫組織化學(xué)染色圖。圖27(B)顯示了結(jié)腸腺瘤中CCPUCC1的免疫組織化學(xué)染色圖。
圖28顯示了通過酵母雙雜交系統(tǒng)將核叢生蛋白(nuclearclusterin)(nCLU)鑒定為與CCPUCC1相互作用的蛋白質(zhì)的結(jié)果。圖28(A)顯示了在酵母細(xì)胞中CCPUCC1與核叢生蛋白的相互作用。圖28(B)顯示了CCPUCC1和nCLU之間在體內(nèi)的相互作用。用CCPUCC1-myc和/或pFlag-叢生蛋白轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞。采用抗FLAG M2抗體或抗myc小鼠抗體進(jìn)行免疫沉淀。采用抗myc(上部圖形)或抗FLAG(下部圖形)抗體進(jìn)行Western印跡分析。CCPUCC1和C端CLU的條帶僅在經(jīng)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的裂解物的泳道內(nèi)發(fā)現(xiàn)，這提示CCPUCC1(上部圖形)與nCLU(下部圖形)蛋白質(zhì)在體內(nèi)發(fā)生相互作用。
圖29顯示了CCPUCC1和nCLU蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。圖29(A)是用pcDNA-myc-CCPUCC1和pFlag-叢生蛋白轉(zhuǎn)染并用小鼠抗myc抗體染色的COS7細(xì)胞的圖像。用FITC標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體使轉(zhuǎn)染細(xì)胞顯像。圖29(B)顯示了用兔抗FLAG抗體染色并用與羅丹明偶聯(lián)的抗兔抗體IgG使之顯像的細(xì)胞的圖像。圖29(C)顯示了A，B和D的合并圖像。圖29(D)顯示了用DAPI復(fù)染細(xì)胞核的圖。
圖30(a-b)描述了Ly6E的亞細(xì)胞定位。圖30(a)是cMyc標(biāo)記的Ly6E蛋白質(zhì)的免疫印跡；圖30(b)描述了SW480細(xì)胞中標(biāo)記的Ly6E蛋白質(zhì)的免疫組織化學(xué)染色，通過FITC是指顯像。細(xì)胞核用DAPI復(fù)染。
圖31(a-c)顯示了Ly6E的反義S-寡核苷酸(Ly6E-AS1，或-AS5)在LoVo細(xì)胞中的生長抑制作用。圖31(a)是凝膠，顯示通過半定量RT-PCR檢測，Ly6E-AS1(AS1)或-AS5(AS5)與對照Ly6E-S1(S1)或S5(S5)相比降低Ly6E的表達(dá)；圖31(b)是用Ly6E-AS1(AS1)，-S1(S1)，-AS5(AS5)或-S5(S5)轉(zhuǎn)染的存活結(jié)腸癌細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(模擬)用姬姆薩氏溶液染色的圖像；圖31(c)是柱形圖，其顯示通過MTT測定法檢測的，用Ly6E-AS1(AS1)，-S1(S1)，-AS5(AS5)或-S5(S5)轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌細(xì)胞的存活力。
圖32顯示了Nkd1的多組織Northern印跡。
圖33(a-c)顯示了Nkd1的反義S-寡核苷酸(Nkd1-AS4，或-AS5)在LoVo和Sw480細(xì)胞中的生長抑制作用。圖33(a)是凝膠，其顯示通過半定量RT-PCR檢測，Nkd1-AS4(AS4)或-AS5(AS5)與對照Nkd1-S4(S4)或-S5(S5)相比降低Nkd1的表達(dá)；圖33(b)是用Nkd1-AS4(AS4)，-S4(S4)，-AS5(AS5)或-S5(S5)轉(zhuǎn)染的存活結(jié)腸癌細(xì)胞以及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(模擬)用姬姆薩氏溶液染色的圖像；圖33(c)是柱形圖，顯示通過MTT檢測，用Nkd1-AS4(AS4)，-S4(S4)，-AS5(AS5)或-S5(S5)轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌細(xì)胞的存活力。
圖34(a-b)顯示了B0338在胃癌中的表達(dá)。圖34(a)是柱形圖，顯示在16例胃癌組織中B0338在cDNA微陣列上的相對表達(dá)率(癌/非癌)，其中Cy3或Cy5信號強(qiáng)度大于選擇基準(zhǔn)值；圖34(b)是凝膠，顯示通過半定量RT-PCR分析的LAPTM4β的表達(dá)T，腫瘤組織；N，正常組織。將GAPDH的表達(dá)作為內(nèi)部對照。
圖35(a-b)顯示了LAPTM4β的結(jié)構(gòu)。圖35(a)顯示了LAPTM4β的多組織Northern印跡；圖35(b)是四個LAPTM4β蛋白質(zhì)跨膜區(qū)的示意圖。
圖36顯示了NIH3T3細(xì)胞中cMyc-或Flag標(biāo)記的LAPTM4β蛋白質(zhì)的免疫組織化學(xué)染色，通過FITC使之顯像。細(xì)胞核用DAPI復(fù)染。
圖37(a-c)顯示了LAPTM4β的反義S-寡核苷酸(LAPTM4β-AS)在MKN1和MKN7胃癌細(xì)胞中的生長抑制作用。圖37(a)是凝膠，顯示了通過半定量RT-PCR檢測，LAPTM4β-AS(AS)與對照LAPTM4β-S(S)、-SCR(SCR)或-REV(REV)相比降低LAPTM4β表達(dá)的；圖37(b)用LAPTM4β-反義(AS)、-REV(REV)，-SCR(SCR)或-S(S)轉(zhuǎn)染的存活胃癌細(xì)胞以及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(模擬)用姬姆薩氏溶液染色的圖像；圖37(c)是柱形圖，顯示了通過MTT測定法檢測，用LAPTM4β-AS(AS)或?qū)φ?S、SCR或REV)S-寡核苷酸轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞的存活力。顯示了相對未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的值。
圖38(a-b)描述了LEMD1的結(jié)構(gòu)。圖38(a)是LEMD1的基因組結(jié)構(gòu)的示意圖；在上部圖形中用空心方框表示外顯子。圖38(b)顯示了多種成年人類組織中LEMD1的多組織Northern印跡。
圖39是LEMD1-AS1(AS1)、LEMD1-AS2(AS2)、LEMD1-AS3(AS3)、LEMD1-AS4(AS4)、LEMD1-AS5(AS5)、LEMD1-REV1(REV1)、LEMD1-REV2(REV2)、LEMD1-REV3(REV3)、LEMD1-REV4(REV4)或LEMD1-REV5(REV5)轉(zhuǎn)染的存活HCT116細(xì)胞用姬姆薩氏溶液染色的圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于如下發(fā)現(xiàn)，在來自結(jié)腸癌或胃癌患者的結(jié)腸和胃的細(xì)胞中存在多個核酸序列表達(dá)的圖譜改變。采用綜合(comprehensive)cDNA微陣列系統(tǒng)可以鑒定基因表達(dá)的差異。
表達(dá)水平在結(jié)腸癌或胃癌患者中被調(diào)節(jié)(即，增高)的基因在本文中被統(tǒng)稱為“CGX核酸”或“CGX多核苷酸”，而相應(yīng)編碼的多肽被稱為“CGX多肽”或“CGX蛋白質(zhì)”。除非另有說明，“CGX”意指本文所述的任何序列(例如，CGX 1-8)。
表達(dá)水平在結(jié)腸直腸癌中增高的7種基因已被鑒定。這7種基因在本文中被稱為結(jié)腸癌關(guān)聯(lián)基因。其中5種是新的，而2種是先前已知的、但其與結(jié)腸癌的相關(guān)性未知的基因。所述5種新型基因包括ARHCL1(“CGX1”)，NFXL1(“CGX2”)，C20orf20(“CGX3”)，LEMD1(“CGX4”)，和CCPUCC1(“CGX5”)。下述表1中總結(jié)了該新的結(jié)腸癌關(guān)聯(lián)基因，而序列表中給出了其核酸和多肽序列。所述已知基因包括Ly6E(“CGX6”)和Nkd1(“CGX7”)。已鑒定在胃癌中表達(dá)水平增加的一種已知基因LAPTM4β(“CGX8”)。該基因在本文中被稱為胃癌相關(guān)基因。
通過檢測細(xì)胞樣品中多種基因的表達(dá)，可在細(xì)胞或細(xì)胞群中確定結(jié)腸癌或胃癌。相似地，通過檢測這些基因在對多種藥劑響應(yīng)下的表達(dá)，可以鑒定出治療結(jié)腸癌或胃癌的藥劑。
表1
本發(fā)明涉及測定(例如，測量)至少一種，以及直至全部CGX序列的表達(dá)。采用GeneBank數(shù)據(jù)庫條目所提供的已知序列的序列信息，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的的技術(shù)來檢測和測定結(jié)腸癌或胃癌關(guān)聯(lián)基因。例如，與CGX序列相應(yīng)的序列數(shù)據(jù)庫條目中的序列可被用于構(gòu)建在例如，Northern印跡雜交分析中檢測CGX RNA序列的探針。作為另一實例，該序列可用于構(gòu)建引物，所述引物特異性地用于在例如基于擴(kuò)增的檢測方法(諸如基于反轉(zhuǎn)錄的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等)中擴(kuò)增CGX序列。
然后將被驗細(xì)胞群(例如，來源于患者的組織樣品)中的一種或多種CGX序列的表達(dá)水平與參照群中一些序列的表達(dá)水平進(jìn)行比較。對照細(xì)胞群包括其對照參數(shù)已知的一種或多種細(xì)胞，即，該細(xì)胞是癌性或非癌性的。
被驗細(xì)胞群中基因表達(dá)水平與參照細(xì)胞群相比較是否能夠揭示出被檢測參數(shù)的存在有賴于參照細(xì)胞群的組成。例如，如果參照細(xì)胞群由非癌性細(xì)胞組成，被驗細(xì)胞群和參照細(xì)胞群中相似的基因表達(dá)水平表明該被驗細(xì)胞群是非癌性的。相反地，如果參照細(xì)胞群由癌性細(xì)胞組成，被驗細(xì)胞群和參照細(xì)胞群間相似的基因表達(dá)分布圖表明該被驗細(xì)胞群包括癌性細(xì)胞。
如果被驗細(xì)胞群中CGX序列的表達(dá)水平相對于參照細(xì)胞群的改變是該參照細(xì)胞群中相應(yīng)CGX序列的表達(dá)水平的1.0、1.5、2.0、5.0、10.0倍或以上或者更多倍，則可認(rèn)為被驗細(xì)胞群中CGX序列的表達(dá)水平上改變。
如有需要，可利用對照核酸來比較被驗細(xì)胞群和參照細(xì)胞群的差異性表達(dá)序列，所述對照核酸的表達(dá)不依賴于檢測的參數(shù)或疾病。例如，對照核酸是已知不依賴于細(xì)胞的癌性或非癌性狀態(tài)而改變的核酸。對照核酸在被驗核酸以及參照核酸中的表達(dá)水平可用于對所比較的群體中的信號水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。對照基因可以是，例如，β-肌動蛋白，甘油醛3-磷酸脫氫酶或核糖體蛋白P1。
將被驗細(xì)胞群與多個參照細(xì)胞群進(jìn)行比較。多個參照群中的每個群在已知參數(shù)上可存在差異。因此，可將被驗細(xì)胞群與已知包含例如結(jié)腸癌或胃癌細(xì)胞的第二參照細(xì)胞群以及已知包含例如非結(jié)腸癌或胃癌細(xì)胞的第二對照群進(jìn)行比較。被驗細(xì)胞包含在來自已知包含，或疑似包含結(jié)腸癌或胃癌細(xì)胞的個體的組織類型或細(xì)胞樣品中。
被驗細(xì)胞獲自身體組織或體液(諸如尿液、糞便、胃分泌液或血液)，例如，身體組織(諸如結(jié)腸，或胃)。例如，被驗細(xì)胞從結(jié)腸或胃組織中純化。
參照細(xì)胞群中的細(xì)胞來自于與被驗細(xì)胞相似的組織類型，例如，結(jié)腸或胃的粘膜組織。在一些實施方案中，對照細(xì)胞所來源的個體與被驗細(xì)胞的相同，例如，來自于被驗細(xì)胞的起源區(qū)域的鄰近區(qū)域?；蛘撸瑓⒄占?xì)胞群來自于分子信息數(shù)據(jù)庫，所述分子信息數(shù)據(jù)庫來源于測定參數(shù)或條件均已知的細(xì)胞。
所述個體優(yōu)選是哺乳動物。所述哺乳動物可以是，例如，人類、非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬，或母牛。
測定CGX 1-8所示1、2、3、4、5或更多個序列的表達(dá)，如有需要，這些序列的表達(dá)可與其它序列一起測定，所述其它序列的表達(dá)水平已知根據(jù)本文所述的一種參數(shù)或疾病，例如，結(jié)腸癌或胃癌或者非結(jié)腸癌或胃癌而改變。
采用本領(lǐng)域任何已知的方法對本文所述基因的表達(dá)在RNA水平進(jìn)行測定。例如，采用特異性識別一種或多種這些序列的探針的Northern雜交分析可被用于測定基因表達(dá)?；蛘?，采用基于反轉(zhuǎn)錄的PCR測定法，例如采用針對差異性表達(dá)序列的特異性引物可對表達(dá)進(jìn)行檢測。
表達(dá)還可在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行測定，即，通過檢測本文所述基因產(chǎn)物所編碼的多肽的水平或其生物活性。所述方法是本領(lǐng)域眾所周知的，其包括，例如，基于抗所述基因所編碼蛋白質(zhì)的抗體的免疫測定法。所述基因所編碼蛋白質(zhì)的生物活性也是眾所周知的。
當(dāng)基因表達(dá)的改變與基因擴(kuò)增或缺失相關(guān)時，可通過比較試驗和參照細(xì)胞群中所檢測的DNA序列的相對量而對試驗和對照群中的序列進(jìn)行比較。
診斷結(jié)腸癌或胃癌通過檢測來自包含或疑似包含結(jié)腸癌或胃癌細(xì)胞的被驗細(xì)胞群(即，來源于患者的生物樣品)的一種或多種CGX核酸序列的表達(dá)可診斷結(jié)腸癌或胃癌。優(yōu)選地，該被驗細(xì)胞群包括上皮細(xì)胞。最優(yōu)選地，該細(xì)胞群包括來自結(jié)腸或胃的粘膜細(xì)胞。其它生物樣品可用于檢測蛋白質(zhì)水平。例如，通過免疫測定法或生物分析法可測定來自待診斷的個體的血液或血清中的蛋白質(zhì)水平。
在被驗細(xì)胞或生物樣品中測定一種或多種結(jié)腸癌或胃癌關(guān)聯(lián)基因例如CGX 1-8的表達(dá)，并將其與正常對照水平的表達(dá)進(jìn)行比較。正常對照水平是指通常見于未患結(jié)腸癌或胃癌的群體中的結(jié)腸癌或胃癌關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)分布圖。來源于患者的組織樣品中結(jié)腸癌或胃癌關(guān)聯(lián)基因表達(dá)水平的增加或降低表明該個體患有或易患結(jié)腸癌或胃癌。例如，試驗群中CGX 1-8的表達(dá)與正常對照水平相比的增加表明該個體患有或易患結(jié)腸癌或胃癌。
當(dāng)與正常對照水平相比，試驗群中50％、60％、80％、90％或更高的結(jié)腸癌或胃癌關(guān)聯(lián)基因發(fā)生改變時，這表明該個體患有或易患結(jié)腸癌或胃癌。
或者，如果將試驗群中結(jié)腸癌或胃癌關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)與患有結(jié)腸癌或胃癌的群體的表達(dá)分布圖相比較，CGX 1-8表達(dá)的降低表明該個體不患有結(jié)腸癌或胃癌。
具體樣品中CGX 1-8的表達(dá)水平可通過對與其相應(yīng)的mRNA或由CGX1-8編碼的蛋白質(zhì)的定量來進(jìn)行評估。mRNA的定量方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，CGX 1-8的相應(yīng)mRNA水平可通過Northern印跡或RT-PCR進(jìn)行評估。因此SEQ ID NO1、3、5、7、9，或11中顯示了CGX 1-5的全長核苷酸序列?；蛘?，CGX 6-8的核苷酸序列已被報道。任何本領(lǐng)域技術(shù)人員均可設(shè)計出用于定量CGX 1-8的探針或引物的核苷酸序列。
CGX 1-8的表達(dá)水平還可根據(jù)所述基因編碼的蛋白質(zhì)的活性或量進(jìn)行分析。用于測定CGX 1-8蛋白質(zhì)的量的方法如下所示。例如，免疫測定法可用于測定生物材料中的蛋白質(zhì)。任何生物材料均可用于測定蛋白質(zhì)或其活性。例如，分析血液樣品可以估計血清標(biāo)記物所編碼的蛋白質(zhì)。另一方面，可選擇適宜的方法從而根據(jù)要分析的每種蛋白質(zhì)的活性來測定由CGX1-8所編碼蛋白質(zhì)的活性。
評估樣品(被驗樣品)中CGX 1-8的表達(dá)水平，并將其與正常樣品進(jìn)行比較。當(dāng)所述比較顯示出靶基因的表達(dá)水平高于正常樣品時，可判斷該個體患有結(jié)腸癌或胃癌?？赏瑫r測定來自正常樣品和個體的樣品中CGX 1-8的表達(dá)水平。或者，通過統(tǒng)計學(xué)方法可確定表達(dá)水平的正常范圍，所述統(tǒng)計學(xué)方法基于這樣的結(jié)果，該結(jié)果通過分析預(yù)先從對照組中收集的樣品中基因的表達(dá)水平而獲得。將通過比較個體樣品所得到的結(jié)果與所述正常范圍進(jìn)行比較；當(dāng)該結(jié)果不在該正常范圍中時，則判斷該個體患有結(jié)腸癌或胃癌。在本發(fā)明中，評估CGX 1-7的表達(dá)水平，并將其與正常樣品進(jìn)行比較，從而用以診斷結(jié)腸癌；評估CGX8用以診斷胃癌。
在本發(fā)明中，還提供了用于診斷結(jié)腸癌或胃癌的診斷劑。本發(fā)明的診斷劑包括與本發(fā)明的多核苷酸或多肽結(jié)合的化合物。優(yōu)選地，可將與CGX1-8的多核苷酸雜交的寡核苷酸，或與CGX 1-8的多肽結(jié)合的抗體用作所述化合物。
鑒定抑制結(jié)腸癌或胃癌關(guān)聯(lián)基因表達(dá)的藥劑抑制結(jié)腸癌或胃癌關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)或活性的藥劑可通過如下方法進(jìn)行鑒定，即通過將表達(dá)結(jié)腸癌或胃癌關(guān)聯(lián)基因的被驗細(xì)胞群與被驗藥劑接觸，并測定結(jié)腸癌或胃癌關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)水平。與正常對照水平相比，表達(dá)的降低表明該藥劑是結(jié)腸癌或胃癌關(guān)聯(lián)基因的抑制劑。
被驗細(xì)胞群是表達(dá)結(jié)腸癌或胃癌關(guān)聯(lián)基因的任何細(xì)胞。例如，所述被驗細(xì)胞群包括粘膜細(xì)胞。優(yōu)選地，所述上皮細(xì)胞來源于結(jié)腸或胃。
評估對個體中結(jié)腸癌或胃癌的治療有效性本文所鑒定的差異性表達(dá)的CGX序列還可使結(jié)腸癌或胃癌的療程得以監(jiān)測。在該方法中，正在接受結(jié)腸癌或胃癌治療的個體提供被驗細(xì)胞群。如有需要，可在治療之前、期間或之后的多個時間點從個體取得被驗細(xì)胞群。然后所述測定細(xì)胞群中一種或多種CGX序列的表達(dá)，并將其與參照細(xì)胞群進(jìn)行比較，所述參照細(xì)胞群包括結(jié)腸癌或胃癌狀態(tài)已知的細(xì)胞。優(yōu)選地，所述參照細(xì)胞未暴露于治療。
如果所述參照細(xì)胞群不包含結(jié)腸癌或胃癌細(xì)胞，所述被驗細(xì)胞群和參照細(xì)胞群中CGX序列之間表達(dá)的相似性表明該治療是有效的。但是，所述試驗群和該參照細(xì)胞群中CGX序列之間表達(dá)的差異表明該治療是無效的。
“有效的”是指治療導(dǎo)致個體中結(jié)腸癌或胃癌腫瘤的大小、患病數(shù)，或轉(zhuǎn)移可能性降低。當(dāng)治療用于預(yù)防時，“有效的”是指治療延緩或阻止結(jié)腸癌或胃癌腫瘤形成。
當(dāng)參照細(xì)胞群包含結(jié)腸癌或胃癌細(xì)胞時，例如，當(dāng)所述參照細(xì)胞群包括在診斷時但治療開始前取自個體的結(jié)腸癌或胃癌細(xì)胞時，被驗細(xì)胞群和該參照細(xì)胞群之間表達(dá)圖譜的相似性表明治療是無效的。相反地，試驗群和該參照細(xì)胞群的CGX序列表達(dá)的差異表明治療是有效的。
當(dāng)參照細(xì)胞群包含非結(jié)腸癌或胃癌細(xì)胞，一種或多種CGX 1-8序列的表達(dá)降低表明治療是有效的。
聯(lián)合用于診斷或治療結(jié)腸癌或胃癌的任何已知方法可對有效性進(jìn)行測定。結(jié)腸癌可通過例如，鑒別癥狀性異常如腸習(xí)慣(bowel habit)改變，大便中的血液(blood in the stool)，比正常狹窄的大便，無原因的體重減輕，和持續(xù)性疲勞，以及直腸檢查時的身體觸診，直腸鏡檢查術(shù)，和鋇灌腸或其它顯像方式，諸如測定大便潛血或血液中的腫瘤抗原等試驗進(jìn)行診斷。胃癌可通過例如，鑒定癥狀性異常如潰瘍癥狀，以及大便潛血試驗，胃鏡檢查術(shù)，鋇餐，計算機(jī)控制的軸向斷層(CT)掃描術(shù)，和超聲進(jìn)行診斷。
選擇適于具體個體的治療結(jié)腸癌或胃癌的治療劑個體基因構(gòu)成的差異可導(dǎo)致其代謝多種藥物的相對能力有差異。在個體中被代謝從而作為抗結(jié)腸癌或胃癌劑的藥劑可通過如下方式使其自身得以顯現(xiàn)，即誘導(dǎo)個體細(xì)胞中基因表達(dá)圖譜的變化，即將所述圖譜從結(jié)腸癌或胃癌狀態(tài)的特征性圖譜改變?yōu)榉墙Y(jié)腸癌或胃癌的特征性基因表達(dá)圖譜。由此，本文公開的差異性表達(dá)的CGX序列使可在來自所選擇個體的被驗細(xì)胞群中檢驗推定的治療性或預(yù)防性抗結(jié)腸癌或胃癌劑，以便確定該藥劑是否是適于該個體的抗結(jié)腸癌或胃癌劑。
為鑒定適于特定個體的抗結(jié)腸癌或抗胃癌藥劑，將來自該個體的被驗細(xì)胞群暴露于治療劑，然后測定一種或多種CGX 1-8序列的表達(dá)。
被驗細(xì)胞群包含表達(dá)結(jié)腸癌或胃癌關(guān)聯(lián)基因的結(jié)腸癌或胃癌細(xì)胞。優(yōu)選地，所述被驗細(xì)胞是來自結(jié)腸或胃的上皮細(xì)胞。例如，將被驗細(xì)胞群在存在候補(bǔ)藥劑的情況下進(jìn)行保溫，然后檢測被驗樣品的基因表達(dá)圖譜并將其與一種或多種參照分布圖(例如結(jié)腸癌或胃癌參照表達(dá)分布圖或者非結(jié)腸癌或胃癌參照表達(dá)分布圖)進(jìn)行比較?；蛘?，首先將該藥劑與細(xì)胞提取物例如肝細(xì)胞提取物(其包含使藥物代謝為活性形式的酶)混合。然后將藥劑的活化形式與被驗細(xì)胞群混合，并檢測基因表達(dá)。優(yōu)選地，在離體條件下將所述細(xì)胞群與藥劑或該藥劑的活化形式接觸。
然后將被驗細(xì)胞群中核酸序列的表達(dá)與參照細(xì)胞群中核酸序列的表達(dá)進(jìn)行比較。該參照細(xì)胞群包括至少一種結(jié)腸癌或胃癌狀態(tài)已知的細(xì)胞。如果該參照細(xì)胞是非結(jié)腸癌或胃癌，被驗細(xì)胞群和參照細(xì)胞群之間相似的基因表達(dá)分布圖表明該藥劑適于治療該個體中的結(jié)腸癌或胃癌。序列在被驗細(xì)胞群中表達(dá)和參照細(xì)胞群中表達(dá)的差異表明該藥劑不適于治療該個體中的結(jié)腸癌或胃癌。
如果參照細(xì)胞是結(jié)腸癌或胃癌細(xì)胞，被驗細(xì)胞群和參照細(xì)胞群之間基因表達(dá)圖譜的相似性表明該藥劑不適于治療個體中的結(jié)腸癌或胃癌。
被驗細(xì)胞群中一種或多種序列CGX 1-8的表達(dá)相對于包含結(jié)腸癌或胃癌的參照細(xì)胞群的降低表明該藥劑具有治療性。
被驗藥劑可以是任何化合物或組合物。在一些實施方案中，被驗藥劑是已知為抗癌劑的化合物和組合物。
鑒定用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌或胃癌的候補(bǔ)治療劑的篩選試驗本文所述差異性表達(dá)的序列還可用于鑒定用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌或胃癌的候補(bǔ)治療劑。該方法基于如下方式，即篩選候補(bǔ)治療劑以便確定其是否將結(jié)腸癌或胃癌狀態(tài)的CGX 1-8序列的特征表達(dá)分布圖轉(zhuǎn)變?yōu)橹甘痉墙Y(jié)腸癌或胃癌狀態(tài)的圖譜。
在該方法中，將細(xì)胞暴露于被驗藥劑或被驗藥劑的組合(依序地或相應(yīng)地)，然后檢測一種或多種CGX 1-8序列在細(xì)胞中的表達(dá)。將試驗群中CGX序列的表達(dá)與未暴露于該被驗藥劑的參照細(xì)胞群中CGX序列的表達(dá)水平進(jìn)行比較。被驗藥劑將增加在一些結(jié)腸癌或胃癌細(xì)胞中被下調(diào)的CGX序列的表達(dá)，和/或?qū)⒔档驮诮Y(jié)腸癌或胃癌細(xì)胞中未被調(diào)節(jié)的那些CGX序列的表達(dá)。
在一些實施方案中，參照細(xì)胞群包括結(jié)腸癌或胃癌細(xì)胞。當(dāng)使用該細(xì)胞群時，存在所述藥劑時核酸序列的表達(dá)相對于不存在該藥劑時細(xì)胞群表達(dá)分布圖的變化表明該藥劑是治療結(jié)腸癌或胃癌的候補(bǔ)治療劑。
該被驗藥劑可以是先前未述及的化合物或可以是先前已知、但不知道其是抗結(jié)腸癌或胃癌劑的化合物。
可進(jìn)一步檢測有效抑制過表達(dá)的基因的表達(dá)的藥劑抑制結(jié)腸癌或胃癌腫瘤生長的能力，并且其可潛在地用于治療結(jié)腸癌或胃癌?？刹捎迷u估抗癌劑的毒性和臨床有效性的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)一步評估所述化合物的臨床有用性。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供了篩選候補(bǔ)藥劑的方法，所述候補(bǔ)藥劑是結(jié)腸癌或胃癌治療中的潛在靶點。如上面所詳述的，通過控制標(biāo)記基因的表達(dá)水平或活性，可以控制結(jié)腸癌或胃癌的發(fā)病和進(jìn)展。因此，候補(bǔ)藥劑(結(jié)腸癌或胃癌治療中的潛在靶點)可通過采用標(biāo)記基因的表達(dá)水平和活性作為指示的篩選方法進(jìn)行鑒定。在本發(fā)明中，所述篩選方法可包括，例如，以下步驟a)將被驗化合物與多肽接觸，所述多肽由選自CGX 1-8的核酸編碼；b)檢測所述多肽和被驗化合物之間的結(jié)合活性；和c)選擇與所述多肽結(jié)合的化合物。
或者，本發(fā)明的篩選方法可包括以下步驟a)將候補(bǔ)化合物與表達(dá)一種或多種標(biāo)記基因的細(xì)胞接觸，其中一種或多種標(biāo)記基因選自CGX 1-8；和b)選擇降低選自CGX 1-8的一種或多種標(biāo)記基因的表達(dá)水平的化合物。
表達(dá)標(biāo)記基因的細(xì)胞包括，例如，由結(jié)腸癌或胃癌建立的細(xì)胞系；所述細(xì)胞可用于本發(fā)明的上述篩選中。
或者，本發(fā)明的篩選方法可包括以下步驟a)將被驗化合物與多肽接觸，所述多肽由選自CGX 1-8的核酸編碼；b)檢測步驟(a)的多肽的生物活性；和c)選擇化合物，其中與不存在該被驗化合物時檢測到的生物活性相比，所述化合物抑制選自CGX 1-8的核酸所編碼多肽的生物活性。
篩選所需要的蛋白質(zhì)可采用標(biāo)記基因的核苷酸序列作為重組蛋白質(zhì)而獲得。根據(jù)該標(biāo)記基因的信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇該蛋白質(zhì)的任何生物活性作為基于所選生物活性的篩選和檢測方法的指標(biāo)。
或者，本發(fā)明的篩選方法可包括以下步驟a)將候補(bǔ)化合物與細(xì)胞接觸，所述細(xì)胞中已導(dǎo)入載體，所述載體包含一種或多種標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)以及在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達(dá)的報道基因，其中的一種或多種標(biāo)記基因選自CGX 1-8，b)檢測所述報道基因的活性；和c)選擇化合物，其與對照相比降低所述報道基因的表達(dá)水平。
適宜的報道基因和宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域中所眾所周知的。篩選所需要的報告物構(gòu)建體可通過使用標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)來制備。當(dāng)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知時，報告物構(gòu)建體可通過使用已知序列信息來制備。如果標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)未被鑒定，包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的核苷酸片段可從基于該標(biāo)記基因的核苷酸序列信息的基因組文庫中分離。
在篩選用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌的本發(fā)明化合物的方法的其它實施方案中，該方法使用了ARHCL1與Zyxin，NFXL1與MGC10334或CENPC1，C20orf20與BRD8，以及CCPUCC1與nCLU的結(jié)合能力。顯示本發(fā)明的蛋白質(zhì)與Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU相結(jié)合。這些發(fā)現(xiàn)提示本發(fā)明的蛋白質(zhì)經(jīng)由其與分子，諸如Zyxin，MGC10334，CENPC1，BRD8和nCLU等的結(jié)合而發(fā)揮細(xì)胞增殖的功能。因此，預(yù)期抑制本發(fā)明的蛋白質(zhì)與Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU之間的結(jié)合會導(dǎo)致細(xì)胞增殖的抑制，且抑制所述結(jié)合的化合物可作為治療或預(yù)防結(jié)腸癌的藥物。
所述篩選方法包括以下步驟(a)在存在被驗化合物條件下，將本發(fā)明的多肽與Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU接觸；(b)檢測該多肽與Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU之間的結(jié)合；和(c)選擇抑制該多肽與Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU之間結(jié)合的化合物。
用于篩選方法的本發(fā)明的多肽，以及Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU可以是重組多肽或天然來源的蛋白質(zhì)，或還可以是其部分肽，只要其保持相互結(jié)合的能力即可。用于篩選方法的本發(fā)明的多肽，Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU可以是，例如，純化的多肽、可溶性蛋白質(zhì)、與載體結(jié)合的形式，或與其它多肽融合的融合蛋白質(zhì)。
可以使用任何被驗化合物，例如，細(xì)胞提取物，細(xì)胞培養(yǎng)上清，微生物發(fā)酵產(chǎn)物，海洋生物提取物，植物提取物，純化的或粗制蛋白質(zhì)，肽，非肽化合物，合成小分子化合物和天然化合物。
作為篩選抑制本發(fā)明的蛋白質(zhì)與Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU之間結(jié)合的化合物的方法，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的許多方法。所述篩選方法可作為體外實驗系統(tǒng)，例如在無細(xì)胞系統(tǒng)中實施。更具體地，首先，將本發(fā)明的多肽，或Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU與支持物結(jié)合，然后將另一種蛋白質(zhì)與被驗樣品一起加至其上。隨后，對該混合物進(jìn)行保溫、洗滌并檢測和/或測定與該支持物結(jié)合的其它蛋白質(zhì)。
可用于結(jié)合蛋白質(zhì)的支持物的實例包括不溶性多糖，諸如瓊脂糖，纖維素，和葡聚糖；和合成樹脂，諸如聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，和硅；優(yōu)選由上述材料制備的商業(yè)上可獲得的珠和板(例如，多孔板，生物傳感器芯片等)。當(dāng)使用珠時，所述珠可被填入柱中。
可根據(jù)常規(guī)方法，諸如化學(xué)結(jié)合和物理吸附法實施蛋白質(zhì)與支持物的結(jié)合?；蛘撸鞍踪|(zhì)可經(jīng)由特異性識別該蛋白質(zhì)的抗體而與支持物結(jié)合。而且，還可通過抗生物素蛋白和生物素結(jié)合的方式實施蛋白質(zhì)與支持物的結(jié)合。
蛋白質(zhì)間的結(jié)合在緩沖液，例如(但不限于)磷酸鹽緩沖液和Tris緩沖液中實施，條件是所述緩沖液不會抑制蛋白質(zhì)間結(jié)合。
在本發(fā)明中，使用表面等離子共振現(xiàn)象的生物傳感器可用作對結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測或定量的方法。當(dāng)使用所述生物傳感器(例如，BIAcore，Pharmacia)時，可僅使用微量多肽且無需標(biāo)記，即可將蛋白質(zhì)間的相互作用作為表面等離子共振信號進(jìn)行實時觀測。因此，采用生物傳感器諸如BIAcore就可以評估本發(fā)明的多肽與Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU之間的結(jié)合。
或者，可對本發(fā)明的多肽，或Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU進(jìn)行標(biāo)記，而結(jié)合的蛋白質(zhì)的標(biāo)記可被用于檢測或測定結(jié)合的蛋白質(zhì)。具體地說，在預(yù)標(biāo)記一種蛋白質(zhì)之后，將該標(biāo)記的蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)在存在被驗化合物的條件下接觸，洗滌后根據(jù)該標(biāo)記檢測或測定結(jié)合的蛋白質(zhì)。
標(biāo)記性物質(zhì)諸如放射性同位素(例如，3H，14C，32P，33P，35S，125I，131I)，酶(例如，堿性磷酸酶，辣根過氧化物酶，β-半乳糖苷酶，β-葡萄糖苷酶)，熒光物質(zhì)(例如，異硫氰酸熒光素(FITC)，羅丹明)，以及生物素/抗生物素蛋白可用于標(biāo)記本方法中的蛋白質(zhì)。當(dāng)用放射性同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)時，可通過液體閃爍實施檢測或測定?；蛘?，可使用光度計對用酶標(biāo)記的蛋白質(zhì)實施檢測或測定，所述檢測或測定可通過加入酶的底物以便來檢測底物的酶性改變(enzymic change)諸如顏色生成來進(jìn)行。此外，在熒光物質(zhì)被用作標(biāo)記的情況下，結(jié)合的蛋白質(zhì)可采用熒光光度計進(jìn)行檢測或測定。
此外，本發(fā)明的多肽與Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU的結(jié)合還可采用針對本發(fā)明的多肽以及Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU的抗體進(jìn)行檢測或測定。例如，將固定在支持物上的本發(fā)明的多肽與被驗化合物以及Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU接觸后，對混合物進(jìn)行保溫并洗滌，然后采用抗Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU的抗體實施檢測或測定。或者，可將Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU固定在支持物上，而將針對本發(fā)明的多肽的抗體用作抗體。
在本發(fā)明的篩選方法中使用抗體時，該抗體優(yōu)選用一種上述標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，并根據(jù)該標(biāo)記物進(jìn)行檢測或測定。或者，針對本發(fā)明的多肽，Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU的抗體可用作第一抗體，該抗體通過以標(biāo)記物標(biāo)記的第二抗體而被檢測出。此外，在本發(fā)明的篩選方法中，與所述蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體可采用蛋白質(zhì)G或蛋白質(zhì)A柱進(jìn)行檢測或測定。
或者，在本發(fā)明的篩選方法的其它實施方案中，可以使用利用細(xì)胞的雙雜交系統(tǒng)(“MATCHMAKER雙雜交系統(tǒng)”，“哺乳動物MATCHMAKER雙雜交檢測試劑盒”，“MATCHMAKER單雜交系統(tǒng)”(Clontech)；“HybriZAP雙雜交載體系統(tǒng)”(Stratagene)；參照“Dalton and Treisman，Cell 68597-612(1992)”，“Fields and Sternglanz，Trends Genet 10286-92(1994)”)。
在雙雜交系統(tǒng)中，將本發(fā)明的多肽融合至SRF-結(jié)合區(qū)或GAL4-結(jié)合區(qū)，并在酵母細(xì)胞中表達(dá)。與本發(fā)明的多肽結(jié)合的Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU被融合至VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，并且在存在被驗化合物的情況下也可在酵母細(xì)胞中表達(dá)。當(dāng)被驗化合物不能抑制本發(fā)明的多肽與Zyxin、MGC10334、CENPC1、BRD8或nCLU之間的結(jié)合時，二者間的結(jié)合即激活報道基因，從而可檢測到陽性克隆。
作為報道基因，除HIS3基因外，還可使用例如Ade2基因，lacZ基因，CAT基因，螢光素酶基因等。
通過篩選而分離的化合物是藥物的候補(bǔ)物，所述藥物抑制標(biāo)記基因編碼的蛋白質(zhì)的活性，且可用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌或胃癌。
此外，可通過本發(fā)明的篩選方法獲得的化合物中還包括其中部分結(jié)構(gòu)通過添加、缺失和/或置換而改變的化合物，該化合物能夠抑制由標(biāo)記基因編碼的蛋白質(zhì)的活性。
當(dāng)通過本發(fā)明的方法分離的化合物作為藥物而施用于人類和其它哺乳動物諸如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、雞、貓、犬、綿羊、豬、牛、猴、狒狒以及猩猩時，該分離的化合物可被直接施用或可采用已知的藥物制備方法而被制成劑型。例如，根據(jù)需要，該藥物可作為糖衣片劑，膠囊劑，酏劑和微囊劑而口服，或以水或任何其它可藥用的液體的無菌溶液或懸浮液的注射液形式以非口服施用。例如，該化合物可與可藥用的載體或介質(zhì)，具體而言為無菌水，生理鹽水，植物油，乳化劑，懸浮劑，表面活性劑，穩(wěn)定劑，調(diào)味劑，賦形劑，載體，防腐劑，粘合劑，等，在通?？山邮艿乃幬镏苽浞椒ㄋ璧膯挝粍┬椭谢旌?。這些制劑中活性成分的量可以得到所述范圍內(nèi)的適宜劑量。
可混合至片劑和膠囊的添加劑的實例是，粘合劑諸如明膠，玉米淀粉，黃蓍膠和阿拉伯膠；賦形劑諸如微晶纖維素；溶脹劑諸如玉米淀粉，明膠和海藻酸；潤滑劑諸如硬脂酸鎂；增甜劑諸如蔗糖，乳糖或糖精；以及調(diào)味劑諸如薄荷，Gaultheria adenothrix油和櫻桃紅(cherry)。當(dāng)單位劑型是膠囊時，液體載體諸如油，也可進(jìn)一步包括在上述成份中。用于注射的無菌組合物可按照標(biāo)準(zhǔn)的藥物制備方法采用載體諸如用于注射的蒸餾水進(jìn)行制備。
生理鹽水，葡萄糖，和包含佐劑諸如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉的其它等張液可被用作注射用含水溶液。其可與適宜的增溶劑，諸如醇，特別是乙醇，多元醇諸如丙二醇和聚乙二醇，非離子表面活性劑，諸如Polysorbate 80(TM)和HCO-50聯(lián)合使用。
麻油或大豆油可用作油性液體，其可與用作增溶劑的苯甲酸芐酯或苯甲醇聯(lián)合使用，且可采用緩沖液諸如磷酸鹽緩沖液和醋酸鈉緩沖液進(jìn)行配制；止痛藥，諸如鹽酸普魯卡因；穩(wěn)定劑，諸如苯甲醇和苯酚；和抗氧化劑。可將制備的注射劑裝于適宜的安瓿中。
可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法將本發(fā)明的藥物組合物投藥患者，例如以動脈內(nèi)，靜脈內(nèi)，或經(jīng)皮注射的方式，也可以經(jīng)鼻內(nèi)，經(jīng)支氣管，肌內(nèi)或口服投藥。施用的劑量和方法根據(jù)患者的體重和年齡以及施用方法而改變；然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可常規(guī)地選擇適宜的施用方法。如果所述化合物可由DNA編碼，可將該DNA插入用于基因治療的載體中，將該載體施用于患者從而實施治療。施用的劑量和方法根據(jù)患者的體重，年齡和癥狀而改變但本領(lǐng)域技術(shù)人員能適當(dāng)?shù)貙ζ溥M(jìn)行選擇。
例如，雖然與本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性的化合物的劑量依賴于癥狀，但經(jīng)口服施用于正常成年個體(體重60kg)時，所述化合物的劑量為約0.1mg-約100mg/日，優(yōu)選約1.0mg-約50mg/日且更優(yōu)選約1.0mg-約20mg/日。
當(dāng)以胃腸外方式(注射劑方式)施用于正常成年個體(體重60kg)時，雖然根據(jù)患者、靶器官、癥狀和施用方法而存在一些差異，適于靜脈內(nèi)注射的劑量是約0.01mg-約30mg/日，優(yōu)選約0.1-約20mg/日且更優(yōu)選約0.1-約10mg/日。而且，當(dāng)用于其它動物的情況下，可以施用按60kg體重轉(zhuǎn)換的量。
評估患結(jié)腸癌或胃癌個體的預(yù)后還提供了評估患結(jié)腸癌或胃癌個體的預(yù)后的方法，該方法通過在疾病階段譜期間比較被驗細(xì)胞群中一種或多種CGX序列的表達(dá)與來自患者的參照細(xì)胞群中所述序列的表達(dá)進(jìn)行。通過比較被驗細(xì)胞群和參照細(xì)胞群中一種或多種CGX序列的基因表達(dá)，或通過比較來自所述個體的被驗細(xì)胞群在不同時間的(overtime)基因表達(dá)圖譜，可對個體的預(yù)后進(jìn)行評估。
參照細(xì)胞群主要包括非結(jié)腸癌或胃癌細(xì)胞，或者結(jié)腸癌或胃癌細(xì)胞。可選地，所述參照是結(jié)腸癌或胃癌或者非結(jié)腸癌或胃癌表達(dá)分布圖。當(dāng)參照細(xì)胞群主要包括非結(jié)腸癌或胃癌細(xì)胞時，一種或多種序列CGX 1-8的表達(dá)增加表明預(yù)后良好程度較低。序列CGX 1-8的表達(dá)降低表明個體預(yù)后良好程度較高。
或者，當(dāng)參照細(xì)胞群主要包括非結(jié)腸癌或胃癌細(xì)胞時，一種或多種序列CGX 1-8的表達(dá)增加表明個體預(yù)后良好程度較低，而表達(dá)降低或相似則表明個體預(yù)后良好程度較高。
試劑盒本發(fā)明還提供了以試劑盒的形式包裝在一起的CGX-檢測試劑，例如，通過具有與部分CGX核酸互補(bǔ)的同源性核酸序列，諸如寡核苷酸序列而特異性識別一種或多種CGX核酸的核酸，或針對CGX核酸所編碼的蛋白質(zhì)的抗體。該試劑盒可在分開的容器中包含核酸或抗體(已結(jié)合于固體基質(zhì)或與將其結(jié)合于所述基質(zhì)的試劑分開包裝)，對照制劑(陽性和/或陰性)，和/或可檢測的標(biāo)記。該試劑盒中可包含實施所述實驗的說明書(例如，書面的，磁帶，VCR，CD-ROM等)。該實驗可以是，例如本領(lǐng)域已知的Northern雜交或夾心ELISA的形式。
例如，將CGX檢測試劑固定在固體基質(zhì)諸如多孔帶上從而形成至少一個CGX檢測位點。多孔帶的測定或檢測區(qū)可包括多個包含核酸的位點。試驗帶還可包含陰性和/或陽性對照的位點?；蛘?，對照位點位于與試驗帶分開的帶上。任選地，不同檢測位點可包含不同量的固定的核酸，即，第一檢測位點上的量較高而隨后的位點上的量較低。加入被驗樣品后，顯示可檢測信號的位點的數(shù)量提供了對樣品中存在的CGX量的定量指示。檢測位點可被設(shè)定為任何適宜的可檢測形狀，通常為跨越試驗帶寬度的條或點的形狀。
或者，該試劑盒包含核酸基質(zhì)陣列，該陣列包含一種或多種核酸序列。該陣列上的核酸可特異性鑒定CGX 1-8所表示的一種或多種核酸序列。在多種實施方案中，CGX 1-8所表示的2、3、4、5、6、7或更多序列的表達(dá)在與陣列結(jié)合的情況下則可被有效地鑒定。所述基質(zhì)陣列可位于，例如固體基質(zhì)(例如，美國專利5,744,305中所述的“芯片”)上。
陣列和復(fù)數(shù)狀態(tài)(pluralities)本發(fā)明還包括包含一種或多種核酸序列的核酸基質(zhì)陣列。該陣列上的核酸特異性鑒定CGX 1-8所表示的一種或多種核酸序列。在多種實施方案中，CGX 1-8所表示的2、3、4、5、6、7或更多序列的表達(dá)可被鑒定。
例如，所述陣列中的核酸可通過具有與上文列舉核酸的一部分互補(bǔ)的同源性核酸序列(諸如寡核苷酸序列等)而鑒定所述列舉的核酸。該基質(zhì)陣列可位于，例如固體基質(zhì)(例如，美國專利5,744,305中所述“芯片”)上。
本發(fā)明還包括核酸序列的分離的復(fù)數(shù)狀態(tài)(即，若兩種或兩種以上核酸的混合物)。該核酸序列可以為液相或固相，例如固定在固體支持物諸如硝酸纖維素膜上。該復(fù)數(shù)狀態(tài)通常包括CGX 1-8所表示的一種或一種以上核酸序列。在多個實施方案中，該復(fù)數(shù)狀態(tài)包括CGX 1-8所表示的2、3、4、5、6、7或更多個序列。
治療結(jié)腸癌或胃癌的方法本發(fā)明提供了治療個體中結(jié)腸癌或胃癌的方法。對易患(或具有易感性)或患有與本文所述差異性表達(dá)的序列(例如，CGX 1-8)的表達(dá)或活性異常相關(guān)的病癥患病風(fēng)險或患有該病癥的個體可預(yù)防性或治療性地進(jìn)行投藥。
該方法還包括降低基因的一種或多種基因產(chǎn)物的表達(dá)和/或功能，所述基因在結(jié)腸癌或胃癌細(xì)胞中的表達(dá)與在非結(jié)腸癌或胃癌細(xì)胞中的表達(dá)相比增加(“過表達(dá)的基因”)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的數(shù)種方法之一對表達(dá)進(jìn)行抑制。例如，可通過對個體施用抑制或拮抗過表達(dá)的一或多種基因的表達(dá)的核酸而抑制表達(dá)。在一個實施方案中，可以施用破壞一或多種基因表達(dá)的反義寡核苷酸或小干擾RNA。
如上述，與CGX 1-8的核苷酸序列對應(yīng)的反義核酸可用于降低CGX 1-8的表達(dá)水平。與在結(jié)腸癌或胃癌中被上調(diào)的CGX 1-8對應(yīng)的反義核酸可用于治療結(jié)腸癌或胃癌。具體來說，本發(fā)明的反義核酸可通過如下方式發(fā)揮作用，即其與CGX 1-8或與CGX 1-8相應(yīng)的mRNA結(jié)合，由此抑制所述基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進(jìn)所述mRNA的降解，和/或抑制由選自CGX 1-8的核酸所編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)，最終抑制所述蛋白質(zhì)的功能。例如，將包含啟動子例如組織特異性或腫瘤特異性啟動子的DNA可操作性連接于被轉(zhuǎn)錄為反義RNA的DNA序列(反義模板)?！翱刹僮餍赃B接于”是指編碼序列與調(diào)節(jié)序列(即，啟動子)以在適宜分子(例如，轉(zhuǎn)錄激活蛋白質(zhì))與該調(diào)節(jié)序列結(jié)合時允許基因表達(dá)的方式進(jìn)行連接。
本文所使用的術(shù)語“反義核酸”包括與靶序列完全互補(bǔ)的核苷酸以及具有一個或多個核苷酸錯配的那些核苷酸，只要該反義核酸能與所述靶序列特異性雜交即可。例如，本發(fā)明的反義核酸包括在至少15個連續(xù)核苷酸的長度上具有至少70％或更高，優(yōu)選80％或更高，更優(yōu)選90％或更高，甚至更優(yōu)選95％或更高同源性的多核苷酸?？蓪⒈绢I(lǐng)域已知的算法用于測定同源性。
反義治療可通過經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)載體和/或基因遞送系統(tǒng)對患者施以反義核酸而實施。適宜的基因遞送系統(tǒng)可包括脂質(zhì)體，受體介導(dǎo)的遞送系統(tǒng)，裸露DNA和病毒載體諸如皰疹病毒，反轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒以及腺伴隨病毒等。CGX生成的降低導(dǎo)致經(jīng)由IRS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減少?？蓪⒅委熜院怂峤M合物配制在可藥用的載體中。所述治療性組合物還可包括上述基因遞送系統(tǒng)?？伤幱玫妮d體是適合施用于動物的生物學(xué)相容性載體例如生理鹽水。化合物的治療有效量是能夠在經(jīng)治療的動物中產(chǎn)生醫(yī)學(xué)上所需的效果，諸如降低CGX基因產(chǎn)物的生成或降低腫瘤的生長。
本發(fā)明的反義核酸衍生物通過以下方式對生成標(biāo)記基因所編碼蛋白質(zhì)的細(xì)胞產(chǎn)生作用與編碼所述蛋白質(zhì)的DNA或mRNA相結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進(jìn)所述mRNA降解，抑制所述蛋白質(zhì)表達(dá)，由此抑制該蛋白質(zhì)的功能。
本發(fā)明的反義核酸衍生物可通過與對衍生物無活性的適宜基質(zhì)混合而被制成外用制劑，諸如搽劑或泥敷劑。
按照需要，該衍生物也可通過加入賦形劑等張劑增溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、止痛劑等而被制成片劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、脂質(zhì)體膠囊劑、注射劑、溶液、滴鼻劑和凍干劑。這些劑型可通過以下已知方法進(jìn)行制備。
可通過將所述反義核酸衍生物直接施用于患病位點或注射至血管中以便到達(dá)患病位點而給予患者。對核酸或CGX抑制性肽或非肽化合物的遞送可采用胃腸外投藥，諸如經(jīng)靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)以及腹膜內(nèi)遞送途徑。反義封固的介質(zhì)也可被用于增加耐久性和膜通透性。實例為脂質(zhì)體、聚左旋賴氨酸、脂質(zhì)、膽固醇、脂轉(zhuǎn)染素(lipofectin)或這些物質(zhì)的衍生物。
本發(fā)明的反義核酸衍生物的劑量可根據(jù)患者情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整并以所需量進(jìn)行使用，所述患者情況例如，包括患者體型，體表面積，年齡，施用的具體核酸，性別，投藥時間和途徑，一般健康情況，和同時施用的其它藥物。例如，可施用的劑量范圍為0.1-100mg/kg，優(yōu)選0.1-50mg/kg。靜脈內(nèi)施用核酸的可選的劑量為約106-1022拷貝的核酸分子。
本發(fā)明的反義核酸抑制本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)，由此可用于抑制本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生物活性。而且，由于能夠抑制本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生物活性，表達(dá)抑制劑(包括本發(fā)明的反義核酸)是有用的。
本發(fā)明的反義核酸包括經(jīng)過修飾的寡核苷酸。例如，硫代核苷酸(thioated nucleotide)可被用于賦予寡核苷酸對核酸酶的抗性。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，在體外檢測與CGX mRNA的多個部分互補(bǔ)的寡核苷酸降低腫瘤細(xì)胞中CGX生成的能力。與在缺乏候補(bǔ)組合物的情況下培養(yǎng)的細(xì)胞相比，與所述候補(bǔ)反義組合物接觸的細(xì)胞中CGX基因產(chǎn)物的減少可通過采用CGX特異性抗體或其它檢測策略進(jìn)行檢測。然后在大鼠或小鼠中，對在基于細(xì)胞或無細(xì)胞的體外測定法中降低CGX生成的序列進(jìn)行體內(nèi)檢測，以證實患有惡性腫瘤的動物中CGX的生成被降低。
適宜的反義S-寡核苷酸具有選自SEQ ID NO50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76或79的核苷酸序列。適用于結(jié)腸直腸癌的反義S-寡核苷酸如下ARHCL1的反義S-寡核苷酸，其包括具有SEQ IDNO50的核苷酸序列的那些序列；NFXL1的反義S-寡核苷酸，其包括具有SEQ ID NO52的核苷酸序列的那些序列；C20orf20的反義S-寡核苷酸，其包括具有SEQ ID NO54或56的核苷酸序列的那些序列；LEMD1的反義S-寡核苷酸，其包括具有選自SEQ ID NO58、60、62、64或66的核苷酸序列的那些序列；CCPUCC1的反義S-寡核苷酸，其包括具有SEQ ID NO68的核苷酸序列的那些序列；Ly6E的反義S-寡核苷酸，其包括具有SEQ ID NO70或72的核苷酸序列的那些序列；Nkd1的反義S-寡核苷酸，其包括具有SEQ ID NO74或76的核苷酸序列的那些序列。LAPTM4β的反義S-寡核苷酸適于胃癌，所述反義S-寡核苷酸包含具有SEQ ID NO79的核苷酸序列的那些序列。
核酶治療也可被用于抑制癌癥患者中CGX基因的表達(dá)。核酶與特定的mRNA結(jié)合，然后在預(yù)定的切割位點進(jìn)行切割，由此破壞轉(zhuǎn)錄物。這些RNA分子可用于根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來抑制CGC基因的表達(dá)(Sullivan等，1994，J.Invest.Derm.10385S-89S；Czubayko等，1994，J.Biol.Chem.26921358-21363；Mahieu等，1994，Blood 843758-65；Kobayashi等1994，Cancer Res.541271-1275)。
而且，針對標(biāo)記基因的siRNA可被用于降低該標(biāo)記基因的表達(dá)水平。術(shù)語“siRNA”意指可阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子?？梢圆捎脤iRNA導(dǎo)入細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括其中DNA是RNA轉(zhuǎn)錄模板的那些技術(shù)。在本發(fā)明中，siRNA包括針對上調(diào)的標(biāo)記基因諸如CGX 1-8的有義核酸序列和反義核酸序列。構(gòu)建siRNA使其單個轉(zhuǎn)錄物具有來自靶基因的有義和互補(bǔ)反義序列例如，發(fā)卡結(jié)構(gòu)。
該方法可被用于改變細(xì)胞中被上調(diào)的表達(dá)(例如，作為細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化結(jié)果)。siRNA與靶細(xì)胞中CGX 1-8之一的相應(yīng)轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)減少。寡核苷酸的長度為至少10個核苷酸，且可與天然存在的轉(zhuǎn)錄物同樣長。優(yōu)選地，所述寡核苷酸的長度為19-25個核苷酸。最優(yōu)選地，所述寡核苷酸的長度短于75、50、25個核苷酸。
采用可獲自Ambion網(wǎng)站(http//www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)的siRNA設(shè)計計算機(jī)程序(design computer program)來設(shè)計siRNAs的核苷酸序列。該計算機(jī)程序根據(jù)以下方案選擇用于siRNA合成的核苷酸序列。
選擇siRNA靶位1.從目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的AUG起始密碼子開始，向下游掃描AA二核苷酸序列。將每次AA和鄰近3′的19個核苷酸的出現(xiàn)記錄為潛在的siRNA靶位。Tuschl等反對針對5′和3′非翻譯區(qū)(UTRs)和鄰近起始密碼子的區(qū)域(75個堿基之內(nèi))設(shè)計siRNA，因為上述區(qū)域可能較為富含調(diào)節(jié)性蛋白質(zhì)結(jié)合位點。UTR結(jié)合蛋白質(zhì)和/或翻譯起始復(fù)合物可干擾與siRNA內(nèi)切核酸酶復(fù)合物的結(jié)合的。
2.將所述潛在靶位與人類基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，不考慮與其它編碼序列顯著同源的任何靶序列?？刹捎肂LAST(可見于NCBI服務(wù)器www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行同源性檢索3.選擇合格的靶序列用于合成。在Ambion，優(yōu)選沿基因選擇數(shù)個靶序列進(jìn)行評估。
在優(yōu)選的實施方案中，適宜siRNA靶序列的適宜核苷酸序列可選自SEQ ID NO126、127、128或129。以下序列可適宜地用于設(shè)計治療結(jié)腸直腸癌的siRNA的核苷酸序列由SEQ ID NO126的核苷酸序列組成的NFXL1的靶序列；由SEQ ID NO127的核苷酸序列組成的C20orf20的靶序列；由SEQ ID NO128或129的核苷酸序列組成的CCPUCC1的靶序列。例如，本發(fā)明優(yōu)選的siRNA包括具有以下核苷酸序列組合的雙鏈RNA。SEQID NO106-121的核苷酸序列的堿基<<t>>上包括堿基<<u>>。
siRNA的靶序列 核苷酸序列組合SEQ ID NO126 SEQ ID NO114/115
SEQ ID NO127SEQ ID NO116/117SEQ ID NO128SEQ ID NO118/119SEQ ID NO129SEQ ID NO120/121本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA抑制本發(fā)明的多肽的表達(dá)，由此可用于抑制本發(fā)明的多肽的生物活性。而且，由于可抑制本發(fā)明多肽的生物活性，故此在這一點上，表達(dá)抑制劑(包含本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA)是有用的。因此，包含本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA的組合物可用于治療結(jié)腸癌或胃癌。
或者，過表達(dá)的基因的一種或多種基因產(chǎn)物的功能可通過施用可與所述基因產(chǎn)物結(jié)合或抑制其功能的化合物而被抑制。所述化合物可以是，例如，針對過表達(dá)的一或多種基因產(chǎn)物的抗體。
本發(fā)明涉及抗體、尤其是針對由上調(diào)的標(biāo)記基因所編碼的蛋白質(zhì)的抗體或該抗體的片段的用途。本文術(shù)語“抗體”是指具有特定結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白分子，所述特定結(jié)構(gòu)僅與用于合成所述抗體的抗原(即，上調(diào)的標(biāo)記基因產(chǎn)物)或與其緊密相關(guān)的抗原發(fā)生相互作用(即，結(jié)合)。此外，所述抗體可以是抗體的片段或修飾的抗體，只要其能結(jié)合標(biāo)記基因所編碼的一種或多種蛋白質(zhì)即可。例如，所述抗體片段可以是Fab，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)v，或單鏈Fv(scFv)，其中來自H和L鏈的Fv片段通過適宜的接頭而連接(Huston J.S.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.855879-5883(1988))。更具體地，可通過用酶，諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體來生成抗體片段?；蛘撸梢詷?gòu)建編碼所述抗體片段的基因，將其插入表達(dá)載體中，并在適宜的宿主細(xì)胞中表達(dá)(參見，例如，Co M.S.等J.Immunol.1522968-2976(1994)；Better M.和HorwitzA.H.Methods Enzymol.178476-496(1989)；Pluckthun A.和Skerra A.Methods Enzymol.178497-515(1989)；Lamoyi E.Methods Enzymol.121652-663(1986)；Rousseaux J.等Methods Enzymol.121663-669(1986)；Bird R.E.和Walker B.W.Trends Biotechnol.9132-137(1991))。
抗體可通過與多種分子，諸如聚乙二醇(PEG)結(jié)合而進(jìn)行修飾。本發(fā)明提供了所述修飾的抗體。該修飾的抗體可通過化學(xué)方法修飾抗體而獲得。這些修飾方法在本領(lǐng)域中是常規(guī)的。
或者，抗體可以作為嵌合抗體(源于非人抗體的可變區(qū)和源于人抗體的恒定區(qū)之間)，或人源化抗體(包含源于非人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，源于人抗體的框架區(qū)(FR)和恒定區(qū))而獲得。使用已知技術(shù)可制備所述抗體。
針對癌細(xì)胞中所發(fā)生的具體分子改變的癌癥治療已經(jīng)過臨床研究和抗癌藥的調(diào)控性批準(zhǔn)而被證實是有效的，所述抗癌藥諸如用于治療晚期乳癌的曲妥單抗(Herceptin)，用于治療慢性髓細(xì)胞性白血病(chronic myeloidleukemia)的伊馬替尼甲酯(imatinib methylate)(Gleevec)，用于治療非小細(xì)胞性肺癌(NSCLC)的吉非替尼(gefitinib)(Iressa)，和用于治療B細(xì)胞淋巴瘤和外套細(xì)胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)的利妥昔單抗(rabimax)(抗CD20mAb)(Ciardiello F，Tortora G.A novel approach in the treatment of cancertargeting the epidermal growth factor receptor.Clin Cancer Res.2001 Oct；7(10)2958-70.Review.；Slamon DJ，Leyland-Jones B，Shak S，F(xiàn)uchs H，PatonV，Bajamonde A，F(xiàn)leming T，Eiermann W，Wolter J，Pegram M，Baselga J，Norton L.Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 formetastatic breast cancer that overexpresses HER2.N Engl J Med.2001 Mar 15；344(11)783-92.；Rehwald U，Schulz H，Reiser M，Sieber M，Staak JO，Morschhauser F，Driessen C，Rudiger T，Muller-Hermelink K，Diehl V，EngertA.Treatment of relapsed CD20+Hodgkin lymphoma with the monoclonalantibody rituximab is effective and well toleratedresults of a phase 2 trial of theGerman Hodgkin Lymphoma Study Group.Blood.2003 Jan 15；101(2)420-424.；Fang G，Kim CN，Perkins CL，Ramadevi N，Winton E，Wittmann S和Bhalla KN.(2000).Blood，96，2246-2253.)。這些藥物在臨床上是有效的，由于其僅靶向轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，故其耐受性比傳統(tǒng)抗癌劑好。因此，所述藥物不僅改善了癌癥患者的存活率和生活質(zhì)量，還驗證了分子靶向癌癥治療這一概念。此外，在與標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療法聯(lián)合使用時，經(jīng)靶向的藥物可增強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療法的功效(Gianni L.(2002).Oncology，63 Suppl 1，47-56.；Klejman A，Rushen L，Morrione A，Slupianek A和Skorski T.(2002).Oncogene，21，5868-5876.)。因此，未來的癌癥治療可涉及傳統(tǒng)藥物與靶特異性藥劑的聯(lián)用，后者針對腫瘤細(xì)胞不同特性諸如血管發(fā)生及侵襲力。
這些調(diào)節(jié)方法可離體或在體外實施(例如，通過在存在所述藥劑的條件下培養(yǎng)細(xì)胞)或(可選地)在體內(nèi)實施(例如，通過將藥劑施用于個體)。由此，本發(fā)明提供了治療對患有疾病或病癥個體的方法，所述疾病或病癥的特征在于差異性表達(dá)的蛋白質(zhì)或核酸分子的表達(dá)或活性異常。在一個實施方案中，該方法包括施用調(diào)節(jié)(例如，上調(diào)或下調(diào))一種或多種差異性表達(dá)的基因的表達(dá)或活性的藥劑(例如，由本文所述篩選實驗所鑒定的藥劑)或所述藥劑的組合。在另一實施方案中，該方法包括施用蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的組合或核酸分子或核酸的組合進(jìn)行治療以代償差異性表達(dá)的基因的降低或異常的表達(dá)或活性。
特征在于基因的水平或生物活性增加(相對于未患有疾病或病癥的個體而言)的疾病或病癥可用拮抗(即，降低或抑制)過表達(dá)一或多種基因的活性的治療劑來進(jìn)行治療。拮抗活性的治療劑可在治療上或預(yù)防上進(jìn)行施用。
可使用的治療劑包括，例如，(i)過表達(dá)的一或多種序列的多肽，或其類似物、衍生物、片段或同源物；(ii)針對所述過表達(dá)的一或多種序列的抗體；(iii)編碼過表達(dá)的一或多種序列的核酸；(iv)“功能障礙性(dysfunctional)”反義核酸或核酸(即由于一或多種過表達(dá)的序列的編碼序列中的異源插入物)；(v)小干擾RNA(siRNA)；或(vi)調(diào)節(jié)劑(即，改變過表達(dá)的多肽與其結(jié)合配偶體之間相互作用的抑制劑、激動劑和拮抗劑)。該功能障礙性反義分子可用于通過同源重組而“敲除”多肽的內(nèi)源功能(參見，例如，Capecchi，Science 2441288-1292 1989)通過定量肽和/或RNA可很容易地檢測增加的水平，所述定量可通過獲取患者組織樣品(例如，從活組織檢查組織中)，在體外檢測其RNA或肽水平、表達(dá)的肽的結(jié)構(gòu)和/或活性(或其表達(dá)改變的基因的mRNA)來進(jìn)行。本領(lǐng)域眾所周知的方法包括(但不限于)免疫測定法(例如，通過Western印跡分析，免疫沉淀然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳，免疫細(xì)胞化學(xué)等)和/或雜交測定法來檢測mRNA的表達(dá)(例如，Northern測定法，斑點印跡，原位雜交等)。
預(yù)防藥劑的施用可在異常基因表達(dá)的特征癥狀出現(xiàn)之前進(jìn)行，由此可防止或(可選地)延遲疾病或病癥的進(jìn)程。根據(jù)所檢測的異常表達(dá)的類型，所述藥劑可用于治療個體。根據(jù)本文所述篩選方法可確定適宜的藥劑。
本發(fā)明另一方面涉及為了治療性目的而調(diào)節(jié)本文所述差異性調(diào)節(jié)的基因之一的表達(dá)或活性的方法。該方法包括將細(xì)胞與藥劑接觸，所述藥劑調(diào)節(jié)差異性表達(dá)的基因的基因產(chǎn)物的一種或多種活性。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性的藥劑可以是如本文所述的藥劑，諸如核酸或蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)、肽、肽模擬物的天然存在的同源配體，或其它小分子。在一個實施方案中，所述藥劑刺激一種或多種差異性表達(dá)的基因的一種或多種蛋白質(zhì)活性。所述刺激性藥劑的實例包括活性蛋白質(zhì)和已被導(dǎo)入細(xì)胞的編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子。
本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防個體中結(jié)腸癌或胃癌的方法，其包括對所述個體施用疫苗，所述疫苗包含由選自CGX 1-8的核酸編碼的多肽或所述多肽的免疫活性片段，或編碼該多肽的多核苷酸或其片段。施用所述多肽在個體中誘導(dǎo)抗腫瘤免疫。為了誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，施用選自CGX 1-8的核酸所編碼的多肽或所述多肽的免疫活性片段，或編碼該多肽的多核苷酸。該多肽或其免疫活性片段可用作對抗結(jié)腸癌或胃癌的疫苗。在一些情況下，蛋白質(zhì)或其片段可以以與T細(xì)胞受體(TCR)結(jié)合或由抗原呈遞細(xì)胞(APC)呈遞的形式進(jìn)行施用，所述APC諸如巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞(DC)或B-細(xì)胞。由于DC具有強(qiáng)抗原呈遞能力，在所述APC中，使用DC是最適宜的。
在本發(fā)明中，針對結(jié)腸癌或胃癌的疫苗是指具有經(jīng)對動物進(jìn)行免疫接種而誘導(dǎo)抗腫瘤免疫功能的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，由選自CGX 1-8的核酸或片段編碼的多肽被認(rèn)為是HLA-A24或HLA-A*0201限制性表位肽，所述多肽可誘導(dǎo)針對表達(dá)CGX 1-8的結(jié)腸癌或胃癌細(xì)胞的、有效且特異的免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明還包括使用該多肽誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法。一般而言，抗腫瘤免疫包括諸如以下的免疫反應(yīng)誘導(dǎo)抗腫瘤的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)識別腫瘤的抗體，和誘導(dǎo)抗腫瘤細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
因此，當(dāng)特定蛋白質(zhì)通過接種動物而誘導(dǎo)任何一種所述免疫反應(yīng)時，該蛋白質(zhì)即可被認(rèn)為具有抗腫瘤免疫誘導(dǎo)功效。由蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫可通過在體內(nèi)或體外觀察宿主免疫系統(tǒng)針對該蛋白質(zhì)的反應(yīng)而進(jìn)行檢測。
例如，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)的檢測方法是眾所周知的。進(jìn)入活體的外來物質(zhì)通過抗原呈遞細(xì)胞(APC)的作用而被呈遞于T細(xì)胞和B細(xì)胞。響應(yīng)于APC所呈遞抗原的T細(xì)胞由于該抗原的刺激而以抗原特異性圖譜分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞；CTL)，然后增殖(這被稱為T細(xì)胞活化)。因此，具體肽對CTL的誘導(dǎo)可通過經(jīng)由APC將該肽呈遞給T細(xì)胞，并檢測CTL的誘導(dǎo)而進(jìn)行評估。此外，APC具有激活CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，嗜酸粒細(xì)胞，和NK細(xì)胞的功效。由于CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在抗腫瘤免疫中同等重要，故該肽的抗腫瘤免疫誘導(dǎo)作用可采用這些細(xì)胞的激活效應(yīng)作為指標(biāo)進(jìn)行評估。
以樹突細(xì)胞(DC)作為APC而對CTL誘導(dǎo)作用進(jìn)行評估的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。在APC中，DC是具有最強(qiáng)CTL誘導(dǎo)作用的代表性APC。在該方法中，首先將試驗多肽與DC接觸，然后將該DC與T細(xì)胞接觸。在與DC接觸后，對具有針對興趣細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用的T細(xì)胞的檢測顯示出該試驗多肽具有誘導(dǎo)所述細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。CTL抗腫瘤的活性可通過，例如，采用51Cr標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞的溶解作為指標(biāo)進(jìn)行檢測?；蛘?，采用3H-脫氧胸苷攝取活性或LDH(乳糖脫氫酶)釋放作為指標(biāo)對腫瘤細(xì)胞損傷程度進(jìn)行評價的方法也是眾所周知的。
除DC外，外周血單核細(xì)胞(PBMC)也可用作APC。已有報道指出，通過在存在GM-CSF和IL-4的情況下培養(yǎng)PBMC，可增強(qiáng)CTL的誘導(dǎo)。相似地，已經(jīng)顯示出通過在存在鑰孔戚血藍(lán)素(KLH)和IL-7的條件下培養(yǎng)PBMC可誘導(dǎo)CTL。
通過這些方法證實具有CTL誘導(dǎo)活性的試驗多肽是具有DC激活效應(yīng)和隨后CTL誘導(dǎo)活性的多肽。因此，誘導(dǎo)針對腫瘤細(xì)胞的CTL的多肽可用作抗腫瘤的疫苗。此外，通過與所述多肽接觸而獲得誘導(dǎo)針對腫瘤的CTL能力的APC可用作抗腫瘤的疫苗。此外，由于經(jīng)APC呈遞多肽抗原而獲得細(xì)胞毒性的CTL也可被用作抗腫瘤的疫苗。采用由APC和CTL產(chǎn)生的抗腫瘤免疫的腫瘤治療方法被稱為細(xì)胞免疫治療。
一般來說，當(dāng)使用多肽進(jìn)行細(xì)胞免疫治療時，已知通過聯(lián)合多種具有不同結(jié)構(gòu)的多肽并將其與DC接觸可增加CTL誘導(dǎo)效率。因此，當(dāng)用蛋白質(zhì)片段刺激DC時，使用多種類型片段的混合物是有利的。
或者，多肽對抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)可通過檢測對抗腫瘤抗體生成的誘導(dǎo)而證實。例如，當(dāng)在用所述多肽免疫的試驗動物中誘導(dǎo)抗該多肽的抗體時，以及當(dāng)這些抗體抑制腫瘤細(xì)胞的生長時，該多肽可被確定為具有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的能力。
通過施用本發(fā)明的疫苗可誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，且這種對該抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)能夠治療和預(yù)防結(jié)腸癌或胃癌?？拱┲委熁?qū)Π┌Y發(fā)病的預(yù)防包括任何步驟，諸如癌性細(xì)胞生長的抑制，癌癥的衰退(involution)，以及癌發(fā)生的抑制?；加邪┌Y的個體死亡率的降低，血液中腫瘤標(biāo)記物的降低，癌伴發(fā)的可檢測癥狀的緩解等等也包括在癌癥的治療或預(yù)防中。所述治療性和預(yù)防性效果優(yōu)選具有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性。例如，在觀察中顯著性水平為5％或更低，其中將疫苗抗細(xì)胞增殖性疾病的治療性或預(yù)防性效果與未施用疫苗的對照進(jìn)行比較。例如，可將Student’s t-檢驗，Mann-Whitney U-檢驗，或ANOVA用于統(tǒng)計學(xué)分析。
上述具有免疫活性的蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的載體可與佐劑聯(lián)合。佐劑是指當(dāng)與具有免疫活性的蛋白質(zhì)一起(或連續(xù))使用時能增強(qiáng)針對該蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)的化合物。佐劑的實例包括(但不限于)霍亂毒素，沙門氏菌毒素，明礬，等。此外，本發(fā)明的疫苗可適宜地與可藥用的載體聯(lián)用。所述載體的實例是無菌水，生理鹽水，磷酸緩沖液，培養(yǎng)液等。此外，疫苗可按需要包含穩(wěn)定劑，混懸劑，防腐劑，表面活性劑等。疫苗可全身或局部地進(jìn)行施用。疫苗施用可通過單一投藥進(jìn)行，或經(jīng)多次投藥而強(qiáng)化。
當(dāng)使用APC或CTL作為本發(fā)明的疫苗時，可通過，例如離體方法治療或預(yù)防腫瘤。更具體地，收集接受治療或預(yù)防的個體的PBMC，將該細(xì)胞與所述多肽在離體條件下接觸，誘導(dǎo)APC或CTL后，可將該細(xì)胞施用于該個體。APC還可通過將編碼所述多肽的載體在離體條件下導(dǎo)入PBMC中來誘導(dǎo)。離體條件下誘導(dǎo)的APC或CTL可在施用前進(jìn)行克隆。通過克隆并使具有高靶細(xì)胞破壞活性的細(xì)胞生長，可以更有效地實施細(xì)胞免疫治療。此外，以該方式分離的APC和CTL不僅可用于對所述細(xì)胞所來源個體進(jìn)行細(xì)胞免疫治療，還可用于對來自其它個體的相似腫瘤類型進(jìn)行細(xì)胞免疫治療。
此外，提供了治療或預(yù)防細(xì)胞增殖性疾病，諸如癌癥的藥物組合物，其包括藥學(xué)有效量的本發(fā)明的多肽。該藥物組合物可用于提高抗腫瘤免疫。
治療結(jié)腸癌或胃癌的藥物組合物本發(fā)明另一方面包括藥學(xué)或治療組合物，其包含一種或多種本文所述的治療化合物。藥物制劑可包括適于經(jīng)口服，經(jīng)直腸，經(jīng)鼻，局部(包括經(jīng)頰和舌下)，經(jīng)陰道或胃腸外(包括經(jīng)肌內(nèi)，皮下和靜脈內(nèi))投藥，或適于經(jīng)吸入或吹入投藥的那些制劑。所述制劑(在適宜時)可為分散的劑量單位，并可通過藥學(xué)領(lǐng)域眾所周知的任何方法進(jìn)行制備。所有所述藥學(xué)方法包括如下步驟，將活性化合物按照需要與液體載體和/或微細(xì)分碎的固體載體聯(lián)用，且然后(如有需要)將所產(chǎn)物塑成所需制劑的形狀。
適于經(jīng)口投藥的藥物制劑可被合宜地制成分散單位，諸如膠囊劑、扁囊劑或片劑，其各包含預(yù)定量的活性成分；散劑或顆粒劑；或溶液、混懸劑或乳劑?；钚猿煞诌€可制為大丸劑、藥糖劑或糊劑，并可以是純的形式，即無載體。用于經(jīng)口投藥的片劑和膠囊劑可包含常規(guī)賦形劑諸如粘合劑、填充劑、潤滑劑、崩解劑或濕潤劑。片劑可通過壓制(compression)或模制(modeling)，任選地用一種或多種配制性成分來制備。壓制片劑可通過在適宜的機(jī)器中將活性成分壓制成非流動形式諸如粉末或顆粒(任選與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、潤滑的，表面活性或分散劑混合)來制備。模制片劑可通過在適宜的機(jī)器中，將用惰性液體稀釋劑濕潤的粉末化合物的混合物進(jìn)行模塑而制備。片劑可根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法進(jìn)行包衣?？诜后w制劑的形式可以是，例如，水性或油性混懸劑、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑，或可以是在使用前用水或其它適宜的載體溶解的干燥產(chǎn)品。所述液體制劑可包含常規(guī)添加劑諸如懸浮劑、乳化劑、非水性載體(可包括食用油)，或防腐劑。片劑可任選地進(jìn)行制備，只要其能緩慢或有控制地釋放其中的活性成分即可。
用于胃腸外道投藥的制劑包括水性和非水性無菌注射液，其可包含抗氧化劑，緩沖液，抑菌劑和溶質(zhì)，所述成份可使該制劑與目的受體的血液等張；以及包括懸浮劑和增稠劑的水性和非水性無菌混懸劑。所述制劑可被置于單位劑量或多劑量容器，例如密封安瓿和玻璃瓶中，并可以冷凍干燥(凍干)狀態(tài)保存，在使用前僅需要加入無菌液體載體例如鹽水、注射用水。或者，所述制劑可以是連續(xù)輸注劑。臨時注射劑溶液和混懸劑可用先前所述類型的無菌散劑，顆粒劑和片劑進(jìn)行制備。
用于直腸投藥的制劑可以是采用常用載體諸如可可脂或聚乙二醇的栓劑。用于在口中局部投藥(例如經(jīng)頰或舌下)的制劑包括在調(diào)味基質(zhì)諸如蔗糖和阿拉伯膠或西黃蓍膠中的、包含活性成分的錠劑，以及在基質(zhì)諸如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠中的、包含活性成分的芳香重劑(pastill)。對于經(jīng)鼻內(nèi)施用，本發(fā)明的化合物可以作為液體噴霧劑或分散性粉劑或以滴劑的形式進(jìn)行使用。滴劑可用水性或非水性基質(zhì)制備，所述基質(zhì)中還包含一種或多種分散劑、增溶劑或懸浮劑。液體噴霧劑可適宜地從壓力包中遞送。
對于通過吸入的投藥，化合物可適宜地通過噴霧器(insufflator)、霧化器(nebulizer)、壓力包或其它適宜遞送噴霧劑的方式進(jìn)行遞送。壓力包可包含適宜的推進(jìn)劑諸如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適宜的氣體。在增壓氣霧劑的情況下，劑量單位可通過閥瓣來遞送經(jīng)計量的量來確定。
或者，對于通過吸入或吹入的投藥，所述化合物可采用干粉組合物的形式，例如所述化合物與適宜的粉末基質(zhì)諸如乳糖或淀粉的粉末混合物。粉末組合物可以是單位劑量形式，例如，膠囊，藥筒，明膠或發(fā)泡包，其中借助吸入器或吹入器來施用所述粉末。
需要時，可使用上述制劑(適于持續(xù)釋放活性成分)。該藥物組合物還可包含其它活性成分諸如抗微生物劑、免疫抑制劑或防腐劑。
應(yīng)當(dāng)理解除上面具體描述的成分外，根據(jù)需要的制劑類型，本發(fā)明的制劑可包括本領(lǐng)域常規(guī)的其它藥劑，例如，適于經(jīng)口服投藥的藥劑可包括調(diào)味劑。
優(yōu)選的單位劑量制劑是包含有效劑量的活性成分的那些制劑(如下述)，或其適宜部分。
對于上述各種情況來說，組合物以約0.1-約250mg/kg/日的劑量經(jīng)口服或經(jīng)注射進(jìn)行施用。用于成年人的劑量范圍一般是約5mg-約17.5g/日，優(yōu)選約5mg-約10g/日，最優(yōu)選約100mg-約3g/日。分散單位劑量形式的片劑或其它單位劑型可合宜地包含有效劑量或其多劑量形式，例如，包含約5mg-約500mg，通常約100mg-約500mg的單位劑量。
所述藥物組合物優(yōu)選經(jīng)口服或經(jīng)注射(靜脈內(nèi)或皮下)進(jìn)行施用，主治醫(yī)師將能確定施用于個體的精確量。但是，施用劑量要依賴多種因素，包括個體的年齡和性別，要進(jìn)行治療的具體疾病及其嚴(yán)重度。投藥途徑也可根據(jù)病癥及其嚴(yán)重度而改變。
CGX核酸本發(fā)明還提供了新的核酸，其包括選自CGX1-5(SEQ ID NO1，3，5，7，9和11)的核酸序列或其互補(bǔ)序列，以及包含這些核酸的載體和細(xì)胞。還提供了由CGX核酸或其生物活性部分編碼的多肽。
本發(fā)明還包括能足以用作鑒別CGX編碼核酸(例如，CGX mRNA)的雜交探針的核酸片段以及可用于CGX核酸分子的擴(kuò)增或突變的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物的片段。如本文所使用的，術(shù)語“核酸分子”意指包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)，RNA分子(例如，mRNA)，用核苷酸類似物生成的DNA或RNA類似物，和其衍生物、片段及其同源物。所述核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈DNA。
“探針”是指長度可變的核酸序列，根據(jù)用途，優(yōu)選為至少約10個核苷酸(nt)或多至約例如6,000nt。探針用于檢測相同、相似或互補(bǔ)的核酸序列。通常由天然或重組來源獲得的較長探針具有高度特異性，且雜交比寡聚體慢很多。探針是單鏈或雙鏈的，并設(shè)計為在PCR，基于膜的雜交技術(shù)，或類似ELISA的技術(shù)中具有高度特異性。
“分離的”核酸分子是與存在于核酸天然來源中的其它核酸分子分離的核酸分子。分離的核酸分子的實例包括(但不限于)包含在載體中的重組DNA分子，保持在異源宿主細(xì)胞中的重組DNA分子，部分或基本上純化的核酸分子，以及合成的DNA或RNA分子。優(yōu)選地，“分離的”核酸不含與核酸天然側(cè)接的序列(即，位于該核酸5′和3′末端的序列)，該序列存在于核酸所來源的生物體的基因組DNA中。例如，在多種實施方案中，分離的CGX核酸分子可包含低于約50kb、25kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，該核苷酸序列在該核酸來源的細(xì)胞的基因組DNA中與所述核酸分子天然側(cè)接。而且，“分離的”核酸分子，諸如cDNA分子，當(dāng)通過重組技術(shù)制備時，可基本上不含其它細(xì)胞性物質(zhì)或培養(yǎng)基，或當(dāng)通過化學(xué)方法合成時，可基本上不含化學(xué)前體物質(zhì)或其它化學(xué)物質(zhì)。
本發(fā)明的核酸分子，例如，具有CGX1-5之一的核苷酸序列(SEQ IDNO1、3、5、7、9或11)的核酸分子，或這些核苷酸序列之一的互補(bǔ)序列，可采用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)和本文提供的序列信息進(jìn)行分離。采用這些核酸序列的全部或部分作為雜交探針，采用標(biāo)準(zhǔn)雜交和克隆技術(shù)可分離CGX核酸序列(例如，按照Sambrook等，eds.，MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL 2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989；和Ausubel，等，eds.，CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，NY，1993.中所述)本發(fā)明的核酸可采用cDNA，mRNA或可選為基因組DNA作為模板和適宜的寡核苷酸引物，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。如此擴(kuò)增的核酸可被克隆至適宜的載體中，并可通過DNA序列分析表征。此外，與CGX核苷酸序列相應(yīng)的寡核苷酸可通過標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)，例如，使用DNA自動合成儀進(jìn)行制備。
如本文所使用的，術(shù)語“寡核苷酸”是指一系列相連接的核苷酸殘基，該寡核苷酸具有的核苷酸堿基數(shù)目足以用于PCR反應(yīng)。短寡核苷酸序列可根據(jù)，或從基因組或cDNA序列設(shè)計，并可被用于在具體細(xì)胞或組織中擴(kuò)增、驗證相同、相似或互補(bǔ)DNA或RNA或揭示所述DNA或RNA的存在。寡核苷酸包含具有至少約10nt-多達(dá)50nt，優(yōu)選約15nt-30nt的核酸序列的部分。它們可通過化學(xué)方法合成，并可被用作探針。
在另一實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子包括與CGX1-5(SEQ IDNO1、3、5、7、9或11)所示核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子。在另一實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子包括與任何這些序列或任何這些核苷酸序列的一部分所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子。與CGX1-5(SEQ ID NO1、3、5、7、9或11)中所示核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子是與所示核苷酸序列充分互補(bǔ)的核酸分子，由此所述核酸分子可與所示核苷酸序列通過氫鍵結(jié)合，而形成少量或無錯配，由此形成穩(wěn)定的雙鏈體。
本文術(shù)語“互補(bǔ)”是指核酸分子的核苷酸單位間的Watson-Crick或Hoogsteen堿基對，而術(shù)語“結(jié)合”是指兩種多肽或化合物和/或其相關(guān)多肽或化合物間的物理或化學(xué)的相互作用。結(jié)合包括離子性，非離子性，范德華力，疏水作用等。物理相互作用可以是直接或間接的。間接相互作用可通過或由于其它多肽或化合物的作用。直接結(jié)合指不通過或由于其它多肽或化合物的作用而發(fā)生的相互作用，其無需其它化學(xué)介質(zhì)。
而且，本發(fā)明的核酸分子可僅包括CGX1-5(SEQ ID NO1、3、5、7、9或11)的核酸序列的一部分，例如，可用作探針或引物的片段或編碼CGX的生物活性部分的片段。本文所提供的片段的定義是至少6個(連續(xù))核酸或至少4個(連續(xù))氨基酸的序列，其長度對于核酸而言足以允許特異性雜交，或?qū)τ诎被岫宰阋栽试S特異性識別表位，且最多是少于全長序列的一些部分。片段可來自所選核酸或氨基酸序列的任何連續(xù)的部分。衍生物是從天然化合物直接或通過修飾或部分置換而形成的核酸序列或氨基酸序列。類似物是具有與天然化合物相似的(但不相同的)結(jié)構(gòu)、但具體部分或側(cè)鏈不同的核酸序列或氨基酸序列。類似物可以是合成的或來自不同進(jìn)化起源的，且可具有與野生型相似或相反的代謝活性。
若衍生物或類似物包含修飾的核酸或氨基酸(如下述)，則衍生物和類似物可以是全長或非全長的。在多個實施方案中，本發(fā)明的核酸或蛋白質(zhì)的衍生物或類似物包括(但不限于)含有與本發(fā)明的核酸或蛋白基本同源的區(qū)的分子，所述區(qū)的相同核酸或氨基酸序列長度上或當(dāng)與經(jīng)過比對的序列(其通過本領(lǐng)域已知的計算機(jī)同源性程序進(jìn)行比對)進(jìn)行比較時與本發(fā)明的核酸或蛋白具有至少約45％、50％、70％、80％、95％、98％或甚至99％的同一性(優(yōu)選80-99％的同一性)，或編碼它的核酸能夠與編碼上述蛋白質(zhì)的序列的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)、中度嚴(yán)謹(jǐn)，或低嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的分子。例如參見Ausubel，等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，JohnWiley & Sons，New York，NY，1993，以及下述。示例性程序是采用缺省設(shè)定的Gap程序(Wisconsin序列分析包，針對UNIX的版本8，GeneticsComputer Group，University Research Park，Madison，WI)，其采用的是Smith和Waterman的算法(Adv.Appl.Math.，1981，2482-489，其全文引入此處作為參考)。
“同源核酸序列”或“同源氨基酸序列”或其變體是指這樣的序列，其特征在于在核苷酸水平或氨基酸水平上具有上述同源性。同源核苷酸序列編碼那些編碼CGX多肽同種型的序列。同種型作為例如，RNA的選擇性剪接的結(jié)果而可以在相同生物體的不同組織中表達(dá)?；蛘撸悩?gòu)體可由不同基因所編碼。在本發(fā)明中，同源核苷酸序列包括編碼除人之外物種的CGX多肽的核苷酸序列，所述物種包括(但不限于)哺乳動物，由此可包括，例如，小鼠，大鼠，兔，犬，貓、牛，馬以及其它生物體。同源核苷酸序列還包括(但不限于)本文所述核苷酸序列的天然存在的等位基因變異和突變。但是，同源核苷酸序列不包括編碼人CGX蛋白質(zhì)的核苷酸序列。同源核酸序列包括編碼在CGX多肽中編碼保守氨基酸置換(如下)以及具有CGX活性的多肽的核酸序列。同源氨基酸序列不編碼人CGX多肽的氨基酸序列。
通過克隆人CGX基因而確定的核苷酸序列可用于生成探針和引物，該探針和引物設(shè)計為用于鑒定和/或克隆其它細(xì)胞類型(例如來自其它組織)中的CGX同源物，以及來自其它哺乳動物的CGX同源物。探針/引物典型地包括基本上純化的寡核苷酸。所述寡核苷酸通常包括這樣的核苷酸序列區(qū)域，其與包含CGX序列的核酸的至少約12，25，50，100，150，200，250，300，350或400連續(xù)有義鏈核苷酸序列，或包含CGX序列的核酸的反義鏈核苷酸序列，或這些序列的天然存在的突變體在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。
基于人CGX核苷酸序列的探針可用于檢測編碼相同的或同源性蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄物或基因組序列。在多個實施方案中，所述探針還包括與其結(jié)合的標(biāo)記基團(tuán)，例如，所述標(biāo)記基團(tuán)可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子。所述探針可被用作診斷檢測試劑盒的一部分，所述試劑盒用于鑒定錯誤表達(dá)(misexpress)CGX蛋白質(zhì)的細(xì)胞或組織，諸如通過在來自個體的細(xì)胞樣品中檢測編碼CGX的核酸的水平，例如，檢測CGX mRNA水平或測定基因組CGX基因是否已經(jīng)發(fā)生突變或缺失。
“具有CGX的生物活性部分的多肽”是指通過具體生物測定法的檢測(具有或不具有劑量依賴性)，顯示與本發(fā)明的多肽(包括成熟形式)的活性相似(但無須相同)活性的多肽。編碼“CGX的生物活性部分”的核酸片段可通過分離部分CGX1-5(SEQ ID NO1、3、5、7、9或11)(該部分編碼具有CGX生物活性的多肽)，表達(dá)CGX蛋白質(zhì)的編碼部分(例如，通過體外重組表達(dá))并評估CGX的編碼部分的活性來制備。例如，編碼CGX多肽的生物活性部分的核酸片段可任選地包括ATP結(jié)合域。在其它實施方案中，編碼CGX的生物活性部分的核酸片段包括一或多個區(qū)域。
CGX變體本發(fā)明進(jìn)一步包括由于遺傳密碼簡并性而與所公開的或所參照的CGX核苷酸序列不同的核酸分子。由此，這些核酸編碼的CGX蛋白質(zhì)與包含例如CGX1、3、5、7、9或11所示CGX核酸的核苷酸序列所編碼的相同。
除CGX1-5(SEQ ID NO1、3、5、7、9或11)中所示大鼠CGX核苷酸序列外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能理解群體(例如，人類群體)中可存在導(dǎo)致CGX多肽的氨基酸序列改變的DNA序列多態(tài)性。由于天然等位基因變異，CGX基因中所述遺傳多態(tài)性可存在于群體中的個體中。如本文所使用的，術(shù)語“基因”和“重組基因”是指包含編碼CGX蛋白質(zhì)，優(yōu)選哺乳動物CGX蛋白質(zhì)的開放閱讀框的核酸分子。所述天然等位基因變異通?？蓪?dǎo)致CGX基因的核苷酸序列中1-5％的變化。任何和全部所述核苷酸變體以及導(dǎo)致的氨基酸多態(tài)性也意在包含于本發(fā)明的范圍中，所述變異及氨基酸多態(tài)性是天然等位基因變異的結(jié)果、且不會改變CGX功能活性的CGX中。
而且，編碼來自其它物種的CGX蛋白質(zhì)，并由此具有與CGX1、3、5、7、9或11人類序列不同的核苷酸序列的核酸分子也意在包含于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。與本發(fā)明CGX DNA的天然等位變體和同源物相應(yīng)的核酸分子可根據(jù)其與本文所公開的人CGX核酸的同源性，采用人cDNA或其部分作為雜交探針，在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下按照標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)進(jìn)行分離。例如，可溶性人CGX DNA可根據(jù)其與膜結(jié)合的人CGX的同源性而被分離。而且，膜結(jié)合的人CGX DNA可根據(jù)其與可溶性人CGX的同源性而被分離。
由此，在其它實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子的長度為至少6個核苷酸，并在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含CGX1-5(SEQ ID NO1、3、5、7、9或11)的核苷酸序列的核酸分子雜交。在其它實施方案中，該核酸的長度為至少10、25、50、100、250或500個核苷酸。在其它實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子與編碼區(qū)雜交。如本文所使用的，術(shù)語“在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交”意在描述這樣一種雜交和洗滌條件，在該條件下彼此具有至少60％同源性的核苷酸序列通常保持彼此的雜交。
同源物(即，編碼來自人類之外物種的CGX蛋白質(zhì)的核酸)或其它相關(guān)序列(例如，旁系同源物(paralog))可利用全部或部分具體人類序列作為探針通過低、中等或高嚴(yán)謹(jǐn)雜交，采用本領(lǐng)域已知用于核酸雜交和克隆的方法而獲得。
在本發(fā)明中，術(shù)語“功能等同物(functional equivalent)”是指受試多肽具有這樣的活性，其與CGX 1-7蛋白質(zhì)相似可促進(jìn)細(xì)胞增殖、并賦予癌細(xì)胞致癌活性。受試多肽是否具有細(xì)胞增殖活性可通過將編碼該受試多肽的DNA導(dǎo)入表達(dá)各多肽的細(xì)胞中，并檢測對細(xì)胞增殖的促進(jìn)或集落形成活性的增加來進(jìn)行判斷?；蛘?，該受試多肽是否在功能上等同于ARHCL1，NFXL1，C20orf20及CCPUCC1可通過分別檢測其與Zyxin，MGC10334或CENPC1，BRD8及nCLU結(jié)合的能力來判斷。此外，該受試多肽是否在功能上等同于所述蛋白質(zhì)可通過其與Zyxin，MGC10334或CENPC1，BRD8，或nCLU的結(jié)合能力來判斷。
本文術(shù)語“嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件”是指這樣的條件，在該條件下探針、引物或寡核苷酸將與其靶序列雜交，而不與其它序列雜交。嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴性的，在不同的環(huán)境下存在差異。較長的序列發(fā)生特異性雜交的溫度比較短序列的高。通常，所選擇的嚴(yán)謹(jǐn)條件為在規(guī)定的離子強(qiáng)度和pH條件下比特異性序列的熱融點(Tm)低約5℃。Tm是平衡時，與靶序列互補(bǔ)的50％的探針與該靶序列雜交(在規(guī)定的離子強(qiáng)度，pH和核酸濃度下)的溫度。由于靶序列通常是過量的，故在Tm、平衡時，50％的探針被占據(jù)。通常，嚴(yán)謹(jǐn)條件是鹽濃度為低于約1.0M鈉離子，通常約0.01-1.0M鈉離子(或其它鹽)，pH7.0-8.3，溫度對于短探針、引物或寡核苷酸(例如，10nt-50nt)為至少約30℃而對于較長探針、引物或寡核苷酸為至少約60℃。嚴(yán)謹(jǐn)雜交還可通過加入去穩(wěn)定劑諸如甲酰胺等而獲得。
嚴(yán)謹(jǐn)條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并可見于CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，N.Y(1989)，6.3.1-6.3.6中。優(yōu)選地，該條件是這樣的條件，即相互之間具有至少約65％、70％、75％、85％、90％、95％、98％，或99％同源性的序列通常保持雜交。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的非限制性實例是，于65℃、在包含6×SSC，50mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA，0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.02％BSA，和500mg/ml變性鮭精DNA的高鹽緩沖液中進(jìn)行雜交。所述雜交后，于50℃、0.2×SSC，0.01％BSA中洗滌一次或多次。在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與CGX1-5(SEQ ID NO1、3、5、7、9，或11)的序列雜交的本發(fā)明的分離的核酸分子與天然存在的核酸分子相對應(yīng)。本文中“天然存在的”核酸分子是指具有天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如，編碼天然蛋白質(zhì))。
在第二個實施方案中提供了核酸序列，其能夠在中等嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下，與包含CGX1-5(SEQ ID NO1、3、5、7、9，或11)的核苷酸序列或其片段、類似物或衍生物的核酸分子雜交。中等嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的非限制性實例是在55℃、6×SSC，5×Denhardt氏溶液，0.5％SDS和100mg/ml變性鮭精DNA中進(jìn)行雜交，隨后在37℃、1×SSC，0.1％SDS中洗滌一次或多次?？墒褂玫钠渌械葒?yán)謹(jǐn)條件是本領(lǐng)域所眾所周知的。參見，例如，Ausubel等(eds.)，1993，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley &Sons，NY，和Kriegler，1990，GENE TRANSFER AND EXPRESSION，ALABORATORY MANUAL，Stockton Press，NY。
在第三個實施方案中提供了核酸，所述核酸能夠在低嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下，與包含CGX1-5(SEQ ID NO1、3、5、7、9，或11)的核苷酸序列或其片段、類似物或衍生物的核酸分子雜交。低嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的非限制性實例是在40℃、35％甲酰胺、5×SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100mg/ml變性鮭精DNA、10％(wt/vol)硫酸葡聚糖中進(jìn)行雜交，隨后在50℃、2×SSC、25mM Tris-HCl(pH7.4)、5mM EDTA、和0.1％SDS中洗滌一次或多次。可使用的其它中等嚴(yán)謹(jǐn)條件是本領(lǐng)域所眾所周知的(例如，用于交叉物種雜交的)。參見，例如，Ausubel等(eds.)，1993，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，NY，和Kriegler，1990，GENE TRANSFER AND EXPRESSION，ALABORATORY MANUAL，Stockton Press，NY；Shilo等，1981，Proc NatlAcad Sci USA 786789-6792。
保守性突變除可存在于群體中的CGX序列的天然存在的等位變體外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解所述改變可被引入CGX核酸或直接引入CGX多肽序列中而不會改變CGX蛋白質(zhì)的功能。在一些實施方案中，CGX1-5(SEQ ID NO1、3、5、7、9或11)的核苷酸序列將被改變，由此導(dǎo)致所編碼CGX蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的改變。例如，可在CGX1-5(SEQ ID NO1、3、5、7、9或11)的序列中在多種“非必要”氨基酸殘基處進(jìn)行會導(dǎo)致氨基酸置換的核苷酸置換?！胺潜匾卑被釟埢强上鄬τ贑GX的野生型序列發(fā)生改變，而不會改變生物活性的殘基，然而“必要”氨基酸殘基是生物活性所需要的。例如，預(yù)期本發(fā)明的CGX蛋白質(zhì)中保守的氨基酸殘基尤其不易于改變。
此外，預(yù)測在本發(fā)明的CGX蛋白質(zhì)家族成員中保守的氨基酸殘基，也特別不易于改變。如此，這些保守性區(qū)域可能不易于突變。然而，其它氨基酸殘基(例如，在CGX蛋白質(zhì)成員中非保守的或僅為半保守的的那些殘基)可能對活性不重要，因此很可能易于改變。
本發(fā)明另一方面涉及編碼CGX蛋白質(zhì)的核酸分子，所述CGX蛋白質(zhì)包含對活性非必要的氨基酸殘基中的改變。所述CGX蛋白質(zhì)在氨基酸序列上與包含CGX1-5(SEQ ID NO1、3、5、7、9或11)的核酸所編碼多肽的氨基酸序列不同，但保持了生物活性。在一個實施方案中，分離的核酸分子包括編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中該蛋白質(zhì)包含與由包含CGX1-5(SEQID NO1、3、5、7、9，或11)的核酸編碼的多肽的氨基酸序列至少約45％同源性，更優(yōu)選60％，且更優(yōu)選至少約70％，80％，90％，95％，98％，且最優(yōu)選至少約99％的同源性的氨基酸序列。
編碼同源CGX蛋白質(zhì)的分離的核酸分子可通過如下方法生成，通過將一種或多種核苷酸置換、添加或缺失引入包含CGX1-5(SEQ ID NO1、3、5、7、9或11)的核酸的核苷酸序列，從而將一或多種氨基酸置換、添加或缺失引入所編碼的蛋白質(zhì)中。
通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，，諸如定點誘變和PCR介導(dǎo)的誘變可將突變引入包含CGX1-5(SEQ ID NO1、3、5、7、9或11)的核酸中。優(yōu)選地，在一個或多個預(yù)測的非必要氨基酸殘基上實施保守性氨基酸置換?！氨Ｊ匦园被嶂脫Q”是這樣一種置換，其中將氨基酸殘基用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基進(jìn)行替換。在本領(lǐng)域中已經(jīng)對具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族給出詳細(xì)說明。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸，精氨酸，組氨酸)，具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，門冬氨酸，谷氨酸)，具有不帶電極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，絲氨酸，絲氨酸，半胱氨酸)，具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，具有β-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)和具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)。因此，CGX中預(yù)測的非必要氨基酸殘基被來自相同側(cè)鏈家族的其它氨基酸殘基置換?；蛘?，在其它實施方案中，突變可沿全部或部分CGX編碼序列而被隨機(jī)引入諸如通過飽和誘變，并可篩選所得突變體的CGX生物活性以便鑒定保持所述活性的突變體。在核酸誘變后，通過本領(lǐng)域已知的任何重組技術(shù)表達(dá)所編碼的蛋白質(zhì)并測定該蛋白質(zhì)的活性。
在其它實施方案中，與第一序列雜交的互補(bǔ)多核苷酸序列的片段是CGX 1、3、5、7、9或11的互補(bǔ)多核苷酸序列的片段。
在其它具體實施方案中，核酸是RNA或DNA。長度為約10至約100個核苷酸，例如，長度為約10至約90個核苷酸，或長度為約10至約75個核苷酸，長度為約10至約50堿基，長度為約10至約40個堿基，或長度為約15至約30個堿基的片段是CGX 1、3、5、7、9或11的互補(bǔ)多核苷酸序列的片段。
CGX多肽本發(fā)明的一個方面涉及分離的CGX蛋白質(zhì)，(SEQ ID NO2，4，6，8，10或12)及其生物活性部分，或其衍生物、片段、類似物或同源物。還提供了適于用作產(chǎn)生抗CGX抗體的免疫原的多肽片段。在一個實施方案中，通過適宜的純化方案，采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)可從細(xì)胞或組織來源中分離天然CGX蛋白質(zhì)。在其它實施方案中，CGX蛋白質(zhì)通過重組DNA技術(shù)制備。作為重組表達(dá)的可選方法，CGX蛋白質(zhì)或多肽可采用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)通過化學(xué)方法合成。
“分離的”或“純化的”蛋白質(zhì)或其生物活性部分基本上不含來自CGX蛋白所來源的細(xì)胞或組織源的細(xì)胞性物質(zhì)或其它污染性蛋白質(zhì)，或如果是通過化學(xué)方法合成則基本上不含化學(xué)前體物質(zhì)或其它化學(xué)物質(zhì)。術(shù)語“基本上不含細(xì)胞物質(zhì)”包括這樣的CGX蛋白質(zhì)制劑，其中所述蛋白質(zhì)與該從中分離或重組制備蛋白質(zhì)的細(xì)胞的細(xì)胞成分相分離。在一個實施方案中，術(shù)語“基本上不含細(xì)胞性物質(zhì)”包括這樣的CGX蛋白質(zhì)制劑，其含有低于約30％(以干重計)的非CGX蛋白質(zhì)(本文中也稱為“污染蛋白質(zhì)”)，更優(yōu)選低于約20％的非CGX蛋白質(zhì)，更優(yōu)選低于約10％的非CGX蛋白質(zhì)，最優(yōu)選低于約5％的非CGX蛋白質(zhì)。當(dāng)CGX蛋白質(zhì)或其生物活性部分經(jīng)重組制備時，還優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，即，培養(yǎng)基占所述蛋白質(zhì)制劑體積的低于約20％，更優(yōu)選低于約10％，最優(yōu)選低于約5％。
術(shù)語“基本上不含化學(xué)前體物質(zhì)或其它化學(xué)物質(zhì)”包括這樣的CGX蛋白質(zhì)制劑，其中所述蛋白質(zhì)與該蛋白質(zhì)合成所涉及的化學(xué)前體物質(zhì)或其它化學(xué)物質(zhì)相分離。在一個實施方案中，術(shù)語“基本上不含化學(xué)前體物質(zhì)或其它化學(xué)物質(zhì)”包括這樣的CGX蛋白質(zhì)制劑，其含有低于約30％(以干重計)的化學(xué)前體物質(zhì)或非CGX化學(xué)物質(zhì)，更優(yōu)選低于約20％的化學(xué)前體物質(zhì)或非CGX化學(xué)物質(zhì)，更優(yōu)選低于約10％的化學(xué)前體物質(zhì)或非CGX化學(xué)物質(zhì)，最優(yōu)選低于約5％的化學(xué)前體物質(zhì)或非CGX化學(xué)物質(zhì)。
CGX蛋白質(zhì)的生物活性部分包括肽，所述肽含有與CGX蛋白質(zhì)的氨基酸序列充分同源的或來自所述氨基酸序列的氨基酸序列，例如包含CGX1-20的核酸所編碼的氨基酸序列，其包括的氨基酸少于全長CGX蛋白質(zhì)，并表現(xiàn)出至少一種CGX蛋白質(zhì)的活性。通常，生物活性部分包括具有至少一種CGX蛋白質(zhì)活性的結(jié)構(gòu)域或基序。CGX蛋白質(zhì)的生物活性部分可以是長度為例如，10個、25個、50個、100個或更多個氨基酸的多肽。
本發(fā)明CGX蛋白質(zhì)的生物活性部分可包含在CGX蛋白質(zhì)間保守的至少一種上文所鑒定的區(qū)域。CGX蛋白質(zhì)的可選擇的生物活性部分可包含至少兩種上文所鑒定的區(qū)域。CGX蛋白質(zhì)的另一生物活性部分可包含至少三種上文所鑒定的區(qū)域。而本發(fā)明的CGX蛋白質(zhì)的另一生物活性部分可包含至少四種上文所鑒定的區(qū)域。
而且，其它生物活性部分(其中蛋白質(zhì)的其它區(qū)域被缺失)可通過重組技術(shù)制備，并評估其天然CGX蛋白質(zhì)的一種或多種功能活性。
在一些實施方案中，CGX蛋白質(zhì)與這些CGX蛋白質(zhì)中的一種基本上同源并保持其功能活性，但由于天然等位變異或誘變而在氨基酸序列中存在差異，如下文詳述。
在具體的實施方案中，本發(fā)明包括分離的多肽，其包含與多肽的序列具有80％或更高同一性的氨基酸序列，所述多肽在施用了PPAR配體的哺乳動物中的表達(dá)受到調(diào)節(jié)。
本發(fā)明將通過以下實施例做進(jìn)一步描述，其并不限制權(quán)利要求中所述本發(fā)明的范圍。下述實施例描述了對在結(jié)腸癌或胃癌細(xì)胞中差異性表達(dá)的基因的鑒定和表征。
實施例1一般方法患者和組織樣品。在征得患者同意的情況下，所有結(jié)腸直腸和胃癌組織以及相應(yīng)非癌性組織均取自接受手術(shù)的患者的外科標(biāo)品。
全基因組cDNA微陣列。采用具有23040個基因的全基因組cDNA微陣列。用DNAe I處理從顯微解剖的組織中提取的總RNA，采用AmpliscribeT7轉(zhuǎn)錄試劑盒(Epicentre Technologies)對所述總RNA進(jìn)行擴(kuò)增，隨后在反轉(zhuǎn)錄期間用Cy染料(Amersham)進(jìn)行標(biāo)記。用Cy5標(biāo)記來自非癌性組織的RNA，而用Cy3標(biāo)記來自腫瘤的RNA。如前面(4)所述實施雜交、洗滌和檢測，每個靶點的Cy5和Cy3熒光強(qiáng)度采用Array Vision軟件(AmershamPharmacia)生成。在減去本底信號后，將每個點的雙值平均化。然后，將載玻片上的所有熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化，以便校正每個載玻片的52個看家基因的平均Cy5和Cy3強(qiáng)度。當(dāng)基因的Cy3和Cy5的強(qiáng)度均低于25,000熒光單位時，從進(jìn)一步的試驗中排除該基因，在剩余的基因中，我們選取Cy3/Cy5信號比值＞2.0的那些做進(jìn)一步的評估。
細(xì)胞系。COS7細(xì)胞，和人結(jié)腸癌細(xì)胞系，LoVo，HCT15，以及SW480獲自美國典型培養(yǎng)物中心(ATCC，Rockville，MD)，人類結(jié)腸癌SNU-C4細(xì)胞獲自韓國細(xì)胞系庫(korea cell-line bank)。人胃癌細(xì)胞系MKN-1，MKN-28，MKN45和MKN74獲自研究生物資源日本保藏中心(Japanese Collection ofResearch Bioresources(JCRB))。人胃癌MKN7細(xì)胞獲自RIKEN，而人胃癌St-4細(xì)胞由Tsuruo博士(癌癥研究所，日本(Institute of cancer Researth，Japan))惠贈。所有細(xì)胞均在適宜的培養(yǎng)基(Sigma)中單層生長，Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基用于COS7；RPMI1640用于SNUC4，HCT15；MKN-1，MKN-7，MKN-28，MKN45，MKN74，St-4，Leibovitz氏L-15培養(yǎng)基(Leibovitz’s L-15)用于SW480，以及HAM氏F-12培養(yǎng)基(HAM’s F-12)用于LoVo。所有培養(yǎng)基中均添加10％胎牛血清和1％抗生素/抗真菌溶液(Sigma)。
RNA制備和RT-PCR。采用Qiagen RNeasy試劑盒(Qiagen)或Trizol試劑(Life Technologies公司)，根據(jù)廠商提供的方案提取總RNA。采用多聚dT12-18引物(Amersham Pharmacia Biotech)和Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(LifeTechnologies)將總RNA的10微克等分試樣逆轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA。將各個單鏈cDNA制品稀釋以便進(jìn)行隨后的PCR擴(kuò)增，所述PCR通過標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR試驗在12μl體積的PCR緩沖液(TAKARA)中進(jìn)行。擴(kuò)增過程在GeneAmpPCR系統(tǒng)9700(Perkin-Elmer，F(xiàn)oster City，CA)中，94℃變性4分鐘，隨后94℃、30秒，60℃、30秒，和72℃、60秒進(jìn)行21個(對于GAPDH)，36個(對于ARHCL1)，32個(對于NFXL1)，32個(對于C20orf20)，40個(對于LEMD1)，30個(對于CCPUCC1，Ly6E和Nkd1)，以及28個(對于LAPTM4β)循環(huán)。引物序列為對于GAPDH正向，5’-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3’(SEQ ID NO13)和反向，5’-GGTCCACCACTGACACGTTG-3’(SEQ ID NO14)；對于ARHCL1正向，5’-TTTCTTCCTAACTGTGATCCAGAT-3’(SEQ IDNO15)和反向5’-ACAACACTTGGTAGCAGCCTT-3’(SEQ ID NO16)；對于NFXL1正向5’-CTCTAACAGACCTCTTAAATTGTG-3’(SEQ IDNO17)反向5’-CATAGACCCATAAGCCCTGTTG-3’(SEQ ID NO18)；對于C20orf20正向，5’-GTGTGCCTCTTCCACGCCAT-3’(SEQ ID NO19)和反向5’-CCTGGTCTTTCAGGTCCATCA-3’(SEQ ID NO20)；對于LEMD1正向，5’-TGTGGTGTTTGTCTACCTGACTG-3’(SEQ ID NO21)和反向5’-ACCATCATGCTCTTAACACAGGT-3’(SEQ ID NO22)；對于CCPUCC1正向，5’-GAGTGGAAGTAACGATGACTC-3’(SEQ IDNO23)和反向5’-GTCATTGTCACTCTCATCCAG-3’(SEQ ID NO24)；對于Ly6E正向5’-GAAGATCTTCTTGCCAGTG-3’(SEQ ID NO25)和反向5’-GCAGCAGGCTCAGCTGC-3’(SEQ ID NO26)；對于Nkd1正向，5’-CTTGTTGATGTGGGTCACACG-3’(SEQ ID NO27)和反向5’-TGTGGAGCTTAGGGAGGCAG-3’(SEQ ID NO28)，LAPTM4β正向，5’-CTATGGCTACTTACGGAGCG-3’(SEQ ID NO29)和反向5’-TCCTTGGCAGCACCATTCAC-3’(SEQ ID NO30)。
Northern印跡分析。將人多組織印跡(Clontech，Palo Alto，CA)與ARHCL1、NFXL1、C20orf20、LEMD1、Nkd1或LAPTM4β的32P標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交。根據(jù)供應(yīng)商推薦的方法實施預(yù)雜交，雜交和洗滌。在-80℃用增感屏(intensifying screen)對印跡進(jìn)行放射自顯影24-72小時。
構(gòu)建表達(dá)ARHCL1、NFXL1、C20orf20、LEMD1、CCPUCC1、Ly6E、Nkd1，或LAPTM4β的質(zhì)粒。采用下列基因特異性引物組，通過RT-PCR擴(kuò)增ARHCL1、NFXL1、C20orf20、LEMD1、CCPUCC1、Ly6E、Nkd1，或LAPTM4β的完整編碼區(qū)對于ARHCL1使用5’-GGCGAATTCGTAATATGCTCACTCGAGTG-3’(SEQ ID NO31)，5’-CCAGGATCCTGACAGCTTGTTTCCA-3’(SEQ ID NO32)和5’-TCTCCGGCCGCTTTCATGACAGCTTG-3’(SEQ ID NO33)，對于NFXL1使用5’-TGCGAATTCGGGATGGAAGCTTCCT-3’(SEQ IDNO34)，5’-GATAATTCTTTTTTTAATTGACATC-3’(SEQ ID NO35)，和5’-CTTGTACCATTGACATCATGGGTGAT-3’(SEQ ID NO36)；對于C20orf20使用5’-TGTGAATTCGCCATGGGAGAGGC-3’(SEQ IDNO37)，5’-TAACTCGAGCGTGCGGCGCCGCTT-3’(SEQ ID NO38)，和5’-TAAGGATCCCGTGCGGCGCCGCTT-3’(SEQ ID NO39)，對于LEMD1使用，5’-TCTGAATTCAGAAAAGAGGCCAAACTTCTATC-3’(SEQ ID NO40)和5’-TCCGATATCAGGTAGACAAACACCACAATGATG-3’(SEQ IDNO41)；對于CCPUCC1使用，5’-GAGGAATTCCGACCCTGGGCTCCTGGGGAC-3’(SEQ ID NO42)，和5’-AAGCTCGAGAAGTCATTGTCACTCTCATCCAG-3’(SEQ IDNO43)；對于Ly6E使用5’-ACGGAATTCCTCTCCAGAATGAAGATCTTC-3’(SEQ ID NO44)，和5’-TCTCTCGAGTCAGGGGCCAAACCGCAGC-3’(SEQ ID NO45)；對于Nkd1使用，5’-CGGCTCGAGCGCATGGCTTAGGGACGCTC-3’(SEQ ID NO46)和5’-TGGGGATCCGCTCTATGTCTGGTAGAAGTG-3’(SEQ ID NO47)；對于LAPTM4β使用，5’-CTGAATTCGGAGCGATGAAGATGGTCGC-3’(SEQ ID NO48)，和5’-AAGCTCGAGGCAGACACGTAAGGTGGCG-3’(SEQ ID NO49)。
將PCR產(chǎn)物克隆至pcDNA3.1(Invitrogen)、pFLAG-CMV-5(Sigma)或pcDNA3.1myc/His(Invitrogen)載體的適宜克隆位點。
免疫印跡。pcDNA3.1myc/His-ARHCL1、pFLAG-ARHCL1、pcDNA3.1myc/His-C20orf20、pFLAG-C20orf20、pcDNA3.1myc/His-CCPUCC1、pcDNA3.1myc/His-Ly6E，pcDNA3.1myc/His-LAPTM4β或pFLAG-LAPTM4β轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用PBS洗滌兩次，然后在裂解緩沖液(150mM NaCl，1％Triton X-100，50mM Tris-HCl pH7.4，1mM DTT，和1×完全蛋白酶抑制劑Cocktail(Boehringer))中進(jìn)行收集。將細(xì)胞均質(zhì)化并以10,000×g離心30分鐘后，通過Bradford測定(Bio-Rad)對上清進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)化。采用10％SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，用小鼠抗myc(SANTA CRUZ)，或抗Flag(SIGMA)抗體進(jìn)行免疫印跡。HRP綴合的山羊抗小鼠IgG(Amersham)用作ECL Detection System(Amersham)的第二抗體。
免疫組織化學(xué)染色。pcDNA3.1myc/His-ARHCL1、pFLAG-ARHCL1、pcDNA3.1myc/His-C20orf20、pFLAG-C20orf20、pcDNA3.1myc/His-CCPUCC1、pcDNA3.1myc/His-Ly6E、pcDNA3.1myc/His-LAPTM4β或pFLAG-LAPTM4β轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，及pFlag-ARHCL1和pCMV-HA-Zyxin，或pCMV-HA-NFXL1轉(zhuǎn)染的HCT16，SW480和COS7細(xì)胞以及pcDNA-myc-CCPUCC1和pFlag-叢生蛋白轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞用包含4％的低聚甲醛的PBS固定15分鐘，然后在室溫，用包含0.1％Triton X-100的PBS處理2.5分鐘使其具有可透過性。隨后，4℃，用PBS中的2或3％BSA覆蓋(cover)細(xì)胞12-24小時以阻斷非特異性雜交。將1∶1000稀釋度的大鼠抗HA單克隆抗體(Roche)，1∶1000稀釋度的兔抗FLAG抗體(Sigma)，1∶1000稀釋度的小鼠抗myc單克隆抗體(Sigma)或1∶2000稀釋度的小鼠抗FLAG抗體(Sigma)用作第一抗體，在與FITC偶聯(lián)的抗小鼠和熒光素偶聯(lián)的抗小鼠IgG第二抗體(Leinco和ICN)一起保溫后，顯示該反應(yīng)。細(xì)胞核用4′，6′二脒基-2′-苯吲哚二鹽酸鹽(phenylindoledihydrochloride)(DAPI)復(fù)染。在ECLIPSE E800顯微鏡下得到熒光圖像。
反義(anti-sense)寡核苷酸對細(xì)胞生長的影響。采用LIPOFECTIN試劑(GIBCO BRL)，用質(zhì)?；駻RHCL1、NFXL1、C20orf20、LEMD1、CCPUCC1、Ly6E、Nkd1或LAPTM4β的合成S-寡核苷酸對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將所述細(xì)胞鋪于10厘米皿(2×105細(xì)胞/皿)上，然后培養(yǎng)3-7日。然后用100％甲醇固定所述細(xì)胞，并用姬姆薩溶液進(jìn)行染色。S-寡核苷酸的序列如下ARHCL1-AS1，5’-GTGAGCATATTACTCC-3’(SEQ ID NO50)；ARHCL1-R1，5’-CCTCATTATACGAGTG-3’(SEQ ID NO51)；NFXL1-AS，5’-GGCCAGGGACAATCTTTC-3’(SEQ ID NO52)；NFXL1-R，5’-CTTTCTAACAGGGACCGG-3’(SEQ ID NO53)；C20orf20-AS1，5’-GCCCACCTCGGCCTCTCC-3’(SEQ ID NO54)；C20orf20-R1，5’-CCTCTCCGGCTCCACCCG-3’(SEQ ID NO55)；C20orf20-AS2，5’-CACCTCGGCCTCTCCCAT-3’(SEQ ID NO56)；C20orf20-R2，5’-TACCCTCTCCGGCTCCAC-3’(SEQ ID NO57)；
LEMD1-AS1，5’-ATCCACCATGATGATAGA-3’(SEQ ID NO58)；LEMD1-REV1，5’-AGATAGTAGTACCACCTA-3’(SEQ ID NO59)；LEMD1-AS2，5’-ACACTTCACATCCACCAT-3’(SEQ ID NO60)；LEMD1-REV2，5’-TACCACCTACACTTCACA-3’(SEQ ID NO61)；LEMD1-AS3，5’-CAGACACTTCACATCCAC-3’(SEQ ID NO62)；LEMD1-REV3，5’-CACCTACACTTCACAGAC-3’(SEQ ID NO63)；LEMD1-AS4，5’-CATGATGATAGAAGTTTG-3’(SEQ ID NO64)；和LEMD1-REV4，5’-GTTTGAAGATAGTAGTAC-3’(SEQ ID NO65)；LEMD1-AS5，5’-ACATCCACCATGATGATA-3’(SEQ ID NO66)；和LEMD1-REV5，5’-ATAGTAGTACCACCTACA-3’(SEQ ID NO67)；CCPUCC1-AS3，5’-CGGAGGTCGCGGAAAG-3’(SEQ ID NO68)；CCPUCC1-S3，5’-CTTTCCGCGACCTCCG-3’(SEQ ID NO69)；Ly6E-AS1，5’-ATCTTCATTCTGGAGA-3’(SEQ ID NO70)；Ly6E-S1，5’-TCTCCAGAATGAAGAT-3’(SEQ ID NO71)，Ly6E-AS5，5’-GAAGATCTTCATTCTG-3’(SEQ ID NO72)；Ly6E-S5，5’-CAGAATGAAGATCTTC-3’(SEQ ID NO73)，Nkd1-AS4，5’-GCGGCCGGCTTGGAGT-3’(SEQ ID NO74)；Nkd1-S4，5’-ACTCCAAGCCGGCCGC-3’(SEQ ID NO75)；Nkd1-AS5，5’-GTAGAAGTGGTGGTAA-3’(SEQ ID NO76)；Nkd1-S5，5’-TTACCACCACTTCTAC-3’(SEQ ID NO77)；LAPTM4β-S，5’-GTGAGCGCGGCGCGCC-3’(SEQ ID NO78)；LAPTM4β-AS，5’-GGCGCGCCGCGCTCAC-3’(SEQ ID NO79)；LAPTM4β-SCR，5’-GCGCGGCCGCGCTCAC-3’(SEQ ID NO80)；LAPTM4β-REV，5’-CACTCGCGCCGCGCGG-3’(SEQ ID NO81)。
溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-聯(lián)苯四唑(3-(4，5-dimethythiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide)(MTT)試驗。用反義或參照(有義、反轉(zhuǎn)和混合)S-寡核苷酸轉(zhuǎn)染一式三份的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染72小時后，用包含500μg/ml MTT(溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-聯(lián)苯四唑)(Sigma)的新鮮培養(yǎng)基置換培養(yǎng)基，然后將該板在37℃保溫4小時。隨后，加入1ml 0.01N HCl/10％SDS將細(xì)胞溶解，然后用ELISA讀板器檢測溶胞產(chǎn)物在570nm檢測波長(參照，630nm)的吸光度。細(xì)胞的存活力通過將所得吸光度與對照細(xì)胞的吸光度進(jìn)行比較來表示。
制備重組ARHCL1和NFXL1蛋白質(zhì)。為了生成針對ARHCL1或NFXL1的特異性抗體，我們制備了重組ARHCL1和NFXL1蛋白質(zhì)。其部分編碼序列通過RT-PCR采用如下引物組進(jìn)行擴(kuò)增用于ARHCL1的N末端區(qū)(ARHCL1-N)5’-GGCGAATTCGTAATATGCTCACTCGAGTGAAAT-3’(SEQ ID NO82)和5’-GTTGAATTCCGTGTTCTCAGGCT-3’(SEQ ID NO83)，用于ARHCL1的C末端區(qū)(ARHCL1-C)5’-GCGGAATTCCTGCTGCAGCACCACAT-3’(SEQID NO84)和5’-ACAGCGGCCGCTTTCATGACAGCTTG-3’(SEQ ID NO85)，用于NFXL1的N末端區(qū)(NFXL1-N)5’-ACAGAATTCGGGATGGAAGCTTC-3’(SEQ ID NO86)和5’-ATACTCGAGAGGAGGTTTAAATTCACGCTC-3’(SEQ ID NO87)，而用于NFXL1的C末端區(qū)(NFXL1-C2)5’-CACGAATTCAAGGTAAAACTTAGATGTCCT-3’(SEQ ID NO88)和5’-GAGCTCGAGTTTATGTTTTTGCCATAGTGATAG-3’(SEQ ID NO89)。純化所述產(chǎn)物，用EcoRl(ARHCL1-N)，EcoRl和NotI(ARHCL1-C)，或EcoRl和Xhol(NFXL1-N和NFXL1-C2)進(jìn)行消化，然后克隆至pGEX6P-1(pGEX-ARHCL1-N或pGEX-ARHCL1-C)或pET28a(pET-NFXL1-N或pET-NFXL1-C2)載體適宜的克隆位點。將質(zhì)粒pGEX-ARHCL1-N，pGEX-ARHCL1-C，pET-NFXL1-N，或pET-NFXL1-C2轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10B(Life Technologies，Inc.)或BL21密碼子+(codon plus)(Novagen)細(xì)胞中。通過加入IPTG來誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)，然后根據(jù)廠商提供的步驟從提取物中進(jìn)行純化。
酵母雙雜交試驗。采用MATCHMAKER GAL4雙雜交系統(tǒng)(BDBioscience)，按照廠商提供的步驟實施酵母雙雜交測定。我們將ARHCL1或NFXL1的部分編碼序列克隆至pAS2-1載體的EcoRl-Xhol位點(pAS2-ARHCL1-N，-ARHCL1-C，-NFXL1-N，和-NFXL1-C2)。我們還采用下列引物組5’-TGTGAATTCGCCATGGGAGAGGC-3’(SEQ ID NO90)和5’-TAAGGATCCCGTGCGGCGCCGCTT-3’(SEQ ID NO91)，以pcDNA3.1-C20orf20作為模板，通過PCR擴(kuò)增了C20orf20的完整編碼區(qū)，然后產(chǎn)物克隆至pAS2-1載體(pAS2-C20orf20)的EcoRI-BamHI位點。我們還將CCPUCC1的完整編碼序列克隆至pAS2-1載體(pAS2-CCPUCC1)的EcoRI位點。我們用pAS2-ARHCL1-N、pAS2-ARHCL1-C、pAS2-NFXL1-N、或pAS2-NFXL1-C2做餌(bait)從人睪丸MATCHMAKER cDNA文庫中篩選出5×105個克隆，以pAS2-C20orf20做餌從文庫中篩選出1.9×106個克隆，而以pAS2-CCPUCC1做餌從文庫中篩選出1.1×106個克隆(BD Bioscience)。
免疫沉淀測定。通過RT-PCR，采用一組引物5’-CATGAATTCCGGCCATGGCG-3’(SEQ ID NO92)和5’-CATCTCGAGTCAGGTCTGGGCTC-3’(SEQ ID NO93)來擴(kuò)增Zyxin的全部編碼區(qū)。純化PCR產(chǎn)物，用EcoRl和Xhol消化，然后克隆至pCMV-HA載體中。將MGC10334或CEMPC1的完整編碼區(qū)以及BRD8的C末端區(qū)從cDNA文庫中分離的陽性克隆亞克隆至pCMV-HA載體(pCMV-HA-MGC10334，pCMV-HA-CEMPC1，和pCMV-HA-BRD8)中。將來自分離的陽性克隆的核叢生蛋白的C末端區(qū)亞克隆至pFlag載體。我們用pFlag-CMV，pFlag-ARHCL1，pCMV-HA，pCMV-HA-Zyxin或其組合轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，用pFlag-CMV，pFlag-NFXL1，pCMV-HA，pCMV-HA-MGC10334，pCMV-HA-CEMPC1或其組合轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，用pFlag-CMV，pFlag-C20orf20，pCMV-HA，pCMV-HA-BRD8或其組合轉(zhuǎn)染COST細(xì)胞，用pcDNA-myc，表達(dá)myc標(biāo)記的(tagged)CCPUCC1的pcDNA-CCPUCC1-myc，pFlag-CMV，pFlag-叢生蛋白，或其組合轉(zhuǎn)染COST細(xì)胞。細(xì)胞用PBS洗滌，然后在包含150mM NaCl，0.5％NP-40，10mMTris-HCl pH7.8，和無EDTA的1×完全蛋白酶抑制劑Cocktail(Roche)的TNE緩沖液中裂解。在通常的免疫沉淀反應(yīng)中，300μg完全細(xì)胞提取物與1μg抗FLAG M2(SIGMA)或抗HA抗體，20μl蛋白質(zhì)G瓊脂糖(Sepharose)珠(Zymed)于4℃保溫2小時。將所述珠在1ml TNE緩沖液中洗滌四次，然后通過在Laemmli Sample Buffer中煮沸來洗脫與該珠結(jié)合的蛋白質(zhì)。通過SDS-PAGE分離沉淀的蛋白質(zhì)，然后用抗myc抗體、抗-HA抗體或兔抗FLAG抗體實施免疫印跡分析。
表達(dá)NFXL1-siRNA，C20orf20-siRNA，和CCPUCC1-siRNA的質(zhì)粒的構(gòu)建及其效果。為了制備表達(dá)短干擾RNA(siRNA)的質(zhì)粒載體，我們采用引物組，并以人胎盤DNA作為引物，通過PCR擴(kuò)增H1RNA或U6snRNA基因的包含其啟動子區(qū)的基因組片段，所述引物組為對于H1RNA，5’-TGGTAGCCAAGTGCAGGTTATA-3’(SEQ ID NO94)和5’-CCAAAGGGTTTCTGCAGTTTCA-3’(SEQ ID NO95)，對于U6snRNA，5’-GGGGATCAGCGTTTGAGTAA-3’(SEQ ID NO96)和5’-TAGGCCCCACCTCCTTCTAT-3’(SEQ ID NO97)。純化產(chǎn)物，然后采用TA克隆試劑盒(Invitrogen)，根據(jù)廠商提供的方案將其克隆至pCR2.0質(zhì)粒載體中。將包含H1RNA或U6snRNA的BamHI和XhoI片段置于pcDNA3.1(+)中的核苷酸56和1257之間，所述片段已用5’-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3’(SEQ ID NO98)和5’-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3’(SEQ ID NO99)通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。連接的DNA成為PCR擴(kuò)增的模板，所述PCR擴(kuò)增使用如下引物對于H1RNA為5’-TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAC-3’(SEQ ID NO100)和5’-TTTAAGCTTGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3’(SEQ ID NO101)，或?qū)τ赨6snRNA5’-TTTAAGCTTGAAGACTATTTTTACATCAGGTTGTTTTTCT-3’(SEQ ID NO102)和5’-TTTAAGCTTGAAGACACGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3’(SEQ ID NO103)。用HindIII消化產(chǎn)物，然后自我連接(self ligate)從而生成psiH1BX3.0或psiU6BX3.0載體質(zhì)粒。參照質(zhì)粒，psiH1BX-EGFP和psiU6BX-EGFP通過將5’-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO104)和5’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO105)的雙鏈寡核苷酸分別克隆至psiH1BX3.0或psiU6BX載體中的BbsI位點來制備。通過將雙鏈寡核苷酸克隆至psiU6BX3.0載體中制備表達(dá)NFXL1-siRNA的質(zhì)粒。用于NFXL1-siRNA的寡核苷酸是對于psiU6BX-NFXL1D，使用5’-CACCAGAAAGATTGTCCCTGGCCTTCAAGAGAGGCCAGGGACAATCTTTCT-3’(SEQ ID NO106)和5’-AAAAAGAAAGATTGTCCCTGGCCTCTCTTGAAGGCCAGGGACAATCTTTCT-3’(SEQ IDNO107)(siRNA的靶序列是SEQ ID NO122)；對于psiU6BX-NFXL1E，使用5’-CACCGGAGATGAAGATTTTGAAGTTCAAGAGACTTCAAAATCTTCATCTCC-3’(SEQ ID NO108)和5’-AAAAGGAGATGAAGATTTTGAAGTCTCTTGAACTTCAAAATCTTCATCTCC-3’(SEQ ID NO109)(使用siRNA的靶序列是SEQ IDNO123)；對于psiU6BX-NFXL1F，使用5’-CACCGAAGAACAGGAAAAGAGATTTCAAGAGAATCTCTTTTCCTGTTCTTC-3’(SEQ ID NO110)和5’-AAAAGAAGAACAGGAAAAGAGATTCTCTTGAAATCTCTTTTCCTGTTCTTC-3’(SEQ ID NO111)(siRNA的靶序列是SEQ ID NO124)，和對于psiU6BX-NFXL1G，使用5’-CACCCCAGAAGGTAAAACTTAGATTCAAGAGATCTAAGTTTTACCTTCTGG-3’(SEQ ID NO112)和5’-AAAACCAGAAGGTAAAACTTAGATCTCTTGAATCTAAGTTTTACCTTCTGG-3’(SEQ ID NO113)(所述siRNA的靶序列是SEQ IDNO125)，和對于psiU6BX-NFXL1H，使用5’-CACCGTATGTGAGCGTGAATTTATTCAAGAGATAAATTCACGCTCACATAC-3’(SEQ ID NO114)和5’-AAAAGTATGTGAGCGTGAATTTATCTCTTGAATAAATTCACGCTCACATAC-3’(SEQ IDNO115)(siRNA的靶序列是SEQ ID NO126)。
通過將雙鏈寡核苷酸克隆至psiH1BX3.0載體中來制備表達(dá)C20orf20-siRNA的質(zhì)粒。用于C20orf20-siRNA的寡核苷酸是5’-TCCCCCGACACTTCCACATGATTTTCAAGAGAAATCATGTGGAAGTGTCGG-3’(SEQ ID NO116)和5’-AAAACCGACACTTCCACATGATTTCTCTTGAAAATCATGTGGAAGTGTCGG-3’(SEQ IDNO117)(psiH1BX-C20orf20，(siRNA的靶序列是SEQ ID NO127)。
通過將雙鏈寡核苷酸克隆至psiU6BX3.0載體來制備表達(dá)CCPUCC1-siRNAs的質(zhì)粒。用于CCPUCC1-siRNA的寡核苷酸是對于siRNA-2，使用5’-TCCCGCGACTAGAGACTCTGCAGTTCAAGAGACTGCAGAGTCTCTAGTCGC-3’(SEQ ID NO118)和5’-TTTTGCGACTAGAGACTCTGCAGTCTCTTGAACTGCAGAGTCTCTAGTCGC-3’(SEQID NO119)(siRNA的靶序列是SEQ ID NO128)；
對于siRNA-3，使用5’-TCCCGACCATCATAGGATGGAGCTTCAAGAGAGCTCCATCCTATGATGGTC-3’(SEQ ID NO120)和5’-TTTTGACCATCATAGGATGGAGCTCTCTTGAAGCTCCATCCTATGATGGTC-3’(SEQ IDNO121)(siRNA的靶序列是SEQ ID NO129)。
采用FuGENE6試劑(Roche)或Nucleofector試劑(Alexa)，按照供應(yīng)商推薦的方法，將質(zhì)粒psiU6BX-NFXL1、psiU6BX-EGFP、psiH1BX-C20orf20、psiH1BX-EGFP或psiH1BX-模擬轉(zhuǎn)染至SNU-C4細(xì)胞中，并將psiU6BX-CCPUCC1-2、psiU6BX-CCPUCC1-3，或psiU6BX-模擬質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HCT116和SNUC4細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后48小時，從細(xì)胞中提取總RNA。將細(xì)胞在400-800μg/ml遺傳霉素(genetiein)(G418)存在下培養(yǎng)14日，然后如其它部分所述用姬姆薩氏溶液(MERCK，德國)染色。
制備CCPUCC1的多克隆抗體。在大腸桿菌中制備重組標(biāo)記的CCPUCC1蛋白質(zhì)，然后采用Pro BondTM組氨酸樹脂，按照廠商推薦的方法(Invitrogen)將所述蛋白質(zhì)從細(xì)胞中純化。用所述重組蛋白質(zhì)接種兔以進(jìn)行免疫。從血清中純化抗CCPUCC1的多克隆抗體。將用pcDNA-myc-CCPUCC1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的提取物和來自結(jié)腸癌細(xì)胞系的提取物通過10％SDS-PAGE進(jìn)行分離并用所述抗體進(jìn)行免疫印跡。將HRP偶聯(lián)的山羊抗兔IgG(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)用作ECL檢測系統(tǒng)的(Amersham PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)的第二抗體。采用抗CCPUCC1抗體進(jìn)行的免疫印跡顯示myc標(biāo)記的CCPUCC1的55kD條帶，其與用抗myc抗體檢測到的圖譜相同。
免疫組織化學(xué)。采用抗CCPUCC1抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。根據(jù)廠商推薦的方法，用SAB-PO過氧化物酶免疫染色系統(tǒng)(Nichirei，Tokyo，日本)處理石蠟包埋的組織切片。通過將所述載片在枸櫞酸鹽緩沖液中于微波爐內(nèi)以700W預(yù)加熱10分鐘，從脫石蠟的和再水合的組織中收集抗原。
統(tǒng)計分析。對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(ANOVA)和Scheffé’s F檢驗。
實施例2鑒定與結(jié)腸癌或胃癌相關(guān)聯(lián)的基因采用包含23040個基因的cDNA微陣列對11個結(jié)腸癌組織和其相應(yīng)結(jié)腸非癌性粘膜組織的表達(dá)分布圖進(jìn)行分析。該分析可鑒別大量基因表達(dá)水平，所述基因表達(dá)水平在癌組織中與在相應(yīng)非癌性組織中相比通常是升高的。其中，在通過選擇基準(zhǔn)的所有七個病例中，與EST(KIAA1157)、UniGene群中的Hs.21894(http//www.ncbi.blm.noh.gov/UniGene)對應(yīng)、內(nèi)部登錄號為B6647的基因在癌組織中與在相應(yīng)非癌性粘膜中相比，在2.60-8.03的上升率范圍內(nèi)上調(diào)(圖1a)。在通過選擇基準(zhǔn)(cut-off filter)的所有四個病例中，與EST(IMAGE4286524)，UniGene群中的Hs.351839對應(yīng)、內(nèi)部登錄號為D7610的第二新基因在癌組織中的表達(dá)水平與在相應(yīng)非癌性粘膜中相比，在1.25-2.44的上升率范圍內(nèi)上升(圖1b)。通過選擇基準(zhǔn)的十個病例中的九個當(dāng)中，與推定的ORF、UniGene群中的Hs.143954對應(yīng)的內(nèi)部登錄號為C4821的第三新基因在癌組織中與在相應(yīng)非癌性粘膜中相比，在1.31-3.83的上升率范圍內(nèi)上調(diào)(圖1c)。通過選擇基準(zhǔn)的三個病例中的兩個當(dāng)中，與EST、XM_050184對應(yīng)、內(nèi)部登錄號為A8108的第四新基因在癌組織中與在相應(yīng)非癌性粘膜中相比，在1.19-5.90的上升率范圍內(nèi)上調(diào)(圖1d)。此外，在通過選擇基準(zhǔn)的所有七個病例中，與ETS、UniGene群中的Hs.155995對應(yīng)。內(nèi)部登錄號為B9223的第五新基因在癌組織中與其相應(yīng)非癌性粘膜相比，在1.49-3.5的上升率范圍內(nèi)上調(diào)(圖1e)。在通過選擇基準(zhǔn)的單個病例中，與Ly6E對應(yīng)、內(nèi)部登錄號為C3703的命名過的基因在癌組織中的表達(dá)水平與在相應(yīng)非癌性粘膜中相比，以2.6的上升率升高(圖1f)，而在通過選擇基準(zhǔn)的四個病例的兩個中，與Nkd1對應(yīng)、內(nèi)部登錄號為D9092的另一經(jīng)過命名的基因在癌組織中的表達(dá)水平與在相應(yīng)非癌性粘膜中相比在1.24-2.63的上升率范圍內(nèi)升高(圖1g)。為說明微陣列的結(jié)果，實施了半定量RT-PCR，其揭示了B6647在另外20個結(jié)腸癌的19個中的表達(dá)與相應(yīng)正常粘膜相比升高(圖2a)，20個腫瘤的12個中D7610的表達(dá)升高(圖2b)，在20個腫瘤的15個中C4821的表達(dá)升高(圖.2c)，而在所有8個檢測的腫瘤中A8108的表達(dá)增加(圖2d)，在28個檢測的腫瘤的15個腫瘤中B9223的表達(dá)增加(圖2e)，在13個檢測的腫瘤的11個中Ly6E的表達(dá)升高(圖2f)，而在所有檢測的腫瘤中Nkd1的表達(dá)均升高(圖2g)。
實施例3通過降低ARHCL1的表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長ARHCL1的鑒定，表達(dá)和結(jié)構(gòu)。采用National Center for BiotechnologyInformation中的BLAST程序(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)用B6647的序列在公共數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行的同源性檢索鑒定了EST包括XM_051093以及具有染色體帶12q13.13(GenBank登錄號NT-009711)的基因組序列。為了測定該基因的編碼序列，采用GENSCAN(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)和Gene Recognition和Assembly Internet Link(GLAIL，http//compbio.ornl.gov/Grail-1.3/)程序來預(yù)測基因組序列中的候補(bǔ)外顯子序列，并實施外顯子聯(lián)結(jié)試驗(exon-connection experiments)。結(jié)果，獲得6462個核苷酸的組裝序列，其包含編碼推定514個氨基酸蛋白質(zhì)的1535個核苷酸的開放閱讀框(GenBank登錄號AB084258)，將該基因命名為ARHCL1(Ras同源物基因家族，成員C樣1)。第一ATG與以下序列側(cè)接與在真核生物中用于啟始翻譯的共有序列一致的序列(ATTATGC)，以及上游框內(nèi)終止密碼子(in-frame stop codon upstream)。ARHCL1 cDNA與該基因組序列的比較顯示出該基因由11個外顯子組成。此外，以ARHCL1的PCR產(chǎn)物作為探針實施多組織northern-印跡分析，檢測到在前列腺、腦和胰中表達(dá)的6.5kb轉(zhuǎn)錄物(圖3a)。預(yù)測的ARHCL1蛋白質(zhì)的氨基酸序列顯示出與人類假定(hypothetical)蛋白質(zhì)DKFZp434P1514.1具有68.7％的同一性，且與小鼠RIKEN cDNA 2310008J22具有61.45％的同一性。采用簡單模塊結(jié)構(gòu)研究工具(SMART，http//smart.embl-heidelberg.de)對蛋白質(zhì)基序的研究揭示了預(yù)測的蛋白質(zhì)包含絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶，家族2C，催化區(qū)(密碼子68-506)(圖3b)。
myc-或Flag標(biāo)記的ARHCL1蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。為了研究ARHCL1蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，將表達(dá)myc標(biāo)記的ARHCL1蛋白質(zhì)(pDNAmyc/His-ARHCL1)或Flag標(biāo)記的ARHCL1蛋白質(zhì)(pFLAG-ARHCL1)的質(zhì)粒被瞬時轉(zhuǎn)染至HCT15細(xì)胞中。采用細(xì)胞提取物以及抗myc或抗Flag抗體的Western印跡分析揭示了分別與標(biāo)記的蛋白質(zhì)對應(yīng)的56-和60-KDa的條帶(圖4a)。隨后用這些抗體對細(xì)胞進(jìn)行的免疫組織化學(xué)染色表明該蛋白質(zhì)主要存在于細(xì)胞質(zhì)中(圖4b)。
目的在于降低ARHCL1表達(dá)的反義S-寡核苷酸對結(jié)腸癌細(xì)胞的生長抑制。為了檢測抑制ARHCL1是否能導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞的生長阻滯和/或細(xì)胞死亡，合成與ARHCL1相應(yīng)的五對對照及反義S-寡核苷酸，然后將其轉(zhuǎn)染至SNU-C4結(jié)腸癌細(xì)胞中，該結(jié)腸癌細(xì)胞在所檢測的11個結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)大量的ARHCL1。在這五個反義S-寡核苷酸中，ARHCL1-AS1在轉(zhuǎn)染12小時后與對照S-寡核苷酸(ARHCL1-R1)相比顯著抑制了ARHCL1的表達(dá)(圖5a)。轉(zhuǎn)染后5日，轉(zhuǎn)染了ARHCL1-AS1的存活細(xì)胞數(shù)顯著低于用ARHCL1-R1轉(zhuǎn)染的情況，這提示抑制ARHCL1降低了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長和/或存活力(圖5b)。在三個獨立試驗中得到一致的結(jié)果。在LoVo人結(jié)腸癌細(xì)胞中觀察到ARHCL1-R1的相似的生長抑制(圖5b)。
重組ARHCL1蛋白質(zhì)的制備。為了生成ARHCL1的特異性抗體，我們構(gòu)建了表達(dá)GST融合的N末端ARHCL1(ARHCL1-N)和C末端ARHCL1(ARHCL1-C)蛋白質(zhì)的質(zhì)粒(圖6A)。當(dāng)把這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌細(xì)胞中時，我們發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了重組蛋白質(zhì)，其在SDS-PAGE上表現(xiàn)出預(yù)期大小，并通過免疫印跡得到證實(圖6B)。
通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與ARHCL1相互作用的蛋白質(zhì)。為了分析ARHCL1的功能，我們采用酵母雙雜交篩選系統(tǒng)搜索了與ARHCL1相互作用的蛋白質(zhì)。在顯示可與ARHCL1的N末端區(qū)(ARHCL1-N)發(fā)生相互作用的75個陽性克隆中，有15、8、7、7和3個克隆分別是Zyxin、DTNB、MAGE-A12、PA28岷偷鞍酌柑28亞單位3。此外，在顯示可與ARHCL1的C末端區(qū)(ARHCL1-C)相互作用的52個陽性克隆中，有2個克隆是FLJ25348。用pAS2-ARHCL1-N或pAS2-ARHCL1-C同時進(jìn)行轉(zhuǎn)化，6個克隆證實了其在酵母中的相互作用(圖7)。
Zyxin與ARHCL1的N末端區(qū)在體內(nèi)的相互作用。為了證實ARHCL1和Zyxin之間在體內(nèi)的結(jié)合，我們在HeLa細(xì)胞中進(jìn)行了免疫沉淀測定(圖8A)。我們用pFlag-ARHCL1、pCMV-HA-Zyxin，或其組合來轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，然后從所述細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)。用抗Flag抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后用抗HA抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，證實了Zyxin和ARHCL1之間在體內(nèi)的相互作用。
Flag標(biāo)記的ARHCL1和HA標(biāo)記的Zyxin在細(xì)胞中的共定位。為了檢測ARHCL1和Zyxin是否在細(xì)胞中共定位，我們將pFlag-ARHCL1和pCMV-HA-Zyxin共轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞中，然后通過免疫組織化學(xué)染色檢測其亞細(xì)胞定位(圖8B)。用抗Flag抗體的染色顯示出Flag標(biāo)記的ARHCL1定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。此外，用抗FLAG和抗HA抗體的染色顯示出HA標(biāo)記的Zyxin與ARHCL1共定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中(圖8B)。該數(shù)據(jù)支持ARHCL1和Zyxin在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中相互作用的觀點。
實施例4通過降低NFXL1的表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長NFXL1的鑒定，表達(dá)，和結(jié)構(gòu)。采用National Center for BiotechnologyInformation中的BLAST程序用D7610的序列在公共數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行的同源性搜索鑒定了EST，其包含BC018019以及具有染色體帶4p12(GenBank登錄號AC107068)的基因組序列。為了測定D7610 cDNA的5’部分的序列，采用所述序列在Gene Recognition和Assembly Internet Link程序中預(yù)測候補(bǔ)外顯子序列。結(jié)果，獲得3,707個核苷酸的組裝序列，其包含編碼推定的911個氨基酸蛋白質(zhì)的2,736個核苷酸的開放閱讀框(GenBank登錄號AB085695)，將其命名為NFXL1(核轉(zhuǎn)錄因子，X-盒結(jié)合樣1)。第一ATG側(cè)接于與真核生物中用于啟始翻譯的共有序列一致的序列(GGGATGG)。NFXL1 cDNA與所述基因組序列的比較顯示出該基因由23個外顯子組成。此外，以NFXL1的PCR產(chǎn)物作為探針實施多組織northern-印跡分析，檢測到在睪丸和甲狀腺中表達(dá)的3.8kb轉(zhuǎn)錄物(圖9a)。預(yù)測的NFXL1蛋白質(zhì)的氨基酸序列顯示出與人NFX1(核轉(zhuǎn)錄因子，X-盒結(jié)合1)具有35.3％的同一性。采用簡單模塊結(jié)構(gòu)研究工具對蛋白質(zhì)基序的研究揭示了預(yù)測的蛋白質(zhì)包含環(huán)指結(jié)構(gòu)域(密碼子160-219)，12NFX型Zn-指結(jié)構(gòu)域(密碼子265-794)，卷曲螺旋區(qū)(密碼子822-873)，以及跨膜區(qū)(密碼子889-906)(圖9b)。
目的在于降低NFXL1表達(dá)的反義S-寡核苷酸對結(jié)腸癌細(xì)胞生長的抑制。為了檢測抑制NFXL1是否可導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞的生長停滯和/或細(xì)胞死亡，根據(jù)NFXL1合成四對對照及反義S-寡核苷酸，然后將其轉(zhuǎn)染至SW480和SNU-C4結(jié)腸癌細(xì)胞中，所述細(xì)胞在檢測的11個結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)大量的NFXL1。轉(zhuǎn)染后五天，用NFXL1-AS轉(zhuǎn)染的存活細(xì)胞的數(shù)量顯著低于用NFX-R轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，這提示抑制NFXL1可降低轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的生長和/或存活(圖10)。在三個獨立試驗中得到一致的結(jié)果。
表達(dá)NFXL1-siRNA的質(zhì)粒對結(jié)腸癌細(xì)胞生長的影響。最近發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物細(xì)胞中，由20或21-聚(mer)雙鏈RNA(dsRNA)與19個互補(bǔ)性核苷酸以及胸苷或尿苷3’端互補(bǔ)二聚體組成的短干擾RNA(siRNA)已經(jīng)顯示出具有基因特異性基因沉默效應(yīng)(gene silencing effect)，而不會誘導(dǎo)基因表達(dá)的總體改變。因此，我們構(gòu)建了表達(dá)多種NFXL1-siRNA的質(zhì)粒，并檢測了其對NFXL1表達(dá)的影響。其中，psiU6BX-NFXL1H而非psiU6BX-NFXL1D、psiU6BX-NFXL1E、psiU6BX-NFXL1F或psiU6BX-NFXL1G顯著抑制NFXL1在SNUC4細(xì)胞中的表達(dá)(圖11A)。為了檢測抑制NFXL1是否可以導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞的生長抑制，我們用psiU6BX-NFXL1H或psiU6BX-EGFP轉(zhuǎn)染了HCT116、SW480或SNUC4細(xì)胞。轉(zhuǎn)染了psiU6BX-NFXL1H的存活細(xì)胞與轉(zhuǎn)染了psiU6BX-EGFP的存活細(xì)胞相比顯著減少，這提示NFXL1表達(dá)的降低抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(圖11B)。
NFXL1在哺乳動物細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。為了研究NFXL1蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，在HCT116，SW480或COS7細(xì)胞中對HA標(biāo)記的NFXL1實施熒光免疫組織化學(xué)染色。細(xì)胞用pCMV-HA-NFXL1轉(zhuǎn)染，固定，用抗HA染色，并用羅丹明偶聯(lián)的第二抗體進(jìn)行顯示。在細(xì)胞質(zhì)中觀察的信號顯示出NFXL1在細(xì)胞質(zhì)中的亞細(xì)胞定位(圖12)。
制備重組NFXL1蛋白質(zhì)為了生成NFXL1特異性抗體，我們構(gòu)建了表達(dá)His標(biāo)記的N末端NFXL1(NFXL1-N)和C末端NFXL1(NFXL1-C2)蛋白質(zhì)的質(zhì)粒(圖13A)。當(dāng)把這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌細(xì)胞中時，我們發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了重組蛋白質(zhì)，其在SDS-PAGE上表現(xiàn)出預(yù)期大小，并通過免疫印跡得到證實(圖13B和13C)。
通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與NFXL1相互作用的蛋白質(zhì)。為了分析NFXL1的功能，我們采用酵母雙雜交篩選系統(tǒng)搜索與NFXL1相互作用的蛋白質(zhì)。在顯示與NFXL1的N末端區(qū)(NFXL1-N)相互作用的145個陽性克隆中，9、7、6、3和3個克隆分別是DKFZp564J047、DKFZp434A1319、MGC10334、SOX30、CENPC1和FLJ25348。此外，在顯示與NFXL1的C末端區(qū)(NFXL1-C2)相互作用的32個克隆中，8和5個克隆分別是FLJ36990和GBP2。同時用pAS2-NFXL1-N或pAS2-NFXL1-C進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這8個鑒定的克隆證實了所述蛋白質(zhì)與NFXL1在酵母中的結(jié)合(圖14A，和14B)。
鑒定MGC10334和CENPC1為與NFXL1相互作用的蛋白質(zhì)。為了證實NFXL1和MGC10334或CENPC1蛋白質(zhì)之間在體內(nèi)的結(jié)合，我們在COS7細(xì)胞中進(jìn)行了免疫沉淀測定(圖15)。我們用pFlag-NFXL1和pCMV-HA-MGC10334，pCMV-HA-CEMPC1或其組合來轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并從所述細(xì)胞提取蛋白質(zhì)。用抗Flag抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后用抗HA抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，證實了NFXL1與MGC10334或CENPC1在體內(nèi)的相互作用。
實施例5通過降低C20ORF20的表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長C20orf20的分離，構(gòu)建和表達(dá)。采用National Center for BiotechnologyInformation中的BLAST程序用C4821的序列在公共數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行的同源性搜索鑒定了EST，其包含BM922576以及具有染色體帶20q13.3(GenBank登錄號AL035669)的基因組序列。為了測定C4821 cDNA的5’部分的序列，在所述基因組序列中預(yù)測候補(bǔ)外顯子序列，并采用GENSCAN以及基因識別和組裝因特網(wǎng)鏈接(Gene Recognition and Assembly Internet Link)程序利用所述序列實施外顯子聯(lián)結(jié)。結(jié)果，獲得1,634個核苷酸的組裝序列，其包含編碼推定的204個氨基酸蛋白質(zhì)的615個核苷酸的開放閱讀框，并將其命名為C20orf20(GenBank登錄號AB085682)。將第一ATG側(cè)接于與真核生物中翻譯起始的共有序列一致的序列(GCCATGG)。C20orf20 cDNA與所述基因組序列的比較顯示出該基因由5個外顯子組成。此外，以C20orf20的PCR產(chǎn)物作為探針實施多組織northern-印跡分析，并檢測到在睪丸和甲狀腺中表達(dá)的1.8kb的轉(zhuǎn)錄物(圖16a)。預(yù)測的C20orf20蛋白質(zhì)的氨基酸序列顯示出與小鼠RIKEN cDNA 1600027N09(XM_110403)具有96.6％的同一性。采用簡單模塊結(jié)構(gòu)研究工具對蛋白質(zhì)基序進(jìn)行的搜索沒有預(yù)測出任何已知的保守區(qū)(圖16b)。
myc-或Flag標(biāo)記的C20orf20蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。為了研究C20orf20蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，將表達(dá)myc標(biāo)記的(pDNAmyc/His-C20orf20)C20orf20蛋白質(zhì)或Flag標(biāo)記的C20orf20蛋白質(zhì)(pFLAG-C20orf20)的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞中。利用細(xì)胞提取物、用抗myc抗體進(jìn)行的Western印跡分析揭示了分別與myc標(biāo)記的蛋白質(zhì)對應(yīng)的主要30-kDa和次要25-Kda的條帶，而用抗Flag抗體的所述分析揭示了與Flag標(biāo)記的蛋白質(zhì)相應(yīng)的主要28-kDa和次要23-Kda的條帶(圖17a)。這些數(shù)據(jù)提示所標(biāo)記蛋白質(zhì)可能有翻譯后的修飾。隨后用這些抗體的細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色表明標(biāo)記的蛋白質(zhì)主要存在于細(xì)胞核中(圖17b)。
目的在于降低C20orf20表達(dá)的反義S-寡核苷酸對結(jié)腸癌細(xì)胞的生長抑制。為了檢測抑制C20orf20是否能導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞的生長阻滯和/或細(xì)胞死亡，合成與C20orf20相應(yīng)的四對對照和反義S-寡核苷酸，然后將其轉(zhuǎn)染至SNU-C4結(jié)腸癌細(xì)胞中，該結(jié)腸癌細(xì)胞在所檢測的11個結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)大量的C20orf20。轉(zhuǎn)染后5日，轉(zhuǎn)染了C20orf20-A1或C20orf20-A2的存活細(xì)胞數(shù)顯著低于轉(zhuǎn)染了C20orf20-R1或C20orf20-R2的存活細(xì)胞數(shù)，這提示抑制C20orf20降低了轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的生長和/或存活力(圖18)。在三個獨立試驗中得到一致的結(jié)果。
表達(dá)C20orf20-siRNA的質(zhì)粒對結(jié)腸癌細(xì)胞生長的影響。為了研究C20orf20在癌細(xì)胞中的功能，我們構(gòu)建了表達(dá)C20orf20-siRNA的質(zhì)粒，并檢測了其對C20orf20表達(dá)的影響。psiH1BX-C20orf20，psiH1BX-EGFP或psiH1BX-模擬對SNU-C4細(xì)胞的轉(zhuǎn)染揭示出psiH1BX-C20orf20與psiH1BX-EGFP或psiH1BX-模擬相比顯著抑制C20orf20在細(xì)胞中的表達(dá)(圖19A)。為了檢測抑制C20orf20是否能導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞的生長抑制，我們用psiH1BX-C20orf20或psiH1BX-EGFP轉(zhuǎn)染HCT116和SW480細(xì)胞。轉(zhuǎn)染了psiH1BX-C20orf20的存活細(xì)胞與轉(zhuǎn)染了psiH1BX-EGFP的那些相比顯著減少，這提示C20orf20表達(dá)降低抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(圖19B)。
通過酵母雙雜交篩選鑒定與C20orf20相互作用的蛋白質(zhì)。為了闡明C20orf20的功能，我們采用酵母雙雜交篩選系統(tǒng)搜索了與C20orf20相互作用的蛋白質(zhì)。我們用表達(dá)C20orf20完整編碼區(qū)的pAS2-C20orf20作餌篩選了來自人睪丸cDNA文庫的1.9×106個克隆。通過隨后的DNA測序，發(fā)現(xiàn)在175個陽性克隆中，發(fā)現(xiàn)有32個為編碼溴結(jié)構(gòu)域含有8(BRD8)的基因。此外，BRD8克隆均包含C端588個氨基酸區(qū)域，表明負(fù)責(zé)所述結(jié)合的區(qū)位于該區(qū)域內(nèi)(圖20A)。將表達(dá)BRD8的C端區(qū)的pAS2-C20orf20和pACT2-BRD8同時轉(zhuǎn)染至酵母細(xì)胞在體外證明了C20orf20和BRD8的相互作用(圖20B)。為在體內(nèi)檢測C20orf20和BRD8的結(jié)合，我們用表達(dá)Flag標(biāo)記的C20orf20蛋白質(zhì)的質(zhì)粒(pFlag-C20orf20)單獨或與表達(dá)HA標(biāo)記的C端BRD8蛋白質(zhì)的那些質(zhì)粒(pCMV-HA-BRD8)一起轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，并實施例免疫沉淀試驗。采用抗FLAG抗體的免疫沉淀和隨后采用抗HA抗體的western印跡分析檢測到與Flag標(biāo)記的C20orf20相應(yīng)的單個條帶，這在體內(nèi)確證了C20orf20和BRD8之間的相互作用(圖20C)。
實施例6通過降低CCPUCC1的表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長CCPUCC1的鑒定，表達(dá)和結(jié)構(gòu)。采用National Center for BiotechnologyInformation中的BLAST程序利用B9223的序列在公共數(shù)據(jù)庫中實施的同源性檢索鑒定了新人類基因(該基因已被注釋為與KIAA0643蛋白質(zhì)、克隆MGC9638(GenBank登錄號BC017070)相似)，以及具有染色體帶16p12(GenBank登錄號NT_010552.9)的基因組序列。為了測定該基因的編碼序列，采用GENSCAN和基因識別和組裝互聯(lián)網(wǎng)鏈接在該基因組序列中預(yù)測候補(bǔ)外顯子序列，并實施外顯子聯(lián)結(jié)試驗。結(jié)果獲得1681個核苷酸的組裝序列，其包含編碼推定413個氨基酸蛋白質(zhì)的1239個核苷酸的開放閱讀框。第一ATG與以下序列側(cè)接與真核生物中翻譯起始的共有序列一致的序列(GTTATGT)以及上游的框內(nèi)終止密碼子。cDNA與該基因組序列的比較顯示出該基因由11個外顯子組成。預(yù)測的蛋白質(zhì)的氨基酸序列顯示出與小鼠RIKEN cDNA 2610111M03(AK011846)89％的同一性。由于采用簡單模塊結(jié)構(gòu)研究工具對蛋白質(zhì)基序的搜索揭示了預(yù)測的蛋白質(zhì)包含卷曲螺旋區(qū)(密碼子195-267)，我們將該基因命名為CCPUCC1(在結(jié)腸癌中上調(diào)的卷曲螺旋蛋白質(zhì))。
myc標(biāo)記的CCPUCC1蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。為了研究CCPUCC1蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，將表達(dá)myc標(biāo)記的(pDNAmyc/His-CCPUCC1)CCPUCC1蛋白質(zhì)的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞中。采用細(xì)胞提取物和抗myc抗體的Western印跡分析顯示了與標(biāo)記的蛋白質(zhì)相對應(yīng)的60-KDa條帶(圖21a)。隨后用所述抗體對細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，表明該蛋白質(zhì)主要存在于細(xì)胞質(zhì)中(圖21b)。
目的在于降低CCPUCC1表達(dá)的反義S-寡核苷酸對結(jié)腸癌細(xì)胞的生長抑制。為了檢測抑制CCPUCC1是否能夠?qū)е陆Y(jié)腸癌細(xì)胞的生長阻滯和/或細(xì)胞死亡，合成與CCPUCC1相應(yīng)的五對對照和反義S-寡核苷酸，然后將其轉(zhuǎn)染至LoVo結(jié)腸癌細(xì)胞中，該結(jié)腸癌細(xì)胞在所檢測的11個結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)大量的CCPUCC1。在所述五種反義S-寡核苷酸中，轉(zhuǎn)染12小時后，CCPUCC1-AS3與對照S-寡核苷酸(CCPUCC1-S3)相比顯著抑制了CCPUCC1的表達(dá)(圖22a)。轉(zhuǎn)染后5日，轉(zhuǎn)染了CCPUCC1-AS3的存活細(xì)胞數(shù)量顯著低于轉(zhuǎn)染了CCPUCC1-S3的存活細(xì)胞數(shù)，這提示抑制CCPUCC1降低了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長和/或存活力(圖22b)。在三個獨立試驗中得到一致的結(jié)果。在SW480人結(jié)腸癌細(xì)胞中觀察到相似的CCPUCC1-AS3的生長抑制。我們還采用LoVo細(xì)胞以CCPUCC1-AS3或CCPUCC1-S3實施了MTT試驗，其證實了相對于CCPUCC1-S3，對CCPUCC1-AS3的響應(yīng)降低了細(xì)胞生存力(圖22c)。
表達(dá)CCPUCC1-siRNA的質(zhì)粒對結(jié)腸癌細(xì)胞生長的影響。為了研究CCPUCC1在癌細(xì)胞中的功能，我們構(gòu)建了表達(dá)CCPUCC1-siRNA的質(zhì)粒并檢測了其對CCPUCC1表達(dá)的影響。與psiU6BX-CCPUCC1-2或psiU6BX-模擬相比，用psiU6BX-CCPUCC1-2，psiU6BX-CCPUCC1-3或psiU6BX-模擬轉(zhuǎn)染SNU-C4或HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞的顯示了psiU6BX-CCPUCC1-3顯著抑制CCPUCC1在細(xì)胞中的表達(dá)(圖23A，24A)。為了檢測抑制CCPUCC1是否可導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞的生長抑制，我們用psiU6BX-CCPUCC1-3或psiU6BX-模擬轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞。轉(zhuǎn)染了psiU6BX-CCPUCC1-3的存活細(xì)胞數(shù)與轉(zhuǎn)染了psiU6BX-CCPUCC1-2的相比顯著減少，這提示CCPUCC1表達(dá)的降低抑制SNU-C4細(xì)胞的生長(圖23B)以及HCT116細(xì)胞的生長(圖24B)。
CCPUCC1在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)。為了檢測CCPUCC1的表達(dá)并研究其功能，我們制備了抗CCPUCC1的多克隆抗體。采用結(jié)腸癌細(xì)胞(包括HCT116，SNUC4，和SW480)的全部提取物的Western印跡分析顯示出與CCPUCC1對應(yīng)的53kDa條帶(圖25)。內(nèi)源CCPUCC1蛋白質(zhì)的大小與用抗myc抗體檢測的myc標(biāo)記的CCPUCC1的大小非常相似(圖25)。
CCPUCC1在結(jié)腸癌細(xì)胞和組織中的亞細(xì)胞定位。為了研究其亞細(xì)胞定位，在HCT116細(xì)胞中實施CCPUCC1的熒光免疫組織化學(xué)染色。細(xì)胞用抗CCPUCC1染色并用與第二抗體偶聯(lián)的熒光素顯示。信號主要在細(xì)胞核中觀察到(圖26)。
CCPUCC1在結(jié)腸的正常上皮，腺癌和腺瘤中的表達(dá)。為了比較CCPUCC1蛋白質(zhì)在非癌性上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的表達(dá)水平，對石蠟包埋的臨床組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。癌細(xì)胞用抗CCPUCC1抗體的染色比非癌性上皮細(xì)胞強(qiáng)(圖27A)。我們還研究了其在腺瘤中的表達(dá)，顯示在腺瘤細(xì)胞中為弱信號(圖27B)。
通過酵母雙雜交篩選系統(tǒng)鑒定與CCPUCC1相互作用的蛋白質(zhì)。為了闡明CCPUCC1的致癌機(jī)理，我們采用酵母雙雜交篩選系統(tǒng)研究了與CCPUCC1相互作用的蛋白質(zhì)。在鑒定的陽性克隆中，核叢生蛋白(nCLU)的C端區(qū)通過在酵母細(xì)胞中同時采用pAS2-CCPUCC1和pACT2-叢生蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)化(圖28A)而與CCPUCC1發(fā)生相互作用。陽性克隆包含密碼子252-449，這表明nCLU中負(fù)責(zé)相互作用的區(qū)域位于該區(qū)內(nèi)。
為了證實CCPUCC1和nCLU在體內(nèi)的結(jié)合，我們用表達(dá)myc標(biāo)記的CCPUCC1的質(zhì)粒(pcDNA-CCPUCC1-myc)單獨或與表達(dá)FLAG標(biāo)記的C端nCLU的質(zhì)粒(pFlag-叢生蛋白)一起用轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，并實施免疫沉淀試驗。采用抗FLAG抗體的免疫沉淀和采用抗myc抗體的western印跡顯示了與CCPUCC1對應(yīng)的單個條帶，而采用抗myc抗體的免疫沉淀和采用抗FLAG抗體的western印跡顯示了與nCLU對應(yīng)的條帶，這表明CCPUCC1與nCLU在體內(nèi)的結(jié)合(圖28B，28C)。
myc標(biāo)記的CCPUCC1和FLAG標(biāo)記的叢生蛋白在細(xì)胞中的共定位。為了檢測CCPUCC1和nCLU是否在細(xì)胞中共定位，我們用pcDNA-CCPUCC1-myc和pFlag-叢生蛋白共轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，然后通過免疫組織化學(xué)染色檢測其亞細(xì)胞定位。用抗myc抗體的染色顯示出標(biāo)記的CCPUCC1蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞核中，而用抗FLAG抗體的染色表明標(biāo)記的nCLU定位于細(xì)胞核中(圖29A，29B，29D)。用pcDNA-CCPUCC1-myc和pFlag-叢生蛋白的共轉(zhuǎn)染以及用所述抗體的二重染色揭示了這些蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞核中，這支持CCPUCC1和nCLU在細(xì)胞中相互作用的觀點(圖29C)。
實施例7通過降低LY6E的表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長Ly6E的鑒定和結(jié)構(gòu)。采用National Center for Biotechnology Information中的BLAST程序用C3703的序列在公共數(shù)據(jù)庫中實施的同源性檢索鑒定了人基因Ly6E(淋巴細(xì)胞抗原6復(fù)合物，基因座E)(GenBank登錄號U66711)，以及具有染色體帶8q24.3(GenBank登錄號NT_008127)的基因組序列。Ly6EcDNA與該基因組序列的比較揭示出該基因由四個外顯子組成。
myc標(biāo)記的Ly6E蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。為了研究Ly6E蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，將表達(dá)myc標(biāo)記的Ly6E蛋白質(zhì)的質(zhì)粒(pDNAmyc/His-Ly6E)瞬時轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞中。采用細(xì)胞提取物和抗myc抗體的Western印跡分析顯示了與標(biāo)記的蛋白質(zhì)對應(yīng)的30-KDa條帶(圖30a)。隨后用所述抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色，表明該蛋白質(zhì)主要存在于細(xì)胞質(zhì)中(圖30b)。
目的在于降低Ly6E表達(dá)的反義S-寡核苷酸對結(jié)腸癌細(xì)胞的生長抑制。為了檢測抑制Ly6E是否能導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞的生長阻滯和/或細(xì)胞死亡，合成與Ly6E相應(yīng)的五對對照和反義S-寡核苷酸，然后將其轉(zhuǎn)染至LoVo或SNU-C4結(jié)腸癌細(xì)胞中，該結(jié)腸癌細(xì)胞在所檢測的11個結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)大量的Ly6E。轉(zhuǎn)染12小時后，在所述五種反義S-寡核苷酸中，Ly6E-AS1或-AS5與對照S-寡核苷酸(Ly6E-S1或-S5)相比，顯著抑制Ly6E在LoVo細(xì)胞中的表達(dá)(圖31a)。轉(zhuǎn)染后5日，轉(zhuǎn)染了Ly6E-AS1或Ly6E-AS5的存活細(xì)胞數(shù)顯著低于轉(zhuǎn)染了Ly6E-S1或Ly6E-S5的存活細(xì)胞數(shù)，這提示抑制Ly6E降低了轉(zhuǎn)染的LoVo細(xì)胞的生長和/或存活力(圖31b)。在三個獨立試驗中得到一致的結(jié)果。此外，我們采用LoVo細(xì)胞用S-寡核苷酸(Ly6E-AS1，AS5，-S1或-S5)實施了MTT試驗，其證實了相對于Ly6E-S1或-S5，對Ly6E-AS1或-AS5的響應(yīng)降低了細(xì)胞生存力(圖31c)。在SNU-C4細(xì)胞中獲得相似結(jié)果。
實施例8通過降低NKD1的表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長Nkd1的鑒定，結(jié)構(gòu)和表達(dá)。采用National Center for BiotechnologyInformation中的BLAST程序用D9092的序列在公共數(shù)據(jù)庫中實施的同源性檢索鑒定了人類基因Nkd1(Naked1)(GenBank登錄號AB062886)，染色體帶16p12(GenBank登錄號NT_010493)的基因組序列。采用Nkd1的PCR產(chǎn)物作為探針實施多組織northern印跡分析，并檢測到在脾，睪丸和卵巢中表達(dá)的4.0kb轉(zhuǎn)錄物(圖32)。
目的在于降低Nkd1表達(dá)的反義S-寡核苷酸對結(jié)腸癌細(xì)胞的生長抑制。為了檢測抑制Nkd1是否可以導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞的生長阻滯和/或細(xì)胞死亡，合成與Nkd1相應(yīng)的四對對照和反義S-寡核苷酸，然后將其轉(zhuǎn)染至所檢測的11個結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)大量Nkd1的LoVo或SW480結(jié)腸癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染12小時后，在所述五種反義S-寡核苷酸中，Nkd1-AS4或-AS5與對照S-寡核苷酸Nks1-S4或-S5相比顯著抑制了Nkd1的表達(dá)(圖33a)。轉(zhuǎn)染后5日，轉(zhuǎn)染了Nkd1-AS4和Nkd1-AS5的存活細(xì)胞數(shù)量顯著低于分別轉(zhuǎn)染了Nkd1-S4或Nkd1-S5的存活細(xì)胞數(shù)，這提示抑制Nkd1降低了轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的生長和/或存活力(圖33b)。在三個獨立試驗中得到一致的結(jié)果。我們還采用LoVo細(xì)胞和SW480細(xì)胞用S-寡核苷酸(Nkd1-AS4，-AS5，-S4或-S5)實施了MTT試驗，其證實了相對于Nkd1-S4或-S5，對Nkd1-AS4或-AS5的響應(yīng)降低了細(xì)胞生存力(圖33c)。
實施例10通過降低LAPTM4β的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的生長鑒定其表達(dá)在人類胃癌中通常發(fā)生上調(diào)的基因B0338。采用包含23040個基因的cDNA微陣列分析20種胃癌組織及其相應(yīng)非癌性胃粘膜組織的表達(dá)分布圖。該分析可鑒定大量基因表達(dá)水平，癌組織中的所述基因表達(dá)水平通常高于相應(yīng)非癌性組織中的所述水平。其中，在通過選擇基準(zhǔn)的十六例中，與LAPTM4β相對應(yīng)的內(nèi)部登錄號為B0338的基因在癌組織中與在相應(yīng)非癌性粘膜中相比，在1.03-16的上升率范圍內(nèi)上調(diào)(圖34a)。
為說明所述微陣列的結(jié)果，實施了半定量RT-PCR，顯示與相應(yīng)正常粘膜相比，LAPTM4β的表達(dá)在另外12個胃癌的8個中增加(圖34b)。
LAPTM4β的表達(dá)和結(jié)構(gòu)。采用LAPTM4β的PCR產(chǎn)物作為探針實施多組織northern印跡分析，并檢測到在脾，卵巢，心臟和骨骼肌中相對高表達(dá)的2.4kb轉(zhuǎn)錄物(圖35a)。LAPTM4β蛋白質(zhì)的氨基酸序列顯示出與人類LAPTM4A的47％的同一性且與小鼠Laptm4b97％的同一性。采用簡單模塊結(jié)構(gòu)研究工具對蛋白質(zhì)基序進(jìn)行搜索，顯示預(yù)測的蛋白質(zhì)包含四個跨膜區(qū)(圖35b)。
myc-或Flag標(biāo)記的LAPTM4β蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。為了研究LAPTM4β蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，將表達(dá)myc標(biāo)記的(pDNAmyc/His-LAPTM4β)或Flag標(biāo)記的LAPTM4β蛋白質(zhì)(pFLAG-LAPTM4β)的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染至NIH3T3細(xì)胞中。采用細(xì)胞提取物以及抗myc或抗Flag抗體的Western印跡分析顯示與所述標(biāo)記的蛋白質(zhì)相對應(yīng)的26-KDa條帶。隨后用這些抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色，表明所述標(biāo)記的蛋白質(zhì)主要存在于高爾基體中(圖36)。
目的在于降低LAPTM4β表達(dá)的反義S-寡核苷酸對胃癌細(xì)胞的生長抑制。為了檢測抑制LAPTM4β是否能導(dǎo)致胃癌細(xì)胞的生長阻滯和/或細(xì)胞死亡，合成與LAPTM4β相應(yīng)的對照和反義S-寡核苷酸，然后將其轉(zhuǎn)染至所檢測的6個胃癌細(xì)胞系中表達(dá)大量LAPTM4β的MKN1或MKN7胃癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染12小時后，反義S-寡核苷酸LAPTM4β-AS與對照S-寡核苷酸(LAPTM4β-S，-SCR或-REV)相比顯著抑制了LAPTM4β的表達(dá)(圖37a)。轉(zhuǎn)染后6日，轉(zhuǎn)染了LAPTM4β-AS的存活細(xì)胞數(shù)顯著低于轉(zhuǎn)染了對照S-寡核苷酸(LAPTM4β-S，-SCR，-REV)的存活細(xì)胞數(shù)，這提示抑制LAPTM4β降低了轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的生長和/或存活力(圖37b)。在三個獨立試驗中得到一致的結(jié)果。我們還采用MKN1和MKN7細(xì)胞以及S-寡核苷酸(LAPTM4β-AS，-S，-SCR，或-REV)實施了MTT試驗，其證實了與LAPTM4β-S，-SCR，或-REV相比，對LAPTM4β-AS的響應(yīng)降低了細(xì)胞生存力(圖37c)。在MKN28，-74和St-4人胃癌細(xì)胞中觀察到由LAPTM4β-AS產(chǎn)生的相似的生長抑制。
實施例11通過降低LEMD1的表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞的生長抑制LEMD1的鑒定，表達(dá)和結(jié)構(gòu)。采用National Center for BiotechnologyInformation中的BLAST程序用A8108的序列在公共數(shù)據(jù)庫中的同源性檢索鑒定了EST，其包含XM_050184及具有染色體帶1q31(GenBank登錄號NT_02190)的基因組序列。為了測定該基因的編碼序列，采用GENSCAN和基因識別和組裝因特網(wǎng)鏈接在基因組序列中預(yù)測候補(bǔ)外顯子序列，并實施外顯子聯(lián)結(jié)試驗。結(jié)果，獲得733個核苷酸的組裝序列，該序列包含編碼29個氨基酸蛋白質(zhì)的90個核苷酸的開放閱讀框(GenBank登錄號AB084765)。由于采用Simple Modular Architecture Research Tool對蛋白質(zhì)基序的搜索顯示了該預(yù)測的蛋白質(zhì)包含LEM基序(密碼子1-27)，我們將該基因命名為LEMD1(包含1的LEM結(jié)構(gòu)域)(圖38a)。第一ATG與以下序列側(cè)接與真核生物中起始翻譯的共有序列一致的序列(ATCATGG)，以及上游的框內(nèi)終止密碼子。LEMD1 cDNA與基因組序列的比較顯示出該基因由4個外顯子組成。最終鑒定了由外顯子1，2和4組成的選擇性剪接體(alternatiolspliaing)。該轉(zhuǎn)錄物包含編碼67個氨基酸蛋白質(zhì)的204個核苷酸的開放閱讀框(GenBank登錄號AB084764)。
此外，我們以LEMD1的PCR產(chǎn)物作為探針實施多組織northern-印跡分析，檢測到在睪丸而不在其它組織中表達(dá)的0.9kb轉(zhuǎn)錄物(圖38b)。預(yù)測的LEMD1蛋白質(zhì)的氨基酸序列顯示出與GenBank登錄號XM_050184的胸腺生成素相似的人類假定蛋白質(zhì)具有62％的同一性。
目的在于降低LEMD1表達(dá)的反義S-寡核苷酸對結(jié)腸癌細(xì)胞的生長抑制。為了檢測抑制LEMD1是否能導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞的生長阻滯和/或細(xì)胞死亡，合成與LEMD1相應(yīng)的五對對照和反義S-寡核苷酸，然后將其轉(zhuǎn)染至所檢測的7個結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)大量LEMD1的HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后5日，轉(zhuǎn)染了反義S-寡核苷酸LEMD1-AS1、2、3、4，或5的存活細(xì)胞數(shù)顯著低于轉(zhuǎn)染了對照S-寡核苷酸LEMD1-REV1、2、3、4，或5的存活細(xì)胞數(shù)，這提示抑制LEMD1降低了轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的生長和/或存活力。在三個獨立試驗中得到一致的結(jié)果(圖39)。
工業(yè)實用性如本文所述，通過激光俘獲切割和全基因組cDNA微陣列的組合得到的結(jié)腸癌或胃癌的基因-表達(dá)分析，鑒定了可作為癌癥預(yù)防和治療靶的具體基因。根據(jù)這些差異性表達(dá)的基因的亞組的表達(dá)，本發(fā)明提供了用于鑒定或檢測結(jié)腸癌或胃癌的分子診斷標(biāo)記。
本文所述方法還可用于鑒定預(yù)防，診斷和治療結(jié)腸癌或胃癌的其它分子靶。本文所報道的數(shù)據(jù)增加了對結(jié)腸癌或胃癌的綜合性理解，促進(jìn)了新的診斷策略的發(fā)展，并提供了鑒定治療藥和預(yù)防藥的分子靶的線索。所述信息促成對結(jié)腸直腸或胃腫瘤發(fā)生更為深入的理解，并提供了發(fā)展診斷，治療新策略的指標(biāo)，以及對結(jié)腸癌或胃癌的最終預(yù)防。
本文所引用的全部專利，專利申請，和出版物均為全文引入作為參考。此外，雖然已對照本發(fā)明的具體實施方案對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可對其進(jìn)行多種改變和修飾是顯而易見的。
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<223>人工合成的S-寡核苷酸<400>72gaagatcttc attctg 16<210>73<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸<400>73cagaatgaag atcttc 16<210>74<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸<400>74gcggccggct tggagt 16<210>75<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸<400>75actccaagcc ggccgc 16<210>76<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸<400>76gtagaagtgg tggtaa 16<210>77<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸<400>77ttaccaccac ttctac 16<210>78<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸<400>78gtgagcgcgg cgcgcc 16<210>79<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸<400>79ggcgcgccgc gctcac 16<210>80
<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸<400>80gcgcggccgc gctcac 16<210>81<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸<400>81cactcgcgcc gcgcgg 16<210>82<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>82ggcgaattcg taatatgctc actcgagtga aat 33<210>83<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>83gttgaattcc gtgttctcag gct 23<210>84<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>84gcggaattcc tgctgcagca ccacat 26<210>85<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>85acagcggccg ctttcatgac agcttg 26<210>86<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>86acagaattcg ggatggaagc ttc 23<210>87<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>87atactcgaga ggaggtttaa attcacgctc 30<210>88<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>88cacgaattca aggtaaaact tagatgtcct 30<210>89<211>33<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>89gagctcgagt ttatgttttt gccatagtga tag 33<210>90<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>90tgtgaattcg ccatgggaga ggc 23<210>91<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>91taaggatccc gtgcggcgcc gctt 24<210>92<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>92catgaattcc ggccatggcg 20<210>93<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>93catctcgagt caggtctggg ctc 23
<210>94<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>94tggtagccaa gtgcaggtta ta 22<210>95<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>95ccaaagggtt tctgcagttt ca 22<210>96<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>96ggggatcagc gtttgagtaa 20<210>97<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>97taggccccac ctccttctat 20<210>98<211>30<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>98tgcggatcca gagcagattg tactgagagt 30<210>99<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>99ctctatctcg agtgaggcgg aaagaacca29<210>100<211>47<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>100tttaagcttg aagaccattt ttggaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaac47<210>101<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>101tttaagcttg aagacatggg aaagagtggt ctca 34<210>102<211>40<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>102tttaagcttg aagactattt ttacatcagg ttgtttttct40
<210>103<211>37<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>103tttaagcttg aagacacggt gtttcgtcct ttccaca 37<210>104<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列<400>104caccgaagca gcacgacttc ttcttcaaga gagaagaagt cgtgctgctt c 51<210>105<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列<400>105aaaagaagca gcacgacttc ttctctcttg aagaagaagt cgtgctgctt c 51<210>106<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列<400>106caccagaaag attgtccctg gccttcaaga gaggccaggg acaatctttc t 51<210>107<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列
<400>107aaaaagaaag attgtccctg gcctctcttg aaggccaggg acaatctttc t 51<210>108<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列<400>108caccggagat gaagattttg aagttcaaga gacttcaaaa tcttcatctc c 51<210>109<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列<400>109aaaaggagat gaagattttg aagtctcttg aacttcaaaa tcttcatctc c 51<210>110<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列<400>110caccgaagaa caggaaaaga gatttcaaga gaatctcttt tcctgttctt c 51<210>111<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列<400>111aaaagaagaa caggaaaaga gattctcttg aaatctcttt tcctgttctt c 51<210>112<211>51
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列<400>112caccccagaa ggtaaaactt agattcaaga gatctaagtt ttaccttctg g 51<210>113<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列<400>113aaaaccagaa ggtaaaactt agatctcttg aatctaagtt ttaccttctg g 51<210>114<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列<400>114caccgtatgt gagcgtgaat ttattcaaga gataaattca cgctcacata c 51<210>115<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列<400>115aaaagtatgt gagcgtgaat ttatctcttg aataaattca cgctcacata c 51<210>116<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列<400>116
tcccccgaca cttccacatg attttcaaga gaaatcatgt ggaagtgtcg g 51<210>117<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列<400>117aaaaccgaca cttccacatg atttctcttg aaaatcatgt ggaagtgtcg g 51<210>118<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列<400>118tcccgcgact agagactctg cagttcaaga gactgcagag tctctagtcg c 51<210>119<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列<400>119ttttgcgact agagactctg cagtctcttg aactgcagag tctctagtcg c 51<210>120<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列<400>120tcccgaccat cataggatgg agcttcaaga gagctccatc ctatgatggt c 51<210>121<211>51<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>用于Si-RNA的人工合成寡核苷酸序列<400>121ttttgaccat cataggatgg agctctcttg aagctccatc ctatgatggt c 51<210>122<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>SiRNA的靶序列<400>122agaaagattg tccctggcct 20<210>123<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>SiRNA的靶序列<400>123ggagatgaag attttgaagt 20<210>124<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>SiRNA的靶序列<400>124gaagaacagg aaaagagatt 20<210>125<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>SiRNA的靶序列<400>125ccagaaggta aaacttagat 20
<210>126<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>SiRNA的靶序列<400>126gtatgtgagc gtgaatttat 20<210>127<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>SiRNA的靶序列<400>127ccgacacttc cacatgattt 20<210>128<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>SiRNA的靶序列<400>128gcgactagag actctgcagt 20<210>129<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>SiRNA的靶序列<400>129gaccatcata ggatggagct 20
權(quán)利要求
1.一種基本上純的多肽，其選自(a)包含SEQ ID NO2，4，6，8，10或12的氨基酸序列的多肽；(b)包含SEQ ID NO2，4，6，8，10或12的氨基酸序列的多肽，其中一個或多個氨基酸被置換、刪除、插入和/或添加，并且該多肽具有與SEQID NO2，4，6，8，10或12的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和(c)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO1，3，5，7，9或11的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由SEQ ID NO2，4，6，8，10或12的氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性。
2.一種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1的多肽。
3.一種載體，其包含權(quán)利要求2的多核苷酸。
4.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求2的多核苷酸或權(quán)利要求3的載體。
5.制備權(quán)利要求1的多肽的方法，所述方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)權(quán)利要求4的宿主細(xì)胞；(b)使該宿主細(xì)胞表達(dá)所述多肽；和(c)收集所表達(dá)的多肽。
6.一種抗體，其與權(quán)利要求1的多肽結(jié)合。
7.一種多核苷酸，所述多核苷酸與權(quán)利要求2的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)并包含至少15個核苷酸。
8.權(quán)利要求2所述多核苷酸的反義多核苷酸或小干擾RNA。
9.反義多核苷酸，其為權(quán)利要求8所述包含SEQ ID NO1的核苷酸序列的多核苷酸的反義多核苷酸，其中所述反義多核苷酸包含SEQ ID NO50的核苷酸序列。
10.反義多核苷酸，其為權(quán)利要求8所述包含SEQ ID NO3的核苷酸序列的多核苷酸的反義多核苷酸，其中所述反義多核苷酸包含SEQ ID NO54或56的核苷酸序列。
11.反義多核苷酸，其為權(quán)利要求8所述包含SEQ ID NO5的核苷酸序列的多核苷酸的反義多核苷酸，其中所述反義多核苷酸包含SEQ ID NO68的核苷酸序列。
12.反義多核苷酸，其為權(quán)利要求8所述包含SEQ ID NO7或9的核苷酸序列的多核苷酸的反義多核苷酸，其中所述反義多核苷酸包含SEQ IDNO58、60、62、64或66組成的核苷酸序列組。
13.反義多核苷酸，其為權(quán)利要求8所述包含SEQ ID NO11的核苷酸序列的多核苷酸的反義多核苷酸，其中所述反義多核苷酸包含SEQ ID NO52的核苷酸序列。
14.小干擾RNA，其為權(quán)利要求8所述包含SEQ ID NO11的核苷酸序列的多核苷酸的小干擾RNA，所述多核苷酸，其中所述小干擾RNA的靶序列包含SEQ ID NO126的核苷酸序列。
15.小干擾RNA，其為權(quán)利要求8所述包含SEQ ID NO3的核苷酸序列的多核苷酸的小干擾RNA，其中所述小干擾RNA的靶序列包含SEQ IDNO127的核苷酸序列。
16.小干擾RNA，其為權(quán)利要求8所述包含SEQ ID NO5的核苷酸序列的多核苷酸的小干擾RNA，其中所述小干擾RNA的靶序列包含SEQ IDNO128或129的核苷酸序列。
17.診斷個體中結(jié)腸癌或患結(jié)腸癌傾向性的方法，包括檢測源于患者的生物樣品中選自CGX1-7的結(jié)腸癌關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)水平，其中所述水平與所述基因的正常對照水平相比增加表明所述個體患有或易患結(jié)腸癌。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述增加為比所述正常對照水平高至少10％。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述方法還包括測定多個結(jié)腸癌關(guān)聯(lián)基因的所述表達(dá)水平。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述表達(dá)水平通過選自下組的任一方法進(jìn)行測定(a)檢測結(jié)腸癌關(guān)聯(lián)基因的mRNA，(b)檢測結(jié)腸癌關(guān)聯(lián)基因編碼的蛋白質(zhì)，和(c)檢測結(jié)腸癌關(guān)聯(lián)基因編碼的蛋白質(zhì)的生物活性。
21.權(quán)利要求17的方法，其中所述表達(dá)水平通過檢測結(jié)腸癌關(guān)聯(lián)基因探針與所述源于患者的生物樣品的基因轉(zhuǎn)錄物之間的雜交來測定。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述雜交步驟在DNA陣列上實施。
23.權(quán)利要求17的方法，其中所述生物樣品包括粘膜細(xì)胞。
24.權(quán)利要求17的方法，其中所述生物樣品包括腫瘤細(xì)胞。
25.權(quán)利要求17的方法，其中所述生物樣品包括結(jié)腸癌細(xì)胞。
26.結(jié)腸癌對照表達(dá)分布圖，其包括選自CGX1-7的兩種或兩種以上基因的基因表達(dá)圖譜。
27.篩選治療或預(yù)防結(jié)腸癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)將被驗化合物與選自CGX1-7的核酸所編碼的多肽接觸；b)檢測所述多肽與被驗化合物的結(jié)合活性；和c)選擇與所述多肽結(jié)合的化合物。
28.篩選用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)將候補(bǔ)化合物與表達(dá)一或多種標(biāo)記基因的細(xì)胞接觸，其中所述一述或多種標(biāo)記基因選自CGX1-7；和b)選擇化合物，所述化合物能降低選自CGX1-7的一或多種標(biāo)記基因的表達(dá)水平。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述被驗細(xì)胞包括結(jié)腸癌細(xì)胞。
30.篩選用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)將被驗化合物與多肽接觸，所述多肽由選自CGX1-7的核酸編碼；b)檢測步驟(a)的多肽的生物活性；和c)選擇化合物，其中與缺失該被驗化合物時檢測到的生物活性相比，所述化合物抑制選自CGX1-7的核酸所編碼多肽的生物活性。
31.篩選用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)將候補(bǔ)化合物與細(xì)胞接觸，所述細(xì)胞中已導(dǎo)入載體，所述載體包含一或多種標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)以及在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達(dá)的報道基因，其中所述一或多種標(biāo)記基因選自CGX1-7，b)檢測所述報道基因的活性；和c)選擇化合物，所述化合物與對照相比降低所述報道基因的表達(dá)水平。
32.篩選用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)在存在被驗化合物的情況下，將ARHCL1編碼的多肽與Zyxin接觸；(b)檢測所述多肽與Zyxin之間的結(jié)合；和(c)選擇被驗化合物，所述被驗化合物可抑制所述多肽與Zyxin之間的結(jié)合。
33.篩選用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)在存在被驗化合物的情況下，將NFXL1編碼的多肽與MGC10334或CENPC1接觸；(b)檢測所述多肽與MGC10334或CENPC1之間的結(jié)合；和(c)選擇被驗化合物，所述被驗化合物可抑制所述多肽和MGC10334或CENPC1之間的結(jié)合。
34.用于篩選治療或預(yù)防結(jié)腸癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)在存在被驗化合物的情況下，將C20orf20編碼的多肽與BRD8接觸；(b)檢測所述多肽與BRD8之間的結(jié)合；和(c)選擇被驗化合物，所述被驗化合物可抑制所述多肽和BRD8之間的結(jié)合。
35.篩選用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)在存在被驗化合物的情況下，將CCPUCC1編碼的多肽與nCLU接觸；(b)檢測所述多肽與nCLU之間的結(jié)合；和(c)選擇被驗化合物，所述被驗化合物可抑制所述多肽和nCLU之間的結(jié)合。
36.一種包含檢測試劑的試劑盒，所述檢測試劑與選自CGX1-7的一或多種核酸序列結(jié)合。
37.一種包含檢測試劑的試劑盒，所述檢測試劑與由選自CGX1-7的核酸序列所編碼的一或多種多肽結(jié)合。
38.一種包含核酸的陣列，所述核酸與選自CGX1-7的兩種或兩種以上的核酸序列結(jié)合。
39.治療結(jié)腸癌的方法，所述方法包括施用藥學(xué)有效量的反義多核苷酸或小干擾RNA的步驟，所述反義多核苷酸或小干擾RNA為選自CGX1-7的多核苷酸的反義多核苷酸或小干擾RNA。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述反義多核苷酸的核苷酸序列選自SEQ ID NO50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74或76的核苷酸序列。
41.權(quán)利要求39的方法，其中所述小干擾RNA的靶序列包括SEQ IDNO126-129的核苷酸序列。
42.治療或預(yù)防個體中結(jié)腸癌的方法，所述方法包括對所述個體施用藥學(xué)有效量的抗體或其片段的步驟，所述抗體或其片段與選自CGX1-7的任一核酸所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)合。
43.治療或預(yù)防個體中結(jié)腸癌的方法，所述方法包括對所述個體施用藥學(xué)有效量的疫苗的步驟，所述疫苗包含選自CGX1-7的核酸所編碼的多肽、或所述多肽的免疫活性片段、或編碼該多肽的多核苷酸。
44.誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，所述方法包括如下步驟將選自CGX1-7的多核苷酸所編碼的多肽與抗原呈遞細(xì)胞接觸，或?qū)⒕幋a所述多肽的多核苷酸或包含該多核苷酸的載體導(dǎo)入抗原呈遞細(xì)胞中。
45.權(quán)利要求44的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，其中所述方法還包括對個體施用所述抗原呈遞細(xì)胞的步驟。
46.治療或預(yù)防個體中結(jié)腸癌的方法，所述方法包括施用藥學(xué)有效量的化合物的步驟，所述化合物由權(quán)利要求27-35任一項的方法獲得。
47.一種用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌的組合物，所述組合物包含藥學(xué)有效量的反義多核苷酸或小干擾RNA，所述反義多核苷酸或小干擾RNA為選自CGX1-7的多核苷酸的反義多核苷酸或小干擾RNA。
48.一種用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌的組合物，所述組合物包含藥學(xué)有效量的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段與選自CGX1-7之一的核酸所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)合。
49.一種用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌的組合物，所述組合物包含藥學(xué)有效量的選自CGX 1-7的核酸所編碼的多肽、或所述多肽的免疫活性片段、或編碼該所述肽的多核苷酸。
50.一種用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌的組合物，所述組合物包含藥學(xué)有效量的活性成分以及可藥用的載體，其中所述活性成分為通過權(quán)利要求27-35任一項的方法選出的化合物。
51.診斷個體中的胃癌或患胃癌傾向性的方法，包括檢測源于患者的生物樣品中胃癌相關(guān)基因CGX8的表達(dá)水平，其中所述水平相對于所述基因的正常對照水平的增加表明所述個體患有胃癌或易患胃癌。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述增加為比所述正常對照水平高至少10％。
53.權(quán)利要求51的方法，其中所述表達(dá)水平通過選自下組的任一方法進(jìn)行測定(a)檢測胃癌相關(guān)基因CGX8的mRNA，(b)檢測胃癌相關(guān)基因CGX8編碼的蛋白質(zhì)，和(c)檢測由胃癌相關(guān)基因CGX8編碼的蛋白質(zhì)的生物活性，
54.權(quán)利要求51的方法，其中所述表達(dá)水平通過檢測胃癌相關(guān)基因CGX8探針與所述源于患者的生物樣品的基因轉(zhuǎn)錄物之間的雜交來測定。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述雜交步驟在DNA陣列上實施。
56.權(quán)利要求51的方法，其中所述生物樣品包括粘膜細(xì)胞。
57.權(quán)利要求51的方法，其中所述生物樣品包括腫瘤細(xì)胞。
58.權(quán)利要求51的方法，其中所述生物樣品包括胃癌細(xì)胞。
59.篩選用于治療或預(yù)防胃癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)將被驗化合物與CGX8編碼的多肽接觸；b)檢測所述多肽與被驗化合物之間的結(jié)合活性；和c)選擇與所述多肽結(jié)合的化合物。
60.篩選用于治療或預(yù)防胃癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)將候補(bǔ)化合物與表達(dá)CGX8的細(xì)胞接觸；和b)選擇降低CGX8的表達(dá)水平的化合物。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述被驗細(xì)胞包括胃癌細(xì)胞。
62.篩選治療或預(yù)防胃癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)將被驗化合物與CGX8編碼的多肽接觸；b)檢測步驟(a)的多肽的生物活性；和c)選擇化合物，其中與缺失該被驗化合物時檢測到的生物活性相比，所述化合物抑制CGX8編碼的多肽的生物活性。
63.篩選用于治療或預(yù)防胃癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)將候補(bǔ)化合物與細(xì)胞接觸，所述細(xì)胞中已導(dǎo)入載體，所述載體包含CGX8的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)以及在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達(dá)的報道基因；b)檢測所述報道基因的活性；和c)選擇化合物，其中所述化合物與對照相比降低所述報道基因的表達(dá)水平。
64.一種包含檢測試劑的試劑盒，所述檢測試劑與CGX8的核酸結(jié)合。
65.一種包含檢測試劑的試劑盒，所述檢測試劑與CGX8編碼的多肽結(jié)合。
66.治療胃癌的方法，所述方法包括施用藥學(xué)有效量的反義多核苷酸或小干擾RNA的步驟，所述反義多核苷酸或小干擾RNA為CGX8的多核苷酸的反義多核苷酸或小干擾RNA。
67.權(quán)利要求66的方法，其中所述反義多核苷酸的核苷酸序列是SEQID NO79的核苷酸序列。
68.治療或預(yù)防個體中胃癌的方法，所述方法包括對所述個體施用藥學(xué)有效量的的抗體或其片段的步驟，其中所述抗體或其片段與CGX8編碼的蛋白質(zhì)結(jié)合。
69.治療或預(yù)防個體中胃癌的方法，所述方法包括對所述個體施用藥學(xué)有效量的疫苗的步驟，其中所述疫苗包含CGX8編碼的多肽、或所述多肽的免疫活性片段、或編碼該多肽的多核苷酸。
70.誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，所述方法包括如下步驟將CGX8編碼的多肽與抗原呈遞細(xì)胞接觸，或?qū)⒕幋a所述多肽的多核苷酸或包含該多核苷酸的載體導(dǎo)入抗原呈遞細(xì)胞中。
71.權(quán)利要求70的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，其中所述方法還包括對個體施用所述抗原呈遞細(xì)胞的步驟。
72.治療或預(yù)防個體中胃癌的方法，所述方法包括施用藥學(xué)有效量的化合物的步驟，所述化合物由權(quán)利要求55-59任一項的方法獲得。
73.一種用于治療或預(yù)防胃癌的組合物，所述組合物包含藥學(xué)有效量的反義多核苷酸或小干擾RNA，所述反義多核苷酸或小干擾RNA是CGX8的多核苷酸的反義多核苷酸或小干擾RNA。
74.一種用于治療或預(yù)防胃癌的組合物，所述組合物包含藥學(xué)有效量的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段與CGX8編碼的蛋白質(zhì)結(jié)合。
75.一種用于治療或預(yù)防胃癌的組合物，所述組合物包含藥學(xué)有效量的CGX8編碼的多肽、或所述多肽的免疫活性片段、或編碼該多肽的多核苷酸。
76.一種用于治療或預(yù)防胃癌的組合物，所述組合物包含藥學(xué)有效量的活性成分以及可藥用的載體，其中所述活性成分為通過權(quán)利要求59-63任一項的方法選出的化合物。
全文摘要
本發(fā)明描述了檢測和診斷結(jié)腸直腸癌和胃癌的客觀方法。在一個實施方案中，診斷方法包括測定結(jié)腸癌或胃癌相關(guān)基因的表達(dá)水平，該表達(dá)水平在結(jié)腸癌或胃癌細(xì)胞與正常細(xì)胞之間存在差別。本發(fā)明還提供了篩選用于治療結(jié)腸癌的治療劑的方法以及對個體進(jìn)行疫苗接種以防止結(jié)腸癌或胃癌的方法。
文檔編號A61P35/00GK1695059SQ0382489
公開日2005年11月9日 申請日期2003年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月30日
發(fā)明者中村佑輔, 古川洋一 申請人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司, 國立大學(xué)法人東京大學(xué)