一種沙棗種子抗菌多肽的制備方法及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種沙棗種子抗菌多肽的制備方法及其用途，該方法先將干燥的沙棗種子進(jìn)行粉碎、脫脂處理之后，采用醋酸提取，丙酮沉淀，再利用反相硅膠柱層析（C18）分離純化即得到沙棗種子抗菌部位。將得到的沙棗種子抗菌部位利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析成分結(jié)果顯示：其由分子量4400Da?14000Da之間的多種多肽組成的多肽與蛋白質(zhì)混合物，該部位被驗(yàn)證其有效的抑制白色念珠菌，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌活性。可作為原料或輔助劑用于制備保健品或其他功能性食品中的用途。
【專利說明】
一種沙棗種子抗菌多肽的制備方法及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及沙棗種子抗菌多肽的制備方法及其用途
【背景技術(shù)】
[0002] 沙率是胡頹子科(Elaeagnus)胡頹子屬落葉喬木或小喬木，它是可直接食用，是一 種新疆維吾爾族人民喜愛的果品。在《中國藥典維吾爾分冊》中記載，主要藥理活性有抗氧 化、抗增殖、抗溶血、抗過敏、抑菌殺菌、抗病毒等，有較高的研究和藥用價(jià)值。沙棗還有健脾 胃，安神，鎮(zhèn)靜，止瀉澀腸的功用。沙棗除飼用外，還是很好的造林、綠化、薪炭，防風(fēng)、固沙樹 種。沙棗作為飼料，在中國西北已有悠久的歷史。其葉和果是羊的優(yōu)質(zhì)飼料。在西北冬季風(fēng) 暴天氣，沙棗林則是羊群避災(zāi)保畜的場所。
[0003] 通過國內(nèi)外有關(guān)沙棗種子化學(xué)成分和生物活性研究的文獻(xiàn)調(diào)查結(jié)果顯示，目前沙 棗的化學(xué)成分報(bào)道主要集中在多糖、黃酮和揮發(fā)油，除此以外，沙棗中的蛋白質(zhì)、脂肪和其 它也有相關(guān)報(bào)道，但目前未見沙棗種子的蛋白和多肽的研究報(bào)道，在種子往往蛋白較多;沙 棗是新疆特色藥用植物，收錄于《中國藥典維吾爾分冊》，分布廣，資源豐富，具有很大的藥 用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。所以，我們以新疆產(chǎn)沙棗種子為研究對象，系統(tǒng)的研究其果實(shí)、果仁中的多 肽成分，尋找有生物活性的多肽，同時也為開發(fā)、利用新疆特色藥用植物資源提供理論依 據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于，提供一種新疆的可食植物-沙棗種子抗菌多肽的制備方法及其 用途，該方法先將干燥的沙棗種子進(jìn)行粉碎、脫脂處理之后，采用醋酸提取，丙酮沉淀，再利 用反相硅膠柱層析(C 18)分離純化即得到沙棗種子抗菌多肽。將得到的沙棗種子抗菌鍍鈦利 用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析成分結(jié)果顯示:其由分子量4400Da-14000Da之間的多種多肽組 成的多肽與蛋白質(zhì)混合物，該多肽被驗(yàn)證其有效的抑制白色念珠菌，大腸桿菌和金黃色葡 萄球菌活性?？勺鳛樵匣蜉o助劑用于制備保健品或其他功能性食品中的用途。
[0005] 本發(fā)明所述的一種沙棗種子抗菌多肽的制備方法，按下列步驟進(jìn)行：
[0006] a、將沙棗果實(shí)用水洗掉，將種子進(jìn)行清洗自然曬干、粉碎，用石油醚脫脂得到脫脂 沙棗種子；
[0007] b、將步驟a中得到的脫脂沙棗種子，在室溫下，用濃度為10%醋酸按料液比為w/v =1:7提取沙棗種子總多肽，溫度20°C，過濾取上清液，再按v/v = 1:5將上清液倒入無水丙 酮中過夜沉淀，在溫度4°C，12000r/min條件下離心3次，每次15min，將每次的沉淀物用冷卻 的無水丙酮洗滌，再將沉淀物自然曬干，得到總多肽提取物，計(jì)算得率和蛋白含量；
[0008] C、將步驟b中提取物，加入預(yù)處理好的填料為C18的反相高效液相RP-HPLC柱，用體 積濃度為15%乙醇平衡，再用乙醇梯度洗脫，分開收集流出液，濃縮冷凍干燥即可得到具有 抗菌作用的沙棗種子抗菌多肽。
[0009] 所述方法獲得的沙棗種子抗菌部位在抑制白色念珠菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球 菌活性中的用途。
[0010] 所述方法獲得的沙棗種子抗菌多肽在制備保健品或其他功能性食品中的用途。
【附圖說明】
[0011] 圖1為本發(fā)明沙棗種子和標(biāo)準(zhǔn)蛋白15%SDS-PAGE考馬斯染色圖，其中1為沙棗種子 抗菌多肽，Μ為標(biāo)準(zhǔn)蛋白（甲狀旁腺激素1-34，4.1KD;抑肽酶，6.5KD;甲狀旁腺激素1-84， 9.5KD;溶菌酶，14.4KD;胰蛋白酶抑制劑，20KD;磷酸丙糖異構(gòu)酶，27KD;豬胃蛋白酶，35KD; 卵清蛋白，45KD;牛血清白蛋白，66KD);
[0012]圖2為本發(fā)明對白色念珠菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌三個菌的活性作用圖，其 中SA為金黃色葡萄球菌;EC為白色念珠菌;CA為大腸桿菌。
[0013] 圖3為本發(fā)明沙棗種子多肽粗體物質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 實(shí)施例1
[0015] a、將300g沙棗果實(shí)用水洗掉，種子進(jìn)行清洗自然曬干、粉碎，用石油醚脫脂得到脫 脂沙棗種子48g;
[0016] b、將步驟a中得到的脫脂沙棗種子，在室溫下，用濃度為10%醋酸按料液比為w/v =1:7在攪拌下提取沙棗種子總多肽，溫度20°C，時間2小時，過濾取上清液，再按v/v= 1: 5 將上清液倒入無水丙酮中過夜沉淀，在溫度4°C，12000r/min條件下離心3次，每次15min，將 每次的沉淀物用冷卻的無水丙酮洗滌，再將沉淀物自然曬干，得到總多肽提取物，利用雙縮 脲法測總的蛋白含量，540nm波長紫外檢測，總蛋白含量為72.6% ;
[0017] c、將步驟b中總多肽提取物，加入預(yù)處理好的填料為C18的反相高效液相RP-HPLC柱 子，用體積濃度為15%乙醇平衡，再用乙醇梯度洗脫，分開收集流出液，濃縮冷凍干燥即可 得到具有抗菌作用的沙棗種子抗菌多肽。
[0018] 實(shí)施例2
[0019]利用瓊脂平板法檢測樣品對三種菌的抑菌作用，并測定樣品對三種菌的抑菌環(huán)大 小，以此判斷樣品的抑菌能力：
[0020]革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌于LB液體培養(yǎng)基中， 175rpm、溫度37°C，過夜培養(yǎng)至0D600在2.0左右（1 X 106CFU/mL)，取過夜培養(yǎng)的菌液10 yL 與8mL含0.7 %瓊脂的LB培養(yǎng)基混勻后平鋪在含25mL 1.5 %瓊脂的LB培養(yǎng)基上，當(dāng)頂層瓊脂 凝固后，滴加用〇.22μπι微孔濾膜濾后的樣品溶液，溫度37°C過夜培養(yǎng)，測量抑菌環(huán)直徑。以 氨芐青霉素為陽性對照，生理鹽水為陰性對照。
[0021 ]表1沙棗種子抗菌多肽的抗菌結(jié)果(M±m(xù))
[0022]
[0023] 實(shí)施例3
[0024] 串聯(lián)質(zhì)譜由兩個質(zhì)譜串聯(lián)而成，其中第一個質(zhì)量分析器將離子預(yù)分離或加能量修 飾，由第二級質(zhì)量分析器分析結(jié)果;本實(shí)驗(yàn)參考蛋白質(zhì)酶解的方法采用串聯(lián)質(zhì)譜將沙棗種 子粗體多肽進(jìn)行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜分析得到分子量分別為5492.9Da，6551.5Da，4400.5Da和 2837Da的四個多肽分子。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種沙棗種子抗菌多肽的制備方法，其特征在于按下列步驟進(jìn)行： a、 將沙棗果實(shí)用水洗掉，將種子進(jìn)行清洗自然曬干、粉碎，用石油醚脫脂得到脫脂沙棗 種子； b、 將步驟a中得到的脫脂沙棗種子，在室溫下，用濃度為10%醋酸按料液比為w/v=l: 7提 取沙棗種子總多肽，溫度20°C，過濾取上清液，再按v/v=l:5將上清液倒入無水丙酮中過夜 沉淀，在溫度4°C，12000r/min條件下離心3次，每次15min，將每次的沉淀物用冷卻的無水丙 酮洗滌，再將沉淀物自然曬干，得到總的多肽提取物，計(jì)算得率和蛋白含量； c、 將步驟b中提取物，加入預(yù)處理好的填料為C18的反相高效液相RP-HPLC柱，用體積濃 度為15%乙醇平衡，再用乙醇梯度洗脫，分開收集流出液，濃縮冷凍干燥即可得到具有抗菌 作用的沙棗種子抗菌多肽。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法獲得的沙棗種子抗菌多肽在抑制白色念珠菌、大腸桿菌和 金黃色葡萄球菌活性中的用途。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法獲得的沙棗種子抗菌部位在制備保健品或其他功能性食 品中的用途。
【文檔編號】A23L33/18GK106008686SQ201610356003
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月26日
【發(fā)明人】阿布力米提·伊力, 阿吉艾克拜爾·艾薩, 艾合米丁·外力, 肖開提·薩力霍
【申請人】中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所