專利名稱：從多肽全能文庫(kù)恢復(fù)可逆可解折疊多肽的方法
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本發(fā)明的背景多肽在多種應(yīng)用中已變成越來越重要的試劑，包括作為醫(yī)藥治療和診斷試劑的應(yīng)用以及多種工業(yè)應(yīng)用。限制多肽更多應(yīng)用的一個(gè)因素是多肽的物理和化學(xué)性質(zhì)。如，多肽必須保持適當(dāng)?shù)恼郫B狀態(tài)才有活性。然而，在儲(chǔ)存條件下或在應(yīng)用條件下(受熱或在有機(jī)溶劑中)，多肽有解折疊或變性的趨向。此外，在利用生物制備系統(tǒng)制備多肽時(shí)，很多多肽的產(chǎn)率很低。因此，很多多肽由于造價(jià)昂貴而不能生產(chǎn)。
限制多肽更多應(yīng)用的一個(gè)重要因素是解折疊的或變性多肽不可逆聚集的趨勢(shì)。聚集受到多肽濃度的影響，并認(rèn)為產(chǎn)生在多種情況中，如部分折疊或解折疊中間產(chǎn)物。有利于部分折疊的中間產(chǎn)物的因素或條件，如升高溫度以及高多肽濃度會(huì)促使不可逆聚集。(Fink，A.L.，F(xiàn)olding & Design 3R23(1998).)如，以濃縮的形式儲(chǔ)存提純的多肽，如凍干制備品，常常導(dǎo)致至少部分多肽不可逆聚集。同樣，在生物系統(tǒng)中表達(dá)制備多肽，如在E.Coli中，常常導(dǎo)致形成含有聚集多肽的包含體。從包含體中恢復(fù)活性多肽是非常困難的，需要在生物制備系統(tǒng)中加入其他步驟，如重折疊步驟。
一種已嘗試的制備具有改進(jìn)特性的多肽的方法是選取具有改進(jìn)穩(wěn)定性活溶解性的多肽變體。(參看，如，Jung，S，et al.J.Mol.Biol.294163-180(1999)；Davies，J and Riechmannn.L.，Prot.Eng.9531-537(1996)；Waldo，G.S.Curr.Opin.Chem.Biol.733-38(2003))。然而，改進(jìn)的穩(wěn)定性或溶解性的選取不解決聚集的問題，因?yàn)榉€(wěn)定性(如熱穩(wěn)定性，熱力學(xué)穩(wěn)定性)和溶解性是適當(dāng)折疊的多肽的特性，而聚集是從部分折疊或部分變性狀態(tài)產(chǎn)生的。此外，多肽穩(wěn)定性和聚集之間沒有證實(shí)的相關(guān)性(Fink，A.L.，F(xiàn)olding & Design 3R23(1998).)。
因此，存在一種使用生物制備系統(tǒng)高產(chǎn)率制備改進(jìn)特性的多肽的需要。
本發(fā)明的概述本發(fā)明涉及可逆可解折疊多肽，涉及包含可逆可解折疊多肽的全能文庫(kù)，并涉及含可逆可解折疊多肽或編碼可逆可解折疊多肽核酸的文庫(kù)。本發(fā)明還涉及制備富含可逆可解折疊多肽或編碼可逆可解折疊多肽核酸的文庫(kù)的方法。本發(fā)明涉及選擇和/或分離可逆可解折疊多肽的方法，涉及制備可逆可解折疊多肽的方法。
一方面，本發(fā)明是從多肽文庫(kù)或全能文庫(kù)(如多肽展示系統(tǒng))選擇，分離和/或恢復(fù)可逆可解折疊的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括解折疊多肽群(如文庫(kù)或全能文庫(kù)或多肽展示系統(tǒng)中的多肽)，重折疊部分解折疊的多肽，選擇，分離和/或恢復(fù)重折疊多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括提供解折疊多肽群(如文庫(kù)或全能文庫(kù)或多肽展示系統(tǒng)中的多肽)，重折疊至少部分解折疊多肽，選擇，分離和/或恢復(fù)重折疊多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括提供多肽展示系統(tǒng)，其中多肽展示系統(tǒng)包括全能文庫(kù)，加熱全能文庫(kù)到至少部分展示的多肽解折疊的溫度(Ts)，冷卻全能文庫(kù)到低于Ts的溫度(Tc)以制備冷卻的全能文庫(kù)。冷卻的全能文庫(kù)包括至少部分解折疊并重折疊的多肽以及部分聚集的多肽。方法進(jìn)一步包括在溫度(Tr)恢復(fù)至少一種結(jié)合配體并可逆可解折疊的多肽。優(yōu)選地，配體結(jié)合折疊多肽，不結(jié)合聚集多肽，恢復(fù)的多肽具有融解溫度(Tm)，Ts＞Tm＞Tc，Ts＞Tm＞Tr。
另一方面，本發(fā)明涉及可逆可解折疊多肽的全能文庫(kù)，涉及編碼可逆可解折疊多肽的核酸的文庫(kù)，涉及制備這樣文庫(kù)和全能文庫(kù)的方法。
一方面，本發(fā)明是分離的可逆可解折疊多肽。在一些實(shí)施方案中，可逆可解折疊多肽是氨基酸序列與親代多肽不同(如一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換，插入和/或缺失)但性質(zhì)上保持親代多肽功能的親代多肽的變體。
本發(fā)明還涉及制備富含可逆可解折疊可變域的抗體可變域文庫(kù)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括(1)提供噬菌體展示系統(tǒng)，其中噬菌體展示系統(tǒng)包括多種展示的抗體可變區(qū)域，其中至少部分展示的抗體可變區(qū)域已經(jīng)解折疊并重折疊，(2)從所述噬菌體展示系統(tǒng)中選擇展示解折疊，重折疊并恢復(fù)結(jié)合功能的可變區(qū)域的噬菌體，(3)獲得編碼展示在恢復(fù)噬菌體上的可變區(qū)域的CDRl和/或CDR2的核酸，以及(4)裝配編碼抗體可變域的核酸文庫(kù)，其中在(3)中獲得的所述核酸可操作連接一種或多種其他核酸以制備編碼其中CDRl和/或CDR2由(3)中獲得的核酸編碼的抗體可變域的構(gòu)建體文庫(kù)。在具體實(shí)施方案中，基本上(1)中所有展示的可變區(qū)域已通過加熱到約80C而解折疊，通過冷卻而重折疊。在其他具體實(shí)施方案中，在(4)中裝配的核酸文庫(kù)編碼抗體可變域，其中CDR3是隨機(jī)化的，不是從已選擇的能可逆可解折疊的抗體可變區(qū)域衍生的。
本文所描述的可逆可解折疊多肽可在E.coli或酵母培養(yǎng)物的上清液中高產(chǎn)率地制備成可溶蛋白質(zhì)。
附圖的簡(jiǎn)述

圖1演示了編碼人類免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域DP47dummy(本文中也稱DP47d)的核酸，包括胚系VH基因片段DP47和胚系VJ基因片段JH47d(SEQ ID NO1，編碼鏈，SEQ ID NO2，非編碼鏈)。圖1還演示了編碼的VH域的氨基酸序列(SEQ IDNO3)。氨基酸是依據(jù)Kabat系統(tǒng)計(jì)數(shù)排列的。(Kabat，E.A.et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，F(xiàn)ifth Edition，U.S.Department of Health and Human Service，U.S.GovernmentPrinting Office(1991))。
圖2演示了編碼人類免疫球蛋白輕鏈(κ)可變區(qū)域DPK9dummy(本文中也稱DPK9d)的核酸，包括胚系VK基因片段DPK9和胚系JK基因片段JKl(SEQ ID NO4，編碼鏈，SEQID NO5，非編碼鏈)。圖2還演示了編碼的VK域的氨基酸序列(SEQ ID NO6)。氨基酸是依據(jù)Kabat系統(tǒng)計(jì)數(shù)排列的。
圖3A-3F是演示在熱誘導(dǎo)解折疊和重折疊后在DP47d支架上展示VH域的噬菌體克隆保留的蛋白質(zhì)A結(jié)合活性的相對(duì)量的直方圖。每種噬菌體克隆的樣品受熱使展示的VH域解折疊，然后冷卻重折疊，另一種樣品保持不受熱。熱處理的以及沒有熱處理的噬菌體樣品結(jié)合蛋白質(zhì)A的活性由ELISA測(cè)定。熱處理克隆體的結(jié)合活性表示為沒有熱處理克隆體的結(jié)合活性的百分比。標(biāo)注dp47的條狀表示DP47d。
圖4A-4C是演示圖3A-3F中展示在噬菌體上幾種VH域的保留相對(duì)于大于60％互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1，CDR2，CDR3)氨基酸序列的表。這些序列在圖4A-4C中克隆數(shù)是相同的。這些克隆體在本問文中用前綴“pA-”表示。如克隆體13也稱為“pA-C13”。在圖4A和4B中的第一組序列來自較高程度重折疊的克隆體，通過蛋白A的結(jié)合評(píng)定的(組1)。圖4C中的下一組序列來自較好重折疊的克隆體。這些克隆體也包括CDR外的突變(組2)。圖4C中的最后一組序列是來自較低程度重折疊的克隆體。
圖5演示了展示VH域進(jìn)行可逆可解折疊的能力與VH域位置22到位置36的氨基酸序列疏水性的關(guān)系。幾種展示VH域的位置22到位置36的氨基酸序列Sweet/Eisenberg疏水評(píng)定(SE-15值)通過15個(gè)氨基酸的窗來確定。在進(jìn)行熱誘導(dǎo)解折疊和重折疊后的每個(gè)克隆體的SE-15值與相對(duì)蛋白質(zhì)A結(jié)合活性(ELISA)相對(duì)作圖。圖中演示了展示VH域進(jìn)行熱誘導(dǎo)解折疊和重折疊的能力和位置22到位置36的氨基酸序列的0或小于0的SE-15值相關(guān)。氨基酸的位置依據(jù)Kabat定義。
圖6是演示幾種展示VH域位置22到位置36的序列的Sweet/Eisenberg疏水性評(píng)分(Sweet/Eisenberg值)的直方圖。Sweet/Eisenberg值大于0的DP47d和BSA1VH域不進(jìn)行熱誘導(dǎo)的解折疊。Sweet/Eisenberg值小于0的HEL4，pA-C13，pA-C47，pA-C59，pA-C76，pA-C85VH域以及每種這些克隆體的VH域進(jìn)行可逆熱誘導(dǎo)解折疊。氨基酸的位置依據(jù)Kabat定義。
圖7演示了解折疊曲線和重折疊曲線的特征表現(xiàn)。曲線通過測(cè)定適當(dāng)折疊的多肽的濃度(如橢圓性或熒光性)作為橫坐標(biāo)與解折疊試劑(如熱(溫度))作為縱坐標(biāo)制得。解折疊和重折疊曲線包括折疊多肽的區(qū)域，多肽不同程度解折疊的解折疊/重折疊過度區(qū)域，和解折疊多肽區(qū)域。重折疊曲線的Y軸方向的中斷是重折疊蛋白質(zhì)恢復(fù)的相對(duì)量。在演示圖中，TM是多肽的融解溫度，TM-10和TM+10分別是多肽融解溫度減去10度和加10度。演示的重折疊曲線顯示多于75％的多肽重折疊了。
圖8演示了dAbHEL4的熱誘導(dǎo)解折疊。dAbHEL4通過加熱解折疊，并在加熱期間評(píng)定橢圓率(實(shí)心圓)。然后，解折疊的dAb通過降低溫度重折疊。然后加熱重折疊的dAb使其解折疊，在加熱期間評(píng)定橢圓率(空心菱形)。圖中顯示兩個(gè)熱誘導(dǎo)解折疊的解折疊曲線是重疊的，說明dAbHEL4進(jìn)行可逆熱誘導(dǎo)解折疊。插入小圖顯示了折疊dAbHEL4在25攝氏度(折疊)下以及解折疊dAbHEL4在80攝氏度的遠(yuǎn)UVCD光譜(解折疊)。
圖9演示了包括其中Trp47被Arg(DP47-W47R)替換的DP47變體的dAb，其受熱沒有可逆可解折疊。dAb DP47-W47R受熱解折疊，在加熱中評(píng)定橢圓率(實(shí)心圓)。然后通過降低溫度重折疊解折疊的dAb。然后通過加熱解折疊重折疊的dAb，在加熱期間評(píng)定橢圓率(空心方塊)。解折疊曲線沒有重疊并變性多肽的形狀特征。
圖10演示了其中Ser35被Gly(DP47-S47G)替換的DP47變體的dAb，其受熱后可逆可解折疊到有限程度。dAb DP47-S47G受熱解折疊，在加熱中評(píng)定橢圓率(實(shí)心圓)。然后通過降低溫度重折疊解折疊的dAb。然后加熱重折疊的dAb使其解折疊，在加熱期間評(píng)定橢圓率(空心菱形)。解折疊曲線沒有重疊，顯示重折疊時(shí)部分橢圓率(部分原始二級(jí)結(jié)構(gòu))恢復(fù)，在重加熱樣品時(shí)觀察到融解過度。
圖11演示了多肽的熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性(ΔG折疊-解折疊)和展示在噬菌體上的多肽的可逆可解折疊的關(guān)系。圖中顯示非-可重折疊的多肽BSA1和DP47d具有高熱力學(xué)穩(wěn)定性，可重折疊多肽HEL4和幾種可重折疊DP47突變體具有較低的熱力學(xué)穩(wěn)定性。可重折疊多肽的熱力學(xué)穩(wěn)定性可通過在熱誘導(dǎo)解折疊期間獲得的橢圓率數(shù)據(jù)確定。不可重折疊的多肽的熱力學(xué)穩(wěn)定性通過尿素誘導(dǎo)解折疊期間監(jiān)測(cè)熒光性確定。
圖12演示了多肽的熱力學(xué)穩(wěn)定性(AG折疊-解折疊)和在E.coli上清液中蛋白質(zhì)表達(dá)量的關(guān)系。圖中顯示非可重折疊多肽BSA1和DP47具有高熱力學(xué)穩(wěn)定性，但表達(dá)量相對(duì)低，可重折疊的多肽HEL4和幾種可重折疊DP47d突變體具有較低熱力學(xué)穩(wěn)定性但表達(dá)量相對(duì)較高?？芍卣郫B多肽的熱力學(xué)穩(wěn)定性從在熱誘導(dǎo)解折疊期間獲得的橢圓率數(shù)據(jù)確定。不可重折疊的多肽的熱力學(xué)穩(wěn)定性通過尿素誘導(dǎo)解折疊期間監(jiān)測(cè)熒光性確定。蛋白質(zhì)表達(dá)是使用蛋白質(zhì)A瓊脂糖從1升E.coli培養(yǎng)物中提純的，歸一到培養(yǎng)物的細(xì)胞密度(OD600)的多肽的量。
圖13演示了在E.coli上清液中蛋白質(zhì)表達(dá)量和展示在噬菌體上可逆可解折疊多肽的關(guān)系。圖中顯示非可重折疊多肽BSA1和DP47d表達(dá)量相對(duì)低，可重折疊多肽HEL4和幾種可重折疊DP47d突變體表達(dá)量相對(duì)高。圖中顯示了展示在噬菌體上可逆可解折疊的多肽和表達(dá)多肽的E.coli培養(yǎng)物的上清液中多肽的量直接相關(guān)性。蛋白質(zhì)表達(dá)是使用蛋白質(zhì)A瓊脂糖從1升E.coli培養(yǎng)物中提純的，歸一到培養(yǎng)物的細(xì)胞密度(OD600)的多肽的量。
圖14演示含有可逆可解折疊Vκ(DPK9-175N)和可逆可解折疊VH(DP47-F27D)的單鏈Fv(scFv)的熱誘導(dǎo)解折疊。scFv受熱解折疊，在加熱中評(píng)定橢圓率(實(shí)心圓)。然后通過降低溫度重折疊解折疊的scFv。然后通過加熱解折疊重折疊的scFv，在加熱期間評(píng)定橢圓率(空心方塊)。圖中顯示兩個(gè)熱誘導(dǎo)解折疊的解折疊曲線是重疊的，說明scFv進(jìn)行可逆熱誘導(dǎo)解折疊。其他含有胚系VH和Vκ，胚系VH和可解折疊Vκ(DPK9-175N)，或可逆可解折疊VH(DP47-F27D)的scFv在使用條件下聚集。插入小圖顯示在熱誘導(dǎo)解折疊前折疊scFv的遠(yuǎn)UV CD光譜(深色線)和熱誘導(dǎo)解折疊和重折疊后折疊scFv的遠(yuǎn)UV CD光譜(淺色線)。光譜是重疊的，說明scFv在重折疊后重新獲得所有二級(jí)結(jié)構(gòu)。
圖15A和15B是直方圖，演示了熱處理噬菌體(80攝氏度10分鐘，然后冷卻到4攝氏度10分鐘)對(duì)展示dAb結(jié)合蛋白質(zhì)A或抗體的結(jié)合的影響。在圖15中，噬菌體多價(jià)展示DP47d或HEL4dAb(5×1011TU/毫升)通過ELISA測(cè)定與抗-c-myc抗體(9E10)或蛋白質(zhì)A的結(jié)合。9E10識(shí)別作為線性確定物的-c-myc標(biāo)記，附加在dAb上的肽標(biāo)記。使用稀釋系列的噬菌體，從0.5OD650納米-OD450納米ELISA信號(hào)所需的噬菌體滴定度(滴定未處理/滴定熱處理的)計(jì)算保留的結(jié)合。在圖15B中，通過ELISA評(píng)定展示DP47d的噬菌體對(duì)蛋白質(zhì)A的結(jié)合。噬菌體濃度高(5×1011TU/毫升)或低(1×109TU/毫升)，DP47d以單價(jià)或多價(jià)狀態(tài)展示。
圖15C是直方圖，演示了熱處理噬菌體(80攝氏度10分鐘，后冷卻到4攝氏度10分鐘)對(duì)感染性的影響。多價(jià)展示DP47d或HEL4的噬菌體加熱然后冷卻，10分鐘后，在22攝氏度用0.9毫克/毫升的胰島素處理噬菌體樣品10分鐘，然后用來感染E.coliTG1細(xì)胞。
圖16A-16C演示了熱處理前和后(80攝氏度10分鐘)的負(fù)染色噬菌體點(diǎn)的透射電子顯微圖。圖16A和圖16B顯示受熱的DP47d噬菌體形成聚集。然而，如圖16C所示，受熱的展示可逆解折疊HEL4VH域的噬菌體，沒有形成聚集。
圖16D是Westem blot圖，其中每道有1010轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)的噬菌體使用抗-PIII鼠單克隆抗體分離檢測(cè)。在1到16道上的噬菌體分別是fd，HEL4(多價(jià))，DP47d(多價(jià))，M13，HEL4(單價(jià))，以及DP47d(單價(jià))。
圖17A是選擇的人類VH3dAbs的凝膠過濾層析代表性分析示圖。C13(—)，C36(———)，C47(——)，C59(-------)，C76(——)和C85(...........)dAbs(10μM在PBS中)的層析通過使用SUPERDEX-75柱獲得(Amersham Biosciences)，C13，C36，C47，C59，C76和C85的表觀分子量分別為22kDa，17kDa，19kDa，10kDa，20kDa，和15kDa。
圖17B演示了由CD記錄的在235納米的C36dAb(5μM在PBS中)熱誘導(dǎo)變性曲線，第一次加熱后的平均剩余橢圓率； ，第二次加熱的平均剩余橢圓率。插入小圖dAb HEL4(5μM在PBS中)在遠(yuǎn)UV區(qū)域不同溫度的CD光譜▲，解折疊前25攝氏度；●，85攝氏度(解折疊多肽)；○，樣品冷卻后25攝氏度。
圖18A演示了TAR2-10-27和變體TAR2-10-27F27D和TAR2-10-27Y23D結(jié)合人類腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)并在受體結(jié)合ELISA中抑制TNF與受體的結(jié)合。將TNFR1固定在板上，將TNF與TAR-10-27，TAR2-10-27F27D，或TAR2-10-27Y23D混合，然后加入到加樣孔中。使用抗-TNF抗體定量與固定受體結(jié)合的TNF 的量。TAR-10-27，TAR2-10-27F27D，和TAR2-10-27Y23D每種都結(jié)合人類TNFR1并抑制TNF與受體的結(jié)合。
圖18B演示TAR2-10-27和變體TAR2-10-27F27D和TAR2-10-27Y23D結(jié)合表達(dá)在Hela細(xì)胞上的人類腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)，并在體外測(cè)試中抑制TNF-誘導(dǎo)IL-8的產(chǎn)生。將Hela細(xì)胞放于微滴定板上，與TAR-10-27，TAR2-10-27F27D，或TAR2-10-27Y23D和300pg/ml TNF培育過夜。培育后，將細(xì)胞的上清液吸去，使用三明治ELISA測(cè)定上清液中IL-8的量。TAR-10-27，TAR2-10-27F27D，或TAR2-10-27Y23D每種都結(jié)合人類TNFR1并抑制TNF誘導(dǎo)的IL-8的產(chǎn)生。
發(fā)明的詳細(xì)描述該發(fā)明是關(guān)于可逆解折疊多肽以及選擇或設(shè)計(jì)這樣的多肽的方法?？赡娼庹郫B多肽有很多優(yōu)點(diǎn)。特別地，這樣的多肽抗聚集，或者說不聚集。由于抗聚集性，可逆解折疊多肽容易高量生產(chǎn)，比如，利用合適的生物學(xué)生產(chǎn)體系例如大腸桿菌表達(dá)的溶解的蛋白質(zhì)。此外，可逆的解折疊多肽能公式化，并且或者說能在比傳統(tǒng)多肽高的濃度中儲(chǔ)存，而且聚集及活性損失少。
就像這里描述的一樣，能夠從多肽展示系統(tǒng)中選擇出可逆解折疊多肽。在多肽展示系統(tǒng)中，多肽已經(jīng)被打開(如加熱)以及正在重折疊(如冷卻)。這里描述的選擇和設(shè)計(jì)過程可逆解折疊多肽抗聚集。這些選擇及設(shè)計(jì)過程與在高穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上選擇多肽的方法截然不同，例如在高溫下仍然折疊的多肽。(如Jung，S.et al.，i.Mol.Biol.294163-180(1999).)正如這里所用地，“多肽展示系統(tǒng)”指的是一個(gè)多肽集合用于以需要的特征為基礎(chǔ)進(jìn)行選擇的系統(tǒng)，如，物理的，化學(xué)的或功能的特性。多肽展示系統(tǒng)是多肽的一個(gè)適當(dāng)?shù)娜芪膸?kù)(例如，在溶液中，固定在適當(dāng)?shù)闹С治锷?。多肽展示系統(tǒng)也是一個(gè)使用細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(例如，在轉(zhuǎn)化、侵染、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)換的細(xì)胞中核酸文庫(kù)的表達(dá)以及細(xì)胞表面編碼的多肽的展示)的生化系統(tǒng)，或者說是一個(gè)非細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)(如乳液的區(qū)別及展示)。優(yōu)選的多肽展示系統(tǒng)將核酸的譯碼功能與通過核酸編碼的多肽的物理的、化學(xué)的及功能的特性結(jié)合起來。當(dāng)使用這種多肽展示系統(tǒng)時(shí)，帶有想要的物理的、化學(xué)的及功能的特性的多肽能被挑選出來，并且編碼挑選出的多肽的核酸能比較容易被析出或再生。眾所周知，在技術(shù)上有許多結(jié)合核酸的譯碼功能及多肽的物理的、化學(xué)的和功能的特性的多肽展示系統(tǒng)，例如噬菌體展示，核糖體展示，乳液區(qū)分及展示，酵母展示，嘌呤霉素展示，細(xì)菌展示，質(zhì)粒上的多肽展示及共價(jià)展示之類的。(參看EP 0436597(Dyax)，U.S.Patent No.6,172,197(McCaffetr et al.)，U.S.Patent No.6,489,103(Griffiths et al.).)多肽展示系統(tǒng)能夠組成許多可復(fù)制的遺傳展示數(shù)據(jù)庫(kù)，正如McCafferty等(見WO 92/01047；U.S.PatentNo.6,172,197)描述的一樣?？蓮?fù)制的遺傳展示數(shù)據(jù)庫(kù)(RGDP)是一個(gè)生物微粒，它帶有給微粒提供復(fù)制能力的遺傳信息。RGDP能在表面至少是多肽的部分表面展示。多肽能通過自身RGDP或人為代入的遺傳信息編碼。RGDP可能是一種病毒，例如，細(xì)菌噬菌體，就像fd or M 13。舉個(gè)例子，RGDP可能是一種在表面展示抗體可變范圍(比如VH，VI)的細(xì)菌噬菌體?？梢詫⑦@種RGDP歸為噬菌體抗體(pAb)。
正如這里所用的，術(shù)語(yǔ)“可可逆解折疊的”及“可逆解折疊”指的是在這項(xiàng)發(fā)明方法中的能被打開(如加熱)及重折疊的多肽?？赡娴啬鼙淮蜷_的多肽(可逆解折疊多肽)在打開時(shí)失去功能，但重折疊時(shí)又恢復(fù)功能。這樣的多肽與在打開或不正確地重折疊(錯(cuò)誤折疊多肽)時(shí)聚集的多肽有顯著差異，也就是不恢復(fù)功能。更優(yōu)選地，當(dāng)在多肽展示系統(tǒng)中時(shí)，可逆解折疊多肽能可逆地打開，例如，在細(xì)菌噬菌體上展示。特別地，當(dāng)在多肽展示系統(tǒng)中展示時(shí)優(yōu)選的可逆解折疊多肽能可逆地打開，并被看作可溶的多肽(如可自溶的多肽)。
就像這里所用的，“多肽全能文庫(kù)”指的是以氨基酸序列多樣性為表現(xiàn)特征的多肽的集合。全能文庫(kù)的各個(gè)部分有共同的特征，比如共同的結(jié)構(gòu)特征(如共同的核結(jié)構(gòu))及共同的功能特征(如結(jié)合共有配體(如遺傳配體或靶配體)的能力)。
就像這里使用的，“文庫(kù)”指的是能被表達(dá)更準(zhǔn)確地說是能復(fù)制的不同種類的核酸的集合。例如，文庫(kù)包含不同種類的合并到適合載體上的核酸的集合，比如，表達(dá)質(zhì)粒，噬菌體等等。這類文庫(kù)的表達(dá)能夠產(chǎn)生多肽全能文庫(kù)?！拔膸?kù)”還表示在結(jié)合核酸譯碼功能及通過核酸編碼的多肽的物理的、化學(xué)的及功能的特性的多肽展示系統(tǒng)中展示的不同種類多肽的集合，并能被選擇或篩選出來提供帶有想要的物理的、化學(xué)的及功能的特性的單個(gè)多肽(核酸編碼同樣)或多肽的集合(核酸編碼同樣)。展示不同種類多肽集合的噬菌體集合是這種文庫(kù)的一個(gè)例子。不同種類的多肽集合這種文庫(kù)包含多肽全能文庫(kù)。
就像這里所用的，“功能多肽”描述了正確地折疊以致帶有特定的需要活性的多肽，比如與配體匹配的活性(如結(jié)合普通配體，結(jié)合靶配體)，或本身具有的或者是自然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的生物活性。例如，術(shù)語(yǔ)“功能多肽”包括抗體或通過抗原結(jié)合點(diǎn)結(jié)合抗原的抗原結(jié)合片斷，以及與底物匹配的酶。
就像這里使用的，“普通配體”指的是與給定全能文庫(kù)的功能部分的實(shí)質(zhì)部分(如全部)匹配的配體。普通配體(如共同的普通配體)能夠與給定全能文庫(kù)的許多部分匹配，即使這些部分沒有與共同靶配體結(jié)合的特性。一般來說，多肽(就像結(jié)合普通配體的能力顯示的一樣)上功能性的普通結(jié)合配體點(diǎn)的存在顯示多肽正確地折疊及功能化。因此，正確折疊的多肽能通過與普通配體結(jié)合從多肽全能文庫(kù)中選擇出或恢復(fù)。普通配體的合適的例子包括超抗原，結(jié)合在全能文庫(kù)功能部分的實(shí)質(zhì)部分上表達(dá)的抗原決定基的抗體，等等。
就像這里使用的，“靶配體”指的是通過多肽被特定的或選擇性的結(jié)合的配體。例如，靶配體可能是一種適合于全能文庫(kù)中特定結(jié)合多肽或多肽被確定的配體。例如，當(dāng)多肽是抗體或抗原結(jié)合片斷，其中靶配體可能是任何想要的抗原或抗原決定基，當(dāng)多肽是一種酶，靶配體可能是任何一種底物。與目的抗原結(jié)合依賴于多肽的功能及多肽的目的抗原結(jié)合點(diǎn)的特征。
就像這里使用的，“抗體多肽”是一種多肽，它是一種抗體，抗體的一部分，或者是包含抗體(如抗原結(jié)合部分)的一部分的熔合蛋白質(zhì)。因此，“抗體多肽”包括，抗體(如免疫球蛋白G)，抗體的重鏈，抗體的輕鏈，重鏈或輕鏈的同型二聚體，及抗原結(jié)合片斷或部分抗體，如Fv片斷(如，單鏈Fv(scFv)，二硫化物結(jié)合Fv)，F(xiàn)ab片斷，F(xiàn)ab’片斷，F(xiàn)(ab’)2片斷，單一可變區(qū)(VH，VL)，dAb等等。
就像這里使用的，“抗體形式”指的是所有合適的多肽結(jié)構(gòu)，其中抗體可變區(qū)能合并使得在結(jié)構(gòu)上賦予結(jié)合特性。眾所周知有許多合適的抗體形式，例如，假象的抗體，人造的抗體，人的抗體，單鏈抗體，雙效抗體，抗體重鏈，抗體輕鏈，抗體重鏈或抗體輕鏈的同型二聚體和異型二聚物，前面所說的所有抗原結(jié)合片斷(如單鏈Fv(scFv)，二硫化物結(jié)合Fv)，F(xiàn)ab片斷，F(xiàn)ab’片斷，F(xiàn)(ab’)2片斷，單一可變區(qū)(VH，VL)，dAb，以及所有前面所說的內(nèi)容(如通過聚乙烯乙二醇或其他適合的聚集體共價(jià)結(jié)合修飾)修改。
“超抗原”是技術(shù)術(shù)語(yǔ)，指的是在一個(gè)與蛋白質(zhì)的常用配體結(jié)合點(diǎn)截然不同的點(diǎn)上免疫球蛋白總科各部分之間相互作用的普通配體。葡萄球菌的腸毒素是與T細(xì)胞受體相互作用的超抗原的例子。與抗體結(jié)合的超抗原包括與免疫球蛋白G不變區(qū)(Bjorckand Kronvall，J.Immunol.，133969(1984))結(jié)合的蛋白質(zhì)G；與免疫球蛋白G不變區(qū)及VH區(qū)(Forsgren and Sjoquist，J.Immunol.，97822(1966))結(jié)合的蛋白質(zhì)A；以及與VL區(qū)(Bjorck，J.Immunol.，1401194(1988))結(jié)合的蛋白質(zhì)L。
就像這里使用的，“解折疊試劑”指的是能使多肽解折疊的試劑(如化合物)或能量。當(dāng)解折疊試劑是一個(gè)化合物時(shí)，一定量的化合物能被添加到多肽展示系統(tǒng)中使達(dá)到想要的多肽解折疊程度。適合的混合物包括變性劑物(如氫氯化胍，尿素)，酸(如鹽酸，醋酸)，堿(如氫氧化鈉，氫氧化鉀)，及有機(jī)溶劑(如酒精(如甲醇，乙醇)，酮(如甲基乙烷基酮)，醛(如甲醛，二甲基甲醛)，四氫呋喃，二氧雜環(huán)乙烷，甲苯等等)。解折疊試劑可以是能量，比如熱量或壓力。當(dāng)解折疊試劑是熱量時(shí)，多肽系統(tǒng)受到足夠量的能量(如熱量的，電磁的)，從而提供給多肽展示系統(tǒng)足夠的熱，使得系統(tǒng)溫度升高到一個(gè)足夠的使得多肽解折疊到想要程度的溫度。優(yōu)先選擇的解折疊試劑(或解折疊試劑的混合物)不是充分地抑制不可逆解折疊的解折疊多肽的聚集。
就像這里使用的，“折疊門護(hù)”指的是根據(jù)生物物理化學(xué)特性及在蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的位置預(yù)防蛋白質(zhì)解折疊的聚集體的不能消除的構(gòu)成的氨基酸殘基。折疊門護(hù)殘基阻礙旁路聚集，因此，要確保蛋白質(zhì)能通過可逆解折疊。一般地，折疊門護(hù)減少已發(fā)現(xiàn)區(qū)域的氨基酸序列的SE值(疏水值)。
就像這里使用的，“可分泌的”或“分泌的”是指當(dāng)多肽通過大腸桿菌生產(chǎn)時(shí)，產(chǎn)生并輸出到外周胞質(zhì)的空間或媒介。
解折疊及重折疊評(píng)定多肽解折疊及重折疊能被評(píng)價(jià)，例如，利用所有合適的方法通過直接或間接的多肽結(jié)構(gòu)。例如，多肽結(jié)構(gòu)可以通過循環(huán)分色性(CD)(如遠(yuǎn)UV CD，近UV CD)，熒光性(如色氨酸側(cè)鏈熒光)，蛋白質(zhì)水解易感性，核磁共振(NMR)，或通過檢測(cè)或測(cè)量依賴正確折疊的多肽功能來檢測(cè)。舉個(gè)例子，多肽解折疊使用功能檢驗(yàn)來評(píng)價(jià)，其中結(jié)合功能(如結(jié)合普通或靶配體，結(jié)合底物)的損失顯示多肽被解折疊。
可溶多肽的解折疊及重折疊的程度能通過解折疊或變性曲線來測(cè)定。解折疊曲線可以通過劃分解折疊試劑(如溫度，變性劑濃度，有機(jī)溶劑濃度)為縱坐標(biāo)，折疊多肽的相關(guān)濃度為橫坐標(biāo)來產(chǎn)生。折疊多肽的相關(guān)濃度可以通過直接或間接利用所有合適的方法(如，CD，熒光，結(jié)合檢驗(yàn))測(cè)定。例如，準(zhǔn)備多肽溶液，溶液橢圓率通過CD測(cè)定。獲得的橢圓率的值代表100％折疊多肽的相關(guān)濃度。溶液中的多肽通過添加解折疊試劑(如熱量，變性劑)解折疊，并且橢圓率定為合適的增量(如溫度的每一等級(jí)的增長(zhǎng)后)。溶液中的多肽通過減少解折疊試劑實(shí)現(xiàn)重折疊，并且橢圓率定為合適的增量。處理數(shù)據(jù)得到解折疊曲線及重折疊曲線。如圖7顯示的，解折疊及重折疊曲線有特有的形狀，包括多肽分子折疊的部分，多肽分子解折疊到各種等級(jí)的解折疊/重折疊的轉(zhuǎn)換，以及多肽分子解折疊的部分。重折疊曲線Y軸的截距是恢復(fù)的重折疊蛋白質(zhì)的相關(guān)數(shù)量。至少50％，或60％，或70％，或75％，或80％，或85％，或90％，或95％的恢復(fù)率可以顯示多肽可逆解折疊過程。
具體情況下，當(dāng)加熱時(shí)，可溶多肽可逆解折疊。通過制備多肽溶液，劃分多肽的解折疊及重折疊曲線測(cè)定可溶多肽解折疊的可逆性?？稍谌魏我环N合適溶劑中配制肽溶液，比如帶有合適的使得肽溶解(如在等電點(diǎn)(pI)上下各三個(gè)單位的pH值)的pH值的水緩沖液。將多肽溶液充分濃縮，使測(cè)出解折疊/折疊。例如，多肽溶液大約為0.1μM到100μM，或更準(zhǔn)確地說是1μM到10μM。
如果可溶多肽的融解溫度已知，可將溶液加熱到Tm以下10度(Tm-10)，通過橢圓率或熒光性(如200nm到250nm遠(yuǎn)UVCD掃描，在235nm或298nm確定的波長(zhǎng)CD；300nm到450nm色氨酸熒光發(fā)射光譜在298nm激發(fā))進(jìn)行折疊評(píng)價(jià)以提供100％相關(guān)的折疊多肽。在預(yù)先確定的增量中(如從0.1到1度的增量)，將溶液加熱到至少在Tm以上10度(Tm+10)，在每個(gè)增量下測(cè)定橢圓率或熒光性。然后，在預(yù)先確定的增量中，冷卻到至少Tm下10度對(duì)多肽進(jìn)行重折疊，在每個(gè)增量下測(cè)定橢圓率或熒光性。如果可溶多肽的融解溫度未知，可通過從25℃加熱到大約100℃對(duì)溶液進(jìn)行解折疊，再冷卻到至少大約25℃進(jìn)行重折疊，測(cè)定每個(gè)加熱或冷卻增量下的橢圓率或熒光性。處理獲得的數(shù)據(jù)得到解折疊曲線及重折疊曲線，其中重折疊曲線的y軸截距是恢復(fù)的重折疊蛋白質(zhì)的相關(guān)數(shù)量。
一些多肽像可溶多肽一樣可逆地解折疊，但不同于展示多肽(如像噬菌體外殼蛋白質(zhì)一樣在細(xì)菌噬菌體表面上熔化蛋白質(zhì)的展示)。然而，一般作為展示多肽時(shí)完成可逆解折疊的多肽也完成作為可溶多肽制備時(shí)的可逆解折疊。因此，在展示多肽的環(huán)境中可逆解折疊有很多優(yōu)點(diǎn)，能提供從全能文庫(kù)或多肽展示文庫(kù)中選擇像可溶多肽一樣可逆解折疊的多肽的能力。
包含在多肽展示系統(tǒng)中的多肽解折疊及重折疊，例如，細(xì)菌噬菌體上的多肽展示，可通過測(cè)定依賴正確折疊的多肽功能來評(píng)價(jià)。例如，包含帶有共同功能的展示多肽的多肽展示系統(tǒng)，比如結(jié)合共同配體(如普通配體，靶配體，底物)，能解折疊或重折疊，且重折疊可利用功能檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。例如，可通過在細(xì)菌噬菌體上展示多肽及測(cè)量或測(cè)定展示多肽的結(jié)合活性來測(cè)定有結(jié)合活性的多肽是否可逆解折疊?？赏ㄟ^加熱噬菌體展示多肽到大約80℃進(jìn)行展示多肽解折疊，然后通過冷卻噬菌體到大約20℃或室溫進(jìn)行重折疊，并可測(cè)量重折疊多肽的結(jié)合活性。至少50％，或60％，或70％，或75％，或80％，或85％，或90％，或95％的結(jié)合活性恢復(fù)率顯示多肽可逆解折疊的過程。優(yōu)選地，可測(cè)定包含抗體可變區(qū)，普通配體(如，蛋白質(zhì)A，蛋白質(zhì)L)結(jié)合或靶配體展示多肽。
在多肽溶液中或在適當(dāng)?shù)亩嚯恼故鞠到y(tǒng)中，從1μM到1mM，從1μM到500μM，或1μM到100μM的多肽濃度下可逆解折疊。例如，當(dāng)在產(chǎn)生0.5mM的展示抗體可變區(qū)多肽自身濃度的多聚體噬菌體展示系統(tǒng)中展示時(shí)，某個(gè)人源抗體可變區(qū)能可逆折疊。特別體現(xiàn)在，在溶液中或在約為10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，601μM，70μM，80μM，90μM，1001μM，200μM，300μM，400μM500μM下噬菌體頂端展示時(shí)多肽可逆解折疊。
選擇方法該發(fā)明是從文庫(kù)或多肽全能文庫(kù)(如多肽展示系統(tǒng))選擇，離析或恢復(fù)可逆解折疊的多肽。具體情況下，該方法含有多肽集合(如文庫(kù)中的多肽，全能文庫(kù)或多肽展示系統(tǒng))解折疊，至少一部分解折疊多肽的重折疊，以及選擇，離析或恢復(fù)重折疊多肽。具體情況下，該方法含有解折疊多肽的集合(如文庫(kù)中的多肽，全能文庫(kù)或多肽展示系統(tǒng))供給，至少一部分解折疊多肽的重折疊，以及選擇，離析或恢復(fù)重折疊多肽。
多肽展示系統(tǒng)優(yōu)選地，在合適的多肽展示系統(tǒng)中，從多肽全能文庫(kù)中選擇，離析或恢復(fù)可逆解折疊多肽。例如，可逆解折疊多肽能從溶液中或者共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合到合適表面的多肽全能文庫(kù)，如塑料或玻璃(如微量測(cè)定板，多肽排列如微排列)，選擇，離析或恢復(fù)。例如，可使用每個(gè)不同文庫(kù)部分(如獨(dú)特的肽序列)表面肽的排列的預(yù)定位置?？赏ㄟ^排列中的空間位置來測(cè)定這種排列中每個(gè)文庫(kù)成分的名稱。例如，可測(cè)定在靶配體之間結(jié)合物相互作用的排列中的位置，以及反應(yīng)文庫(kù)成分的出現(xiàn)，因此在空間位置的基礎(chǔ)上確定反應(yīng)文庫(kù)成分的序列。(見U.S.Patent No.5,143,854，WO 90/15070and WO 92/10092.)優(yōu)選地，該方法使用結(jié)合核酸譯碼功能及通過核酸編碼的多肽的物理的、化學(xué)的及功能的特性的多肽展示系統(tǒng)。優(yōu)選地，多肽展示系統(tǒng)包含一個(gè)文庫(kù)，比如細(xì)菌噬菌體展示文庫(kù)。細(xì)菌噬菌體展示是一個(gè)特別優(yōu)選的多肽展示系統(tǒng)。
已經(jīng)描述了許多合適的細(xì)菌噬菌體展示系統(tǒng)(如單價(jià)的及多化合價(jià)的展示系統(tǒng))。(見Griffiths et al.，U.S.Patent No.6,555,313 BI(見參考文獻(xiàn))；Johnson et al.，U.S.Patent No.5,733,743(見參考文獻(xiàn))；McCafferty et al.，U.S.Patent No.5,969,108(見參考文獻(xiàn))；Mulligan-Kehoe，U.s.Patent No.5,702,892(見參考文獻(xiàn))；Winter，G.et al.，Annu.Rev.Immunol.12433-455(1994)；Soumillion，P.et al.，Appl.Biochem.Biotechnol.47(2-3)175-189(1994)；Castagnoli，L.et al′.，Comb.Chem.High Throughput Screen，4(2)121-133(2001).)可在任何一種合適的細(xì)菌噬菌體上展示出細(xì)菌噬菌體展示系統(tǒng)中的多肽展示，比如絲狀噬菌體(如fd，M13，F(xiàn)1)，細(xì)胞溶解酶噬菌體(如，T4，T7，lambda 11)，或RNA噬菌體(如MS2)。
一般地，可生產(chǎn)或提供展示多肽全能文庫(kù)的噬菌體文庫(kù)，就像帶有噬菌體外殼蛋白質(zhì)的熔化蛋白質(zhì)一樣?？赏ㄟ^任何合適的方法生產(chǎn)這種文庫(kù)，比如將編碼展示多肽的噬菌體載體文庫(kù)或噬菌體載體引入合適的宿主菌，并培養(yǎng)產(chǎn)生的細(xì)菌使生成噬菌體(如需要的話使用合適的輔助噬菌體或補(bǔ)充質(zhì)粒)?？赏ㄟ^合適的方法從這種培養(yǎng)基中重新獲得噬菌體文庫(kù)，比如沉淀法及離心法。
多肽展示系統(tǒng)由含有多樣性的所有需要的數(shù)量的多肽全能文庫(kù)組成。例如，全能文庫(kù)包含帶有與自然產(chǎn)生的多肽相應(yīng)通過有機(jī)體表達(dá)的氨基酸序列的多肽，有機(jī)體組，需要的組織或細(xì)胞類型，或者帶有隨機(jī)或任意排列的氨基酸序列的多肽。如果需要的話，這些多肽可共用一個(gè)核或框架。例如，全能文庫(kù)或文庫(kù)中的所有多肽可以從蛋白質(zhì)A，蛋白質(zhì)L，蛋白質(zhì)G，成纖維區(qū)，抗促成素，CTLA4，需要的酶(如，聚合酶，纖維素酶)，或來自免疫球蛋白總科的多肽，比如抗體或抗體片段(如，VH，VL)。在這種全能文庫(kù)或文庫(kù)中的多肽可由隨機(jī)或任意排列的氨基酸序列指定區(qū)及共有氨基酸序列區(qū)組成。具體情況下，全能文庫(kù)中所有或完全所有多肽都是需要的類型，如需要的酶(如聚合酶)或需要的抗體的抗原結(jié)合片段(如人源VH或VL)。首先體現(xiàn)在，多肽展示系統(tǒng)由多肽全能文庫(kù)組成，其中每個(gè)多肽由抗體可變區(qū)組成。例如，全能文庫(kù)中的每個(gè)多肽包含VH，VL或Fv(如單鏈Fv)。
通過合適的方法，可將氨基酸序列差異引入需要的多肽或框架的任何需要的區(qū)域。例如，通過使用所有合適的突變方法(如低精度PCR，寡核苷酸引物或直接突變形成點(diǎn)，使用NNK密碼子多樣化)或所有合適的方法構(gòu)建編碼各種多肽的核酸文庫(kù)，可將氨基酸序列差異引入靶配體，比如抗體可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)或疏水區(qū)。如果需要的話，可任意排列多樣化的多肽區(qū)。
組成全能文庫(kù)的多肽的大小主要是選擇的問題，統(tǒng)一的多肽大小是不唯一的。一般地，在全能文庫(kù)中，多肽含有至少9個(gè)氨基酸殘基及二級(jí)結(jié)構(gòu)。更重要地是，全能文庫(kù)中，多肽至少有三級(jí)結(jié)構(gòu)(至少來自一個(gè)結(jié)構(gòu)域)。
多肽全能文庫(kù)由可逆解折疊多肽組成，并且可使用這里描述的合適的解折疊試劑解折疊。例如，可將多肽全能文庫(kù)濃縮在可逆解折疊的多肽中，且在大腸桿菌隱秘表達(dá)。一般地，在這種濃縮的可逆解折疊全能文庫(kù)中至少包含10％的多肽。更優(yōu)選地，在濃縮的全能文庫(kù)中，至少有20％，或30％，或40％，或50％，或60％，或70％，或80％，或90％的多肽可逆解折疊。最優(yōu)全能文庫(kù)包含加熱時(shí)可逆解折疊的多肽。
具體地，全能文庫(kù)中的全部多肽共用一個(gè)框架特征(如物理特征，化學(xué)特征，功能特征)。優(yōu)選地，共有的框架特征依賴于正確地折疊，從解折疊及錯(cuò)誤折疊的多肽中區(qū)分正確折疊的多肽。例如，共有的框架特征是一種類似結(jié)合引力的特征，這種結(jié)合引力使得正確折疊的多肽從錯(cuò)誤折疊或解折疊的多肽中區(qū)分及選擇出來。具體地，共有的框架特征可用于選擇正確折疊的多肽，避免解折疊及錯(cuò)誤折疊的多肽。例如，在該方法中使用了多肽全能文庫(kù)，比如共用的結(jié)合配體(如，結(jié)合共同的普通配體，結(jié)合共同的靶配體，結(jié)合(或被結(jié)合在)共同的抗體)，共同的催化活性或蛋白質(zhì)水解抗性(如，由蛋白酶引起蛋白質(zhì)水解停止)，其中，全能文庫(kù)中的所有多肽有共同的區(qū)分解折疊及錯(cuò)誤折疊與正確折疊的功能特征。另一方面，在該方法使用了所有可逆解折疊的帶有共同的區(qū)分解折疊及錯(cuò)誤折疊與正確折疊的選擇性特征的多肽全能文庫(kù)。
在具體實(shí)施方案中，多肽展示系統(tǒng)由含有免疫球蛋白可變區(qū)(如VH，VL)的多肽文庫(kù)組成。可變區(qū)以細(xì)菌線性序列(如DP47無(wú)意義突變(SEQ ID NO3，DPK9無(wú)意義突變(SEQ ID NO6))為基礎(chǔ)，如果需要的話，可有一個(gè)或更多的變化區(qū)域，比如互補(bǔ)決定區(qū)。VH的其他合適的細(xì)菌線性序列包括VH基因片段DP4，DP7，DP8，DP9，DPK，DP31，DP33，DP45，DP46，DP49，DP50，DP51，DP53，DP54，DP65，DP66，DP67，DP68及DP69編碼的序列，以及JK片段JH1，IEI2，JH3，JH4，JH4b，JH5及JH6。VL的其他合適的細(xì)菌線性序列包括VK基因片段DPK1，DPK2，DPK3，DPK4，DPK5，DPK6，DPK7，DPK8，DPK9，DPK10，DPK12，DPK13，DPK15，DPK16，DPK18，DPK19，DPK20，DPK21，DPK22，DPK23，DPK24，DPK25，DPK26及DPK 28編碼的序列，以及JK片段JK1，JK2，JK3，JK4and JK5。
一個(gè)或更多的可變區(qū)的結(jié)構(gòu)域(FR)包括(a)人源結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，(b)至少8個(gè)人源結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的連續(xù)氨基酸，或(c)人源細(xì)菌胚系抗體基因片段編碼的氨基酸序列，其中所說的結(jié)構(gòu)域是由Kabat氨基酸編號(hào)系統(tǒng)定義的。在具體實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域序列與相應(yīng)的人源細(xì)菌胚系抗體基因片段編碼的結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同，或者說相對(duì)于相應(yīng)的人源細(xì)菌胚系抗體基因片段編碼的結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列形成5個(gè)氨基酸的差異。
在其他實(shí)施方案中，F(xiàn)R1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3及FR4的氨基酸序列與相應(yīng)的人源細(xì)菌胚系抗體基因片段編碼的結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同，或者說相對(duì)于相應(yīng)的人源細(xì)菌胚系抗體基因片段編碼的結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3及FR4的氨基酸序列有10個(gè)氨基酸的差異。另外，F(xiàn)R1，F(xiàn)R2及FR3的氨基酸序列與相應(yīng)的人源細(xì)菌胚系抗體基因片段編碼的結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同。
組成可變區(qū)的多肽準(zhǔn)確地構(gòu)成靶配體或普通配體結(jié)合點(diǎn)。另一方面，普通配體結(jié)合點(diǎn)是一種超抗原結(jié)合點(diǎn)，比如蛋白質(zhì)A，蛋白質(zhì)L，或蛋白質(zhì)G?？勺儏^(qū)可以任何一種需要的可變區(qū)為基礎(chǔ)出，例如人源VH(如VH1a，VH1b，VH2，VH3，VH4，VH5，VH6)，人源Vλ(如VλI，VλII，VλIII，VλIV，VλV，VλVI)或人源VК(如，VК1，VК2，VК3，VК4，VК5，VК6，VК7，VК8，VК9 orVК10)。優(yōu)選地，可變區(qū)不是camelid免疫球蛋白區(qū)，比如VHH，或者說包含一個(gè)或更多氨基酸(如氨基酸結(jié)構(gòu))，它僅與細(xì)菌線性序列編碼的camelid免疫球蛋白可變區(qū)有關(guān)，而與人源免疫球蛋白可變區(qū)無(wú)關(guān)。(見Davies et al.，Protein Engineering 9531-537(1996)；Tanha et al.，J.Riol，Chenz，276；24774-24780(2001)；Riechmann et al.，J.Immunol.Methods 2325-38(1999).)具體情況下，可逆解折疊的VH不是由與突變(如鼠源)細(xì)菌線性結(jié)構(gòu)域有關(guān)的一個(gè)或更多氨基酸組成的。優(yōu)選地，加熱時(shí)可變區(qū)可逆解折疊。
離析出的組成可變區(qū)的多肽可以是一種抗體形式。因此，某些具體情況下，離析出的組成可逆解折疊可變區(qū)的多肽可以是可變區(qū)的同型二聚體，組成可變區(qū)的異型二聚體，F(xiàn)v，scFv，結(jié)合Fv的二硫化物，F(xiàn)ab，單一可變區(qū)或與免疫球蛋白Fc部分熔合的可變區(qū)。
具體情況下，多肽展示系統(tǒng)由核酸聚合酶的多肽組成，如耐熱的DNA聚合酶(如Taq聚合酶)的變化。
解折疊與重折疊可通過任何一種解折疊試劑將多肽(如展示多肽)解折疊。合適的解折疊試劑包括熱量或壓力，低pH或高pH，變性劑(如氫氯化胍，尿素等等)以及有機(jī)溶劑(如酒精(如，甲醇，乙醇)，酮(如甲基乙烷基酮)，醛(如甲醛，二甲基甲醛)，四氫呋喃，二氧雜環(huán)乙烷，甲苯等等)。某些具體情況下，使用解折疊試劑將展示多肽解折疊，附加條件為解折疊試劑不是變性劑。一般地，可將多肽集合導(dǎo)入一定數(shù)量的能導(dǎo)致集合中10％多肽解折疊的解折疊試劑(如熱量)中以實(shí)行解折疊。特殊情況下，可將多肽集合導(dǎo)入一定數(shù)量的能導(dǎo)致集合中至少20％或30％或40％或50％或60％或70％或80％或90％或95％或98％或99％或全部多肽解折疊的解折疊試劑(如熱量)中以實(shí)行解折疊。
實(shí)際情況中，全能文庫(kù)中的多肽應(yīng)有一系列融解溫度(Tm)。對(duì)于全能文庫(kù)來說，可通過從全能文庫(kù)中獲得10到100個(gè)多肽的隨機(jī)樣本及測(cè)定樣本中多肽的平均Tm值來得到Tm值。
優(yōu)選地，將多肽展示系統(tǒng)加熱到合適的解折疊溫度(Ts)(如能使得至少10％的展示多肽解折疊的溫度)實(shí)現(xiàn)展示多肽解折疊?？赏ㄟ^任何一種合適的方法很容易地測(cè)得能使所需要的百分比的展示多肽解折疊的溫度，比如參照解折疊或重折疊曲線(如這里所述)。當(dāng)需要將所有展示多肽解折疊時(shí)，降到多肽系統(tǒng)的解折疊及重折疊曲線中的解折疊部分之間的最低溫度一般來說是足夠的。選擇的溫度將依賴于展示系統(tǒng)的耐熱能力。例如，如果展示多肽或多肽變體來自于嗜熱或極端嗜熱生物(如水生嗜熱微生物)，可使用100℃或更高的解折疊溫度。當(dāng)加熱實(shí)現(xiàn)多肽解折疊時(shí)，一般地說可通過至少加熱到被篩選多肽的Tm或高于到被篩選多肽的Tm的溫度實(shí)現(xiàn)多肽解折疊。
在一些實(shí)施方案中，可通過將多肽展示系統(tǒng)的溫度升高到介于25℃和100℃之間的解折疊溫度實(shí)現(xiàn)展示多肽解折疊。當(dāng)多肽展示系統(tǒng)是噬菌體展示時(shí)，通過將噬菌體展示系統(tǒng)的溫度升高到大約80℃展示多肽解折疊更合適。高溫(如100℃)下的解折疊展示的或可溶的多肽也是優(yōu)先且有優(yōu)點(diǎn)的。例如，通過加熱多肽展示或系統(tǒng)或可溶多肽到100℃，對(duì)高溫消毒的多肽進(jìn)行選擇，離析或消毒。
一旦得到需要的解折疊溫度，如果需要的話，多肽展示系統(tǒng)就可在一定溫度下維持一段時(shí)間(如大約10小時(shí))。例如，多肽展示系統(tǒng)可在解折疊溫度下維持100毫秒到10小時(shí)。特殊情況下，多肽展示系統(tǒng)可在解折疊溫度下維持1秒到20分鐘。
多肽展示系統(tǒng)的溫度可以任何合適的比率上升，例如以每毫秒1℃到每小時(shí)1℃的比率。特殊情況下，溫度以每分鐘1℃的比率上升。
在多肽展示系統(tǒng)中，解折疊多肽或解折疊多肽的一部分可通過降低系統(tǒng)中解折疊試劑的濃度實(shí)現(xiàn)重折疊。系統(tǒng)中解折疊試劑的濃度可通過任何一種方法降低，比如稀釋，透析，緩沖液交換，滴定或其他合適的方法。例如，熱量可通過冷卻到室溫或冷藏(如在冷藏室)來降低。例如，壓力可通過通風(fēng)來降低。
據(jù)介紹，在選擇之前只有一部分解折疊展示多肽重折疊。例如，當(dāng)解折疊試劑最低程度地減少時(shí)，可對(duì)高穩(wěn)定的可逆解折疊多肽進(jìn)行選擇，離析或恢復(fù)，以使得只有解折疊展示多肽的最穩(wěn)定的部分能重折疊。因此，可將多肽展示系統(tǒng)中解折疊試劑的數(shù)量或濃度降到重折疊所需的程度來實(shí)現(xiàn)重折疊。通過任何合適的方法，如參照解折疊及重折疊曲線(如這里所述)，可以很容易地測(cè)定保持在多肽展示系統(tǒng)中但允許所要百分?jǐn)?shù)的解折疊展示多肽重折疊的解折疊試劑的數(shù)量或濃度。當(dāng)所有解折疊展示多肽需要重折疊時(shí)，可將解折疊試劑的數(shù)量或濃度降到解折疊之前(如系統(tǒng)冷卻到室溫)多肽展示系統(tǒng)中的濃度或數(shù)量，或者將解折疊試劑全部移出。
一般地，可通過降低解折疊試劑(如熱量)的數(shù)量或濃度實(shí)現(xiàn)重折疊，使得至少大約0.00001％的解折疊多肽重折疊。特殊情況下，通過降低解折疊試劑(如熱量)的數(shù)量或濃度實(shí)現(xiàn)重折疊，使得多肽展示系統(tǒng)中至少大約0.0001％，或0.001％，或0.01％，或0.1％，或1％，或10％，或20％，或30％，或40％，或50％，或60％，或70％，或80％，或90％，或95％，或98％，或99％或所有經(jīng)歷重折疊的多肽重折疊。
就像這里描述的，熱量是最合適的解折疊試劑。在展示多肽加熱解折疊的情況下，可通過多肽展示系統(tǒng)的溫度降到重折疊溫度(Tc)(低于99℃高于多肽展示系統(tǒng)的冰點(diǎn))對(duì)展示解折疊多肽重折疊。和解折疊一樣，選擇的重折疊溫度依賴于展示多肽的耐熱能力。例如，如果展示多肽或多肽變體來自于嗜熱或極端嗜熱生物(如水生嗜熱微生物)，可使用100℃或更高的重折疊溫度。優(yōu)選地，解折疊溫度和重折疊溫度至少相差大約10到120℃。
在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽展示系統(tǒng)是一種噬菌體展示系統(tǒng)，可將系統(tǒng)加熱到大約80℃實(shí)現(xiàn)展示多肽解折疊，通過將噬菌體展示系統(tǒng)的溫度降到約1℃和70℃之間實(shí)現(xiàn)展示解折疊多肽重折疊。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，可通過將噬菌體展示系統(tǒng)的溫度降到約1到60℃之間，或1到50℃，或1到40℃，或1到30℃，或1到20℃之間，或1到10℃實(shí)現(xiàn)展示解折疊多肽重折疊。
一旦得到需要的重折疊溫度，如果需要的話，多肽展示系統(tǒng)就可在一定溫度下維持一段時(shí)間(如大約10小時(shí))。例如，多肽展示系統(tǒng)可在重折疊溫度下維持100毫秒到10小時(shí)。特殊情況下，多肽展示系統(tǒng)可在重折疊溫度下維持1秒到20分鐘。
多肽展示系統(tǒng)的溫度可以任何合適的比率下降，例如以大約每毫秒1℃到每小時(shí)1℃的比率。特殊情況下，溫度以大約每100毫秒1℃或每秒1℃的比率下降。
在展示多肽的解折疊與重折疊期間，多肽展示系統(tǒng)可在大氣壓(約1atm)下維持。然而，如果需要的話，多肽展示系統(tǒng)可在較低或較高的壓力下維持。這種情況下，需要或多或少的解折疊試劑來或得需要的解折疊程度。例如，因?yàn)榻档突蛏呦到y(tǒng)的壓力能改變系統(tǒng)的溫度，因此，需要供給多肽展示系統(tǒng)(相對(duì)于1atm)或多或少的熱量使達(dá)到需要的解折疊溫度。
解折疊與重折疊可在合適的pH值或緩沖液條件下實(shí)現(xiàn)。一般地，解折疊與重折疊在大約1到13或2到12的pH值下實(shí)現(xiàn)。對(duì)于解折疊和重折疊更合適的pH條件為pH值約5到9，或6到8，或7。酸性或堿性條件下折疊及解折疊多肽要考慮到極酸性或極堿性條件下起作用的多肽的選擇，比如服且在腹中起作用的多肽藥物。
選擇/離析/恢復(fù)通過任何合適的方法，從全能文庫(kù)或文庫(kù)(如多肽展示系統(tǒng))中選擇，離析或恢復(fù)可逆解折疊多肽(如一些可逆解折疊多肽)。通過選擇或離析多肽可對(duì)多肽進(jìn)行恢復(fù)。恢復(fù)可在合適的恢復(fù)溫度(Tr)下實(shí)現(xiàn)。一般地，合適的恢復(fù)溫度是任何低于多肽融解溫度(Tm)但高于多肽展示系統(tǒng)冰點(diǎn)的溫度。在一些實(shí)施方案中，恢復(fù)溫度(Tr)與重折疊溫度(Tc)完全相同(及Tr＝Tc)。
在一些實(shí)施方案中，以可選擇的區(qū)分正確折疊多肽與解折疊及錯(cuò)誤折疊多肽的特征(如物理特征，化學(xué)特征，功能化特征)為基礎(chǔ)選擇或離析可逆解折疊多肽。這種可選擇的特征包括熒光性，光敏性，化學(xué)修飾易感性(如碘代乙酸，碘代乙酸酐或其他合適的多肽修飾取代物)。優(yōu)選地，以合適的可選擇的區(qū)分正確折疊多肽與解折疊及錯(cuò)誤折疊多肽的功能性特征為基礎(chǔ)對(duì)可逆解折疊多肽進(jìn)行選擇，離析或恢復(fù)。對(duì)于選擇或離析可逆解折疊多肽來說，合適的功能化特征包括任何一種依賴于多肽的正確折疊的功能。因此，當(dāng)正確折疊時(shí)，可逆解折疊多肽有功能，但功能會(huì)因?yàn)榻庹郫B而失去或變小，并且當(dāng)多肽解折疊或錯(cuò)誤折疊時(shí)功能會(huì)失去或變小。合適的可選擇的功能性特征包括結(jié)合普通配體(如超抗原)，結(jié)合靶配體(如抗原，抗原決定基，底物)，結(jié)合抗體(如正確折疊的多肽上通過抗原決定基表達(dá))，催化活性及蛋白質(zhì)水解抗性。(見Tomlinson et al.，WO 99/20749；WO01/57065；WO 99/58655)在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，從文庫(kù)或所有可逆解折疊多肽共用一個(gè)共同的可選擇特征的多肽全能文庫(kù)中選擇或離析可逆折疊多肽。例如，可從文庫(kù)或多肽全能文庫(kù)中選擇可逆解折疊多肽，在多肽全能文庫(kù)中，所有可逆解折疊多肽結(jié)合共同的普通配體，結(jié)合共同的靶配體，結(jié)合(或被結(jié)合在)共同的抗體，占有共同的催化活性或每種蛋白質(zhì)水解抗性(如通過特定蛋白酶的蛋白質(zhì)水解)。以結(jié)合共同普通配體為基礎(chǔ)的選擇能產(chǎn)生大量含有最初文庫(kù)或全能文庫(kù)成分的所有可逆解折疊多肽的多肽。
任何一種合適的方法都可用于選擇，離析或恢復(fù)可逆解折疊多肽。例如，通過控制和使用合適的親和矩陣選擇，離析或恢復(fù)結(jié)合靶配體或普通配體的多肽(如蛋白質(zhì)A，蛋白質(zhì)L或抗體)。通過在合適的容器(如管子，培養(yǎng)皿)中添加配體(如普通配體，靶配體)溶液以及使得配體沉淀或包在容器壁上來完成。剩下的配體能被洗脫，多肽(如噬菌體展示文庫(kù))能被添加到容器及維持在適合多肽結(jié)合免疫球蛋白配體的條件下的容器中。自由多肽能被洗脫，結(jié)合多肽能通過任何合適的方法恢復(fù)，如刮掉或降低pH值。
合適的配體親和矩陣一般包括配體共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的固體支持物或床(如瓊脂糖)。在合適的多肽上的配體結(jié)合的條件下，親和矩陣可通過批次處理，柱處理或其他任何合適的處理與多肽(噬菌體展示文庫(kù))混合。沒有結(jié)合親和矩陣的多肽可被洗脫，結(jié)合的多肽可通過任何合適的方法洗提及恢復(fù)，如較低pH值的緩沖液洗提，適度變性溶液(如尿素)，或?yàn)榕c配體結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)的肽。
在一些實(shí)施方案中，普通配體或靶配體是抗體或抗原結(jié)合片段。結(jié)合多肽結(jié)構(gòu)特性的抗體或抗原結(jié)合片段作為普通配體有特殊的用途，其中多肽完整地保存在多肽文庫(kù)或全能文庫(kù)中。對(duì)于離析或選擇可逆解折疊多肽，適合作為配體使用的抗體和抗原結(jié)合片段可以是單克隆或多克隆，且可通過任何合適的方法制備。
可逆解折疊多肽也可通過與金屬離子鰲合選擇。例如，在許多蛋白質(zhì)裸露的表面，與其他與金屬鰲合的物質(zhì)一樣，固定化金屬親和層析(IMAC；Hubert and Porath，J.Chromotogaphy，98247(1980))利用組氨酸和半胱氨酸殘基的金屬鰲合特性。使用樹脂，瓊脂糖，構(gòu)成復(fù)合金屬離子的二價(jià)鰲合劑(如亞氨基乙酰乙酸，IDA，二羧酸)。這樣的樹脂很容易制備，許多這樣的樹脂可從商業(yè)途徑獲得，如CHEATING瓊脂糖凝膠6B(Pharmacia FineChemicals；Piscataway，NJ)。金屬離子包括但不僅僅包括二價(jià)陽(yáng)離子Ni2+，Cu2+，Zn2+及Co2+。由這項(xiàng)發(fā)明可以看出，在由0.1到1.0mM濃度的鹽(有代表性地，NaCl或KCl)和弱配體(如Tris，氨水)組成的鰲合緩沖液中可制備多肽全能文庫(kù)或文庫(kù)，弱配體對(duì)樹脂的金屬離子有親和力，但比選擇的多肽的程度更低。鰲合緩沖液中，弱配體的有用濃度范圍為0.01-0.1M。
在允許有金屬鰲合區(qū)的多肽鰲合的條件下，可將多肽全能文庫(kù)或文庫(kù)與樹脂聯(lián)系起來。非鰲合多肽可被洗脫，篩選出的多肽通過緩沖液洗提，其中弱配體存在于比鰲合緩沖液濃度高的濃度中，更明確地說，盡管對(duì)金屬離子鰲合親和力較低，選擇對(duì)于弱配體來說足夠取代篩選出的多肽的濃度。提取液中弱配體的有用濃度比鰲合緩沖液多10到50個(gè)折疊，主要從0.1到0.3M。提取液中的鹽濃度與鰲合緩沖液相等。通過該發(fā)明中的方法，樹脂的金屬離子主要作為普通配體起作用；然而，據(jù)預(yù)測(cè)他們也可作為靶配體使用。
利用標(biāo)準(zhǔn)層析儀器(如柱，緩沖液通過重力作用流過，通過真空吸入或加壓排出)或批次生產(chǎn)(其中帶有金屬的樹脂是混合物)及多肽全能文庫(kù)或文庫(kù)，可實(shí)現(xiàn)IMAC。
通過IMAC血清T4蛋白的部分純化已有描述(見et al.，U.S.Patent No.5,169,936)；然而，組成暴露在表面的金屬鰲合區(qū)的蛋白質(zhì)的主要光譜包含其他可溶T4蛋白，人源血清蛋白(如IgG，結(jié)合珠蛋白，血液結(jié)合素，Gc-球蛋白，Clq，C3，C4)，人外源凝集素，鋅指位點(diǎn)Tyr(P)磷酸酯酶，烯醇酶，羧肽酶，Cu，Zn過氧化物歧化酶(包括人以及其他真核細(xì)胞的所有這些物質(zhì))，核苷磷酸酯酶，白細(xì)胞干擾素，乳鐵傳遞蛋白，人血漿α2-SH糖蛋白，β2-巨球蛋白，α1-抗胰島素，血纖維蛋白溶酶原促酶劑，胃腸多肽，胃蛋白酶，人和牛的血清蛋白，粒性白細(xì)胞的顆粒蛋白，溶解酵素，非組蛋白的蛋白質(zhì)，人纖維蛋白原，人血清鐵傳遞蛋白，人源淋巴毒素，鈣結(jié)合蛋白，蛋白質(zhì)A，抗生物素蛋白，肌血球素，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素，人生長(zhǎng)激素，改變的生長(zhǎng)因子，血小板生長(zhǎng)因子，α-人促尿酸鈉排泄的多肽及其他。此外，膜蛋白序列的細(xì)胞外區(qū)域可通過IMAC純化。利用這里所說的方法，可以對(duì)可逆解折疊多肽以及由以上任何一種蛋白質(zhì)或金屬鰲合變化進(jìn)行選擇，離析或恢復(fù)。
以解折疊或重折疊的噬菌體的易傳染性或噬菌體展示多肽的集合為基礎(chǔ)，可從合適的噬菌體展示系統(tǒng)(或其他合適的多肽展示系統(tǒng))中篩選出可逆解折疊多肽。高濃度的展示多肽可通過多化合價(jià)的噬菌體蛋白(如絲狀細(xì)菌噬菌體的pIII蛋白)產(chǎn)生。展示多肽靠近噬菌體頂端，并且如果不可逆解折疊的話能相互作用形成集合體。當(dāng)噬菌體展示系統(tǒng)由足夠濃度下大量噬菌體顆粒組成時(shí)，這樣的集合體是在特定噬菌體上展示的多肽之間或在兩個(gè)或更多噬菌體上展示的多肽之間形成的噬菌體內(nèi)部集合體。因此，通過合適的方法(如離心(如超速離心))恢復(fù)沒有聚集的展示多肽或以展示多肽的功能或噬菌體傳染性為基礎(chǔ)進(jìn)行選擇，可從多化合價(jià)噬菌體展示系統(tǒng)中篩選出可逆解折疊多肽。
例如，當(dāng)加熱到合適溫度(如大約80℃)時(shí)展示多肽解折疊。然而，將絲狀噬菌體加熱到80℃時(shí)噬菌體的傳染性只稍微減少(Holliger et al.，J.Mol.Bìol.ZN8649-657(1999))。高濃度展示多肽可導(dǎo)致解折疊多肽集合以及充分減少噬菌體(可逆解折疊展示多肽)傳染性。例如，非可逆解折疊展示多肽噬菌體傳染性可按70個(gè)折疊或更多的降幅減少。然而，通過加熱(如80℃(相對(duì)于非展示多肽噬菌體傳染性加熱到80℃))將可逆解折疊展示多肽噬菌體的傳染性減少到更低的程度或完全不變。因此，在一些實(shí)施方案中，可通過多肽展示系統(tǒng)(如絲狀細(xì)菌噬菌體展示系統(tǒng))中合適的解折疊和重折疊多肽以及選擇傳染性未完全減少或完全不變的噬菌體來篩選可逆解折疊多肽。為了得到所要的性質(zhì)，篩選出的可逆解折疊多肽可進(jìn)一步篩選，如結(jié)合需要的抗原，催化活性等等。以傳染性為基礎(chǔ)的篩選也可用于制備文庫(kù)或者在可逆解折疊多肽或編碼可逆解折疊多肽的核酸中富集的全能文庫(kù)。
以沒有可逆解折疊的展示多肽噬菌體集合為基礎(chǔ)，也能從合適的噬菌體展示系統(tǒng)(或其他合適的多肽展示系統(tǒng))中篩選可逆解折疊多肽。例如，在至少一些沒有可逆解折疊的多肽聚集的條件下，合適的多肽展示系統(tǒng)能解折疊(通過加熱到大約80℃)及重折疊(通過冷卻)。聚集體的存在及程度可通過合適的方法(如電子顯微鏡或傳染性檢驗(yàn))測(cè)定?？衫煤线m的方法恢復(fù)沒有聚集的多肽(如在噬菌體上展示)來篩選可逆解折疊多肽，比如離心法(超速離心法)或感染合適的宿主菌(當(dāng)多肽在噬菌體上展示時(shí))。
能制備出其他多肽展示系統(tǒng)，包括多肽固定在固體支持物上的系統(tǒng)，其中沒有可逆解折疊的展示多肽能形成聚集體。一般地，這胚系統(tǒng)中的展示多肽彼此之間距離很近。例如，通過僅僅大約兩倍的多肽的線性氨基酸序列的長(zhǎng)度來分離展示多肽。通過不超過多肽中氨基酸殘基數(shù)與肽鍵長(zhǎng)度(3.8A)的兩倍相乘測(cè)定的距離來分離展示多肽。例如，通過不超過200A到300A來分離多肽。舉個(gè)特殊的例子，多肽含有100個(gè)氨基酸，且通過不超過760A分離。展示系統(tǒng)處在不超過兩個(gè)相鄰的相同球形多肽中心距離的位置。例如，通過C標(biāo)底物范圍兩個(gè)免疫可變區(qū)之間距離應(yīng)該不超過25A。
這樣的多肽展示系統(tǒng)可通過任何合適的方法制備。例如，就像聚集多肽的熔合蛋白(如二聚化或低聚化，聚集在病毒外殼)，可結(jié)合(見例子，WO 02/30945)或產(chǎn)生多肽。這樣的多肽展示系統(tǒng)也能通過合適的固體支持物(如珠，塑料，玻璃)上利用合適的方法固定的多肽制備。通過恢復(fù)用任何方法都不聚集的展示多肽，從這種多肽展示系統(tǒng)中篩選可逆解折疊多肽。例如，當(dāng)多肽在可移動(dòng)的固體支持物(如珠)上展示時(shí)，可形成珠間聚集或通過離心法或其他合適方法恢復(fù)。
一般地，多肽展示系統(tǒng)由大量多肽種類及多個(gè)多肽(多肽分子)組成。優(yōu)選地，每個(gè)多肽種類存在于足夠使可逆解折疊種類聚集的濃度中。例如，在多個(gè)展示多肽互相臨近協(xié)調(diào)定位的多肽展示系統(tǒng)中，如噬菌體展示，每個(gè)多肽種類存在于足夠高的使可逆解折疊種類聚集的濃度中。
在一些實(shí)施方案中，從多肽全能文庫(kù)中篩選結(jié)合配體或可逆解折疊多肽的過程包括提供多肽全能文庫(kù)構(gòu)成的多肽展示系統(tǒng)；將全能文庫(kù)加熱到一個(gè)至少一部分展示多肽解折疊的溫度(Ts)；全能文庫(kù)冷卻到一定溫度(Tc)(其中Ts＞Tc)，至少一部分多肽重折疊且一部分多肽聚集；在至少一個(gè)多肽可逆解折疊及結(jié)合配體的溫度(Tr)下恢復(fù)。優(yōu)選地，配體與折疊的多肽結(jié)合(結(jié)合)但不與聚集的多肽結(jié)合(不結(jié)合)。恢復(fù)后的可逆解折疊多肽有融解溫度(Tm)，優(yōu)選地，全能文庫(kù)加熱到Ts，冷卻到Tc，可逆解折疊多肽在Tr時(shí)離析，得Ts＞Tm＞Tc且Ts＞Tm＞Tr。優(yōu)選地，恢復(fù)后的多肽錯(cuò)誤折疊。在某種精選的區(qū)分正確折疊的多肽及解折疊與錯(cuò)誤折疊(如這里所述)的多肽的特征(如物理特征，化學(xué)特征，功能性特征)的基礎(chǔ)上可識(shí)別出錯(cuò)誤折疊的多肽。
在一些實(shí)施方案中，此過程進(jìn)一步包括確認(rèn)恢復(fù)后的多肽結(jié)合配體(如靶配體，普通配體)。此過程進(jìn)一步包括確認(rèn)恢復(fù)后的多肽的Tm值低于全能文庫(kù)加熱到的Ts值。通過合適的方法測(cè)定恢復(fù)后的多肽的Tm值(如通過循環(huán)二色性)，隨溫度增加多肽的熒光性的改變及微掃描熱量測(cè)定(DSC)。優(yōu)選地，當(dāng)接近總數(shù)時(shí)，恢復(fù)后的多肽Tm值等于或高于37℃，且偏向于高于37℃。某種具體情況下，恢復(fù)后的多肽的Tm值低于60℃。另一種具體情況下，恢復(fù)后的多肽Tm值高于37℃低于60℃。
在一些實(shí)施方案中，多肽在與Tc完全相等的溫度(即Tc＝Tr)下恢復(fù)。另一中具體情況中，Ts至少約為60℃。某些具體情況中，恢復(fù)后的多肽的Tm值低于60℃，且全能文庫(kù)加熱到高于60℃的溫度(Ts)。
在一些實(shí)施方案中，多肽展示系統(tǒng)構(gòu)成大量可復(fù)制的遺傳展示數(shù)據(jù)庫(kù)。優(yōu)選地，多肽展示系統(tǒng)是一種噬菌體展示系統(tǒng)，比如多化合價(jià)噬菌體展示系統(tǒng)。一些具體情況下，多肽展示系統(tǒng)，預(yù)選全能文庫(kù)或多肽文庫(kù)由至少約103個(gè)組分(種類)，或至少約104個(gè)組分，或至少約105個(gè)組分，或至少約106個(gè)組分，107個(gè)組分組成。具體情況下，提供噬菌體展示系統(tǒng)，且至少有一部分Tc下聚集的多肽形成噬菌體間聚集。
設(shè)計(jì)多肽的方法另外一方面，本發(fā)明是關(guān)于設(shè)計(jì)或制備不同的可逆折疊多肽的方法。這個(gè)方法包括提供親代多肽的氨基酸序列；鑒定一個(gè)或多個(gè)所謂的疏水氨基酸序列區(qū)域；選取一個(gè)或多個(gè)疏水區(qū)域；并且取代選擇區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)氨基酸以產(chǎn)生突變的氨基酸序列，往往這些被選擇取代的區(qū)域的疏水性會(huì)有所降低。一個(gè)包含突變氨基酸序列的多肽是可以合成出來的，并且在合成之后，可以通過合適的方法評(píng)定或是鑒定它的可逆折疊能力。實(shí)際上，突變體可以在這里所述的方法下，通過加熱或是冷卻以實(shí)現(xiàn)可逆的折疊。
一個(gè)突變的可逆折疊的多肽可以使用任何想要的親代多肽順序合成得到。例如一個(gè)可逆折疊的多肽可以用基于不同蛋白質(zhì)序列的親代多肽得到，這些親代蛋白質(zhì)序列可以是酶、蛋白A、蛋白L、纖維蛋白素、抗促成素的框架結(jié)構(gòu)序列，也可以是CTLA4蛋白的主結(jié)構(gòu)域序列，還可以是免疫球蛋白超家族中的多肽的序列，如抗體或是抗體片段。
當(dāng)親代多肽是一個(gè)抗體的可變結(jié)合域(如人的VH和VL結(jié)構(gòu)域)時(shí)，它包括V結(jié)構(gòu)域和D結(jié)構(gòu)域(即組成VH結(jié)構(gòu)域的多肽序列)及J結(jié)構(gòu)域片段序列，這些片段是由一連串的V、D、J基因的片段編碼的，也可以是自然突變的片段序列或是人工合成的突變片段(如活體誘變或其他過程)。例如，親代多肽可以是胚系基因編碼的含有突變氨基酸序列的親代免疫球蛋白的可變結(jié)構(gòu)域，或是通過插入或刪除V(D、J)片段的核苷酸(如嘌呤核苷酸或嘧啶核苷酸)而得到的重組片段，也可以是從有親緣關(guān)系的突變體中得到的突變片段。
同樣，親代多肽也可以是由胚系氨基酸序列基因編碼的親代酶蛋白，或是誘變或人工合成的突變體(如活體誘變)。
親代多肽的疏水區(qū)可通過使用合適的運(yùn)算法則來鑒定。實(shí)際中，疏水區(qū)的鑒定是使用Sweet和Eisenberg法則(Sweet，R.M.and Eisenberg，D.，J.Mol.Biol.171479-488(1983))。Sweet和Eisenberg法則可以使一個(gè)8到18個(gè)氨基酸片段(要鑒定疏水區(qū))產(chǎn)生一個(gè)疏水值(S/E值)，這個(gè)片段可以是9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個(gè)氨基酸。常常優(yōu)選15個(gè)氨基酸的片段。在一些具體的實(shí)際應(yīng)用中，親代氨基酸順序常用Sweet和Eisenberg法則分析，同時(shí)可以得到選擇性的疏水區(qū)的疏水性位點(diǎn)(縱坐標(biāo)是用合適的片段得到的S/E值的數(shù)值，橫坐標(biāo)是選定的疏水區(qū)的氨基酸的位置)。選定的疏水區(qū)中突變氨基酸序列是通過改變親代多肽中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸設(shè)計(jì)的，并且通過Sweet和Eisenberg法則分析。這樣一個(gè)含有突變氨基酸的疏水性位點(diǎn)就產(chǎn)生了。含有突變氨基酸的選定的疏水區(qū)的疏水性位點(diǎn)的曲線下的面積與相應(yīng)的親代氨基酸序列疏水區(qū)曲線下的面積的減少，顯示了選定的疏水性區(qū)域的減少。這里所述的突變的VH或VL的氨基酸序列包括一個(gè)或多個(gè)VH或VL中氨基酸的取代。同時(shí)，突變的VH或VL的氨基酸序列包括一個(gè)或多個(gè)框架結(jié)構(gòu)域。
在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，我們優(yōu)選設(shè)計(jì)、制備含有突變的抗體可變結(jié)構(gòu)域的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，含有突變的抗體可變結(jié)構(gòu)域就是可變的VH結(jié)構(gòu)域，在這個(gè)結(jié)構(gòu)域中，根據(jù)相應(yīng)的親代VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列，疏水性的22位到36位(Kabat氨基酸編號(hào)系統(tǒng))的氨基酸被刪除了。在一些實(shí)施方案中，含有突變的抗體可變結(jié)構(gòu)域就是另一個(gè)VH結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域是根據(jù)相應(yīng)的親代VH結(jié)構(gòu)域的H1嚕噗(H1嚕噗是根據(jù)AbM氨基酸編號(hào)系統(tǒng)定義的)而將疏水性的H1嚕噗刪除了。實(shí)際上，疏水性是通過一個(gè)VH結(jié)構(gòu)域的15個(gè)氨基酸片段用Sweet和Eisenberg法則確定的。在一些實(shí)施方案中，可變的VH結(jié)構(gòu)域中從22號(hào)氨基酸到36號(hào)氨基酸序列的S/E值的取值范圍為0.15或更少，0.1或更少，然后一位小數(shù)的變化到零，即0.09或更少、0.08或更少、0.07或更少、0.06或更少、0.05或更少、0.04或更少直至零。實(shí)際上，VH結(jié)構(gòu)域的H1嚕噗的S/E值為零或更少。
在一些實(shí)施方案中，含有突變的抗體可變結(jié)構(gòu)域就是可變的VL結(jié)構(gòu)域，并且FR2-CDR2結(jié)構(gòu)域和(或)FR3結(jié)構(gòu)域的疏水性位點(diǎn)根據(jù)親代VL結(jié)構(gòu)域中的FR2-CDR2結(jié)構(gòu)域(其中FR2-CDR2結(jié)構(gòu)域和FR3結(jié)構(gòu)域是根據(jù)Kabat氨基酸編號(hào)系統(tǒng)定義的)和(或)FR3結(jié)構(gòu)域進(jìn)行刪除突變。在一些實(shí)施方案中，含有突變的抗體可變結(jié)構(gòu)域也是可變的VL結(jié)構(gòu)域，并且疏水性氨基酸序列位點(diǎn)包括從44到53號(hào)位點(diǎn)和73到76號(hào)位點(diǎn)(Kabat氨基酸編號(hào)系統(tǒng))，根據(jù)相應(yīng)的親代VL結(jié)構(gòu)域中的氨基酸在這兩個(gè)片段中進(jìn)行刪除突變。實(shí)際上，疏水性位點(diǎn)通過VL結(jié)構(gòu)域中的11個(gè)氨基酸片段用Sweet和Eisenberg法則確定。在一些實(shí)施方案中，44到53號(hào)位點(diǎn)的氨基酸序列的S/E值低于0.23。例如，含有突變的VL結(jié)構(gòu)域中的44到53號(hào)位點(diǎn)的氨基酸序列的S/E值可以是低于0.2、低于0.17、低于0.15、低于0.13、低于0.10或低于-0.1。在一些實(shí)施方案中，含有突變的VL結(jié)構(gòu)域中的FR3結(jié)構(gòu)域的S/E值低于0.35。例如，含有突變的VL結(jié)構(gòu)域中的FR3結(jié)構(gòu)域的S/E值可低于0.25、低于0.2、低于0.17、低于0.15、低于0.13、低于0.10或低于-0.1。
一個(gè)突變的多肽包括突變的氨基酸序列和可逆的解折疊氨基酸序列，它可以通過合適的方法合成出來。例如，親代多肽的氨基酸序列可以進(jìn)行特定位點(diǎn)的改變(例如這里所述的關(guān)于抗體可變結(jié)構(gòu)多肽片段的突變操作)以產(chǎn)生突變的解折疊多肽。
文庫(kù)及全能文庫(kù)在其他方面，本發(fā)明涉及到可逆的解折疊多肽、可逆解折疊多肽文庫(kù)、建立這個(gè)文庫(kù)和全能文庫(kù)的方法。
這個(gè)文庫(kù)和全能文庫(kù)包括這里所述的，使用合適的可逆的解折疊方法得到可逆的解折疊多肽(和編碼可逆的解折疊多肽的核苷酸序列)。普遍說來，文庫(kù)中包含或是編碼大約低于1％的可逆解折疊多肽。為了是數(shù)據(jù)更適用，包含或是編碼可逆解折疊多肽的文庫(kù)通常會(huì)采用至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％等一系列數(shù)值。這里涉及的文庫(kù)通過可逆的解折疊多肽或是編碼可逆的解折疊多肽的核苷酸序列的信息得到強(qiáng)化。好的文庫(kù)及全能文庫(kù)應(yīng)該包括加熱狀態(tài)下的可逆解折疊多肽。實(shí)際上，本發(fā)明的文庫(kù)包含在其他宿主中可以復(fù)制的異種核苷酸，例如包含有編碼多肽的核苷酸序列的復(fù)制重組載體——E.coli。
編碼或是包括解折疊多肽的文庫(kù)可以通過任何合適的方法得到。本發(fā)明的文庫(kù)可用于設(shè)計(jì)編碼一個(gè)感興趣的多肽(如從文庫(kù)中選出的一個(gè)多肽)，或是用這里所述的方法從另一個(gè)文庫(kù)中進(jìn)行選擇。例如，可逆的解折疊多肽強(qiáng)化文庫(kù)可以通過使用合適的多肽展示系統(tǒng)來制備。
在一個(gè)例子中，一個(gè)包含抗體可變結(jié)構(gòu)域(如VH，Vκ，Vλ結(jié)構(gòu)域)的多肽展示文庫(kù)的噬菌體展示庫(kù)用這里所述的方法打開折疊和重新折疊，收集的噬菌體展示庫(kù)產(chǎn)生的重新折疊的多肽數(shù)據(jù)可以產(chǎn)生富含可逆的解折疊多肽的文庫(kù)。在另外一個(gè)例子中，優(yōu)選篩選包含抗體可變結(jié)構(gòu)域(如VH，Vκ，Vλ結(jié)構(gòu)域)的被展示的多肽噬菌體展示庫(kù)，用于鑒定與想要的目標(biāo)抗原結(jié)合的多肽文庫(kù)中的多肽數(shù)目。收集特異結(jié)合的多肽，并進(jìn)行打開折疊與重新折疊的操作，這樣即可得到一個(gè)有特點(diǎn)結(jié)合性的可逆的解折疊多肽的文庫(kù)，這個(gè)文庫(kù)富含可逆的解折疊多肽。
在另外一個(gè)例子中，選擇(如從文庫(kù)中選擇)感興趣的多肽(如免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域)，并且通過氨基酸序列分析以確定這個(gè)多肽的疏水性。疏水性可以用任何合適的方法、數(shù)值范圍、運(yùn)算法則確定。實(shí)際中，疏水性通過Sweet和Eisenberg法則(Sweet，R.M.and Eisenberg，D.，J.Mol.Biol.171479-488(1983))來確定。選擇一個(gè)多肽的疏水性區(qū)域，制備出含有多樣性的目標(biāo)多肽的疏水區(qū)域的核苷酸序列。制備的核苷酸序列可以是隨即突變的目標(biāo)區(qū)域的氨基酸相應(yīng)的序列，也可以是包含編碼多肽的選擇性疏水區(qū)域的刪除突變多樣性序列(通過氨基酸替換得到)。獲得的核苷酸序列可被插入載體(如噬菌體、質(zhì)粒)當(dāng)中用于產(chǎn)生文庫(kù)。這個(gè)文庫(kù)可以在合適的多肽展示系統(tǒng)中獲得表達(dá)，多肽可以進(jìn)行解折疊和重折疊，獲得的可逆的解折疊多肽可以被選擇或是根據(jù)這里所述的方法用于富含可逆的解折疊多肽文庫(kù)數(shù)據(jù)。
當(dāng)感興趣的多肽文庫(kù)建立后，它是一個(gè)多樣的目標(biāo)序列的疏水性區(qū)域的解折疊多肽疏水區(qū)相關(guān)的集合體。這個(gè)集合體是否傾向于疏水區(qū)，可以通過各種合適的方法確定。例如，疏水區(qū)的氨基酸可以被疏水性稍低的氨基酸取代(如Tyr被Asp或Glu取代)。獲得的多肽可以解折疊，集合體可以通過任何合適的方法鑒定。包括取代的氨基酸的減少的多肽集合體表明疏水區(qū)包含的取代氨基酸是傾向于疏水區(qū)的。
一個(gè)典型的多肽的全能文庫(kù)或文庫(kù)包括至少有一個(gè)氨基酸取代的VH結(jié)構(gòu)域(基于親代VH結(jié)構(gòu)域而由胚系VH結(jié)構(gòu)域基因片段組成)，這個(gè)氨基酸序列中應(yīng)包括22位到36位或26位到35位(均指Kabat氨基酸編號(hào)系統(tǒng))氨基酸序列的刪除。另一種典型的多肽的全能文庫(kù)或文庫(kù)應(yīng)包括VH結(jié)構(gòu)域，且其中的22位到36位(Kabat氨基酸編號(hào)系統(tǒng))具有0或者更小的S/E疏水值。實(shí)際上，全能文庫(kù)或文庫(kù)中約有1％的多肽的22位到36位具有0或者更小的S/E疏水值。為了更確切，常常使全能文庫(kù)或文庫(kù)中至少有10％、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％、或90％的多肽的22位到36位具有0或者更小的S/E疏水值。
另一種典型的多肽的全能文庫(kù)或文庫(kù)包括少有一個(gè)氨基酸取代的VL結(jié)構(gòu)域(基于親代VL結(jié)構(gòu)域而由胚系VL結(jié)構(gòu)域基因片段組成)，這個(gè)氨基酸序列中應(yīng)包括44位到53位(均指Kabat氨基酸編號(hào)系統(tǒng))氨基酸序列的刪除。另一種典型的多肽的全能文庫(kù)或文庫(kù)包括少有一個(gè)氨基酸取代的VL結(jié)構(gòu)域(基于親代VL結(jié)構(gòu)域而由胚系VL結(jié)構(gòu)域基因片段組成)的疏水氨基酸序列框架3(FR3)(Kabat氨基酸編號(hào)系統(tǒng))。其他全能文庫(kù)或文庫(kù)可以通過改變特定的抗體可變區(qū)所包含的氨基酸序列而得到。
一個(gè)文庫(kù)或全能文庫(kù)可以建立在可逆的解折疊(如加熱)多肽的基礎(chǔ)上，這樣一個(gè)可逆的解折疊多肽可以是選定的或通過這里所述的方法設(shè)計(jì)的。大體說來，一個(gè)或是多個(gè)氨基酸序列或多肽中氨基酸的取代，常常會(huì)防止產(chǎn)生解折疊的多肽集合體不可逆的發(fā)生。這樣的氨基酸被稱作折疊態(tài)“門護(hù)”(見例子，16-19部分)。折疊態(tài)“門護(hù)”可以被鑒定，例如通過矯正兩個(gè)或多個(gè)可逆的解折疊多肽的氨基酸序列和基于包括少量突變的必需氨基酸氨基酸序列(多肽框架氨基酸序列)可以鑒定折疊態(tài)“門護(hù)”。這樣的矯正過程可用于框架結(jié)構(gòu)中氨基酸序列取代物的鑒定，并常用于可逆的解折疊多肽的鑒定。一個(gè)基于框架結(jié)構(gòu)序列的但包含需要鑒定的氨基酸序列突變的多肽，可用于制備和鑒定可逆的解折疊態(tài)，以證明那些需要鑒定的氨基酸序列是所謂的折疊態(tài)“門護(hù)”。折疊態(tài)“門護(hù)”取代物同樣可以用于鑒定預(yù)期多肽，例如人的VH結(jié)構(gòu)域(見例子，16-19部分)。
文庫(kù)應(yīng)包括編碼可逆的解折疊多肽的核苷酸序列的集合或是解折疊多肽的集合，這些集合中的每一個(gè)多肽都包括一個(gè)正常的折疊態(tài)“門護(hù)”取代物(一個(gè)或多個(gè)折疊態(tài)“門護(hù)”取代物)。例如，如這里所述，可以制備一個(gè)包含突變核苷酸序列的編碼人的抗體可變區(qū)的集合體，在每一個(gè)編碼人的抗體可變區(qū)都有折疊態(tài)“門護(hù)”取代物。如果需要，文庫(kù)的成員可以在特定區(qū)域序列(如在CDRs區(qū)域)有不同的序列突變。在確定的具體過程中，文庫(kù)包括編碼抗體可變結(jié)構(gòu)域(如人的VH結(jié)構(gòu)域，人的VL結(jié)構(gòu)域)的氨基酸序列突變體的集合，同時(shí)這些抗體可變結(jié)構(gòu)域中包含有折疊態(tài)“門護(hù)”取代物。在一個(gè)具體過程中，文庫(kù)包括編碼VHS(人的VHS)的氨基酸序列突變體的集合，而VHS結(jié)構(gòu)域在CDR1，CDR1和CDR2，CDR1或CDR2包含有折疊態(tài)“門護(hù)”取代物。實(shí)際上，這些文庫(kù)中的編碼VHS的核苷酸序列包括不同的CDR3s(例如隨即突變的CDR3s)。
折疊態(tài)“門護(hù)”取代物可以用這里所述的方法或別的方法被設(shè)計(jì)加入CDR1或(和)CDR2中，并且編碼VHS的氨基酸序列包含這些折疊態(tài)“門護(hù)”取代物。VHS的可逆的解折疊態(tài)可由這里所述的方法或其他方法分離、篩選出來，并且編碼VH結(jié)構(gòu)域的CDR1或(和)CDR2的可逆解折疊態(tài)的核苷酸序列也可以得到，也可矯正其一個(gè)或多個(gè)編碼核苷酸序列，使之適合框架結(jié)構(gòu)域和CDR3。
在一些實(shí)施方案中，核苷酸序列文庫(kù)編碼可逆的解折疊多肽，并且每個(gè)文庫(kù)成員都編碼一個(gè)包括親代多肽氨基酸序列的多肽，這個(gè)多肽中至少有一個(gè)氨基酸取代物是被折疊態(tài)“門護(hù)”取代物替代了，或者是至少有一個(gè)別的氨基酸取代物被替換、增加或刪除。親代多肽可以是包括這里所述的框架結(jié)構(gòu)域的抗體可變結(jié)構(gòu)域。在特定操作中，親代多肽可以是人的VH結(jié)構(gòu)域并有折疊態(tài)“門護(hù)”引入CDR1。在一些實(shí)施方案中，親代多肽是人的VL結(jié)構(gòu)域并有折疊態(tài)“門護(hù)”引入FR2-CDR2結(jié)構(gòu)域。
在一些實(shí)施方案中，核苷酸序列文庫(kù)編碼可逆的解折疊的抗體可變結(jié)構(gòu)域。其中文庫(kù)的成員包括最初的核苷酸序列編碼CDR1，且隨即的序列編碼可逆的解折疊的抗體可變結(jié)構(gòu)域CDR2。這里所說的最初的核苷酸序列可通過技術(shù)操作連接到一個(gè)或多個(gè)其他核苷酸上，從而產(chǎn)生編碼抗體可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)序列，且這個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)中的CDR1和隨即的CDR2由所謂的最初核苷酸序列編碼。如果需要，文庫(kù)中的成員編碼的抗體可變結(jié)構(gòu)域中的CDR3可以進(jìn)行多樣性重組(如在特定位點(diǎn)的重組)或隨機(jī)重組(如越過整個(gè)CDR3序列或包含長(zhǎng)度變化的CDR3)。
編碼一個(gè)全部需要的多肽的文庫(kù)可以用任何合適的方法獲得。例如，一個(gè)編碼需要多肽(如聚合酶、免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域)的核苷酸序列可以得到，且在每一個(gè)核苷酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)突變的核苷酸序列集合體也可以制備。例如可以用傾向差錯(cuò)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增核苷酸序列，反應(yīng)中可引入化學(xué)誘變劑(Deng et al.J.Biol.Chem.，2699533(1994))或微生物誘變因子鏈(Low et al.J.Mol.Biol.，260359(1996))。
在一些實(shí)施方案中，核苷酸序列的特定區(qū)域可以有目的的進(jìn)行多樣性改變。誘變選擇性位點(diǎn)的方法在這項(xiàng)工作中是眾所周知的，例如可以通過使用或不使用PCR的方法實(shí)現(xiàn)寡核苷酸的錯(cuò)配或蛻變。例如合成的抗體文庫(kù)可通過特定的結(jié)合有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的抗原誘變而得到。隨機(jī)突變的或部分隨機(jī)突變的抗體H3和L3結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被連接到胚系免疫球蛋白V基因中，用于產(chǎn)生不使用框架結(jié)構(gòu)域誘變方法的大型文庫(kù)(Hoogenboom and Winter(1992)supra；Nissim et al.(19N)supra，Griffiis et al.(1994)supra；DeKruif et al.(1995)supra)。這種造成多樣性方法已經(jīng)被擴(kuò)展到其他一些或者說是全部的與結(jié)合有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的抗原相關(guān)的誘變中了(Crameri et at.(1996)Nature Med.，2100；Riechmann et al.(1995)Bio/Technolory，13475；Morphosys，WO 97/08320，supra)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過一種使用第一步的產(chǎn)物作為大引物的兩步PCR法(見例子Landt，O.etal.，Gene 96125-128(1990))得到多樣性的特定的核苷酸序列區(qū)域。目標(biāo)區(qū)域的多樣性可以通過許多方法得到，如SOE PCR法(見例子Horton，R.M.et al.，Gene 7761-68(1989))。
正如這里所述，選擇性位點(diǎn)的序列多樣性可通過改變編碼序列得到，這些多肽的編碼序列中有許多(大多是20個(gè)或少于20個(gè))成為一體的可突變的氨基酸序列。根據(jù)IUPAC命名法，最萬(wàn)能的密碼子是NNK，它可以編碼所以氨基酸，正如TAG作為終止密碼子一樣。NNK密碼子更適合用于引入需要的序列多樣性。其他具有相同結(jié)尾的密碼子，包括NNN密碼子，也可以使用，NNN密碼子可以引導(dǎo)產(chǎn)物終止于附加的終止密碼子TGA和TAA。這樣的目標(biāo)途徑可以使目標(biāo)區(qū)域的全部序列空間被發(fā)掘出來。
優(yōu)選的可逆的解折疊多肽文庫(kù)包括免疫球蛋白超家族(抗體或蛋白質(zhì))中的多肽成員。例如，文庫(kù)可包括可逆的解折疊抗體多肽和已知主鏈信息的抗體多肽(見例子Tomlinson et al.，WO99/20749)。
文庫(kù)可以通過合適的質(zhì)粒或載體制備。正如這里所用的方法，載體涉及將離散的核苷酸片段引入異種細(xì)胞的DNA中，以實(shí)現(xiàn)表達(dá)或復(fù)制。任何合適的載體都可以使用，包括質(zhì)粒(如細(xì)菌質(zhì)粒)、病毒載體、細(xì)菌噬菌體載體、人工染色體載體或質(zhì)體載體。這些載體可用于單克隆和誘變，同時(shí)表達(dá)載體可用于構(gòu)建表達(dá)文庫(kù)。載體通常有一個(gè)或多個(gè)克隆位點(diǎn)(如多接頭)，一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)和至少一個(gè)篩選標(biāo)記基因。表達(dá)載體往往還有與多肽轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)的一系列元件，如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、信號(hào)序列及其他類似的元件。這些元件可以通過基因操作連接到一起用于編碼多肽，當(dāng)表達(dá)載體再合適的條件下(如在合適的宿主細(xì)胞中)培養(yǎng)時(shí)，基因所表達(dá)的多肽就會(huì)表達(dá)出來。
克隆和表達(dá)載體通常可以使核苷酸序列在一個(gè)或多個(gè)宿主細(xì)胞中復(fù)制。特別在克隆載體中，這個(gè)核苷酸序列是一個(gè)能使宿主染色體NDA獨(dú)立自主復(fù)制的序列，且通常包含復(fù)制起始位點(diǎn)或自主復(fù)制序列。這樣的序列存在于不同的細(xì)菌、酵母及病毒中。質(zhì)粒pBR322中的復(fù)制起始位點(diǎn)適用于大多數(shù)革蘭氏陰性菌，而2micron質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)適用于酵母，多種多樣的濾過性病毒(如SV40病毒，腺病毒)的復(fù)制起始位點(diǎn)適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。通常復(fù)制起始位點(diǎn)不需要哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，除非是使用哺乳動(dòng)物表達(dá)載體時(shí)能得到高水平的DNA復(fù)制，如COS細(xì)胞。
克隆或表達(dá)載體包括選擇性基因，即所謂的選擇性標(biāo)記。這些選擇性基因表達(dá)的蛋白質(zhì)是宿主細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中存活或生長(zhǎng)所必需的。如果宿主細(xì)胞中沒有這些選擇性基因，那么它將不能在培養(yǎng)基上存活。典型的選擇性基因編碼的蛋白質(zhì)可以抵抗抗生素和其他毒素，如氨芐青霉素、新霉素、氨甲基喋呤或四環(huán)素，還可自主彌補(bǔ)宿主代謝缺陷，或是為宿主提供特定的但是在培養(yǎng)基中不存在的營(yíng)養(yǎng)成分。
合適的表達(dá)載體包括為數(shù)眾多的組成元件，如復(fù)制起始位點(diǎn)，選擇性標(biāo)記基因，一個(gè)或多個(gè)表達(dá)控制元件，其中表達(dá)控制元件包括轉(zhuǎn)錄控制元件(如起始子、增強(qiáng)子、終止子)和一個(gè)或多個(gè)翻譯控制元件，還有信號(hào)序列和引導(dǎo)序列等類似的序列。表達(dá)控制元件和信號(hào)或引導(dǎo)序列如果需要的話，可以由載體或其他來源提供。例如，編碼抗體鏈的基因克隆的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)控制元件可用于直接表達(dá)。
啟動(dòng)子可用于需要的宿主細(xì)胞的表達(dá)。啟動(dòng)子可以是組成型的或誘導(dǎo)型的。例如，啟動(dòng)子可以通過基因操作引入編碼抗體、抗體鏈或蛋白質(zhì)的核苷酸序列中，使其可直接指導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄。不同形式的適用于原核生物的(如適用于大腸桿菌的β-內(nèi)酰胺酶和乳糖酶的啟動(dòng)子系統(tǒng)、堿性磷酸酯酶啟動(dòng)子系統(tǒng)、色氨酸啟動(dòng)子系統(tǒng)、lac、tac、T3、T7啟動(dòng)子系統(tǒng))或真核生物的(如SV40早期或晚期啟動(dòng)子、Rous肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列啟動(dòng)子、細(xì)胞巨噬病毒啟動(dòng)子、腺病毒晚期啟動(dòng)子、EG-1a啟動(dòng)子)啟動(dòng)子是可以根據(jù)需要選用的。
另外，表達(dá)載體有篩選宿主細(xì)胞是否攜帶了載體的選擇性標(biāo)記，例如在表達(dá)載體中篩選原始載體和復(fù)制載體。產(chǎn)物是抗生素或毒物的抵抗物的基因常常是選擇性標(biāo)記，并常用于原核(具有氨芐青霉素抗性的β-內(nèi)酰胺酶基因、具有四環(huán)素抗性的Tet基因)和真核(抗新霉素的基因、抗氨芐青霉素的基因)表達(dá)細(xì)胞中。二氫葉酸還原酶基因可以在載體中用氨甲基喋呤實(shí)現(xiàn)篩選。宿主細(xì)胞中的營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因(如LEU2、URA2、HIS3)通常用在酵母中作為篩選基因。在使用病毒或噬菌體載體，或者載體可整合到宿主染色體中時(shí)，慢性病毒載體常常是考慮的對(duì)象。
適用于原核(如類如大腸桿菌的細(xì)菌)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體通常有pET載體(如pET.pET-12a，pET-36，pET-37，pET-39，pET-40，由Novagen及其他公司生產(chǎn))，噬菌體載體(如pCANTAB 5E，Pharmacia公司生產(chǎn))，pRIT2T(融合蛋白載體，Pharmacia公司生產(chǎn))，pCDM8，pCDNA1.1/amp，pcDNA3.1，pRc/RSV，pEF-1(Invitrogen，Carlsbad，CA生產(chǎn))，pCMV-SCRIPT，pFB，pSG5，pXTI(Stratagene，La Jolla，CA生產(chǎn))，pCDEF3(Goldman，L.A.，et al.，Biotechniques，211013-1015(1996))，pSVSPORT(GibcoBRL，Rockville，MD)，pEF-Bos(Mizushima，S.，et al.，Nucleic Acids Res.，185322(1990))以及其他類似的載體。表達(dá)載體在多種表達(dá)宿主中都是可用的，例如原核細(xì)胞(大腸桿菌)、昆蟲細(xì)胞(果蠅S2細(xì)胞)、酵母(甲醇酵母、巴斯德酵母、釀酒酵母)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(COS細(xì)胞)。
優(yōu)選的表達(dá)載體應(yīng)該是可以表達(dá)相應(yīng)的多肽文庫(kù)成員的基因序列的載體。選擇性的種屬或目標(biāo)配合物可以通過單體培養(yǎng)或表達(dá)表達(dá)文庫(kù)中的多肽的單克隆獲得。如上所述，優(yōu)選的選擇性展示系統(tǒng)是細(xì)菌噬菌體展示系統(tǒng)，然而或許會(huì)選用噬菌體或噬粒系統(tǒng)。優(yōu)選的載體是噬菌粒載體，它包含有大腸桿菌的復(fù)制起始位點(diǎn)(可復(fù)制雙鏈DNA)和噬菌體復(fù)制起始位點(diǎn)(可復(fù)制單鏈DNA)。這些載體的相關(guān)操作和表達(dá)在這篇文章(Hoogenboom andWinter(1992)supra；Nissim et al.(1994)supra)中有詳細(xì)描述。簡(jiǎn)而言之，這個(gè)載體包括一個(gè)β-內(nèi)酰胺酶基因，用于選擇陽(yáng)性噬菌粒；還包括一個(gè)表達(dá)序列上游的lac啟動(dòng)子；另外，整個(gè)包括合適的引導(dǎo)序列(如pelB引導(dǎo)序列)、多克隆位點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)肽標(biāo)記位點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)TAG終止密碼子及噬菌體蛋白pIII基因。然而使用不同的有抑制物的或沒有抑制物的大腸桿菌菌株，此菌株培養(yǎng)時(shí)加入乳糖、IPTG或輔助噬菌體(如VCS M13)，載體可以實(shí)現(xiàn)復(fù)制而質(zhì)粒不表達(dá)，所以只產(chǎn)生大量的多肽文庫(kù)成員或產(chǎn)生噬菌體，這些噬菌體中有一些在其表面含有多肽-pIII蛋白的融合蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的文庫(kù)和全能文庫(kù)能包括抗體的各種形式。例如，文庫(kù)中的多肽可以是全長(zhǎng)的抗體或抗體片段，如Fab、F(ab)2、Fv、scFv片段和斷裂的VH或VL結(jié)構(gòu)域片段，還有一些其他未修飾或修飾的片段。scFv片段跟其他抗體多肽的片段一樣，可以通過任何合適的方法得到。許多合適的抗體制備的方法在這篇文章都以述及。例如，scFv片段可以通過合適的寡聚連接多肽(如(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3接頭或其他合適的接頭肽)將兩個(gè)編碼可變結(jié)構(gòu)域的基因序列連接起來得到。這個(gè)接頭橋肽連接了第一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的C-末端和第二個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的N-末端。類似的，可以構(gòu)建其他形式的抗體形式，如Fv、Fab、F(ab)2片段。構(gòu)建Fab和F(ab)2片段時(shí)，VH和VL結(jié)構(gòu)域多肽可通過不變結(jié)構(gòu)域片段連接起來，這可以從重排基因中分離得到，或從微生物C基因中得到，或是通過抗體序列數(shù)據(jù)直接合成得到。本發(fā)明所涉及的文庫(kù)或全能文庫(kù)是，VH或VL結(jié)構(gòu)域的文庫(kù)或全能文庫(kù)。
在一些實(shí)施方案中，文庫(kù)和全能文庫(kù)包括可逆的解折疊的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域(，VH和VL結(jié)構(gòu)域)。所需的結(jié)構(gòu)域可以以細(xì)菌基因序列(如DP47無(wú)意義區(qū)(SEQ ID NO3)，DPK9無(wú)意義區(qū)(SEQ ID NO6)為基礎(chǔ)得到，如果需要，還可在這些區(qū)域?qū)崿F(xiàn)突變，例如在互補(bǔ)決定區(qū)實(shí)現(xiàn)突變。
可變結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)框架結(jié)構(gòu)域(FR)包括(a)人的框架結(jié)構(gòu)域氨基酸序列，(b)至少8個(gè)與人的框架結(jié)構(gòu)域氨基酸序列相毗鄰的氨基酸，或者(c)重組于微生物基因組中的人的抗體基因片段編碼的氨基酸序列，這里所說的框架結(jié)構(gòu)域是由Kabat系統(tǒng)定義的。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)框架結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列正好是相應(yīng)的重組于微生物基因組中的人的抗體基因片段編碼的氨基酸序列，或者一個(gè)或多個(gè)所謂的框架結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列最多包含有5個(gè)不同的氨基酸，這些氨基酸不同于所謂的相應(yīng)的由重組于微生物基因組中的人的抗體基因片段編碼的氨基酸序列。
在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)R1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列與相應(yīng)的重組于微生物基因組中的人的抗體基因片段編碼的氨基酸序列是相同的，或者FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列最多包含有10個(gè)不同的氨基酸，這些氨基酸不同于所謂的相應(yīng)的由重組于微生物基因組中的人的抗體基因片段編碼的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)R1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列與所謂的相應(yīng)的由重組于微生物基因組中的人的抗體基因片段編碼的氨基酸序列是相同的。
包含可逆的解折疊可變結(jié)構(gòu)域的多肽常常包含一個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)和(或)一個(gè)種屬特異結(jié)合位點(diǎn)。具體表現(xiàn)是，種屬配體結(jié)合位點(diǎn)是一個(gè)超抗原(如蛋白A、蛋白L或蛋白G)結(jié)合位點(diǎn)。
合適的結(jié)構(gòu)域可以基于任何需要的可變結(jié)構(gòu)域得到，例如人的VH結(jié)構(gòu)域(如VH1a、VH1b、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6)或人的Vκ結(jié)構(gòu)域(如Vκ1、Vκ2、Vκ3、Vκ4、Vκ5、Vκ6、Vκ7、Vκ8、Vκ9、Vκ10)。實(shí)際上，可變結(jié)構(gòu)域并非Camelid免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，例如VHH結(jié)構(gòu)域，或是包含一個(gè)或多個(gè)Camelid免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域中的特殊氨基酸(框架結(jié)構(gòu)氨基酸)且不同于人的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域(見例子，Davies et al.，ProteinEngineering 9531-537(1996)；Tanha et al.，J.Biol.Chem.27624774-24780(2001)；Riechmann et al.，J.Immunol，Method-Y 2325-38(1999))。一個(gè)具體表現(xiàn)是，可逆的解折疊VH結(jié)構(gòu)域不包含一個(gè)或多個(gè)特殊的重組于微生物基因組中的鼠的抗體基因片段編碼的氨基酸。實(shí)際上，當(dāng)加熱或是冷卻時(shí)，這個(gè)可變結(jié)構(gòu)域是可逆的解折疊的。
包含可變結(jié)構(gòu)域的分離的多肽可以抗體形式存在。然而，特定的具體表現(xiàn)是，可逆的解折疊的包含可變結(jié)構(gòu)域的分離的多肽可以是一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的同型二聚體，如一個(gè)Fv片段、一個(gè)scFv片段、一個(gè)二硫鍵結(jié)合的Fv片段，一個(gè)Fab片段、一個(gè)單鏈可變結(jié)構(gòu)域或可變結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白Fc片段融合的蛋白。
多肽在一方面，本發(fā)明是關(guān)于一個(gè)獨(dú)立可逆的解折疊多肽。正如這里所述，這個(gè)多肽可以在大腸桿菌中表達(dá)，并且有高的產(chǎn)量。正如這里所述，在優(yōu)選的操作中，可逆的解折疊多肽(當(dāng)加熱時(shí))在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)是分泌型的，所以可以很容易的以可溶多肽的形式收集到。這種多肽在在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)被認(rèn)為是分泌型的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可逆的解折疊的多肽在大腸桿菌中分泌表達(dá)的量最少是0.5mg/L。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在大腸桿菌中表達(dá)的可逆的解折疊的多肽的量是至少約0.75mg/L，至少約1mg/L，至少約4mg/L，至少約5mg/L，至少約10mg/L，至少約15mg/L，至少約20mg/L，至少約a25mg/L，至少約30mg/L，至少約35mg/L，至少約40mg/L，至少約45mg/L，至少約50mg/L，至少約100mg/L，至少約200mg/L，至少約300mg/L，至少約400mg/L，至少約500mg/L，至少約600mg/L，至少約700mg/L，至少約800mg/L，a至少約900mg/L，至少約1g/L。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在大腸桿菌中表達(dá)可逆的解折疊的多肽的量從至少約1mg/L變化到至少約1g/L，從至少約1mg/L變化到至少約750mg/L，從至少約100mg/L變化到至少約1g/L，從至少約200mg/L變化到至少約1g/L，從至少約300mg/L變化到至少約1g/L，從至少約400mg/L變化到至少約1g/L，從至少約500mg/L變化到至少約1g/L，從至少約600mg/L變化到至少約1g/L，從至少約700mg/L變化到至少約1g/L，從至少約800mg/L變化到至少約1g/L，從至少約900mg/L變化到至少約1g/L。但是這里所述的蛋白可在大腸桿菌中以分泌形式表達(dá)出來，它們可以通過任何合適的方法制備，例如使用化學(xué)合成法或不借助大腸桿菌的生物學(xué)方法。在特定的優(yōu)選的實(shí)施方案中，可逆的解折疊多肽是人的抗體可變結(jié)構(gòu)域(VH和VL結(jié)構(gòu)域)或包含可逆的解折疊的人的抗體可變結(jié)構(gòu)域。
在一些實(shí)施方案中，可逆的解折疊多肽是親代多肽的變體，它含有不同于親代多肽的氨基酸序列(如發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、增加或刪除)，但還具體部分親代多肽的功能。實(shí)際上，可逆的解折疊的變體多肽具有親代多肽至少約25％的活性，至少約30％的活性，至少約40％的活性，至少約50％的活性，至少約60％的活性，至少約70％的活性，至少約80％的活性，至少約90％的活性，至少約95％的活性，或具有親代多肽的全部活性。例如，如果親代多肽是一種酶，變體多肽中含有不同于親代多酶的氨基酸序列(如如發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、增加或刪除)，但是仍保留親代酶的催化活性。實(shí)際上，可逆的解折疊的變體酶可通過催化速率常數(shù)來說明其特性，如它可以具有至少約25％的親代酶的催化速率常數(shù)。
可逆的解折疊突變多肽可根據(jù)任何需要的親代多肽制備。例如，可逆的解折疊多肽可以通過基于其他蛋白質(zhì)框架分析基礎(chǔ)上得到的親代多肽而制備，其中其他蛋白質(zhì)可以是酶、蛋白A、蛋白L、纖維蛋白素、抗促成素蛋白、CTL4的結(jié)構(gòu)域，或者是包括抗體或抗體片段在內(nèi)的免疫球蛋白超家族中的多肽。
親代多肽包括分別由重組的微生物V、D或J基因片段編碼的V、D(是包括VH結(jié)構(gòu)域的多肽的片段)或J片段，它還可以由自然突變或人工誘變(如活體誘變或其他方法)的基因序列編碼。例如，親代多肽可以是包含重組的微生物基因片段編碼的氨基酸序列的親代免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域，也可是由插入或刪除突變引起重組的V(D)、J基因片段(如嘌呤或嘧啶核苷酸的改變)編碼的親代多肽，或是由有性繁殖過程引起的重組的基因編碼的多肽。同樣，親代多肽可以是重組的微生物基因片段編碼的或由自然突變或人工誘變(如活體誘變)的基因序列編碼的親代酶。
可逆的解折疊突變多肽可通過任何合適的方法制備。例如，可以通過在特定位點(diǎn)(如這里所述的抗體可變結(jié)構(gòu)域多肽的特定位點(diǎn))改變親代多肽的氨基酸序列得到可逆的解折疊突變多肽。可逆的解折疊突變多肽還可通過其他方法制備，例如，通過提供編碼親代多肽的核苷酸序列，制備編碼突變親代多肽的核苷酸序列文庫(kù)(如使用易錯(cuò)PCR或其他合適的方法)，并使用合適的多肽展示系統(tǒng)表達(dá)這個(gè)文庫(kù)，即可得到突變的親代多肽。突變多肽可以可逆的解折疊，也能保留通過上面所述的方法或其他合適的方法制備的親代多肽的需要的功能。
包含V結(jié)構(gòu)域的可逆的解折疊多肽在優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的多肽包含一個(gè)可逆的解折疊的免疫球蛋白的可變結(jié)構(gòu)域(如VH結(jié)構(gòu)域、突變VH結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域或突變VL結(jié)構(gòu)域)。在特定的實(shí)施方案中，分離的多肽包含一個(gè)可逆的解折疊的突變VH結(jié)構(gòu)域或一個(gè)可逆的解折疊的突變VL結(jié)構(gòu)域。實(shí)際上，可逆的解折疊的可變結(jié)構(gòu)域(如VH結(jié)構(gòu)域、突變VH結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域或突變VL結(jié)構(gòu)域)以合適的分離常數(shù)(Kd)和解離常數(shù)(Koff)與靶配體結(jié)合。合適的分離常數(shù)Kd可以是從50nM到20pM的范圍或更少，例如Kd可以是約50nM，約1nM，約900pM，約800pM，約700pM，約600pM，約500pM，約400pM，約300pM，約200pM，約100pM，約20pM或更少。合適的解離常數(shù)Koff可以是從1×10-7s-1到1×10-1s-1或更少，例如Koff可以是約1×10-1s-1，約1×10-2S-1，約1×10-3s-1，約1×10-4s-1，約1×10-5s-1，約1×10-6S-1，約1×10-7s-1或更少。實(shí)際中，分離常數(shù)Kd和解離常數(shù)Koff可以通過基因組表面共振得到。
在特定的實(shí)施方案中，分離的多肽包含一個(gè)可逆的解折疊的VH結(jié)構(gòu)域(或突變VH結(jié)構(gòu)域)。在一些實(shí)施方案中，可逆的解折疊的突變VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與親代VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列是不相同的。突變VH結(jié)構(gòu)域在22到36位點(diǎn)中至少有一個(gè)氨基酸突變，或者是突變VH結(jié)構(gòu)域在親代VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的H1嚕噗中至少有一個(gè)氨基酸突變。VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸的位點(diǎn)、CDR結(jié)構(gòu)域(H1、H2、H3)及框架結(jié)構(gòu)域(FR1、FR2、FR3、FR4)可以用任何合適的系統(tǒng)定義，例如可用Kabat，Chothia或AbM系統(tǒng)定義。實(shí)際中，從22位點(diǎn)只到36位點(diǎn)均由Kabat氨基酸編號(hào)系統(tǒng)定義，H1是由AbM軟件(抗體分析和結(jié)構(gòu)模擬軟件，由Oxford Molecular提供)數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)定義。與親代VH結(jié)構(gòu)域相比，突變VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列包括從22到36位點(diǎn)中至少有一個(gè)氨基酸序列替換。
在特定的實(shí)施方案中，可逆的解折疊的突變VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在從22到36位點(diǎn)中至少有一個(gè)Pro或Gly氨基酸殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可逆的解折疊的突變VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在H1嚕噗中有至少一個(gè)Pro或Gly氨基酸殘基。在特定的實(shí)施方案中，與親代VH結(jié)構(gòu)域相比，可逆的解折疊的突變VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在從22到36位點(diǎn)中至少有一個(gè)Pro或Gly氨基酸殘基被取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與親代VH結(jié)構(gòu)域相比，可逆的解折疊的突變VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在H1嚕噗中有至少一個(gè)Pro或Gly氨基被取代。在特定的實(shí)施方案中，可逆的解折疊的突變VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在29位點(diǎn)發(fā)被Pro或Gly氨基酸殘基取代。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，與親代VH結(jié)構(gòu)域相比，可逆的解折疊的突變VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在從22到36位點(diǎn)中至少有一個(gè)氨基酸殘基被取代。這樣，與親代VH結(jié)構(gòu)域相比，突變的VH結(jié)構(gòu)域在從22到36位點(diǎn)的疏水性降低了。疏水性可以用任何合適的規(guī)則或法則來確定。實(shí)際中，疏水性由Sweet和Eisenberg法則確定，且發(fā)現(xiàn)與親代VH結(jié)構(gòu)域相比，突變的VH結(jié)構(gòu)域從22到36位點(diǎn)的氨基酸序列的S/E疏水值降低了。S/E法可以測(cè)定9到18個(gè)氨基酸片段的疏水值(如9、10、12、13、14、15、16、17、18個(gè)氨基酸的片段)。在實(shí)際中，常使用15個(gè)氨基酸的片段測(cè)定VH結(jié)構(gòu)域的S/E疏水值。
在特定的實(shí)施方案中，突變的VH結(jié)構(gòu)域在從22到36位點(diǎn)的氨基酸序列的S/E疏水值可以是0.15或更少，0.1或更少；然后以一位小數(shù)變化，可以是0.09或更少、0.08或更少、0.07或更少、0.06或更少、0.05或更少、0.04或更少。在優(yōu)選的實(shí)際操作中，突變的VH結(jié)構(gòu)域在從22到36位點(diǎn)的氨基酸序列的S/E疏水值可以是0.03或更少、0.02或更少、0.01或更少。在其他的優(yōu)選的實(shí)際操作中，突變的VH結(jié)構(gòu)域在從22到36位點(diǎn)的氨基酸序列的S/E疏水值可以是0或更少。
制備的由親代多肽的22到36位點(diǎn)發(fā)生突變的，且S/E疏水值減小的多肽由許多優(yōu)點(diǎn)。例如，22到36位點(diǎn)發(fā)生突變的S/E疏水值較低的多肽在表達(dá)系統(tǒng)(如細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng))中不會(huì)聚集且產(chǎn)量較高。VH結(jié)構(gòu)域在高蛋白濃度下具有抗凝聚的能力是因?yàn)槠溆休^低的S/E疏水值。而且，突變的VH結(jié)構(gòu)域在從22到36位點(diǎn)的氨基酸序列的S/E疏水值比親代多肽的S/E疏水值小時(shí)，它便具有較強(qiáng)的抗凝聚能力；而當(dāng)突變的VH結(jié)構(gòu)域的S/E疏水值降低至0或更小時(shí)，突變的VH結(jié)構(gòu)域即便在較高蛋白濃度(約200pM)下仍具有超強(qiáng)的抗凝聚能力。
在一些實(shí)施方案中，可逆的解折疊的突變VH結(jié)構(gòu)域在從22到36位點(diǎn)的氨基酸序列的S/E疏水值可以是0.15或更少，0.1或更少，0.09或更少、0.08或更少、0.07或更少、0.06或更少、0.05或更少、0.04或更少。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變的VH結(jié)構(gòu)域在從22到36位點(diǎn)的氨基酸序列的S/E疏水值可以是0.03或更少、0.02或更少、0.01或更少。在其他的優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變的VH結(jié)構(gòu)域在從22到36位點(diǎn)的氨基酸序列的S/E疏水值可以是0或更少。
在一些實(shí)施方案中，突變VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列不同于親代VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，它在H1嚕噗中有至少一個(gè)氨基酸發(fā)生突變。實(shí)際上，突變VH結(jié)構(gòu)域在H1嚕噗中至少有一個(gè)氨基酸發(fā)生了取代，因此突變VH結(jié)構(gòu)域中的H1嚕噗的疏水性比親代VH結(jié)構(gòu)域中的H1嚕噗的疏水性小。突變VH結(jié)構(gòu)域中的H1嚕噗的S/E疏水值是0或更少。
在一些實(shí)施方案中，可逆的解折疊突變VH結(jié)構(gòu)域包含H1嚕噗，它的S/E疏水值是0或更少。
在特定的具體例子中，可逆的解折疊VH結(jié)構(gòu)域(如突變VH結(jié)構(gòu)域)包含親代多肽的氨基酸取代序列，其在27、29、30、31、32、33、35位點(diǎn)被其他氨基酸取代的情況列于下表中。
可逆的解折疊VH結(jié)構(gòu)域(如突變VH結(jié)構(gòu)域)包含親代多肽的重組氨基酸取代序列，其取代情況列于表1中；且如果需要的話，可逆的解折疊VH結(jié)構(gòu)包含的親代多肽的重組氨基酸取代序列可以是在親代多肽的22到26位點(diǎn)，28位點(diǎn)和36位點(diǎn)(Kabat氨基酸編號(hào)系統(tǒng))。
在另外的特定的實(shí)施方案中，可逆的解折疊VH結(jié)構(gòu)域包含親代多肽的氨基酸取代序列，它在27位點(diǎn)被Asp或Glu取代；親代多肽在29位點(diǎn)被Asp，Glu，Pro或Gly取代；在32位點(diǎn)被Asp或Glu取代(以上編號(hào)均指Kabat氨基酸編號(hào)系統(tǒng)，下同)。在一些實(shí)施方案中，包含親代多肽的氨基酸取代序列的可逆的解折疊VH結(jié)構(gòu)域在27位點(diǎn)被Asp取代；在29位點(diǎn)被Asp，Pro或Gly取代；在32位點(diǎn)被Glu取代。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含親代多肽的氨基酸取代序列的可逆的解折疊VH結(jié)構(gòu)域在27位點(diǎn)被Asp取代；在32位點(diǎn)被Asp取代。如果需要，包含親代多肽的氨基酸取代序列的可逆的解折疊VH結(jié)構(gòu)域可在多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行取代，如22-26位點(diǎn)，28-31位點(diǎn)，33-36位點(diǎn)，以便將一個(gè)或多個(gè)類似區(qū)域的S/E疏水值，使其變?yōu)?或更小。
可變結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)框架結(jié)構(gòu)域(FR)包括(a)人的框架結(jié)構(gòu)域氨基酸序列，(b)至少8個(gè)與人的框架結(jié)構(gòu)域氨基酸序列相毗鄰的氨基酸，或者(c)重組于微生物基因組中的人的抗體基因片段編碼的氨基酸序列，這里所說的框架結(jié)構(gòu)域是由Kabat系統(tǒng)定義的。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)框架結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列正好是相應(yīng)的重組于微生物基因組中的人的抗體基因片段編碼的氨基酸序列，或者一個(gè)或多個(gè)所謂的框架結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列最多包含有5個(gè)不同的氨基酸，這些氨基酸不同于所謂的相應(yīng)的由重組于微生物基因組中的人的抗體基因片段編碼的氨基酸序列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)R1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列與相應(yīng)的重組于微生物基因組中的人的抗體基因片段編碼的氨基酸序列是相同的，或者FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列最多包含有10個(gè)不同的氨基酸，這些氨基酸不同于所謂的相應(yīng)的由重組于微生物基因組中的人的抗體基因片段編碼的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)R1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列與所謂的相應(yīng)的由重組于微生物基因組中的人的抗體基因片段編碼的氨基酸序列是相同的。例如，突變的VL結(jié)構(gòu)域可以是人的DP47無(wú)意義突變體(SEQ ID NO3)。
包含可逆的解折疊可變結(jié)構(gòu)域的多肽常常包含一個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)和(或)一個(gè)種屬特異結(jié)合位點(diǎn)。具體表現(xiàn)是，種屬配體結(jié)合位點(diǎn)是一個(gè)超抗原(如蛋白A、蛋白L或蛋白G)結(jié)合位點(diǎn)。
合適的結(jié)構(gòu)域可以基于任何需要的可變結(jié)構(gòu)域得到，例如人的VH結(jié)構(gòu)域(如VH1a、VH1b、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6)或人的Vκ結(jié)構(gòu)域(如Vκ1、Vκ2、Vκ3、Vκ4、Vκ5、Vκ6、Vκ7、Vκ8、Vκ9、Vκ10)。優(yōu)選地，可變結(jié)構(gòu)域并非Camelid免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，例如VHH結(jié)構(gòu)域，或是包含一個(gè)或多個(gè)Camelid免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域中的特殊氨基酸(框架結(jié)構(gòu)氨基酸)且不同于人的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域(見例子，Davies et al.，ProteinEngineering 9531-537(1996)；Tanha et al.，J.Biol.Chem.27624774-24780(2001)；Riechmann et al.，J.Immunol，Method-Y 2325-38(1999))。一個(gè)實(shí)施方案是，可逆的解折疊VH結(jié)構(gòu)域不包含一個(gè)或多個(gè)特殊的重組于微生物基因組中的鼠的抗體基因片段編碼的氨基酸。優(yōu)選地，當(dāng)加熱或是冷卻時(shí)，這個(gè)可變結(jié)構(gòu)域是可逆的解折疊的。
包含可變結(jié)構(gòu)域的分離的多肽可以抗體形式存在。然而，特定的具體表現(xiàn)是，可逆的解折疊的包含可變結(jié)構(gòu)域的分離的多肽可以是一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的同型二聚體，如一個(gè)Fv片段、一個(gè)scFv片段、一個(gè)二硫鍵結(jié)合的Fv片段，一個(gè)Fab片段、一個(gè)單鏈可變結(jié)構(gòu)域或可變結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白Fc片段融合的蛋白。
本發(fā)明同樣涉及包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL結(jié)構(gòu)域)的獨(dú)立的可逆解折疊多肽。在一個(gè)具體例子中，包含可逆解折疊的VL結(jié)構(gòu)域的分離的多肽，在從44到53位點(diǎn)有低于0.23的S/E疏水值的氨基酸序列。在其他具體例子中，44到53位點(diǎn)的S/E疏水值可低于0.2，低于0.17，低于0.15，低于0.13，低于0.10，或者低于-0.1，還可更低。S/E疏水值法適用于9到18個(gè)氨基酸大小的片段(即有9、10、11、12、13、14、15、16、17、18個(gè)氨基酸的片段)。11個(gè)氨基酸大小的片段正適合VL結(jié)構(gòu)域。VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸的位點(diǎn)、CDR結(jié)構(gòu)域(L1、L2、L3)及框架結(jié)構(gòu)域(FR1、FR2、FR3、FR4)可以用任何合適的系統(tǒng)定義，例如可用Kabat，Chothia或AbM系統(tǒng)定義。實(shí)際中，VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸的位點(diǎn)、CDR結(jié)構(gòu)域及框架結(jié)構(gòu)域由Kabat編號(hào)系統(tǒng)定義。在另外的具體例子中，可逆的解折疊VL結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)FR3框架結(jié)構(gòu)域，其S/E疏水值低于0.35，同時(shí)FR3框架結(jié)構(gòu)域是由Kabat氨基酸編號(hào)系統(tǒng)定義的。在另外的具體例子中，F(xiàn)R3框架結(jié)構(gòu)域可的S/E疏水值可低于0.3，可低于0.25，可低于0.2，可低于0.17，可低于0.15，可低于0.13，可低于0.10，可低于-0.1或更低。
在特定的實(shí)施方案中，分離的多肽包括可逆的解折疊突變VL結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，可逆的解折疊突變VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列不同于親代VL結(jié)構(gòu)域，它在從44到53位點(diǎn)中至少由一個(gè)氨基酸突變。由于相對(duì)于親代多肽，可逆的解折疊突變VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在44到53位點(diǎn)中至少有一個(gè)氨基酸發(fā)生取代，所以其44到53位點(diǎn)的S/E疏水值可低于0.23。相對(duì)于親代多肽，可逆的解折疊突變VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在44到53位點(diǎn)中任何地方發(fā)生至少一個(gè)氨基酸取代。在其他的實(shí)施方案中，可逆的解折疊突變VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列不同于親代VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，它在突變VL結(jié)構(gòu)域的FR3框架結(jié)構(gòu)域中有至少一個(gè)氨基酸取代。在這些具體例子中，包含F(xiàn)R3框架結(jié)構(gòu)域的突變VL結(jié)構(gòu)域含有親代FR3框架結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，但其中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代，因此其S/E疏水值低于0.35。
在另外的實(shí)施方案中，可逆的解折疊突變VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列不同于親代VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，它在突變VL結(jié)構(gòu)域的FR3框架結(jié)構(gòu)域中有至少一個(gè)氨基酸取代，由于包含F(xiàn)R3框架結(jié)構(gòu)域的突變VL結(jié)構(gòu)域含有親代FR3框架結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列且其中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代，因此FR3框架結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的S/E疏水值低于0.35。例如，可逆的解折疊突變VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列不同于親代VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，它在突變VL結(jié)構(gòu)域的73到76位點(diǎn)有至少一個(gè)氨基酸突變，因此突變VL結(jié)構(gòu)域的73到76位點(diǎn)由于至少有氨基酸序列的取代，其S/E疏水值比包含F(xiàn)R3框架結(jié)構(gòu)域的突變VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列低0.35。
在特定的實(shí)施方案中，包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代物的可逆的解折疊突變VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸取代情況列于表2中，其取代位點(diǎn)可以是10、13、20、23、26、27、29、31、32、35、36、39、40、42、45、46、47、48、49、50、57、59、60、68、75、79、80、83、89、90、92位點(diǎn)(Kabat氨基酸編號(hào)系統(tǒng))。例如，當(dāng)可逆的解折疊的獨(dú)立VL結(jié)構(gòu)域是突變VL結(jié)構(gòu)域時(shí)，它可以是包括一個(gè)或多個(gè)不同于親代氨基酸的氨基酸序列，其取代位點(diǎn)可以是表2中所列的位點(diǎn)10、13、20、23、26、27、29、31、32、35、36、39、40、42、45、46、47、48、49、50、57、59、60、68、75、79、80、83、89、90、92位點(diǎn)(Kabat氨基酸編號(hào)系統(tǒng))。
可逆解折疊的VL或VL變體的氨基酸序列可由表2中列出的任何一種氨基酸或氨基酸混合物置換組成，如果需要的話，可通過在26號(hào)親本位與Asn或在89號(hào)親本位與Arg氨基酸殘基置換進(jìn)一步區(qū)分親本VL(Kabat計(jì)數(shù))。
在具體實(shí)施方案中，可逆解折疊的VL變體由氨基酸序列組成，其中45號(hào)位親本氨基酸殘基被Glu，Asp，Gln，Pro，Asn，His或Thr取代；48號(hào)位親本氨基酸殘基被Asn，Pro，Asp，Thr，Gly或Val取代；49號(hào)位親本氨基酸殘基被Asn，Asp，Ser，Cys，Glu，Gly，Lys或Arg取代；50號(hào)位親本氨基酸殘基被Pro，Asp，Asn，Glu或Arg取代；75號(hào)位親本氨基酸殘基被Asn或Met取代(Kabat計(jì)數(shù))。
其他特殊實(shí)施方案中，可逆解折疊的VL或VL變體由含有表2所列的一個(gè)氨基酸置換的氨基酸序列構(gòu)成，且有如下的氨基酸序列Gly在31號(hào)位，Asn在49號(hào)位；Ser在32號(hào)位，Asn在75號(hào)位；Ser在40號(hào)位，Asp在49號(hào)位；Arg在39號(hào)位，Asn在49號(hào)位；Glu在45號(hào)位，Asn在75號(hào)位；Pro在46號(hào)位，Asp在50號(hào)位；Asn在26號(hào)位，Thr在42號(hào)位，Asp在50號(hào)位；
Phe在32號(hào)位，Glu在45號(hào)位，Glu在57號(hào)位；Asp在49號(hào)位，Ala在80號(hào)位，Arg在89號(hào)位；Asn在49號(hào)位，Glu在在68號(hào)位，Arg79號(hào)位；Ser在20號(hào)位，Trp在23號(hào)位，Phe在46號(hào)位，Asn在49號(hào)位；Val在29號(hào)位，Asn在42位，Glu在45號(hào)位，Leu在83號(hào)位，His在92號(hào)位；Thr在35號(hào)位，Pro在90號(hào)位，；Asp在45號(hào)位，Pro在60號(hào)位；Arg在49號(hào)位，Phe在10號(hào)位；Ser在49號(hào)位，Ala在20號(hào)位；Ser在49號(hào)位，Arg在27號(hào)位；Pro在50號(hào)位，Val在48號(hào)位；Arg在50號(hào)位，Gly在13號(hào)位，Glu在42號(hào)位。這里所有的編號(hào)均是依據(jù)Kabat氨基酸編號(hào)系統(tǒng)某些實(shí)施方案中，可逆解折疊的VL變體的氨基酸序列由一個(gè)從44號(hào)位到53號(hào)位的Pro或Gly置換或在FR3(如從73號(hào)位到76號(hào)位)相對(duì)于親本VL氨基酸序列構(gòu)成。在一些實(shí)施方案中，VL變體的氨基酸序列由45、48及50號(hào)位Pro組成。
可逆解折疊的VL或VL變體的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域包括(a)人源結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，(b)人源結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的至少8個(gè)連續(xù)氨基酸，(c)人源細(xì)菌胚系抗體基因片段編碼的氨基酸序列，其中所說的結(jié)構(gòu)域是Kabat定義的。某些具體情況下，一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與人源細(xì)菌胚系抗體基因片段編碼的相關(guān)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列相同，或者說相對(duì)于相應(yīng)的人源細(xì)菌胚系抗體基因片段編碼的結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列形成5個(gè)氨基酸的差異。
在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)R1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3及FR4的氨基酸序列與相應(yīng)的人源細(xì)菌胚系抗體基因片段編碼的結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同，或者說相對(duì)于相應(yīng)的人源細(xì)菌胚系抗體基因片段編碼的結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3及FR4的氨基酸序列有10個(gè)氨基酸的差異。另外，F(xiàn)R1，F(xiàn)R2及FR3的氨基酸序列與相應(yīng)的人源細(xì)菌胚系抗體基因片段編碼的結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同。例如，突變的VL結(jié)構(gòu)域可以是人的DPK9的無(wú)意義突變。
基于想要的親代多肽的突變VL結(jié)構(gòu)域，例如人源Vλ(如，VλI，VλII，VλIII，VλIV，VλV，VλVI)或人源VК(如，VК1，VК2，VК3，VК4，VК5，VК6，VК7，VК8，VК9 or VК10)。優(yōu)選地，可變區(qū)不是camelid免疫球蛋白區(qū)，比如VHH，或者說包含一個(gè)或更多氨基酸(如，氨基酸結(jié)構(gòu))，它僅與細(xì)菌線性序列編碼的camelid免疫球蛋白可變區(qū)有關(guān)，而與人源免疫球蛋白可變區(qū)無(wú)關(guān)。(見，Davies et al.，Protein Engineering 9531-537(1996)；Tanha et al.，J.Riol，Chenz，276；24774-24780(2001)；Riechmannet al.，J.Immunol.Methods 2325-38(1999).)具體地，可逆解折疊的VH不是由與突變(如，鼠源)細(xì)菌線性結(jié)構(gòu)域有關(guān)的一個(gè)或更多氨基酸組成的。實(shí)際上，加熱時(shí)VL結(jié)構(gòu)域可以可逆的解折疊。
包含可逆的解折疊VL結(jié)構(gòu)域(如突變VL結(jié)構(gòu)域)的分離的多肽可以有抗體形式。然而，在具體的例子中，包含可逆的解折疊VL結(jié)構(gòu)域(如突變VL結(jié)構(gòu)域)的分離的多肽可以是一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的同型二聚體，如一個(gè)Fv片段、一個(gè)scFv片段、一個(gè)二硫鍵結(jié)合的Fv片段，一個(gè)Fab片段、一個(gè)單鏈可變結(jié)構(gòu)域或可變結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白Fc片段融合的蛋白。
包含融合的V結(jié)構(gòu)域的分離的多肽本發(fā)明也涉及包含免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域(VH和VL結(jié)構(gòu)域)的分離的多肽，這里所說的可變結(jié)構(gòu)域包括一個(gè)在CDR2和CDR3的半胱氨酸之間形成的二硫鍵，CDR2和CDR3均由Kabat氨基酸編號(hào)系統(tǒng)定義。在一些具體例子中，半胱氨酸殘基之間的二硫鍵可以在52a位和98位半胱氨酸之間形成，也可在51位和98位之間，或51位和100a位之間，這里的位置編號(hào)均是依據(jù)Kabat氨基酸編號(hào)系統(tǒng)。在另外的具體例子中，二硫鍵可以在51位半胱氨酸和CDR3中的半胱氨酸之間形成，也可在CDR2中的半胱氨酸和98位的半胱氨酸，這里所說的CDR2和CDR3及位點(diǎn)編號(hào)均是依據(jù)Kabat氨基酸編號(hào)系統(tǒng)。
包含可變結(jié)構(gòu)域的分離的多肽可以抗體形式存在。然而，特定的具體表現(xiàn)是，可逆的解折疊的包含可變結(jié)構(gòu)域的分離的多肽可以是一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的同型二聚體，如一個(gè)Fv片段、一個(gè)scFv片段、一個(gè)二硫鍵結(jié)合的Fv片段，一個(gè)Fab片段、一個(gè)單鏈可變結(jié)構(gòu)域或可變結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白Fc片段融合的蛋白。
核苷酸，宿主細(xì)胞和制備可逆解折疊的多肽的方法正如這里所述，本發(fā)明涉及由分離的或重組的核苷酸編碼的可逆解折疊多肽。
這里所涉及的“分離的”核苷酸是指在其初始環(huán)境下(如在胞內(nèi)或在培養(yǎng)基中的作為文庫(kù)的核苷酸序列)從其他材料中分離出來的核苷酸(如基因組DNA、cDNA或RNA)。一個(gè)分離的核苷酸序列可以是載體的一部分(如質(zhì)粒)。核苷酸序列可以通過生物法得到，也可通過化學(xué)法合成，或通過生物重組和化學(xué)法結(jié)合得到(如，半合成)。它可以通過任何合適的方法被分離出來。
這里提到的“重組核酸”是指通過重組DNA方法生產(chǎn)的核酸，包括依靠人工重組的方法，例如利用染色體及質(zhì)粒進(jìn)行無(wú)限擴(kuò)增，如限制性內(nèi)切梅、同源重組、病毒細(xì)胞等等。核酸的制備是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)完成的。重組核酸也指通過細(xì)胞自然反應(yīng)機(jī)制或細(xì)胞修飾作用(例如細(xì)胞修飾作用可產(chǎn)生一些合適的重組酶，如Cre等)整合入內(nèi)生或外生核酸片斷所產(chǎn)生的重組型核酸。當(dāng)介入宿主細(xì)胞后，重組核酸要經(jīng)過表達(dá)篩選以確保重組的有效性。例如一個(gè)功能性的重排人類抗體轉(zhuǎn)錄基因就是一種重組核酸。
本發(fā)明的核酸分子可用于生產(chǎn)抗體(例如人體抗體、人源化抗體、嵌合抗體及前面提到的抗原抗體結(jié)合片斷)，如嵌合有整合素aE或整合素aE鏈(CD 103)的抗體。就是說將一個(gè)能夠編碼本發(fā)明所述抗體的核酸整合入一個(gè)合適的結(jié)構(gòu)(例如一個(gè)表達(dá)載體)中以便進(jìn)一步調(diào)控其表達(dá)過程或插入合適的宿主細(xì)胞中生產(chǎn)此編碼多肽段。
同時(shí)，本發(fā)明提供了適于表達(dá)此抗體或抗原抗體結(jié)合片斷的表達(dá)結(jié)構(gòu)或表達(dá)載體。例如，將一個(gè)能夠編碼所需抗體全部或部分片斷的核酸插入一個(gè)合適的核酸載體(例如質(zhì)?；虿《炯?xì)胞)中，此載體在合適的生物體系(例如有復(fù)制子存在的環(huán)境下)中具有復(fù)制能力。多種載體具有此復(fù)制能力，包括單拷貝或多拷貝的質(zhì)粒及開始整合入宿主染色體細(xì)胞的質(zhì)粒。適合的表達(dá)基因包含多種成分，包括一個(gè)復(fù)制啟動(dòng)子基因、一個(gè)選擇性標(biāo)記基因、一個(gè)或多個(gè)表達(dá)控制因子例如轉(zhuǎn)錄控制因子(包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終結(jié)子等等)和一個(gè)或多個(gè)翻譯信號(hào)、一個(gè)信號(hào)序列或主導(dǎo)序列等等。前邊提到的表達(dá)控制因子和單個(gè)信號(hào)或主導(dǎo)序列可由載體或其他物質(zhì)提供，例如，一個(gè)可以編碼抗體的克隆核酸的轉(zhuǎn)錄及翻譯控制片斷可以用來指導(dǎo)表達(dá)過程。
另一方面，此發(fā)明也與重組宿主細(xì)胞及前面提到的生產(chǎn)折疊可逆性多肽的方法有關(guān)。具有折疊可逆性的多肽可通過多種方法獲得，例如，可通過表達(dá)一個(gè)或多個(gè)能夠編碼具有折疊可逆性多肽的核酸方法來獲得。這里所說的表達(dá)片斷可以插入合適的宿主細(xì)胞，并在適合此結(jié)構(gòu)表達(dá)的環(huán)境下培養(yǎng)(例如在細(xì)胞中、在動(dòng)物體內(nèi)、在植物體內(nèi))，獲得目的細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌細(xì)胞及其他適合的細(xì)菌細(xì)胞，也可以是真核細(xì)胞，包括真菌、酵母菌細(xì)胞(例如畢赤酵母、曲霉菌、釀酒酵母、裂殖酵母菌及粗糙脈胞菌)及其他低等真菌細(xì)胞，一些高級(jí)的真核細(xì)胞例如昆蟲細(xì)胞(如DrosophilaSchnieder S2細(xì)胞、Sf9昆蟲細(xì)胞(WO 94/26087(O′Connor))及哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如COS細(xì)胞，包括COS-1(ATCC Accession No.CRL-1650)and COS-7(ATCC Accession No.CRL-1651)，CHO(e.g.，ATCC Accession No.CRL-9096)，293(ATCC Accession No.CRL-1573)，HeLa細(xì)胞(ATCC Accession No.CCL-2)，CV1(ATCCAccession No.CCL-70)，WOP(Dailey，L.，et al.，J Virol.，54739-749(1985)，3T3，293T(Pear，W.S.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.，908392-8396(1993))NSO細(xì)胞，SP2/0，HuT 78細(xì)胞等等)，或者植物細(xì)胞(例如馬鈴薯細(xì)胞).(舉例參見Ausubel，F(xiàn).M.et al.，eds.Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Associates and John Wiley & amp；Sons Inc.(1993).)。
此項(xiàng)發(fā)明也與另外一種重組宿主細(xì)胞有關(guān)，該宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)重組核酸或包含能夠編碼折疊可逆性多肽的核酸的表達(dá)結(jié)構(gòu)。同時(shí)，此發(fā)明也包括制備折疊可逆性多肽的方法和如何維持此重組宿主細(xì)胞在一個(gè)合適的條件下完成此折疊可逆性多肽的表達(dá)。如有需要，此方法也可進(jìn)一步用于這種多肽的分離或回收過程。
例如，將一個(gè)可編碼具有折疊可逆性多肽的核酸分子(一個(gè)或多個(gè)核酸分子)或包含這種核酸分子的表達(dá)結(jié)構(gòu)(一個(gè)或多個(gè)表達(dá)結(jié)構(gòu))引入合適的宿主細(xì)胞中，在通過合適的篩選方法(例如轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)染、電穿孔及傳染等方法)篩選出重組宿主細(xì)胞，這樣一來，核酸分子就能可控的連接上一個(gè)或多個(gè)表達(dá)控制因子(例如，連接到一個(gè)載體中，或一個(gè)細(xì)胞加工過程產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)中，或整合入宿主細(xì)胞的基因中)。所產(chǎn)生的重組宿主細(xì)胞應(yīng)在一個(gè)適合其表達(dá)轉(zhuǎn)錄的環(huán)境下培養(yǎng)(例如在引發(fā)子之前、在一個(gè)合適的動(dòng)物體中、在一種合適的能夠供給細(xì)胞生長(zhǎng)所需鹽分、生長(zhǎng)因子、抗體及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基中等等)以編碼生成所需多肽。如果需要的話，這些編碼的多肽可以從動(dòng)物體內(nèi)、宿主細(xì)胞中、培養(yǎng)基內(nèi)及牛奶中分離出來并回收。這一過程包含著重組核酸在宿主細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)(參見WO 92/03918，GenPharm International)這里提到的折疊可逆性多肽也可在合適的體外表達(dá)系統(tǒng)通過化學(xué)聚合或其他適合的方法來生產(chǎn)。
具體而言，該發(fā)明不包括含有不定因素的多肽，例如包含由生殖細(xì)胞VH或生殖細(xì)胞VL基因片斷編碼的或組成的片斷或包含SEQ ID NOS7-60的片斷。
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GLN ILE VAL LEU THR GLN SER PRO ALA ILE MET SER ALASER PRO GLY GLU LYS VAL THR MET THR CYS SER ALA SERSER SER VAL SER TYR MET HIS TRP TYR GLN GLN LYS SERGLY THR SER PRO LYS ARG TRP ILE TYR ASP THR SER LYSLEU ALA SER GLY VAL PRO ALA ARG PHE SER GLY SER GLYSER GLY THR SER TYR SER LEU THR ILE SER SER MET GLUALA GLU ASP ALA ALA THR TYR TYR CYS GLN GLN TRP SERSER ASN PRO TYR THR PHE GLY GLY GLY THR LYS LEU GLUILE LYS SEQ ID NO10GLN ILE VAL LEU THR GLN SER PRO ALA ILE MET SER ALASER PRO GLY GLU LYS VAL THR MET THR CYS SER ALA SERSER SER VAL SER TYR MET HIS TRP TYR GLN GLN LYS SERGLY THR SER PRO LYS ARG TRP ILE TYR ASP THR SER LYSLEU ALA SER GLY VAL PRO ALA ARG PHE SER GLY SER GLYSER GLY THR SER TYR SER LEU THR ILE SER SER MET GLUALA GLU ASP ALA ALA THR TYR TYR CYS GLN GLN TRP SERSER ASN PRO TYR THR PHE GLY GLY GLY THR LYS LEU GLUILE LYSSEQ ID NO11
GLU ILE GLN LEU THR GLN SER PRO SER SER LEU SER ALASER LEU GLY GLU ARG VAL SER LEU THR CYS ARG THR SERGLN GLU ILE SER GLY TYR LEU SER TRP LEU GLN GLN LYSPRO ASP GLY THR ILE LYS ARG LEU ILE TYR ASP ALA THRLYS LEU ASP SER GLY ALA PRO LYS ARG PHE SER GLY SERARG SER GLY SER ASP TYR SER LEU THR ILE SER SER LEUGLU SER GLU ASP PHE ALA ASP TYR TYR CYS LEU GLN TYRALA SER PHE PRO ARG THR PHE GLY GLY GLY THR LYS LEUGLU ILE LYS ARG THR VAL ALA ALA PRO SER VAL PHE ILEPHE PRO PRO SER ASP GLU GLN LEU LYS SER GLY THR ALASER VAL VAL CYS LEU LEU ASN ASN PHE TYR PRO ARG GLUALA LYS VAL GLN TRP LYS VAL ASP ASN ALA LEU GLN SERGLY ASN SER GLN GLU SER VAL THR GLU GLN ASP SER LYSASP SER THR TYR SER LEU SER SER THR LEU THR LEU SERLYS ALA ASP TYR GLU LYS HIS LYS VAL TYR ALA CYS GLUVAL THR HIS GLN GLY LEU SER SER PRO VAL THR LYS SERPHE ASN ARG GLY GLU CYS SEQ ID NO12ASP ILE GLN MET THR GLN SER PRO SER SER LEU SER ALASER VAL GLY ASP ARG VAL THR ILE THR CYS GLN ALA SERGLN ASP ILE SER ASP TYR LEU ILE TRP TYR GLN GLN LYSLEU GLY LYS ALA PRO ASN LEU LEU ILE TYR ASP ALA SER
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GLN PRO GLU ASP ILE ALA THR TYR TYR CYS GLN GLN TYRASP ASP LEU PRO TYR THR PHE GLY GLN GLY THR LYS VALGLU ILE LYS ARG SEQ ID NO15ASP ILE GLN MET THR GLN SER PRO SER SER LEU SER ALASER VAL GLY ASP ARG VAL THR ILE THR CYS GLN ALA SERGLN ASP ILE SER ASP TYR LEU ILE TRP TYR GLN GLN LYSLEU GLY LYS ALA PRO ASN LEU LEU ILE TYR ASP ALA SERTHR LEU GLU THR GLY VAL PRO SER ARG PHE SER GLY SERGLY SER GLY THR GLU TYR THR PHE THR ILE SER SER LEUGLN PRO GLU ASP ILE ALA THR TYR TYR CYS GLN GLN TYRASP ASP LEU PRO TYR THR PHE GLY GLN GLY THR LYS VALSEQ ID NO16DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYSSEQ ID NO17DIVLTQAPPSLDVSQGRATISCRTSKSVRTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLNLCASNQVSRVPARFSGSGSGTDFTLKIHPVEEEDAATYFCQQSNENPSEQ ID NO18VIWMTQSPSLLSASTGDRVTISCRMSQGISSYLAWYQQKPGKAPELLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYCQQYYSFP
SEQ ID NO19AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNNYP SEQID NO20AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNNYP SEQID NO21DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPSEQ ID NO22DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPSEQ ID NO23DIQMIQSPSFLSASVGDRVSIICWASEGISSNLAWYLQKPGKSPKLFLYDAKDLHPGVSSRFSGRGSGTDFTLTIISLKPEDFAAYYCKQDFSYP SEQID NO24EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP SEQID NO25
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQGVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGPGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWH SEQID NO26EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCGASQSVSSSYLAWYQQKPGLAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPSEQ ID NO27QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPPSEQ ID NO28QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPSEQ ID NO29QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLWIYDTSNLVSGVPARFSGSRSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQYSGYPSSEQ ID NO30ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSSTSPKLWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSMEAEDVATYYCFQGSGYPLSEQ ID NO31QILLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYDTSNLASGFPARFSGSGSGTSYSLIISSMEAEDAATYYCHQRSSYP SEQID NO32
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMHWYQQKPGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSYPSEQ ID NO33DIQMTQSPASLSASVGETVTITCQASENIASDLAWYQKQGKSPQLLVYDARNLADGVPSRFSGSGSGTHYSLNIHSLQSEDVARYYCQHYYGTPSEQ ID NO34AQVLTQTESPVSAPVGGTVTINCQASQSVYDNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYDASKLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQGSYYSSGWY SEQ ID NO35AQGPTQTPS SVSAAVGGTVTINCQTSESFYSNNILSWYQQKPGQPPKLLIYDASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCQGSYHSSGWY SEQ ID NO36AAVLTQTPSPVSAAVGGTVTIKCQSSQSVYNNNLLSWYQQKPGQPPKLLIYDASNLASGVPDRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGGYDDDAD SEQ IDNO37AVVLTQTASPVSAAVGGTVTINCQASQSISTALAWYQQKPGQRPKLLIYDASKLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQQGYSSSSAD SEQ IDNO38GLU VAL LYS VAL ILE GLU SER GLY GLY GLY LEU VAL GLNPRO GLY GLY SER LEU LYS LEU SER CYS ALA ALA SER GLY
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ALA PRO GLY LYS GLY LEU GLU TRP ILE GLY GLU ILE HISPRO ASP SER GLY THR ILE ASN TYR THR PRO SER LEU LYSASP LYS PHE ILE ILE SER ARG ASP ASN ALA LYS ASN SERLEU TYR LEU GLN MET SER LYS VAL ARG SER GLU ASP THRALA LEU TYR TYR CYS ALA ARG LEU HIS TYR TYR GLY TYRASN ALA TYR TRP GLY GLN GLY THR LEU VAL THR VAL SERALA GLU SER ALA ARG ASN PRO THR ILE TYR PRO LEU THRLEU PRO PRO ALA LEU SER SER ASP PRO VAL ILE ILE GLYCYS LEU ILE HIS ASP TYR PHE PRO SER GLY THR MET ASNVAL THR TRP GLY LYS SER GLY LYS ASP ILE THR THR VALASN PHE PRO PRO ALA LEU ALA SER GLY GLY ARG TYR THRMET SER ASN GLN LEU THR LEU PRO ALA VAL GLU CYS PROGLU GLY GLU SER VAL LYS CYS SER VAL GLN HIS ASP SERASN PRO VAL GLN GLU LEU ASP VAL ASN CYS SER GLYSEQ ID NO41MET TYR ARG SER ALA PHE SER VAL GLY LEU GLU THR ARGVAL THR VAL PRO ASN VAL PRO ILE ARG PHE THR LYS ILEPHE TYR ASN GLN GLN ASN HIS TYR ASP GLY SER THR GLYLYS PHE TYR CYS ASN ILE PRO GLY LEU TYR TYR PHE SERTYR HIS ILE THR VAL TYR MET LYS ASP VAL LYS VAL SERLEU PHE LYS LYS ASP LYS ALA VAL LEU PHE THR TYR ASPGLN TYR GLN GLU LYS ASN VAL ASP GLN ALA SER GLY SER
VAL LEU LEU HIS LEU GLU VAL GLY ASP GLN VAL TRP LEUGLN VAL TYR GLY ASP GLY ASP HIS ASN GLY LEU TYR ALAASP ASN VAL ASN ASP SER THR PHE THR GLY PHE LEU LEUTYR HIS ASP THR ASN SEQ ID NO42MET TYR ARG SER ALA PHE SER VAL GLY LEU GLU THR ARGVAL THR VAL PRO ASN VAL PRO ILE ARG PHE THR LYS ILEPHE TYR ASN GLN GLN ASN HIS TYR ASP GLY SER THR GLYLYS PHE TYR CYS ASN ILE PRO GLY LEU TYR TYR PHE SERTYR HIS ILE THR VAL TYR MET LYS ASP VAL LYS VAL SERLEU PHE LYS LYS ASP LYS ALA VAL LEU PHE THR TYR ASPGLN TYR GLN GLU LYS ASN VAL ASP GLN ALA SER GLY SERVAL LEU LEU HIS LEU GLU VAL GLY ASP GLN VAL TRP LEUGLN VAL TYR GLY ASP GLY ASP HIS ASN GLY LEU TYR ALAASP ASN VAL ASN ASP SER THR PHE THR GLY PHE LEU LEUTYR HIS ASP THR ASN SEQ ID NO43MET TYR ARG SER ALA PHE SER VAL GLY LEU GLU THR ARGVAL THR VAL PRO ASN VAL PRO ILE ARG PHE THR LYS ILEPHE TYR ASN GLN GLN ASN HIS TYR ASP GLY SER THR GLYLYS PHE TYR CYS ASN ILE PRO GLY LEU TYR TYR PHE SERTYR HIS ILE THR VAL TYR MET LYS ASP VAL LYS VAL SER
LEU PHE LYS LYS ASP LYS ALA VAL LEU PHE THR TYR ASPGLN TYR GLN GLU LYS ASN VAL ASP GLN ALA SER GLY SERVAL LEU LEU HIS LEU GLU VAL GLY ASP GLN VAL TRP LEUGLN VAL TYR GLY ASP GLY ASP HIS ASN GLY LEU TYR ALAASP ASN VAL ASN ASP SER THR PHE THR GLY PHE LEU LEUTYR HIS ASP THR ASN SEQ ID NO44MET TYR ARG SER ALA PHE SER VAL GLY LEU GLU THR ARGVAL THR VAL PRO ASN VAL PRO ILE ARG PHE THR LYS ILEPHE TYR ASN GLN GLN ASN HIS TYR ASP GLY SER THR GLYLYS PHE TYR CYS ASN ILE PRO GLY LEU TYR TYR PHE SERTYR HIS ILE THR VAL TYR MET LYS ASP VAL LYS VAL SERLEU PHE LYS LYS ASP LYS ALA VAL LEU PHE THR TYR ASPGLN TYR GLN GLU LYS ASN VAL ASP GLN ALA SER GLY SERVAL LEU LEU HIS LEU GLU VAL GLY ASP GLN VAL TRP LEUGLN VAL TYR GLY ASP GLY ASP HIS ASN GLY LEU TYR ALAASP ASN VAL ASN ASP SER THR PHE THR GLY PHE LEU LEUTYR HIS ASP THR ASN SEQ ID NO45MET TYR ARG SER ALA PHE SER VAL GLY LEU GLU THR ARGVAL THR VAL PRO ASN VAL PRO ILE ARG PHE THR LYS ILEPHE TYR ASN GLN GLN ASN HIS TYR ASP GLY SER THR GLY
LYS PHE TYR CYS ASN ILE PRO GLY LEU TYR TYR PHE SERTYR HIS ILE THR VAL TYR MET LYS ASP VAL LYS VAL SERLEU PHE LYS LYS ASP LYS ALA VAL LEU PHE THR TYR ASPGLN TYR GLN GLU LYS ASN VAL ASP GLN ALA SER GLY SERVAL LEU LEU HIS LEU GLU VAL GLY ASP GLN VAL TRP LEUGLN VAL TYR GLY ASP GLY ASP HIS ASN GLY LEU TYR ALAASP ASN VAL ASN ASP SER THR PHE THR GLY PHE LEU LEUTYR HIS ASP THR ASN SEQ ID NO46MET TYR ARG SER ALA PHE SER VAL GLY LEU GLU THR ARGVAL THR VAL PRO ASN VAL PRO ILE ARG PHE THR LYS ILEPHE TYR ASN GLN GLN ASN HIS TYR ASP GLY SER THR GLYLYS PHE TYR CYS ASN ILE PRO GLY LEU TYR TYR PHE SERTYR HIS ILE THR VAL TYR MET LYS ASP VAL LYS VAL SERLEU PHE LYS LYS ASP LYS ALA VAL LEU PHE THR TYR ASPGLN TYR GLN GLU LYS ASN VAL ASP GLN ALA SER GLY SERVAL LEU LEU HIS LEU GLU VAL GLY ASP GLN VAL TRP LEUGLN VAL TYR GLY ASP GLY ASP HIS ASN GLY LEU TYR ALAASP ASN VAL ASN ASP SER THR PHE THR GLY PHE LEU LEUTYR HIS ASP THR ASN SEQ ID NO47ALA VAL GLN LEU GLU GLN SER GLY PRO GLY LEU VAL ARG
PRO SER GLN THR LEU SER LEU THR CYS THR VAL SER GLYTHR SER PHE ASP ASP TYR TYR TRP THR TRP VAL ARG GLNPRO PRO GLY ARG GLY LEU GLU TRP ILE GLY TYR VAL PHETYR THR GLY THR THR LEU LEU ASP PRO SER LEU ARG GLYARG VAL THR MET LEU VAL ASN THR SER LYS ASN GLN PHESER LEU ARG LEU SER SER VAL THR ALA ALA ASP THR ALAVAL TYR TYR CYS ALA ARG ASN LEU ILE ALA GLY GLY ILEASP VAL TRP GLY GLN GLY SER LEU VAL THR VAL SER SERALA SER THR LYS GLY PRO SER VAL PHE PRO LEU ALA PROSER SER LYS SER THR SER GLY GLY THR ALA ALA LEU GLYCYS LEU VAL LYS ASP TYR PHE PRO GLU PRO VAL THR VALSER TRP ASN SER GLY ALA LEU THR SER GLY VAL HIS THRPHE PRO ALA VAL LEU GLN SER SER GLY LEU TYR SER LEUSER SER VAL VAL THR VAL PRO SER SER SER LEU GLY THRGLN THR TYR ILE CYS ASN VAL ASN HIS LYS PRO SER ASNTHR LYS VAL ASP LYS LYS VAL GLU PRO SEQ ID NO48GLU VAL GLN LEU VAL GLU SER GLY GLY GLY LEU VAL GLNPRO GLY ARG SER LEU ARG LEU SER CYS VAL THR SER GLYPHE THR PHE ASP ASP TYR ALA MET HIS TRP VAL ARG GLNSER PRO GLY LYS GLY LEU GLU TRP VAL SER GLY ILE SERTRP ASN THR GLY THR ILE ILE TYR ALA ASP SER VAL LYSGLY ARG PHE ILE ILE SER ARG ASP ASN ALA LYS ASN SER
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VAL SER SER GLY ARG TYR PRO TYR ASP VAL PRO ASP TYRGLY SER GLY ARG ALA SEQ ID NO50ASP VAL GLN LEU GLN GLN SER GLY PRO GLU LEU GLU LYSPRO GLY ALA SER VAL LYS ILE SER CYS LYS ALA SER GLYPHE SER LEU PRO GLY HIS ASN ILE ASN TRP ILE VAL GLNARG ASN GLY LYS SER LEU GLU TRP ILE GLY ASN ILE ASPPRO TYR TYR GLY GLY THR ASN PHE ASN PRO LYS PHE LYSGLY LYS ALA THR LEU THR VAL ASP LYS SER SER SER THRLEU TYR MET HIS LEU THR SER LEU GLN SER GLU ASP SERALA VAL TYR TYR CYS ALA ARG ARG ARG ASP GLY ASN TYRGLY PHE THR TYR TRP GLY GLN GLY THR LEU VAL THR VALSER ALA ALA LYS THR THR PRO PRO SER VAL TYR PRO LEUALA PRO GLY SER ALA ALA GLN THR ASN SER MET VAL THRLEU GLY CYS LEU VAL LYS GLY TYR PHE PRO GLU PRO VALTHR VAL THR TRP ASN SER GLY SER LEU SER SER GLY VALHIS THR PHE PRO ALA VAL LEU GLN SER ASP LEU TYR THRLEU SER SER SER VAL THR VAL PRO SER SER THR TRP PROSER GLU THR VAL THR CYS ASN VAL ALA HIS PRO ALA SERSER THR LYS VAL ASP LYS LYS ILE SEQ ID NO51QDTLKEYGPGKLPSQTFSLTCTFSGFSLSTYGMMVSWMCQPSGKGLVWLALIWCNNDKGYNPFLRSQLTISKDTSNNQVFLKITSVDPADTATYYCA SEQ ID NO52
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SER ASP GLU GLN LEU LYS SER GLY THR ALA SER VAL VALCYS LEU LEU ASN ASN PHE TYR PRO ARG GLU ALA LYS VALGLN TRP LYS VAL ASP ASN ALA LEU GLN SER GLY ASN SERGLN GLU SER VAL THR GLU GLN ASP SER LYS ASP SER THRTYR SER LEU SER SER THR LEU THR LEU SER LYS ALA ASPTYR GLU LYS HIS LYS VAL TYR ALA CYS GLU VAL THR HISGLN GLY LEU SER SER PRO VAL THR LYS SER PHE ASN ARGGLY GLUSEQ ID NO55GLU LEU VAL MET THR GLN SER PRO SER SER LEU SER ALASER VAL GLY ASP ARG VAL ASN ILE ALA CYS ARG ALA SERGLN GLY ILE SER SER ALA LEU ALA TRP TYR GLN GLN LYSPRO GLY LYS ALA PRO ARG LEU LEU ILE TYR ASP ALA SERASN LEU GLU SER GLY VAL PRO SER ARG PHE SER GLY SERGLY SER GLY THR ASP PHE THR LEU THR ILE SER SER LEUGLN PRO GLU ASP PHE ALA ILE TYR TYR CYS GLN GLN PHEASN SER TYR PRO LEU THR PHE GLY GLY GLY THR LYS VALGLU ILE LYS ARG THR VAL ALA ALA PRO SER VAL PHE ILEPHE PRO PRO SER ASP GLU GLN LEU LYS SER GLY THR ALASER VAL VAL CYS LEU LEU ASN ASN PHE TYR PRO ARG GLUALA LYS VAL GLN TRP LYS VAL ASP ASN ALA LEU GLN SERGLY ASN SER GLN GLU SER VAL THR GLU GLN ASP SER LYSASP SER THR TYR SER LEU SER SER THR LEU THR LEU SERLYS ALA ASP TYR GLU LYS HIS LYS VAL TYR ALA CYS GLUVAL THR HIS GLN GLY LEU SER SER PRO VAL THR LYS SERPHE ASN ARG GLY GLU CYSSEQ ID NO56GLU LEU VAL MET THR GLN SER PRO SER SER LEU SER ALASER VAL GLY ASP ARG VAL ASN ILE ALA CYS ARG ALA SERGLN GLY ILE SER SER ALA LEU ALA TRP TYR GLN GLN LYSPRO GLY LYS ALA PRO ARG LEU LEU ILE TYR ASP ALA SERASN LEU GLU SER GLY VAL PRO SER ARG PHE SER GLY SERGLY SER GLY THR ASP PHE THR LEU THR ILE SER SER LEU
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在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明就是一個(gè)由可可逆解折疊的抗體可變域組成并鍵合了一個(gè)靶向配體的獨(dú)立的多肽?？扇〉氖?，可可逆地解折疊的抗體可變域與一個(gè)靶向配體結(jié)合，這些配體可以是細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子受體或是生長(zhǎng)因子受體(例如，人細(xì)胞因子，人生長(zhǎng)因子，人細(xì)胞因子受體，或人生長(zhǎng)因子受體)。更可取的是可可逆解折疊的抗體可變域在中和劑量為50(ND50，大約為1uM或更少)時(shí)消除了細(xì)胞因子、長(zhǎng)因子、胞因子受體或是生長(zhǎng)因子受體的活動(dòng)，這個(gè)劑量相當(dāng)于在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞含量測(cè)定中為500uM或更少-含量測(cè)定可由本文中描述的海拉細(xì)胞被腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素-8分泌物來衡量。更詳細(xì)的說，可可逆解折疊的抗體可變域在中和劑量為ND50時(shí)消除了細(xì)胞因子、長(zhǎng)因子、胞因子受體或是生長(zhǎng)因子受體的活動(dòng)，這個(gè)劑量大約相當(dāng)于400nM或更少，或者300nM或更少，或者200nM或更少，或者100nM或更少，或者1nM或更少，或者100pM或更少，或者10pM或更少。
在一些實(shí)施方案中，可可逆解折疊的抗體可變域鍵合細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子，并抑制細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子與同源的細(xì)胞因子受體或生長(zhǎng)因子受體間的反應(yīng)，其抑制濃度為50(IC50)，在標(biāo)準(zhǔn)的受體鍵合含量測(cè)定中，大約相當(dāng)于1uM或更少，或者500nM或更少-這里的受體含量檢測(cè)為腫瘤壞死因子受體1(p55)含量的檢測(cè)。更具體的體現(xiàn)為，可可逆解折疊的抗體可變域鍵合細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子，并抑制細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子與同源的細(xì)胞因子受體或生長(zhǎng)因子受體間的反應(yīng)，其抑制濃度為50(IC50)，這個(gè)濃度大約相當(dāng)于400nM或更少，或者300nM或更少，或者200nM或更少，或者100nM或更少，或者1nM或更少，或者100pM或更少，或者10pM或更少。這里其它的一些體現(xiàn)為，可可逆解折疊的抗體可變域鍵合細(xì)胞因子受體或生長(zhǎng)因子受體，并抑制細(xì)胞因子受體或生長(zhǎng)因子受體與同源的細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子間的反應(yīng)，其抑制濃度為50(IC50)，在標(biāo)準(zhǔn)的受體鍵合含量測(cè)定中，大約相當(dāng)于1uM或更少，或者500nM或更少-這里的受體含量檢測(cè)為腫瘤壞死因子受體1(p55)含量的檢測(cè)。更具體的體現(xiàn)為，可可逆解折疊的抗體可變域鍵合細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子，并抑制細(xì)胞因子受體或生長(zhǎng)因子受體與同源的細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子間的反應(yīng)，其抑制濃度為50(IC50)，這個(gè)濃度大約相當(dāng)于400nM或更少，或者300nM或更少，或者200nM或更少，或者100nM或更少，或者1nM或更少，或者100pM或更少，或者10pM或更少。
組合物包含一個(gè)可可逆解折疊的多肽，包括藥物學(xué)的和生理學(xué)的組合物被提供。藥物學(xué)的和生物學(xué)的組合物由一個(gè)或多個(gè)可可逆解折疊的多肽與藥物學(xué)和生理學(xué)上可接受的載體所構(gòu)成。代表性的，這些載體包括水溶液，乙醇/水溶液，乳狀液或懸浮液，包括鹽的和/或緩沖的介質(zhì)。腸胃外的載體包括氯化鈉溶液，林格右旋糖，右旋糖和氯化鈉及乳酸林格鹽。如果有必要在懸浮液中保持一個(gè)多肽的絡(luò)合物，合適的生理上可接受的輔助劑可以從稠化劑中選擇，例如羧甲基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，明膠和藻酸鹽。靜脈內(nèi)的載體包括流體、有營(yíng)養(yǎng)的補(bǔ)償物和電解質(zhì)補(bǔ)償物，例如那些建立在右旋糖格林液基礎(chǔ)上的物質(zhì)。防腐劑和其他添加劑，例如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體也可能會(huì)介紹到。(Mack(1982)Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th Edition)。
這個(gè)組合物可以包含一定要求的量的可可逆地解折疊的多肽，比如，該組合物包含分子質(zhì)量占5％～99％的可可逆地解折疊的多肽。詳細(xì)地說，該組合物包含分子質(zhì)量占10％～99％，或20％～99％，或30％～99％，或40％～99％，或50％～99％，或60％～99％，或70％～99％，或80％～99％，或90％～99％，或95％～99％的可可逆地解折疊的多肽。
在一個(gè)例子里，這個(gè)組合物是一個(gè)生物學(xué)上洗滌用的粉末，它包含一個(gè)可可逆地解折疊的多肽(例如，一個(gè)包含可可逆地解折疊的免疫球蛋白可變域的多肽)。其它的一些表現(xiàn)為，這個(gè)組合物可以被冷凍干燥(凍干)。
本發(fā)明也提供了一個(gè)密封的包裝(例如，密封的無(wú)菌包裝)，里面包含有可可逆地解折疊的多肽(例如，當(dāng)加熱時(shí)(例如，一個(gè)包含可可逆地解折疊的免疫球蛋白可變域的多肽))。一些具體的表現(xiàn)為，這個(gè)密封的包裝進(jìn)一步包含有一個(gè)滅菌的器具。詳細(xì)的說，該滅菌的器具是一個(gè)醫(yī)療器械，比如外科器械。
這里所描述的可可逆地解折疊的多肽將會(huì)在預(yù)防、抑制或處理炎癥，過敏性，癌癥，細(xì)菌或?yàn)V過性病毒感染，和自身免疫混亂(它們包括，但并不限制于I型糖尿病，多樣硬化癥，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，全身性紅斑狼瘡，節(jié)段性回腸炎，重癥肌無(wú)力)方面有非常突出的應(yīng)用。
在直接的應(yīng)用中，條件“預(yù)防”涉及先于病癥的誘發(fā)對(duì)保護(hù)性組合物的服用?！耙种啤笔侵覆“Y誘發(fā)后但在病癥的臨床癥狀表現(xiàn)之前對(duì)組合物的服用?！疤幚怼笔窃诩膊“Y狀開始出現(xiàn)后對(duì)保護(hù)性組合物的服用。
在有效地篩選預(yù)防和處理疾病地可可逆地解折疊的多肽時(shí)，動(dòng)物模型系統(tǒng)可以被采用的。采用易感染的老鼠來檢驗(yàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的方法在技術(shù)上以為人所知。(Knight et al.(1978)J.Exp.Med.，1471653；Reinersten et al.(1978)New Eng.J.Med.，299515)。采用從其它物種得到的可溶性乙酰膽堿蛋白在SJL/J母系老鼠身上誘發(fā)疾病被用來檢驗(yàn)重癥肌無(wú)力(MG)。(Lindstrom et al.(1988)Adv.Immunol.，42233)通過對(duì)易受感染的老鼠系注射II型膠原蛋白關(guān)節(jié)炎可被誘發(fā)。(Stuart et al.(1984)Ann.Rev.ImmunoL，42233)一個(gè)模型提出，對(duì)易受感染的兔子注射非典型分支桿菌感染的熱休克蛋白，輔助性關(guān)節(jié)炎會(huì)被誘發(fā)。(VanEden et al.(1988)Nature，331171)通過對(duì)甲狀腺球膽白的服用可在老鼠身上誘發(fā)甲狀腺炎。(Maron et al.(1980)J Exp.Med.，1521115)胰島素依賴型糖尿病(IDDM)會(huì)自然的發(fā)生或可在一定種類的老鼠，像Kanasawa等描述的那些體內(nèi)誘發(fā)。(1984)Diabetologia，27113鼠和兔的自身免疫性腦脊髓炎模型可應(yīng)用于人的多發(fā)性硬化癥中。在這個(gè)模型中，通過對(duì)髓磷鞘的服用脫髓鞘病會(huì)被誘發(fā)。(見Paterson(1986)Textbookoflmmunopathology，Mischer et al.，eds.，Grune and Stratton，NewYork，pp.179-213；McFarlin et al.(1973)Science，179478andSatoh et al.(1987)J Immunol.，138179).
發(fā)明中提到的被選擇的多肽可以用作個(gè)別的給藥的組合物或與其它藥劑一起聯(lián)合使用。這些藥劑包括很多免疫療法的藥物，如cylcosporine，氨甲蝶呤，阿霉素，順氯氨鉑和免疫毒素。藥物組合物可以包括多種細(xì)胞毒素的雞尾酒式復(fù)合或者其它藥劑與選擇的抗體、受體、或者本發(fā)明中相關(guān)的鍵合的蛋白、或者甚至是本發(fā)明中提到的根據(jù)不同特異性選擇的多肽聯(lián)合使用-這里所說的多肽指的是采用不同靶向配體來選擇多肽，而不管它們?cè)诜弥笆欠癖话l(fā)掘出來。
根據(jù)本發(fā)明藥物組合物的服用的辦法可以是常見的技術(shù)中那些早已為人所知的。對(duì)于治療，包括無(wú)限制的免疫療法，選擇的抗體，受體，或者本發(fā)明中提到的鍵合蛋白可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)來應(yīng)用到任何病人身上。該應(yīng)用可以采用任何適當(dāng)?shù)姆绞剑c胃外用藥，靜脈注射，肌肉注射，引流過腹膜地，皮膚下地，或經(jīng)過肺部路線，或者，適當(dāng)?shù)?，采用?dǎo)管直接輸液。使用的劑量和頻率需要臨床醫(yī)師根據(jù)病人的年齡、性別和身體情況，與其它藥物的協(xié)同使用，副作用和其它的一些因素來加以考慮。有治療效果的可可逆解折疊的多肽(例如，可可逆解折疊的抗體可變域)的用量被應(yīng)用。這個(gè)有治療效果的用量指的是在用藥的情況下取得期望的治療效果的足夠的量。
本發(fā)明也為對(duì)象(例如，病人)在使用可可逆解折疊的多肽方面提供了試劑盒的使用辦法，它包含一個(gè)可可逆解折疊的多肽、一個(gè)藥物傳遞設(shè)備和用法說明書。一個(gè)可可逆解折疊的多肽可用作一個(gè)劑型，比如一個(gè)凍干粉劑型。一定程度上具體化，這個(gè)藥物傳遞設(shè)備可以從由注射器，吸入器，鼻內(nèi)的或眼睛的使用設(shè)備(例如，mister、眼，或鼻點(diǎn)滴器)和無(wú)針注射設(shè)備組成中選取。
本發(fā)明中選擇的多肽可以采用凍干保存，在用之前用合適的載體使其再生。任何合適的凍干方法(例如噴霧干燥，塊狀干燥)和/或再生技術(shù)都可以采用。感到欣慰的是像凍干和再生這些已很成熟的技術(shù)使得抗體活性的損失(例如，在常見的免疫球蛋白中，IgM抗體活性比IgG抗體活性更容易損失)程度發(fā)生改變，并且使用水平可以向上調(diào)整以作補(bǔ)償。更細(xì)化一些，本發(fā)明提供了一個(gè)組合物，它包含一個(gè)在這里已描述的凍干的可可逆解折疊的多肽。更適應(yīng)地，這個(gè)凍干的多肽在再次水合的時(shí)候活性損失不會(huì)超過約20％，或不會(huì)超過約25％，不會(huì)超過約30％，不會(huì)超過約35％，不會(huì)超過約40％，不會(huì)超過約45％，不會(huì)超過約50％。活性指的是這個(gè)多肽凍在干前要求產(chǎn)生的它的效果的量。例如，在給定的時(shí)間段內(nèi)將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物最大量的一半時(shí)所需要的再水合酶的量，或者可以說，在靶向蛋白上結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到半飽和時(shí)所需要的鍵合多肽的量。多肽的活性可以在凍干前采用任何適宜的方法來測(cè)定，并采用相同的方法測(cè)定再水合后的活性從而測(cè)定其活性損失的量。
包含現(xiàn)在選擇的多肽或相關(guān)的雞尾酒式的組合物被用于預(yù)防和/或治療處理。在某些治療應(yīng)用中，實(shí)現(xiàn)最小的局部抑制、壓制、調(diào)變、殺死所選擇的細(xì)胞群體，或得到該群體其它一些可測(cè)量的參數(shù)的足夠的用量定義為“治療有效量”。達(dá)到這個(gè)劑量所需的用量有賴于疾病的嚴(yán)重程度和病人自身免疫系統(tǒng)的大概狀態(tài)，但是一般用量范圍為0.005～5.0mg所選擇的相關(guān)的抗體、受體(例如，T-cell受體)或鍵合蛋白/kg體重，更常用的劑量為0.05～2.0mg/kg體重。對(duì)于預(yù)防性的應(yīng)用，包含現(xiàn)在選擇的多肽或相關(guān)的雞尾酒式的的組合物的用量也相似或使用更低微的劑量。
根據(jù)本發(fā)明包含有選擇的多肽的組合物可以被用來預(yù)防和治療以幫助改造、滅活、殺死或去除動(dòng)物體內(nèi)選擇的目標(biāo)細(xì)胞群體。另外，這里所描述的選擇的多肽體系可以用于體外或生物體外有選擇性的殺死、減少、或相反，有效的從不同種類的細(xì)胞聚集體中去除目標(biāo)細(xì)胞群體。來自哺乳動(dòng)物的血液可以在體外與所選擇的抗體、細(xì)胞表面受體或相關(guān)的鍵合蛋白結(jié)合，由此不期望的細(xì)胞會(huì)被殺死，或相反，可將其從按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)需要回到動(dòng)物體內(nèi)的血液中去除。
試驗(yàn)部分第一部分EP-VH基因組及EP-VL基因組錯(cuò)位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種隨機(jī)突變的方法，將突變基因引入DNA序列中，因此，這是一種非常有效的生產(chǎn)編碼多種蛋白質(zhì)的核酸的方法，錯(cuò)位的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可通過多種途徑來實(shí)現(xiàn)，例如可通過改變緩沖液條件(例如改變脫氧核苷三磷酸的濃度)來降低核苷酸配對(duì)的精確度從而誘使突變發(fā)生。在此試驗(yàn)過程中，錯(cuò)位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的基因組是通過使用GENEMORPHPCR突變?cè)噭┖衼順?gòu)建的，此試劑盒包含MUTAZYME DNA聚合酶，這種聚合酶與常見的Taq聚合酶相比有著更高的核苷錯(cuò)配體本比率。突變反映常常使用這一系統(tǒng)來進(jìn)行，并可通過改變模板(VH和VK的編碼序列)的初始濃度來控制突變的改變，其中，初始濃度的改變可以按照給定的突變發(fā)生比率來確定。首先，將兩個(gè)基因組分別以VH及VK為模板來構(gòu)建，再將其轉(zhuǎn)入載體pR2，VH的模辦是V3- 23/DP47和Ju4b，VL的模板是012/02/DPK9和JK}，pR2質(zhì)粒從pHENI中分離得到的(Hoogenboom，HR et al.，Nucleic Acids Res.194133-4137(1991).)pR2包含一個(gè)半乳糖啟動(dòng)子，一個(gè)上游克隆位點(diǎn)的導(dǎo)向片斷，緊接著是His6和VSV標(biāo)記位點(diǎn)，一個(gè)中止子和一個(gè)基因編碼的外殼蛋白片斷，這些組成了一個(gè)有著較低突變頻率(-1堿基變化/模板)的體系和一個(gè)中等突變頻率(-2堿基變化/模板)的體系。這些基因組可產(chǎn)生的變化的種類有1-2×105。
將錯(cuò)配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)基因組轉(zhuǎn)入質(zhì)粒Fd-Myc中通過將擴(kuò)增了基因組產(chǎn)物質(zhì)粒載體Fd-Myc加入載體PR2中以繼續(xù)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增過程。位于載體pR2中的錯(cuò)配體因組與載體一起轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞大腸桿菌HB2151中，并在此進(jìn)行多次復(fù)制，鏈長(zhǎng)增加到大約22*22cm。在此過程中，必需的總生物量達(dá)到10-10g才能保證錯(cuò)配體因組的所有多樣變化都被包括。將基因鏈及DNA基因庫(kù)相繼從總生物體中分離出來，所得的獨(dú)立的基因庫(kù)即可作為錯(cuò)配體因庫(kù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板。
這個(gè)基因庫(kù)是由聚合酶鏈?zhǔn)桨l(fā)應(yīng)通過合成低聚核苷酸前體物質(zhì)完成擴(kuò)增過程的，此低聚核苷酸前體物質(zhì)包含ApaL 1和Not 1.兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，能夠促進(jìn)擴(kuò)增產(chǎn)物插入質(zhì)粒Fd-Myc相應(yīng)的位點(diǎn)中去。
VH Fd-Myc聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)前體物質(zhì)為5’GAG CGC CGT GCA CAG GTG CAG CTG TTG 3’(SEQ ID NO61)5’GAG TCG ACT TGC GGC CGCGCT CGA GAC GGT GAC 3’(SEQ IDNO62)Vx Fd-Myc聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)前體物質(zhì)為5’GAG CGC CGT GCA CAG AIC CAG ATG ACC CAG TCT CC 3’(SEQID NO63)5’GAG TCG ACT TGC GGC CGC CCG TTT GAT TTC CAC CTT GG 3’(SEQ ID NO64)下劃線處為限制性位點(diǎn)ApaL 1(GTGCAC)和Not 1(GCGGCCGC)。引物由5’端開始生物素(酰)化的作用。將核酸結(jié)合入ApaL1位點(diǎn)開始編碼VFX or Vx，Vf和VK所編碼的第一個(gè)氨基酸都是谷氨酸。
用瓊脂糖凝膠純化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所得的擴(kuò)增基因組，然后用限制性內(nèi)切酶消化ApaL 1和Not 1.兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，在將消化產(chǎn)物用苯酚/氯仿萃取法純化，用streptavidinDYNABEADS(親和素標(biāo)記的磁性微珠，購(gòu)自Dynal生物技術(shù)公司)處理掉5’末端及未消化的產(chǎn)物，放入QIAQUICK PCR純化試劑盒(購(gòu)自Qiagen公司)。產(chǎn)物將會(huì)附著在質(zhì)粒Fd-Myc的ApaL1或Not 1.酶切位點(diǎn)上，以106-107的大小轉(zhuǎn)錄入大腸桿菌TG1中。
第二部分325G基因庫(kù)Fd-Myc質(zhì)粒的構(gòu)建Fd-Myc質(zhì)粒是通過酶切Fd-tet-Dog1(McCafferty et al.(Nature)1989)質(zhì)粒的ApaL1和Not1位點(diǎn)，并將其捆綁與由5’末端磷酸化低聚糖LJ1012和LJ1013(片斷序列分別為NO65和NO66)組成的double-stranded DNA試劑盒中裝配重組生成的。這兩種低聚糖能夠編碼myc tag融合蛋白和胰島素分裂位點(diǎn)。所產(chǎn)生的Fd-Myc載體與Fd-Tet-Dog1十分相似，其中ApaL1和Not1位點(diǎn)基因代表了插入主導(dǎo)片斷及基因III之間的克隆體系。這一現(xiàn)象的另外一個(gè)特點(diǎn)是融合蛋白Myc-Tag在NotI及基因III之間的表達(dá)使編碼的基因III溶解蛋白的免疫學(xué)診斷成為可能，并且由于融合蛋白中含有胰島素酶酶切位點(diǎn)，從而使質(zhì)粒片斷(例如選擇性的使用抗-Myc抗體)可以通過胰島素酶的消化作用洗提。
LJ1012P-TGCACAGGTCCACTGCAGGAGGCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATTC(SEQ ID NO65)LJ1013P-GGCCGAATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCGAGGACGTCACCTGCTG(SEQ ID NO66)3.25G嵌入物或綁定物質(zhì)的制備分別利用11種不同的捆綁DNA基因庫(kù)(包括pR3-7781，pR3-7782，pR3-7783，pR3-7784，pR3-7785，pR3-7786，pR3-7787，pR3-7788，pR3-7789，pR3-77890和pR3-7791)作模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，這些基因庫(kù)是以VH-DP47為基礎(chǔ)的，包含各種CDR1，CDR2，和CDR3(CDR3的氨基酸鏈長(zhǎng)從10變化到20)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以Lu1011和LJ1027為引物進(jìn)行從而在5’末端添加入ApaL1酶切位點(diǎn)，在3′-末端添加入Not1酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增所得片斷依次經(jīng)過純化消化過程，再重新純化并將其導(dǎo)入Fd-myc相應(yīng)的位點(diǎn)上。
LJ1011GAGTCGACTTGCGGCCGCGCTCGAGACGGTGACCAG(SEQID NO67)LJ1027GAGCGCCGTGCACAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGG(SEQID NO68)3.25G基因庫(kù)及其存儲(chǔ)物的電穿孔技術(shù)純化之后，這11種捆綁物質(zhì)導(dǎo)入或電轉(zhuǎn)錄入大腸桿菌TG1細(xì)胞中，經(jīng)過電穿孔，細(xì)胞懸浮在2XTY中，并于37℃下培養(yǎng)一小時(shí)使其得以充分表達(dá)，然后，所得基因組連接入TYE試劑盒中補(bǔ)充15pg/ml環(huán)四環(huán)素，培養(yǎng)過夜，等分TYE試劑盒中的菌液，取出一部分補(bǔ)充15.g/ml環(huán)四環(huán)素滴定，確定基因組的大小為1.6×109個(gè)克隆單位，等分的基因庫(kù)可通過在OD600-40中懸浮細(xì)胞來制備，并用等量的丙三醇稀釋(最后的OD600等于20)，等分的產(chǎn)物應(yīng)制成1ml的樣品并于-80℃環(huán)境下冷凍保存，直至用時(shí)取出。
噬菌體的生產(chǎn)和純化將一個(gè)1ml的3.25G的基因庫(kù)樣本解凍，并將其嫁接到于一個(gè)2.5L的搖瓶中，此搖瓶中含有500ml2xTY培養(yǎng)基，并補(bǔ)充15pg/ml環(huán)四環(huán)素。在30℃條件下培養(yǎng)20小時(shí)，讓噬菌體充分生長(zhǎng)，然后于5500轉(zhuǎn)/分條件下離心15分鐘以除去細(xì)胞，然后向450ml培養(yǎng)基中加入90mlPEG/NaCl溶液(其中聚乙二醇8000的含量為20％[Sigma公司，通常以PEG6000出售]，2.5M NaCl)，此時(shí)培養(yǎng)基都聚集在液體表面，混合均勻后，將此溶液儲(chǔ)存在冰中培養(yǎng)一小時(shí)，噬菌體可通過在4℃時(shí)于5500轉(zhuǎn)/分條件下離心30分鐘獲得。丟棄上浮物質(zhì)，重新離心一邊離心管，在小心的出去剩余的PEG/NaCl溶液，細(xì)胞小球懸浮于10ml PBS緩沖液中，于3300轉(zhuǎn)/分條件下離心15分鐘除去剩余細(xì)菌，用孔徑為0.45llm的濾紙過濾，噬菌體的濃度可通過分光光度計(jì)測(cè)定將噬菌體稀釋100倍在260nm條件下測(cè)定其吸光度，噬菌體濃度(單位為Tu每ml)可通過下面公式來計(jì)算OD260×1013×2.214.最后得到的噬菌體應(yīng)于-20℃條件下保存，并添加10-15％的丙三醇(最終濃度)。
第三部分噬菌體的篩選涂布或分層培養(yǎng)在室溫下將菌落涂布培養(yǎng)過夜(大概18小時(shí))，加入4ml包含10μg/ml蛋白A的PBS緩沖液或4ml含有10μg/ml蛋白L的PBS緩沖液。第二天早上，倒掉液體，對(duì)于添加蛋白A涂布的菌落用添加2％v/v吐溫20的PBS緩沖液封存，對(duì)于添加蛋白L涂布的菌落用含有2％w/v牛血清白蛋白的磷酸緩沖液來封存，菌落于37℃條件下培養(yǎng)1小時(shí)，然后在進(jìn)行噬菌體篩選前用磷酸緩沖液洗滌3次。
Fd噬菌體表達(dá)的多肽段的熱變性及復(fù)性用200μl的磷酸緩沖液稀釋大約5×1010單位的噬菌體抗體基因組，然后等分為兩組薄壁的PCR菌落，將菌落放入聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀中在80℃條件下(最高不要超過85℃)加熱10分鐘，然后在反應(yīng)器中迅速將溶液冷卻倒4℃從而獲得可表達(dá)具有變性可逆性蛋白的噬菌體溶液。
可表達(dá)變性可逆性蛋白多肽段的Fd噬菌體的篩選收集噬菌體溶液，并向其中加入4ml磷酸緩沖液，對(duì)于添加蛋白A涂布的菌落PBS緩沖液中應(yīng)添加2％v/v吐溫20，對(duì)于添加蛋白L涂布的菌落磷酸緩沖液中應(yīng)含有2％w/v牛血清白蛋白。所得的噬菌體溶液加入添加蛋白A涂布的菌落或添加蛋白L涂布的菌落中，封存，在室溫條件下上搖床培養(yǎng)30分，然后靜置分層1.5小時(shí)，分別用含有0.1％吐溫20的磷酸緩沖液及純磷酸緩沖液洗滌10次以洗去游離的噬菌體，附著的噬菌體可用含有1mg/ml胰島素酶的磷酸緩沖液洗提，并在低轉(zhuǎn)速的搖床中培養(yǎng)10到15分，之后，將包含洗提出來的噬菌體的溶液放入干凈的微型離心管中冰凍儲(chǔ)存。
大腸桿菌轉(zhuǎn)染篩選出的Fd噬菌體將大腸桿菌TG1細(xì)胞放入2xTY培養(yǎng)基中于37℃條件下培養(yǎng)過夜，在25ml新鮮的2xTY培養(yǎng)基中將樣品稀釋100倍，并于37℃條件下震蕩培養(yǎng)(250tpm)直到樣品在600nm(OD600)的吸光度達(dá)到0.5-0.7(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期)。取10ml這種培養(yǎng)基，加入500μl洗提得到的噬菌體溶液(剩下的500μl仍于4℃條件下保存)，在37℃條件下靜置培養(yǎng)30分讓噬菌體充分轉(zhuǎn)染，然后取100μl等分液滴定其中10μl按1∶100的倍率稀釋，另外10μl按1∶10000的倍率稀釋加入到2xTY培養(yǎng)基中用含有15μl環(huán)四環(huán)素的標(biāo)記物標(biāo)記，37℃條件下培養(yǎng)過夜，滴定值由克隆量的增值，稀釋倍率(稀釋100倍或10000倍)決定，然后將所得量乘以1000(從10ml轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中取出了10μl)就是500μl洗提噬菌體的滴定值。洗提所得總噬菌體的滴定值為此滴定值乘2(總共1ml)。將剩余的9.9ml大腸桿菌TG1細(xì)胞培養(yǎng)基放入一個(gè)14ml的試管中，于3300r/m條件下離心10分鐘，此時(shí)，細(xì)胞球懸浮于2ml新鮮的2xTY培養(yǎng)基中，將他平鋪于22cm2包含15μg/ml環(huán)四環(huán)素的平皿中于37℃條件下培養(yǎng)過夜。
Fd噬菌體載體的擴(kuò)增第二天，將10ml含有15％丙三醇的2xTY培養(yǎng)基加入平皿中，用玻璃珠震蕩使細(xì)胞變松，然后倒入50ml干凈的試管中。將細(xì)胞懸浮液的50％接種到100ml含有15μg/ml環(huán)四環(huán)素的2xTY培養(yǎng)基中，同時(shí)，用1ml消過毒的丙三醇稀釋1ml細(xì)胞懸浮液并與-70℃條件下冷凍保存。將前面提到的100ml培養(yǎng)基放入搖床中于37℃條件下培養(yǎng)過夜。
篩選得到的Fd噬菌體載體的純化第二天，將過夜培養(yǎng)的100ml培養(yǎng)基于3300r/m條件下離心15分鐘除去細(xì)菌細(xì)胞，用孔徑為0.45um的未使用過的濾紙濾出上層懸浮物。取80ml懸浮物，像其中加入20ml PEG/NaCl溶液(20％聚乙二醇8000；Sigma公司出品，通常以PEG6000出售；2.5M NaCl)充分混合后，將此溶液至于冰上培養(yǎng)1小時(shí)來沉淀噬菌體。然后將混合物置于離心機(jī)中于4℃條件下以3300r/m的速度離心30分鐘，即可收集到噬菌體。丟棄上層物質(zhì)，將離心管再重新離心一次，即可除去多余的PEG/NaCl溶液。將細(xì)胞重新溶解懸浮于1ml磷酸緩沖液中，并放入干凈的微型離心管中于11600r/m條件下離心10分鐘除去剩余的細(xì)胞殘骸，并將上清液倒入干凈的微型離心管中于4℃條件下保存直到下一部分。噬菌體的滴定量可由分光光度計(jì)估算得出用磷酸緩沖液稀釋100倍之后于260nm下測(cè)定吸光度，其滴定值(TU/ml)可由下面公式算出OD260×1013×2.214。
結(jié)論應(yīng)用這一方法及3.25G噬菌體基因庫(kù)(第二部分)，對(duì)添加蛋白A涂布的菌落進(jìn)行了3次篩選，第一次篩選完成時(shí)，噬菌體的滴定值低于107TU，但是經(jīng)過第三次篩選之后，此滴定值大于109TU。經(jīng)過三輪篩選所得的細(xì)胞懸浮液樣本經(jīng)過一系列稀釋(10-1級(jí)數(shù))轉(zhuǎn)接到TYE試劑盒中，并添加15μg/ml環(huán)四環(huán)素，于37℃條件下培養(yǎng)過夜之后，即可看到獨(dú)立的克隆菌落(見第四部分)。
應(yīng)用這一方法及EP-VH噬菌體基因庫(kù)(第一部分)，對(duì)添加蛋白A涂布的菌落進(jìn)行了3次篩選，生產(chǎn)出高滴定量的產(chǎn)品，從第三輪篩選所得噬菌體擴(kuò)增液中得到的細(xì)菌懸濁液經(jīng)過一系列稀釋(10-1級(jí)數(shù))轉(zhuǎn)接到TYE試劑盒中，并添加15μg/ml環(huán)四環(huán)素，于37℃條件下培養(yǎng)過夜之后，即可看到獨(dú)立的克隆菌落(見第四部分)。
應(yīng)用這一方法及EP-Vlc噬菌體基因庫(kù)(第二部分)，對(duì)添加蛋白L涂布的菌落進(jìn)行了3次篩選，生產(chǎn)出高滴定量的產(chǎn)品，從第三輪篩選所得噬菌體擴(kuò)增液中得到的細(xì)菌懸濁液經(jīng)過一系列稀釋(10-1級(jí)數(shù))轉(zhuǎn)接到TYE試劑盒中，并添加15μg/ml環(huán)四環(huán)素，于37℃條件下培養(yǎng)過夜之后，即可看到獨(dú)立的克隆菌落(見第四部分)。
第四部分噬菌體篩選1生長(zhǎng)的噬菌體克隆體系及其制備將單一菌落放入96孔培養(yǎng)板(平底、有蒸發(fā)蓋、)中生長(zhǎng)，每個(gè)孔中都含有175μl添加15μg/ml環(huán)四環(huán)素的2xTY培養(yǎng)基，并用噬菌體篩選方法灌入分離所得的單一菌落，將培養(yǎng)板置于37℃條件下?lián)u床培養(yǎng)過夜(大約18小時(shí))，第二天，于室溫條件下以2000r/m的轉(zhuǎn)速離心20分鐘可獲得球狀細(xì)胞。從每個(gè)培養(yǎng)基懸液中取出100μl加入到96孔培養(yǎng)板中。
為了加速ELISA(酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定)試劑盒檢測(cè)噬菌體的速度，通常用化學(xué)的方法給噬菌體引入一個(gè)生物型官能團(tuán)，這一方法使噬菌體可以通過鏈親合素及過氧化物酶的變化來檢測(cè)(Sigma公司生產(chǎn)的Str-HRP)，選用這一方法是為了減少孔板中用于檢測(cè)噬菌體的抗體及監(jiān)測(cè)固定的蛋白A或蛋白L的抗體之間的交叉反應(yīng)。因此，每100μl培養(yǎng)基懸液樣品與100μl包含生物素Sulfo-NHS濃度為500μM的磷酸緩沖液在EZ-link多功能切換器中室溫條件下反應(yīng)一小時(shí)(在轉(zhuǎn)臺(tái)上攪動(dòng)培養(yǎng)基)。
噬菌體的加熱變性(噬菌體表達(dá)多肽的熱誘導(dǎo)解鏈)從200μl經(jīng)過生物素修飾的噬菌體樣品中取出80μl加入到熱導(dǎo)96孔培養(yǎng)板中，并在另一熱導(dǎo)96孔培養(yǎng)板中重復(fù)此過程，將第一個(gè)培養(yǎng)板蓋上蓋子，放入聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀中在80℃(溫度最高不能超過85℃)條件下培養(yǎng)10分鐘，加熱完成后迅速將培養(yǎng)板冷卻至4℃。第二個(gè)培養(yǎng)板一直在冰上保存，此時(shí)，平行處理兩個(gè)培養(yǎng)板向每個(gè)孔中(包含80μl加熱過的或未加熱過的噬菌體懸液)加入20μl含有10％v/v吐溫20(添加蛋白A的ELISA試劑盒)或10％w/v BSA(添加蛋白L的ELISA試劑盒)的磷酸緩沖液并混合均勻，再用ELISA試劑盒進(jìn)行分析。
ELISA試劑盒的涂層和阻凝劑向微型96孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔洞中加入100μl含有10μg/ml蛋白A或蛋白L的磷酸緩沖液涂層，室溫下過夜培養(yǎng)(大概18小時(shí))，第二天，試劑盒中涂層物質(zhì)風(fēng)干，在向每個(gè)孔洞中加入200μl含有2％v/v吐溫20(添加蛋白A的孔中)或2％w/v BSA(添加蛋白L的孔中)的磷酸緩沖液做阻凝劑，置于37℃條件下培養(yǎng)，篩選前用磷酸緩沖液洗滌3次。
噬菌體的ELISA經(jīng)過熱處理控制的噬菌體樣品加入經(jīng)過涂層及阻凝作用的ELISA試劑盒中，室溫條件下培養(yǎng)2小時(shí)，然后用磷酸緩沖液洗滌培養(yǎng)板孔洞6次以除去未附著上的噬菌體。將Str-HRP(過氧化物酶標(biāo)記物)按1∶2000的稀釋率溶于含有2％v/v吐溫20(添加蛋白A的孔中)或2％w/v BSA(添加蛋白L的孔中)的磷酸緩沖液中，并向培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入100μl，室溫下培養(yǎng)1小時(shí)，用磷酸緩沖液洗滌培養(yǎng)板孔洞6次以除去未附著上的Str-HRP。取10mg/mlTMB(四甲基聯(lián)苯胺)溶液以100的稀釋倍數(shù)用0.1M的乙酸鈉(pH為6)稀釋，然后按照加入過氧化苯(0.4μg每mlTBM緩沖液)，取100μl所得溶液加入培養(yǎng)板小孔中進(jìn)行比色反應(yīng)。當(dāng)溶液顯藍(lán)色時(shí)，向孔中加入50μl1M的硫磺酸中止反應(yīng)(顏色變?yōu)辄S色)，用分光光度計(jì)于450nm下測(cè)定吸光度。
結(jié)論上面所描述的篩選噬菌體的方法分為5個(gè)獨(dú)立的部分表達(dá)蛋白具有復(fù)性能力的3.25G噬菌體基因庫(kù)(第二部分)的克隆系表達(dá)蛋白具有復(fù)性能力的EP-VH噬菌體基因庫(kù)(第一部分)的克隆系表達(dá)蛋白具有復(fù)性能力的EP-Vk噬菌體基因庫(kù)(第一部分)的克隆系VH-DP47d(第十部分)的十個(gè)微型噬菌體基因庫(kù)的克隆系Vk-DPK9d(第十部分)的十個(gè)微型噬菌體基因庫(kù)的克隆系對(duì)于每一種篩選，都應(yīng)用正反饋調(diào)節(jié)和負(fù)反饋調(diào)節(jié)來控制復(fù)折疊現(xiàn)象發(fā)生的百分比對(duì)于添加蛋白A的ELISA，由VH-DP47d起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，由HEL4起正反饋調(diào)節(jié)作用。這里的VH-DP47d表達(dá)蛋白不能在加熱或冷卻過程中表現(xiàn)變性可逆性，然而HEL4(將從VH3(DP47+JH4菌系)中篩選出來的蛋白溶解酵素基因庫(kù)發(fā)生隨機(jī)CDR 1，2and 3突變產(chǎn)生的單一VH噬菌體)在此條件下卻能夠表現(xiàn)這種性質(zhì)。對(duì)于添加蛋白L的ELISA，由Vk-DPK9起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，由VK-DPK9-A50P(從具有可表達(dá)變性可逆性蛋白的Vk中篩選EP Vk基因庫(kù)可得)起正反饋調(diào)節(jié)作用。
對(duì)每一組噬菌體克隆系列，為加熱的噬菌體要與加熱的噬菌體同時(shí)進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，這種方法是一種噬菌體表達(dá)多肽抗體變性可逆性的半定量測(cè)定方法，例如，假定一組未加熱的噬菌體克隆物經(jīng)ELISA試劑盒所得OD450的結(jié)果為1.5(當(dāng)參照物為空白的懸濁液時(shí)為1.45)，而同一組加熱過的噬菌體克隆物經(jīng)ELISA試劑盒所得OD450的結(jié)果為0.6(當(dāng)參照物為空白的懸濁液時(shí)為0.55)時(shí)，這株噬菌體的復(fù)折疊百分比(也可比作蛋白A粘合物加熱或冷凍處理后的活性)為(0.55/1.45)*100＝29.0％。
VH基因或Vx基因嵌入物(見第6部分)的DNA排列順序決定了噬菌體的復(fù)折疊百分比，另外，篩選出來的克隆菌株還要進(jìn)行再次ELISA反應(yīng)進(jìn)一步定量分析其復(fù)性百分比。
第五部分噬菌體篩選2生長(zhǎng)的噬菌體克隆體系及其制備將噬菌體放入50毫升試管中培養(yǎng)每個(gè)試管中含有11ml添加15μg/ml環(huán)四環(huán)素的2xTY培養(yǎng)基，接種經(jīng)過噬菌體篩選1(第4部分)所得的單一菌株，置于37℃條件下?lián)u床培養(yǎng)過夜(大約18小時(shí))。第二天，于4℃條件下以3300r/m的轉(zhuǎn)速離心20分鐘可獲得球狀細(xì)胞除去菌體，再用孔徑為0.45um的未使用過的濾紙濾出上層懸浮物。取80ml懸浮物，像其中加入2ml PEG/NaCl溶液(20％聚乙二醇8000；Sigma公司出品，通常以PEG6000出售；2.5M NaCl)充分混合后，將此溶液至于冰上培養(yǎng)1小時(shí)來沉淀噬菌體。然后將混合物置于離心機(jī)中于4℃條件下以3300r/m的速度離心30分鐘，即可收集到噬菌體。丟棄上層物質(zhì)，將離心管再重新離心一次，即可除去多余的PEG/NaCl溶液。將細(xì)胞重新溶解懸浮于0.2ml磷酸緩沖液中，并放入干凈的微型離心管中于11600r/m條件下離心10分鐘除去剩余的細(xì)胞殘骸，并將上清液倒入干凈的微型離心管中于冰上保存。噬菌體的滴定量可由分光光度計(jì)估算得出用磷酸緩沖液稀釋100倍之后于260nm下測(cè)定吸光度，其滴定值(TU/ml)可由下面公式算出OD260×1013×2.214。
為了加速ELISA(酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定)試劑盒檢測(cè)噬菌體的速度，通常用化學(xué)的方法給噬菌體引入一個(gè)生物型官能團(tuán)，這一方法使噬菌體可以通過鏈親合素及過氧化物酶的變化來檢測(cè)(Sigma公司生產(chǎn)的Str-HRP)，選用這一方法是為了減少孔板中用于檢測(cè)噬菌體的抗體及監(jiān)測(cè)固定的蛋白A或蛋白L的抗體之間的交叉反應(yīng)。因此，每100μl包含4×1010噬菌體的磷酸緩沖液與100μl包含生物素Sulfo-NHS濃度為50μM的磷酸緩沖液在EZ-link多功能切換器中室溫條件下反應(yīng)一小時(shí)(在轉(zhuǎn)臺(tái)上攪動(dòng)培養(yǎng)基)，然后在4℃條件下過夜培養(yǎng)。
噬菌體的加熱變性(噬菌體表達(dá)多肽的熱誘導(dǎo)解鏈)取100μl經(jīng)過生物素修飾的同一噬菌體的樣品加入到薄壁PCR試管中(剩余的經(jīng)過處理的菌體儲(chǔ)存于冰中)，然后放入聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀中在80℃(溫度最高不能超過85℃)條件下培養(yǎng)10分鐘，加熱完成后迅速將培養(yǎng)板冷卻至4℃。此時(shí)，平行處理兩個(gè)試管(一個(gè)試管中含有加熱過的樣品，另一個(gè)含有儲(chǔ)存于冰中的樣品)首先將兩樣品分別按照4的級(jí)數(shù)倍稀釋8個(gè)樣，其中，對(duì)于VH-DP47菌株用含有2％v/v吐溫20的磷酸緩沖液稀釋對(duì)于VK-DPK9菌株用包含2％w/v BSA的磷酸緩沖液稀釋。這時(shí)，噬菌體濃度最高的試管中的滴定值為1010TU/ml，適于用ELISA試劑盒進(jìn)行分析。
噬菌體的ELISA經(jīng)過熱處理控制的噬菌體樣品加入經(jīng)過涂層及阻凝作用的ELISA試劑盒(涂層及阻聚層的添加方法見第4部分)中，室溫條件下培養(yǎng)2小時(shí)，然后用磷酸緩沖液洗滌培養(yǎng)板孔洞6次以除去未附著上的噬菌體。將Str-HRP(過氧化物酶標(biāo)記物)按1∶2000的稀釋率溶于含有2％v/v吐溫20(添加蛋白A的孔中)或2％w/v BSA(添加蛋白L的孔中)的磷酸緩沖液中，并向培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入100μl，室溫下培養(yǎng)1小時(shí)，用磷酸緩沖液洗滌培養(yǎng)板孔洞6次以除去未附著上的Str-HRP。取10mg/mlTMB(四甲基聯(lián)苯胺)溶液以100的稀釋倍數(shù)用0.1M的乙酸鈉(pH為6)稀釋，然后按照加入過氧化苯(0.4μg每mlTBM緩沖液)，取100μl所得溶液加入培養(yǎng)板小孔中進(jìn)行比色反應(yīng)。當(dāng)溶液顯藍(lán)色時(shí)，向孔中加入50μl 1M的硫磺酸中止反應(yīng)(顏色變?yōu)辄S色)，用分光光度計(jì)于450nm下測(cè)定吸光度。
結(jié)論此方法使用5種實(shí)驗(yàn)進(jìn)行噬菌體篩選對(duì)VH-DP47噬菌體進(jìn)行單一氨基酸或多個(gè)氨基酸突變的擴(kuò)增對(duì)VK-DPK9噬菌體進(jìn)行單一氨基酸或多個(gè)氨基酸突變的擴(kuò)增DP47，BSA1，HEL4，pA-C(13，36，47，59，76，85)，VK-DPK9等菌株的克隆及可表現(xiàn)預(yù)期復(fù)性比的VH-DP47d的十個(gè)微型噬菌體基因庫(kù)的克隆系。
BSA1是一種不具有熱變性復(fù)性能力的牛血清白蛋白，其編碼基因是由VH3(DP47+JH4菌系)發(fā)生隨機(jī)CDR 1，2and 3突變產(chǎn)生的單一VH噬菌體。
對(duì)于每一種篩選，都應(yīng)用正反饋調(diào)節(jié)和負(fù)反饋調(diào)節(jié)來控制復(fù)折疊現(xiàn)象發(fā)生的百分比對(duì)于添加蛋白A的ELISA，由VH-DP47d起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，由HEL4起正反饋調(diào)節(jié)作用。對(duì)于添加蛋白L的ELISA，由Vk-DPK9起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，由VK-DPK9-A50P(從具有可表達(dá)變性可逆性蛋白的Vk中篩選EPVk基因庫(kù)可得)起正反饋調(diào)節(jié)作用。
結(jié)果可由如下方法得出對(duì)于每一種噬菌體，都要進(jìn)行兩個(gè)樣本的八點(diǎn)稀釋平行試驗(yàn)，一個(gè)樣本不經(jīng)過熱處理，另一個(gè)樣本經(jīng)過熱處理。這種方法能夠定量的減少噬菌體抗體表現(xiàn)的具有變性-復(fù)性可逆性的蛋白的百分比。在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)圖(X軸為對(duì)應(yīng)噬菌體濃度的對(duì)數(shù)值，Y軸為每一濃度下的OD450)中繪制OD450曲線，用線性內(nèi)插法作圖。
所表現(xiàn)的復(fù)性百分比按照如下方法計(jì)算對(duì)每一菌株，計(jì)算某一噬菌體濃度下的特OD450值(對(duì)于經(jīng)過加熱處理的和未經(jīng)過加熱處理的樣本分別計(jì)算)，假定產(chǎn)生某一OD450值的加熱處理的噬菌體濃度為2×108，未經(jīng)過加熱處理的噬菌體濃度為5×109，其復(fù)性百分比可由如下公式算出(2×108/5×109)*100＝4％。重復(fù)這一方法，我們可以算出VH-DP47d的復(fù)性百分比大約為0.5％，HEL4的大約為18％。
第6部分DNA編碼順序具有變性可逆性質(zhì)的DNA序列的可變部分的編碼順序如下聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)混合物5μl 10x緩沖液1ul引物L(fēng)J212(20pmol/ul)1ul引物L(fēng)J006(20pmol/ul)1ul 20mM脫氧核糖核酸0.5ul Taq DNA聚合酶
41.5ul H2O將50ul聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)混合物等分入96孔PCR微型孔板中，用已消毒的接種針挑取Fd-Myc/TG1菌落接種到混合物中，將接種針在聚合物中攪動(dòng)5次，用油覆蓋。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)參數(shù)如下94℃解鏈10min，然后按照如下步驟重復(fù)30次94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，45秒；最后于72℃條件下培養(yǎng)5分鐘，擴(kuò)增樣品用QIAQUICK PCR純化儀純化。編碼序列可由任一引物((LJ212和/或LJ006))完成。
檢測(cè)到的可編碼具有變性可逆性的免疫球蛋白的基因突變序列的變化區(qū)域在表3及表4中表示出來。
引物序列LJ006 5’ATGGTTGTTGTCATTGTCGGCGCA 3’(SEQ ID NO69)LJ212 5’ATGAGGTTTTGCTAAACAACTTTC 3’(SEQ ID NO70)
第7部分篩選所的EP VH菌體的目錄表3篩選所的具有變性復(fù)性性質(zhì)的EP VH菌體的突變區(qū)
其中，*m表示ELISA訊號(hào)適中，H表示ELISA訊號(hào)較強(qiáng)表4篩選所的具有變性復(fù)性性質(zhì)的EP VH菌體的突變頻率
第八部分EP Vκ選擇表表5為可逆熱解折疊選擇的EP-Vκ庫(kù)中的克隆發(fā)生的突變
選擇給出了高的ELISA信號(hào)的所有克隆表6為可逆熱解折疊選擇的EP-Vκ庫(kù)中的克隆突變的頻率
第九部分選擇的3.25G VH表采用加熱/冷卻噬菌體篩選方法(見第三部分)在3.25G庫(kù)中選擇后得到選擇的3.25G VII列表，大范圍的篩選(見第四部分)試驗(yàn)確定了VH克隆，它在熱變性作用后在噬菌體存在時(shí)會(huì)再褶皺。
通過對(duì)熱處理的鍵合的評(píng)價(jià)和控制在這里所描述的ELISA反應(yīng)中對(duì)蛋白A的噬菌體可以對(duì)克隆進(jìn)行分析。(表3A-3F)中60％以上可解折疊的克隆通過序列測(cè)定進(jìn)行了進(jìn)一步的分析。表4A-4C給出了60％以上重褶的克隆的可能序列。表4A-4C給出的第一批序列是從ELISA反應(yīng)中給出了高的OD450和高的％解折疊度的克隆中得到的。這些序列不包括胱氨酸。這個(gè)序列群為在CDR1、CDR2和CDR3的所有位點(diǎn)的氨基酸選擇的分析構(gòu)成了數(shù)據(jù)系列。
表4A-4C中的第二批序列是從能給出優(yōu)良的ELISA信號(hào)和好的重褶性的克隆中得到的。這些克隆包含CDR系列之外的突變。
表4A-4C中最后的序列群來自ELISA信號(hào)和/或重褶性相對(duì)較低的克隆。
由表4A-4C給出的序列，六個(gè)克隆被選擇并在噬菌體(像列出的多肽)和作為可溶性蛋白方面進(jìn)行了進(jìn)一步的詳細(xì)的分析。六個(gè)被選擇的克隆指的是pA-C13，pA-C36，pA-C47，pA-C59，pA-C76and pA-C85。(表4A-4C中只用后綴識(shí)別的是克隆，如，“pA-C13”是“C13”)另外，將DP47插入個(gè)體突變株，并在作為這些突變株中的一部分、作為可溶性蛋白的噬菌體存在時(shí)對(duì)重褶性進(jìn)行分析。這些特殊的突變是F27D，F(xiàn)29V，F(xiàn)27D/F29V，Y32E，S35G，S53P，G54D，W47R，F(xiàn)27D/F29V/Y32D/S35G，S53P/G54D，F(xiàn)l00nV，Y102S，F(xiàn)100nV/Y102S，W103R。
這些克隆在噬菌體(除了三個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)被采用外，依據(jù)第五部分的草案)和溶液中的重褶性被表征。對(duì)溶液的重褶性，在CD(見第12部分)之后接著進(jìn)行熱變性作用。這些研究的結(jié)果見表7。
表7
*Y表示水溶液中的重褶能力，N表示可變域在水溶液中不能重褶，nd＝未確定第十部分袖珍庫(kù)方案從溫度選擇的克隆庫(kù)(易錯(cuò)和G3.25庫(kù))內(nèi)發(fā)現(xiàn)的氨基酸取代位置進(jìn)行分析從而在特殊位點(diǎn)的整個(gè)序列空間都可以得到考察。
易錯(cuò)PCR試驗(yàn)了一些有限的些列空間。例如，1bp改變/模板的頻率的易錯(cuò)Vκ庫(kù)中選擇的A50P取代總共只能試驗(yàn)6個(gè)附加的氨基酸。在位置50的丙氨酸被密碼子GCT所編碼。改變這個(gè)密碼子中的一個(gè)堿基對(duì)可以給出下面的密碼子排列和氨基酸丙氨酸＝GCT，GCA，GC G，GCC天氡氨酸＝GAT甘氨酸＝GGT脯氨酸＝CCT絲氨酸＝TCT蘇氨酸＝ACT纈氨酸＝GTT通過密碼子NNK(N＝A，G，C or T；K＝G or T；M＝A or C)在特殊位點(diǎn)任意排列的寡核苷酸被用于PCR策略中進(jìn)行試驗(yàn)整個(gè)序列空間(見表8)。對(duì)Vκ兩步PCR策略也被采用。(見Landt，O.et al.Gene 96125～128(1990))最初的PCR產(chǎn)物(也可叫做“mega-引物”)是采用FD-Myc引物一起改變(見第八部分和第九部分)產(chǎn)生的，這個(gè)FD-Myc引物是將為了亞克隆的ApaL1或Not1限制性位點(diǎn)帶入到如前所述的FD-Myc中構(gòu)成的。
VκFD-Myc PCR引物5’GAG CGC CGT GCA CAG ATC CAG ATG ACC CAG TCT CC 3’(SEQID NO71)5’GAG TCG ACT TGC GGC CGCCCG TTT GAT TTC CAC CTT GG3’(SEQ ID NO72)限制性位點(diǎn)ApaL 1(GTGCAC)和Not 1(GCGGCCGC)用下劃線標(biāo)出。引物的5’端用生物素標(biāo)記。結(jié)合ApaL1位點(diǎn)可導(dǎo)致VH和Vκ的第一個(gè)氨基酸變成谷氨酸。
DPK9可用作DNA的模板。第一輪PCR產(chǎn)物或mega-引物隨后被用于有第一輪亞克隆進(jìn)Fd-Myc反應(yīng)中沒有用的第二個(gè)引物存在的第二輪PCR反應(yīng)中。這次的PCR給出的產(chǎn)物包含有適合亞克隆進(jìn)Fd-Myc各個(gè)位點(diǎn)的Apal1/Not1限制性位點(diǎn)。
對(duì)VH應(yīng)用了SOE PCR。(見Horton，R.M.et al.Gene 7761-68(1989))被SOE PCR用于產(chǎn)生取代的引物如表9所示。突變產(chǎn)物擴(kuò)增所必須的附加引物和亞克隆進(jìn)Fd-Myc中的Apal1/Not1位點(diǎn)的序列是5’GAG CGC CGT GCA CAG GTG CAG CTG TTG 3’(SEQ ID NO73)5’GAG TCG ACT TGC GGC CGC GCT CGA GAC GGT GAC 3’(SEQ IDNO74)表8包含NNK密碼子的Vκ寡核苷酸
a45、48、49和50位置的引物是正義/反義串，因此顛倒NNK到KNN，并將其用于包含有ApaL1位點(diǎn)的編碼串的VκFd-Myc引物的第一輪PCR反應(yīng)中。倒過來，設(shè)計(jì)了編碼串75位點(diǎn)用于包含了Not1位點(diǎn)的反義Fd-Myc引物中。
表9 SOE PCR中的VH寡核苷酸
一旦開始裝配和消化，PCR片段就會(huì)連接上Fd-Myc引物的ApaL1和Not1位點(diǎn)。連接后的DNA通過電穿孔轉(zhuǎn)化到E.coli TGI細(xì)胞中。在37攝氏度下經(jīng)過一個(gè)小時(shí)的表型表達(dá)，將這些細(xì)胞放到補(bǔ)有15ug/ml四環(huán)素的TYE平板上。
為了從袖珍庫(kù)中篩選，培養(yǎng)采用第四部分描述的96孔細(xì)胞培養(yǎng)平板。為了進(jìn)行適當(dāng)?shù)目刂疲齻€(gè)孔(通常為A1，D6，H11)接種上正義控制的噬菌體(例如Fd-myc-HEL4)，三個(gè)孔接種上負(fù)義控制的噬菌體(例如，F(xiàn)d-myc-DP47d)。剩下的90個(gè)孔接種上來自袖珍庫(kù)的90個(gè)不同的克隆。每個(gè)袖珍庫(kù)的平板準(zhǔn)備程序是一樣的。
每個(gè)袖珍庫(kù)用90個(gè)克隆足以覆蓋編碼的差異。事實(shí)上，既然用NNK來表示每一個(gè)位置的多樣性，這里面總共只有32種可能。對(duì)90個(gè)克隆的篩選保證了有超過90％的機(jī)會(huì)使得每個(gè)可能的編碼(和因此得到的氨基酸)在篩選的袖珍庫(kù)中至少會(huì)出現(xiàn)一次。這也保證了在所有研究的(隨機(jī)的)位點(diǎn)篩選到覆蓋所有可能的氨基酸取代物。噬菌體的生物素化程序和通過ELISA檢測(cè)/篩選的描述見第四部分。
幾種噬菌體可從表現(xiàn)有良好的解折疊性的VH袖珍庫(kù)中得到。這些噬菌體隨后進(jìn)入第二中篩選程序(見第五部分)從而得到更多的解折疊性的數(shù)據(jù)。
第十一部分dAbs的亞克隆，表達(dá)和純化亞克隆選擇的替代物被亞克隆到能在E.coli BL21(DE3)(pLysS)中表達(dá)的的質(zhì)粒中。來自Fd-Myc的噬菌體克隆的DNA在采用包含有Sal1和BamH1限制性位點(diǎn)的引物中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所描述的DNA測(cè)序、有PCR來自Fd-Myc/TG1克隆的VH或VKDNA的分離在本協(xié)議中是重要的。用過的引物見表10。向前的引物導(dǎo)入了兩個(gè)氨基酸(絲氨酸和蘇氨酸)到N-末端。這是制造一個(gè)Sal1限制性位點(diǎn)的結(jié)果。反義引物在編碼區(qū)域的終點(diǎn)設(shè)計(jì)有兩個(gè)連續(xù)的終止編碼(TAA)。
表10亞克隆的寡核苷酸
表達(dá)和純化來自包含有表達(dá)質(zhì)?？寺〉男迈r轉(zhuǎn)化的E.coli菌株BL21(DE3)pLysS的克隆簇在2xTY(青霉素/氯霉素、37攝氏度，250rpm條件下生長(zhǎng)過夜。)生長(zhǎng)過夜的培養(yǎng)液的按1/100接種到相同培養(yǎng)基的更大容器中在相同條件下知道其生長(zhǎng)到OD600＝0.9為止。然后將1mM IPTG(異丙基β，D-硫代半乳糖苷酶)加到培養(yǎng)液中，接著讓培養(yǎng)液在30℃下培養(yǎng)過夜。然后將發(fā)酵液在3300g、4℃下離心10分鐘。上清液通過0.45μm得到。
可溶性的的VH和VκdAb可從蛋白A或蛋白L基質(zhì)(蛋白A瓊脂或蛋白L瓊脂)。依靠培養(yǎng)液的體積，上清液可以直接加到蛋白A或L基質(zhì)柱中，或者基質(zhì)直接加到上清液中(分批鍵合)。可從收集的基質(zhì)中得到分批鍵合的上清液，或者可將基質(zhì)填充到一個(gè)適合的柱子里。從蛋白A或蛋白L的基質(zhì)中得到的上清液表現(xiàn)出低的pH值。DAbs可以通過Superdex75柱進(jìn)行進(jìn)一步的凝膠過濾。(法瑪西亞技術(shù))第十二部分CD分析在4℃PBS中透析過夜，并采用截取分子量為5000的離心收集試管離心濃縮(20℃)可純化dAbs。將含有1-5μMPBS的1.5毫升dAb裝進(jìn)CD玻管(1厘米厚)中放入J-720分光偏振計(jì)中，在12nm/min掃描速度、2-nm掃描寬度和1秒積分時(shí)間的條件下從200nm-250nm(在平均基礎(chǔ)上的四個(gè)積累段)的遠(yuǎn)紫外區(qū)記錄室溫(25℃)和高溫(85℃)下的光譜。
熱誘導(dǎo)的解折疊曲線在間隔2nm波段寬度的六個(gè)固定波長(zhǎng)(常常是235nm，有時(shí)也在225nm)下記錄。CD玻管中的溫度以每小時(shí)50℃的速度上升，變化范圍為25℃-85℃。在1/20秒的讀取頻率，1秒的積分時(shí)間和間隔2nm波段寬度條件下讀取數(shù)據(jù)。解折疊后，將樣品迅速冷卻到25℃(15℃/min)，記錄其光譜，一個(gè)新的熱誘導(dǎo)的解折疊曲線被記錄。
通過比較第一次和第二次熱誘導(dǎo)曲線可對(duì)dAb分子熱誘導(dǎo)變性后的可可逆解折疊的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。超壓的第一次和第二次熱誘導(dǎo)的解折疊曲線表明在1-5μMPBS(例如，pA-C36，pA-C47)中dAb可可逆熱解折疊。在遠(yuǎn)紫外區(qū)結(jié)果也一樣正確25℃記錄的超壓的第一次和第二次光譜表明dAb可可逆解折疊(見圖8)。
如果dAb在熱解折疊時(shí)聚集，第一次的解折疊曲線的表征應(yīng)該有一個(gè)混合的陡的躍變和嘈雜的柱狀躍變線(由于集結(jié)的積累作用)。而且，第二次解折疊曲線根本上和第一次的不相同混合的躍變幾乎不能檢測(cè)，因?yàn)闆]有，或很少解折疊的分子在樣品降溫的時(shí)候能正確的重褶。所以，第一次和第二次的遠(yuǎn)紫外光譜很不相同，后者與用變性分子觀測(cè)到的結(jié)果更相似。聚集的dAb的一個(gè)典型的例子就是虛擬的DP47，或DP47-W47R(圖9)。
采用同樣的方法，下面分離的人的VH dAbs表現(xiàn)出人解折疊不可逆性虛擬的DP47，BSA1，DP47-F29V，DP47-W47R，DP47-G54D，DP47-W103R。
下面分離的人的VH dAbs已證實(shí)完全可可逆解折疊HEU4，pA-C13，pA-C36，pA-C47，pA-C59，pA-C76，pA-C85，DP47-F27D，DP47-F27D/F29V/Y32E/S35G，DP47-Y32D。同時(shí)證實(shí)DP47-S35G的可可逆解折疊性有很小程度的損失。
第十三部分Vκ結(jié)果的袖珍庫(kù)噬菌體ELISA和克隆的評(píng)估是根據(jù)本協(xié)議第四部分完成的，選擇出的表現(xiàn)出可可逆解折疊性的克隆的DNA測(cè)序是根據(jù)本協(xié)議的第六部分完成的。
表11供熱可逆解折疊選擇的Vκ結(jié)果的袖珍庫(kù)的克隆中發(fā)現(xiàn)的突變
表12熱處理后保持大于70％蛋白L鍵合活性的在位點(diǎn)45處的替代物
aK45E，148N，Y49D/N，A50P和175N處的單個(gè)替代物是從易錯(cuò)噬菌體展示庫(kù)里通過溫度選擇得到的(第一部分)。易錯(cuò)PCR試驗(yàn)了有限的序列空間。因此，這些位點(diǎn)被NNK寡核苷酸誘變發(fā)生隨機(jī)變化從而使得整個(gè)序列空間都得到研究。
b從每一個(gè)袖珍庫(kù)里的94個(gè)克隆的噬菌體可通過在80℃、10分鐘條件下檢測(cè)蛋白L鍵合活性來篩選。熱處理之前對(duì)噬菌體進(jìn)行生物素?；?，隨后在涂有一層蛋白L的平板上得到它，并通過HRP來進(jìn)行檢測(cè)。從每個(gè)庫(kù)中得到的活性高于70％的大約10個(gè)克隆將進(jìn)行測(cè)序。由于第二個(gè)位點(diǎn)的替代物和差的序列信號(hào)，序列的總數(shù)有時(shí)會(huì)少于10。(例如，已發(fā)現(xiàn)可以維持高的活性的多個(gè)替代物如下K45T/Q90P；K45D/S60P；Y49R/S10F；Y49S/T20A；Y49S/Q27R；A50P/I48V；A50R/A13G/K42E)活性在0-10％范圍的A50X袖珍庫(kù)中的五個(gè)克隆的注解給出下列序列2A，1T，1V，1Y。
c175位點(diǎn)的替代物代表部分結(jié)果。
第十四部分VH結(jié)果的袖珍庫(kù)噬菌體ELISA和克隆的評(píng)估是根據(jù)本協(xié)議第四部分完成的，當(dāng)加熱和冷卻的時(shí)候選擇的表現(xiàn)出可可逆解折疊性的克隆的DNA測(cè)序是根據(jù)本協(xié)議的第六部分完成的。
表13
在選擇的氨基酸欄，()里的數(shù)字與帶有這個(gè)突變的克隆數(shù)目一致，這些是經(jīng)過噬菌體ELISA篩選得到肯定后挑選的。在最好的％重褶性欄(也就是...蛋白A ELISA)，()中的數(shù)字與載有特殊突變的所有克隆所觀測(cè)到的％重褶性值一致。
在帶有下列突變的克隆中發(fā)現(xiàn)有假突變(Ser25-Pro)A84E，or A33V，or A33E，or A33Q。有可能S25P突變?cè)谥伛扌陨嫌幸粋€(gè)肯定的效果。這有可能在預(yù)計(jì)的位點(diǎn)上超過突變的效果。
為了噬菌體的重褶性，根據(jù)本協(xié)議第五部分描述的進(jìn)一步分析肯定的克隆數(shù)，其結(jié)果見表14所示。
表14
Ref.的意思是根據(jù)本協(xié)議第五部分通過蛋白A鍵合來確定噬菌體的％解折疊性。SE-15代表從Cys22(包括它)到Trp36(包括它)的序列片段的S/E疏水分?jǐn)?shù)特殊克隆的每個(gè)氨基酸的疏水分?jǐn)?shù)都已加入并被15分開。四倍體意思是四倍突變體(例如，F(xiàn)27D/F29V/S35G/Y32E)。
第十五部分通過熱變性作用篩選的抗聚集作用域的抗體蛋白聚集是生化技術(shù)上的一個(gè)難題。這我們描述了一個(gè)通過熱變性作用篩選有抗聚集作用的多肽的方法。這也可以闡述傾向于聚集的抗體重鏈可變域(dAbs)(Ward，E.S.，et al.Nature341，544-546(1989)；Ewert，S.，et al.Biochemistry 41，3628-3636(2002))。在絲狀噬菌體的傳染性頂端dAbs展示了它的多化合價(jià)，瞬時(shí)加熱引導(dǎo)其解折疊促進(jìn)了dAbs的聚集。冷卻后，選擇dAbs鍵合到蛋白A上(一個(gè)與折疊式dAbs鍵合的普通的配體)?？煽赡娼庹郫B的噬菌體展示dAbs從而了那些不可逆的。噬菌體dAbs體系中的六個(gè)dAbs在選擇后被表征，所有的抗聚集作用的，都是可溶的，能在細(xì)菌中很好的表達(dá)，并可得到高的純化產(chǎn)率。這些結(jié)果證實(shí)了這里所描述的方法可以用來生產(chǎn)抗聚集作用的多肽，并且可以識(shí)別氨基酸殘基、序列或特征以促進(jìn)或阻止那些包括蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊的疾病(Dobson，C.M.Trends Biochem Sci24，329-332(1999)；Rochet，J.C.& Lansbury，P.T.，Jr.Curr OpenSti-uct Biol 10，60-68(2000))的蛋白聚集。
與人的VH dAbs相比較，駱駝早就表現(xiàn)出抗聚集作用，甚至當(dāng)溫度加熱到90℃的高溫也沒問題(Ewert，S.，et al.Biochemistry41，3628-3636(2002)；Dumoulin，M.et al.Protein Sci 11，500-515(2002)；van der Linden，R.H.et al.Biochim Biophys Acta 1431，3746(1999))。這個(gè)顯著的性質(zhì)歸結(jié)于可可逆解折疊性，和一系列在β-折疊支架中的高的保存、主要的親水性突變已被建議用于解釋這個(gè)行為(Ewert，S.，et al.Biochemistry 41，3628-3636(2002)；Durnoulin，M.et al，Protein Sci 11，500-515(2002))。如這里所描述的，提到的作為HEL4的人的VH dAb有于那些駱駝相似的生物物理性質(zhì)(也見Jespers，L.，et al.J Mol Biol 337，893-903(2004))。例如，HEM dAb可在濃度為56μM、高于62.1℃(Tm)條件下可逆解折疊。相比較而言，在高于55℃加熱5.0μM的DP47d dAb(一個(gè)典型的被作為HEL4dAb的線狀胚系的基因編碼的人的VHdAb)的溶液會(huì)導(dǎo)致不可逆解折疊和聚集體系(Jespers，L.，et aLJMol Biol 337，893-903(2004))。人的HEL4dAb在β-折疊支架中沒有突變，而且不同于被包含互補(bǔ)決定性區(qū)域(CDRs)的環(huán)中的突變的DP47d dAb(表15)。我們采用HEL4和DP47d dAbs發(fā)展了一個(gè)方法，用于從那些不可逆聚集體中篩選可可逆解折疊的人的VH dAbs。
HEL4和DP47d dAbs展示了絲狀噬菌體表面的多化合價(jià)狀態(tài)，因此在抗體表型和基因型之間提供了連接和一個(gè)強(qiáng)有力的篩選方法(McCafferty，J.，et al.Nature，348，552-554(1990))。為了促使變性，融合噬菌體(5×1011轉(zhuǎn)換單位/ml(TU/ml))應(yīng)加熱到80℃10分鐘(Holliger，P.，et al.J Mol Biol 288，649-657(1999))；但是dAbs不行，它在60℃以上解折疊(Ewert，S.，et al.Biochemistry 41，3628-3636(2002))。冷卻后，展示的噬菌體dAbs通過關(guān)于蛋白A的噬菌體ELISA來測(cè)定解折疊性能。鍵合為HEL4簡(jiǎn)化了3個(gè)折疊，但是為DP47d噬菌體簡(jiǎn)化了560個(gè)折疊。(圖15A)。這表明在噬菌體頂端可可逆解折疊的HEL4dAb是有意義的，但是DP47d沒有。
DP47d dAb加熱時(shí)的聚集通過電子顯微鏡透射觀察沒用的污染的噬菌體，盡管DP47d噬菌體和加熱過的HEL4噬菌體(圖16C)沒有看到聚集簇，還是可以觀察到大于90％的加熱過的DP47的噬菌體(圖16A和圖16B)通過它們的端點(diǎn)連接到一塊。這些噬菌體簇為DP47d熱變性作用后的聚集提供了直接的證據(jù)。這些簇的出現(xiàn)既要求有高的噬菌體濃度，又要求在噬菌體頂端有高的dAb濃度(每個(gè)頂端展示的dAbs的數(shù)目)。蛋白印跡免疫分析表明對(duì)多化合價(jià)的噬菌體～80％的五個(gè)pIII外層蛋白載有一個(gè)dAb而單價(jià)噬菌體為～20％(圖16D)。所以，當(dāng)加熱效價(jià)為1×109的多價(jià)DP47d噬菌體或效價(jià)為5×107的單價(jià)DP47d噬菌體時(shí)觀察不到噬菌體簇，而且在兩種情況下蛋白A的鍵合各自分別只減少了8個(gè)折疊和6個(gè)折疊(圖15B)。在沒有任何特別的理論舒服的情況下將可以看到，當(dāng)把DP47d dAb加熱到80℃時(shí)，DP47d dAb會(huì)在噬菌體頂端聚集成微小的集體開始聚集(內(nèi)部聚集步驟)然后通過噬菌體簇(噬菌體相互作用步驟)生長(zhǎng)形成低聚集團(tuán)，因此像所說的其它蛋白一樣，噬菌體體系的聚集作用是一個(gè)兩步的過程(Dobson，C.M.Trends Biochem Sci 24，329-332(1999))。
不可逆解折疊的熱的噬菌體展示的dAbs減小了傳染性同前面觀察的野生型絲狀噬菌體一樣，80℃輕微的減少了(減少3個(gè)折疊)HEL4噬菌體的傳染性(Holliger，P.，et al.J MolBiol 288，649-657(1999))，但是很大程度上降低了DP47d噬菌體的傳染性(減少≥70個(gè)折疊)(圖15C)。加熱過的DP47d的傳染性可以通過添加干擾素得到部分恢復(fù)，推測(cè)這可能干擾素穿透了dAb和/或連接dAb和pIII蛋白質(zhì)的多肽連接物。這些觀測(cè)與模型是一致的，在這個(gè)模型里，DP47d dAb在噬菌體內(nèi)和噬菌體間的聚集阻止了pIII蛋白的N-末端區(qū)域與細(xì)菌菌毛和/或TolA受體的鍵合(Holliger，P.，et al.JMol Biol 288，649-657(1999))。
噬菌體展示的HEL4和DP47d dAbs的選擇是在各自混合比例為1∶106、80℃孵化10分鐘、冷卻和在固定化蛋白A上選擇的條件下進(jìn)行的。被束縛的噬菌體用干擾素洗提，并用于重新感染細(xì)菌。經(jīng)過兩個(gè)周期這樣的選擇后，感染的克隆(n＝86)的上清液經(jīng)過關(guān)于固定化雞蛋溶菌酶(HEL)的ELISA的檢驗(yàn)后用做從DP47d噬菌體中區(qū)分出HEL專一性HEL4噬菌體。
12個(gè)克隆中的噬菌體限制著雞蛋溶菌酶(每選擇一圈會(huì)富集相應(yīng)的HEL4噬菌體的360個(gè)折疊)。在沒有加熱時(shí)重復(fù)用蛋白A進(jìn)行選擇時(shí)86例測(cè)試的克隆中沒有一例可以分泌HEL4噬菌體。因此，通過兩輪的熱變性作用和蛋白A的生物淘選，抗熱聚集的噬菌體dAbs可以從那些沒有的沒有此功能的中挑選出來。
一個(gè)人的VH dAbs體系(1.6×109克隆)通過比較CDRs和DP47d dAb和展示噬菌體的多化合價(jià)得到的環(huán)的多樣性取得。蛋白A篩選后的三輪熱變性作用作用之后，200個(gè)克隆之外的179個(gè)分泌了加熱后仍能保持超過80％蛋白A鍵合活性的dAb噬菌體。20個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序后顯示在CDRs序列和長(zhǎng)度中dAb序列有著大量的可變性(表15)。其多樣性表明，像HEL4，包含CDRs的位于環(huán)中的突變足夠?qū)奂饔卯a(chǎn)生抗性。這些dAbs中的18個(gè)有酸性的等電點(diǎn)(5.1±1.1，平均數(shù)±SD)，這與協(xié)議前面所說的在網(wǎng)狀蛋白充填和抗性與聚集的直接的相互作用是一致的。(Wilkinson，D.L.&Harrison，R.G.Nature 341，544-546(1991)；Chiti，F(xiàn).et al.Proc Natl Acad Sci USA.99，16419-16426(2002))為了進(jìn)一步表征(C13，C36，C47，C59，C76，and C85)，挑選包含10-20個(gè)氨基酸的CDR3s的六個(gè)dAbs。這些蛋白選自細(xì)菌，與只有2.9ml/LDP47d dAb比較在細(xì)菌抑制中C36，C47和C59dAbs的恢復(fù)的產(chǎn)率高達(dá)20mg/L。(表16)在固定化蛋白A的純化后，將dAbs通過superdex-75柱的體積排阻色譜(凝膠過濾柱；安瑪西亞生物技術(shù)公司)。Dabs洗提時(shí)是一個(gè)單分散對(duì)稱峰，幾乎可以定量回收，表明它可以和其它的人的dAbs相比較(Ewert，S.，et al.Biochemistry 41，3628-3636(2002)；Ewert，S.，et aL J MolBiol 325，531-553(2003))。它們不會(huì)粘到柱子的基質(zhì)上。Dabs洗提的分子量平均(Mr-app)為17kDa(10-22kDa)，與計(jì)算dAbs的單峰的分子量(Mr-calc)13-14kDa相似。(圖17A)從其它的dAbs觀察Mr-app變化的(Ewert，S.，et al.Biochemistry 41，3628-3636(2002)；Ewert，S.，et at.JMol Biol 325，531-553(2003))而且可能導(dǎo)致與柱基質(zhì)或單體/二聚體微弱的瞬時(shí)反應(yīng)(Sepulveda，J.，et al.JMol Biol 333，355-365(2003))。重要地，在5μM，每一個(gè)都選擇可可逆解折疊的dAbs并協(xié)同有熱變性作用地重復(fù)循環(huán)。(圖17B)因此，選擇地dAbs不僅要有抗聚集性，還要像報(bào)道的駱駝地dAbs(Ewert，S.，et al.Biochemistry 41，3628-3636(2002)；Arbabi Ghahroudi，M.，et al.FEBS Lett 414，521-526(1997))一樣，是單節(jié)顯性，表達(dá)好，并在凝膠過濾純化時(shí)有好的收率。
抗原的選擇在上面描述的工作里，蛋白A，一個(gè)可鍵合每一個(gè)體系的常見配體，在這用來篩選。但是，任何期望的抗原都可以用來選擇將可可逆解折疊性和期望的抗原的特異性結(jié)合到一起的dAbs。這就證實(shí)了通過選擇一個(gè)合成的人VH體系與人血清白蛋白(HSA)鍵合，有或沒有熱變性步驟，在兩輪篩選后為了鍵合到HSA上接著進(jìn)行篩選44個(gè)克隆。在沒有加熱步驟的時(shí)候，篩選到能結(jié)合HSA的六個(gè)獨(dú)特的dAb克隆(表15)。當(dāng)應(yīng)用加熱步驟時(shí)，一個(gè)單dAb克隆(#10克隆，表15)得到了恢復(fù)。盡管在序列上與其它的克隆中的三個(gè)很相似(#2、#5、#6和#10有92％同源性)，只有10#顯示出可可逆解折疊的性質(zhì)(與其它的維持低于10％的鍵合信號(hào)相比，克隆#10噬菌體加熱后能維持與HSA100％鍵合信號(hào))。
討論蛋白聚集使得正常工藝路線偏離而與折疊路線競(jìng)爭(zhēng)，并且經(jīng)常涉及到解折疊狀態(tài)的關(guān)聯(lián)，或者部分解折疊狀態(tài)的關(guān)聯(lián)。通過引導(dǎo)穩(wěn)定的天然的突變和/或縮小解折疊或部分解折疊狀態(tài)的聚集的傾向(例如，通過增加這些狀態(tài)的可溶解性)可獲得抗聚集性。(增加ΔGN-U，折疊的自由能)為了改變選擇的蛋白變異體的穩(wěn)定性有幾種策略可供選擇(i)將噬菌體的感染性和展示蛋白的蛋白水解抗性連接到一起(Kristensen，P.& Winter，G.FoldDes 3，321-328(1998)；Sieber，V.，et al.Nat Biotechnol 16，955-960(1998)；Martin，A.，et al.JMolBiol 309，717-726(2001))和/或(ii)提高溫度或增加變性劑對(duì)展示蛋白提出挑戰(zhàn)(Shusta，E.V.，et alNat Biotechnol 18，754-759(2000)；Jung，S.，et al.JMol Biol 294，163-180(1999)).除了大多數(shù)穩(wěn)定的蛋白變異體，直到現(xiàn)在幾乎所有的焦點(diǎn)都開始動(dòng)搖(和進(jìn)一步消除)。例如，通過加熱噬菌體抗體庫(kù)到60℃，Jung et al.(JMol Biol 294，163-180(1999))用一個(gè)改善的ΔGN-U(+3.7kcal/mol)選擇了4D5Flu抗體片段的變異體，它能在60℃維持折疊。除了這個(gè)溫度之外，抗體片段的折疊在當(dāng)噬菌體展示抗體片段被加熱時(shí)導(dǎo)致了聚集和感染性的損失。
通過比較，在這里描述的研究里，篩選包括體系里所有穩(wěn)定的和不穩(wěn)定的可誘導(dǎo)折疊的dAbs。這個(gè)選擇過程控制dAbs的可解折疊的能力從而避免在80℃加熱和冷卻帶來的在噬菌體尖端的不可逆性的聚集。選擇的dAbs的折疊性能不能歸因于天然狀態(tài)的穩(wěn)定性，是因?yàn)檫x擇的dAbs的熱力學(xué)穩(wěn)定性的生物物理分析表明選擇的域沒有典型的聚集傾向的人的dAbs穩(wěn)定。因?yàn)樵?5℃折疊的自由能(ΔGN-U)(14-23kJ/mol)(表16)比那些DP47d dAb(35kJ/mol)和其它的建立在相同的人的DP47/3-23細(xì)菌線狀片段(39.7-52.7kJ/mol)的聚集傾向的dAbs要低的多。(Tomlinson，I.M.，et al.JMol Biol 227，776-798(1992)；Ewert，S.，et al.Biochemistry 41，3628-3636(2002))因此這里所描述的采用熱變性作用的選擇過程選擇了解折疊狀態(tài)和部分解折疊狀態(tài)的有利的性質(zhì)。
選擇的dAbs的其它的一些有利的性質(zhì)在它們對(duì)聚集作用的抗性方面直接有所體現(xiàn)。例如，從這些抗聚集的dAbs中獲得高水平的表達(dá)與作為胞間聚集的E.coli中的重組抗體片段產(chǎn)物限制產(chǎn)率的主要因素證實(shí)是一致的。(Wrn，A.& Pltickthun，A.JMolBiol 305，989-1010(2001))另外，這兒選擇的dAbs在凝膠過濾時(shí)氡不會(huì)粘在基質(zhì)上。
這里所描述的方法可以用于生產(chǎn)改善了的那些可以在絲狀細(xì)菌噬菌體(例如，在一個(gè)多化合價(jià)的狀態(tài)中)表面功能性展示的和被只能識(shí)別一個(gè)正確的折疊狀態(tài)的多肽(例如，鍵合有正確折疊的多肽的抗體，鍵合有正確折疊的多肽的受體)的配體綁定的其它多肽的版本(例如，在細(xì)菌胞間表達(dá)的多肽)。這樣的多肽可以通過噬菌體多樣化(例如，通過隨機(jī)誘變工程)展示、變性和在回到自然狀態(tài)(重褶)允許的條件后通過生物淘選(或其它適合的辦法)來挑選。這里描述的方法也提供了一個(gè)鑒別多肽片段氨基酸殘基的分析手段，這些殘基可能是蛋白重褶時(shí)偏離了路線，其中包括那些蛋白錯(cuò)誤重疊的疾病的情況(Dobson，C.M.Trends Biochem Sci 24，329-332(1999)；Rochet，J.C.& Lansbury，P.T.，Jr.Curr Opin Struct Biol 10，60-68(2000))。
表15本研究中描述的包含dAbs的CDRs的環(huán)的序列
1根據(jù)Kabat et al.定義的CDR1，2 and 3和根據(jù)Chothia et al的結(jié)構(gòu)性環(huán)H1，2and 3a......這些區(qū)域和94 of FR3的殘基給出的序列。
2根據(jù)Kabat et al.的殘基數(shù)目。
3蛋白A(a)和人血清白蛋白選擇的克隆的序列。
4H3-CDR3的氨基酸的長(zhǎng)度。
4這個(gè)克隆也包括框架2中Trp47到Cys的一個(gè)突變。
表16選擇的dAbs的生物物理的和表達(dá)的數(shù)據(jù)
1可逆解折疊(或DP47d dAb聚集)的溫度中間轉(zhuǎn)折點(diǎn)。
2從熱變性作用曲線得到的熱力學(xué)穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)。
325℃脲引導(dǎo)的去變性作用曲線中得到的熱力學(xué)穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)。(未出版的數(shù)據(jù)，L.J.，O.S.，G.W.and L.C.James)4從Superdex G75洗提積分的峰面積獲得。
5標(biāo)準(zhǔn)化到OD600值5.0時(shí)細(xì)菌培養(yǎng)液的1L上清液中獲得的純化的蛋白的收率。
67％移入多聚物種樣品匹配的峰。
7nd未檢測(cè)。
方法噬菌體展示人類VH dAb基因組dAb基因組是通過DP47d dAb基因序列幾個(gè)密碼子的以低聚核苷酸為中介進(jìn)行的兩步多樣化反應(yīng)獲得的，具體方法如下所示(氨基酸位置及IUPAC-IUB核酸密碼的編碼方式)27，KWT；28，ANS；29，NTT；30，ANC；31，NMT；32，NAS；33，DHT；35，RSC；50，RSC；52，NNK；52a，RNS；53，VVw；54，CGT；94，RSW；101，NVS；102，THT；及CDR3從95到100X(這里的X是指按照字母順序從a到k)的NNK密碼子。經(jīng)過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA插入物從側(cè)面接入ApaL1.(5′-末端)and NotI(3′-末端)，消化并附著在Fd-Myc的相應(yīng)位點(diǎn)上，F(xiàn)d-Myc載體是從含有c-myc tag聚合酶(AM位點(diǎn)和gene III位點(diǎn)之間)的fdCAT1噬菌體(McCafferty，J.，et al.Nature 348，552-554(1990))衍生而來的一種多化合價(jià)噬菌體載體。然后，用電穿孔的方法將附著物導(dǎo)入大腸桿菌TG1細(xì)胞中，放入含有15μg/ml環(huán)四環(huán)素2xTY培養(yǎng)基(2xTY-Tet)中，得到5×1010單位的克隆庫(kù)。為了單價(jià)展示，將dAb基因(NcoI-NotI DNA片斷)接入質(zhì)粒pR2的相應(yīng)位點(diǎn)中，質(zhì)粒pR2是從pHENI(Hoogenboom，H.R.et al.Nucleic Acids Res 19，4133-4137(1991))中分離得到的，在Notai位點(diǎn)and gene III之間含有His 8和VSV標(biāo)記。按照文獻(xiàn)方法(McCafferty，J.，et al.Nature 348，552-554(1990)；Hoogenboom，H.R.et at Nucleic AcidsRes 19，4133-4137(1991))制備、純化及儲(chǔ)存噬菌體。向SDS PAGE(4-12％Bis-Tris凝膠，lnvitrogen公司)中加入，1×1010單位的克隆系來分析噬菌體蛋白，在用Millipore公司的PVDF(聚偏氯乙烯)Immobilon-P(0.45um)膜檢測(cè)，將膜密封后放入anti-pIII鼠科動(dòng)物抗體(MoBiTec公司)中培養(yǎng)，在放入抗鼠科過氧化物酶(sigma-Aldrich公司)中培養(yǎng)，最后放入電化學(xué)發(fā)光劑(AmershamBiosciences公司)中。
噬菌體ELISA化驗(yàn)ELISA培養(yǎng)板的孔中用下列配體涂層10μg/ml含有蛋白A的磷酸緩沖液；10μg/ml含有mab 9E10的磷酸緩沖液或0.1M含有3mg/ml HEL的NaHCO3緩沖液(pH 9.6)，4℃下放置過夜。在向每孔中加入添加2％v/v吐溫20的PBS緩沖液(PBST)及按一定級(jí)數(shù)稀釋的噬菌體溶液，培養(yǎng)2小時(shí)，用PBS緩沖液清洗，固定的噬菌體按照如下方法進(jìn)行分析在分析與HEL結(jié)合噬菌體過程中，可直接用山葵過氧化物酶及anti-M13單克隆抗體(Amersham公司)的結(jié)合物檢測(cè)，以3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺作底物。在分析與蛋白A結(jié)合的噬菌體過程中，要先將噬菌體(4×1010TU/ml)在4C條件下用生物素NHS(Perbio公司)(終濃度為50μM)進(jìn)行生物素?；?，然后在檢測(cè)過程中不斷向PBST溶液中加入鏈親和素-山葵過氧化物結(jié)合物(1μg/ml)(Sigma-Aldrich公司)，底物與上面相同。在分析與人血清白蛋白(HSA)(Sigma公司，PBS溶液中含有10μg/ml)相結(jié)合的噬菌體時(shí)，F(xiàn)LISA實(shí)驗(yàn)發(fā)生在含有2％脫脂奶粉的PBS緩沖液(PBSM)中，所的噬菌體通過兔anti-fd抗菌素單克隆抗體(Sigma公司，1/1000稀釋率)和山羊抗-兔IgG血清配體與山葵過氧化物酶(Sigma公司，1/1000稀釋率)反應(yīng)兩步監(jiān)測(cè)，底物同上。
電鏡檢查將噬菌體(1×1012TU/ml)加熱到80℃培養(yǎng)10分鐘，完成后置于4℃條件下或自然冷卻，在磷酸緩沖液中稀釋到1×1010TU/ml后，將噬菌體涂布與輝光涂炭銅格上(S 160-3，AgarScientific公司)，用磷酸緩沖液洗滌，然后用2％(W/V)的乙酸雙氧鈾著色，在BEl Tecnai 12電子顯微鏡下(120KV)觀察，在膜上記錄下校準(zhǔn)倍率。
噬菌體篩選免疫試管用蛋白A涂層，用PBST密封過夜，純化的噬菌體(1×1011TU/ml磷酸緩沖液中)按照上述方法加熱，用PBST稀釋到3ml，放入免疫試管中培養(yǎng)2小時(shí)，用磷酸緩沖液洗滌10次，用1ml包含100μg/ml胰蛋白酶的磷酸緩沖液洗提10分鐘，得到蛋白A束縛的噬菌體，用它在37℃條件下感染10ml大腸桿菌TG1細(xì)胞30分鐘，經(jīng)過多次稀釋，將噬菌體涂布到2xTY瓊脂培養(yǎng)基上.在下一輪篩選過程中，將菌體刮下放入200ml2xTY瓊脂培養(yǎng)基上于37℃條件下進(jìn)行擴(kuò)增(McCafferty，J.，et al.Nature348，552-554(1990))。對(duì)于HAS的篩選，應(yīng)用了一種合成的人類VH系(Domantis Ltd公司)，將抗原(磷酸緩沖液中含有10μg/ml)涂布在免疫試管中，以PBSM作阻聚劑，在進(jìn)行生物淘洗前對(duì)噬菌體肽庫(kù)(1×1012TU/ml)不進(jìn)行任何處理或只進(jìn)行熱處理作用。
蛋白質(zhì)的表達(dá)及純化將多種dAds的基因編碼序列半克隆入pET-12a中，并通過PCR反應(yīng)加入SalI和BamH1位點(diǎn)，在轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)pLysS細(xì)胞中(Novagen公司)中，30℃條件下經(jīng)過16小時(shí)后，dAb的表達(dá)(1L)誘使IPTG的產(chǎn)生，其最終濃度為1mM。經(jīng)過離心，懸浮物經(jīng)過濾(0.22μM)后加入5ml鏈?zhǔn)降鞍譇(AmershamBiosciences公司)與4℃條件下過夜培養(yǎng)，用磷酸緩沖液洗滌，束縛的蛋白dAds用0.1M氨基乙酸-HCl洗提(pH 3.0)，中和至pH為7.4，蛋白樣品用磷酸緩沖液透析濃縮，與4℃條件下存放。經(jīng)過SDS-PAGE用12％Bis-Tris膠(Invitrogen公司)處理后，蛋白質(zhì)純度可直接由視覺觀測(cè)計(jì)算。為了獲得單位培養(yǎng)基的表達(dá)率，從新鮮的經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中取五種菌系于37℃條件下進(jìn)行過夜培養(yǎng)，并按照上述方式表達(dá)(50ml)，過夜之后，測(cè)定所有培養(yǎng)基體積，按照上述方法進(jìn)行純化后測(cè)定相應(yīng)體積下的600×OD600nm(120到135ml)。用純化所得蛋白質(zhì)的總量來推得每升細(xì)菌培養(yǎng)基的蛋白轉(zhuǎn)化率，并根據(jù)最終5.0的OD600nm校正吸光度值。500μL 7μM的dAd溶液用SUPERDEX-75(AmershamBiosciences公司)進(jìn)行凝膠色譜分析，用統(tǒng)一的標(biāo)尺標(biāo)記色譜圖上的峰面積，最后表達(dá)率由曲線總面積表示。
循環(huán)二色性(圓二色)測(cè)量法向圓二色試管(1cm長(zhǎng))中加入5μM含有dAd的PBS溶液，放入J-720旋光分析儀(Jasco公司)中，在25℃和80℃條件下，用遠(yuǎn)紫外光(200nm-250nm)測(cè)定CD值，帶寬為2nm，整合時(shí)間為1秒。在235nm下檢測(cè)每一dAd溶液從25℃到80℃的CD延展曲線，并進(jìn)行一次重復(fù)測(cè)定。此延展曲線用文獻(xiàn)(Myers，J.K.，et al.Protein Sci 4，2138-2148(1995))方法分析后與文獻(xiàn)(Pace，C.N.& Scholtz，J.M.in Protein Structure，A Practical Approach，Edn.2.(ed.T.E.Creighton)299-321(Oxford University Press，NewYork；1997))所描述的完全符合，用Tm(轉(zhuǎn)變中點(diǎn)絕對(duì)溫度)，ΔHm(Tm條件下延展轉(zhuǎn)變焓)來計(jì)算蛋白質(zhì)在25℃條件下的熱力學(xué)穩(wěn)定性(方法見(Pace，C.N.& Scholtz，J.M.in ProteinStructure，A Practical Approach，Edn.2.(Ed.T.E.Creighton)299-321(Oxford University Press，New York；1997))。
第16部分將可折疊性門護(hù)殘基引入單一可變區(qū)并表明其特征可折疊性門護(hù)殘基是一種有著很好的生物物理性質(zhì)在蛋白序列中位于前列的氨基酸，能夠預(yù)防變性蛋白質(zhì)的不可逆聚集，確保蛋白變性的可逆性?？烧郫B性門護(hù)殘基的功能(由其位置及生物物理性質(zhì)決定)對(duì)溶液中未絮凝的變性蛋白的最大濃度有影響。所以，能夠?qū)⒖烧郫B性門護(hù)殘基引入缺少特異性抗原單一可變區(qū)(DP47d，or VK dummy)。
TAR2-10-27是一種含有人類腫瘤壞死基因1(TNFRI，有時(shí)也指″TAR2″)的Vn3基因，TAR2-10-27的氨基酸排列順序?yàn)镋VQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEWYWMGWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDAAVYYCAKVKLGGGPNFGYRGQGTLVTVSS (SEQ ID NO191)這一設(shè)計(jì)合理的方法是另一種方法的補(bǔ)充，可成功的將可折疊性門護(hù)殘基引入dAd基因庫(kù)的ab initio位點(diǎn)(見第18部分)。
選擇TAR2-10-27的可折疊性門護(hù)基團(tuán)在人類DP-47-Vn3基因區(qū)，H1-loop環(huán)繞的疏水序列防止了聚集作用的發(fā)生，定點(diǎn)突變及生物物理分析的結(jié)果表明，在DP-47集團(tuán)的22到36位點(diǎn)中，即使一個(gè)單點(diǎn)突變就可以使此可變區(qū)域在濃度大于5μM時(shí)獲得合適的可折疊性。單點(diǎn)突變的最適位點(diǎn)為Phe27和Tyr32，最適替代物為親水性Asp(天門氡氨酸)，Gln(谷氨酰氨)，Asn(天門冬酰氨)基團(tuán)及beta帶缺陷的Pro(輔氨酸)。如表17所示，TAR2-10-27的HI-loop序列上4個(gè)定點(diǎn)突變極大降低了SE-15(檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量)的值，并因此獲得較多的可折疊性產(chǎn)物。再加上定點(diǎn)突變方式，可進(jìn)一步降低SE-15的值，使之低于0。
表17
DP-47-VH3區(qū)域的F27D，F(xiàn)27Q，Y32D或Y32Q定點(diǎn)突變通過重疊-PCR反應(yīng)完成，半克隆所得核酸編碼的VH3突變區(qū)，純化表達(dá)的編碼蛋白。
將編碼這些蛋白質(zhì)的基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后半克隆入pET-12A載體的SalI及NotI酶切位點(diǎn)中，此載體的OmpT主導(dǎo)基因序列被一種真核生物的基因序列所取代。將此基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌BL21(DE3)pLyss中，涂布在含有TYE-瓊脂、5％葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素的培養(yǎng)基中37℃條件下進(jìn)行過夜培養(yǎng)。
從所生成的菌落中挑取單一生物菌落放入10mL 2xTY培養(yǎng)基(包含5％葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素)中37℃條件下進(jìn)行過夜培養(yǎng)，從過夜培養(yǎng)所得菌液中取出5ml放入含有500ml2xTY培養(yǎng)基的2.5L培養(yǎng)瓶中，于37℃條件下?lián)u床培養(yǎng)(250rpm)直至OD600nm的值在0.5-0.6，將培養(yǎng)瓶放入藥床中30℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)。20分鐘后，加入1mM的IPTG(終濃度)即可生成蛋白產(chǎn)物，繼續(xù)過夜培養(yǎng)。
將培養(yǎng)基倒入0.5或1L圓形的瓶子(玻璃或塑料)中，在加入0.5或1L1∶1的蛋白A漿(樹脂)(Amersham Biosciences公司)，將混合物卷起平放4℃條件下過夜。然后將瓶子數(shù)值放置使樹脂沉積到底部，將樹脂分別用1X PBS及500mM NaCl(2X)重復(fù)清洗，然后放入水滴型的柱中，用5倍體積的上述溶液繼續(xù)清洗，自然風(fēng)干，當(dāng)樹脂快干時(shí)，加入0.1M的PH為3的氨基乙酸，可收集到1ml的片斷。收集蛋白的試管事先用200μL1M的Tris洗提，直至pH等于7.4，從而起到中和作用。測(cè)定所得片段及洗提蛋白的OD280nm，包含蛋白的片斷在合適的緩沖液(多用1X PBS)的作用下可析出蛋白。測(cè)定蛋白濃度(用消光系數(shù)法)和純度(用SDS-PAGE分析儀)。
表18表示了每升培養(yǎng)基的蛋白產(chǎn)率，如上所述，pET/BL21(DE3)pLys S系統(tǒng)的DP-47-YH3區(qū)加入可折疊門護(hù)基因后，其蛋白表達(dá)量明顯增多。
表18
在不同濃度下測(cè)定加熱的或冷卻的蛋白聚合體。
在80℃條件下加熱不同濃度的蛋白(1-100μM)10分鐘，然后在4℃或室溫條件下放置10分鐘讓蛋白進(jìn)行復(fù)性，向復(fù)性的蛋白溶液中加入蛋白A球，靜置直到微球捕獲所有復(fù)性蛋白時(shí)為止。重復(fù)洗滌微球，用等量的微球填充SDS-PAGE凝膠。通過計(jì)量密度來確定收集蛋白的量/濃度，及計(jì)算高溫曝光后能夠完成一半復(fù)性的蛋白濃度([protein]50％)。
準(zhǔn)備不同濃度的蛋白樣品(1-100μM)，在PCR儀中加熱10分鐘(80℃條件下，溫度偏差小于10℃)，用0.5ml薄壁試管密封。對(duì)蛋白樣品制備一組平行樣，但不加熱。
加熱之后，將樣品在4℃條件下放置一段時(shí)間，在倒入1.5ml的試管中在4℃條件下高速離心10分鐘，回收上清液，向每個(gè)試管中加入20μL 1∶1的蛋白A漿(樹脂)，并用1mL PBS溶液加滿后用加熱的滾輪在室溫下包裹1-2小時(shí)，當(dāng)?shù)鞍譇微球固定上時(shí)，移去上清液，用1mL的PBS溶液洗滌微球3次，重新懸浮于40μL SDS緩沖液中。此緩沖液含有已知濃度的BSA，可作為修正裝載體積的標(biāo)準(zhǔn)。將樣品在90℃條件下加熱10分鐘，用14,000rpm的轉(zhuǎn)速離心分離10分鐘，取等量的樣品用12％的Bis/Tris S1DS-NuPage凝膠分離，用密度計(jì)量法確定相同的裝載量、背景和強(qiáng)度。將密度計(jì)量數(shù)據(jù)按照最初蛋白濃度作圖，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定[protein]50％，表19表示的就是蛋白濃度[protein]50％。
表19
在TAR2-10-27中引入可折疊門護(hù)基因?qū)τ诟叩鞍诐舛认碌牡鞍踪|(zhì)阻聚作用起到很好的效果，相對(duì)于平行樣TAR2-10-27，對(duì)于TAR210-27 F27D和TAR2-10-27 Y32Q濃度可提高2到4倍，對(duì)TAR210-27 Y32D濃度可提高7-25倍。
功能分析VH區(qū)TNF R 1蛋白的附著活性可通過受體附著化驗(yàn)器及細(xì)胞基化驗(yàn)器測(cè)定。
在受體附著器分析中，測(cè)定了抗-TNFRI VH區(qū)抑制TNF及重組TNF受體1(p55)結(jié)合的能力。簡(jiǎn)單得說，向MAXISORP培養(yǎng)板中加入30μg/ml抗人類Fc的鼠單克隆抗體(Zymed公司，圣弗朗西斯科，美國(guó))，過夜培養(yǎng)。用含有0.05％的吐溫-20的磷酸緩沖液洗滌微孔，加入含有1％BSA的磷酸緩沖液密封，然后加入100ng/ml的TNF受體1Fc融合蛋白(R&D Systems，明尼阿波利斯，美國(guó))。將抗-TNFR1 VH區(qū)和TNF混合，以10ng/ml的終濃度加入到經(jīng)過清洗的微孔中，用2μg/ml的生物酰化的抗TNF抗體(HyCult biotechnology公司，Uben，荷蘭)和1∶500倍稀釋的用辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素(Amersham Biosciences，UK)與TNF進(jìn)行抗體結(jié)合及顯色反應(yīng)，加入HCl可中止反應(yīng)，測(cè)定450nm下的吸光度?？?TNFRI VH區(qū)的結(jié)合活性降低了TNF的結(jié)合活性，因此降低了吸光度(圖18A)。
在基于細(xì)胞的分析試驗(yàn)中，通過將TNF導(dǎo)入HeLa細(xì)胞中(方法改自Akeson，L.et al.Journal of Biological Chemistry 271，30517-30523(1996)，描述了轉(zhuǎn)染方法)的方法測(cè)定抗-TNFRI VH區(qū)中和IL-8分泌物感應(yīng)現(xiàn)象的能力。簡(jiǎn)單的講，將HeLa細(xì)胞涂布到微型培養(yǎng)板上加入VH區(qū)蛋白及300pg/ml TNF過夜加速培養(yǎng)，加速培養(yǎng)后，除去上浮細(xì)胞，用夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試法(sandwich ELISA)(R&D Systems，明尼阿波利斯，美國(guó))測(cè)定IL-8含量?？?TNFRI VH區(qū)的結(jié)合活性降低IL-8的分泌物產(chǎn)量(圖18B)。
這兩種分析方法的結(jié)果表明TAR2-10-27 F27D和TAR2-10-27 Y32D保持了生物活性。其中TAR2-10-27 Y32D的活性與其平行樣dAb TAR2-10-27相同，TAR2-10-27的生物活性相對(duì)于TAR2-10-27來講有所降低(圖18A和圖18B)。在這兩種實(shí)驗(yàn)中，IC50的值可由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出，其精度取兩個(gè)因數(shù)的平均值。
結(jié)論這一部分表明，可以向預(yù)先確定特異性的VH區(qū)引入可折疊的門護(hù)殘基來增加變量，限制抗原結(jié)合活性的聚集。實(shí)現(xiàn)這一過程不需要預(yù)先知道VH區(qū)域的功能性抗體基團(tuán)結(jié)合區(qū)域。一個(gè)特別變量(TAR2-1027-Y32D)保持著全部的生物活性，對(duì)于聚集作用[protein]50％的抑制力增強(qiáng)了10的級(jí)數(shù)倍。引入可折疊門護(hù)基因的另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的表達(dá)水平(例如，在pET/BL21(DE3)pLysS系統(tǒng)中其表達(dá)水平增強(qiáng)了10n倍)。TAR2-10-27-Y32D的SE值(0.068)依然大于0，大于HEL4的SE值(-0.187)。因此，如果有需要的話，可繼續(xù)向TAR2-10-27-Y32D中插入可折疊性門護(hù)基因以便進(jìn)一步改善其生物物理性質(zhì)。
第十七部分從合成的VH域的庫(kù)中篩選包含有折疊門護(hù)的特異性的抗原VH域采用噬菌體展示技術(shù)，抗體可變域可從建立在與抗原結(jié)合的基礎(chǔ)上的人造體系中分離到。(例如，在細(xì)菌培養(yǎng)皿中鍵合抗原固定化在平板上，并回收粘著的噬菌體，“生物淘選”)。這個(gè)方法可以用于選擇可以與通過一個(gè)加熱變性步驟(或在反向控制的時(shí)候沒有加熱步驟)從合成的人的VH體系中的人血清白蛋白(HSA)鍵合的人的VH。
合成的VH域的噬菌體庫(kù)是4G庫(kù)，它是建立在包含有DP47線狀細(xì)菌基因和JH4片段的人VH3基礎(chǔ)上的。在下面的特殊位點(diǎn)的多樣性通過CDR1、CDR2和CDR3中的誘變(采用NNK密碼子；根據(jù)Kabat的編號(hào)方式)被引導(dǎo)CDR1中為30，31，33，35；CDR2中為50，52，52a，53，55，56；CDR3中4-12個(gè)多樣化的殘基例如H95，H96，H97，and H98 in 4G Hui 1 and H95，H96，H97，H98，H99，H100，H100a，H100b，H100c，H100d，H100e和4GH19中的H100f。最后的三個(gè)CDR3的殘基是FDY，所以CDR3的長(zhǎng)度在7-15個(gè)殘基范圍內(nèi)變化。庫(kù)中包含＞1×1010單獨(dú)的克隆。
協(xié)議4G庫(kù)被分成兩個(gè)有相等數(shù)量轉(zhuǎn)換單位(1×1011)的兩個(gè)亞庫(kù)。一個(gè)用于反HSA的生物淘選，另一個(gè)在每個(gè)淘選步驟前于80℃10分鐘條件下加熱解折疊。為了加熱步驟，噬菌體樣品在100μL PCR管中被分散。加熱后，片段開始結(jié)合。兩個(gè)樣品(加熱處理過的和沒有加熱控制的)都在4℃14000rpm條件下離心10分鐘。上清液在免疫試管里進(jìn)一步進(jìn)行選擇。免疫試管(100μg/ml)里覆有抗原(HAS，Sigma-Aldrich)，在4℃保存。試管中2MPBS溶液中填以2％脫脂乳。
結(jié)論在第一輪選擇后(R1)，大約有3000個(gè)噬菌體從試管中洗提出來(從加熱過的噬菌體庫(kù)和從未加熱的噬菌體庫(kù))。在第二輪選擇后，從未加熱的噬菌體中選擇到的克隆得到混在一起的菌苔，然而，加熱過的噬菌體庫(kù)的富集卻不是很顯著(大約效價(jià)增加2-5個(gè)折疊)。個(gè)體的克隆(n＝44)是從R2后的庫(kù)中(熱處理和控制)和生長(zhǎng)過夜的上清液中分泌的噬菌體中隨機(jī)選取得到的(采用96孔酶標(biāo)細(xì)胞培養(yǎng)板)。
根據(jù)本協(xié)議的第四部分進(jìn)行噬菌體ELISA，并做一些修改。酶標(biāo)板上的細(xì)胞覆蓋上HSA(10μg/ml)并充填2M PBS過夜。每個(gè)樣品采用0.1％吐溫-20的PBS溶液清洗三次。檢測(cè)試劑采用稀釋率為1∶1000兔抗噬菌體fd full IgG(Sigma)與和隨后的稀釋率為1∶1000的山葵過氧化物酶共扼的山羊-抗-兔的fullIgG(Sigma)。所有的個(gè)體的克隆都經(jīng)過加熱步驟或沒有加熱步驟抗HSA的測(cè)試。它們也經(jīng)過BSA(10μg/ml)和塑料的測(cè)試。只有2/37肯定的信號(hào)不具體。
正如所推測(cè)的，未經(jīng)過加熱控制篩選得到的所有克隆分泌不能持續(xù)進(jìn)行熱處理的噬菌體VH域。對(duì)比而言，加熱篩選得到的所有克隆分泌降溫時(shí)會(huì)折疊的噬菌體VH域。對(duì)ELISA反應(yīng)中得到肯定的36個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，從加熱淘選的克隆中得到6個(gè)唯一的序列，并且從熱解折疊淘選中得到一個(gè)唯一的序列(克隆#10)((表15b)#1-#4，#6，#7，和#10)。
在CDR1中位于30和31位點(diǎn)有兩個(gè)酸性殘基的克隆#10，表現(xiàn)出最低的SE值(0.06)(15個(gè)氨基酸窗口)。向比較而言，從不加熱的噬菌體篩選的所有序列中得到的SE平均值高于0.15(為0.203±0.020；平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)，從而解釋了它們高的聚集傾向。(有趣的是，#10和#2、#5、#6有92％的同源性，表明在這四個(gè)VH域的HSA上有一個(gè)普通的鍵合的抗原決定部位。但是只有克隆#10表現(xiàn)出了重褶性并在位置30和31保持折疊。
用純化的噬菌體對(duì)噬菌體展示的VH域的行為進(jìn)行進(jìn)一步的分析。根據(jù)本協(xié)議的第五部分進(jìn)行噬菌體ELISA，并做一些修正。1×108的噬菌體加熱處理(80℃，10分鐘，100μL)或放著不進(jìn)行加熱處理。
樣品在4℃14000rpm條件下離心10分鐘后將上清液加入到ELISA的覆有HAS(1/3的稀釋率)的洞中。ELISA顯影后，每個(gè)熱處理/未熱處理的噬菌體對(duì)OD450nm值(y軸)對(duì)噬菌體數(shù)目(x軸)作圖，從而計(jì)算出％-重褶性。結(jié)果如表20所示。
表20
結(jié)論結(jié)果表明，盡管不加熱情況下選擇的VH域克隆沒有一個(gè)在加熱后展現(xiàn)出10％的重褶性，熱解折疊步驟后HAS(克隆#10)上選擇的VH域當(dāng)在噬菌體表達(dá)時(shí)表現(xiàn)完全的抗性。這個(gè)研究證實(shí)加熱時(shí)可可逆解折疊的專一的抗原可變域可以從有聚集傾向的VH域的體系中選擇(前面的4G庫(kù)中的＞98％克隆表現(xiàn)出熱聚集現(xiàn)象)。
第十八部分包括折疊門護(hù)的殘基的人造VH域的噬菌體庫(kù)的創(chuàng)建第十六部分中示范的有良好的折疊性的VH域可從有聚集傾向的VH域中分離到，這個(gè)VH域中CDR1環(huán)是變化的。因此在主要的體系中VH域占很小的百分比在CDR1環(huán)中有折疊門護(hù)。這部分描述了多數(shù)可可逆解折疊的VH域的噬菌體體系的制備。
方法和結(jié)果多樣性由通過隨機(jī)地結(jié)合采用集合PCR編碼地多樣化地CDR1、CDR2和CDR3地DNA片段引入的。將產(chǎn)生的片段克隆進(jìn)一個(gè)噬菌體載體(Fd-myc其前導(dǎo)序列被一個(gè)真核的前導(dǎo)序列所代替，見第二部分)從而生成主要的庫(kù)(VH-6G)。VH庫(kù)建立在單個(gè)人的架構(gòu)上(V3-23/DP-47and JH4b)。被這個(gè)架構(gòu)編碼的規(guī)范的結(jié)構(gòu)(VH1-3)在人的抗體體系中是非常常見的。使用抗原結(jié)合位點(diǎn)的位置的多樣化的NNK使得側(cè)鏈也是多樣化的，抗原結(jié)合位點(diǎn)在已知的結(jié)構(gòu)中與抗原接觸，并在成熟的體系中高度的多樣化。多樣化與下面的位置是一致的(Kabat的編號(hào)方式)VH CDR1H30，H31，H32，H33，H35。
VH CDR2H50，H52，H52a，H53，H55 and H56。
VH CDR34-12多樣化的殘基例如H95，H96，H97，和4GH11中的H98和H95，H96，H97，H98，H99，H100，H100a，H100b，H100c，H100d，H100e and 4G H19中的H100f。最后的三個(gè)CDR3的殘基是FDY，所以CDR3的長(zhǎng)度在7-15個(gè)殘基范圍內(nèi)變化。
主要的庫(kù)然后被用作生產(chǎn)噬菌體原種。將噬菌體原種分成兩個(gè)一個(gè)原種用做固定化蛋白A的淘選(它可直接和折疊的VH域鍵合)。束縛的噬菌體被洗出來用做感染E.coli，并且DNA庫(kù)可從混合在一起的感染的細(xì)胞(DNA混合“E”)中制得。
第二個(gè)原種先在80℃下加熱10分鐘，隨后在蛋白A上淘選。淘選后繁殖得噬菌體庫(kù)富集了熱變性后重褶得VH域。從這些噬菌體中得到得DNA池指的是DNA池“H”。來自主要的庫(kù)的和選擇得庫(kù)的個(gè)體的克隆分別生長(zhǎng)生產(chǎn)噬菌體。這些噬菌體要經(jīng)過檢驗(yàn)在不進(jìn)行熱處理或在80℃熱處理之后與蛋白A的鍵合能力(評(píng)估產(chǎn)物和正確的折疊)。其結(jié)果見表21。
表21
接下來包含了混在一起的CDR1和CDR2區(qū)域的DNA片段從DNA池H中擴(kuò)增得到。DNA池E中只有混在一起的CDR3s被擴(kuò)增。最后，一個(gè)CDR3s池從與6G主要的庫(kù)一起的未試驗(yàn)過的傳代(nP)中由PCR擴(kuò)增得到。從未試驗(yàn)過的傳代池的生產(chǎn)通過來自主要的庫(kù)的噬菌體的生長(zhǎng)、通過沉淀純化噬菌體，由純化的噬菌體感染E.coli和從細(xì)菌中回收DNA。采用SOE PCR，CDR1和CDR2s的池與CDR3s的池隨機(jī)結(jié)合來重建整個(gè)VH域的基因。下面的結(jié)合已準(zhǔn)備(表22)。
表22
CDR1和CDR2可從DNA池H中系統(tǒng)的得到，因?yàn)镃DR1片段包含聚集作用的決定子。相比較而言，CDR3s來自“E”和“nP”池，它們對(duì)于聚集沒有那么重要。
SOE-PCR后，將片段克隆進(jìn)噬菌體載體(Fd-myc其前導(dǎo)序列被一個(gè)真核的前導(dǎo)序列所代替，見第二部分)，并為得到大的體系(＞1010克隆)通過電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)化到E.coli中。來自VH-6G-H+E和VH-6G-H+nP庫(kù)的個(gè)體的克隆(n＝44)各自生長(zhǎng)得到噬菌體產(chǎn)物。這些噬菌體要經(jīng)過檢驗(yàn)在不進(jìn)行熱處理或在80℃熱處理之后與蛋白A的鍵合能力(評(píng)估產(chǎn)物和正確的折疊)。其結(jié)果見表23。
表23
包含熱選擇的CDR1和CDR2環(huán)的展示了的功能性VH域的85％的噬菌體，在加熱后保留了蛋白A的鍵合能力。因此VH-6G庫(kù)中多數(shù)VH域包括折疊門護(hù)。相比較而言，在不樂觀的4G(VH-4G-H20)庫(kù)中僅有12％的VH域的克隆在加熱的時(shí)候抵抗聚集作用并保持蛋白A的鍵合活力。這些結(jié)果證實(shí)了在庫(kù)徹底清除過程(對(duì)蛋白A)加入一個(gè)加熱步驟，會(huì)導(dǎo)致伴隨編碼包含折疊門護(hù)和加熱時(shí)可可逆解折疊的VH域的DNA片段的VH域的庫(kù)的富集(通過7個(gè)折疊)。
來自VH-6G-H+E和VH-6G-H+nP庫(kù)的十四個(gè)隨機(jī)挑選的克隆被選取并進(jìn)行測(cè)序。包含CDR1的環(huán)的序列列表如下，同時(shí)也給出了SE分值(采用15個(gè)氨基酸的窗口)變化的氨基酸用下劃線標(biāo)出。
克隆 序列 SE-分值1.CAASGFTFOYGPMSW(SEQ ID NO197) 0.1522.CAASGFTFAADNMDW(SEQ ID NO198) -0.0743.CAASGFTFPTNEMSW(SEQ ID NO199) -0.0154.CAASGFTFGNASMDW(SEQ ID NO200) -0.0415.CAASGFTFEDDLMNW(SEQ ID NO201) -0.0216.CAASGFTFGGDEMTW(SEQ ID NO202) -0.0617.CAASGFTFDDSTMQW(SEQ ID NO203) -0.0758.CAASGFTFDNSVMGW(SEQ ID NO204) 0.0469.CAASGFTFDQTAMHW(SEQ ID NO205) -0.02110.CAASGFTFPELPMGW(SEQ ID NO206) 0.10511.CAASGFTFTPGKMNW(SEQ ID NO207)0.01312.CAASGFTFEHRTMGW(SEQ ID NO208)-0.01113.CAASGFTFPNSDMVW(SEQ ID NO209)0.05814.CAASGFTFGKSTMAW(SEQ ID NO210)0.044全面地，14個(gè)克隆的這個(gè)區(qū)的SE分值的平均值(±SD)為0.007(±0.018)這比VH簇(DP47)的SE分值的平均值(0.190)和那個(gè)區(qū)的編碼差異法(NNK密碼子)計(jì)算出來的SE分值平均值低的多。每個(gè)位點(diǎn)的差異相對(duì)較大分別在位置30、31、32、和35計(jì)算了數(shù)據(jù)表中7、11、8、10、9個(gè)不同的氨基酸。強(qiáng)的親水性和β-折疊破壞者如天氡氨酸，谷氨酸，脯氨酸和甘氨酸占全部氨基酸的43％(在編碼遺傳多樣性上相對(duì)占19％)。
結(jié)論人的VH3域的合成庫(kù)由PCR片段重組創(chuàng)建并在絲狀噬菌體的表面展示。主VH3dAbs多數(shù)(85％)在加熱到80℃時(shí)可可逆解折疊。這個(gè)庫(kù)通過下面幾個(gè)方面產(chǎn)生(1)CDR1區(qū)域的多樣性(在位點(diǎn)30、31、32、33和35)，(2)在徹底清除蛋白A之前主要的噬菌體庫(kù)的熱處理，和(3)PCR為媒介的加熱選擇的CDR1-CDR2編碼的基因和未經(jīng)試驗(yàn)過的傳代-CDR3編碼的基因的重組。在產(chǎn)生的庫(kù)中，CDR1的序列是不同的，但是富集了折疊門護(hù)殘基，如天氡氨酸，谷氨酸，脯氨酸和甘氨酸。
第十九部分正如這里所描述的和證實(shí)的，折疊門護(hù)可以導(dǎo)入包含有DP47d的H1環(huán)的區(qū)域，或者包含F(xiàn)R2-CDR2在預(yù)先確定專一性下將折疊門護(hù)導(dǎo)入dAbs的其它研究這部分描述的時(shí)在預(yù)先確定專一性下將折疊門護(hù)導(dǎo)入dAb的實(shí)施。TAR1-5-19是一個(gè)有TNF-α專一性的Vκ1域。它的序列是DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASELQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO211)合理的設(shè)計(jì)的工作的結(jié)果補(bǔ)充了其它的方法，其中“折疊門護(hù)”導(dǎo)入在噬菌體上展示的開頭字母為ab的dAb庫(kù)中。
選擇TAR1-5-19的折疊門護(hù)正如這里所描述的和證實(shí)的，折疊門護(hù)可以導(dǎo)入到包含有DP47d的H1環(huán)的區(qū)域或包含Vκ簇的FR2-CDR2的區(qū)域。對(duì)于TAR1-5-19，我們選擇位點(diǎn)49-一個(gè)在FR2-CDR2間邊界的可溶的暴露的殘基。這里應(yīng)該注明的是，在dAb的結(jié)構(gòu)和突變數(shù)據(jù)沒有的情況下，抗體結(jié)合部位內(nèi)(或接近的)的突變可能會(huì)產(chǎn)生鍵合活力。
如表28所示，PEP1-5-19較低的SE-15分值的兩個(gè)單點(diǎn)突變(在15個(gè)氨基酸的窗口上使用Sweet-Eisenberg(SE)衡量Sweet R.M.& Eisenberg D.，J.Mol，Biol.171479-488(1983))，因此表明突變的多肽會(huì)有高的折疊率。這也表明在15個(gè)氨基酸區(qū)域內(nèi)，PEP1-5-19的SE分值也相當(dāng)?shù)牡汀?br> 表28
關(guān)于噬菌體展示TAR1-5-19和突變的聚集作用測(cè)定采用第五部分噬菌體篩選2中描述的方法，單克隆噬菌體展示的TAR1-5-19和變異體80℃加熱10分鐘或不加熱，然后在覆有TNF-α的ELISA的洞里孵化。％折疊性數(shù)據(jù)根據(jù)第五部分噬菌體篩選2中描述的方法進(jìn)行計(jì)算，所得結(jié)果見表30。
表30
折疊門護(hù)對(duì)TAR1-5-19重褶有有利的效果，即使加熱到80℃在噬菌體上展示時(shí)包含折疊門護(hù)的噬菌體也有抗聚集作用。然而，必須說明的是，由于低的SE分值，父代的TAR1-5-19也表現(xiàn)出好的重褶性。
關(guān)于TAR1-5-19和變異體的受體鍵合測(cè)定活性測(cè)定采用RBA-ELISA(數(shù)量不斷增加的dAb處的受體鍵合測(cè)定用于和水溶性的TNF-α鍵合到固定化的TNF-α受體上的競(jìng)爭(zhēng)。束縛TNF-α后用生物素?；臎]有競(jìng)爭(zhēng)的抗體和鏈親和素絡(luò)合物檢測(cè)。IC50(nM)是要求減少50％沒有飽和數(shù)量的對(duì)于受體TNF-α的dAb用量。結(jié)果見表31。
表31
這里，TAR1-5-19里的折疊門護(hù)導(dǎo)入對(duì)TAR1-5-19的內(nèi)部活動(dòng)產(chǎn)生影響。這表明TAR1-5-19中的Y49殘基可能涉及到(直接的或間接的)與TNF-α專一的接觸。對(duì)于TAR1-5-19，為了導(dǎo)入折疊門護(hù)，Y49出現(xiàn)不是最好的選擇(盡管突變?nèi)匀幌喈?dāng)活潑)。圍繞Y49中心的15個(gè)氨基酸內(nèi)的片段的其它位置可以在沒有降低dAb活性的情況下降低SE分值。例如，I48被P、D、T、G或N替代，Y49被S、C、E、G、K、N或R替代，和/或I75被N或M的TAR1-5-19變異體如這里所描述的可以生產(chǎn)和表征。
結(jié)論在這個(gè)研究里，在不知道抗原-dAb組合物的結(jié)構(gòu)的情況下，折疊門護(hù)被引入預(yù)先設(shè)定專一性的dAb中。TAR1-5-19變異體的鍵合減少了6-20個(gè)折疊，但是變異體仍然以一定活性附著在目標(biāo)上，證實(shí)了變異體有生物活性。這也說明了一個(gè)兩個(gè)單點(diǎn)突變制造出來并得到研究。導(dǎo)入折疊門護(hù)的進(jìn)一步的好處在于可以實(shí)現(xiàn)創(chuàng)建和篩選其它的包含單點(diǎn)突變的變異體或突變體的結(jié)合，例如實(shí)現(xiàn)位置的變化或文庫(kù)的產(chǎn)生。
表24對(duì)DP47-VH(和11個(gè)氨基酸的窗口)的Sweet-Eisenberg(S/E)評(píng)價(jià)
表25對(duì)DP47-Vκ(和11個(gè)氨基酸的窗口)的Sweet-Eisenberg(S/E)評(píng)價(jià)
表26對(duì)DP47-VH(和15個(gè)氨基酸的窗口)的Sweet-Eisenberg(S/E)評(píng)價(jià)

表27對(duì)DPK9-Vk(和15個(gè)氨基酸的窗口)的Sweet-Eisenberg(S/E)評(píng)價(jià)
雖然通過優(yōu)選的實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明具體地進(jìn)行了演示和說明，對(duì)于此領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，在不背離本發(fā)明的所附權(quán)利要求所概括的范圍的情況下，在細(xì)節(jié)和形式可有多種變通。
權(quán)利要求
1.從多肽全能文庫(kù)中恢復(fù)至少一種可逆可解折疊多肽的方法，其中全能文庫(kù)中可逆可解折疊的多肽具有區(qū)別折疊多肽和解折疊或錯(cuò)折疊多肽的共同可選擇特性，方法包括提供包括展示多肽的全能文庫(kù)的多肽展示系統(tǒng)；解折疊至少部分所述展示多肽；重折疊至少部分解折疊多肽；以及恢復(fù)至少一種可逆可解折疊并具有所述的可從重折疊部分選擇的特性的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述解折疊是通過加熱到溫度Ts實(shí)現(xiàn)的，所述重折疊是通過冷卻到溫度Tc實(shí)現(xiàn)的，所述重折疊在溫度Tr，恢復(fù)的多肽具有融解溫度Tm，其中Ts＞Tm＞Tc和Ts＞Tm＞Tr。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中加熱和冷卻后，多肽展示系統(tǒng)包括至少部分解折疊和重折疊多肽以及部分聚集多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括確定可逆可解折疊的恢復(fù)多肽的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多肽展示系統(tǒng)包括文庫(kù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多肽展示系統(tǒng)是噬菌體展示，核糖體展示，乳液區(qū)室化和展示，酵母展示，嘌呤霉素展示，細(xì)菌展示，在質(zhì)粒上多肽展示，或共價(jià)展示。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多肽展示系統(tǒng)是噬菌體展示。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中解折疊是通過升高多肽展示系統(tǒng)的溫度，調(diào)節(jié)多肽展示系統(tǒng)的壓力，調(diào)節(jié)多肽展示系統(tǒng)的pH，增加多肽展示系統(tǒng)中離液劑的濃度和/或增加多肽展示系統(tǒng)中有機(jī)溶劑的濃度來實(shí)現(xiàn)的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中多肽是使用解折疊試劑來解折疊，解折疊試劑基本上不抑制不可逆可解折疊的解折疊多肽的聚集。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中解折疊是通過升高多肽展示系統(tǒng)的溫度到至少約50％展示多肽解折疊的解折疊溫度來實(shí)現(xiàn)的，重折疊是通過降低多肽展示系統(tǒng)的溫度到至少部分解折疊多肽重折疊的重折疊溫度來實(shí)現(xiàn)的。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中多肽展示系統(tǒng)被加熱到基本上所有展示多肽解折疊的解折疊溫度。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述解折疊溫度和所述重折疊溫度至少有約10C差距。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述共同可選擇的特性是可選擇功能特性結(jié)合配體，催化活性，或抗蛋白質(zhì)水解。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述可選擇功能特性是結(jié)合普通配體。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述共同可選擇特性是在折疊時(shí)呈遞在展示多肽上的表位，但不含錯(cuò)折疊或解折疊多肽上的。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中每個(gè)展示多肽包括抗體可變域。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述抗體可變域是人類抗體可變域。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，條件是所述可變域不含一種或多種由胚系序列編碼的只有Camelid免疫球蛋白可變域才有的氨基酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述可變域的一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)(FR)包括(a)人類構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列，(b)人類構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列的至少8個(gè)鄰接氨基酸，或(c)由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的氨基酸序列，其中所述構(gòu)架區(qū)是Kabat所定義的。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述可變域中一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列與由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同，或所述一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相對(duì)于由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)總共包括不超過5個(gè)不同的氨基酸。
21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中在所述可變域中FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4的氨基酸序列與由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同，或FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4的氨基酸序列相對(duì)于由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)總共包括不超過10個(gè)不同的氨基酸。
22.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中每種展示多肽包括含有FR1，F(xiàn)R2和FR3區(qū)域的抗體可變域，所述FR1，F(xiàn)R2和FR3的氨基酸序列與由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中可逆可解折疊的多肽通過結(jié)合靶配體恢復(fù)。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中可逆可解折疊的多肽通過結(jié)合普通配體恢復(fù)。
25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多肽展示系統(tǒng)是噬菌體展示，可逆可解折疊的多肽通過恢復(fù)感染噬菌體或感染噬菌體的子代來恢復(fù)。
26.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中多肽展示系統(tǒng)是多價(jià)噬菌體展示系統(tǒng)，其中每種展示多肽包括抗體可變域，解折疊是通過升高所述多價(jià)噬菌體系統(tǒng)的溫度到約80C的解折疊溫度來實(shí)現(xiàn)的；重折疊是通過降低所述多價(jià)噬菌體系統(tǒng)的溫度到至少低于所述解折疊溫度約10C的重折疊溫度來實(shí)現(xiàn)的。
27.從多肽全能文庫(kù)中恢復(fù)至少一種結(jié)合配體并可逆可解折疊的多肽的方法，方法包括提供包括所述全能文庫(kù)的多肽展示系統(tǒng)；加熱全能文庫(kù)到至少部分展示多肽解折疊的溫度Ts；冷卻全能文庫(kù)到低于Ts的溫度Tc，其中冷卻的全能文庫(kù)包括至少部分解折疊和重折疊的多肽以及部分聚集的多肽；在溫度Tr恢復(fù)至少一種結(jié)合配體和可逆可解折疊的多肽，其中配體結(jié)合折疊多肽不結(jié)合聚集多肽，恢復(fù)多肽具有融解溫度Tm，其中Ts＞Tm＞Tc和Ts＞Tm＞Tr。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，進(jìn)一步包括確定恢復(fù)多肽結(jié)合配體。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述配體是普通配體或靶配體。
30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，進(jìn)一步包括確定Tm＜Ts。
31.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中Tm＞37C。
32.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中Tc基本上與Tr相同。
33.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述多肽展示系統(tǒng)包括多個(gè)可復(fù)制的遺傳展示包裝。
34.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述多肽展示系統(tǒng)是噬菌體展示系統(tǒng)。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述噬菌體展示系統(tǒng)是多價(jià)噬菌體展示系統(tǒng)。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中至少部分在冷卻全能文庫(kù)中聚集的多肽形成噬菌體間聚集。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中在冷卻全能文庫(kù)中聚集的多肽形成噬菌體間聚集和噬菌體內(nèi)聚集。
38.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述全能文庫(kù)包括至少約103個(gè)組成。
39.從多肽全能文庫(kù)中恢復(fù)至少一種結(jié)合配體并可逆可解折疊的多肽的方法，方法包括提供包括所述全能文庫(kù)的多肽展示系統(tǒng)；其中所述被加熱至少部分展示多肽解折疊的溫度Ts，冷卻全能文庫(kù)到低于Ts的溫度Tc，冷卻的全能文庫(kù)包括至少部分解折疊和重折疊的多肽以及部分聚集的多肽；在溫度Tr恢復(fù)至少一種結(jié)合配體和可逆可解折疊的多肽，其中配體結(jié)合折疊多肽不結(jié)合聚集多肽，恢復(fù)多肽具有融解溫度Tm，其中Ts＞Tm＞Tc和Ts＞Tm＞Tr。
40.制備富含結(jié)合配體并可逆可解折疊的多肽的全能文庫(kù)的方法，方法包括提供包括結(jié)合配體的多肽全能文庫(kù)的多肽展示系統(tǒng)；加熱全能文庫(kù)到至少部分展示多肽解折疊的溫度Ts；冷卻全能文庫(kù)到低于Ts的溫度Tc，其中冷卻的全能文庫(kù)包括至少部分解折疊和重折疊的多肽以及部分聚集的多肽；由此制備富含結(jié)合配體并可逆可解折疊多肽的全能文庫(kù)。
41.制備編碼可逆可解折疊多肽的核酸文庫(kù)的方法，方法包括(a)提供一種或多種親代多肽變體，其中親代多肽具有區(qū)別折疊親代多肽和解折疊或錯(cuò)折疊親代多肽的可選擇特性，其中所述變體包括所述親代多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被替換的氨基酸序列。(b)解折疊并重折疊所述一種或多種變體；(c)選擇一種或多種保持親代多肽的所述可選擇特性的解折疊變體多肽；(d)確定從(c)選擇的一種或多種重折疊變體多肽的氨基酸序列并識(shí)別重折疊變體的氨基酸序列中與親代氨基酸序列的相應(yīng)殘基不同的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；(e)制備編碼包括所述親代多肽的氨基酸序列中至少一個(gè)氨基酸殘基被(d)中所識(shí)別的氨基酸殘基替換，至少另一個(gè)氨基酸殘基被替換，插入或缺失的氨基酸序列的多肽的核酸文庫(kù)。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中多肽是使用基本上不抑制沒有可逆可解折疊的解折疊多肽的聚集的解折疊試劑來解折疊的。
43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中變體多肽是通過加熱到高于變體多肽的融解溫度Tm的溫度來解折疊，通過冷卻來重折疊。
44.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述親代多肽是抗體可變域。
45.制備富含抗熱聚集的可變域的抗體可變域文庫(kù)的方法，方法包括(a)提供包括大量展示的抗體可變域的噬菌體展示系統(tǒng)，其中至少部分展示可變域是解折疊和重折疊的；(b)從所述噬菌體展示系統(tǒng)選擇至少一個(gè)展示解折疊，重折疊并重獲得結(jié)合功能的可變區(qū)域的噬菌體；(c)獲得編碼展示在(b)中選擇的噬菌體上的可變域的CDR1和任意地CDR2的核酸；(d)制備編碼抗體可變域的核酸文庫(kù)，其中從(c)獲得的所述核酸可操作連接一種或多種其他核酸以制備核酸構(gòu)建體文庫(kù)，其中核酸構(gòu)建體編碼CDR1和任意地CDR2由(c)獲得的核酸編碼的抗體可變域。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中基本上所有(a)中的展示可變區(qū)域都通過加熱到約80C解折疊并通過冷卻重折疊。
47.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中在(d)所裝配的核酸文庫(kù)編碼抗體可變域，其中CDR3是隨機(jī)化的不是從選擇的能加熱可逆可解折疊的抗體可變域衍生的。
48.制備可逆可解折疊變體多肽的方法，方法包括提供親代多肽的氨基酸序列；識(shí)別所述氨基酸序列的疏水區(qū)域；選擇識(shí)別的疏水區(qū)域；在選擇的疏水區(qū)域中替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸以制備變體氨基酸序列，這樣區(qū)域的疏水性降低；以及制備包含所述變體氨基酸序列的變體多肽。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，進(jìn)一步包括評(píng)定變體多肽的解折疊和重折疊。
50.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中變體多肽是通過加熱到高于變體多肽的融解溫度Tm的溫度來解折疊，通過冷卻來重折疊。
51.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中親代氨基酸序列的所述疏水區(qū)域通過使用Sweet/Eisenberg疏水評(píng)分來識(shí)別。
52.制備含有可逆可解折疊變體抗體重鏈可變域(VH)的多肽的方法，方法包括提供親代VH域的氨基酸序列；替換所述親代VH的H1環(huán)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸以制備變體VH，變體VH的H1環(huán)的Sweet/Eisenberg(S/E)疏水評(píng)分相對(duì)于親代VH的H1環(huán)的Sweet/Eisendberg疏水評(píng)分降低了，其中所述H1環(huán)由AbM氨基酸編碼系統(tǒng)限定；或替換一個(gè)或多個(gè)所述親代VH氨基酸序列位置22到位置36的氨基酸，以制備變體VH，變體VH的位置22到位置36的氨基酸序列的S/E疏水評(píng)分相對(duì)于親代VH的位置22到位置36的氨基酸序列的疏水評(píng)分降低了，其中位置22到位置36依據(jù)Kabat氨基酸編碼系統(tǒng)來排列；制備包括變體VH變體多肽。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，進(jìn)一步包括評(píng)定變體VH的解折疊和重折疊。
54.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中多肽是使用基本上不抑制沒有可逆可解折疊的解折疊多肽的聚集的解折疊試劑來解折疊的。
55.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中變體VH是通過加熱到高于變體多肽的融解溫度Tm的溫度來解折疊，通過冷卻來重折疊。
56.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述親代VH是人類VH。
57.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中條件是所述變體VH不含一種或多種由胚系序列編碼的只有Camelid免疫球蛋白可變域才有的構(gòu)架氨基酸。
58.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述變體VH的一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)(FR)包括(a)人類構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列，(b)人類構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列的至少8個(gè)鄰接氨基酸，或(c)由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的氨基酸序列，其中所述構(gòu)架區(qū)是Kabat所定義的。
59.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述變體VH中一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列與由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同，或所述一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相對(duì)于由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)總共包括不超過5個(gè)不同的氨基酸。
60.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中在所述變體VH中FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4的氨基酸序列與由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同，或FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4的氨基酸序列相對(duì)于由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)總共包括不超過10個(gè)不同的氨基酸。
61.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中變體VH包括含有FR1，F(xiàn)R2和FR3區(qū)域，所述FR1，F(xiàn)R2和FR3的氨基酸序列與由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同。
62.根據(jù)權(quán)利要求58-61任何一個(gè)的方法，其中所述人類胚系抗體基因區(qū)段包括DP47胚系VH基因區(qū)段。
63.根據(jù)權(quán)利要求58-61任何一個(gè)的方法，其中所述人類胚系抗體基因區(qū)段包括胚系VH基因區(qū)段選自DP4，DP7，DP8，DP9，DP10，DP31，DP33，DP45，DP46，DP49，DP50，DP51，DP53，DP54，DP65，DP66，DP67，DP68，和DP69。
64.根據(jù)權(quán)利要求62或權(quán)利要求63所述的方法，其中人類胚系抗體基因區(qū)段進(jìn)一步包括胚系JH基因區(qū)段選自JH1，JH2，JH3，JH4，JH4b，JH5，JH6。
65.制備包括可逆可解折疊的變體抗體輕鏈可變域(VL)的多肽的方法，方法包括提供親代VL域的氨基酸序列；替換所述親代VL的FR2-CDR2區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸以制備變體VL，變體VL的FR2-CDR2區(qū)域的Sweet/Eisenberg(S/E)疏水評(píng)分相對(duì)于親代VH的FR2-CDR2區(qū)域的Sweet/Eisendberg疏水評(píng)分降低了；替換所述親代VL的FR3的一個(gè)或多個(gè)氨基酸以制備變體VL，變體VL的FR3的Sweet/Eisenberg(S/E)疏水評(píng)分相對(duì)于親代VH的相應(yīng)區(qū)域的Sweet/Eisendberg疏水評(píng)分降低了；或替換一個(gè)或多個(gè)所述親代VL氨基酸序列位置44到位置53的氨基酸，以制備變體VL，變體VL的位置44到位置53的氨基酸序列的S/E疏水評(píng)分相對(duì)于親代VL的位置相應(yīng)區(qū)域的疏水評(píng)分降低了；或替換一個(gè)或多個(gè)所述親代VL氨基酸序列位置73到位置76的氨基酸，以制備變體VL，變體VL的位置73到位置76的氨基酸序列的S/E疏水評(píng)分相對(duì)于親代VL的相應(yīng)區(qū)域的疏水評(píng)分降低了；以及制備包含所述變體VL變體多肽，其中FR2-CDR2區(qū)域，F(xiàn)R3，位置44-56和位置73-76是依據(jù)Kabat氨基酸編碼系統(tǒng)來排列的。
66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，進(jìn)一步包括評(píng)定變體VL的解折疊和重折疊。
67.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中多肽是使用基本上不抑制沒有可逆可解折疊的解折疊多肽的聚集的解折疊試劑來解折疊的。
68.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中變體VL是通過加熱到高于變體多肽的融解溫度Tm的溫度來解折疊，通過冷卻來重折疊。
69.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中所述親代VL是人類VL。
70.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中條件是所述變體VL不含一種或多種由胚系序列編碼的只有Camelid免疫球蛋白可變域才有的構(gòu)架氨基酸。
71.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中所述變體VL的一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)(FR)包括(a)人類構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列，(b)人類構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列的至少8個(gè)鄰接氨基酸，或(c)由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的氨基酸序列，其中所述構(gòu)架區(qū)是Kabat所定義的。
72.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中所述變體VL中一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列與由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同，或所述一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相對(duì)于由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)總共包括不超過5個(gè)不同的氨基酸。
73.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中在所述變體VL中FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4的氨基酸序列與由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同，或FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4的氨基酸序列相對(duì)于由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)總共包括不超過10個(gè)不同的氨基酸。
74.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中變體VL包括含有FR1，F(xiàn)R2和FR3區(qū)域，所述FR1，F(xiàn)R2和FR3的氨基酸序列與由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同。
75.根據(jù)權(quán)利要求71-74任何一個(gè)的方法，其中所述人類胚系抗體基因區(qū)段包括胚系VL基因區(qū)段選自DPK1，DPK2，DPK3，DPK4，DPK5，DPK6，DPK7，DPK8，DPK9，DPK10，DPK11，DPK12，DPK13，DPK15，DPK16，DPK18，DPK19，DPK20，DPK21，DPK22，DPK23，DPK24，DPK25，DPK26和DPK28。
76.根據(jù)權(quán)利要求75所述的方法，其中所述人類胚系抗體基因區(qū)段進(jìn)一步包括胚系JK基因區(qū)段選自JK1，JK2，JK3，JK4，和JK5。
77.制備富含可逆可解折疊多肽的文庫(kù)的方法，其中所述可逆可解折疊多肽具有區(qū)別折疊多肽和解折疊或錯(cuò)折疊多肽的共同可選擇特性，方法包括提供包括大量展示多肽的多肽展示系統(tǒng)；解折疊部分所述展示多肽；重折疊至少部分解折疊多肽；以及從所述部分中恢復(fù)可逆可解折疊并具有所述的可共同可選擇特性的多肽群。
78.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其中所述多肽展示系統(tǒng)將核酸的編碼功能與核酸所編碼的多肽的物理，化學(xué)和/或功能特性聯(lián)系起來。
79.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其中所述多肽展示系統(tǒng)是噬菌體展示，核糖體展示，乳液區(qū)室化和展示，酵母展示，嘌呤霉素展示，細(xì)菌展示，在質(zhì)粒上多肽展示，或共價(jià)展示。
80.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其中所述多肽展示系統(tǒng)是噬菌體展示。
81.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其中多肽是使用解折疊試劑來解折疊，解折疊試劑基本上不抑制不可逆可解折疊的解折疊多肽的聚集。
82.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其中解折疊是通過升高多肽展示系統(tǒng)的溫度，調(diào)節(jié)多肽展示系統(tǒng)的壓力，調(diào)節(jié)多肽展示系統(tǒng)的pH，增加多肽展示系統(tǒng)中離液劑的濃度和/或增加多肽展示系統(tǒng)中有機(jī)溶劑的濃度來實(shí)現(xiàn)的。
83.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其中解折疊是通過升高多肽展示系統(tǒng)的溫度到至少約50％展示多肽解折疊的解折疊溫度來實(shí)現(xiàn)的，重折疊是通過降低多肽展示系統(tǒng)的溫度到至少部分解折疊多肽重折疊的重折疊溫度來實(shí)現(xiàn)的。
84.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中多肽展示系統(tǒng)被加熱到基本上所有展示多肽解折疊的解折疊溫度。
85.根據(jù)權(quán)利要求84所述的方法，其中所述解折疊溫度和所述重折疊溫度至少有約10C差距。
86.根據(jù)權(quán)利要求84所述的方法，其中所述多肽展示系統(tǒng)是噬菌體展示，可逆可解折疊的多肽通過恢復(fù)感染噬菌體或感染噬菌體的子代來恢復(fù)。
87.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其中所述共同可選擇的特性是可選擇功能特性結(jié)合配體，催化活性，或抗蛋白質(zhì)水解。
88.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其中每個(gè)展示多肽包括抗體可變域。
89.根據(jù)權(quán)利要求88所述的方法，其中所述抗體可變域是人類抗體可變域。
90.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，條件是所述可變域不含一種或多種由胚系序列編碼的只有Camelid免疫球蛋白可變域才有的構(gòu)架氨基酸。
91.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其中可逆可解折疊的多肽通過結(jié)合靶配體恢復(fù)。
92.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其中可逆可解折疊的多肽通過結(jié)合普通配體恢復(fù)。
93.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其中多肽展示系統(tǒng)是多價(jià)噬菌體展示系統(tǒng)，其中每種展示多肽包括抗體可變域，解折疊是通過升高所述多價(jià)噬菌體系統(tǒng)的溫度到約80C的解折疊溫度來實(shí)現(xiàn)的；重折疊是通過降低所述多價(jià)噬菌體系統(tǒng)的溫度到至少低于所述解折疊溫度約10C的重折疊溫度來實(shí)現(xiàn)。
94.分離多肽，包括免疫球蛋白可變域，其中所述免疫球蛋白可變域?qū)Π信潴w具有結(jié)合特異性，加熱到適當(dāng)解折疊溫度時(shí)可逆可解折疊，在E.coli表達(dá)時(shí)是可分泌的，條件是所述可變域不含一種或多種由胚系序列編碼的只有Camelid免疫球蛋白可變域才有的構(gòu)架氨基酸。
95.根據(jù)權(quán)利要求94所述的分離多肽，其中所述適當(dāng)?shù)慕庹郫B溫度是高于免疫球蛋白可變域的融解溫度Tm的溫度。
96.根據(jù)權(quán)利要求94所述的分離多肽，其中所述適當(dāng)?shù)慕庹郫B溫度是約80C。
97.根據(jù)權(quán)利要求94所述的分離多肽，其中所述可變域是人類免疫球蛋白重鏈可變域(VH)。
98.根據(jù)權(quán)利要求94所述的分離多肽，其中所述可變域是人類免疫球蛋白輕鏈可變域(VL)。
99.根據(jù)權(quán)利要求94所述的分離多肽，其中所述靶配體是人類抗原或表位。
100.根據(jù)權(quán)利要求94所述的分離多肽，其中所述多肽是抗體形式。
101.根據(jù)權(quán)利要求94所述的分離多肽，其中所述多肽由單鏈VH組成。
102.根據(jù)權(quán)利要求94所述的分離多肽，其中所述可變域結(jié)合所述靶配體，結(jié)合常數(shù)(Kb)約為50nM到約20pM，Koff約為5×10-1S-1到約1×10-7S-1。
103.根據(jù)權(quán)利要求94所述的分離多肽，其中所述可變域由E.coli表達(dá)時(shí)分泌量至少為約0.5毫克/升。
104.根據(jù)權(quán)利要求94所述的分離多肽，其中所述可變域由E.coli表達(dá)時(shí)分泌量至少為約1毫克/升到至少約1克/毫升。
105.分離多肽，包括可逆可解折疊的變體免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域(VH)，所述變體VH包括親代VH的氨基酸序列，其中H1環(huán)中至少一個(gè)氨基酸殘基被替換，這樣變體VH的H1環(huán)的Sweet/Eisenberg(S/E)疏水評(píng)分相對(duì)于親代VH的H1環(huán)的Sweet/Eisendberg疏水評(píng)分降低了，其中所述H1環(huán)由AbM氨基酸編碼系統(tǒng)限定；或所述變體VH包括親代VH的氨基酸序列，其中至少一個(gè)位置22到位置36的氨基酸被替換，這樣位置22到位置36的氨基酸序列的S/E疏水評(píng)分相對(duì)于親代VH的位置22到位置36的氨基酸序列的疏水評(píng)分降低了，其中位置22到位置36依據(jù)Kabat氨基酸編碼系統(tǒng)來排列。
106.根據(jù)權(quán)利要求105所述的分離多肽，其中變體VHH1環(huán)的S/E評(píng)分是0或小于0，或所述變體VH的位置22到位置36的氨基酸序列的S/E評(píng)分是0或小于0。
107.分離多肽，包括可逆可解折疊的變體免疫球蛋白重鏈可變區(qū)域(VH)，所述變體VH包括親代VH的氨基酸序列，其中H1環(huán)中至少一個(gè)氨基酸殘基被Pro或Gly殘基替換，其中所述H1環(huán)由AbM氨基酸編碼系統(tǒng)限定；或所述變體VH包括親代VH的氨基酸序列，其中至少一個(gè)位置22到位置36的氨基酸被Pro或Gly殘基替換，其中位置22到位置36依據(jù)Kabat氨基酸編碼系統(tǒng)來排列。
108.根據(jù)權(quán)利要求105-107任何一個(gè)所述的分離多肽，其中所述變體VH加熱到高于其融解溫度Tm時(shí)可逆可解折疊。
109.根據(jù)權(quán)利要求105-107任何一個(gè)所述的分離多肽，其中所述變體VH加熱到約80C時(shí)可逆可解折疊。
110.根據(jù)權(quán)利要求105-107任何一個(gè)所述的分離多肽，條件是所述變體VH不含一種或多種由胚系序列編碼的只有Camelid免疫球蛋白可變域才有的構(gòu)架氨基酸。
111.根據(jù)權(quán)利要求105-107任何一個(gè)所述的分離多肽，其中所述親代變體VH是人類變體VH。
112.根據(jù)權(quán)利要求105-107任何一個(gè)所述的分離多肽，其中所述分離多肽是抗體形式。
113.根據(jù)權(quán)利要求105-107任何一個(gè)所述的分離多肽，其中所述變體VH的一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)(FR)包括(a)人類構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列，(b)人類構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列的至少8個(gè)鄰接氨基酸，或(c)由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的氨基酸序列，其中所述構(gòu)架區(qū)是Kabat所定義的。
114.根據(jù)權(quán)利要求105-107任何一個(gè)所述的分離多肽，其中所述變體VH中一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列與由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同，或所述一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相對(duì)于由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)總共包括不超過5個(gè)不同的氨基酸。
115.根據(jù)權(quán)利要求105-107任何一個(gè)所述的分離多肽，其中在所述變體VH中FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4的氨基酸序列與由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同，或FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4的氨基酸序列相對(duì)于由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)總共包括不超過10個(gè)不同的氨基酸。
116.根據(jù)權(quán)利要求105-107任何一個(gè)所述的分離多肽，其中變體VH包括含有FR1，F(xiàn)R2和FR3區(qū)域，所述FR1，F(xiàn)R2和FR3的氨基酸序列與由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同。
117.根據(jù)權(quán)利要求113-116任何一個(gè)所述的分離多肽，其中所述人類胚系抗體基因區(qū)段包括DP47胚系VH基因區(qū)段。
118.根據(jù)權(quán)利要求113-116任何一個(gè)所述的分離多肽，其中所述人類胚系抗體基因區(qū)段包括胚系VH基因區(qū)段選自DP4，DP7，DP8，DP9，DP10，DP31，DP33，DP45，DP46，DP49，DP50，DP51，DP53，DP54，DP65，DP66，DP67，DP68，和DP69。
119.根據(jù)權(quán)利要求117或118任何一個(gè)所述的分離多肽，其中人類胚系抗體基因區(qū)段進(jìn)一步包括胚系JH基因區(qū)段選自JH1，JH2，JH3，JH4，JH4b，JH5，JH6。
120.分離多肽，包括可逆可解折疊的變體免疫球蛋白輕鏈可變域(VL)，其中所述變體VL含有親代VL的氨基酸序列，其中至少一個(gè)FR2-CDR2區(qū)域中的氨基酸被替換，這樣變體VL的FR2-CDR2區(qū)域的Sweet/Eisenberg(S/E)疏水評(píng)分相對(duì)于親代VH的FR2-CDR2區(qū)域的Sweet/Eisendberg疏水評(píng)分降低了；所述變體VL含有親代VL的氨基酸序列，其中FR3中至少一個(gè)氨基酸殘基被替換，這樣變體VL的FR3的Sweet/Eisenberg(S/E)疏水評(píng)分相對(duì)于親代VH的相應(yīng)區(qū)域的Sweet/Eisendberg疏水評(píng)分降低了；所述變體VL含有親代VL的氨基酸序列，其中所述親代VL氨基酸序列位置44到位置53的至少一個(gè)氨基酸殘基被替換，這樣變體VL的位置44到位置53的氨基酸序列的S/E疏水評(píng)分相對(duì)于親代VL的位置相應(yīng)區(qū)域的疏水評(píng)分降低了；和/或所述變體VL含有親代VL的氨基酸序列，其中所述親代VL氨基酸序列位置73到位置76的至少一個(gè)氨基酸殘基被替換，這樣變體VL的位置73到位置76的氨基酸序列的S/E疏水評(píng)分相對(duì)于親代VL的相應(yīng)區(qū)域的疏水評(píng)分降低了；其中FR2-CDR2區(qū)域，F(xiàn)R3，位置44-56和位置73-76是依據(jù)Kabat氨基酸編碼系統(tǒng)來排列的。
121.根據(jù)權(quán)利要求120所述的分離多肽，其中所述變體VL的FR2-CDR2區(qū)域的S/E評(píng)分為0.23或小于0.23；所述變體VL的FR3的S/E評(píng)分為0.35或小于0.35；所述變體VL的位置44到位置53的氨基酸序列的S/E疏水評(píng)分為0.23或小于0.23；和/或；所述變體VL的位置73到位置76的氨基酸序列的S/E疏水評(píng)分為0.35或小于0.35。
122.分離多肽，包括可逆可解折疊的變體免疫球蛋白輕鏈可變域(VL)，其中所述變體VL含有親代VL的氨基酸序列，其中FR3中至少一個(gè)氨基酸殘基被Pro或Gly殘基替換；和/或其中所述變體VL含有親代VL的氨基酸序列，所述親代VL氨基酸序列位置44到位置53的至少一個(gè)氨基酸殘基被Pro或Gly殘基替換；其中FR3和位置44-56是依據(jù)Kabat氨基酸編碼系統(tǒng)來排列的。
123.根據(jù)權(quán)利要求120-122任何一個(gè)所述的分離多肽，其中所述變體VL加熱到高于其融解溫度Tm時(shí)可逆可解折疊。
124.根據(jù)權(quán)利要求120-122任何一個(gè)所述的分離多肽，其中所述變體VL加熱到約80C時(shí)可逆可解折疊。
125.根據(jù)權(quán)利要求120-122任何一個(gè)所述的分離多肽，其中所述分離多肽是抗體形式。
126.根據(jù)權(quán)利要求120-122任何一個(gè)所述的分離多肽，其中所述變體VL的一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)(FR)包括(a)人類構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列，(b)人類構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列的至少8個(gè)鄰接氨基酸，或(c)由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的氨基酸序列，其中所述構(gòu)架區(qū)是Kabat所定義的。
127.根據(jù)權(quán)利要求120-122任何一個(gè)所述的分離多肽，其中所述變體VL中一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列與由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同，或所述一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相對(duì)于由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)總共包括不超過5個(gè)不同的氨基酸。
128.根據(jù)權(quán)利要求120-122任何一個(gè)所述的分離多肽，其中在所述變體VL中FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4的氨基酸序列與由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同，或FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4的氨基酸序列相對(duì)于由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)總共包括不超過10個(gè)不同的氨基酸。
129.根據(jù)權(quán)利要求120-122任何一個(gè)所述的分離多肽，其中變體VL包括含有FR1，F(xiàn)R2和FR3區(qū)域，所述FR1，F(xiàn)R2和FR3的氨基酸序列與由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同。
130.根據(jù)權(quán)利要求126-129任何一個(gè)所述的分離多肽，其中所述人類胚系抗體基因區(qū)段包括胚系VL基因區(qū)段選自DPK1，DPK2，DPK3，DPK4，DPK5，DPK6，DPK7，DPK8，DPK9，DPK10，DPK11，DPK12，DPK13，DPK15，DPK16，DPK18，DPK19，DPK20，DPK21，DPK22，DPK23，DPK24，DPK25，DPK26和DPK28。
131.根據(jù)權(quán)利要求126-129任何一個(gè)所述的分離多肽，其中所述人類胚系抗體基因區(qū)段進(jìn)一步包括胚系JK基因區(qū)段選自JK1，JK2，JK3，JK4，和JK5。
132.多肽全能文庫(kù)，其中在全能文庫(kù)中至少約10％的多肽可逆可解折疊并在E.coli中表達(dá)時(shí)是可分泌的。
133.根據(jù)權(quán)利要求132所述的全能文庫(kù)，其中多肽包括抗體可變域。
134.根據(jù)權(quán)利要求133所述的全能文庫(kù)，其中所述抗體可變域包括抗原結(jié)合位點(diǎn)。
135.根據(jù)權(quán)利要求133所述的全能文庫(kù)，其中所述抗體可變域是人類抗體可變域。
136.根據(jù)權(quán)利要求133所述的全能文庫(kù)，其中條件是所述變體VH不含一種或多種由胚系序列編碼的只有Camelid免疫球蛋白可變域才有的構(gòu)架氨基酸。
137.根據(jù)權(quán)利要求135所述的全能文庫(kù)，其中所述可變域的一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)(FR)包括(a)人類構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列，(b)人類構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列的至少8個(gè)鄰接氨基酸，或(c)由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的氨基酸序列，其中所述構(gòu)架區(qū)是Kabat所定義的。
138.根據(jù)權(quán)利要求135所述的全能文庫(kù)，其中所述可變域中一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列與由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同，或所述一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相對(duì)于由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)總共包括不超過5個(gè)不同的氨基酸。
139.根據(jù)權(quán)利要求135所述的全能文庫(kù)，其中在所述可變域中FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4的氨基酸序列與由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同，或FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4的氨基酸序列相對(duì)于由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)總共包括不超過10個(gè)不同的氨基酸。
140.根據(jù)權(quán)利要求135所述的全能文庫(kù)，其中每個(gè)展示多肽包括抗體可變域，抗體可變域包括含有FR1，F(xiàn)R2和FR3區(qū)域，所述FR1，F(xiàn)R2和FR3的氨基酸序列與由人類胚系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同。
141.根據(jù)權(quán)利要求132所述的全能文庫(kù)，其中可逆可解折疊多肽當(dāng)折疊時(shí)具有共同可選擇特性，所述共同所選擇特性解折疊或錯(cuò)折疊的多肽不具有。
142.根據(jù)權(quán)利要求141所述的全能文庫(kù)，其中所述共同可選擇的特性是結(jié)合配體，催化活性，或抗蛋白質(zhì)水解。
143.根據(jù)權(quán)利要求132所述的全能文庫(kù)，其中所述多肽展示系統(tǒng)是噬菌體展示，核糖體展示，乳液區(qū)室化和展示，酵母展示，嘌呤霉素展示，細(xì)菌展示，在質(zhì)粒上多肽展示，或共價(jià)展示。
144.編碼可逆可解折疊多肽的核酸文庫(kù)，文庫(kù)中每個(gè)組成編碼至少一種多肽包括至少一個(gè)氨基酸殘基被折疊看門殘基替換以及至少一個(gè)其他氨基酸被替換，插入或缺失的親代多肽的氨基酸序列。
145.根據(jù)權(quán)利要求144所述的文庫(kù)，其中所述親代多肽是抗體可變域。
146.根據(jù)權(quán)利要求145所述的文庫(kù)，其中所述抗體可變域是人類VH。
147.根據(jù)權(quán)利要求146所述的文庫(kù)，其中所述折疊看門殘基是在CDR1中。
148.根據(jù)權(quán)利要求145所述的文庫(kù)，其中所述抗體可變域是人類VL。
149.編碼可逆可解折疊抗體可變域的核酸文庫(kù)，文庫(kù)的每個(gè)組成包括編碼可逆可解折疊抗體可變域的CDR1的核苷酸序列。
150.根據(jù)權(quán)利要求149所述的文庫(kù)，其中文庫(kù)的每個(gè)組成包括編碼可逆可解折疊抗體可變域的CDR2的核苷酸序列。
151.根據(jù)權(quán)利要求149所述的文庫(kù)，其中文庫(kù)的組成編碼其中CDR3是多樣化的或隨機(jī)化的抗體可變域。
152.根據(jù)權(quán)利要求149所述的文庫(kù)，其中文庫(kù)編碼人類抗體重鏈可變域(VH)。
153.根據(jù)權(quán)利要求48-76任何一個(gè)所述的方法制備的可逆可解折疊的分離多肽，其中所述多肽在E.coli中制備時(shí)是可分泌的，條件是多肽不是Camelid抗體可變域。
154.根據(jù)權(quán)利要求1-39任何一個(gè)所述的方法制備的可逆可解折疊的分離多肽，其中所述多肽在E.coli中制備時(shí)是可分泌的，條件是多肽不是Camelid抗體可變域。
155.編碼根據(jù)權(quán)利要求94-131，153或154任何一個(gè)所述的可逆可解折疊多肽的分離核酸。
156.富含根據(jù)權(quán)利要求41-47核77-93任何一個(gè)所述的方法制備的可逆可解折疊多肽的文庫(kù)。
157.根據(jù)權(quán)利要求156所述的文庫(kù)，其中所述文庫(kù)包括編碼所述可逆可解折疊多肽的異質(zhì)核酸集。
158.編碼根據(jù)權(quán)利要求40，132-143任何一個(gè)所述的多肽全能文庫(kù)的核酸文庫(kù)。
159.包括根據(jù)權(quán)利要求94-131，153或154任何一個(gè)所述的可逆可解折疊多肽的組合物。
160.根據(jù)權(quán)利要求159所述的組合物，其中所述多肽的量占重量比約5％到約99％。
161.根據(jù)權(quán)利要求159所述的組合物，其中所述組合物是溶液。
162.根據(jù)權(quán)利要求159所述的組合物，其中所述組合物是藥物組合物。
163.根據(jù)權(quán)利要求159所述的組合物，其中所述組合物是生物洗滌粉。
164.包含凍干的根據(jù)權(quán)利要求94-131，153或154任何一個(gè)所述的可逆可解折疊多肽的組合物。
165.根據(jù)權(quán)利要求164所述的組合物，其中所述凍干的可逆可解折疊多肽在再水化時(shí)損失不超過其約20％的活性。
166.包含根據(jù)權(quán)利要求94-131，153或154任何一個(gè)所述的可逆可解折疊多肽的密封包裝。
167.根據(jù)權(quán)利要求166所述的密封包裝，進(jìn)一步包括消毒指示說明。
168.根據(jù)權(quán)利要求167所述的密封包裝，其中所述消毒指示說明是醫(yī)療指示說明。
169.根據(jù)權(quán)利要求167所述的密封包裝，其中所述醫(yī)療指示說明是外科手術(shù)指示說明。
170.用于給受試體服用可逆可解折疊多肽的試劑盒，包括根據(jù)權(quán)利要求94-131，153或154任何一個(gè)所述的可逆可解折疊多肽，藥物轉(zhuǎn)送裝置以及，任意地使用指示說明。
171.根據(jù)權(quán)利要求170所述的試劑盒，其中所述多肽是凍干的。
172.根據(jù)權(quán)利要求170所述的試劑盒，其中所述藥物轉(zhuǎn)送裝置是注射器，吸入器，鼻內(nèi)用藥裝置，眼睛用藥裝置，或無(wú)針注射裝置。
173.治療或診斷受試體疾病或病變的方法，包括給需要的受試體服用治療上有效量的權(quán)利要求94-131，153或154任何一個(gè)所述的可逆可解折疊多肽。
174.權(quán)利要求94-131，153或154的任何一個(gè)所述的可逆可解折疊多肽在治療或診斷中的應(yīng)用。
175.權(quán)利要求94-131，153或154的任何一個(gè)所述的可逆可解折疊多肽在制備治療疾病的藥物中的應(yīng)用。
176.用在治療或診斷中的權(quán)利要求94-131，153或154的任何一個(gè)所述的可逆可解折疊多肽。
177.權(quán)利要求94-131，153或154任何一個(gè)所述的可逆可解折疊多肽在制備治療和/或預(yù)防和/或抑制由細(xì)胞因子，細(xì)胞因子受體，酶，酶輔助因子，或DNA結(jié)合蛋白介導(dǎo)的疾病或病況的藥物中的應(yīng)用。
178.權(quán)利要求94-131，153或154任何一個(gè)所述的可逆可解折疊多肽，其中多肽包括免疫球蛋白可變域，用來靶中細(xì)胞因子受體，酶，酶輔助因子，或DNA結(jié)合蛋白，用來治療和/或預(yù)防和/或抑制由細(xì)胞因子，細(xì)胞因子受體，酶，酶輔助因子，或DNA結(jié)合蛋白介導(dǎo)的疾病或病況。
179.根據(jù)權(quán)利要求176-178任何一個(gè)所述的多肽，其中疾病或病況是炎性病況，變態(tài)性超敏反應(yīng)，癌癥，細(xì)菌或病毒感染，或自身免疫疾病。
180.根據(jù)權(quán)利要求179所述的多肽，其中疾病或病況是哮喘，牛皮癬，I型糖尿病，多發(fā)性硬化，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，Crohn癥，重癥肌無(wú)力，白血病或?qū)嶓w腫瘤。
181.重組體宿主細(xì)胞，包括編碼權(quán)利要求94-131，153或154任何一個(gè)所述的可逆可解折疊多肽的重組核酸，其中所述重組核酸可操作地與表達(dá)控制序列連接。
182.制備可逆可解折疊多肽的方法，包括在適合表達(dá)所述重組核酸的條件下保持權(quán)利要求181的宿主細(xì)胞，其中表達(dá)所述重組細(xì)胞核酸，制備所述可逆可解折疊多肽。
183.權(quán)利要求40，144-148和156-158任何一個(gè)所述的文庫(kù)或全能文庫(kù)在選擇可逆可解折疊多肽中的應(yīng)用。
184.根據(jù)權(quán)利要求183所述的應(yīng)用，其中所述可逆可解折疊多肽包括可逆可解折疊抗體可變域。
185.根據(jù)權(quán)利要求183所述的應(yīng)用，其中所述可逆可解折疊多肽包括抗體形式。
186.制備富含可逆可解折疊多肽的噬菌體展示文庫(kù)的方法，包括提供包括大量展示多肽的噬菌體展示文庫(kù)，其中所述文庫(kù)中至少部分展示多肽解折疊并重折疊；將宿主細(xì)胞與所述噬菌體展示文庫(kù)接觸制備感染宿主細(xì)胞；和從感染宿主細(xì)胞恢復(fù)感染噬菌體或感染噬菌體子代，由此制備富含可逆可解折疊多肽的噬菌體展示文庫(kù)。
187.制備富含可逆可解折疊多肽的噬菌體展示文庫(kù)的方法，包括提供包括大量展示多肽的噬菌體展示文庫(kù)；在所述文庫(kù)中解折疊并然后重折疊至少部分展示的多肽；將產(chǎn)生的含有解折疊并重折疊的展示多肽的噬菌體展示文庫(kù)與宿主細(xì)胞接觸制備感染的宿主細(xì)胞；從感染的宿主細(xì)胞恢復(fù)感染噬菌體或感染噬菌體子代，由此制備富含可逆可解折疊多肽的噬菌體展示文庫(kù)。
188.根據(jù)權(quán)利要求186或187所述的方法，其中所述展示多肽通過加熱解折疊并通過冷卻解折疊。
189.根據(jù)權(quán)利要求186或187所述的方法，其中所述噬菌體展示文庫(kù)是多價(jià)噬菌體fd展示文庫(kù)，所述適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞是E.coli。
190.根據(jù)權(quán)利要求186-189任何一個(gè)所述的方法制備的噬菌體展示文庫(kù)。
191.從噬菌體展示文庫(kù)中恢復(fù)至少一種可逆可解折疊多肽的方法，包括提供包括大量展示多肽的噬菌體展示文庫(kù)，其中所述文庫(kù)中至少部分展示多肽解折疊并重折疊；將宿主細(xì)胞與所述噬菌體展示文庫(kù)接觸制備感染宿主細(xì)胞；和從感染宿主細(xì)胞恢復(fù)至少一種感染噬菌體或感染噬菌體子代，由此恢復(fù)可逆可解折疊多肽。
192.從噬菌體展示文庫(kù)中恢復(fù)至少一種可逆可解折疊多肽的方法，包括提供包括大量展示多肽的噬菌體展示文庫(kù)；在所述文庫(kù)中解折疊并然后重折疊至少部分展示的多肽；將產(chǎn)生的噬菌體展示文庫(kù)與宿主細(xì)胞接觸制備感染的宿主細(xì)胞；從感染的宿主細(xì)胞恢復(fù)感染噬菌體或感染噬菌體子代，由此恢復(fù)可逆可解折疊多肽。
193.制備富含可逆可解折疊多肽噬菌體展示文庫(kù)的方法，包括提供包含大量展示多肽的噬菌體展示文庫(kù)，其中所述文庫(kù)中至少部分展示的多肽在至少部分解折疊多肽聚集的條件下解折疊并重折疊；從噬菌體展示文庫(kù)恢復(fù)未聚集噬菌體。
194.根據(jù)權(quán)利要求193所述的方法，其中所述未聚集噬菌體是通過離心或感染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)菌來恢復(fù)的。
195.制備可逆可解折疊多肽地方法，包括提供氨基酸序列(a)由權(quán)利要求4的方法確定的可逆可解折疊多肽的氨基酸序列，(b)與其相同的氨基酸序列，或(c)由于替換，缺失或插入1到約10個(gè)氨基酸而不同的氨基酸序列；合成包括所述氨基酸序列或表達(dá)編碼所述氨基酸序列的核酸的多肽，由此制備可逆可解折疊多肽。
196.根據(jù)權(quán)利要求195所述的方法，進(jìn)一步包括確認(rèn)合成的可逆可解折疊多肽的步驟。
197.根據(jù)權(quán)利要求195所述的方法，其中所述多肽受熱可逆可解折疊。
198.分離的多肽，包括免疫球蛋白可變(V)域，其中所述V域包括CDR2半胱氨酸和CDR3半胱氨酸間的二硫化物鍵，其中CDR2和CDR3是Kabat所定義的。
199.根據(jù)權(quán)利要求198所述的分離多肽，其中所述二硫化物鍵是位置52a上和位置98上的半胱氨酸殘基間，位置51上和位置98上的半胱氨酸殘基間，或位置51上和位置100b上的半胱氨酸間的二硫化物鍵。
200.根據(jù)權(quán)利要求198所述的多肽，其中所述二硫化物鍵在位置51上的半胱氨酸和CDR3上半胱氨酸之間，或在CDR2上的半胱氨酸和位置98上的半胱氨酸之間，其中CDR2，CDR3和所述位置是Kabat所定義的。
全文摘要
本發(fā)明涉及可逆可解折疊多肽(如，受熱時(shí)解折疊，冷卻時(shí)重折疊)，涉及包含可逆可解折疊多肽的全能文庫(kù)，并涉及含可逆可解折疊多肽或編碼可逆可解折疊多肽核酸的文庫(kù)。本發(fā)明還涉及制備富含可逆可解折疊多肽或編碼可逆可解折疊多肽核酸文庫(kù)的方法。本發(fā)明涉及選擇和/或分離可逆可解折疊多肽的方法，涉及制備可逆可解折疊多肽的方法。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1823164SQ200480020375
公開日2006年8月23日 申請(qǐng)日期2004年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月14日
發(fā)明者勞倫特·S·杰斯珀斯, 菲利普·C·瓊斯, 克瑞斯托弗·H·J·菲瑪, 格雷戈里·P·溫特 申請(qǐng)人:多曼蒂斯有限公司