專利名稱：一種血管緊縮素i轉(zhuǎn)換酶活性抑制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療和預(yù)防高血壓的藥物，具體地說是一種血管緊縮素I轉(zhuǎn)換酶(angiotensin I coverting enzyme，略稱為ACE)活性抑制劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
高血壓的發(fā)病與腎素-血管緊縮素系統(tǒng)有著深深的相關(guān)性。腎素-血管緊縮素系統(tǒng)對存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜等的ACE起著重要的作用；即從肝臟分泌的血管緊縮素肽原被腎臟產(chǎn)生的腎素切斷，由此產(chǎn)生了血管緊縮素I，血管緊縮素I由ACE切斷成血管緊縮素II；這個血管緊縮素II使血管收縮造成血壓升高，并且作用于副腎上皮質(zhì)，促進(jìn)了醛固酮分泌。
另一方面，血漿中激肽釋放酶切斷了激肽原蛋白，產(chǎn)生了舒緩激肽。舒緩激肽具有血管擴張作用，使血壓下降。ACE使舒緩激肽分解成碎片，失去其使血管擴張的作用。
綜上所述，ACE一方面產(chǎn)生使血壓上升的血管緊縮素II；另一方面，使具有血管舒張作用的舒緩激肽分解；兩個方面都造成了血壓的上升。所以，如果抑制了ACE的活性，就可以抑制血壓的上升，或者使血壓下降。
作為ACE的活性阻礙物質(zhì)，如廣為人知的合成物卡普托普利，作為高血壓的治療藥物被廣泛使用。而且，最近幾年從各種食品當(dāng)中也發(fā)現(xiàn)和確定了多種具有ACE阻礙活性的肽；其中牛乳酪蛋白，發(fā)酵乳以及由魚類由來的多種肽添加到食品中作為保健食品，在日本已經(jīng)由國家批準(zhǔn)作為特定的保健食品，實現(xiàn)了商品化(例如，日本的發(fā)明專利特公昭60-23085；特公昭61-51562；特公昭61-51564)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種安全性高的血管緊縮素I轉(zhuǎn)換酶活性抑制劑。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種血管緊縮素I轉(zhuǎn)換酶活性抑制劑，其有效成份至少含有一種以Ala-Pro、Thr-Pro、Val-Pro、Glu-Pro、Lys-Pro、Arg-Pro，Gly-Pro所表示的氨基酸序列形成的二肽或這六種具有ACE抑制活性肽的鹽類。
由于手相不同而定義為L型氨基酸和D型氨基酸；所述二肽(可形成的不同構(gòu)型)包括L型和L型，L型和D型，D型和D型氨基酸組成的二肽。
所述血管緊縮素I轉(zhuǎn)換酶活性抑制劑可用于治療和預(yù)防高血壓的藥物或保健食品中。
以下，對上述ACE的抑制劑進(jìn)行具體的說明，但是本發(fā)明的權(quán)利要求不受該說明的拘束和限制。
本發(fā)明的ACE抑制劑，是Ala-Pro，Thr-Pro，Val-Pro，Glu-Pro，Lys-Pro，Arg-Pro，Gly-Pro所表示的氨基酸序列形成的肽，以及由它們的鹽類中至少一種作為有效成分；所述二肽的鹽類可以用通常的方法生產(chǎn)；1)與酸反應(yīng)產(chǎn)生的鹽類比如說鹽酸，硫酸，硝酸，磷酸等無機酸；蟻酸，乙酸，丙酸，甘氨膽酸，蘋果酸，檸檬酸，酒石酸，琥珀酸等有機酸等形成的鹽類；2)與金屬離子形成的鹽類，包括鈉鹽，鉀鹽，鈣鹽，銨鹽；以及3)與氨基乙醇，三乙氨，二環(huán)乙氨等形成的胺類鹽等沒有特別的限制。
本發(fā)明ACE抑制劑用于治療和預(yù)防高血壓的藥物中，其可為加入各種充填劑所形成的散劑，顆粒劑，片劑，膠囊，懸浮液，乳化液，噴劑，粉劑等，通過口腔攝取或者是注射液的形式使用；本發(fā)明ACE抑制劑可經(jīng)口腔和非經(jīng)口腔投入使用；非經(jīng)口腔的投入方法比如皮下和靜脈注射，肛腸投入等；可以任意選用生理鹽水，葡萄糖，安定劑，防腐劑，懸浮劑，乳化劑等制成的注射液。
本發(fā)明ACE抑制劑可以添加到各種食品當(dāng)中，作為抑制血壓保健食品；食品的形態(tài)可以是清涼飲料，乳酸飲料，調(diào)味品，湯類，奶酪，火腿，點心等。
本發(fā)明ACE抑制劑的使用量是沒有特別的限制，具體的要根據(jù)高血壓的程度，患者的年齡，體重，身體狀況和給與的方法等因素適當(dāng)?shù)卮_定。比如對高血壓的患者經(jīng)口服攝取的場合，Ala-Pro，Thr-Pro，Val-Pro，Glu-Pro，Lys-Pro，Arg-Pro，Gly-Pro所表示的氨基酸序列而形成的肽以及它的鹽類至少一種，每日按每公斤體重0.1-50毫克服用，如果使用其中兩種以上活性肽的方式，可以按總和計量來考慮。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.藥效期長。本發(fā)明六種抑制ACE二肽，分子量小，在消化道里非常容易吸收，六種活性肽的肽鏈的C端均是脯氨酸(其C末端是脯氨酸與前一個氨基酸形成的肽)，在腸道內(nèi)不容易被蛋白酶消化分解掉，可以長時間在體內(nèi)存在，在體內(nèi)難以被分解，可以維持較長時間的抑制血壓升高的效果。
2.安全性高。本發(fā)明的活性肽來源于天然(食品)蛋白質(zhì)，作為藥品和保健品對人體沒有毒害等副作用，不會對身體造成危害，其在血管內(nèi)的吸收性和吸收后的安定性都比較高，安全、廉價的，具有可生產(chǎn)性。
3.應(yīng)用效果好。本發(fā)明應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對魚蛋白的酶解產(chǎn)物(對魚蛋白質(zhì)的蛋白水解酶的處理)進(jìn)行了分離和純化，通過氨基酸分析，得到了Gly-Pro，Ala-Pro，Thr-Pro，Val-Pro，Glu-Pro，Lys-Pro，Arg-Pro所表示的氨基酸序列形成的肽，這6種肽(或者其鹽類中任何一種成份)抑制了腎素-血管緊縮素系統(tǒng)中的血管緊縮素I轉(zhuǎn)換酶(angiotensin Icoverting enzyme，略稱為ACE)的活性，阻止了血管緊縮素I轉(zhuǎn)換成血管緊縮素II；從而可以降低動物血壓，或者抑制動物血壓的升高趨勢。
4.用途廣泛，意義深遠(yuǎn)。本發(fā)明的肽和其鹽是從來沒有的新發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)，有各種各樣的作用和效果，如對ACE的抑制作用，前列腺素E2的合成促進(jìn)作用，環(huán)前列腺素合成促進(jìn)作用以及降低血壓作用等；具體應(yīng)用為ACE抑制劑的有效成分，降血壓的有效成分，動脈硬化預(yù)防劑的有效成分；可以作為治療高血壓的藥物或者是抑制血壓升高趨勢的藥物以及健康保健品；此發(fā)明提示如果通過酶處理，從多種食品蛋白質(zhì)中可以得到具有ACE抑制作用的生物活性肽；也提示從食品蛋白質(zhì)中可以提取具有其他生理活性的肽類物質(zhì)。
具體實施例方式
實施例1文獻(xiàn)(1)闡述了從蛋白質(zhì)的酶加水分解產(chǎn)物中分離肽的步驟和方法，以及活性肽對血管緊縮素I轉(zhuǎn)換酶活性抑制的測定方法；[文獻(xiàn)1.SusumuMaruyama，Hajime Itachi，Hideoki Tanaka，Noboru Tomizuka and HideoSuzuki.，Studies on the Active Site and Antihypertensive Activityof Angiotensin I-Coverting Enzyme Inhibitors Derivered from Casein，Agric.Biol.Chem.，51(6)，1581-1586，1987.]參照文獻(xiàn)(1)的蛋白質(zhì)降解和分離的方法，由鰱魚蛋白的胰蛋白酶水解液體10毫升經(jīng)SephadexLH 20柱進(jìn)行層析分離，30％甲醇溶液洗脫，回收具有ACE活性抑制作用的分餾部分。這個過程重復(fù)了3次，即從總量30毫升中，把層析得到的活性部分減壓濃縮后，加樣至DEAE Toyopearl 650M column離子交換柱，通過蒸餾水的洗脫得到的活性分餾部分A，以及0-1摩爾氯化鈉溶液的直線梯度洗脫得到的弱活性分餾部分B。
A部分加樣至SP Toyopearl 650M column離子交換柱，通過蒸餾水的洗脫得到的活性分餾部分A-1，以及0-1摩爾氯化鈉溶液的直線梯度洗脫得到的活性分餾部分A-2。A-1分餾部分再通過使用Symmetry C18column的HPLC，用含有0.1％三氟乙酸的0-32％乙腈直線梯度洗脫得到了二肽的分餾部分A-1-1，A-1-2，A-1-3，A-1-4，A-1-5；同樣的方法從A2得到了A-2-1，A-2-2；從B活性分餾部分得到了B-1，B-2，B-3，B-4?；厥盏?1種肽經(jīng)過減壓干燥成為最終的測定氨基酸序列的樣品。
這些測定氨基酸序列的樣品經(jīng)過Applied Biosystem公司制造的491型蛋白質(zhì)序列測試儀的分析，確定A-1-1為Gly-Pro，A-1-2為Ala-Pro，Glu-Pro，Thr-Pro的混合體，A-1-3，A-1-4，A-1-5分別為Val-Pro，Gly-Ile，Gly-Leu；A-2-1，A-2-2分別為Lys-Pro，Arg-Pro；化學(xué)合成的上述肽的在HPLC溶出的時間與從魚蛋白中精致的肽在HPLC上的溶出時間是一致的。由附表1來表示其中6種肽對ACE的抑制活性。
實施例2文獻(xiàn)(2)闡述了抑制血管緊縮素I轉(zhuǎn)換酶的活性肽，對抑制遺傳性管血壓動物模型SHR大白鼠血壓升高的測定方法[文獻(xiàn)2.Hiroyuki Fujita，Masaaki Yoshikawa.，LKPNMa prodrug-Type ACE-inhibitory peptidederived from fish protein.Immunopharmacology(44)，123-127，1999.]。
實施例1中的ACE抑制活性的測定方法參考文獻(xiàn)(2)，從Sigma公司購入的兔肺由來的ACE，用22毫摩爾硼酸緩沖液(pH8.3)溶解，使它成為濃度為60毫單位每毫升濃度的溶液作為酶溶液。從Sigma公司購入的Hip-His-Leu(Hippuryl-L-histidyl-L-leucine)用上述的硼酸緩沖液溶解，作為濃度是7.6毫摩爾基質(zhì)溶液。在0.5毫升的離心管內(nèi)，加入測試液體，即魚蛋白質(zhì)的酶加水分解液，或者是活性肽50微升，在攝氏37度5分鐘反應(yīng)后，加入上述的基質(zhì)溶液125微升，充分混合以后進(jìn)行攝氏37度30分鐘反應(yīng)。之后，用10％的三氟乙酸20微升來停止反應(yīng)。由ACE作用分離的馬尿酸通過以下的HPLC條件來定量。
HPLC的測定條件柱μBondasphere 5μC8300 column洗脫液含有0.1％三氟乙酸的0-32％乙腈直線梯度洗脫流速每分鐘一毫升檢波波長228nm的紫外檢測這個實驗進(jìn)行多次重復(fù)實驗，抑制率由以下公式來算出抑制率＝(A-B)/A×100(％)公式中A為不含抑制劑的馬尿酸面積，B含抑制劑的馬尿酸面積。50％的抑制率濃度用IC50來表示。
附表1.魚蛋白由來的活性肽對血管緊縮素I轉(zhuǎn)換酶的抑制

權(quán)利要求
1.一種血管緊縮素I轉(zhuǎn)換酶活性抑制劑，其特征在于其有效成份至少含有一種以Ala-Pro、Thr-Pro、Val-Pro、Glu-Pro、Lys-Pro、Arg-Pro，Gly-Pro所表示的氨基酸序列形成的二肽或它們的鹽。
2.按照權(quán)利要求1所述的血管緊縮素I轉(zhuǎn)換酶活性抑制劑，其特征在于所述二肽的構(gòu)型包括L型和L型，L型和D型和/或D型和D型氨基酸。
3.一種權(quán)利要求1所述血管緊縮素I轉(zhuǎn)換酶活性抑制劑的應(yīng)用，其特征在于Ala-Pro、Thr-Pro、Val-Pro、Glu-Pro、Lys-Pro、Arg-Pro，Gly-Pro及它們的鹽可用于治療和預(yù)防高血壓的藥物或保健食品。
4.按照權(quán)利要求3所述血管緊縮素I轉(zhuǎn)換酶活性抑制劑的應(yīng)用，其特征在于所述藥物可以與充填劑形成各種形式的散劑，顆粒劑，片劑，膠囊，水溶液，懸浮液，乳化液，噴劑或粉劑。
5.按照權(quán)利要求3所述血管緊縮素I轉(zhuǎn)換酶活性抑制劑的應(yīng)用，其特征在于所述藥物使用時可以采取經(jīng)口腔或非經(jīng)口腔的投入方法；非經(jīng)口腔的投入可以采取皮下和靜脈注射或肛腸投入；注射液的制作可以任意選用生理鹽水，葡萄糖，安定劑，防腐劑，懸浮劑或乳化劑。
6.按照權(quán)利要求3所述血管緊縮素I轉(zhuǎn)換酶活性抑制劑的應(yīng)用，其特征在于所述保健食品的形態(tài)可以是液體的清涼飲料、乳酸飲料、調(diào)味品或湯類；也可以是固體的奶酪、火腿或點心。
全文摘要
本發(fā)明至少是由六種Ala－Pro，Thr－Pro，Val－Pro，Glu－Pro，Lys－Pro，Arg－Pro，Gly－Pro所表示的，或者其鹽類中一種成分所構(gòu)成的ACE抑制劑。應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對魚蛋白的酶加水分解，對具有ACE抑制活性分餾部分進(jìn)行了分離和純化，對其分子構(gòu)造即肽的氨基酸序列進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)由序列Ala－Pro，Thr－Pro，Val－Pro，Glu－Pro，Lys－Pro，Arg－Pro，Gly－Pro所表示的氨基酸序列二肽。上述二肽對ACE活性有較好的抑制作用。上述的6種活性肽的C末段均由脯氨酸構(gòu)成，它形成的肽鍵很難被蛋白分解酶切斷，在體內(nèi)可以長時間地抑制ACE活性。因此，可以將上述活性肽或者其鹽類作為高血壓患者的長期治療藥物，或者添加在食品中作為健康保健食品。
文檔編號A61P9/12GK1623600SQ20031010526
公開日2005年6月8日 申請日期2003年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月4日
發(fā)明者胡建恩, 杜昱光, 白雪芳, 李曙光, 譚成玉 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所