專(zhuān)利名稱(chēng)：乙型肝炎治療疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乙型肝炎治療疫苗。具體而言，本發(fā)明涉及一種乙型肝炎表面抗原和一蛋白載體偶聯(lián)的治療疫苗。更具體而言，本發(fā)明涉及一種含有乙型肝炎表面抗原與破傷風(fēng)類(lèi)毒素經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)而成的結(jié)合物，再經(jīng)適宜配制成為治療疫苗。本發(fā)明還涉及這種治療疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
乙型肝炎是嚴(yán)重影響人類(lèi)健康的傳染性疾病之一，全世界約有3.5億人為慢性攜帶者(Lee，W.M.等人，N Engl J Med，3371733-45，1997)。我國(guó)是乙型肝炎高發(fā)流行區(qū)，約有1億人口攜帶乙肝表面抗原，慢性乙肝病人約2000～3000萬(wàn)。慢性乙肝是引起肝硬化、肝癌的最主要原因(Wright，T.L.等人，Lancet，3421340-4，1993)。目前為止，尚無(wú)有效的治療藥物和治療手段，乙型肝炎成為重大的社會(huì)衛(wèi)生問(wèn)題。
抗病毒治療是清除乙肝病毒，減少并發(fā)癥，防止肝纖維化的措施之一。目前抗病毒藥物療效明確的有干擾素和拉米夫啶，其他藥物如胸腺素、白介素-12、泛昔洛韋等也有一定的抗病毒作用。干擾素既能抑制病毒復(fù)制，又能調(diào)節(jié)宿主免疫功能。但干擾素的持續(xù)有效率僅為20％，且治療費(fèi)用昂貴，難以推廣應(yīng)用，尤其對(duì)ALT正常的病人效果較差(Hoonfnagle，J.H.等人，N Engl J Med，336347-356，1997)。拉米夫啶口服吸收好，在肝細(xì)胞內(nèi)磷酸化為三磷酸拉米夫啶，通過(guò)抑制HBV-DNA逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA多聚酶的活性而起到抗病毒作用，但拉米夫啶停藥后復(fù)燃及長(zhǎng)期用藥后耐藥株的出現(xiàn)是急待解決的問(wèn)題(Dienstag，J.L.等人，N Engl J Med，3331657-1661，1995)。
乙型肝炎慢性化機(jī)制十分復(fù)雜，其中免疫耐受是形成慢性化的機(jī)制之一。乙型肝炎慢性化為HBV抗原和感染宿主相互作用的結(jié)果，特異性免疫治療是打破免疫耐受的方法之一。治療性乙肝疫苗可通過(guò)改變抗原提呈和加工途徑，激活耐受機(jī)體的免疫應(yīng)答，從而打破免疫耐受，改變慢性乙肝的臨床過(guò)程。研究表明乙肝疫苗或乙肝疫苗合用免疫調(diào)節(jié)劑可打破轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫耐受，具有較好的治療前景(Mancini.M.等人，J Med Virol，3967-74，1993)。
目前，葛蘭素史克公司和美國(guó)Cytel等公司均已有治療性疫苗進(jìn)入臨床考核階段。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)治療性乙肝疫苗發(fā)展迅速，乙肝表面抗原和乙肝免疫球蛋白復(fù)合物制劑，已經(jīng)I期臨床證明安全性好，正在進(jìn)行II期臨床考核；多肽表位疫苗已批準(zhǔn)進(jìn)入I期臨床，此外作為免疫調(diào)節(jié)劑使用的60μg劑乙肝疫苗也進(jìn)入審評(píng)階段。
乙肝抗原作為治療性乙肝疫苗的主要成分，在臨床應(yīng)用具有良好的前景具實(shí)用性，多年來(lái)已積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，證明安全性好，價(jià)格低廉，治療方案較易接受，但療效仍無(wú)定論，可能與選擇疫苗的種類(lèi)、劑量、佐劑成分以及治療對(duì)象的選擇等因素有關(guān)。研究方向應(yīng)從疫苗劑量的增加、免疫調(diào)節(jié)劑的配合，給藥途徑，或與干擾素抗病毒藥物聯(lián)合應(yīng)用，特別是新型疫苗佐劑等方面深入研究。
乙肝缺乏動(dòng)物模型，藥效學(xué)評(píng)價(jià)困難。單用乙肝疫苗不易打破免疫耐受，必須輔助以能增加乙肝疫苗的細(xì)胞免疫反應(yīng)免疫增強(qiáng)劑，而如何選擇和使用免疫增強(qiáng)劑是治療性乙肝疫苗研究的難點(diǎn)。近期研究表明，早期誘導(dǎo)特異性的TH1類(lèi)細(xì)胞反應(yīng)是治療乙肝的關(guān)鍵，因此研究的重點(diǎn)應(yīng)為尋找能增加特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的免疫增強(qiáng)劑或類(lèi)似物(佐劑)。
免疫實(shí)踐證明，細(xì)菌莢膜多糖屬于T細(xì)胞非依賴(lài)性抗原，其免疫效果與接種對(duì)象的年齡明顯相關(guān)，嬰幼兒的免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不完善，接種多糖疫苗后不能有效激活T輔助細(xì)胞和T記憶細(xì)胞，不能誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫回憶反應(yīng)，因而，免疫保護(hù)時(shí)間短暫，再次免疫接種也不能產(chǎn)生加強(qiáng)免疫效應(yīng)。例如，腦膜炎球菌多糖抗原雖能誘導(dǎo)產(chǎn)生IgM和IgG抗體，但人類(lèi)所產(chǎn)生的IgG主要是IgG2亞類(lèi)，而人血清IgG2亞類(lèi)抗體出現(xiàn)較遲，一般要到8～12歲才能上升至成人水平。這可能與分泌IgG2亞類(lèi)抗體的B淋巴細(xì)胞發(fā)育遲緩有關(guān)。故此，嬰幼兒接種多糖疫苗后，產(chǎn)生只有短暫作用的IgM抗體為主。為提高多糖疫苗的免疫效果，主要辦法是將多糖抗原與蛋白載體結(jié)合，使多糖抗原由T細(xì)胞非依賴(lài)性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)細(xì)胞依賴(lài)性抗原。研究表明，多糖與蛋白載體結(jié)合后，T細(xì)胞能識(shí)別載體，刺激B細(xì)胞對(duì)多糖產(chǎn)生應(yīng)答，并能誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫回憶反應(yīng)使更多的B細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌多糖和一蛋白載體偶聯(lián)后的效果在Hib(b型流感嗜血桿菌)結(jié)合疫苗和C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗中得到了驗(yàn)證。多糖和蛋白載體偶聯(lián)后，T細(xì)胞能識(shí)別載體，刺激B細(xì)胞對(duì)多糖產(chǎn)生抗體應(yīng)答，并能誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫記憶反應(yīng)。上述結(jié)合疫苗均能產(chǎn)生足夠.高水平的抗莢膜IgG抗體和有免疫記憶的B細(xì)胞。目前已有4種蛋白載體用于結(jié)合疫苗，破傷風(fēng)類(lèi)毒素、突變無(wú)毒白喉毒素(CRM197)、白喉類(lèi)毒素和B群腦膜炎球菌外膜蛋白。
破傷風(fēng)梭菌在適宜培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖的過(guò)程中所產(chǎn)生的破傷風(fēng)毒素是一種由1,315個(gè)氨基酸所組成的、分子量為150,700的單純蛋白質(zhì)。破傷風(fēng)毒素是一種外毒素，最初是在菌體內(nèi)形成單一多肽鏈，當(dāng)從菌體釋放出后便形成具有輕鏈和重鏈的以雙硫鍵相連的多肽鏈。破傷風(fēng)毒素經(jīng)甲醛脫毒處理后轉(zhuǎn)變成類(lèi)毒素，依然保留良好的破傷風(fēng)抗原的免疫原性，而其毒力降低并不引起相應(yīng)癥狀(Gapta，R.K.et al，J.of Biol.Stand.，1985，13355～359)。
鑒于上述原因，本發(fā)明采用蛋白載體和乙肝表面抗原經(jīng)化學(xué)共價(jià)偶聯(lián)。該蛋白載體作為免疫增強(qiáng)劑誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生對(duì)乙肝表面抗原的細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而達(dá)到打破乙肝病人的免疫耐受，改變慢性乙肝的臨床過(guò)程的目的。
目前最常用的人用疫苗佐劑仍為氫氧化鋁和磷酸鋁。而APC佐劑、T細(xì)胞佐劑，可選擇性誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫，有效控制和殺傷細(xì)胞內(nèi)病原體和腫瘤細(xì)胞，故為研究的重點(diǎn)。近年來(lái)，TH1極化佐劑的研究已成為研究熱點(diǎn)。一些佐劑配方包括微生物來(lái)源的FCA、MDP、MPL、細(xì)胞因子如IL-12、r-IFN、脂質(zhì)體等均可刺激小鼠產(chǎn)生TH1應(yīng)答，可望成為用于免疫治療的新型疫苗佐劑或免疫調(diào)節(jié)劑。
鑒于上述原因，本發(fā)明將乙肝表面抗原與破傷風(fēng)類(lèi)毒素為代表的蛋白載體經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)行成的結(jié)合物，以綠膿桿菌制劑作為佐劑，再經(jīng)適宜配制成為乙型肝炎治療疫苗。該治療疫苗用于臨床上治療乙型肝炎患者和健康人預(yù)防乙型肝炎病毒感染。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種新的疫苗，特別是，本發(fā)明提供了一種乙型肝炎表面抗原和一蛋白載體化學(xué)共價(jià)偶聯(lián)而成的乙型肝炎治療疫苗。優(yōu)選的是，含有以破傷風(fēng)類(lèi)毒素為載體的并與乙型肝炎表面抗原經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)形成的共價(jià)結(jié)合物為主要成份的乙型肝炎治療疫苗，用以臨床上治療乙型肝炎患者和健康人預(yù)防乙型肝炎病毒感染。
本發(fā)明還提供了一種制備乙型肝炎治療疫苗的方法，該方法包括(A)將2.5～90微克乙型肝炎表面抗原和5～60微克的蛋白載體偶聯(lián)地一偶聯(lián)物；(B)將乙型肝炎表面抗原和蛋白載體的偶聯(lián)物經(jīng)配制而成一種乙型肝炎治療疫苗。
其中所述的蛋白載體是選自破傷風(fēng)類(lèi)毒素、白喉類(lèi)毒素、無(wú)毒性白喉變異株CRM197毒素和B群腦膜炎球菌外膜蛋白群組的任何一種。優(yōu)選的是，所述的蛋白載體是破傷風(fēng)類(lèi)毒素。本發(fā)明的疫苗可以用鋁佐劑和/或緩沖生理鹽水配制。
在本發(fā)明，乙型肝炎表面抗原可以與作載體的破傷風(fēng)類(lèi)毒素經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)形成共價(jià)結(jié)合物，再將此共價(jià)結(jié)合物配制成一種新的乙型肝炎治療疫苗的方法。
本發(fā)明所用乙型肝炎表面抗原為商品化的基因工程乙肝抗原，其來(lái)源包括酵母細(xì)胞和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)等表達(dá)系統(tǒng)。乙型肝炎表面抗原的制備方法見(jiàn)《中國(guó)生物制品制品規(guī)程》(化學(xué)工業(yè)出版社，2000年，175～183頁(yè))。
本發(fā)明所用破傷風(fēng)類(lèi)毒素是指商品化破傷風(fēng)類(lèi)毒素，如精制破傷風(fēng)類(lèi)毒素。破傷風(fēng)類(lèi)毒素的制備方法見(jiàn)《中國(guó)生物制品制品規(guī)程》(化學(xué)工業(yè)出版社，2000年，213～218頁(yè))本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，作為載體的蛋白可以是破傷風(fēng)類(lèi)毒素、突變無(wú)毒白喉毒素(CRM197)、白喉類(lèi)毒素和B群腦膜炎球菌外膜蛋白中的任何一個(gè)。這里給出的破傷風(fēng)類(lèi)毒素僅僅是為了例示性說(shuō)明本發(fā)明，如果滿足需要也可采用其它蛋白載體。
本發(fā)明采用溴化氰(CNBr)活化乙型肝炎表面抗原，以虎鉑酰亞胺(SPDP)為雙功能親核間隔基，是之形成乙型肝炎表面抗原虎鉑酰亞胺衍生物。進(jìn)一步通過(guò)碳二亞胺(EDAC)介導(dǎo)的縮合作用與破傷風(fēng)類(lèi)毒素共價(jià)結(jié)合，獲得乙型肝炎表面抗原-破傷風(fēng)類(lèi)毒素偶聯(lián)結(jié)合物。再經(jīng)超濾濃縮，柱層析純化獲得的高分子偶聯(lián)結(jié)合物，經(jīng)除菌過(guò)濾、配制、稀釋分裝成為治療疫苗。
如上所述，在乙型肝炎表面抗原和破傷風(fēng)類(lèi)毒素形成偶聯(lián)物的過(guò)程中，可以由單個(gè)乙型肝炎表面抗原經(jīng)活化后可能有多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)結(jié)合多個(gè)破傷風(fēng)類(lèi)毒素。同樣也可以由活化后的單個(gè)破傷風(fēng)類(lèi)毒素的多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)結(jié)合多個(gè)乙型肝炎表面抗原。乙型肝炎表面抗原和破傷風(fēng)類(lèi)毒素的結(jié)合并不限定于1∶1，也就是一個(gè)乙型肝炎表面抗原分子上可以偶聯(lián)上1個(gè)或者多個(gè)破傷風(fēng)類(lèi)毒素分子；同樣地，一個(gè)破傷風(fēng)類(lèi)毒素分子上可以偶聯(lián)上1個(gè)或者多個(gè)乙型肝炎表面抗原分子。在乙型肝炎表面抗原和破傷風(fēng)類(lèi)毒素的偶聯(lián)中，優(yōu)選發(fā)生乙型肝炎表面抗原和破傷風(fēng)類(lèi)毒素的一一對(duì)應(yīng)的結(jié)合。但是如上所述，乙型肝炎表面抗原和破傷風(fēng)類(lèi)毒素的各種結(jié)合只要并不影響本發(fā)明的治療疫苗所能達(dá)到的效果，那么所有這些偶聯(lián)中的細(xì)節(jié)變化均應(yīng)包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
本發(fā)明所述的乙型肝炎表面抗原與破傷風(fēng)類(lèi)毒素的偶聯(lián)方法僅僅是用于說(shuō)明，所以，可以采用各種等同的方法實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述的偶聯(lián)過(guò)程，因此任何用于蛋白分子偶聯(lián)的方法和工藝或者過(guò)程都有可能用于實(shí)施本發(fā)明。
在本發(fā)明的治療疫苗中，乙型肝炎表面抗原每劑免疫劑量為2.5～90微克之間，蛋白載體，例如破傷風(fēng)類(lèi)毒素，含量在5～60微克之間，至于用量的上限，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)治療疫苗臨床使用的常規(guī)實(shí)踐靈活掌握。
本發(fā)明的治療疫苗中可以進(jìn)一步添加綠膿桿菌制劑作為佐劑，增強(qiáng)治療疫苗的免疫應(yīng)答水平。
在本發(fā)明的治療疫苗中可以進(jìn)一步添加吸附佐劑，例如氫氧化鋁和/或磷酸鋁等鋁佐劑。使用時(shí)，可以對(duì)本發(fā)明的治療疫苗進(jìn)行稀釋?zhuān)线m的稀釋液的不限定的實(shí)例有緩沖生理鹽水稀釋液。
總之，目前還沒(méi)有一種新的利用乙型肝炎表面抗原與一種蛋白載體經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)而成的治療疫苗。本發(fā)明通過(guò)將乙型肝炎表面抗原和蛋白載體進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)，以綠膿桿菌制劑作為佐劑，得到新型的乙型肝炎治療疫苗。該治療疫苗可特異性的誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫，用于臨床上治療乙型肝炎患者和健康人預(yù)防乙型肝炎病毒感染。
本發(fā)明的另一重點(diǎn)是，采用綠膿桿菌制劑為佐劑，優(yōu)選的是以綠膿桿菌MSHA菌毛株制劑。本發(fā)明首次將綠膿桿菌MSHA菌毛株制劑(PA)作為佐劑加入乙型肝炎治療疫苗中。用MSHA菌毛株制備的綠膿桿菌制劑已作為治療腫瘤的藥物上市，該制品能調(diào)整人體體液免疫和細(xì)胞免疫的不平衡狀態(tài)，增加巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性，維持T細(xì)胞的數(shù)量與比例，調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-2、干擾素與抗體的協(xié)同作用(中國(guó)生物制品規(guī)程，化學(xué)工業(yè)出版社，2000年，265頁(yè))。
本發(fā)明治療性乙肝疫苗具有較高的安全性，理由如下1.乙肝表面抗原乙肝表面抗原作為預(yù)防性疫苗的主要成分已在世界范圍內(nèi)經(jīng)數(shù)億人次、近20年的大量應(yīng)用，應(yīng)用效果充分證明了其安全性。
2.破傷風(fēng)類(lèi)毒素破傷風(fēng)類(lèi)毒素已作為常規(guī)疫苗在全世界范圍內(nèi)使用，其良好的安全和保護(hù)效果早已公知。
3.綠膿桿菌制劑作為佐劑應(yīng)用的安全性綠膿桿菌制劑是中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的治療腫瘤的上市品種，其制造檢定規(guī)程已列入《中國(guó)生物制品制品規(guī)程》(2000年版)。綠膿桿菌制劑臨床應(yīng)用的安全性已被證實(shí)。
4.乙肝表面抗原與破傷風(fēng)毒素偶聯(lián)后的安全性在整個(gè)偶聯(lián)過(guò)程中采用了透析、超濾、柱層析等綜合措施，有效地去除了化學(xué)試劑的殘余物和小分子量物質(zhì)，保證了制品的安全性。
5.乙肝治療疫苗的安全驗(yàn)證經(jīng)異常毒性實(shí)驗(yàn)證實(shí)乙肝治療疫苗在動(dòng)物體內(nèi)有良好的安全性。


圖1乙肝抗原與TT偶聯(lián)后免疫小鼠體液免疫反應(yīng)，其中ED50單位為稀釋度，HbsAg+TT乙肝抗原與TT偶聯(lián)，HbsAg+AL-TT乙肝疫苗(含鋁佐劑)與TT混合，HbsAg+Al乙肝疫苗(含鋁佐劑)，HbsAg-TT乙肝抗原與TT混合。
圖2乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT與與PA混合組誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，其中，HBsAg+TT乙肝抗原與TT偶聯(lián)，HBsAg+TT+PA乙肝抗原與TT偶聯(lián)混合PA，HBsAg+Al乙肝疫苗(含鋁佐劑)。
圖3乙型肝炎治療疫苗誘導(dǎo)抗體的IGg2a/IGg1比值，其中G1乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT與PA混合組；G2乙肝疫苗組；G3乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT組。
圖4治療性乙肝疫苗免疫小鼠脾細(xì)胞ELISPOT檢測(cè)γ-IFN結(jié)果。
圖5治療性乙肝疫苗免疫小鼠脾細(xì)胞ELISPOT檢測(cè)IL-2結(jié)果。
圖6治療性乙肝疫苗不同劑量HBsAg免疫小鼠脾細(xì)胞ELISPOT檢測(cè)γ-IFN結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例描述本發(fā)明以破傷風(fēng)類(lèi)毒素為蛋白載體與乙型肝炎表面抗原通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)形成共價(jià)結(jié)合物，經(jīng)配制成治療疫苗，并經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)證明該治療疫苗具有可靠的安全性和顯著的免疫原性。
實(shí)施例1乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和精制破傷風(fēng)類(lèi)毒素(TT)共價(jià)偶聯(lián)物的制備取濃度為1～2mg/ml的HBsAg，加0.5～1.0mg/ml溴化氰(CNBr)活化，在23±3℃下作用0.5～1小時(shí)，維持PH8.2～10。加N-琥鉑酰亞胺-3-(2-硫代吡啶)丙酸(SPDP)2.5～4mg/ml活化物，維持PH8.2～10.0，作用10～30分鐘。于2～8℃攪拌10～20小時(shí)，透析去除小分子物質(zhì)。加濃度為2～4mg/ml的等體積TT混合均勻，加入碳二亞胺(EDAC)15～25mg/ml混合物，5～15℃作用0.5～1小時(shí)，調(diào)PH5～7。偶聯(lián)原液經(jīng)300KD透析膜在0.2M NaCl溶液透析12～15小時(shí)。收集透析后結(jié)合物，經(jīng)Sephacryl S 400柱層析，用0.15～0.2M NaCl洗脫，收集V0峰附近高分子量結(jié)合物。除菌過(guò)濾后無(wú)菌保存于2～8℃。
圖1、乙型肝炎表面抗原與破傷風(fēng)類(lèi)毒素經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)而成的共價(jià)結(jié)合物柱層析圖。圖中的上層峰乙型肝炎表面抗原鋒，與破傷風(fēng)類(lèi)毒素結(jié)合后，分子量增大，以V0附近高分子量化合物為主；下層峰破傷風(fēng)類(lèi)毒素峰，與乙型肝炎表面抗原結(jié)合后，分子量隨之增大，以V0附近高分子量化合物為主。
實(shí)施例2 乙型肝炎治療疫苗配制和稀釋分裝(無(wú)佐劑)根據(jù)乙型肝炎表面抗原和破傷風(fēng)類(lèi)毒素偶聯(lián)物中乙型肝炎表面抗原含量測(cè)定結(jié)果，用緩沖生理鹽水無(wú)菌稀釋分裝，使每劑治療疫苗為；≥0.5ml分裝量、含有乙型肝炎表面抗原2.5～90微克、含有破傷風(fēng)類(lèi)毒素5～60微克、pH 5.5～7.2、硫柳汞30～70微克。
實(shí)施例3乙型肝炎治療疫苗配制和稀釋分裝(含佐劑)根據(jù)乙型肝炎表面抗原和破傷風(fēng)類(lèi)毒素偶聯(lián)物中乙型肝炎表面抗原含量測(cè)定結(jié)果，用氫氧化鋁稀釋液無(wú)菌稀釋分裝，使每劑治療疫苗為；≥0.5ml分裝量、含有乙型肝炎表面抗原2.5～90微克、含有破傷風(fēng)類(lèi)毒素5～60微克、pH 5.5～7.2、硫柳汞30～70微克、氫氧化鋁0.35～0.70毫克。
實(shí)施例4乙型肝炎治療疫苗安全性研究對(duì)乙型肝炎治療疫苗的安全性進(jìn)行考核，分別采用小鼠、豚鼠異常毒性試驗(yàn)法，考核其安全性。
選用豚鼠、腹腔接種5ml乙型肝炎治療疫苗，分別于免前、免后7天稱(chēng)體重，并每日觀察接種反應(yīng)。
選用SPF級(jí)Balb/C小鼠，腹腔接種0.5ml乙型肝炎治療疫苗，分別于免前、免后7天稱(chēng)體重，并每日觀察接種反應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表1、表2。
表1.乙型肝炎治療疫苗豚鼠安全性試驗(yàn)


表2.乙型肝炎治療疫苗小鼠安全性試驗(yàn)

異常毒性試驗(yàn)表明乙型肝炎治療疫苗具有可靠的安全性。
實(shí)施例5乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT誘導(dǎo)動(dòng)物體液免疫的研究—ED50測(cè)定將乙肝表面抗原與破傷風(fēng)類(lèi)毒素偶聯(lián)物，乙肝表面抗原與破傷風(fēng)類(lèi)毒素(TT)混合物，乙肝疫苗與破傷風(fēng)類(lèi)毒素混合物和乙肝疫苗分別稀釋4、16、64、256倍后，腹腔注射BALB/c小鼠，原倍抗原為含10μg HbsAg，每組10只小鼠。免疫后4周時(shí)，采集血清，應(yīng)用RIA試劑檢測(cè)乙肝表面抗體。應(yīng)用Reed-Munch法計(jì)算ED50。由圖1可見(jiàn)乙肝疫苗-TT偶聯(lián)組抗體效力最高(6.68)，顯著高于乙肝疫苗與TT混合組(2.59)，乙肝疫苗與TT混合組(0)和乙肝疫苗組(4)(P＜0.01)。其次為乙肝疫苗與TT混合組和乙肝疫苗組，而乙肝表面抗原與TT混合組免疫小鼠后檢測(cè)不到抗體反應(yīng)。
實(shí)施例6乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT與綠膿桿菌制劑(PA)混合誘導(dǎo)體液免疫的研究將乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT與PA混合后，稀釋4、16、64、256倍后腹腔注射BALB/c小鼠。每組10只，對(duì)照組為表面抗原混合PA組，氫氧化鋁佐劑疫苗組。免疫、采集血清、檢測(cè)乙肝表面抗體和ED50統(tǒng)計(jì)方法同前。
由圖2可見(jiàn)乙肝疫苗-TT偶聯(lián)組和乙肝疫苗-TT偶聯(lián)混合PA組抗體效力顯著高于乙肝疫苗組(19.0；28.9；5.0，P＜0.01)；而乙肝疫苗-TT偶聯(lián)混合PA組誘導(dǎo)抗體反應(yīng)又明顯高于乙肝疫苗-TT偶聯(lián)組，提示混合PA可進(jìn)一步增高乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT的抗體反應(yīng)。
實(shí)施例7乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT與PA混合組誘導(dǎo)體液免疫抗體亞型的研究將乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT組及乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT與PA混合組，稀釋4、16、64、256倍后腹腔注射BALB/c小鼠。每組10只，對(duì)照組為氫氧化鋁佐劑疫苗組。免疫、采集血清等方法同前，應(yīng)用酶聯(lián)免疫方法分別檢測(cè)抗-HBs IgG、IGg2a和IGg1。結(jié)果見(jiàn)圖3。
由圖3可見(jiàn)乙肝治療性疫苗組免疫小鼠誘導(dǎo)IGg2a/IGg1比例(1.1412)顯著高于乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT組(0.421)和乙肝疫苗組(0.235)(P＜0.01)，表明乙肝治療性疫苗可誘導(dǎo)高水平IGg2a，即可誘導(dǎo)較強(qiáng)的TH1細(xì)胞反應(yīng)。
實(shí)施例8乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)破傷風(fēng)類(lèi)毒素(TT)與PA混合組誘導(dǎo)特異性細(xì)胞因子的研究將乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT與PA混合后，背部皮下免疫小鼠，其中HBsAg的含量均為3μg/只，分別按實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每組10只小鼠，共5組。分別于第5日、10日、15日放血處死。按常規(guī)制備脾懸液并經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，用完全培養(yǎng)基(含15％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液)調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106ml-1，，于24孔培養(yǎng)板上每孔加入1000μl該懸液，200μl HBsAg多肽，HBsAg的終濃度為50μg·ml-1，培養(yǎng)板置37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)5天，收集上清。分別用ELISPOT試劑盒檢測(cè)細(xì)胞因子γ-IFN和IL-2。
由圖4，5、6可見(jiàn)，在小鼠免后5、10和20天時(shí)，誘導(dǎo)CTL效應(yīng)細(xì)胞因子γ-IFN或IL-2產(chǎn)生的能力均以乙肝治療性疫苗與PA混合組最高，其次為乙肝治療性疫苗組，均顯著高于疫苗對(duì)照組。
應(yīng)用含1、3和6μg HBsAg的乙肝治療性疫苗與PA混合組、乙肝治療性疫苗組、疫苗對(duì)照組分別免疫小鼠，在免后10天時(shí)處死，應(yīng)用ELISPOT試劑盒檢測(cè)γ-IFN。結(jié)果表明隨免疫HBsAg含量增加，乙肝治療性疫苗組和乙肝治療性疫苗與PA混合組誘導(dǎo)γ-IFN細(xì)胞數(shù)明顯升高，3和6μg HBsAg的乙肝治療性疫苗組及與PA混合組顯著高于1μg組(P＜0.05)；而6μg乙肝治療性疫苗組及與PA混合組與3μg組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
實(shí)施例9HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠打破免疫耐受的研究分別應(yīng)用乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT與PA混合組、乙肝治療性疫苗組、乙肝疫苗對(duì)照組，免疫HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠，其中HbsAg含量均為3ug，免疫3次后1周時(shí)處死，檢測(cè)HBsAg、抗-HBs。
表3治療性乙肝疫苗免疫轉(zhuǎn)基因小鼠后打破免疫耐受的研究

參見(jiàn)表3，結(jié)果表明，乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT組和乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT與PA混合組均能顯著增強(qiáng)打破轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫耐受，而對(duì)照乙肝疫苗組10只小鼠免疫3次后，仍有9只HBsAg陽(yáng)性，提示乙肝治療性疫苗的治療前景。
綜上從誘導(dǎo)體液免疫，抗體亞型；特異性CTL效應(yīng)細(xì)胞因子測(cè)定、轉(zhuǎn)基因小鼠打破免疫耐受的研究等方面證明了乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT(HBsAg+TT)的治療作用；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT與PA混合組(HBsAg+TT+PA)組免疫效果更優(yōu)。
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎治療疫苗，由乙型肝炎表面抗原和一蛋白載體化學(xué)共價(jià)偶聯(lián)而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎治療疫苗，其特征在于，所述的乙型肝炎表面抗原為基因工程乙型肝炎表面抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的乙型肝炎治療疫苗，其特征在于，所述的基因工程乙型肝炎表面抗原來(lái)源包括酵母細(xì)胞和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)表達(dá)系統(tǒng)制備的乙型肝炎表面抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎治療疫苗，其特征在于，所述的蛋白載體是選自破傷風(fēng)類(lèi)毒素、白喉類(lèi)毒素、無(wú)毒性白喉變異株CRM197毒素和B群腦膜炎球菌外膜蛋白群組的任何一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎治療疫苗，其特征在于，所述化學(xué)偶聯(lián)由單個(gè)乙型肝炎表面抗原經(jīng)活化后的多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)結(jié)合多個(gè)破傷風(fēng)類(lèi)毒素實(shí)現(xiàn)的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎治療疫苗，其特征在于，所述的化學(xué)偶聯(lián)由單個(gè)破傷風(fēng)類(lèi)毒素經(jīng)活化后的多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)結(jié)合多個(gè)乙型肝炎表面抗原實(shí)現(xiàn)的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎治療疫苗，其特征在于，所述的乙型肝炎表面抗原的含量在每毫升2.5～90微克之間，蛋白載體含量在5～60微克之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一所述的乙型肝炎治療疫苗，其特征在于，可以用鋁佐劑和/或緩沖生理鹽水配制。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一所述的乙型肝炎治療疫苗，其特征在于，以綠膿桿菌制劑為佐劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的乙型肝炎治療疫苗，其特征在于，所述的綠膿桿菌制劑為綠膿桿菌MSHA菌毛株制劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一所述的乙型肝炎治療疫苗，其特征在于，其制劑包括脂質(zhì)體、毫微顆粒(納米級(jí)顆粒)以及它們的凍干粉形式的制劑。
12.一種制備乙型肝炎治療疫苗的方法，該方法包括(A)將2.5～90微克乙型肝炎表面抗原和5～60微克的蛋白載體偶聯(lián)地一偶聯(lián)物；(B)將乙型肝炎表面抗原和蛋白載體的偶聯(lián)物經(jīng)配制而成一種乙型肝炎治療疫苗。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的乙型肝炎治療疫苗的方法，其特征在于，所述的蛋白載體是選自破傷風(fēng)類(lèi)毒素、白喉類(lèi)毒素、無(wú)毒性白喉變異株CRM197毒素和B群腦膜炎球菌外膜蛋白群組的任何一種。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的乙型肝炎治療疫苗的方法，其特征在于，所述的蛋白載體是選自破傷風(fēng)類(lèi)毒素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種乙型肝炎治療疫苗及其制備方法，包括將乙型肝炎表面抗原和一蛋白載體進(jìn)行偶聯(lián)形成結(jié)合物，該結(jié)合物中的乙型肝炎表面抗原與蛋白載體發(fā)生化學(xué)共價(jià)偶聯(lián)。本發(fā)明可以采用綠膿桿菌制劑為佐劑。本發(fā)明中乙型肝炎面抗原和蛋白載體偶聯(lián)后形成的結(jié)合物可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)乙型肝炎表面抗原較高且特異的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，由此結(jié)合物制備的新型偶聯(lián)治療疫苗可用于臨床上治療乙型肝炎患者和健康人預(yù)防乙型肝炎病毒感染。
文檔編號(hào)A61K47/42GK1618466SQ200310113770
公開(kāi)日2005年5月25日 申請(qǐng)日期2003年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月21日
發(fā)明者薛平, 張國(guó)銘 申請(qǐng)人:薛平, 張國(guó)銘