專利名稱：Hiv－1治療性重組雞痘病毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一株重組雞痘病毒疫苗。
背景技術(shù)：
艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)在全球的迅速蔓延，已成為威脅人類最嚴(yán)重的病毒病之一。據(jù)聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署和WHO估計(jì)，AIDS從80年代初流行至2000年6月為止，全球累計(jì)5300多萬人感染HIV或身患AIDS，其中約1880萬人已經(jīng)死亡。目前我國的HIV-1感染人數(shù)正呈加速上升趨勢，在我國大陸的HIV感染人數(shù)已超過100萬，到2010年可達(dá)1000萬以上。目前HIV感染者的藥物治療費(fèi)用每人每年需要1.2-5.0萬美元，這樣大的費(fèi)用即使在發(fā)達(dá)國家亦難以承受，何況迄今為止尚未見有真正有效的治療藥物。因此，世界各國又一次將目標(biāo)轉(zhuǎn)向?qū)嵱没疉IDS疫苗的開發(fā)。
HIV全病毒滅活后制備的滅活疫苗，由于殘留的HIV核酸可能具有感染性，作為免疫原接種予人，危險(xiǎn)性很大。而在過去開發(fā)的HIV基因工程疫苗大多為亞單位疫苗(gp160、gp120、p24、p55)和多肽疫苗(V3、C4-V3)，但造價(jià)高，抗感染免疫效果不佳。在大腸桿菌、沙門氏菌(表達(dá)env)、結(jié)核桿菌(表達(dá)V3)、酵母等系統(tǒng)表達(dá)的蛋白不能被忠實(shí)地加工，常用于制作診斷制劑而不適于用作疫苗研究。因此人們普遍寄希望于基因工程活載體疫苗和巨分子亞單位疫苗，以期誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫，可寄希望于新型HIV治療性疫苗。
到目前為止，人們已利用多種病毒系統(tǒng)，例如，昆蟲的桿狀病毒(gp160、gp120、p24、p55、gag-V3)、腺病毒、痘苗病毒、金絲雀痘病毒等表達(dá)了HIV的結(jié)構(gòu)基因，以期制備第三代基因工程重組疫苗，其中包括治療和預(yù)防用疫苗。已進(jìn)入I、II、III期臨床試驗(yàn)、且有望成為疫苗的有HIV重組雞痘病毒(表達(dá)env)進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)，HIV重組痘苗病毒(表達(dá)env、env-pol、gag-pol-env)將進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)，HIV重組金絲雀痘病毒(表達(dá)gag-pol-env)將進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)，DNA疫苗(表達(dá)env-rev、gag-pol、gag-pol-rev)將進(jìn)入II、III期臨床試驗(yàn)。
近年來的研究表明，利用痘苗病毒表達(dá)的Env進(jìn)行基礎(chǔ)免疫接種后，再用桿狀病毒表達(dá)的Env蛋白進(jìn)行追加免疫，可誘發(fā)人體較高的中和抗體。Gag蛋白是HIV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一。由于Gag蛋白氨基酸序列相對保守，抗原變異較少，使用Gag蛋白作為AIDS疫苗，有可能克服Env蛋白不能有效抵抗異源變異病毒株攻擊的缺陷。此外，Gag蛋白還有一個(gè)重要特點(diǎn)即自我裝配功能，它能在病毒的其他成分缺失，甚至在自身序列不完整時(shí)，自我裝配成病毒樣粒子，在細(xì)胞膜表面出芽成熟。這對于構(gòu)建巨分子顆?；乖直匾蚨鳪ag蛋白成為疫苗研究的新熱點(diǎn)。目前正在通過對核心蛋白(Gag)、Gag-Pol(聚合酶)、Gag-Env和Gag-Pol-Env的表達(dá)研究，以求制備HIV巨分子顆?；呙绾虷IV巨分子重組活載體疫苗。
在真核載體系統(tǒng)中，雞痘病毒是目前安全性好、具有良好應(yīng)用前景的哺乳動(dòng)物病毒載體，其基因組結(jié)構(gòu)更為龐大，能容納較大的外源基因而不喪失其感染性；被表達(dá)的外源蛋白，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的流產(chǎn)性早期復(fù)制過程中，仍能忠實(shí)地進(jìn)行修飾，如糖基化、羧基化等；外源基因的表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫原性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)時(shí)間較長的細(xì)胞免疫和體液免疫；嚴(yán)格的胞漿內(nèi)復(fù)制，避免了病毒基因重組入宿主細(xì)胞染色體的可能性，消除了重組病毒應(yīng)用對人畜的潛在威脅。同時(shí)，既可提取目的蛋白作為亞單位疫苗，又可直接用重組病毒本身作為重組活載體疫苗。
近幾年來，發(fā)現(xiàn)AIDS、結(jié)核及乙型肝炎等一些慢性疾病的持續(xù)性感染中，應(yīng)用其治療性疫苗后，可有效調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，增強(qiáng)天然免疫力，在控制感染方面發(fā)揮重要作用，從而使得疫苗在治療方面的作用受到人們的廣泛關(guān)注，成為當(dāng)前病毒研究的熱點(diǎn)。雖然治療性疫苗在應(yīng)用上有其局限性，但對某些慢性感染、持續(xù)性感染、周期性復(fù)發(fā)性疾病、腫瘤等的治療，以及作為某些傳染病的輔助治療，控制微生物感染和提高機(jī)體免疫應(yīng)答能力上，還是有著廣闊的發(fā)展前景。治療性疫苗與預(yù)防性疫苗相比，不但在免疫機(jī)理上不同，且各有其特點(diǎn)，前者的接種對象大多是持續(xù)性慢性感染者，或無癥狀的帶毒者，且機(jī)體的免疫應(yīng)答能力低下；后者的接種對象則是廣大的易感的健康群體，免疫應(yīng)答能力正常。另外，二者在組成成分上有所不同，治療性疫苗不像預(yù)防性疫苗那樣僅為保護(hù)性抗原成分，而是根據(jù)需要，對治療性疫苗的成分作各種最佳組合，且十分強(qiáng)調(diào)佐劑的作用。治療性疫苗是用高度純化的微生物抗原及能提高機(jī)體免疫力的其它成分組合而成，所以其免疫原性強(qiáng)，對免疫系統(tǒng)有較強(qiáng)的刺激作用，且可通過不同途徑把微生物抗原提呈給免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)機(jī)體免疫力的產(chǎn)生，并可打破免疫耐受，提高機(jī)體自身對病原微生物的特異性免疫應(yīng)答等。另外，導(dǎo)致這些慢性疾病的病原微生物又多為胞內(nèi)寄生性，免疫物質(zhì)難以發(fā)揮作用，患者的細(xì)胞介導(dǎo)免疫(CMI)又多發(fā)生缺陷，注射疫苗后，則可通過改善機(jī)體的免疫狀態(tài)，刺激恢復(fù)特異性CMI應(yīng)答，達(dá)到根除病原，防止疾病復(fù)發(fā)的目的。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，提供根據(jù)HIV-1抗原表位的構(gòu)象特點(diǎn)，設(shè)計(jì)、構(gòu)建最佳的疫苗抗原構(gòu)象，開發(fā)以HIV-1抗原表位為基礎(chǔ)、以HIV-1結(jié)構(gòu)蛋白P24為載體分子，對抗原進(jìn)行人工分子設(shè)計(jì)并輔以計(jì)算機(jī)模擬的新型基因工程治療性重組雞痘病毒疫苗。
本發(fā)明以HIV-1CNB gag基因?yàn)槟０?，利用PCR方法，獲得HIV衣殼蛋白基因p24，將p24基因插入MEG基因的QYIANSKFIGITEL與AMQMLKETI兩個(gè)表位之間，獲得了以P24核心蛋白為載體分子的全新HIV復(fù)合多表位基因MEGp24。
再將MEGp24嵌合基因插入至雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體pUTA2復(fù)合啟動(dòng)子ATI-P7.5×20下游，構(gòu)建出重組雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體pUTA2-MEGp24。
再將重組雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體pUTA2-MEGp24與雞痘病毒FPV共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞CEF，進(jìn)行同源重組，通過BUdR加壓篩選，獲得重組病毒rFPV-MEGp24。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、本發(fā)明獲得的HIV治療性重組雞痘病毒疫苗基因?yàn)槿斯ぴO(shè)計(jì)，在HIV表達(dá)產(chǎn)物中優(yōu)選高度保守的免疫優(yōu)勢T/B細(xì)胞表位基因，刪除產(chǎn)生免疫抑制及免疫病理的基因序列。
2、本發(fā)明獲得的HIV治療性重組雞痘病毒疫苗可誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生針對所選表位及衣殼蛋白P24的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。
3、本發(fā)明獲得的HIV治療性重組雞痘病毒疫苗對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是安全的，無任何病理現(xiàn)象出現(xiàn)。
4、本發(fā)明獲得的HIV治療性重組雞痘病毒疫苗的基因序列來自HIV-1B亞型中國流行株，該疫苗可作為我國治療兼預(yù)防AIDS的活載體疫苗。
5、本發(fā)明獲得的全新HIV復(fù)合多表位基因MEGp24覆蓋了中國流行株HIV-1env、gag、Nef、pol等主要結(jié)構(gòu)蛋白基因，可用于不同流行株HIV-1的預(yù)防和治療。
6、本發(fā)明重組病毒可表達(dá)中國流行株HIV-1 Env、Gag、Nef、Pol等主要結(jié)構(gòu)蛋白的優(yōu)勢表位肽及P24蛋白，從而誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生針對所選表位及衣殼蛋白P24的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。
具體實(shí)施例方式1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(氯化鈣法)
以無菌接種環(huán)刮取凍存于-70℃冰箱的大腸桿菌菌種，劃線接種于不含氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)16h左右。挑取單一菌落，接種到100ml LB培養(yǎng)基中，37℃、250r/min振搖培養(yǎng)到OD600＝0.4~0.6，在無菌條件下將細(xì)菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到兩個(gè)無菌并以冰預(yù)冷的聚丙烯離心管中(以下操作均需無菌)，冰浴10min，使培養(yǎng)物冷卻到0℃；4℃2000r/min離心10min，棄上清，以10ml冰預(yù)冷的75mmol/L CaCl2、10mmol/L(pH6.5)溶液重懸沉淀，冰浴10min，4℃2000r/min離心10min，棄上清，以2ml冰預(yù)冷的、含15％(v/v)甘油的75mmol/L CaCl2、10mmol/L Tris·Cl(pH6.5)溶液重懸每管沉淀，用無菌吸頭將感受態(tài)細(xì)胞分裝于無菌微量離心管中，每管200μl；標(biāo)明菌株、體積和日期，置-70℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?br> 2轉(zhuǎn)化將適量質(zhì)粒DNA(質(zhì)粒體積＜1μl，連接產(chǎn)物＜10μl，DNA＜50ng)加入200μl感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃水浴熱沖擊90s，冰浴冷卻2min；加入200μl 37℃預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，37℃150r/min振搖培養(yǎng)50min；取培養(yǎng)液涂布于含Amp(50μg/ml)的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)14~16h后，出現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌落。
3質(zhì)粒的提取3.1質(zhì)粒的小量制備(堿裂解法)挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化菌落，接種到2ml含50μg/ml Amp的LB培養(yǎng)液(下同)中，37℃250r/min振搖培養(yǎng)12~16h；將1.5ml轉(zhuǎn)入微量離心管中，12000r/min離心30s，棄上清。以200μl冰預(yù)冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris·Cl，pH8.0；10mmol/L EDTA，pH8.0)重懸沉淀，加入200μl新配制的溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，顛倒數(shù)次混勻，加入200μl用冰預(yù)冷的溶液III(3mol KAc，5mol/L冰乙酸)，顛倒混勻，4℃12000r/min離心10min，取上清，分別用等量飽和酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，氯仿/異戊醇(24∶1)各抽提一次；加2倍體積冷無水乙醇，混合均勻，置-20℃30min，4℃12000r/min離心10min，棄上清，沉淀用70％冷乙醇洗滌抽干。以20μl含終濃度20μg/ml RNA酶(無DNA酶)的TE(10mmol/L Tris·HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA，pH8.0，下同)溶解沉淀，并于37℃水浴中作用30min，瓊脂糖凝膠電泳檢查或-20℃保存。
3.2質(zhì)粒的大量制備與純化將含有目的質(zhì)粒的細(xì)菌接種于100ml LB培養(yǎng)液中，37℃250r/min振搖培養(yǎng)16~18h；冰浴10min，4℃4000r/min離心10min，棄上清，沉淀用20ml預(yù)冷的STE(10mmol/L Tris·Cl，pH8.0；50mmol/LEDTA，pH8.0)洗滌一次，4000r/min離心10min，棄上清；用4ml預(yù)冷的溶液I重懸沉淀，加8ml新配的溶液II充分混勻，冰浴10min后，加6ml預(yù)冷的溶液III中止反應(yīng)，冰浴10min，4℃7000r/min離心15min，取上清加0.6~0.7倍體積的異丙醇，37℃作用30min；4℃，7000r/min離心15min，棄上清，以適量TE(pH8.0)溶解沉淀后，加等體積的氯化鋰(5mol/L)充分混勻，8000r/min離心10min；取上清，加2倍體積100％冷乙醇，-20℃30min，4℃12000r/min離心10min；棄上清，沉淀用70％冷乙醇洗滌并抽干。以適量TE(pH8.0)溶解沉淀，加無DNA酶的RNA酶(10mg/ml)至終濃度20μg/ml，37℃水浴30min；加等體積13％聚乙二醇溶液(PEG8000，2.5mol/L NaCl)，4℃靜置過夜；4℃12000r/min離心l0min，棄上清；加400μl TE(pH8.0)溶解沉淀，用等體積酚、酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)、氯仿/異戊醇(24∶1)各抽提一次，加0.1倍體積3MNaAC(pH5.2)，2倍體積100％冷乙醇，混勻后-20℃30min以上，4℃12000r/min離心10min，棄上清，沉淀用70％冷乙醇洗滌并抽干，溶于適量TE(pH8.0)中，-20℃保存。
3.3質(zhì)粒DNA的定量以TE(pH8.0)為空白對照，用TZK-800Z型紫外可見分光光度計(jì)測定波長260nm和280nm下的核酸溶液光密度(OD)值。OD260＝1相當(dāng)于含質(zhì)粒大約50μg/ml，雙鏈DNA純品的OD260/OD280值為1.8，如樣品OD260/OD280值明顯低于1.8，則可能有蛋白質(zhì)或酚污染，需進(jìn)一步純化。
4瓊脂糖凝膠電泳用0.5×TBE電泳緩沖液(0.045mol/L Tris-硼酸，0.001mol/LEDTA)配0.8-1.2％(w/v)瓊脂糖凝膠溶液，加熱至瓊脂糖完全溶解后，加EB(10mg/ml)至終濃度0.5μg/ml；混勻倒入封固好的膠模中，插入相應(yīng)的梳子，梳子距底板1.0mm左右，待凝膠完全凝固，小心移去梳子，將凝膠放入裝有0.5×TBE電泳緩沖液的電泳槽中，取適量DNA樣品在封口膜上與適量體積加樣緩沖液(0.25％溴酚藍(lán)、0.25％二甲苯青FF、40％蔗糖)混勻，用微量加樣器將樣品加到梳孔中，以5v/cm的電壓電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)電泳至適當(dāng)位置，在長波紫外燈下觀察結(jié)果和拍照。
5 DNA操作5.1限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)單酶切反應(yīng)將1.0μg質(zhì)粒DNA與適量水混勻，使其總體積為18μl，加入2-3單位限制性內(nèi)切酶及1μl相應(yīng)的10×限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，輕彈管壁混勻并離心，置最適反應(yīng)溫度水浴2~3h，瓊脂糖凝膠電泳檢查。對大量質(zhì)粒DNA的酶切反應(yīng)，相應(yīng)擴(kuò)大限制性內(nèi)切酶用量和反應(yīng)體積，取少量反應(yīng)液電泳檢查，完全酶切后，-20℃保存，以備進(jìn)一步鑒定或回收片段之用。
雙酶切反應(yīng)選擇反應(yīng)活性等于或接近100％的同一緩沖系統(tǒng)進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，若溫度或緩沖系統(tǒng)不同，則按先低溫后高溫，先低鹽后高鹽的順序進(jìn)行；或第一酶切完成后，酚/仿抽提，乙醇沉淀后，再進(jìn)行第二酶切反應(yīng)。
5.2 DNA片段的回收將酶切完全的、含目的DNA片段的溶液與上樣緩沖液混合，加入適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠板中電泳至目的DNA片段完全分離。電泳結(jié)束后用潔凈的刀片在長波紫外燈下切下含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠，放入一1.5ml的微量離心管中。選用北京鼎國生物公司生產(chǎn)的從凝膠中回收DNA試劑盒回收DNA片段。
將切取的含DNA片段的凝膠(100-300mg)搗碎，按重量比1∶3(DNA片段∶溶液B)加入溶液B；50℃水浴10min，直至膠完全溶化，其間漩渦振蕩三次，瓊脂糖必須完全溶化。如果體積大于500μl，可適當(dāng)增加溶膠時(shí)間，若此時(shí)溶液變紅，可加15μl NaAc；將溶液置于離心柱中，靜止1-2min，大于8,000rpm，離心30～60s。若一次加不完，可分兩次離心；倒掉液體，加入500μl溶液C(用時(shí)乙醇1∶1稀釋)于離心柱中，大于8,000rpm，離心30～60s，倒掉液體；用溶液C(用時(shí)乙醇1∶1稀釋)500μl再洗一遍，大于8,000rpm離心30～60s；15,000rpm再次離心30～60s，摔干剩余液體；將離心柱置于新的離心管中，加入50℃預(yù)熱的溶液D 30~50μl，混勻，靜止2min，15,000rpm離心60s。管底即DNA；將DNA貯存于-20℃。
5.3外源DNA片段與質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)粘端連接取0.5μg回收的載體DNA，加3~5倍摩爾量的外源DNA片段，2μl 5×連接緩沖液加水定容至10μl，最后加入1Weiss單位T4DNA連接酶，混勻并離心，16℃連接1~4h，取7μl連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞。
平端連接取0.1μg平末端去磷后的載體DNA，加5~8倍量的平端目的DNA片段，3μl 5×連接緩沖液，加水定容至15μl混勻后，加入1Weiss單位T4 DNA連接酶，混勻離心，15℃連接4~18h。取5μl連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞。
5.4重組子的酶切篩選和鑒定將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，37℃培養(yǎng)過夜。取單菌落接種于2ml AmpLB培養(yǎng)液中，小量制備質(zhì)粒DNA。選擇1~2種合適的限制性內(nèi)切酶單獨(dú)或組合消化，瓊脂糖凝膠電泳分析。挑選酶切結(jié)果與預(yù)計(jì)相同者進(jìn)一步用2種以上的內(nèi)切酶消化，所有酶切結(jié)果均與預(yù)計(jì)完全相同者，即為目的重組質(zhì)粒。
6雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建6.1PCR擴(kuò)增HIV-1 p24基因利用DNAStar軟件設(shè)計(jì)出上游引物F5’CGG GAT CCA TGT ACC CTA TAG TGC AAA ACC TCCAG 3’下游引物R5’GCT CTA GAT TCA GCC AAA ATT CTT GCT TTA TG3’分別引入BamH I、Xba I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，以pKS-gag(HIV-1)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為pKS-Gag，1l；引物F(20pmol/l)，0.5l；引物R(20pmol/l)，0.5l；premix EXtaq，25l；H2O，23l。PCR反應(yīng)條件為94℃ 60秒、55℃ 30秒、72℃ 45秒，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。
將PCR反應(yīng)產(chǎn)物克隆至pGEM-T載體中，篩選陽性重組子(pGEM-T-p24)，提取質(zhì)粒，使用T7做為測序引物對陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測定。
6.2嵌合基因(MEGp24)的構(gòu)建將序列測定正確的pGEM-T-p24陽性重組質(zhì)粒用BamHI/XbaI雙酶切下，與用相同雙酶切的pKS-MEG(BamHI/XbaI)連接，利用6.1中的F/R引物對，進(jìn)行陽性重組子的篩選和鑒定，并進(jìn)一步用Xba I及Xho I雙酶切鑒定。將陽性重組子命名為pKS-MEGp24。
6.3雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體pUTA2-MEGp24的構(gòu)建將嵌合基因MEGp24用EcoRI和NotI從中間載體pKS-MEGp24上切下，以Klenow大片段補(bǔ)平；用Sma I酶切雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體pUTA2，并去磷酸化；將已補(bǔ)平的MEGp24基因與已去磷酸化的pUTA2載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，酶切鑒定正反向。挑選正向連接的陽性克隆作為雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體，并命名為pUTA2-MEGp24。
7同源重組及重組病毒的加壓篩選7.1 FPV毒價(jià)測定用于同源重組的FPV經(jīng)細(xì)胞傳代復(fù)壯，計(jì)算蝕斑形成單位(PFU)，并用HE染色，鑒定病毒。將FPV按102~106稀釋倍數(shù)接種于傳代生長的6×30mm培養(yǎng)板CEF單層，補(bǔ)加含1％甲基纖維素和1％小牛血清(FCS)的MEM作為維持液，37℃，5％CO2培養(yǎng)120h后，棄培養(yǎng)液，PBS(pH7.2)洗2次，室溫下1％甲醛固定15min，自來水洗滌，0.1％結(jié)晶紫染色5min，自來水洗滌，統(tǒng)計(jì)病毒蝕斑數(shù)，并計(jì)算出每毫升病毒液中所含的蝕斑形成單位(Plaque forming units，PFU)。
PFU＝(病毒蝕斑數(shù)×稀釋倍數(shù))/染毒體積(ml)7.2體內(nèi)同源重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞采用脂質(zhì)體法于6×30mm培養(yǎng)板中接種傳代的CEF 1×105~3×105個(gè)/ml，當(dāng)細(xì)胞長至80％融合時(shí)，感染0.1MOI(Multiplicity of infection)的FPV，37℃ 5％CO2吸附2h后，與在室溫下作用15~30min的轉(zhuǎn)染試劑DOTAP和重組質(zhì)粒的混合物共轉(zhuǎn)染。即在500μl MEM中，加入15μl DOTAP Liposomal，輕輕混勻，另取500μl MEM加入重組質(zhì)粒DNA 10μg混勻。然后將后者滴加于前一液體中輕輕混勻，溫室下作用15~30min。轉(zhuǎn)染后12~18h，更換新鮮配制的含2％FCS的MEM，繼續(xù)培養(yǎng)48~72h，收獲病毒。
7.3重組病毒的BUdR加壓篩選在6×30mm培養(yǎng)板上制備CEF單層。接毒前24小時(shí)用含40μg/mlBUdR(5-溴脫氧核糖尿苷)的MEM營養(yǎng)液培養(yǎng)，然后按10MOI接種重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后收獲的病毒，5％CO2吸附2h后，再用含40μg/ml BUdR的MEM營養(yǎng)液培養(yǎng)120h，收獲細(xì)胞。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，然后將收獲細(xì)胞反復(fù)凍融三次，在無BUdR的營養(yǎng)液中培養(yǎng)，待細(xì)胞出現(xiàn)病變后，分別挑出單個(gè)病毒蝕斑，純化3次后，分別進(jìn)行擴(kuò)毒。用無BudR的MEM營養(yǎng)液培養(yǎng)，待出現(xiàn)細(xì)胞病變后挑出單個(gè)病毒蝕斑，并分別進(jìn)行擴(kuò)毒，按下述四種方法鑒定重組病毒。
8重組病毒的基因組PCR與RT-PCR鑒定8.1基因組PCR鑒定取20μl細(xì)胞培養(yǎng)物(凍融3次)加入到25μl蛋白酶K溶液(0.25％SDS，5mM EDTA，10mM Tris-HCl pH8.0)中，56℃反應(yīng)2h，置95℃作用10min滅活蛋白酶K。加入1×PCR緩沖液使總體積為450μl，PCR時(shí)取5～25μl即可。
上游引物FP5’GAG CCT GTT TCT GTT GTT GC 3’下游引物RP5’AGC TGC GGA TCT GTC TCT G 3’PCR反應(yīng)條件94℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。瓊脂糖電泳觀察目的條帶擴(kuò)增情況?；蚪M中擴(kuò)增出1174bp片段的候選毒株為重組病毒，野毒FPV的基因組中不能擴(kuò)增出該條帶。
8.2 RT-PCR鑒定將加壓篩選后的單個(gè)蝕斑在CEF上2次擴(kuò)增，至細(xì)胞出現(xiàn)病變達(dá)80-90％時(shí)，收獲細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)Oligo dT，1μl；總RNA，8μl；H2O，補(bǔ)至15μl。將上述反應(yīng)體系置于70℃，持續(xù)5min后，迅速放入冰浴中，加入M-MLV，1μl；酶抑制劑，1μl；5×buffer，6μl；dNTP，1.5μl；H2O，補(bǔ)至30μl。將該體系置于42℃反應(yīng)1h，然后置于95℃，作用5min；迅速冰浴后利用特異性引物對FP/RP對cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，體系及條件同上?？俁NA中擴(kuò)增出1174bp片段的候選毒株為重組病毒，野毒FPV的總RNA中不能擴(kuò)增出該條帶。
9重組病毒表達(dá)產(chǎn)物的檢測9.1間接免疫熒光法(IFA)鑒定重組病毒取適量初步篩選并純化的重組病毒，接種于飛片上CEF單層細(xì)胞，同時(shí)設(shè)FPV和細(xì)胞對照。37℃5％CO2感作2h，加入含1％FCS及0.5g甲基纖維素的MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)到細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后，取出飛片，PBS(pH7.2)洗一次，100％丙酮固定10~15min，PBS沖洗。在用3％牛血清白蛋白緩沖液(10mmol/L Tris·Cl，pH7.5，150mmol/L NaCl，0.05％Tween20)溶液封閉2h后，與中國人HIV-1陽性血清(1∶300)或鼠抗人P24單抗(1∶50)反應(yīng)2h，PBS洗滌3次，然后與異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗人IgG或羊抗鼠IgG反應(yīng)2h，PBS洗滌3~5次，載玻片上加一滴甘油緩沖液(50％甘油PBS)，將載有細(xì)胞的飛片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察和拍照。
IFA檢測顯示，感染重組病毒的CEF細(xì)胞在核周圍及細(xì)胞漿中出現(xiàn)與特異性熒光抗體發(fā)生反應(yīng)的黃綠色熒光，而對照組FPV感染細(xì)胞則看不到黃綠色熒光，為伊維斯藍(lán)染成紅色熒光。結(jié)果說明，重組病毒表達(dá)了MEGP24蛋白。
9.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將擴(kuò)增后的純化重組病毒，以10MOI分別接種于10ml培養(yǎng)瓶1×106個(gè)/ml CEF細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)FPV對照和細(xì)胞對照，至細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)，棄培養(yǎng)液，用1ml 37℃預(yù)熱的TEN(40mmol/L Tris·ClpH7.5，1mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl)洗脫細(xì)胞，收集于Eppendorf管中，3000r/min離心5min，棄上清，細(xì)胞沉淀用PBS洗一次，加60μl裂解緩沖液(10mmol/L Tris·Cl，pH7.4，1mmol/L MgCl2，0.5％NP40，20μg/ml DNaseI)裂解，冰浴30min，煮沸3min，5000r/min離心5min，-20℃凍存。
取30μl細(xì)胞裂解液與等量2×樣品緩沖液(100mmol/L Tris·Cl，pH6.8，4％SDS，0.2％溴酚藍(lán)，20％甘油，使用前加入2.5％β-巰基乙醇)混勻，于10％凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。
9.3免疫印跡(Western blot)經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白后，將其電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5％脫脂乳或3％牛血清白蛋白緩沖液(10mmol/L Tris·Cl，pH7.5，150mmol/LNaCl，0.05％Tween20)37℃封閉2h，洗滌緩沖液(10mmol/L Tris·ClpH7.5，150mmol/L NaCl，0.05％Tween20)洗滌3次，每次5~10min，將中國人HIV-1陽性血清或鼠抗人P24單抗用封閉緩沖液稀釋后覆蓋膜上，室溫感作2h，洗滌3~5次，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgG(1∶1000)室溫感作2h，洗滌3~5次后，每次5~10min，用10ml堿性磷酸酶緩沖液(100mmol/L NaCl，5mmol/L MgCl2，100mmol/L Tris·Cl pH9.5)加入66μl NBT(0.5g NBT，70％二甲基甲酰胺)，混勻后再加33μlBCIP(0.5g BCIP，100％二甲基甲酰胺)，顯色10~20min，用蒸餾水中止反應(yīng)。
結(jié)果證實(shí)，表達(dá)產(chǎn)物可以與中國人HIV-1陽性血清及鼠抗P24單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，證明重組雞痘病毒成功表達(dá)了MEGp24蛋白。
將以上4種方法檢測均為陽性的重組病毒候選株命名為rFPV-MEGp24，即HIV-1治療性重組雞痘病毒疫苗。
10重組病毒表達(dá)外源蛋白的穩(wěn)定性將獲得的重組病毒rFPV-MEGp24在CEF細(xì)胞連續(xù)傳10代，分別用第4、6、8和10代重組病毒以10MOI的量接種同等量的CEF細(xì)胞，對收獲的細(xì)胞總蛋白作SDS-PAGE和Western blot分析，檢測目的蛋白的相對表達(dá)量。
11 HIV-1治療性重組雞痘病毒疫苗的實(shí)驗(yàn)免疫研究11.1重組雞痘病毒疫苗免疫小鼠BALB/c雌性小鼠16只，體重18~20g，6～8周齡，SPF(III)級動(dòng)物。隨機(jī)分2組，分別于雙側(cè)脛前肌注射野毒FPV和重組毒rFPV-MEGp24，毒量為107PFU/只，容量為100μl。共免疫3次，第1次與第2次的時(shí)間間隔為14天，第2次與第3次的時(shí)間間隔為28天。最后一次免疫后第7天摘眼球取血，頸椎脫臼處死，凝血分離血清供ELISA檢測抗HIV抗原的IgG抗體。無菌取其脾臟分別檢測細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性，并用流式細(xì)胞儀分析T淋巴細(xì)胞亞類的數(shù)量。
11.2脾臟免疫學(xué)指標(biāo)的檢測11.2.1脾臟單淋巴細(xì)胞懸液制備斷頭處死小鼠，無菌條件下取出脾臟，置于盛有RPMI 1640培養(yǎng)基的平皿中，用玻片研磨，300目尼龍網(wǎng)過濾制成單細(xì)胞懸液，1500r/min，離心5min，棄上清。用Hanks液離心洗細(xì)胞兩次，重懸于含10％NBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)，調(diào)至2×107個(gè)/ml備用。
11.2.2脾T淋巴細(xì)胞亞類數(shù)量的檢測取脾細(xì)胞懸液0.1ml，加5ml PBS，1500r/min，離心10min，洗細(xì)胞兩次，在0.5ml PBS細(xì)胞懸浮液中分別加熒光標(biāo)記大鼠抗小鼠CD3+、CD4+和CD8+單克隆抗體(此抗體用PBS按1∶10稀釋)室溫避光放置30min，再加5ml PBS洗一次，1500r/min離心10min，將管底細(xì)胞用200μl PBS懸浮，待上流式細(xì)胞儀檢測。FACS檢測10000個(gè)細(xì)胞，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
結(jié)果表明，重組毒免疫組小鼠CD3+/CD4+與CD3+/CD8+的比值顯著高于FPV對照組，提示重組病毒免疫小鼠后，均表達(dá)了外源蛋白，并誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生良好的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
11.2.3脾細(xì)胞特異性CTL細(xì)胞毒活性檢測靶細(xì)胞的制備將H-2d限制性HIV識別表位多肽RGPGRAFVTI、AMQMLKETI、DRVIEVVQGAYRAIR及不相關(guān)對照肽AGCKNFFWKTFTSC與P815細(xì)胞在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱共孵育2h，制備成相應(yīng)肽標(biāo)記的靶細(xì)胞。
特異性CTL細(xì)胞毒活性檢測將RGPGRAFVTI、AMQMLKETI、DRVIEVVQGAYRAIR及不相關(guān)對照肽AGCKNFFWKTFTSC作為體外刺激原，與小鼠的脾細(xì)胞于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱共孵育2h，加入絲裂霉素C至終濃度為40mg/L，培養(yǎng)2h后用PBS洗滌細(xì)胞4次，以除掉絲裂霉素，即為相應(yīng)肽標(biāo)記的刺激細(xì)胞。將免疫小鼠的脾細(xì)胞懸液調(diào)整至5×107個(gè)/ml。靶細(xì)胞和刺激細(xì)胞各1ml加入60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，補(bǔ)加2mlRPMI1640，培養(yǎng)24h后加入IL2至終濃度50U/ml，繼續(xù)培養(yǎng)5天。2000r/min離心5min。沉淀以RPMI 1640懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度至107個(gè)/ml，即作為效應(yīng)細(xì)胞。以乳酸脫氫酶釋放法檢測CTL反應(yīng)。96微孔板上劃分好樣品、自然釋放及最大釋放孔，效靶細(xì)胞比例(E/T)為12.5∶1、25∶1、50∶1，每孔補(bǔ)加RPMI 1640至200l，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，效靶細(xì)胞于37℃5％CO2共同孵育4h，取上清501，加入LDH作用底物50l，室溫、閉光反應(yīng)30min后加50l終止液終止反應(yīng)，490nm下測吸光度，計(jì)算公式如下 結(jié)果表明，重組病毒rFPV-MEGp24免疫組產(chǎn)生了針對所選表位RGPGRAFVTI、AMQMLKETI和DRVIEVVQGAYRAIR的強(qiáng)CTL反應(yīng)，與FPV對照組及不相關(guān)對照肽AGCKNFFWKTFTSC組相比，差異顯著(P＜0.01)，提示重組病毒能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生HIV特異性細(xì)胞殺傷反應(yīng)。
11.3ELISA試劑盒測定免疫小鼠血清中抗HIV抗體ELISA試劑盒中的包被抗原為基因工程表達(dá)的HIV外膜及核心抗原，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體。在酶聯(lián)免疫儀450nm測量各孔OD值，將酶標(biāo)儀測得的OD450值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
結(jié)果表明，重組病毒rFPV-MEGp24免疫組HIV特異性抗體的水平明顯高于FPV對照組(P＜0.01)，表明重組病毒誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生HIV特異性體液免疫應(yīng)答。
權(quán)利要求
1.一種HIV-1治療性重組雞痘病毒疫苗，其特征在于以HIV-1CNB gag基因?yàn)槟０?，利用PCR方法，獲得HIV衣殼蛋白基因p24，將p24基因插入MEG基因的QYIANSKFIGITEL與AMQMLKETI兩個(gè)表位之間，獲得了以P24核心蛋白為載體分子的全新HIV復(fù)合多表位基因MEGp24。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HIV-1治療性重組雞痘病毒疫苗，其特征在于將MEGp24嵌合基因插入至雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體pUTA2復(fù)合啟動(dòng)子ATI-P7.5×20下游，構(gòu)建出重組雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體pUTA2-MEGp24。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的HIV-1治療性重組雞痘病毒疫苗，其特征在于將重組雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體pUTA2-MEGp24與雞痘病毒FPV共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞CEF，進(jìn)行同源重組，通過BUdR加壓篩選，獲得重組病毒rFPV-MEGp24。
全文摘要
一種HIV－1治療性重組雞痘病毒疫苗，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的目的在于，提供根據(jù)HIV－1抗原表位的構(gòu)象特點(diǎn)，設(shè)計(jì)、構(gòu)建最佳的疫苗抗原構(gòu)象，開發(fā)以HIV－1抗原表位為基礎(chǔ)、以HIV－1結(jié)構(gòu)蛋白P24為載體分子，對抗原進(jìn)行人工分子設(shè)計(jì)并輔以計(jì)算機(jī)模擬的新型基因工程治療性重組雞痘病毒疫苗。本發(fā)明重組病毒可表達(dá)中國流行株HIV－1Env、Gag、Nef、Pol等主要結(jié)構(gòu)蛋白的優(yōu)勢表位肽及P24蛋白，從而誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生針對所選表位及衣殼蛋白P24的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是安全的，無任何病理現(xiàn)象出現(xiàn)。
文檔編號A61P31/22GK1672733SQ20041001075
公開日2005年9月28日 申請日期2004年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月26日
發(fā)明者金寧一, 張立樹, 李子健, 江文正, 宋英今, 王宏, 金洪濤, 馬鶴雯 申請人:中國人民解放軍軍需大學(xué)軍事獸醫(yī)研究所