專利名稱：新的人胚胎肝源性因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有促肝細(xì)胞增殖活性的細(xì)胞生長因子，特別是涉及衍生于人胚胎肝組織的新的人胚胎肝源性因子，其分離和純化方法，以及所說的因子在維持胎肝細(xì)胞擴增和傳代培養(yǎng)、促進(jìn)肝細(xì)胞再生和治療損傷相關(guān)疾病以及構(gòu)建人工肝臟中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
從受精開始，胚胎的發(fā)育始終是細(xì)胞內(nèi)合成活性物質(zhì)的直接或間接結(jié)果。胚胎發(fā)育最重要的一個方面就是調(diào)節(jié)這些特殊的蛋白質(zhì)和其他大分子物質(zhì)的合成。尋找到這些特殊的發(fā)育信號，對它們進(jìn)行組織定位，確定它們出現(xiàn)的時間，對深入了解胚胎的發(fā)育與組織再生都有著非常重要的意義。在胚胎發(fā)育過程中，最重要的不是個別基因的表達(dá)，而是這些表達(dá)產(chǎn)物、即各種蛋白質(zhì)在時間和空間上的聯(lián)系與配合。
胚胎從一個細(xì)胞(受精卵)發(fā)育為(5～7)×1012個細(xì)胞構(gòu)成的足月胎兒，是一個極其復(fù)雜的動態(tài)變化的過程。在這個過程中，各臟器并非是從開始即呈現(xiàn)出該器官成熟狀態(tài)下的典型結(jié)構(gòu)與功能，它們經(jīng)歷從細(xì)胞到組織到成體結(jié)構(gòu)器官這樣一個從量變到質(zhì)變的發(fā)育過程。
肝臟作為人體的一個重要器官，其發(fā)育過程是一個多階段的連續(xù)的復(fù)雜變化過程，并且受到激素、生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)等多種因子的調(diào)節(jié)和控制。目前已知有多種因子與肝臟的形成及損傷修復(fù)過程密切相關(guān)。這些因子可以出現(xiàn)在組織發(fā)生發(fā)育的不同階段，或促進(jìn)細(xì)胞增殖，或促進(jìn)細(xì)胞分化或誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，從而對肝組織的生理和病理性再生發(fā)揮嚴(yán)格的調(diào)控作用。
研究結(jié)果表明，人們多年來所尋找的促進(jìn)肝組織再生的活性物質(zhì)并不只是最初所預(yù)料的單一物質(zhì)，而是多種因子的集合體，這些因子通過不同的作用方式或途徑，在肝組織發(fā)生和再生的不同階段發(fā)揮各自的作用(Imai K et al.，Hepatol.Res.27(4)302-308，2003；Kusaka K etal，J.Physiol.248273-284，1975)。目前已知的參與肝細(xì)胞增殖分化過程的物質(zhì)包括肝細(xì)胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)、腫瘤壞死因子(TNF)、白介素6(IL-6)，以及胰島素、地塞米松、制瘤素M(OSM)和去甲腎上腺素等，這些物質(zhì)通過內(nèi)分泌、自分泌或旁分泌途徑調(diào)節(jié)并控制肝細(xì)胞的增殖與分化(Richman，R.A.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1976，733589-3593；Kang YH，et al.Exp Cell Res.2004；293(2)239-47；George K.et al.，1997，276(5309)60)。
雖然目前對發(fā)育完善的成熟肝組織細(xì)胞的增殖與分化過程及相關(guān)調(diào)控因子已有了比較深入的了解，但人們對胚胎肝臟特別是發(fā)育早期肝臟功能和結(jié)構(gòu)以及肝細(xì)胞增殖與分化過程和相關(guān)調(diào)控因子的卻知之甚少。
因此，深入了解胚胎發(fā)育期間肝細(xì)胞群落形成的影響因素以及這些因素對肝細(xì)胞自身和其他細(xì)胞、組織和器官發(fā)育的作用將是十分必要的。特別是，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)并深入研究影響肝細(xì)胞生長和分化的可能因子，必將有利于認(rèn)識肝組織和器官形成、發(fā)育的調(diào)控機理，同時也可能為肝細(xì)胞損傷相關(guān)疾病的治療提供新的治療劑。
發(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是提供一種新的人胚胎肝源性因子(hELF)，特征在于所說的因子在聚丙烯酰胺凝膠電泳中測得的表觀分子量為大約30KD，具有極好的耐熱和耐酸堿能力和極好的促進(jìn)肝細(xì)胞及其他組織來源細(xì)胞的體外增殖和分化活性。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的耐熱和耐酸堿能力是指于60℃放置2小時或于100℃加熱15分鐘，或于pH 1.0至pH 12.0條件下處理，該因子均不喪失其生物學(xué)活性。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的肝細(xì)胞是指人肝細(xì)胞和肝腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種分離和純化如上限定的人胚胎肝源性因子的方法，該方法包括分離6-12周齡人胚胎肝組織勻漿的上清；經(jīng)用丙酮分級沉淀后收集沉淀物并超濾；收集分子量大于10,000的蛋白質(zhì)，使用陰離子交換柱進(jìn)行反復(fù)(兩次)柱層析純化后，得到所需的人胚胎肝源性因子。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，其中用于分級沉淀的丙酮濃度分別為45％和65％(V/V)。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，其中超濾所用透析膜的截留分子量為10,000道而頓。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，其中陰離子交換層析柱是Mono S。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，其中所得到的胚胎肝衍生的細(xì)胞生長因子的純度大于95％。
本發(fā)明的再一個目的是提供如上限定的人胚胎肝源性因子在構(gòu)建正常人胚胎肝細(xì)胞系和人工肝臟中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一個目的是提供如上限定的人胚胎肝源性因子在治療肝細(xì)胞損傷性疾病中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一個目的是提供如上限定的人胚胎肝源性因子在促進(jìn)人胚胎肝細(xì)胞增殖和人胚胎肝細(xì)胞傳代培養(yǎng)中的應(yīng)用。
附圖簡要說明

圖1顯示第一次離子交換層析的洗脫曲線。整個洗脫過程中出現(xiàn)兩個主峰(第5-18ml)，并確定促細(xì)胞增殖活性出現(xiàn)在洗脫的第2峰(第16-17ml)。
圖2顯示第二次離子交換層析的洗脫曲線。整個洗脫過程中出現(xiàn)兩個主峰(第13-24管)，并確定第一峰為活性峰(第15和16ml)。
圖3顯示本發(fā)明純化產(chǎn)物的十二烷基磺酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜。其中泳道1為分子量標(biāo)準(zhǔn)品，泳道2為第一次層析后收集的活性部分，泳道3為第二次層析后收集的活性部分。
圖4顯示在hELF作用下HepG2細(xì)胞增殖的經(jīng)時變化。
圖5顯示本發(fā)明的hELF對肝腫瘤細(xì)胞系增殖的影響。肝腫瘤細(xì)胞系HepG2在含有2％NBCS的DMEM培養(yǎng)基中平面培養(yǎng)5天。其中圖5a顯示未加hELF的對照組HepG2細(xì)胞的生長狀態(tài)(100×)可見細(xì)胞增殖緩慢，多單個存在，細(xì)胞克隆形成率低，克隆體積小。圖5b顯示培養(yǎng)基中添加hELF的實驗組HepG2細(xì)胞的生長狀態(tài)(100×)，可見細(xì)胞增殖旺盛，克隆形成率高且克隆體積較大，部分克隆發(fā)生匯合。圖5c和5d分別為對照組和實驗組HepG2細(xì)胞的高倍(200×)顯微鏡檢照片(參見實施例2)。
圖6顯示本發(fā)明的hELF對人胚胎肝細(xì)胞系增殖的影響。人胚胎肝細(xì)胞在含有2％NBCS的DMEM培養(yǎng)基中平面培養(yǎng)12天。其中圖6a顯示培養(yǎng)基中未加hELF的對照組人胚胎肝細(xì)胞的生長狀態(tài)可見細(xì)胞多為成纖維細(xì)胞樣增殖，失去肝細(xì)胞的典型形態(tài)，并且發(fā)生了細(xì)胞融合(100×)。圖6b顯示培養(yǎng)基中添加hELF的實驗組人胚胎肝細(xì)胞的生長狀態(tài)可見細(xì)胞仍維持肝細(xì)胞的典型形態(tài)，并有大的肝細(xì)胞克隆形成(100×)。
圖7顯示本發(fā)明的hELF對培養(yǎng)的Hela細(xì)胞增殖的影響。Hela細(xì)胞在含有0.3％NBCS的DMEM培養(yǎng)基中平面培養(yǎng)3天。其中圖7a顯示培養(yǎng)基中未加hELF的對照組Hela細(xì)胞(0.3％NBCS)的正常形態(tài)和生長狀態(tài)(200×)。圖7b顯示培養(yǎng)基中加hELF的實驗組Hela細(xì)胞的旺盛生長和增殖狀態(tài)(200×)。
發(fā)明的具體內(nèi)容本發(fā)明涉及具有肝細(xì)胞增殖活性的細(xì)胞生長因子，特別是涉及衍生于人胚胎肝組織的新的人胚胎肝源性因子(hELF)，其分離和純化方法，以及所說的因子在促進(jìn)肝細(xì)胞再生和治療損傷相關(guān)疾病，以及構(gòu)建正常人胚胎肝細(xì)胞系和人工肝臟中的應(yīng)用。
一般說來，肝臟在胚胎第12周才由前體細(xì)胞發(fā)育為分化良好的器官，此時它并不具備成熟肝臟的功能。肝臟在胚胎發(fā)育20周之后構(gòu)建其自身的結(jié)構(gòu)，并在此時才開始逐漸發(fā)育出成熟肝臟的復(fù)雜的代謝功能。成年人的肝臟具有血漿蛋白的合成、脂肪生成、解毒功能、尿素合成等許多的代謝功能。然而，目前人們對胚胎發(fā)育早期肝臟的功能和結(jié)構(gòu)以及發(fā)生和發(fā)育卻了解甚少。
為了深入了解和分析胚胎肝組織發(fā)育和再生的機理，進(jìn)一步找出受損肝組織的強大再生能力的影響因素和生物化學(xué)基礎(chǔ)，本發(fā)明人基于長期從事組織再生特別是肝組織再生學(xué)研究的實踐，從6-12周齡人胚胎肝組織中分離并純化得到了一種我們稱之為“人肝胚胎肝源性因子”(hELF)的蛋白質(zhì)物質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人進(jìn)一步分析了該物質(zhì)的理化性質(zhì)、制備了相應(yīng)的單克隆抗體并深入研究了該物質(zhì)的體外生物學(xué)活性和其可能的臨床應(yīng)用，從而完成了本發(fā)明。
首先，我們使用從健康人6-12周齡人工流產(chǎn)胚胎分離的肝組織作為材料來源，以常規(guī)的化學(xué)和生物化學(xué)方法由所述的材料分離并純化得到一種對熱和強酸強堿環(huán)境均異常穩(wěn)定的，分子量大約30 KD的蛋白質(zhì)物質(zhì)(參見實施例1)。對該物質(zhì)的進(jìn)一步生物學(xué)活性分析結(jié)果顯示，在含新生牛血清(NBCS)的DMEM基本培養(yǎng)基中，本發(fā)明得到的這種蛋白質(zhì)不僅可以顯著地促進(jìn)體外培養(yǎng)的原代人胚胎肝細(xì)胞的增殖和分化，而且對肝癌HepG2細(xì)胞和SSMC-7721細(xì)胞、小鼠乳腺癌D2F2細(xì)胞以及人宮頸癌Hela細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞系均有顯著地生長促進(jìn)作用(參見實施例2，3，5)。因此，本發(fā)明人將該蛋白質(zhì)定名為“人胚胎肝源性因子”(hELF)。
另外，我們使用肝癌HepG2細(xì)胞和SSMC-7721細(xì)胞作為靶細(xì)胞，以常規(guī)噻唑藍(lán)比色法(MTT法)檢測本發(fā)明的人胚胎肝源性因子對肝癌HepG2細(xì)胞和SSMC-7721細(xì)胞(作為靶細(xì)胞)增殖的影響，結(jié)果令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，由第7至12周齡胚胎肝組織分離的粗提物可以刺激和促進(jìn)靶細(xì)胞的生長，而由大于12周齡胚胎肝組織分離的粗提物則表現(xiàn)有明顯地抑制靶細(xì)胞生長并促進(jìn)細(xì)胞凋亡活性。這些實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的hELF在胚胎發(fā)育的不同階段可能有不同的表達(dá)水平。
為了制備本發(fā)明的人胚胎肝源性因子，例如可以首先將胚胎肝組織剪碎制備組織勻漿并離心收集上清。分別用45％和65％(V/V)的丙酮分級沉淀后收集沉淀物。然后使用截留分子量為10,000道爾頓的超濾膜進(jìn)行超濾。收集分子量大于10,000道爾頓的蛋白質(zhì)，使用Mono S陽離子交換層析柱進(jìn)行反復(fù)(兩次)層析純化，最終得到純度大于98％、總活性回收率約為9.3％的本發(fā)明的人胚胎肝源性因子(hELF)。
使用聚丙烯酰胺凝膠電泳法對如此得到的生物學(xué)活性蛋白質(zhì)的分析結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)的表觀分子量約為30KD。進(jìn)一步的理化性質(zhì)分析顯示，本發(fā)明的hELF在60℃下放置2小時或于100℃加熱處理15分鐘后，該蛋白質(zhì)仍保留其固有的活性。另外，分別用1M HCL(pH 1)或1M NaOH(pH 12)處理24小時后，本發(fā)明的hELF亦不喪失其活性。因此可以認(rèn)為，本發(fā)明的hELF對熱和極端酸性或堿性條件均表現(xiàn)有良好的穩(wěn)定性。
體外生物學(xué)鑒定結(jié)果顯示，在含不同濃度新生牛血清(NBCS)的DMEM基本培養(yǎng)基中，本發(fā)明的hELF具有顯著地增加人胚胎肝細(xì)胞的數(shù)目、維持正常肝細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞生長活力的作用。另外，我們實驗還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的hELF還可顯著地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞系(例如肝癌HepG2細(xì)胞和SSMC-7721細(xì)胞、小鼠乳腺癌D2F2細(xì)胞以及人宮頸癌Hela細(xì)胞等)生長增殖的能力(參見實施例2和5)。
因此，可以將本發(fā)明的hELF所具有的獨特理化性質(zhì)和生物學(xué)活性總結(jié)如下(1)在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中，顯示其表觀分子量約為30KD。
(2)是一種熱穩(wěn)定的物質(zhì)，60℃放置2小時或于100℃加熱15分鐘均不喪失活性。
(3)具有較強的耐酸堿能力，在pH1.0至pH12.0范圍內(nèi)都具有活性，并且在堿性條件下活性增強。
(4)對尿素不敏感。
(5)活性分布具有階段性，受到胎齡的限制。在我們收集的不同胎齡來源的樣本中，只有胎齡小于12周的組織提取物表現(xiàn)出極強的促肝腫瘤細(xì)胞系增殖作用。但hELF對人胚胎肝細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用不存在這種階段性，即hELF對胎齡12周以上的人胚胎肝細(xì)胞和胎齡12周以下的人胚胎肝細(xì)胞均有促增殖作用。
(6)其生物學(xué)活性表現(xiàn)為促進(jìn)體外培養(yǎng)的人胚胎肝細(xì)胞、人源性肝腫瘤細(xì)胞株的增殖。但對體外培養(yǎng)的原代大鼠肝細(xì)胞的增殖無影響。
(7)活性不具有種屬特異性。雖然該因子對體外培養(yǎng)的成年大鼠肝細(xì)胞沒有增殖促進(jìn)作用，但可明顯地促進(jìn)小鼠乳腺癌細(xì)胞系D2F2細(xì)胞的增殖。
(8)活性不具有組織特異性，例如不僅可促進(jìn)人肝腫瘤來源的細(xì)胞系HepG2細(xì)胞、SSMC-7721細(xì)胞和人胚胎肝細(xì)胞的增殖，還可明顯促進(jìn)乳腺癌來源的細(xì)胞系D2F2細(xì)胞和人宮頸癌來源的細(xì)胞系Hela細(xì)胞的增殖。
(9)該因子促進(jìn)胚胎肝細(xì)胞的生長表現(xiàn)為促進(jìn)胚胎肝細(xì)胞的增殖和分化。
(10)在胚胎肝細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)中發(fā)揮關(guān)鍵性細(xì)胞生長促進(jìn)作用。加入此因子后，胚胎肝細(xì)胞可連續(xù)傳3-5代，并能維持肝細(xì)胞正常形態(tài)。而未加入此因子的對照組人胚胎肝細(xì)胞在傳代培養(yǎng)過程中迅速失去肝細(xì)胞的典型形態(tài)，不能夠傳代培養(yǎng)。
目前已公布的具有肝細(xì)胞增殖與肝組織再生促進(jìn)功能的因子包括HGF、HSS、ALR、抑瘤素-M(OSM)、表皮生長因子(EGF)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGF-d)等。為了進(jìn)一步說明本發(fā)明的hELF是一種不同于所有目前已知的肝細(xì)胞增殖與肝組織再生促進(jìn)因子的新的蛋白質(zhì)，現(xiàn)僅就本發(fā)明的hELF在理化性質(zhì)和生物學(xué)活性方面與這些已知因子的主要區(qū)別簡要比較如下。
(1)hELF與HSS及ALR的區(qū)別HSS與ALR的均來源于肝臟，但這兩種因子究竟是否為同一種物質(zhì)目前還缺乏統(tǒng)一的認(rèn)識。雖然本發(fā)明的hELF在理化性質(zhì)與HSS和ALR存在有某些相同之處(例如熱穩(wěn)定性，對酸堿不敏感等)，但hELF在生物學(xué)功能和分子大小上與HSS及ALR則存在很大差別。
hELF與HSS的區(qū)別HSS的分子量在12～20kD之間(LaBrecque DR.Hepatic stimulator substanceDiscovery.characteristics and mechanism of action.Dig Dis Sci.1991；36(5)669-73.)。HSS的生物活性最大特點就是具有組織特異性，即這種因子的活性作用僅限于肝源性細(xì)胞，對其它組織來源的細(xì)胞無作用。而本發(fā)明的hELF不僅可以促進(jìn)肝源性細(xì)胞的增殖，同時對乳腺癌來源的細(xì)胞系和人宮頸癌來源的細(xì)胞系亦有明顯的增殖促進(jìn)作用。
ALR分子的天然結(jié)構(gòu)為二聚體，非還原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中的表觀分子大小為30KD，還原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳時分子大小為15KD。而hELF無論是在還原還是在未還原的條件下電泳，分子量都是30KD。對于HSS與ALR的研究雖然尚存在某些不確定性，但它們之間公認(rèn)的最大共同點是生物活性具有組織特異性，即這兩種因子的僅對肝源性細(xì)胞有活性，對其它組織來源的細(xì)胞無作用(Francavilla A，Hagiya M，Porter A，et al.Augmenter of Liver RegenerationItsPlace in the Universe of Hepatic Growth Factor.Hepatology，1994，20(3)747-757)。
(2)hELF與HGF的區(qū)別hELF對HepG2的生物活性作用與HGF完全相反。已知HGF抑制HepG2細(xì)胞的增殖，促進(jìn)HepG2的遷移。在HepG2細(xì)胞培養(yǎng)物中加入HGF，可以觀察到細(xì)胞不再呈典型的克隆樣生長，而是分散單個存在，且細(xì)胞不增殖(Shiota G，Nakamura T，Schmidt EV.Hepatocyte growth factor regulates transforming growth factor alpha inHepG2 hepatic cells.Biochem Biophys Res Commun，1994，200(2)1 099-1104.)。這一現(xiàn)象與我們觀察到的hELF促進(jìn)HepG2呈典型克隆樣增殖的現(xiàn)象完全相反。另外，本發(fā)明的hELF對體外培養(yǎng)成年大鼠肝細(xì)胞無促增殖活性，HGF具有很強的促進(jìn)體外培養(yǎng)成年大鼠肝細(xì)胞增殖的作用。
理化性質(zhì)上看，本發(fā)明的hELF具有大約30KD的分子量并且于100℃條件下加熱15分鐘不失活；而HGF的分子量約為82～85kD并且于100℃加熱3分鐘即失去活性。因此可以確定，hELF與HGF是完全不相同的兩種因子。
(3)hELF與抑瘤素-M(OSM)的區(qū)別OSM為一種28kDa的糖蛋白，對熱和酸穩(wěn)定，是IL-6家族的成員。OSM可以促進(jìn)胚胎肝細(xì)胞的分化，并可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(低劑量OSM即可抑制乳腺癌細(xì)胞的生長)。這與hELF對乳腺癌細(xì)胞D2F2的促增殖作用相反。因此可以確定，hELF是一種不同于OSM的物質(zhì)。
(4)hELF與其它生長因子的區(qū)別從以下幾方面可以明顯看出本發(fā)明的hELF與表皮生長因子(EGF)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGF-α)和激素類物質(zhì)胰島素等因子的區(qū)別(a)從分子量和理化性質(zhì)上看，EGF分子量6KD，F(xiàn)GF分子量16～17KD，TGF-α分子量6KD，胰島素分子量5773。其中，F(xiàn)GF在60℃加熱5分鐘或pH＜4.0條件下將失去活性。
(b)這些因子雖然都有促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的活性，但它們的作用強度均小于hELF。
(c)胰島素主要是與其它生長因子發(fā)揮協(xié)同作用，其本身并沒有單獨促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的活性。
通過以上的比較可以看出，本發(fā)明的hELF在理化特征和生物學(xué)活性上完全不同所有已知的肝細(xì)胞特別是胚胎肝細(xì)胞增殖促進(jìn)因子，是一種此前未知的生物學(xué)活性物質(zhì)。
鑒于本發(fā)明的hELF的特有生物學(xué)活性，有可能將該因子作為一種關(guān)鍵性因子應(yīng)用于人胚胎肝細(xì)胞系的建立、生物肝的構(gòu)建、惡性腫瘤疾病的診斷或作為肝組織再生促進(jìn)劑用于促進(jìn)肝組織因肝切除、創(chuàng)傷或病原體(例如病毒)感染造成的肝組織嚴(yán)重?fù)p傷后的再生和修復(fù)。例如，可以基于本發(fā)明的人胚胎肝源性因子的刺激和促進(jìn)人胚胎肝細(xì)胞生長增殖的能力，將該因子用于人胚胎肝細(xì)胞系的建立和/或擴增。在構(gòu)建人工肝臟中，可以使用本發(fā)明的hELF作為外源性因子用于促進(jìn)人工肝臟內(nèi)肝細(xì)胞的快速生長并長期維持其典型表型。另外，在某些肝源性或非肝源性惡性腫瘤發(fā)生的情況下，可以通過檢測hELF的分布或病變組織中hELF的水平作為一種腫瘤診斷的輔助手段。特別是，在肝組織遭受各種物理、化學(xué)或生物學(xué)損傷導(dǎo)致肝細(xì)胞大量破壞的情況下，可以使用本發(fā)明的hELF作為治療劑，用于促進(jìn)受損肝組織的盡快再生和修復(fù)。再者，也可以使用本發(fā)明的hELF作為防止或減輕肝臟損傷的有效保護(hù)劑。
下列實施例旨在結(jié)合附圖進(jìn)一步舉例描述而不是限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明的任何平行改變和改動都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。
實施例實施例1hELF的提取與純化從得自健康母體人工流產(chǎn)的約10周齡胚胎中無菌分離完整肝臟并稱重。將肝臟剪碎成3mm3大小的組織塊，然后將組織塊移至手動玻璃勻漿器中，加入D-Hanks溶液，溫和地將其破碎，直至勻漿器中無肉眼可見的肝組織塊。將勻漿液移入離心管中，4℃，3,000rpm離心15分鐘。棄去沉淀，留取組織提取物的上清(SA)，4℃保存。以上操作均在無菌條件下進(jìn)行(參見D.R.馬歇克，J.T.門永，R.R.布格斯等，蛋白質(zhì)純化與鑒定實驗指南，科學(xué)出版社，2000，第一版，p24-31)。
用丙酮分級沉淀(45％～65％)組織提取物上清(SA)攪拌下向上清中加入預(yù)冷的丙酮(終濃度為45％，V/V)，離心去掉不溶物后，繼續(xù)向上清中加入終濃度為65％(V/V)的丙酮。放置30分鐘后，離心棄去上清。將沉淀物重新溶解在抽出液中，用蒸餾水充分透析后凍干。然后重新溶解得到SB溶液。檢測結(jié)果可知，SB具有促進(jìn)HepG2細(xì)胞和SSMC-7721細(xì)胞增殖的活性。由SA溶液到SB溶液，蛋白質(zhì)純化2倍，活性回收率達(dá)到176.3％。
使用截留分子量為10,000道爾頓的透析膜，對SB溶液進(jìn)行超濾處理(4℃條件下，3,000rpm，連續(xù)離心1.5小時)，直到將SB溶液的體積濃縮至原體積的1/5。然后收集超濾的溶液，得到的分子量大于10,000道爾頓的SC溶液和分子量小于10,000道爾頓的SD溶液。分別檢測這些溶液對HepG2細(xì)胞增殖的影響，確定SC溶液促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖的作用，且其作用強度與超濾前的SB溶液無差別。而SD溶液對HepG2細(xì)胞的增殖無促進(jìn)作用。
由此可以認(rèn)為，人胚胎肝組織的促進(jìn)細(xì)胞增殖的活性物質(zhì)分子量在10,000道爾頓以上，而分子量小于10,000道爾頓的物質(zhì)則沒有這種活性。
然后，進(jìn)一步使用Mono S層析柱(50×5mm)對SC溶液進(jìn)行離子交換層析(AKTA100型層析儀)。梯度洗脫條件是A溶液(0.20mM Tris-HCl溶液(pH 8.0)，含0.01％Tween)B溶液(含2M NaCl的A溶液)＝0％～50％，流速為1ml/分鐘。洗脫期間分別監(jiān)測各管洗脫物的214nm，254nm和280nm吸光率。
第一次層析開始洗脫前，UV-280曲線在未結(jié)合部位可見1個較大的吸收峰。洗脫過程中，有3個主峰被洗脫下來。收集第7ml至第26ml洗脫液。然后將各管洗脫液的pH值調(diào)至7.2，以96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞為靶細(xì)胞，檢測各管洗脫液的生物學(xué)活性。
第一次層析收集的洗脫液活性檢測顯示活性出現(xiàn)在被洗脫的第2個峰，位于洗脫體積的第14～18ml，洗脫的鹽濃度在25％～35％之間。對HepG2細(xì)胞增殖的影響，尤以16～17ml(SE)的促增殖活性作用最強(參見圖1)。
合并第一次層析得到的Mono S洗脫液(SE)的活性部分，使用Mono S離子層析柱再次進(jìn)行離子交換層析分離。在未結(jié)合部位僅有1個小的280曲線吸收峰，洗脫過程中出現(xiàn)了2個主峰，收集為第13～24ml，經(jīng)活性檢測，確定活性峰為第1個主峰，生物活性出現(xiàn)在第15、16ml，洗脫的鹽濃度與第一次層析結(jié)果重合(參見圖2)。
由SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜可見，純化后的物質(zhì)在分子量30kD的位置有一條明顯的單一的銀染色區(qū)帶(參見圖3)。第二次純化后產(chǎn)物純度提高11398倍，回收率約為9.3％。我們將此因子命名為人胚胎肝源性因子(hELF)。
整個分離、純化過程中產(chǎn)物的總蛋白含量、活性、比活性、純度和回收率變化情況如下列表1所示。
表1hELF產(chǎn)物純化過程中的各參數(shù)變化
實施例2hELF對肝腫瘤細(xì)胞系增殖的影響分別將HepG2細(xì)胞(購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫)和SSMC-7721細(xì)胞(購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫)分為空白對照組和實驗組，接種于含10％新生牛血清(NBCS)的DMEM培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)板的孔(8000細(xì)胞/孔)中，于5％ CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。
HepG2細(xì)胞培養(yǎng)24小時后，將空白對照組的培養(yǎng)基換成含D-Hanks液(20μl)和2％新生牛血清(NBCS)的DMEM培養(yǎng)基，并將實驗組的培養(yǎng)基換成含hELF溶液(20μl，終濃度5ng/ml)的上述培養(yǎng)基。
繼續(xù)培養(yǎng)期間，實驗組HepG2細(xì)胞在加入hELF因子后的第2～3天便開始明顯增殖，細(xì)胞很快形成較多克隆。從HepG2細(xì)胞的生長過程可見，hELF對HepG2細(xì)胞的促增殖作用非常顯著。到第7天結(jié)束培養(yǎng)時，實驗組OD490數(shù)值達(dá)到對照組的2倍以上(參見圖4)。然而，此時對照組的細(xì)胞未見明顯增殖，幾乎沒有克隆形成。高倍鏡下可見，實驗組HepG2細(xì)胞生長狀態(tài)非常典型，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，克隆內(nèi)的細(xì)胞界限不清，連接緊密。培養(yǎng)至第5天時，鏡下可見對照組的細(xì)胞增殖緩慢，多為單個細(xì)胞或幾個細(xì)胞組成的小克隆，而實驗組的細(xì)胞克隆形成率非常高，并且克隆體積較大，部分克隆間發(fā)生匯合。實驗組與對照組的增殖狀況相比較，差異非常明顯(參見圖5a-5d)。
SSMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)24小時后，將空白對照組的培養(yǎng)基換成含D-Hanks液(20μl)和0.3％新生牛血清(NBCS)的DMEM培養(yǎng)基，并將實驗組的培養(yǎng)基換成含hELF溶液(20μl，終濃度5ng/ml)的上述培養(yǎng)基。
在含0.3％ NBCS的DMEM培養(yǎng)基中，SSMC-7721細(xì)胞的增殖相對比較緩慢。培養(yǎng)第3天，對照組細(xì)胞只形成少量克隆。而培養(yǎng)基中添加了本發(fā)明的hELF的實驗組細(xì)胞則可見增殖迅速，并形成較大的克隆。實驗組細(xì)胞的形態(tài)與對照組細(xì)胞相近。培養(yǎng)7天后細(xì)胞基本長滿培養(yǎng)板的底部。
實施例3hELF對體外原代培養(yǎng)的人胚胎肝細(xì)胞增殖的影響取大約10周的胚胎，采用已知的體外膠原酶消化與機械分離相結(jié)合的方法分離肝細(xì)胞。細(xì)胞總數(shù)在5×105～7×106之間，并且多為5個細(xì)胞左右的小細(xì)胞團(細(xì)胞存活率約為60％～70％)。
所得人胚胎肝細(xì)胞懸液按比例稀釋后，以3.5×104/cm2的細(xì)胞密度接種于膠原被覆的96孔培養(yǎng)板和24孔培養(yǎng)板中，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后，更換培養(yǎng)液。
在常規(guī)培養(yǎng)條件下平面培養(yǎng)8小時后，人胚胎肝細(xì)胞完全貼壁，呈多邊形，可見較多雙核細(xì)胞且核仁清晰。其中30％～40％的細(xì)胞處于有絲分裂狀態(tài)。培養(yǎng)的第8天，細(xì)胞長滿培養(yǎng)板底部。培養(yǎng)12天后，鏡下可見培養(yǎng)基(含2％ NBCS的DMEM)中添加hELF(20μl，終濃度5ng/ml)的實驗組胚胎肝細(xì)胞形成大片細(xì)胞克隆，細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞間連接緊密并保持肝細(xì)胞的典型形態(tài)。培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞以典型肝細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞為主，肝細(xì)胞克隆間偶而可見一些成纖維樣細(xì)胞的增殖。相反，此時對照組細(xì)胞發(fā)生融合，形成體積較大的融合體，每個融合體內(nèi)含有多個細(xì)胞核，并且很難發(fā)現(xiàn)具有典型肝細(xì)胞形態(tài)特征的細(xì)胞。大片的肝細(xì)胞克隆消失，取而代之的是成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞增殖旺盛，在培養(yǎng)細(xì)胞中占較大比例(參見圖6a和6b)。另外，培養(yǎng)5天后，在含10％NBCS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的實驗組細(xì)胞的數(shù)量明顯高于對照組。
以上的實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的hELF作為人胚胎肝細(xì)胞傳代培養(yǎng)的一個關(guān)鍵性因子，可以在維持肝細(xì)胞的表型特征的前提下顯著地促進(jìn)細(xì)胞的增殖，可使體外培養(yǎng)的人胚胎肝細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)3-5代。相反，未加hELF的對照組細(xì)胞傳代后失去了肝細(xì)胞的典型形態(tài)，并主要表現(xiàn)為成纖維樣細(xì)胞增殖。
在多次重復(fù)實驗中還發(fā)現(xiàn)，盡管hELF來源于胎齡小于12周的胚胎肝臟，但其對胚胎肝細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用并沒有受到胎齡的限制。hELF對實驗中所取不同胎齡的多個樣本的胚胎肝細(xì)胞均表現(xiàn)出明顯的促增殖作用。胎齡小于和大于12周齡的胚胎肝細(xì)胞在hELF作用下的生長狀態(tài)沒有明顯差別。
實施例4hELF對體外原代培養(yǎng)成年大鼠肝細(xì)胞增殖的影響采用兩步原位膠原酶灌流法(Seglen PO.Exp.Cell Res.，1973；82391.)分離大鼠肝細(xì)胞。形態(tài)學(xué)檢查可見，體外培養(yǎng)的成年大鼠肝細(xì)胞呈典型肝細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞體積較大，呈多邊形，細(xì)胞核大而圓，核仁清晰可見，有雙核細(xì)胞，并且某些細(xì)胞正處于分裂狀態(tài)。將大鼠肝細(xì)胞懸液按比例稀釋后，以3.5×104/cm2的細(xì)胞密度接種于膠原被覆的96孔培養(yǎng)板和24孔培養(yǎng)板中，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后，將96孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液更換為含8％NBCS的Williams培養(yǎng)液。將96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)的肝細(xì)胞分為對照組和實驗組，實驗組加入hELF，終濃度為5ng/ml。培養(yǎng)5天后，以MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖狀況。
結(jié)果如下列表2所示。
表2 hELF對原代培養(yǎng)成年大鼠肝細(xì)胞增殖的影響(x±s)
P＞0.05由表2所示數(shù)據(jù)及鏡下觀察結(jié)果可以得知，體外平面培養(yǎng)5天后，實驗組與對照組細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量均無明顯差異。而且，SA、SE、hELF組與對照組比較，細(xì)胞增殖無明顯差異。這些結(jié)果表明，hELF對體外原代培養(yǎng)的成年大鼠肝細(xì)胞的增殖沒有明顯的促進(jìn)作用。
實施例5hELF對其他組織來源的腫瘤細(xì)胞株增殖的影響人宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞采用含10％NBCS的DMEM培養(yǎng)液在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。每3天更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)約4～5天，細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿底部的70％～80％時進(jìn)行消化傳代。將計數(shù)后的細(xì)胞懸液稀釋為6×104細(xì)胞/ml，以6,000細(xì)胞/孔的密度均勻接種于96孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24小時后，將含10％NBCS的DMEM培養(yǎng)液更換為含0.3％NBCS的DMEM培養(yǎng)液(180μl/孔)。實驗組加入待測物質(zhì)后，用D-Hanks溶液將每孔培養(yǎng)液體積補至200μl?？瞻讓φ战M加D-Hanks溶液(20μl/孔)。每組設(shè)6個平行孔。結(jié)果可見，培養(yǎng)開始第24～48小時后，添加本發(fā)明hELF的實驗組中人宮頸癌來源的Hela細(xì)胞即表現(xiàn)出明顯地增殖狀態(tài)，而且與對照組相比細(xì)胞形態(tài)無差異(參見圖7a和7b)。
小鼠乳腺癌細(xì)胞系D2F2細(xì)胞采用含10％NBCS的DMEM培養(yǎng)液在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。每3天更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)約4～5天，細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿底部的70％～80％時，進(jìn)行消化傳代。將計數(shù)后的細(xì)胞懸液稀釋為6×104細(xì)胞/ml，以6,000/孔的密度均勻接種于96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)24小時后，將10％NBCS的DMEM培養(yǎng)液更換為含0.3％ NBCS的DMEM培養(yǎng)液(180μl/孔)。實驗組加入待測物質(zhì)后，用D-Hanks溶液將每孔培養(yǎng)液體積補至200μl。空白對照組加D-Hanks溶液(20μl/孔)。每組設(shè)6個平行孔。
在D2F2細(xì)胞培養(yǎng)物中，添加hELF后也出現(xiàn)與Hela細(xì)胞相似的生長狀態(tài)。雖然在含0.3％NBCS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的D2F2細(xì)胞增殖緩慢，但添加hELF后48小時內(nèi)便開始迅速增殖。至培養(yǎng)的第4天，與對照組相比細(xì)胞數(shù)量上的差異已經(jīng)非常顯著。而且，實驗組細(xì)胞在增殖過程中始終維持D2F2細(xì)胞的典型形態(tài)，與對照組細(xì)胞形態(tài)相近。
權(quán)利要求
1.人胚胎肝源性因子，特征在于所說的因子在聚丙烯酰胺凝膠電泳中測得的表觀分子量為大約30KD，并具有極好的耐熱和耐酸堿能力和促進(jìn)肝細(xì)胞及其他組織來源細(xì)胞的體外增殖和分化活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的因子，其中所說的耐熱和耐酸堿難看、能力是指于60℃放置2小時或于100℃加熱15分鐘，或于pH1.0至pH12.0條件下處理，將該因子均不喪失其生物學(xué)活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的因子，其中所說的肝細(xì)胞是指人肝細(xì)胞和肝腫瘤細(xì)胞。
4.分離和純化如上限定的人胚胎肝源性因子的方法，該方法包括分離8-12周令人胚胎肝細(xì)胞懸液的上清；經(jīng)用丙酮分級沉淀后收集沉淀物并超濾；收集分子量大于10,000的蛋白質(zhì)，使用陰離子交換柱進(jìn)行反復(fù)的柱層析純化后，得到所需的人胚胎肝源性因子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中用于分級沉淀的丙酮濃度分別為45％和65％(V/V)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中超濾所用透析膜的截留分子量為10,000道而頓。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中陰離子交換層析柱是Mono S。
8.如權(quán)利要求1限定的人胚胎肝源性因子在人工肝臟構(gòu)建中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求1限定的人胚胎肝源性因子在治療肝細(xì)胞損傷性疾病中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求1限定的人胚胎肝源性因子在促進(jìn)人胚胎肝細(xì)胞增殖和人胚胎肝細(xì)胞傳代培養(yǎng)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有肝細(xì)胞增殖活性的細(xì)胞生長因子，特別是涉及衍生于人胚胎肝組織的新的人胚胎肝源性因子，其分離和純化方法，以及所說的因子在促進(jìn)肝細(xì)胞再生、治療損傷相關(guān)疾病和構(gòu)建人工肝臟中的應(yīng)用。
文檔編號A61P1/16GK1721441SQ200410010989
公開日2006年1月18日 申請日期2004年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月14日
發(fā)明者顏煒群, 胡春光 申請人:吉林圣元科技有限責(zé)任公司