專利名稱：修飾的腫瘤抗原肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于刺激機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)的腫瘤抗原肽，特別是基于腫瘤抗原HER2/neu的修飾的手性腫瘤抗原肽，其制備方法及其在生產(chǎn)用于治療腫瘤特別是乳腺癌的藥物或疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的惡性腫瘤治療方法包括外科手術(shù)治療、放射線治療和化學(xué)藥物治療，這些療法的共同缺點(diǎn)是由于惡性腫瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)而難以完全切除腫瘤組織或徹底殺滅腫瘤細(xì)胞，最終導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。而且，這些治療手段缺乏特異性，在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也損傷正常細(xì)胞。因此需要發(fā)展新的腫瘤治療途徑與手段。
細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)在機(jī)體防御病毒感染和清除體內(nèi)變異細(xì)胞的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。CTL的活化是通過MHC I類分子遞呈抗原并被CTL識(shí)別來實(shí)現(xiàn)的。其中被遞呈的抗原在抗原遞呈細(xì)胞(APC)內(nèi)被加工處理成大多長(zhǎng)約9～11個(gè)氨基酸的抗原肽表位。MHC I類分子與這些肽的復(fù)合物結(jié)合T細(xì)胞表面受體(TCR)后導(dǎo)致T細(xì)胞活化，產(chǎn)生肽特異性的CTL，進(jìn)而可特異地殺傷表達(dá)這些肽抗原的腫瘤細(xì)胞。
越來越多的腫瘤抗原和/或抗原肽被鑒定，使腫瘤抗原蛋白質(zhì)的治療應(yīng)用成為可能。而基因工程技術(shù)和多肽合成技術(shù)的進(jìn)步，也大大推動(dòng)了腫瘤免疫治療藥物和腫瘤抗原肽疫苗的發(fā)展。與腫瘤細(xì)胞疫苗和DNA疫苗等傳統(tǒng)疫苗相比，多肽疫苗有以下優(yōu)點(diǎn)①可以方便的化學(xué)合成所設(shè)計(jì)的多肽，不受材料來源限制；②易于制備和純化，能大量合成高純度、具有高度可重復(fù)性的多肽；③化學(xué)性質(zhì)和熱力學(xué)性質(zhì)比蛋白質(zhì)更穩(wěn)定，便于運(yùn)輸和保存；④沒有毒性或感染性因子(如重組載體DNA及其編碼的蛋白質(zhì)或肽)的污染；⑤下游加工處理簡(jiǎn)單易行且成本低。由于合成多肽疫苗具有以上這些優(yōu)點(diǎn)，因此成為一種具有廣闊應(yīng)用前景的腫瘤免疫治療劑。
neu基因最初是在化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)的大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)化基因(Shih C et al，Nature，290261-264，1981)。neu基因與編碼表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的基因erbB具有高度同源性(Coussens L et al，Science，30(4730)1132-1139，1985)。與neu基因相對(duì)應(yīng)的人類基因her2定位于第17對(duì)染色體長(zhǎng)臂21位(17q21)上，是一種原癌基因，其表達(dá)產(chǎn)物是由1255個(gè)氨基酸組成的分子量為185kD的受體酪氨酸激酶——HER2/neu蛋白(簡(jiǎn)稱HER2/neu，又稱作p185)，其分子由信號(hào)肽、胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)四個(gè)部分組成(Christianson TA et al，Cancer Res，58(22)5123-5129，1999)。her2/neu基因主要在胚胎發(fā)生時(shí)開始表達(dá)，成年后，用免疫組化方法在正常組織上皮細(xì)胞中僅可檢測(cè)到極少量的HER2/neu蛋白。在正常組織中，her2/neu常以單拷貝形式出現(xiàn)。her2/neu的擴(kuò)增和/或蛋白的過度表達(dá)通常表現(xiàn)在乳腺、卵巢、肺、胰腺及胃腸道腫瘤等的腫瘤細(xì)胞上，并且往往伴隨著患者生存期縮短，提前復(fù)發(fā)及預(yù)后不良(Slamon DJ，Science，235(4785)177-182)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，her2/neu過表達(dá)可導(dǎo)致非腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺癌的發(fā)生(Hoang M P et al，Am.J.Clin.Patho.，113(6)852-856，2000)。her2/neu基因活化后的表達(dá)產(chǎn)物與表皮生長(zhǎng)因子受體家族的其它成員形成異源二聚體，或自發(fā)形成同源二聚體，這些二聚體與相應(yīng)的配體結(jié)合后，介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)傳遞而引起胞內(nèi)酪氨酸磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)并將增殖信號(hào)傳入胞核內(nèi)，最終導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。
有證據(jù)表明，某些腫瘤病人體內(nèi)存在HER2/neu特異性抗體或CTL反應(yīng)，HER2/neu的表達(dá)產(chǎn)物能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)(Disis ML et al，Cancer Res，1；54(1)16-20，1994)，并且已證明被動(dòng)免疫療法如HER2/neu特異抗體Heceptin具有抗腫瘤作用(Baselga J et al，Cancer Research，58(13)2825。因此，HER2/neu可以作為惡性腫瘤主動(dòng)免疫治療的理想靶點(diǎn)。
發(fā)明目的本發(fā)明的一個(gè)目的是提供基于HER2/neu序列的修飾的腫瘤抗原肽，特征在于它們分別具有如序列表中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，并且各自至少包含有一個(gè)D-型氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的肽是以化學(xué)合成方法得到的。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供HER2/neu特異性疫苗或藥物組合物，所說的疫苗或藥物組合物是由如上限定的腫瘤抗原肽以及一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體組成的。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所說的疫苗或藥物組合物還可含有選自完全佛氏佐劑或不完全佛氏佐劑的免疫增強(qiáng)劑。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所說的疫苗或藥物組合物還可含有選自白介素2、γ干擾素和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的一種或多種細(xì)胞因子。
本發(fā)明的再一個(gè)目的涉及如上限定的疫苗或藥物組合物在誘導(dǎo)HER2/neu特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的HER2/neu特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)是HER2/neu特異性細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的腫瘤是乳腺癌。
附圖簡(jiǎn)要說明

圖1顯示D-P42-50的半制備柱層析圖。
圖2顯示D-P782-790的半制備柱層析圖。
圖3顯示D-P42-50的質(zhì)譜圖。
圖4顯示D-P782-790的質(zhì)譜圖。
圖5顯示本發(fā)明的免疫原性肽對(duì)小鼠乳腺腫瘤生長(zhǎng)的影響。
圖6顯示接受本發(fā)明的腫瘤抗原疫苗(D-P42-50+GM-CSF)治療35天后，動(dòng)物乳腺癌移植瘤的組織病理學(xué)檢查結(jié)果(200×)。
圖7顯示接受本發(fā)明的腫瘤抗原疫苗(D-P782-790+GM-CSF)治療35天后，動(dòng)物乳腺癌移植瘤的組織病理學(xué)檢查結(jié)果(200×)。
圖8顯示接受本發(fā)明的腫瘤抗原疫苗(D-P42-50+GM-CSF)治療35天后，動(dòng)物乳腺癌移植瘤的組織透射光鏡檢查結(jié)果(10,000×)。
圖9顯示接受本發(fā)明的腫瘤抗原疫苗(D-P782-790+GM-CSF)治療35天后，動(dòng)物乳腺癌移植瘤的組織透射光鏡檢查結(jié)果(10,000×)。
發(fā)明的具體內(nèi)容在人和哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中，T細(xì)胞介導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)、移植物排斥和細(xì)胞毒活性等一系列細(xì)胞免疫反應(yīng)。某些T細(xì)胞與專門的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)即MHC分子相互作用以在細(xì)胞表面上遞呈抗原。專門化的抗原遞呈細(xì)胞(APC)如巨嗜細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞毒性和輔助T細(xì)胞增殖并識(shí)別靶細(xì)胞表面上表達(dá)的相應(yīng)抗原，進(jìn)而誘導(dǎo)T細(xì)胞(CTL)或其他細(xì)胞殺傷這些靶細(xì)胞。
T細(xì)胞特別是CD8+和CD4+T細(xì)胞在介導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答中起到不可替代的作用。T細(xì)胞的激活和擴(kuò)增需要一系列免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的參與。樹突狀細(xì)胞(DC)作為功能最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞(APC)，將攝取、加工和處理后的抗原遞呈給T細(xì)胞，賦予T細(xì)胞活化的第一信號(hào)。同時(shí)，DC表面的CD80/CD86(B7-1/B7-2)、CD40等共刺激分子與T細(xì)胞表面相應(yīng)的受體或配體相互作用后，介導(dǎo)T細(xì)胞活化的第二信號(hào)。另外，CTL的活化還需要CD4+T細(xì)胞分泌的白介素2(IL-2)、γ干擾素(IFN-γ)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和等細(xì)胞因子的參與。
為了使特異性腫瘤抗原負(fù)載在成熟的樹突狀細(xì)胞上，有必要通過改變抗原表位肽分子的局部旋光性并賦予分子以局部手性特征，以增強(qiáng)抗原肽對(duì)蛋白酶降解的抗性，延長(zhǎng)分子的體內(nèi)半衰期，提高其在抗原遞呈細(xì)胞上的負(fù)載能力，進(jìn)而增強(qiáng)其誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫原反應(yīng)的能力。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種腫瘤抗原肽，特別是一種基于腫瘤抗原HER2/neu的抗原肽。本發(fā)明進(jìn)一步提供制備所說的抗原肽的方法以及所說的抗原肽在生產(chǎn)用于治療腫瘤特別是乳腺癌的藥物或疫苗中的應(yīng)用。
為了得到本發(fā)明的腫瘤抗原肽，發(fā)明人首先利用SYFPEITHI基序法預(yù)測(cè)與乳腺癌關(guān)系密切的HER2/neu抗原蛋白的HLA-A2限制性CTL肽表位，從HER2/neu蛋白的胞外區(qū)和胞內(nèi)區(qū)中各選取一段與HLA-A2分子結(jié)合自由能最高的肽P42-50(Val-Val-Gln-Cys-Gly-Gln-Tyr-Leu-His)和P782-790(Leu-Cys-Ile-Cly-Leu-Leu-Ary-Ser-Val)。在不影響肽與MHC-I類分子結(jié)合的前提下，我們對(duì)所說的肽段進(jìn)行了必要的修飾。所說的修飾包括將P42-50的羧基端殘基L-Leu替換為D-Leu，將P782-790的羧基端殘基L-Ser替換為D-Ser，并分別得到如序列表中SEQID NO1和SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。發(fā)明人希望這些修飾能夠在改變肽分子局部旋光性并賦予分子以局部手性特征的基礎(chǔ)上，增強(qiáng)抗原肽對(duì)蛋白酶降解的抗性，延長(zhǎng)分子的體內(nèi)半衰期，增加其在抗原遞呈細(xì)胞上的負(fù)載量，進(jìn)而提高其誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)的能力。
本發(fā)明的乳腺癌抗原肽羧基末端或氨基末端或兩者可以是羧酸保護(hù)基團(tuán)或氨保護(hù)基團(tuán)取代的，并且優(yōu)選的保護(hù)基團(tuán)應(yīng)是有利于向細(xì)胞輸送所說肽(例如通過降低肽的親水性并提高親脂性)的基團(tuán)。另外，保護(hù)基團(tuán)應(yīng)是對(duì)肽鏈的形成條件穩(wěn)定的，同時(shí)可在不破壞正在延伸的肽鏈的情況下易于除去的。適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)包括9-芴甲基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羧基(Boc)、芐氧基羧基(Cbz)、聯(lián)苯異丙基羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧芐氧基羰基，以及2-氰基-叔丁氧羰基等。其中優(yōu)選的是9-芴甲基羰基(Fmoc)。
可以使用上述C或N末端保護(hù)基團(tuán)，按照本領(lǐng)域已知的固相肽合成技術(shù)合成本發(fā)明的雜合肽(例如參見Steward，J.M.and Young J.D.，Solid Phase PeptideSynthesis，2nd Ed.，Pierce Chemical Company，Rockford，I11.(1984))。在固相肽合成方法中，首先將C末端氨基酸連接到一個(gè)適當(dāng)?shù)墓滔噍d體或樹脂上。用于合成C末端羧基肽的的優(yōu)選的固相載體是4-羥甲基苯氧甲基-共聚(苯乙烯-1％二乙烯苯)。用于C末端酰胺的優(yōu)選固相載體是4-(2′，4′-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧乙酰胺乙基樹脂(Apllied Biosystem Co.)?？山柚鶱，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N，N′-二異丙基碳二亞胺(DIC)或2-(1-氫-1-苯并三唑基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸(HBTU)使C末端氨基酸偶聯(lián)到樹脂上(50-100℃，在二氯甲烷或DMF溶劑中反應(yīng)1至24小時(shí))。當(dāng)固相載體是4-(2′，4′-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧乙酰胺乙基樹脂時(shí)，應(yīng)在與上述C末端氨基酸偶聯(lián)之前用哌啶等仲胺將Fmoc基團(tuán)裂解掉。可以使用鄰苯三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸(HBTU，1當(dāng)量)在DFM中與去保護(hù)的4-(2′，4′-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧乙酰胺乙基樹脂偶聯(lián)。
當(dāng)固相合成結(jié)束時(shí)，可以用裂解試劑(例如苯甲硫醚、水、乙二硫醇及三氟乙酸)處理樹脂結(jié)合的多肽，以從樹脂上去掉合成的肽并使之去保護(hù)。如果肽的C末端是烷基酰胺，可以用烷基胺進(jìn)行氨解以裂解出樹脂。或者，可以用乙醇進(jìn)行轉(zhuǎn)酯處理以去除結(jié)合的肽，然后再進(jìn)行氨解或直接進(jìn)行轉(zhuǎn)酰胺基處理。
可以使用離子交換層析、親水吸附層析、硅膠吸附層析、分配層析、高效液相層析(HPLC)，特別是反相HPLC等一系列層析步驟純化完全去保護(hù)的合成肽。
合成肽被純化后，可使用配有120A分析儀的Applied biosystems 477A型蛋白質(zhì)序列儀，以自動(dòng)Edman化學(xué)法分析純化的肽的氨基酸序列，并可使用激光解吸質(zhì)譜法測(cè)定各個(gè)肽序列的分子質(zhì)量。
不同等位基因的MHC-I類分子結(jié)合具有不同氨基酸序列的多肽，并且這些氨基酸的變化主要局限在多肽的氨基末端，也就是說，多肽氨基末端的氨基酸殘基限定了特定MHC分子識(shí)別的性質(zhì)(Bjorkman PJ et al，Ann Rev Bioche，59253-288，1990)。因此，在不改變抗原肽的氨基末端，即不改變與MHC-I類分子結(jié)合的前提下，我們改變合成多肽的羧基末端氨基酸(包括將P42-50的羧基末端殘基L-Leu替換為D-Leu，P782-790的羧基末端殘基L-Ser替換為D-Ser)，合成了具有局部手性特征的多肽D-P42-50和D-P782-790。這樣，便可在增強(qiáng)分子的體內(nèi)穩(wěn)定性及在抗原遞呈細(xì)胞表面上的結(jié)合的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高其免疫原性。
本發(fā)明中，我們采用Fmoc固相多肽合成策略，共合成了包括L-P42-50(相當(dāng)于her2/neu蛋白第42-50位氨基酸的野生型抗原九肽)，D-P42-50(相當(dāng)于her2/neu蛋白第42-50位氨基酸并至少包括一個(gè)D型氨基酸取代的抗原九肽)，L-P782-790(相當(dāng)于her2/neu蛋白第782-790位氨基酸的野生型抗原九肽)和D-P782-790(相當(dāng)于her2/neu蛋白第782-790位氨基酸并至少包括一個(gè)D型氨基酸取代的抗原九肽)在內(nèi)的四種抗原肽。合成過程結(jié)束后，利用中壓反相液相層析法對(duì)合成的粗肽進(jìn)行純化并分析。結(jié)果顯示，肽L-P42-50和D-P42-50的純度分別為99.2％及98.9％，L-P782-790和D-P782-790的純度分別為99.1％和99.0％。利用解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定各色譜峰的分子量，經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)及凍干獲得純品肽，結(jié)果可見L-P42-50和D-P42-50總產(chǎn)率分別為63％和45％，L-P782-790和D-P782-790總產(chǎn)率分別為58％和46％。
經(jīng)體外細(xì)胞學(xué)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明的修飾的抗原肽可有效地促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和乳腺癌特異性CTL的增殖，激發(fā)免疫系統(tǒng)對(duì)瘤細(xì)胞的殺傷活性，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。特別是我們的比較實(shí)驗(yàn)顯示，與野生型序列相比，本發(fā)明修飾的抗原肽能夠更有效地促進(jìn)T細(xì)胞的增殖，提高T細(xì)胞分泌IFN-γ的能力，從而增加CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。
可以將本發(fā)明的抗原肽制成無機(jī)酸或有機(jī)酸鹽，這些鹽包括但不只限于鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無機(jī)酸鹽，以及乙酸鹽、海藻酸鹽、檸檬酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、乳酸鹽、草酸鹽、酒石酸鹽等有機(jī)酸鹽，從而可得到水或油溶性的或可分散的疫苗或藥物制劑。
可以將假單胞菌外毒素(PE40或PE60)、白喉內(nèi)毒素、蓖麻毒素或霍亂毒素等細(xì)胞毒性劑連接到本發(fā)明的雜合肽或其片段上，從而提供一種能夠定向破壞或殺傷與本發(fā)明的抗原肽結(jié)合的細(xì)胞的手段?？梢允顾f的與細(xì)胞毒性劑連接的肽最大可能的達(dá)到預(yù)定部分。例如可通過插管使蓖麻毒素連接的高親合性抗原肽片段直接被遞送到靶位點(diǎn)，或進(jìn)入通向靶位點(diǎn)的血管內(nèi)。或者，也可以將本發(fā)明的合成的免疫原性肽化學(xué)偶聯(lián)到大分子載體蛋白質(zhì)例如白蛋白或戚孔鑰蛋白分子上，以誘導(dǎo)增強(qiáng)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。
可以按照醫(yī)藥工業(yè)中已知的方法(如參見Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.1990)，將本發(fā)明的抗原肽與一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體、賦形劑和/或免疫增強(qiáng)劑相混合，制成適于各種胃腸道外途徑(例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、器官內(nèi)以及皮內(nèi)、皮下等途徑)給藥的各種不同劑型的疫苗或藥物組合物。醫(yī)藥上可接受的載體包括無毒性的并且對(duì)活性成分沒有干擾作用的液體填充劑或稀釋劑。所說的免疫增強(qiáng)劑可以是完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑。
這里應(yīng)特別指出的是，為了更有效地誘導(dǎo)腫瘤特別是乳腺癌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，本發(fā)明的免疫原性肽疫苗或藥物組合物中最好還包含一種或多種選自白介素2、γ干擾素和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的細(xì)胞因子。
為了經(jīng)所說的胃腸道外給藥，可將本發(fā)明的免疫原性肽溶解在水、鹽水、右旋糖溶液、乙醇或油中制成溶液或懸浮液。所使用的載體也可以包括防腐劑、混懸劑、增溶劑、緩沖劑等其他成分。
本發(fā)明的藥物或疫苗組合物的給藥劑量一般為0.0001至200mg/kg/天，每天可以以亞劑量形式分幾次給藥。但確切的用藥劑量應(yīng)根據(jù)待治療疾病的性質(zhì)、疾病嚴(yán)重程度、病人的年齡和身體一般狀況，以及給藥途徑等因素由臨床醫(yī)生決定。
本發(fā)明的抗原肽或其疫苗或藥物組合物可用于預(yù)防或治療原發(fā)或轉(zhuǎn)移的各種實(shí)體瘤特別是乳腺腫瘤。當(dāng)用于預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí)，可單獨(dú)或與腫瘤放療或化療聯(lián)合使用。例如可在實(shí)體瘤放射治療后，聯(lián)合使用本發(fā)明的肽化合物和一種或幾種常規(guī)腫瘤化療藥物?；蛘?，在經(jīng)過手術(shù)、放療及化療后，繼續(xù)使用本發(fā)明的肽化合物，以清除體內(nèi)可能存在的微小腫瘤轉(zhuǎn)移灶，或穩(wěn)定并抑制任何殘存的原發(fā)乳腺腫瘤。
實(shí)施例實(shí)施例1本發(fā)明腫瘤特異性抗原肽的合成基本上按照已知的方法，使用Advenced ChemTech 90型肽合成儀分別合成具有SEG ID NO1和SEG ID NO2所示氨基酸序列的九肽，即D-P42-50和D-P782-790，同時(shí)分別合成序列中不包括D型氨基酸的相應(yīng)野生型九肽，即L-P42-50和L-P782-790。
為此，首先稱取固相樹脂(Wang Resin-Val-Fmoc樹脂和Wang Resin-Leu-Fmoc樹脂各0.3mmol)，并用二氯甲烷(DMF)充分溶漲。然后使用DIC和HOBt做偶聯(lián)劑，在DMF溶劑中重復(fù)下列合成循環(huán)步驟，依次加入上述肽片段中所示的氨基酸1、首先用含20％哌啶的DMF洗滌(5分鐘)反應(yīng)器中的Fmoc-氨基酸；2、使用溶于DMF中的20％哌啶再次處理25分鐘，以從氨基酸功能集團(tuán)上除去Fmoc保護(hù)基團(tuán)；3、用DMF洗2次，每次2分鐘；4、使用甲醇(MeOH)洗1次，共2分鐘；5、再次用DMF洗2次，每次2分鐘；6、在DIC和HOBt偶聯(lián)劑的存在下，加入相當(dāng)于樹脂氨基3倍量的被保護(hù)的氨基酸，室溫下反應(yīng)1小時(shí)；7、用DMF洗2次，每次2分鐘；8、使用甲醇(MeOH)洗1次，共2分鐘；9、再次用DMF洗2次，每次2分鐘。
合成完成后，用四氫呋喃(THF)洗樹脂(5分鐘)以除去DMF，然后在氬氣和氮?dú)猸h(huán)境下風(fēng)干樹脂，從而得到樹脂結(jié)合的肽。
將樹脂結(jié)合的肽與預(yù)制備(-5至-10℃保存)的裂解試劑(三氟乙酸∶水∶苯酚∶以二硫醚∶茴香硫醚＝82.5∶5∶5∶2.5∶5)的混合物于大約0℃下攪拌約15分鐘，再于室溫下繼續(xù)攪拌約120分鐘。然后濾出樹脂并用純凈的三氟乙酸淋洗。將濾出并洗過的樹脂按每份0.5ml加到含有約8ml二乙醚的離心管內(nèi)，離心所得到的懸浮液后，除去上清?？啥啻沃貜?fù)該過程直到所有的肽均被沉淀出來。用乙醚洗沉淀的濾液，然后風(fēng)干并冷凍干燥之。
裂解完成后，使用Sephasil peptide C18柱以HPLC方法純化如上得到的粗肽(用5-100％乙腈梯度經(jīng)60分鐘洗脫)(結(jié)果參見圖1和2)，然后冷凍干燥如此純化的肽。將所得到的肽用0.1％三氯乙酸溶解后，用解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀測(cè)定分子量(結(jié)果參見圖3和4)。
為了最終制得本發(fā)明的疫苗組合物，可預(yù)先或使用前臨時(shí)在所說的抗原肽疫苗中加入適當(dāng)濃度的免疫佐劑(例如完全或不完全弗氏佐劑)，和/或細(xì)胞因子(例如白介素2、γ干擾素和/或粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子)。
實(shí)施例2本發(fā)明的疫苗組合物對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力和特異性CTL殺傷活性的影響本實(shí)施例使用接種了乳腺癌細(xì)胞D2F2(轉(zhuǎn)染了人HER2/neu全長(zhǎng)度cDNA的細(xì)胞系，由Wei-Zen Wei博士惠贈(zèng))的純系小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別觀察本發(fā)明的免疫原性肽或其疫苗組合物對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力和特異性CTL殺傷活性的影響。
選擇雌性BALB/c小鼠100只接種D2F2細(xì)胞，7天后將動(dòng)物分為10組空白對(duì)照組、GM-CSF組、L-P42-50、L-P42-50+GM-CSF組、D-P42-50、D-P42-50+GM-CSF組、L-P782-790、L-P782-790+GM-CSF組、D-P782-790和D-P782-790+GM-CSF組。每組5只動(dòng)物。每只小鼠背部免疫多肽30μg，每周一次，共兩次，并隔天皮下注射GM-CSF 300ng。
(1)小鼠脾臟重量的測(cè)定第二次免疫7天后處死動(dòng)物，無菌取脾臟并剪除脾臟周圍結(jié)締組織然后稱量脾重。結(jié)果總結(jié)于下列表1中。
表1本發(fā)明的腫瘤抗原肽對(duì)免疫小鼠脾臟重量的影響(X±SD，n＝6)
a，b與對(duì)照組相比P＜0.05；c，d與對(duì)照組相比P＜0.01；e與a組相比P＜0.05；f與b相比P＜0.05。
(2)T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)實(shí)驗(yàn)(MTT比色法)第二次免疫7天后，每組隨機(jī)選取六只小鼠，無菌取脾，用400目的鋼網(wǎng)機(jī)械分離脾細(xì)胞，用含10％ RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度到2.0×106/ml，添加96孔培養(yǎng)板，每孔0.1ml(2.0×105/孔)，實(shí)驗(yàn)孔中添加合成肽(終濃度5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)，以ConA(5μg/ml)組為陽性對(duì)照，空白培養(yǎng)液組為陰性對(duì)照。每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔，在37℃、5％ CO2條件下培養(yǎng)72小時(shí)。之后每孔添加20μl MTT(5μg/ml)，在37℃，5％ CO2條件下培養(yǎng)4h，1000rpm離心5分鐘，吸棄上清，每孔添加二甲亞砜150μl，輕輕震蕩10分鐘以溶解紫色結(jié)晶沉淀。然后在波長(zhǎng)490nm測(cè)定吸光值并計(jì)算各孔的平均OD值和刺激指數(shù)SI。結(jié)果如下列表2所示。
表2本發(fā)明的腫瘤抗原肽對(duì)免疫小鼠淋巴細(xì)胞增殖活性的影響(X±SD，n＝6)
a，b與對(duì)照組相比P＜0.05；c，d與對(duì)照組相比P＜0.01；e與a組相比P＜0.05；f與b相比P＜0.05。
(3)T細(xì)胞分泌IFN-γ的測(cè)定(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法，ELISPOT法)用含10μg/ml大鼠抗小鼠IFN-γ抗體的PBS包被96孔板(50μl/孔)，然后4℃過夜。用PBS洗培養(yǎng)板3次后，添加100μl含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，37℃保溫30分鐘進(jìn)行封閉。棄去封閉液并用PBS洗培養(yǎng)板3次后，將50μl(2×107/ml)脾細(xì)胞添加到96孔培養(yǎng)板中(每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔)，然后每孔加入50μl本發(fā)明的合成肽(10μg/ml)，于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)72小時(shí)。陽性對(duì)照孔添加ConA(終濃度5μg/ml)，陰性對(duì)照孔添加50μl 10％胎牛血清。反應(yīng)后用PBS洗培養(yǎng)板3次并添加50μl(5μg/ml)酶標(biāo)記的抗IFN-γ第二抗體，4℃過夜。用PBS洗板3次，每孔添加100μl含0.1％堿性磷酸酶的PBS溶液，37℃保溫1小時(shí)。用PBS洗板3次，添加50μl含140μg/ml的BCIP凝膠溶液，室溫反應(yīng)30分鐘，產(chǎn)生藍(lán)色斑點(diǎn)。然后常規(guī)相差顯微鏡計(jì)算斑點(diǎn)個(gè)數(shù)。結(jié)果如下列表3所示。
表3本發(fā)明的腫瘤抗原肽對(duì)免疫小鼠T細(xì)胞分泌IFN-γ的影響(X±SD，n＝6)
a，b與對(duì)照組相比P＜0.05；c，d與對(duì)照組相比P＜0.01；e與a組相比P＜0.05；f與b相比P＜0.05。
(4)特異性CTL檢測(cè)(細(xì)胞毒性T細(xì)胞顆粒酶釋放法)第二次免疫后7天，處死動(dòng)物分離脾臟并制備脾細(xì)胞懸液(20×107/ml)。取1ml懸液加入在培養(yǎng)板中混入本發(fā)明的抗原肽(5μg/ml)和IL-2(終濃度10U/ml)，37℃和5％CO2條件下培養(yǎng)8天得到效應(yīng)細(xì)胞。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔中添加50μl含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液得到效應(yīng)CTL細(xì)胞懸液(2×106/ml)。在檢測(cè)孔(E)中按不同的效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞比例(E∶T)(40∶1，20∶1，10∶1)添加50μl D2F2細(xì)胞(50μl)。同時(shí)在酶總釋放對(duì)照孔(R)中添加40μl完全培養(yǎng)液和10μl 1％TritonX-100，在空白對(duì)照孔(B)中添加完全培養(yǎng)液(50μl)。每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)板置37℃和5％CO2條件下培養(yǎng)。4小時(shí)后，1100rpm離心5分鐘。然后吸取50μl培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)入試管中，添加950μl臨時(shí)配制的BLT底物應(yīng)用液。37℃水浴20分鐘后將試管置于冰浴中，立即添加PMSF(為一種不可逆的絲氨酸酯酶抑制劑)10μl(終濃度0.05mol/L)。然后于412nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，計(jì)算本發(fā)明的腫瘤抗原肽誘導(dǎo)的特異性CTL的活性。結(jié)果如下列表4所示。
表4本發(fā)明的腫瘤抗原肽對(duì)免疫小鼠CTL殺傷率的影響(％)(X±SD，n＝6)
a，b與對(duì)照組相比P＜0.05；c，d與對(duì)照組相比P＜0.01；e與a組相比P＜0.05；f與b相比P＜0.05。
由以上表1-4所示的結(jié)果可以看出，與陰性對(duì)照組相比，無論是天然野生型HER2/neu抗原表位肽(L-P42-50和L-P782-790)還是本發(fā)明修飾的新的HER2/neu抗原表位肽(D-P42-50和D-P782-790)分別與GM-CSF聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，均可促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、增加IFN-γ分泌性T淋巴細(xì)胞數(shù)目，并特異地殺傷D2F2乳腺癌細(xì)胞。而在GM-CSF的存在下，本發(fā)明修飾的HER2/neu抗原表位肽即D-P42-50和D-P782-790分別表現(xiàn)出比天然野生型HER2/neu抗原表位肽具有更為顯著的誘導(dǎo)抗腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力，例如具有更顯著的促T細(xì)胞增殖活性、促T細(xì)胞分泌活性和特異性CTL激活活性等。這是由于本發(fā)明修飾的腫瘤抗原肽D-P42-50和D-P782-790的分子局部被賦予了手性特征，具有了不同于其天然母體HER2/neu肽的結(jié)構(gòu)特征，在一定程度上提高了免疫原性，從而使其更能夠有效地誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL的生成和釋放。
實(shí)施例3本發(fā)明的腫瘤抗原肽疫苗的體內(nèi)抑瘤活性本實(shí)施例使用接種了D2F2乳腺癌細(xì)胞(為轉(zhuǎn)染了人HER2/neu全長(zhǎng)度cDNA的細(xì)胞系)的純系小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察本發(fā)明的疫苗組合物對(duì)荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的的影響。
基本上按照實(shí)施例2的方法制備腫瘤動(dòng)物模型并分組，于接種腫瘤細(xì)胞后21天處死動(dòng)物并測(cè)量腫瘤重量、抑瘤率和腫瘤體積。結(jié)果如表5和附圖5所示。另外，實(shí)驗(yàn)中還切除腫瘤組織進(jìn)行了病理組織學(xué)檢查(結(jié)果未示出)。
表5本發(fā)明的腫瘤抗原肽對(duì)小鼠D2F2乳腺腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用(X±SD，n＝6)
a，b與對(duì)照組相比P＜0.05；c，d與對(duì)照組相比P＜0.01；e與a組相比P＜0.05；f與b相比P＜0.05。
由以上表5和附圖5所示的結(jié)果可以看出，無論是天然野生型HER2/neu抗原表位肽(L-P42-50和L-P782-790)還是本發(fā)明修飾的新的HER2/neu抗原表位肽(D-P42-50和D-P782-790)，當(dāng)將它們分別與GM-CSF聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，均可使腫瘤的重量和體積明顯低于對(duì)照組。而且，在GM-CSF的存在下，本發(fā)明修飾的HER2/neu抗原表位肽即D-P42-50和D-P782-790分別表現(xiàn)出比天然野生型HER2/neu抗原表位肽具有更為顯著的體內(nèi)抗腫瘤免疫的活性和抑制腫瘤生長(zhǎng)的的能力。
病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明修飾的新的HER2/neu抗原表位肽(D-P42-50和D-P782-790)分別與GM-CSF聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可見腫瘤組織中央界限清楚、有大面積的壞死灶，細(xì)胞胞漿紅染，細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失。但組織結(jié)構(gòu)的輪廓依然保存、核染色質(zhì)崩解為小碎片并見有核膜破裂。(參見附圖6和7)。
進(jìn)一步的腫瘤組織細(xì)胞透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察可見，本發(fā)明修飾的新的HER2/neu抗原表位肽(D-P42-50和D-P782-790)分別與GM-CSF聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，腫瘤細(xì)胞核不規(guī)則、核膜凹陷、異染色質(zhì)輕度增多，部分腫瘤細(xì)胞核固縮、線粒體腫脹、腫瘤細(xì)胞核不規(guī)則、胞質(zhì)深染呈凋亡早期的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。(參見附圖8和9)。
以上結(jié)果表明，與野生型(L-HER2/neu)抗原肽相比，本發(fā)明修飾的HER2/neu抗原肽能夠更有效地促進(jìn)T細(xì)胞的增殖，增加T細(xì)胞的IFN-γ分泌，進(jìn)一步提高CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。
序列表<110>吉林圣元科技有限公司<120>修飾的腫瘤抗原肽及其應(yīng)用<140>
<141>
<160>2<210>1<211>9<212>氨基酸<213>人工序列<220>
<223>合成的HER2/neu腫瘤抗原的HLA-A2限制性CTL表位(九肽)序列。
<400>1ValValGlnCysGlyGlnTyrD-LeuHis1 5<210>2<211>9<212>氨基酸<213>人工序列<220>
<223>合成的HER2/neu腫瘤抗原的HLA-A2限制性CTL表位(九肽)序列。
<400>2LeuCysIleGlyLeuLeuAryD-SerVal1 權(quán)利要求
1.基于HER2/neu序列的修飾的腫瘤抗原肽，特征在于它們分別具有如序列表中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，并且各自至少包含有一個(gè)D-型氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的腫瘤抗原肽，其中所說的肽是以化學(xué)合成方法得到的。
3.HER2/neu特異性腫瘤疫苗或藥物組合物，所說的疫苗或藥物組合物是由權(quán)利要求1的腫瘤抗原肽以及一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體組成的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的腫瘤疫苗或藥物組合物，其中還可含有選自完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑的免疫增強(qiáng)劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的腫瘤疫苗或藥物組合物，其中還可含有選自白介素2、γ干擾素和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的一種或多種細(xì)胞因子。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的腫瘤疫苗或藥物組合物在誘導(dǎo)HER2/neu特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所說的HER2/neu特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)是HER2/neu特異性細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞反應(yīng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所說的腫瘤是乳腺癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于刺激機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)的腫瘤抗原肽，特別是基于腫瘤抗原HER2/neu的修飾的手性腫瘤抗原肽，其制備方法及其在生產(chǎn)用于治療腫瘤特別是乳腺癌的藥物或疫苗中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1721436SQ200410010990
公開日2006年1月18日 申請(qǐng)日期2004年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月14日
發(fā)明者顏煒群, 王芳 申請(qǐng)人:吉林圣元科技有限責(zé)任公司