專利名稱：中藥奇可力多糖及其免疫制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用奇可力進(jìn)行提取多糖并用于抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)劑的方法。本發(fā)明涉及中藥制藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤常稱癌癥，是一組嚴(yán)重威脅人類健康的常見病、多發(fā)病。治療惡性腫瘤的方法包括外科手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療(簡(jiǎn)稱化療)?；煆?qiáng)調(diào)全身性治療而有別于適合局部腫瘤治療的外科手術(shù)和放射治療。
自從1943年Gilman等首先將氮芥應(yīng)用于淋巴瘤的治療，揭開了現(xiàn)代腫瘤化療學(xué)的序幕以來，抗惡性腫瘤藥(antineoplastic·drugs)的基礎(chǔ)和臨床研究取得長(zhǎng)足進(jìn)步，化療已從姑息性目標(biāo)向根治性目標(biāo)邁進(jìn)，約5％惡性腫瘤有可能通過化療得到治愈。然而，占惡性腫瘤90％以上的實(shí)體瘤的治療卻未能達(dá)到滿意的效果。腫瘤化療主要存在兩大障礙其一，抗惡性腫瘤藥物的毒性反應(yīng)?，F(xiàn)今臨床使用的傳統(tǒng)細(xì)胞毒類抗惡性腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性不強(qiáng)，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常的組織細(xì)胞也有不同程度的損傷。毒性反應(yīng)成為化療時(shí)藥物用量受限的關(guān)鍵因素。其二，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。化療過程中，腫瘤細(xì)胞對(duì)抗惡性腫瘤藥物產(chǎn)生不敏感現(xiàn)象即耐藥性，是腫瘤化療失敗的重要原因，亦是腫瘤化療急需解決的難題。
近年來，細(xì)胞分子生物學(xué)的進(jìn)步以及腫瘤藥理學(xué)的發(fā)展，為惡性腫瘤的藥物防治提供了不少新靶點(diǎn)，抗惡性腫瘤藥正從傳統(tǒng)的細(xì)胞毒類藥物向針對(duì)機(jī)制的多環(huán)節(jié)作用的新型抗惡性腫瘤藥物發(fā)展，如腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化劑、腫瘤細(xì)胞凋亡(apoptosis)誘導(dǎo)劑、抗腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移藥、新生血管生成抑制劑、腫瘤耐藥性逆轉(zhuǎn)劑以及腫瘤基因治療等。
奇可力(Chicory)是菊科菊苣屬(Cichoriumintgbus Linne)二至多年生草本植物，原產(chǎn)于地中海地區(qū)。在我國(guó)主要分布于中部、東北及新疆等地。目前在華北、東北等地區(qū)有大面積栽培。奇可力性喜涼，適于北方地區(qū)種植。
奇可力的主要成分為菊糖(Inulin)，它是一種多聚果糖，聚合度DP為2～60，平均為10，屬于水溶性膳食纖維。除了具有低聚糖的功能外，還能促進(jìn)人體對(duì)鈣、鎂的吸收利用，菊糖具有生物活性，它具有良好抗疲勞、提高機(jī)體免疫能力抗腫瘤療效。
技術(shù)實(shí)施方案上述奇可力多糖的制備方法，以菊苣的地下塊莖(奇可力)為原料，按下列步驟制備(1)奇可力干燥粉碎，過50-100目篩；(2)上述奇可力細(xì)粉用4～20倍量20～90％乙醇回流提取，回收乙醇并濃縮至相對(duì)密度為1.02～1.08，靜置，取消液用稀鹽酸調(diào)pH至酸性后，用醋酸乙酯萃取，合并萃取液，回收醋酸乙酯，得奇可力多糖提取物；(3)奇可力多糖減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，即得。
本發(fā)明奇可力多糖應(yīng)用在提高機(jī)體免疫能力抗腫瘤方面，可與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體(輔料)配制成藥劑。
上述藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體或輔料，例如稀釋劑、賦形劑和水等，填充劑如淀粉、糊精、蔗糖、甘露醇、乳糖，微晶纖維素等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；潤(rùn)濕劑如甘油崩解劑如甲基淀粉鈉，羥丙纖維素，交聯(lián)羧甲基纖維素，瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇、吐溫80、十二烷基硫酸鈉；吸附載缽如高嶺土和皂粘土；潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、微粉硅膠和聚乙二醇等。另外在藥劑中還可以含有其它輔劑如香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明奇可力多糖藥劑可通過口服、直腸或腸胃外給藥的方式施用于患者。用于口服時(shí)，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、膠囊、粉劑、顆粒劑等，制成液體制劑如水或油懸浮劑其它液體制劑如糖漿、合劑、酏劑等；用于腸胃外給藥時(shí)，可將其制成注射用的溶液、粉針、水或油性懸浮劑等。本發(fā)明優(yōu)選的形式是片劑、包衣片劑、膠囊、顆粒劑、合劑和粉針、注射液。
本發(fā)明的奇可力多糖及其藥劑的施用量可根據(jù)用藥途徑、患者年齡、體重、所治療的疾病的類型和嚴(yán)重程度等變化，其日劑量以奇可力多糖計(jì)算可以是1mg/kg～600mg/kg體重，優(yōu)選5mg/kg～400mg/kg體重?？梢砸淮位蚨啻问┯?。
本發(fā)明奇可力多糖應(yīng)用于提高機(jī)體免疫能力抗腫瘤方面，療效確切，無毒副作用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1奇可力多糖的制備①取奇可力15kg，用8倍量75％乙醇回流提取二次，每次回流提取1小時(shí)，過濾，合并濾液，回收盡乙醇，并濃縮至相對(duì)密度為1.02～1.08，靜置，過濾，高速離心，用稀鹽酸調(diào)pH至2～3，用6倍量濃縮液體積的醋酸乙酯萃取，合并萃取液，回收醋酸乙酯即得奇可力多糖提取物。②將奇可力多糖提取物，減壓干燥，粉碎，過80目篩，即得本發(fā)明奇可力多糖。
實(shí)施例2奇可力多糖粉針劑的制備實(shí)施例1奇可力多糖 15克甘露醇20克取實(shí)施例1奇可力多糖，置適宜容器中，加注射用水約900ml，加入甘露醇攪拌均勻，再加注射用水至1000ml，用0.22um的微孔濾膜過濾，在無菌條件下，灌裝于西林瓶中，部分塞上丁橡膠塞，裝盤，冷凍干燥。凍干結(jié)束后壓塞、壓蓋即得。
實(shí)施例3奇可力多糖注射液液的制備實(shí)施例1奇可力多糖15g吐溫-80 1ml注射用水 加至1000mt取實(shí)施例1奇可力多糖，用900ml注射用水溶解，再用1％的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至6～7，加1ml吐溫-80，補(bǔ)加注射用水至1000ml，靜置，用0.22um微孔濾膜過濾，灌封，流通蒸汽滅菌，即得。
實(shí)施例4奇可力多糖膠囊劑的制備實(shí)施例1奇可力多糖600g糊精 350g羧甲基纖維素鈉 50g硬脂酸鎂 15g取實(shí)施例1奇可力多糖、糊精、羧甲基纖維素鈉、硬脂酸鎂混合均勻，過80目篩，用干式制粒機(jī)制粒，用60目篩整粒，灌于膠囊中，即得。
以上實(shí)施例僅為了對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，而本發(fā)明的范圍不受所舉實(shí)施例的局限。
本發(fā)明提供的多糖是一種新型的抗腫瘤免疫作用新藥，為證明其治療抗腫瘤作用效果，發(fā)明者使用按上述實(shí)施例1中提供的方法制備得到的多糖，進(jìn)行了藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果如下三批奇可力多糖抗腫瘤作用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果摘要三批奇可力多糖灌胃給藥對(duì)肉瘤(S180)、肝癌(Hep)、、胃癌(MFC)細(xì)胞荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)具有明顯的抑瘤作用，其中對(duì)S180作用顯著，較低劑量即可顯示明顯作用；延長(zhǎng)S180荷瘤鼠生存時(shí)間；同時(shí)可增加吞噬指數(shù)a、廓清指數(shù)k及胸腺系數(shù)；對(duì)體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能亦有增強(qiáng)作用。
試驗(yàn)材料動(dòng)物昆明種小鼠，雌雄各半，體重18-22g。由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。質(zhì)量合格證號(hào)醫(yī)動(dòng)字第10-5107號(hào)。
藥物三批奇可力多糖(以下簡(jiǎn)稱多糖)由長(zhǎng)春市昌達(dá)天然植物開發(fā)有限公司提供，注射用環(huán)磷酰胺，由上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格200mg/支。批號(hào)990905。RPMI1640由Hyclone公司提供；ConA由Sigma公司生產(chǎn)。
腫瘤細(xì)胞株肉瘤(S180)、肝癌(Hep)、胃癌(MFC)由本室常規(guī)傳代培養(yǎng)。
試驗(yàn)與結(jié)果1、多糖對(duì)S180肉瘤的抑制作用[1]無菌條件下取接種第7天S180瘤源動(dòng)物的腹水，加無菌生理鹽水稀釋，使其濃度為1×107個(gè)活癌細(xì)胞/ml，取50只小鼠，雌雄各半，每只小鼠右前肢腋下皮下接種0.2ml，約含2×106個(gè)活瘤細(xì)胞。接種后次日將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成五組，空白對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組及給藥三個(gè)劑量組，劑量分別為2.0g/kg、1.0g/kg、0.5g/kg?？瞻讓?duì)照組每日灌胃給予生理鹽水0.2ml/10g，連續(xù)給藥10天；陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射環(huán)磷酰胺30mg/kg，隔日給藥；多糖三個(gè)劑量組均為每日灌胃給藥，連續(xù)10天。荷瘤小鼠停藥后次日將動(dòng)物處死，解剖皮下瘤塊并稱重，分別計(jì)算各組的平均瘤重，計(jì)算抑瘤率。發(fā)酵生產(chǎn)的三批多糖重復(fù)試驗(yàn)。
抑瘤率＝(空白對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重)/空白對(duì)照組瘤重×100％結(jié)果見表1。
表1多糖對(duì)小鼠S180的抑制作用(x±SD，n＝10)

注與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
由表1結(jié)果可見，在三批抑瘤試驗(yàn)中，多糖對(duì)S180荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)呈現(xiàn)出明顯的抑制作用。各次換瘤試驗(yàn)抑瘤率均體現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。實(shí)驗(yàn)中亦觀察到環(huán)磷酰胺對(duì)S180有顯著的抑瘤作用。
2、多糖對(duì)肝癌的抑制作用無菌條件下取接種第7天Hep瘤源動(dòng)物的腹水，加無菌生理鹽水稀釋，使其濃度為1×107個(gè)活癌細(xì)胞/ml，取50只小鼠，雌雄各半，每只小鼠右前肢腋下皮下接種0.2ml，約含2×106個(gè)活瘤細(xì)胞。接種后次日將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成五組，空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、多糖給藥組分三個(gè)劑量組2.0g/kg、1.0g/kg、0.5g/kg?？瞻讓?duì)照組每日灌胃給蒸餾水0.2ml/10g，連續(xù)給藥10天；陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射環(huán)磷酰胺30mg/kg，隔日給藥；多糖三個(gè)劑量均為每日灌胃給藥，連續(xù)10天。荷瘤小鼠停藥后次日將動(dòng)物處死，解剖皮下瘤塊并稱重，分別計(jì)算各組的平均瘤重，計(jì)算抑瘤率。
抑瘤率＝(空白對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重)/空白對(duì)照組瘤重×100％結(jié)果見表2。
表2多糖對(duì)小鼠肝癌的抑制作用(x±SD，n＝10)

與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
由表2結(jié)果可見，多糖對(duì)肝癌荷瘤Hep小鼠腫瘤生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，其中大劑量組(2g/kg)作用較明顯，抑瘤率達(dá)41.6％，與空白組比較有顯著性差異(P＜0.05)3、多糖(第三批)對(duì)胃癌的作用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分配、荷瘤及給藥方法同2，結(jié)果見表3表3多糖對(duì)小鼠胃癌的抑瘤作用(x±SD，n＝10)

與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01.
4、多糖對(duì)S180肉瘤荷瘤小鼠免疫吞噬功能的影響[2]接種方法同上，取40只小鼠，雌雄各半，接種后次日將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成4組，空白對(duì)照組，多糖給藥組分三個(gè)劑量組1.5g/kg、0.5g/kg、0.167g/kg?？瞻讓?duì)照組每日灌胃給予生理鹽水0.2ml/10g，連續(xù)10天；多糖給藥各組每日灌胃給藥一次，連續(xù)10天。末次給藥后30min，尾靜注印度墨汁0.1ml/10g，眶后靜脈叢取血20μl，于1、5min測(cè)光密度值，并稱體重、脾重、胸腺重，計(jì)算廓清指數(shù)K及吞噬活性a。結(jié)果見表4。
表4多糖對(duì)荷瘤小鼠免疫吞噬功能的影響(x±SD，n＝10)


與空白組比較*P＜0.05，**P＜0.01.***P＜0.001由表3結(jié)果可見，多糖可增加廓清指數(shù)K及吞噬活性a，與空白組比較具有顯著性差異。
4、多糖對(duì)體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響[3]小鼠摘眼球放血處死，無菌條件下取出脾臟，置于盛有RPMI1640培養(yǎng)液的玻璃研磨器內(nèi)，研磨成單細(xì)胞懸液，經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾至離心管中，1500轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，棄上清，同樣方式洗滌細(xì)胞兩次，最后制成5×106細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液100μl加入96孔培養(yǎng)板中，再加入刀豆A(ConA)或多糖溶液100μl，使每孔最終體積200μl。37℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)，終止培養(yǎng)液前6小時(shí)加入MTT20μl，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入DMSO20μl，570nm測(cè)光密度值(OD)。結(jié)果見表5。
表5多糖對(duì)體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響(x±SD，n＝10)

注與空白組比較，*P＜0.05，與ConA組比較△P＜0.05由表5結(jié)果可見，多糖單獨(dú)使用即可促使淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，其中25μg/ml、2.5μg/ml、0.25μg/ml三個(gè)劑量組作用明顯，與空白組比較具有顯著性差異(P＜0.05)。
6、多糖體外抑瘤作用研究采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法體外藥敏試驗(yàn)。于無菌室、超凈臺(tái)中分別取S180，B16和胃癌培養(yǎng)液，進(jìn)行活細(xì)胞記數(shù)，取(2～5)×105個(gè)/ml濃度的癌細(xì)胞，加入10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液于96孔培養(yǎng)皿，100μl/孔，給予每組6孔置37℃、CO2培養(yǎng)箱孵育4h，分別加入配制好的5種濃度的多糖，使培養(yǎng)液終濃度分別為250μg/ml、25μg/ml、2.5μg/ml、0.25μg/ml和0.025μg/ml，空白對(duì)照組不加藥液，繼續(xù)培養(yǎng)48h，終止培養(yǎng)前加MTT染料，加DMSO溶解甲瓚，酶標(biāo)儀測(cè)定OD值(見表6)。
表6多糖體外抑瘤作用(x±SD，n＝10)

與空白組比較P＞0.05體外抑瘤試驗(yàn)表明，多糖在250μg/ml～0.025μg/ml劑量其間，體外無抑瘤作用(P＞0.05)。
7、多糖對(duì)S180荷瘤小鼠生命延長(zhǎng)的影響[4]取雄性小鼠100只，小鼠經(jīng)皮膚消毒后，腹腔注射接種S1800.2ml/只，癌細(xì)胞數(shù)目為2×106個(gè)，接種24h后將動(dòng)物隨機(jī)分成5組，空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組及給藥三個(gè)劑量組分別為1.5g/kg、0.5g/kg、0.167g/kg組?？瞻讓?duì)照組每日灌胃給予生理鹽水0.2ml/10g，連續(xù)給藥10天；陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射環(huán)磷酰胺30mg/kg，隔日給藥；多糖三個(gè)劑量組均為每日灌胃給藥，連續(xù)12天。觀察小鼠生存天數(shù)。
計(jì)算實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生命延長(zhǎng)率生命延長(zhǎng)率＝(給藥組平均生存天數(shù)-空白組平均生存天數(shù))/空白組平均生存天數(shù)×100％。結(jié)果見表7。
表7多糖對(duì)S180荷瘤小鼠生存期的影響(x±SD，n＝10)

與對(duì)照組比較**P＜0.01，*P＜0.05由表7結(jié)果可見。多糖各劑量組及環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組均能明顯延長(zhǎng)S180荷瘤小鼠生存的時(shí)間。
結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多糖具有明顯的抑瘤作用，灌胃給藥，可明顯抑制S180荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)S180荷瘤小鼠生存時(shí)間，與空白組比較具有顯著差異性。對(duì)肝癌、胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)亦具有一定抑制作用。多糖可增加吞噬活性a，廓清指數(shù)K及胸腺系數(shù)，對(duì)體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能亦具有增強(qiáng)作用。但多糖未表現(xiàn)明顯體外抑瘤作用，說明多糖抑瘤作用與免疫調(diào)節(jié)或增加免疫功能有關(guān)。
權(quán)利要求
1.利用奇可力提取多糖抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)劑的方法。
2.工藝流程(1)奇可力用4～20倍量20～90％乙醇回流提取，回收乙醇并濃縮至相對(duì)密度為1.02～1.08，靜置，取消液用稀鹽酸調(diào)pH至酸性后，用醋酸乙酯萃取，合并萃取液，回收醋酸乙酯，得奇可力多糖提取物；(2)奇可力多糖減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，即得。
3.上述方法得到奇可力多糖可以通過常規(guī)工藝制作成各種劑型藥物用于提高機(jī)體免疫能力抗腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開一種以菊苣的地下塊莖(奇可力)為原料，生產(chǎn)奇可力多糖抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)劑的方法。該方法為腫瘤的免疫療法提供一種新型、安全、無毒、口服有效，便于長(zhǎng)期服用的免疫增強(qiáng)劑的生產(chǎn)方法。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1742765SQ20041001107
公開日2006年3月8日 申請(qǐng)日期2004年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月1日
發(fā)明者鄭鴻雁, 魏征人, 昌友權(quán), 于樹文 申請(qǐng)人:鄭鴻雁, 魏征人, 昌友權(quán)