專利名稱：一種紅車軸草提取物及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域。具體涉及紅車軸草提取物及制備方法。
背景技術(shù)：
紅車軸草(Trifolium.Pratense.L)為豆科(Leguminosae)多年生草本植物，又名紅三葉、紅花苜蓿和合三葉草，屬車軸草屬(Trifolium.L)。我國(guó)南北各地均有栽培，是優(yōu)良飼料和牧草。紅車軸草含有黃酮類物質(zhì)、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類和維生素等成分。其中異黃酮因有植物雌激素樣作用和黃酮類物質(zhì)的抗癌作用而格外受人關(guān)注。紅車軸草中含有的異黃酮主要有鷹嘴豆芽素A(biochaninA)和B(formonetin)、染料木素(genistein)、大豆素(daidzein)等4種，這些成分是目前研究較深入的植物雌激素，對(duì)于預(yù)防乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌，改善骨質(zhì)疏松和更年期癥狀等有一定作用并越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于臨床，也使之成為一種極有前途的天然保健食品。
現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明紅車軸草的主要藥理作用有(1)選擇性抗痙攣、消炎和殺菌作用紅車軸草在體外有抑制草履蟲的作用(0.2％醇浸劑可使草履蟲于30分鐘內(nèi)停止活動(dòng))。大豆素具有類似罌粟堿樣的解除平滑肌痙攣?zhàn)饔茫蠖管占按蠖顾乜梢跃徑飧哐獕夯颊叩念^痛等癥狀。故國(guó)外民間有用其做抗瘧藥，亦有用于祛痰、解痙攣。治百日咳及支氣管炎。其花粉對(duì)某些革蘭氏陰性桿菌有抗菌作用，利用其消炎殺菌作用治療皮膚病，如濕疹、燒傷、潰瘍和牛皮癬。
(2)雌激素樣作用染料木素、鷹嘴豆芽素A和B及大豆素均有雌性激素樣作用，這可能是由于它們于己烯雌酚和雌二醇結(jié)構(gòu)相似的緣故，而它們的活性約為己烯雌酚(diethylatilbestrol)的1/10萬(wàn)，為雌二醇(estradilo)的1/2萬(wàn)～1/50(以重量計(jì))。以小鼠子宮重量作指標(biāo)，將藥粉混于飼料中喂食，比較它們的活性強(qiáng)度，認(rèn)為大豆素的作用最強(qiáng)，染料木素與鷹嘴豆芽素A，而鷹嘴豆芽素B為最差。紅車軸草作為一植物雌激素有其獨(dú)到之處它們幾乎能分布到人體每個(gè)細(xì)胞中發(fā)揮作用，當(dāng)人體雌激素水平高時(shí)，可抑制激素分泌，因它能與雌激素受體結(jié)合，從而阻止了人體自身激素的結(jié)合。反之，當(dāng)人體雌激素水平低時(shí)，它們能提供額外的雌激素樣作用。正因如此，紅車軸草在臨床上即被用來(lái)治療婦女體內(nèi)雌激素水平升高的經(jīng)前期綜合癥，又被用于治療雌激素降低時(shí)的更年期綜合癥和絕經(jīng)。另外，紅車軸草也能治療雌激素病如子宮肌瘤。子宮內(nèi)膜異位及骨質(zhì)疏松癥等。
(3)抗癌作用紅車軸草含高濃度異黃酮等黃酮類物質(zhì)，它被認(rèn)為是一種潛在抗癌物質(zhì)。美國(guó)國(guó)家癌癥中心于1996年將燃料木素列入腫瘤預(yù)防藥物臨床發(fā)展計(jì)劃中，主要預(yù)防目標(biāo)是前列腺癌和乳腺癌。乳腺癌病人血漿中雌激素偏高，植物雌激素對(duì)其有拮抗作用。從而抑制乳腺癌。實(shí)驗(yàn)表明異黃酮類物質(zhì)為抗氧化劑，是自由基的強(qiáng)清除劑，故具抗癌效用。
目前國(guó)內(nèi)外對(duì)紅車軸草的研究越來(lái)越多。中國(guó)專利申請(qǐng)03118845.1公開了一種紅車軸草提取物及制劑，該提取物采用紅車軸全草醇提濃縮后的沉淀部分用酯提取獲得，盡管該專利申請(qǐng)公開的提取物總異黃酮量可達(dá)到10～85％，但未對(duì)具體活性成分加以控制，且該提取物方法繁瑣，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種質(zhì)量穩(wěn)定可靠，提取方法簡(jiǎn)便，療效確切的紅車軸草提取物。
本發(fā)明公開的紅車軸草提取物是以紅車軸全草為原料，經(jīng)醇提、純化后獲得，采用HPLC法檢測(cè)，該提取物中異黃酮苷以刺芒柄化素和染料木素的含量之和計(jì)不小于12.0％。
本發(fā)明所要解決的另以技術(shù)問(wèn)題在于公開上述提取物的制備方法。
本發(fā)明紅車軸草提取物的制備方法包括下列步驟取紅車軸全草，粉碎，用乙醇加熱回流提取，合并提取液，濃縮回收乙醇，濃縮液上大孔吸附樹脂柱，依次用水及不同濃度的乙醇洗脫，收集相應(yīng)的洗脫液，回收乙醇，干燥，即得。
其中所述用于提取和洗脫的乙醇濃度為5～95％v/v，純化使用的大孔吸附樹脂選自苯乙烯型或2-甲基丙烯酸酯型的大孔吸附樹脂。
紅車軸草含有黃酮類物質(zhì)、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類和維生素等成分，其中含有的異黃酮主要有鷹嘴豆芽素A(biochaninA)和B(formonetin)、染料木素(genistein)、大豆素(daidzein)等4種，根據(jù)紅車軸草提取物中活性成分的特性，本發(fā)明確定了紅車軸草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)及控制方法。
本發(fā)明確定的紅車軸草提取物的質(zhì)量控制方法內(nèi)容包括1.采用薄層層析法定性鑒別異黃酮苷；2.采用此外分光光度法測(cè)定刺芒柄化素含量，總異黃酮以刺芒柄化素C16H12O4計(jì)，不少于19.8％；3.采用高壓液相法測(cè)定刺芒柄化素和染料木素的含量，異黃酮苷以刺芒柄化素C16H12O4和染料木素C15H10O5的含量之和計(jì)，不少于12.0％。
本發(fā)明所要解決的再一技術(shù)問(wèn)題在于公開上述紅車軸草提取物在制備治療骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明紅車軸草提取物可與藥用輔料制成各種醫(yī)學(xué)上可接受的藥物制劑，特別適用于治療和預(yù)防由于雌激素水平低下引起的骨質(zhì)疏松。
用本發(fā)明紅車軸草提取物對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的防治作用進(jìn)行研究1.受試藥物1.1.名稱紅車軸草提取物1.2.提供單位上海市中藥研究所植化室1.3.配制方法按5∶3的比例(重量比)，稱取一定量的紅車軸草提取物和藥用淀粉，然后把兩者放在研缽內(nèi)研勻，再用0.5％的CMC配制成所需濃度的混懸液。
1.4.溶劑0.5％的CMC2.對(duì)照品陰性對(duì)照0.5％CMC陽(yáng)性對(duì)照尼爾雌醇3.動(dòng)物3.1.來(lái)源、種屬SD雄性大鼠，由上海西普爾—必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)滬動(dòng)合證字152號(hào)。
3.2.體重240～260g4.劑量4.1.劑量設(shè)置按異黃酮計(jì) 低劑量200mg/kg中劑量400mg/kg高劑量800mg/kg4.2.每只動(dòng)物的給藥體積1ml/100g體重(每周按體重變化調(diào)整)5.給藥途徑灌胃6.實(shí)驗(yàn)方法6.1.分組及給藥60只雌性大鼠，其中50只乙醚麻醉后，按常規(guī)方法切除雙側(cè)卵巢，剩下的10只大鼠做相同的手術(shù)操作，但不切除卵巢，作為假手術(shù)組(Sham)。將切除卵巢的大鼠分為模型對(duì)照組(OXV)、尼爾雌醇組(E3)和紅車軸草提取物(RC，高、中、低)等5組，在手術(shù)后第10天開始灌胃給藥，給藥體積均為1ml/100g體重，每周按體重調(diào)整給藥量，高、中、低劑量組分別每天給予200、400和800mg/kg的RC提取物，Sham和OVX組每天給予0.5％CMC，E3組給予2mg/kg的尼爾雌醇，每周一次，連續(xù)給藥三個(gè)月。
6.2.骨密度測(cè)定和股骨相對(duì)體積質(zhì)量測(cè)定給藥結(jié)束后，處死大鼠，分離雙側(cè)股骨，剔凈附著的肌肉和結(jié)締組織，稱取左側(cè)股骨的濕重，并在自制的排水法體積測(cè)定裝置上測(cè)定其體積，計(jì)算相對(duì)體積質(zhì)量值；測(cè)定右側(cè)股骨的骨密度。
6.3.子宮重量系數(shù)測(cè)定取出子宮，輕擠出子宮腔內(nèi)的液體，然后稱取重量，它和自身的體重之比即為子宮重量系數(shù)。
6.4.統(tǒng)計(jì)方法所有計(jì)量結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，并進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。
7.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、2。
雌性大鼠切除卵巢后，體重增加長(zhǎng)加快，子宮重量減輕，骨密度降低，與模型對(duì)照組相比，尼爾雌醇組和紅車軸草提取物組的體重增加值減小，子宮重量系數(shù)值升高，骨密度增加，但股骨相對(duì)體積質(zhì)量值變化不明顯。
表1 RC對(duì)去卵巢大鼠體重增長(zhǎng)百分率和子宮重量的影響

與OVX組比較*P＜0.05***P＜0.001；與Sham組比較###P＜0.001表2 RC對(duì)去卵巢大鼠骨密度的影響


與OVX組比較*P＜0.05；與Sham組比較###P＜0.0018.討論卵巢是產(chǎn)生雌激素的重要器官，女性到了更年期以后，由于卵巢功能的減退，導(dǎo)致體內(nèi)雌激素水平急劇下降，從而產(chǎn)生一些包括肥胖、盜汗、心煩、失眠和骨質(zhì)疏松等在內(nèi)的綜合癥，針對(duì)這一情況，臨床上主要以補(bǔ)充雌激素為主的方法。目前臨床上使用的雌激素大多通過(guò)合成而來(lái)，文獻(xiàn)報(bào)道，長(zhǎng)期應(yīng)用此類雌激素，具有產(chǎn)生子宮癌和乳腺癌的危險(xiǎn)，而應(yīng)用從天然植物中提取的雌激素類產(chǎn)物，能減少這一危險(xiǎn)性的發(fā)生，這引起了人們的極大關(guān)注，越來(lái)越多的人開始從事這方面的研究。
紅車軸草是豆科車軸草屬植物，文獻(xiàn)報(bào)道它富含異黃酮類化合物，這是一類植物雌激素類成分，近年來(lái)，對(duì)植物雌激素的研究報(bào)道很多，表明它具有弱雌激素樣的生物活性，對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松具有一定的預(yù)防作用。本發(fā)明采用切除雌性大鼠卵巢的方法模擬女性更年期后的情況，研究了紅車軸草提取物對(duì)大鼠骨密度和子宮重量的影響作用；結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅車軸草提取物對(duì)雌激素水平低下引起的肥胖、子宮萎縮和骨密度降低有一定對(duì)抗作用，這種作用可能和它的雌激素樣活性有關(guān)，詳細(xì)作用機(jī)理有待于作進(jìn)一步的研究。
9.結(jié)論綜上所述，可以得出以下結(jié)論紅車軸草提取物具有弱雌激素樣作用，對(duì)去卵巢引起的大鼠骨質(zhì)疏松癥具有一定的防治作用。
本發(fā)明紅車軸草提取物制備簡(jiǎn)單且質(zhì)量控制方法完善，保證了提取物所制備的制劑劑量準(zhǔn)確，療效可靠，特別適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1 紅車軸草提取物薄層色譜圖樣品1.供試品20030529-1
2.供試品20030529-23.供試品20030529-34.刺芒柄花素、染料木素混和對(duì)照品5.刺芒柄花素對(duì)照品6.染料木素對(duì)照品圖2刺芒柄花素標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝5194.6x+25.788R＝0.999914圖3染料木素標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝5440x+48.709R＝0.999具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 紅車軸草質(zhì)量檢測(cè)方法的建立一.鑒別參照黃酮苷元的鑒別方法，取本品25mg，加70％乙醇溶液5ml，搖勻，作為供試品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液和正文[含量測(cè)定]項(xiàng)下的異黃銅苷對(duì)照品溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以氯仿-丙酮-甲酸(10∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；硅膠G薄層板上，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，未顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。
二.紫外分光光度法測(cè)定紅車軸草提取物中總異黃酮的含量1.材料與儀器島津UV-2401紫外分光光度儀、刺芒柄化素對(duì)照品(陜西慧科植物開發(fā)有限公司提供，純度90％)，樣品紅車軸草提取物(批號(hào)20021213、20030529-1、20030529-2、20030529-3)、試劑均為AR級(jí)。
2.標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)異黃酮的性質(zhì)，選用刺芒柄化素作為測(cè)定總異黃酮的對(duì)照品。
精密稱取刺芒柄化素對(duì)照品5.2mg，置50ml量瓶中，用水飽和的正丁醇溶解并稀釋至刻度，精密吸取上述溶液0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml和5.0ml，分別置25ml量瓶中，各加70％乙醇至刻度，搖勻。照分光光度法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VB)，分別在249.5nm的波長(zhǎng)處依法測(cè)定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程y＝0.0053+1.9524x(r＝0.9999)，樣品在0mg～0.52mg之間有良好的線性關(guān)系。
3.供試品純化方法考察選擇批號(hào)為20021213的樣品作為方法學(xué)研究；參考異黃酮的提取、分離方法，選用氧化鋁層析作為純化方法。
氧化鋁用量取供試品45mg，精密稱定，加5ml水飽和的正丁醇使溶解，加于不同用量的中性氧化鋁柱(100～120目，內(nèi)徑15mm)上，用水飽和正丁醇洗脫，收集正丁醇洗脫液至50ml，精密吸取該溶液1ml，置25ml量瓶中，用70％乙醇稀釋至刻度，搖勻，在249.5nm處測(cè)定紫外吸收值，結(jié)果(表4)表明，氧化鋁用量14g，供試品即達(dá)到純化。根據(jù)實(shí)際操作，氧化鋁用量定為15g。
表4氧化鋁用量

4.重復(fù)性試驗(yàn)取樣品，一式5份，依正文方法測(cè)定總異黃酮，結(jié)果見(jiàn)表5。
表5重復(fù)性試驗(yàn)(n＝5)

5.回收率試驗(yàn)取樣品適量，加入一定量的刺芒柄化素對(duì)照品，依法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。
表6刺芒柄化素加樣回收率

6.樣品測(cè)定取樣品，批號(hào)(1)20030529-1、(2)20030529-2、(3)20030529-3，依法測(cè)定總異黃酮含量，結(jié)果見(jiàn)表7。
表7樣品測(cè)定

7.含量限度現(xiàn)根據(jù)三批樣品的含量數(shù)據(jù)，按平均值(28.28％)的70％，暫定本品按干燥品計(jì)算，含總異黃酮以刺芒柄化素(C16H12O4)計(jì)，不得少于19.8％。
三.高效液相色譜法測(cè)定紅車軸草中異黃酮苷的含量1.儀器與試藥安捷倫HP1100高效液相色譜儀；刺芒柄化素對(duì)照品(陜西慧科植物開發(fā)有限公司提供，純度90％)，染料木素對(duì)照品(陜西慧科植物開發(fā)有限公司提供，純度98％)；樣品紅車軸草提取物(批號(hào)20030529-1、20030529-2、20030529-3)、；試劑甲醇、乙腈(色譜級(jí))，磷酸、鹽酸(分析純)，水(重蒸去離子)。
2.色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱Kromasil C18 4.6×150mm，5um填料；柱溫25℃；流動(dòng)相乙腈-0.1％磷酸(35∶65)，流速1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。理論板數(shù)按刺芒柄化素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。
3.線性關(guān)系分別精密稱取刺芒柄化素、染料木素對(duì)照品適量，加甲醇-乙腈(1∶1)制成每1ml各含0.25mg、0.13mg的對(duì)照品混合溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液1μl，2μl，5μl，8μl，10μl，12μl，15μl進(jìn)樣(n＝3)，分別以刺芒柄化素和染料木素進(jìn)樣量濃度(mg/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果(圖2、圖3)表明，刺芒柄化素在0.25～3.75μg，染料木素在0.13～1.95μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
4.樣品測(cè)定取樣品批號(hào)(1)20030529-1、(2)20030529-2、(3)20030529-3，依法測(cè)定異黃酮苷含量，結(jié)果見(jiàn)表8。
表8樣品測(cè)定

5.含量限度現(xiàn)根據(jù)三批樣品的含量數(shù)據(jù)，按平均值(17.27％)的70％，暫定本品按干燥品計(jì)算，含總異黃酮以刺芒柄化素(C16H12O4)和染料木素(C15H10O5)的含量之和計(jì)，不得少于12.0％。
四.水分測(cè)定取樣品批號(hào)(1)20030529-1、(2)20030529-2、(3)20030529-3，按中國(guó)藥典2000年版一部附錄ⅨH第一法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表9。
表9水分測(cè)定

根據(jù)三批樣品的水分?jǐn)?shù)據(jù)，按最高值(6.52％)計(jì)，暫定水分不得大于7.0％。
實(shí)施例2紅車軸草質(zhì)量控制方法本品為豆科植物紅車軸草Trifolium pratense L.的花序及帶花枝葉經(jīng)加工制成的提取物。
制法取紅車軸草，粉碎，用70％～80％的乙醇加熱回流提取，合并提取液，回收乙醇并濃縮至適量，加于已處理好的大孔吸附樹脂柱上，依次用水及不同濃度的乙醇洗脫，收集相應(yīng)的洗脫液，回收乙醇，噴霧干燥；或回收乙醇，濃縮成稠膏，真空干燥，粉碎，即得。
性狀本品為淺棕褐色至棕褐色的粉末；味微甘。
鑒別取本品25mg，加70％乙醇溶液5ml，搖勻，作為供試品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液和[含量測(cè)定]項(xiàng)下的異黃酮苷對(duì)照品溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以氯仿-丙酮-甲酸(10∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。
檢查
分水不得過(guò)7.0％(中國(guó)藥典2000年版附錄一部IXH第一法)。
重金屬不得過(guò)百萬(wàn)分之二十(中國(guó)藥典2000年版附錄一部IXE)。
熾灼殘?jiān)坏眠^(guò)0.8％(中國(guó)藥典2000年版附錄一部IXJ)。
含量測(cè)定總異黃酮對(duì)照品溶液的制備精密稱取刺芒柄化素對(duì)照品5mg，置50ml量瓶中，加水飽和的正丁醇適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1ml中含刺芒柄化素0.1mg)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取對(duì)照品溶液0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分別置25ml的量瓶中，各加70％乙醇至刻度，搖勻。照分光光度法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VB)，分別在249.5nm的波長(zhǎng)處依法測(cè)定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測(cè)定法取本品45mg，精密稱定，加5ml水飽和的正丁醇使溶解，加于中性氧化鋁柱(100～120目，15g，內(nèi)徑15mm)上，用水飽和的正丁醇洗脫，收集洗脫液50ml，搖勻。精密量取1ml，置25ml量瓶中，加70％乙醇至刻度，搖勻，在249.5nm的波長(zhǎng)處依法測(cè)定吸收度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中刺芒柄化素的重量(mg/ml)，計(jì)算，即得。
本品按干燥品計(jì)算，含總異黃酮以刺芒柄化素(C16H12O4)計(jì)，不得少于19.8％。
異黃酮苷照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VID)測(cè)定。
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.1％磷酸(35∶65)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。理論板數(shù)按刺芒柄化素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。
對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取刺芒柄化素、染料木素對(duì)照品適量，加甲醇-乙腈(1∶1)制成每1ml各含0.2mg、0.1mg的混合溶液，即得。
供試品溶液的制備取本品25mg，精密稱定，置平底燒瓶中，加甲醇20％鹽酸(1∶3)混合液40ml，置水浴中加熱回流2小時(shí)，靜置冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過(guò)，取濾液，即得。
測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
本品按干燥品計(jì)算，含異黃酮苷以刺芒柄化素(C16H12O4)和染料木素(C15H10O5)的含量之和計(jì)，不得少于12.0％。
貯藏密封，閉光。
實(shí)施例3取紅車軸草100g，粉碎，用20％的乙醇加熱回流提取3次，合并提取液，回收乙醇并濃縮至適量加于已處理好的大孔吸附樹脂柱(D101型大孔樹脂)上，依次用水及不同濃度的乙醇洗脫，收集相應(yīng)的洗脫液，回收乙醇，濃縮成稠膏，噴霧干燥，即得，總異黃酮含量20.3％，異黃酮苷以刺芒柄化素(C16H12O4)和染料木素(C15H10O5)的含量之和計(jì)為13.1％，收率6.5％。
實(shí)施例4取紅車軸草100g，粉碎，用80％的乙醇加熱回流提取3次，合并提取液，回收乙醇并濃縮至適量加于已處理好的大孔吸附樹脂柱(D101型大孔樹脂)上，依次用水及不同濃度的乙醇洗脫，收集相應(yīng)的洗脫液，回收乙醇，濃縮成稠膏，噴霧干燥，即得，總異黃酮含量28.3％，異黃酮苷以刺芒柄化素(C16H12O4)和染料木素(C15H10O5)的含量之和計(jì)為16.8％，收率2.2％
權(quán)利要求
1.一種紅車軸草提取物，其特征在于該提取物是以紅車軸全草為原料，經(jīng)醇提、純化后獲得，采用HPLC法檢測(cè)，該提取物中異黃酮苷以刺芒柄化素和染料木素的含量之和計(jì)不小于12.0％。
2.一種權(quán)利要求1所述的紅車軸草提取物的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟取紅車軸全草，粉碎，用乙醇加熱回流提取，合并提取液，濃縮回收乙醇，濃縮液上大孔吸附樹脂柱，依次用水及不同濃度的乙醇洗脫，收集相應(yīng)的洗脫液，回收乙醇，干燥，即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于其中所述用于提取和洗脫的乙醇濃度為5～95％v/v。
4.據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于其中所述純化使用的大孔吸附樹脂選自苯乙烯型或2-甲基丙烯酸酯型的大孔吸附樹脂。
5.一種權(quán)利要求1所述的紅車軸草提取物的質(zhì)量控制方法，其特征在于其中所述的質(zhì)量控制方法包括1)采用薄層層析法定性鑒別異黃酮苷；2)采用紫外分光光度法測(cè)定刺芒柄化素含量，總異黃酮以刺芒柄化素C16H12O4計(jì)，不少于19.8％；3)采用高壓液相法測(cè)定刺芒柄化素和染料木素的含量，異黃酮苷以刺芒柄化素C16H12O4和染料木素C15H10O5的含量之和計(jì)，不少于12.0％。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的質(zhì)量控制方法，其特征在于其中所述的薄層層析法定性鑒別異黃酮苷的方法為取按權(quán)利要求2制得的紅車軸草提取物25mg，加70％乙醇溶液5ml，搖勻，作為供試品溶液；照中國(guó)藥典2000年版一部附錄VI B薄層色譜法，吸取上述供試品溶液和異黃酮苷對(duì)照品溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以氯仿-丙酮-甲酸＝10∶1∶1為展開劑，展開，取出，晾干，置254nm紫外光燈下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；其中對(duì)照品溶液的制備為分別精密稱取刺芒柄化素、染料木素對(duì)照品適量，加甲醇-乙腈(1∶1)制成每1ml各含0.2mg、0.1mg的混合溶液，即得。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的質(zhì)量控制方法，其特征在于其中所述的紫外分光光度法測(cè)定總異黃酮含量方法包括對(duì)照品溶液的制備精密稱取刺芒柄化素對(duì)照品5mg，置50ml量瓶中，加水飽和的正丁醇適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得每1ml中含刺芒柄化素0.1mg；標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取對(duì)照品溶液0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分別置25ml的量瓶中，各加70％乙醇至刻度，搖勻。照中國(guó)藥典2000年版一部附錄V B分光光度法，分別在249.5nm的波長(zhǎng)處依法測(cè)定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；測(cè)定法取紅車軸草提取物45mg，精密稱定，加5ml水飽和的正丁醇使溶解，加于內(nèi)徑為15mm的100～120目15g的中性氧化鋁柱中，用水飽和的正丁醇洗脫，收集洗脫液50ml，搖勻；精密量取1ml，置25ml量瓶中，加70％乙醇至刻度，搖勻，在249.5nm的波長(zhǎng)處依法測(cè)定吸收度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中刺芒柄化素的重量mg/ml，計(jì)算，即得；按干燥品計(jì)算，含總異黃酮以刺芒柄化素C16H12O4計(jì)，不得少于19.8％。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的質(zhì)量控制方法，其特征在于其中所述的采用高壓液相法測(cè)定異黃酮苷含量的方法包括色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.1％磷酸＝35∶65為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。理論板數(shù)按刺芒柄化素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500；對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取刺芒柄化素、染料木素對(duì)照品適量，加甲醇-乙腈＝1∶1制成每1ml各含0.2mg、0.1mg的混合溶液，即得；供試品溶液的制備取紅車軸草提取物25mg，精密稱定，置平底燒瓶中，加甲醇∶20％鹽酸＝1∶3混合液40ml，置水浴中加熱回流2小時(shí)，靜置冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用孔徑為0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取濾液，即得；測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得；按干燥品計(jì)算，含異黃酮苷以刺芒柄化素C16H12O4和染料木素C15H10O5的含量之和計(jì)，不得少于12.0％。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述紅車軸草提取物在制備治療骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用，其特征在于其中所述的藥物用于治療和預(yù)防由于雌激素水平低下引起的骨質(zhì)疏松。
全文摘要
本發(fā)明涉及紅車軸草提取物及制備方法。本發(fā)明公開的紅車軸草提取物是以紅車軸全草為原料，經(jīng)醇提、純化后獲得，采用HPLC法檢測(cè)，該提取物中異黃酮苷以刺芒柄化素和染料木素的含量之和計(jì)不小于12.0％。本發(fā)明還公開了紅車軸草質(zhì)量控制方法。本發(fā)明紅車軸草提取物制備簡(jiǎn)單且質(zhì)量控制方法完善，保證了提取物所制備的制劑劑量準(zhǔn)確，療效可靠，特別適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61K31/7048GK1683381SQ20041001774
公開日2005年10月19日 申請(qǐng)日期2004年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月16日
發(fā)明者王玉芹, 周健, 法洋, 奚靜芳 申請(qǐng)人:上海市中藥研究所