專利名稱：治療肥胖癥的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子衍生物多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種用于治療肥胖癥的重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(rhCNTF)衍生物——rhCNTF(1-185)，制備純化該衍生物的方法，以及該衍生物在治療肥胖癥及神經(jīng)損傷相關(guān)疾病中的用途。
背景技術(shù)：
睫神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)分子量約為22.75kDa，包括200個氨基酸，其核苷酸序列為SEQ ID NO1，氨基酸序列為SEQ ID NO2，分子內(nèi)含一個半胱氨酸，無二硫鍵，無糖基化，在體內(nèi)以單體形式存在，等電點(diǎn)為5.78。CNTF基因位于人11號染色體長臂12區(qū)，無前體形式，無信號肽。目前認(rèn)為CNTF屬于遠(yuǎn)相關(guān)的成血細(xì)胞因子超家族的成員，與IL-6、LIF(白血病抑制因子)等結(jié)構(gòu)類似，其二級結(jié)構(gòu)富含α-螺旋結(jié)構(gòu)，高級結(jié)構(gòu)由四個α-螺旋束組成分子的骨架結(jié)構(gòu)。α-螺旋結(jié)構(gòu)為維持其生物活性所必需，而羧基端的結(jié)構(gòu)對其生物活性貢獻(xiàn)不大，α-螺旋中部D2區(qū)和A-B襻構(gòu)成受體的結(jié)合部位，D1區(qū)則形成相對保守的構(gòu)象。
CNTF受體(CNTF-Rα鏈)是目前發(fā)現(xiàn)的成血細(xì)胞因子受體超家族成員中最為保守的組合，是由372個氨基酸組成的糖蛋白。CNTF-Rα對CNTF只具有低親和力，CNTF與CNTF-Rα形成的復(fù)合物先與gp130結(jié)合，再與LIF-Rβ結(jié)合，形成高親和力受體，激活JaK-TyK，直接或間接使STAT 80/90磷酸化，激活tis-11、c-jun、c-fos等因子的轉(zhuǎn)錄。
CNTF可維持多種靶神經(jīng)元的存活、分化及成體神經(jīng)元的功能執(zhí)行，其中對腦、脊髓的運(yùn)動神經(jīng)元的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化起重要作用；還能改變多種神經(jīng)肽的表達(dá)，對神經(jīng)支配的骨骼肌有營養(yǎng)作用。
一些常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如Parkinson綜合癥、Alzheimer綜合癥、肌側(cè)索硬化癥等都與神經(jīng)營養(yǎng)因子功能受干擾有密切關(guān)系，因此利用相應(yīng)的神經(jīng)營養(yǎng)因子治療這些疾病已成為一個新的方向。但由于神經(jīng)營養(yǎng)因子均為蛋白質(zhì)，不易通過血腦屏障，故目前臨床主要在脊髓和顱運(yùn)動神經(jīng)元或外周神經(jīng)元疾病上進(jìn)行。
現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)CNTF還可用于肥胖癥的治療。CNTF與leptin有一條相同的信號傳導(dǎo)途徑，都將信號傳遞到下丘腦的海馬神經(jīng)，通過海馬神經(jīng)調(diào)節(jié)食欲，減少食物的攝取，因此CNTF也可使ob/ob肥胖小鼠體重下降。但CNTF還有另一條尚未研究清楚的信號傳導(dǎo)途徑，它對db/db突變小鼠(缺乏leptin受體)和由飼喂高脂肪食物產(chǎn)生的小鼠(DIO小鼠)都有減重的作用。所以CNTF有比leptin更廣泛的應(yīng)用前景。
肥胖是一種嚴(yán)重危害人體健康的慢性疾病。肥胖與多種疾病有關(guān)，如II型糖尿病、高血壓(進(jìn)而可導(dǎo)致心衰和中風(fēng))和高膽固醇(進(jìn)而可導(dǎo)致動脈粥樣硬化和冠狀動脈疾病)，隨著體重指數(shù)(BMI，一種評價體重的指標(biāo))的增加，患糖尿病、惡性脂肪瘤、某些癌癥、睡眠窒息癥和骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)率也顯著增加。
由于肥胖能引起多種代謝異常，是糖尿病與心血管病發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素之一，并與心血管疾患的發(fā)病率與死亡率增高有關(guān)。傳統(tǒng)上基于飲食和運(yùn)動對肥胖癥的非藥物治療的長期療效往往十分有限，促使臨床醫(yī)生不得不尋求藥物以治療肥胖癥。
國內(nèi)外對CNTF的研究主要集中在利用基因工程技術(shù)構(gòu)建CNTF突變體的高表達(dá)菌株，以提高其生物學(xué)活性，但均以包涵體形式表達(dá)，必須進(jìn)行變性和復(fù)性等過程，不適于大規(guī)模制備。
本發(fā)明的申請人發(fā)現(xiàn)了一種用于治療肥胖癥的重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(rhCNTF)衍生物——rhCNTF(1-185)，與天然CNTF相比，僅去掉了C端15個氨基酸，保持了天然CNTF的穩(wěn)定性，首次實(shí)現(xiàn)了可溶形式的表達(dá)，表達(dá)量高，穩(wěn)定性好；純化時無需變性和復(fù)性，并且在動物的藥效試驗(yàn)中顯示了良好的減重效果和安全性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個方面提供了一種用于治療肥胖癥的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)衍生物多肽——rhCNTF(1-185)蛋白，該多肽是包含SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽，或其片段、同源物、類似物或衍生物。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，rhCNTF(1-185)具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明的另一個方面提供了一種編碼睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)衍生物多肽的多核苷酸分子，其特征在于它是選自以下幾種的任何一種(A)與SEQ ID NO3有至少70％同源性的核苷酸序列；(B)與SEQ ID NO3的核苷酸序列雜交或互補(bǔ)的核苷酸序列；和(C)(A)或(B)核苷酸序列的片段。
(D)與SEQ ID NO4編碼相同序列的蛋白質(zhì)、但因遺傳密碼的簡并性而在序列上有所不同的核苷酸序列。
優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸分子包含SEQ ID NO3所示的核苷酸序列；更優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸分子具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
本發(fā)明進(jìn)一步提供含有編碼本發(fā)明rhCNTF(1-185)多核苷酸的表達(dá)載體、包含被任何所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以及由其衍生的新的株系或細(xì)胞系。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含編碼本發(fā)明rhCNTF(1-185)多核苷酸分子的重組原核表達(dá)載體pET-32a-CNTF，以及遺傳工程菌pET-CNTF/BL21。
本發(fā)明進(jìn)一步提供制備睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子衍生物rhCNTF(1-185)多肽的方法，其包括在適于表達(dá)多肽的條件下培養(yǎng)用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，再從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化所表達(dá)的多肽。
本發(fā)明進(jìn)一步提供含有本發(fā)明睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)衍生物多肽rhCNTF(1-185)為活性成分以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，以及該藥物組合物在治療肥胖癥，神經(jīng)變性疾病和神經(jīng)損傷以及治療青光眼中的用途。
本文中提到的rhCNTF(1-185)多肽的“同源性”多肽是指，多肽本來具有rhCNTF(1-185)蛋白的氨基酸序列，但其中一個或多個氨基酸殘基已被不同的氨基酸殘基保守地取代，并且所得到的多肽可用于實(shí)施本發(fā)明。保守氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的。造成這樣的取代的規(guī)則包含由Dayhof，M.D.(1978，國家生物醫(yī)學(xué)研究基金，Washington，D.C.，第5卷，增刊3)等所述的取代規(guī)則。更具體地說，保守氨基酸取代發(fā)生在與其酸性、極性或側(cè)鏈大小相關(guān)聯(lián)的氨基酸家族內(nèi)。一般可將遺傳編碼的氨基酸分為四組(1)酸性氨基酸＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性氨基酸＝賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性氨基酸＝丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不帶電的極性氨基酸＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸也共同分類為芳香氨基酸。任何特定組內(nèi)的一個或多個取代，例如用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、或用谷氨酸取代天冬氨酸、或用絲氨酸取代蘇氨酸，或任何其他氨基酸殘基結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸殘基，例如有相似酸性、極性、側(cè)鏈大小的，或在其某些組合方面有相似性的氨基酸殘基取代，一般對多肽的功能或免疫原性不會有太大影響。
在本發(fā)明中，“SEQ ID NO4所示氨基酸序列的類似物”被定義為，與SEQ ID NO4相比較，具有一個或幾個氨基酸取代，刪除，轉(zhuǎn)換或增加的分子?！癝EQ ID NO4所示氨基酸序列的衍生物”被定義為如下一種分子，它具有SEQ ID NO4或SEQ ID NO4類似物氨基酸序列，但是另外還具有化學(xué)修飾的一個或幾個氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)，α-碳原子，末端氨基，或者末端羧酸基?；瘜W(xué)修飾包括增加部分化學(xué)結(jié)構(gòu)，生成新鍵，和除去部分化學(xué)結(jié)構(gòu)。對氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的修飾包括賴氨酸ε-氨基的?；彼?，組氨酸或賴氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸羧酸基的烷基化，以及谷氨酰胺或天冬酰胺的脫酰氨基。末端氨基的修飾包括脫氨基，N-低級烷基修飾，N-二低級烷基修飾和N-?；揎棥δ┒唆然男揎棸０沸揎?，低級烷基酰胺修飾，二烷基酰胺修飾和低級烷基酯修飾。低級烷基是C1-C4烷基。并且，還可以用蛋白質(zhì)化學(xué)的普通技術(shù)人員熟知的保護(hù)基，保護(hù)一個或幾個側(cè)鏈基團(tuán)或末端基團(tuán)。還可以使氨基酸的α-碳原子單甲基化或二甲基化。
本文所用的術(shù)語“多核苷酸分子”是指單鏈或雙鏈的DNA和RNA分子，可包含一個或多個原核序列，cDNA序列，包含外顯子和內(nèi)含子的基因組DNA序列，化學(xué)合成的DNA和RNA序列，以及有義和相應(yīng)的反義鏈。
生產(chǎn)和操作本文公開的多核苷酸分子的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并可按照已描述的重組技術(shù)(參見Maniatis等，1989，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約；Ausubel等，1989，分子生物學(xué)當(dāng)前技術(shù)，Greene Publishing Associates &Wiley Interscience，NY；Sambrook等，1989，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約；Innis等(編)，1995，PCR策略，Academic Press，Inc.，San Diego；和Erlich(編)，1992，PCR技術(shù)，牛津大學(xué)出版社，New York)完成。
本發(fā)明提供了包含編碼重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(rhCNTF)衍生物多肽——rhCNTF(1-185)核苷酸序列的一種的多核苷酸分子，在進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的編碼rhCNTF(1-185)多肽的多核苷酸分子包含選自下列成員的核苷酸序列(1)SEQ ID NO3所示的核苷酸序列；(2)與SEQ ID NO3所示核苷酸序列至少70％相同、優(yōu)選至少80％相同、更優(yōu)選至少90％相同、最優(yōu)選95％相同的核苷酸序列；(3)在中等嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下(即在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中于65℃與結(jié)合于濾膜的DNA雜交，并在0.2xSSC/0.1％SDS中于42℃洗滌的條件；參見Ausubel等(編)，1989，分子生物學(xué)當(dāng)前技術(shù)，第1卷，Green PublishingAssocintes，Inc.，and John Wiley & Sons，Inc.，NY，P.2.10.3)、優(yōu)選高度嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件(即在0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中于65℃與結(jié)合于濾膜的DNA雜交，并在0.1xSSC/0.1％SDS中于68℃洗滌條件；參閱Ausubel等，1989，上述文獻(xiàn))下與具有SEQ ID NO3或其互補(bǔ)序列的多核苷酸分子能雜交的核苷酸序列；或者(4)與SEQID NO4編碼相同序列的蛋白質(zhì)、但因遺傳密碼的簡并性而在序列上有所不同的核苷酸序列。
可用于表達(dá)本發(fā)明的編碼rhCNTF(1-185)多肽序列的各種表達(dá)載體是本領(lǐng)域已知的，其中包括含有特定編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA和粘粒DNA表達(dá)載體?？山?jīng)加工而含有本發(fā)明的多核苷酸分子的典型原核表達(dá)載體質(zhì)粒包括pUC8、pUC9、pBR322和pBR329(Biorad Laboratories，Richmond，CA)、pPL和pKK223(Pharmacia，Piscataway，NJ)、pQE50(Qiagen，Chatsworth，CA)和pGEM-T EASY(Promega，Madison，WI)等?？山?jīng)加工而含有本發(fā)明的多核苷酸分子的典型真核表達(dá)載體包括蛻皮激素誘導(dǎo)型哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen，Carlsbad，CA)、基于巨細(xì)胞病毒啟動子-增強(qiáng)子的系統(tǒng)(Promega，Madison，WI；Stratagene，La Jolla，CA；Invitrogen)，和基于桿狀病毒的表達(dá)系統(tǒng)(Promega)等。
可用于實(shí)施本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是真核或原核細(xì)胞。這樣的已轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞包括但不只限于微生物，例如用重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，或者用重組載體轉(zhuǎn)化的酵母，或者是動物細(xì)胞，如用重組病毒載體如桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞，或用重組病毒載體如腺病毒或痘苗病毒感染的哺乳動物細(xì)胞等。例如，可使用大腸桿菌菌株，如DH5α菌株。真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，但也可有效地利用小鼠、倉鼠、牛、猴或人細(xì)胞系等哺乳動物細(xì)胞?？捎糜诒磉_(dá)本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)的真核宿主細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、NIH/3T3等。
含有本發(fā)明多肽的藥物組合物可用于多種治療目的，本發(fā)明的藥物組合物不僅用于治療肥胖癥；還可以用于治療神經(jīng)變性性疾病，如視網(wǎng)膜變性、涉及運(yùn)動神經(jīng)元的疾病；還可以用于治療外周神經(jīng)障礙、Alzheimer、Parkinson、Huntington以及神經(jīng)損傷等的治療。優(yōu)選的，本發(fā)明藥物組合物用于治療肥胖癥和促進(jìn)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞軸突再生，用于治療由于青光眼引起的眼內(nèi)高壓造成的視神經(jīng)的損傷。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明的藥物組合物適用于各種給藥方式，例如口服給藥、經(jīng)皮給藥、靜脈內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、局部給藥、經(jīng)鼻給藥等。根據(jù)所采用的給藥方式，可將本發(fā)明的多肽藥物組合物制成合適的劑型，其中包含至少一種有效劑量的本發(fā)明的多肽和至少一種藥學(xué)上可接受的藥用載體。
適當(dāng)劑型的實(shí)例為片劑，膠囊，糖衣片劑，粒劑，口服溶液和糖漿，用于皮膚表面的油膏和藥貼，氣霧膠，鼻噴劑，以及可用于注射的無菌溶液等。
含有本發(fā)明多肽的藥物組合物可以制成溶液或者凍干粉末以用于胃腸外給藥。在使用前可加入適當(dāng)溶劑或其它可藥用的載體將粉末重新配制。液體配方一般是緩沖液、等滲溶液和水溶液。
劑型中還可含有其它常規(guī)組分，如防腐劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、緩沖液、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽、乳化劑、增甜劑、著色劑、調(diào)味劑等等。本發(fā)明藥物組合物中使用的穩(wěn)定劑優(yōu)選檸檬酸鈉、甘氨酸、甘露醇、神經(jīng)節(jié)糖苷等。含有本發(fā)明藥物組合物的注射水針或凍干粉針更優(yōu)選的配方包括，rhCNTF(1-185)0.1-5mg，NaCl 8mg，檸檬酸鈉3mg或磷酸鹽2mg，神經(jīng)節(jié)糖苷25-50mg或甘氨酸15-30mg或甘露醇15-20mg，注射用水1ml。
若有特殊治療要求，本發(fā)明的藥物組合物還可包含其他活性藥理成分，這種相伴使用有利于治療。
本發(fā)明的藥物組合物中多肽的用量可以在一個較大范圍內(nèi)變動，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)一些已知的因素，諸如疾病的種類，病情嚴(yán)重程度，病人體重，劑型，所選用藥途徑很容易的加以確定。通常每日的用量為1-3μg/kg。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.與天然CNTF相比，僅去掉了C端15個氨基酸，保持了穩(wěn)定性。
2.首次實(shí)現(xiàn)了可溶形式的表達(dá)，表達(dá)量高，穩(wěn)定性好。純化時無需變性和復(fù)性，工藝簡單，易于放大生產(chǎn)，成本低廉。
3.在動物的藥效試驗(yàn)中顯示了良好的減重效果和安全性。
4.未做點(diǎn)突變，有效避免了免疫原性的增強(qiáng)。


圖1重組質(zhì)粒pET-32a-CNTF構(gòu)建圖2實(shí)驗(yàn)大鼠0-9天體重變化。Control代表模型對照組；S8代表陽性對照組，鹽酸西布曲明，8mg/kg；0.15代表rhCNTF 0.15mg/kg組；0.2代表rhCNTF 0.2mg/kg組；0.25代表rhCNTF 0.25mg/kg組；0.3代表rhCNTF 0.3mg/kg組。
圖3實(shí)驗(yàn)大鼠0-9天的攝食量變化率。Control代表模型對照組；S8代表陽性對照組，鹽酸西布曲明，8mg/kg；0.15代表rhCNTF0.15mg/kg組；0.2代表rhCNTF 0.2mg/kg組；0.25代表rhCNTF0.25mg/kg組；0.3代表rhCNTF 0.3mg/kg組。計(jì)算時以各組0天時為0。
圖4實(shí)驗(yàn)大鼠0-9天的體重、體脂和肌肉重量變化。Control代表模型對照組；S8代表陽性對照組，鹽酸西布曲明，8mg/kg；0.15代表rhCNTF 0.15mg/kg組；0.2代表rhCNTF 0.2mg/kg組；0.25代表rhCNTF 0.25mg/kg組；0.3代表rhCNTF 0.3mg/kg組。以模型對照組值為0進(jìn)行計(jì)算。
實(shí)施例實(shí)施例一表達(dá)載體的構(gòu)建我們采用PCR方法從人胎兒大腦組織的cDNA庫(購自Clontech)中擴(kuò)增CNTF的cDNA片段。根據(jù)CNTF基因序列設(shè)計(jì)的引物為5’引物5’GAA GAT CTG GAC GAC GAC GAC AAG ATGGCT TTC ACA GAG CAT TC 3’
3’引物5’GGA ATT CTT ACC CAG TCT GAT GAG AAG AAATG 3’為了能將PCR產(chǎn)物直接插入表達(dá)載體，我們在5’引物中設(shè)計(jì)入Bgl II酶切位點(diǎn)，在3’引物中設(shè)計(jì)入EcoR I酶切位點(diǎn)。
PCR反應(yīng)條件如下60.5μl ddH2O10μl 10×擴(kuò)增緩沖液2μl 10μM dNTP10μl 5’引物(10μM)10μl 3’引物(10μM)5μl 模板cDNA(～1ng)2.5μl Taq DNA polymerase(1U/μl)PCR反應(yīng)混合物在94℃變性5分鐘后，按下列條件進(jìn)行反應(yīng)94℃變性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸30秒。反應(yīng)30個循環(huán)。然后72℃再延伸12分鐘。
PCR反應(yīng)結(jié)束后，將約590pb大小的PCR產(chǎn)物插入表達(dá)載體pET-32a(+)(購自Novagen)；將連接構(gòu)建好的質(zhì)粒pET-32a(+)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(購自Stratagene)。通過篩選和測序，得到插入序列完全正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-CNTF(見圖1)，含有重組表達(dá)載體的工程菌為pET-CNTF/BL21，其表達(dá)率可占總菌體蛋白的20-40％，均以可溶形式存在。
實(shí)施例二rhCNTF(1-185)的純化經(jīng)高密度發(fā)酵獲得的工程菌菌體洗滌離心后用10mmol/L PB，50mmol/L咪唑，pH8.0的緩沖液重懸浮，高壓勻質(zhì)機(jī)破菌，離心(10000g×30min，4℃)得上清。上清液上用平衡緩沖液10mmol/LPB，50mmol/L咪唑，pH8.0平衡的Chelating Sepharose FF柱(購自Pharmacia)，而后用同樣的緩沖液洗至基線，再用10mmol/L PB，200mmol/L咪唑，pH8.0緩沖液洗脫Thioredoxin-EK-CNTF融合蛋白，其純度大于80％。
所得融合蛋白按1U∶10mg加入腸激酶rEK酶(購自Invitrogen)，25℃保溫20小時。電泳檢測酶解效率大于95％后，將酶解液上10mmol/L PB，pH8.0平衡的Chelating Sepharose FF柱，這時rhCNTF(1-185)不被吸附而直接穿透，絕大部分的雜蛋白、幾乎所有的EK酶被Chelating Sepharose FF柱吸附。收集穿透峰上用10mmol/L PB，3mol/L NaCl，pH8.0緩沖液平衡的Phenyl Sepharose F.F.柱，用10mmol/L PB(pH7.0)洗脫，即為純化的rhCNTF(1-185)純品。
實(shí)施例三rhCNTF(1-185)的抗肥胖作用1.高營養(yǎng)性肥胖(DIO)大鼠模型的制備取若干只大鼠(斷乳SD大鼠，雄性，體重85-105g，SPF級)，喂以高能飼料，造成DIO模型，正常對照組大鼠20只喂以普通飼料，以DIO組大鼠體重≥正常對照組大鼠體重的20％為模型成功，共造型6周。第1周飼料消耗量為15g/只，第3周為20g/只，第5-6周為23g/只。第6周末時，從正常大鼠中選出10只做為正常對照，從造型成功的大鼠中選出肥胖大鼠60只，每組10只，分別分為模型對照組、陽性對照組和rhCNTF 4個劑量的受試組。
2.rhCNTF(1-185)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)方法2.1分組及給藥
第1組正常對照組，喂以普通飼料第2組模型對照組，喂以高營養(yǎng)飼料第3組陽性對照組，鹽酸西布曲明，ig，8mg/kg，喂以高營養(yǎng)飼料)第4組rhCNTF 0.15mg/kg，sc，喂以高營養(yǎng)飼料第5組rhCNTF 0.2mg/kg，sc，喂以高營養(yǎng)飼料第6組rhCNTF 0.25mg/kg，sc，喂以高營養(yǎng)飼料第7組rhCNTF 0.3mg/kg，sc，喂以高營養(yǎng)飼料陽性對照組大鼠用西布曲明灌胃，2ml/kg，1日1次，其余各組大鼠均用等體積生理鹽水灌胃，1日1次。rhCNTF(1-185)各組大鼠每天sc注射不同濃度的受試藥1次，每次1ml/kg。正常對照組、模型對照組和陽性對照組sc注射等體積賦形劑生理鹽水溶液。
2.2測定指標(biāo)(1)體重及攝食量給藥前(0天)、給藥后1、2、3、4、5、7、9天定時記錄體重及攝食量。
(2)血脂含量測定(3)體脂重量及骨骼肌重量測定3.結(jié)果給藥0天時，模型組大鼠體重較正常對照組增加20％，與正常對照組相比P＜0.01，說明DIO模型成立。在整個實(shí)驗(yàn)過程中，模型組大鼠體重持續(xù)增長，和實(shí)驗(yàn)前比較，體重增長率為7.33％。西布曲明組大鼠體重在用藥第2天時達(dá)到最低(和給藥前比，降低了3.91％)，隨后緩慢回升，各時點(diǎn)體重與模型對照組相比P＜0.01，差別有顯著性。rhCNTF(1-185)各組大鼠在用藥期間，DIO大鼠的體重降低有明顯量-效關(guān)系，其中rhCNTF 0.15mg/kg組降低了6.42％，0.2mg/kg組降低了8.58％，0.25mg/kg組降低了9.01％，0.3mg/kg組降低了12.73％，體重與模型對照組相比均P＜0.01)。各組大鼠0～9天體重變化見圖2和表1。
給藥0天時各組之間大鼠的攝食量無顯著性差異，在整個實(shí)驗(yàn)過程中，模型組大鼠的攝食量一直穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)。西布曲明組大鼠攝食量在用藥第1天后達(dá)到最低(與模型對照組相比P＜0.01)，隨后緩慢回升，與模型對照組接近，差別無顯著性。給藥0～7天內(nèi)，各rhCNTF劑量組大鼠的攝食量持續(xù)減少，有明顯量-效關(guān)系。其中，0.15、0.2、0.25、0.3mg/kg劑量組大鼠攝食量在第7天時達(dá)到最低點(diǎn)，與模型對照組比均P＜0.01，各組大鼠攝食量變化見圖3和表2。
西布曲明組可以顯著降低DIO大鼠的血糖，對血脂其它指標(biāo)無顯著性影響。rhCNTF各組大鼠血清LDL-C值均有降低趨勢，和模型對照組比，0.15mg/kg組差別有顯著性；0.3mg/kg組血清TG含量降低且差別有顯著性，而其它劑量組血清TG含量無顯著性變化；rhCNTF各組大鼠血清CHO、HDL-C含量均無明顯升高或降低，和模型對照組比較，差別亦無顯著性，結(jié)果見表3。
給藥9天后，曲美8mg/kg及rhCNTF各組DIO大鼠的體脂重量均明顯降低，和模型對照組比，曲美8mg/kg組降低40.26％，rhCNTF各組分別降低了27.59％、23.09％、28.55％和32.49％，各用藥組大鼠體脂重量與模型對照組比，rhCNTF 0.2mg/kg組P＜0.05，曲美8mg/kg及rhCNTF 0.15、0.25、0.3mg/kg組P＜0.01。曲美8mg/kg及rhCNTF 0.15～0.3mg/kg組DIO大鼠的右比目魚肌重量明顯降低，和模型對照組比，曲美8mg/kg組大鼠右比目魚肌重量降低了8.40％，rhCNTF各組分別降低了10.26％、13.90％、14.83％、18.38％。各組右比目魚肌重量與模型對照組比，曲美8mg/kg和rhCNTF 0.15mg/kg組P＜0.05，rhCNTF 0.2、0.25、0.3mg/kg組P＜0.01。各組大鼠相對于模型對照組大鼠的體重、體脂重量和右比目魚肌重量變化見圖4和表4。
通過上述實(shí)驗(yàn)可以知道，rhCNTF(1-185)可使DIO大鼠的攝食量和體重明顯減少，并有明顯的量-效關(guān)系，給藥結(jié)束后，rhCNTF(1-185)各組DIO大鼠的體脂重量經(jīng)測定均明顯降低，此外還可降低LDC-C含量，但不影響血清HDL-C含量，此作用對肥胖患者十分有利。另外，rhCNTF(1-185)不影響大鼠活動、外觀及行為，不引起大鼠興奮和抑制，對大鼠血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類、血小板計(jì)數(shù)無明顯有病理意義的影響，不影響大鼠肝、腎功能。
實(shí)施例四制備以rhCNTF(1-185)為活性組份的注射劑配方rhCNTF(1-185)100mgNaCl 8gNa2HPO41.6gNaH2PO40.55g
甘氨酸 20g甘露醇 15g注射用水1000mlpH值7.0無菌過濾后分裝成1ml/支的注射水針劑或凍干，制成凍干粉針。
實(shí)施例五制備治療視神經(jīng)變性損傷的滴眼劑配方rhCNTF(1-185) 100mg透明質(zhì)酸2.5g維生素B62.5g?；撬? 2.0g苯扎溴氨0.1g甘露醇 15g注射用水1000mlpH值6.5無菌過濾后分裝成10ml/支，4℃保存。
通過上述具體的實(shí)施例，更容易理解本發(fā)明。上述實(shí)施例只是舉例描述，而不用來限制本發(fā)明的范圍。
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amyotrophic lateral sclerosis.Neurology 461244-1249
表1.rhCNTF用藥0天、9天時大鼠的體重及體重增長率劑量 0d體重 9d體重 9d體重組別mg/kg /g /g 增長率/％正常對照 - 338.9±20.9Δ374.4±42.3Δ10.475模型對照 - 405.3±14.6 435.0±14.7 7.327905曲美 8 404.4±11.3 406.6±13.0Δ0.544016rhCNTF0.15 404.7±14.3 378.7±17.5Δ-6.42451rhCNTF0.2405.8±15.5 371.0±19.4Δ-8.57565rhCNTF0.25 404.1±14.0 367.7±11.0Δ-9.00767rhCNTF0.3406.0±11.3 354.3±12.4Δ-12.734與模型對照組比，*P＜0.05，ΔP＜0.01表2.rhCNTF用藥0天、5天及9天時大鼠的攝食量(g)劑量 0d攝食量 5d攝食量 9d攝食量組別mg/kg ggg正常對照 - 30.28±5.95 30.00±5.54*31.88±7.57模型對照 - 27.51±2.70 25.91±1.56 27.03±4.63曲美 8 25.32±3.23 20.91±2.61Δ22.46±5.43rhCNTF0.15 26.23±1.52 18.05±2.60Δ24.62±3.76rhCNTF0.226.28±3.14 17.59±3.42Δ25.95±5.26rhCNTF0.25 24.87±5.17 16.84±2.11Δ26.29±3.36rhCNTF0.326.06±2.80 15.29±3.82Δ27.00±2.78與模型對照組比，*P＜0.05，ΔP＜0.01表3.給藥9天時各組大鼠的血脂及血糖含量組別 劑量 GLU HDL-C LDL-CCHO TGmg/kg mmol/L mmol/L mmol/L mmol/Lmmol/L正常對- 8.01± 0.44± 1.92±2.49± 0.66±照 1.300.060.31 0.35 1.92模型對- 9.04± 0.47± 1.95±2.55± 0.63±照 1.090.050.21 0.28 0.22曲美 8 7.92± 0.44± 1.81±2.38± 0.60±0.97*0.070.31 0.37 0.14rhCNTF0.15 9.92± 0.44± 1.77±2.36± 0.72±1.150.060.22 0.30 0.27rhCNTF0.2 9.01± 0.44± 1.72±2.29± 0.62±1.080.070.27 0.31 0.22rhCNTF0.25 9.65± 0.44± 1.76±2.32± 0.62±0.730.080.31 0.15 0.20rhCNTF0.3 9.22± 0.49± 1.75±2.53± 0.43±1.560.090.45 0.51 0.19*
與模型對照組比，*P＜0.05表4.給藥9天時各組大鼠的體重、體脂重量及骨骼肌重量組別 劑量體重 體脂重量 右比目魚肌重mg/kg /g /g量/g正常對照 - 406.0±52.0Δ10.78±4.09Δ1.14±0.15模型對照 - 459.1±41.5 17.76±2.31 1.07±0.09曲美 8 418.8±21.7Δ10.61±3.59Δ0.98±0.10*rhCNTF 0.15404.4±29.1Δ12.86±2.45Δ0.96±0.09*rhCNTF 0.2 398.3±44.1Δ13.66±4.28*0.92±0.09ΔrhCNTF 0.25396.5±33.8Δ12.69±3.14Δ0.91±0.08ΔrhCNTF 0.3 390.7±22.0Δ11.99±2.36Δ0.88±0.01Δ與模型對照組比，*P＜0.05，ΔP＜0.01。
序 列 表<110>西南生物工程產(chǎn)業(yè)化中試基地有限公司<120>治療肥胖癥的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子衍生物多肽<160>4<170>Patent In Version 3.0<210>1<211>600<212>DNA<213>智人(homo sapiens)<400>1ATGGCTTTCA CAGAGCATTC ACCGCTGACC CCTCACCGTC GGGACCTCTG TAGCCGCTCT60ATCTGGCTAG CAAGGAAGAT TCGTTCAGAC CTGACTGCTC TTACGGAATC CTATGTGAAG 120CATCAGGGCC TGAACAAGAA CATCAACCTG GACTCTGCGG ATGGGATGCC AGTGGCAAGC 180ACTGATCAGT GGAGTGAGCT GACCGAGGCA GAGCGACTCC AAGAGAACCT TCAAGCTTAT 240CGTACCTTCC ATGTTTTGTT GGCCAGGCTC TTAGAAGACC AGCAGGTGCA TTTTACCCCA 300ACCGAAGGTG ACTTCCATCA AGCTATACAT ACCCTTCTTC TCCAAGTCGC TGCCTTTGCA 360TACCAGATAG AGGAGTTAAT GATACTCCTG GAATACAAGA TCCCCCGCAA TGAGGCTGAT 420GGGATGCCTA TTAATGTTGG AGATGGTGGT CTCTTTGAGA AGAAGCTGTG GGGCCATAAG 480GTGCTGCAGG AGCTTTCACA GTGGACAGTA AGGTCCATCC ATGACCTTCG TTTCATTTCT 540TCTCATCAGA CTGGGATCCC AGCACGTGGG AGCCATTATA TTGCTAACAA CAAGAAAATG 600<210>2<211>200<212>PRT<213>智人(homo sapiens)
<400>2Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp Leu Cys Ser1 5 10 15Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu The Ala Leu Thr Glu20 25 30 35Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile Asn Leu Asp Ser Ala Asp40 45 50Gly Met Pro Val Ala Ser Thr Asp Gln Trp Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg55 60 65 70Leu Gln Glu Asn Leu Gln Ala Tyr Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu75 80 85Leu Glu Asp Gln Gln Val His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala90 95 100 105Ile His Thr Leu Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu110 115 120 125Met Ile Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile130 135 140Asn Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys Val Leu145 150 155 160Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu Arg Phe Ile Ser165 170 175Ser His Gln Thr Gly Ile Pro Ala Arg Gly Ser His Tyr Ile Ala Asn Asn Lys180 185 190 195Lys Met200<210>3<211>555<212>DNA<213>智人(homo sapiens)
<400>3ATGGCTTTCA CAGAGCATTC ACCGCTGACC CCTCACCGTC GGGACCTCTG TAGCCGCTCT60ATCTGGCTAG CAAGGAAGAT TCGTTCAGAC CTGACTGCTC TTACGGAATC CTATGTGAAG120CATCAGGGCC TGAACAAGAA CATCAACCTG GACTCTGCGG ATGGGATGCC AGTGGCAAGC180ACTGATCAGT GGAGTGAGCT GACCGAGGCA GAGCGACTCC AAGAGAACCT TCAAGCTTAT240CGTACCTTCC ATGTTTTGTT GGCCAGGCTC TTAGAAGACC AGCAGGTGCA TTTTACCCCA300ACCGAAGGTG ACTTCCATCA AGCTATACAT ACCCTTCTTC TCCAAGTCGC TGCCTTTGCA360TACCAGATAG AGGAGTTAAT GATACTCCTG GAATACAAGA TCCCCCGCAA TGAGGCTGAT420GGGATGCCTA TTAATGTTGG AGATGGTGGT CTCTTTGAGA AGAAGCTGTG GGGCCATAAG480GTGCTGCAGG AGCTTTCACA GTGGACAGTA AGGTCCATCC ATGACCTTCG TTTCATTTCT540TCTCATCAGA CTGGG 555<210>4<211>185<212>PRT<213>智人(homo sapiens)<400>4Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp Leu Cys Ser15 10 15Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu The Ala Leu Thr Glu20 25 30 35Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile Asn Leu Asp Ser Ala Asp40 45 50Gly Met Pro Val Ala Ser Thr Asp Gln Trp Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg55 60 65 70Leu Gln Glu Asn Leu Gln Ala Tyr Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu75 80 85 90
Leu Glu Asp Gln Gln Val His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala95 100 105Ile His Thr Leu Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu110 115 120 125Met Ile Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile130 135 140Asn Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys Val Leu145 150 155 160Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu Arg Phe Ile Ser165 170 175 180Ser His Gln Thr Gly18權(quán)利要求
1.一種用于治療肥胖癥的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子衍生物多肽，其特征在于該多肽是包含SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽，或其片段、同源物、類似物或衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其特征在于該多肽是具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的多肽，其特征在于這里指的肥胖癥包括飲食誘導(dǎo)的肥胖癥和糖尿病等疾病相關(guān)的肥胖癥。
4.一種編碼權(quán)利要求1或2多肽的多核苷酸分子，其特征在于它是選自以下幾種的任何一種(A)與SEQ ID NO3有至少70％同源性的核苷酸序列；(B)與SEQ ID NO3的核苷酸序列雜交或互補(bǔ)的核苷酸序列；(C)(A)或(B)核苷酸序列的片段；和(D)與SEQ ID NO4編碼相同序列的蛋白質(zhì)、但因遺傳密碼的簡并性而在序列上有所不同的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的多核苷酸分子，其特征在于該多核苷酸分子包含SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多核苷酸分子，其特征在于具有SEQ IDNO3所示的核苷酸序列。
7.含有權(quán)利要求4-6任一多核苷酸分子的重組表達(dá)載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體是原核表達(dá)載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的表達(dá)載體，該原核表達(dá)載體是pET-32a-CNTF。
10.含有權(quán)利要求7-10任一表達(dá)載體的遺傳工程宿主細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，該大腸桿菌宿主細(xì)胞是pET-CNTF/BL21。
13.制備權(quán)利要求1或2多肽的方法，其特征在于該方法包括在適于表達(dá)多肽的條件下培養(yǎng)用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，再從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化所表達(dá)多肽的步驟。
14.純化權(quán)利要求1或2多肽的方法，其特征在于含有重組原核表達(dá)載體的宿主菌經(jīng)發(fā)酵、離心和勻漿破碎，上清液用親和層析純化，經(jīng)腸激酶酶切后，再分別用親和層析和疏水層析純化。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其特征在于親和層析柱是CheletingSepharose Fast Flow親和層柱。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的方法，其特征在于疏水層析柱是PhenylSepharose F.F.柱。
17.一種藥物組合物，其特征在于該藥物組合物中含有作為活性成分的權(quán)利要求1或2的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物，該藥物組合物是通過包括靜脈內(nèi)，皮下，肌肉，鞘內(nèi)，鼻腔粘膜，口腔粘膜等藥物傳遞途徑的方式給藥。
19.權(quán)利要求1或2的多肽在制備治療肥胖癥的藥物組合物中的用途。
20.權(quán)利要求1或2的多肽在制備治療青光眼的藥物組合物中的用途。
21.權(quán)利要求1或2的多肽在制備治療神經(jīng)變性性疾病如視網(wǎng)膜變性，以及運(yùn)動神經(jīng)元疾病、外周神經(jīng)障礙、Alzheimer、Parkinson、Huntington等神經(jīng)系統(tǒng)疾病和神經(jīng)損傷的藥物組合物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于治療肥胖癥的重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(rhCNTF)衍生物－rhCNTF(1－185)，首次利用基因克隆技術(shù)實(shí)現(xiàn)了這種有生物活性的rhCNTF衍生物在大腸桿菌中的高效可溶表達(dá)，公開了制備純化該衍生物的方法，以及該衍生物在治療肥胖癥及神經(jīng)損傷相關(guān)疾病中的用途。
文檔編號A61P27/06GK1563087SQ20041003075
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月2日
發(fā)明者李曉鵬, 楊莉, 胡昌華, 李明 申請人:西南生物工程產(chǎn)業(yè)化中試基地有限公司