專利名稱：神經(jīng)營養(yǎng)因子nnt－1的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種命名為NNT-1的新型多肽和具有神經(jīng)營養(yǎng)活性的相關多肽、涉及編碼這類多肽的新型核酸分子并涉及其它相關的方面。
相關領域描述許多神經(jīng)性障礙和疾病至少部分是由特殊種類的神經(jīng)元的變性或死亡所導致的。例如，帕金森病的特征在于遲緩的隨意肌運動、肌肉強直和震顫。這類癥狀至少部分歸因于位于稱作黑質的大腦特殊區(qū)域的產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)元的進行性變性。這些神經(jīng)元(“多巴胺能神經(jīng)元”)的變性導致稱作紋狀體的大腦鄰接區(qū)域中的多巴胺水平下降。這種紋狀體含有表達多巴胺受體的神經(jīng)元；這些神經(jīng)元涉及控制運動活性。目前對多巴胺能神經(jīng)元變性的原因還不了解，但是已經(jīng)將它歸因于自由基、過量的鐵含量、環(huán)境毒素、興奮性氨基酸神經(jīng)毒性、以及可能的某些神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏(Jenner，《神經(jīng)病學》(Neurology)增刊3S6-S12 ；Adams和Victor編輯《神經(jīng)病學機理》(Principles of Neurology)第42章“神經(jīng)系統(tǒng)的變性疾病”，McGraw Hill，NY )。
諸如肌萎縮性側索硬化(ALS；也稱作Lou Gehrig’s病)、進行性肌肉萎縮、以及遺傳運動和感覺神經(jīng)病(進行性神經(jīng)病性疾病)這樣的所有疾病至少部分是由于位于脊髓腹側角中的運動神經(jīng)元蛻變所造成的。
海馬(一種定義清楚的結構、它是大腦皮層的部分)在形成長期記憶的過程中起重要作用。例如由局部缺血造成的海馬的破壞可以導致無法形成新的記憶。位于海馬CA1區(qū)域中的錐體CA1神經(jīng)元的變性是阿爾茨海默病的一個特征。對于發(fā)生在諸如中風和大腦損傷這樣的疾病中的局部缺血和缺氧性損害來說，這些相同的神經(jīng)元是選擇性易受損的。此外，在癲癇病中，CA1錐體海馬神經(jīng)元以及位于海馬CA3區(qū)域中的錐體神經(jīng)元選擇性地受到損傷。
紋狀體是來自黑質的含多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)末梢的神經(jīng)支配區(qū)。大多數(shù)紋狀體神經(jīng)元利用GABA(4-氨基丁酸)作為其神經(jīng)遞質。紋狀體是發(fā)生在亨廷頓舞蹈病中的進行性神經(jīng)變性的主要靶向物，其中主要神經(jīng)元的缺失是使用GABA的紋狀體神經(jīng)元的缺失。
含血清素的神經(jīng)元位于群集在菱腦中線周圍的群體神經(jīng)元中。這些神經(jīng)元涉及控制體溫、情緒和睡眠。含血清素的神經(jīng)元系統(tǒng)的障礙包括、例如抑郁癥、其它情緒疾病和失眠。
感光細胞是視網(wǎng)膜神經(jīng)元的特殊亞群并且是產(chǎn)生視覺的原因。感光細胞的損傷和/或死亡可導致失明。諸如因色素性視網(wǎng)膜炎、老年斑變性和靜止性夜盲導致的視網(wǎng)膜變性的特征均在于感光細胞外側部分的進行性萎縮和功能的喪失，其中所述的感光細胞外側部分是含有將光刺激物轉化成電活性的視覺色素的特殊結構。
盡管有一些可獲得的用于治療所述癥狀和減輕這類疾病嚴重性的療法(例如用于治療帕金森病的L-多巴胺)，但是目前沒有預防或減少多數(shù)上述種類受影響神經(jīng)元的變性、或促進其修復的有效療法。
近來，已經(jīng)根據(jù)其對各種神經(jīng)元的營養(yǎng)活性而鑒定了幾種天然存在的蛋白質分子。將這些分子命名為“神經(jīng)營養(yǎng)因子”。神經(jīng)營養(yǎng)因子是內(nèi)源性可溶性蛋白質，它們可以刺激或調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活、生長、和/或形態(tài)成形性(參見Fallon和Laughlin，《神經(jīng)營養(yǎng)因子》(Neurotrophic Factors)，Academic Press，San Diego，CA )。
根據(jù)氨基酸序列的同源性和/或三維結構，公知的神經(jīng)營養(yǎng)因子屬于多肽生長因子的幾種不同蛋白質的超家族(MacDonald和Hendrikson，《細胞》(Cell)，73421-424 )。神經(jīng)營養(yǎng)因子的一個族是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白族。通常該族由NGF(神經(jīng)生長因子)、BDNF(大腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子)、NT-3(神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3)、NT-4(神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4)和NT-6(神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-6)組成。
CNTF(睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子)和LIF(白血病抑制因子)是具有神經(jīng)營養(yǎng)活性的細胞因子多肽。根據(jù)它們的結構特征和受體組成，這些多肽與一族造血細胞因子有關，該族造血細胞因子包括IL-6(白細胞介素-6)、IL-11(白細胞介素-11)、G-CSF(粒細胞集落刺激因子)和制癌蛋白-M。本發(fā)明的NNT-1具有顯著類似于各種該族神經(jīng)營養(yǎng)因子的特征。參見附圖6。
GDNF(神經(jīng)膠質衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子)是一種屬于TGF-β(轉化生長因子β)超家族的神經(jīng)營養(yǎng)因子。GDNF表現(xiàn)出對多巴胺能和運動神經(jīng)元的有效促進存活和分化的作用(Lin等，《科學》(Science)2601130-1132 ；Yan等，《自然》(Nature)373341-344 )。
盡管公知這些神經(jīng)營養(yǎng)因子可以促進神經(jīng)元的生長和/或存活，但是幾乎很少有人了解有關與這些因子一起起作用的分子的情況。在一種可以鑒定其它神經(jīng)蛋白和相關分子的方式中，給予動物一種或多種公知對神經(jīng)系統(tǒng)有作用的化合物，然后對組織分析涉及對該化合物產(chǎn)生神經(jīng)反應的基因的誘導情況。例如，可以篩選在某些神經(jīng)系統(tǒng)的組織、諸如大腦的海馬區(qū)中誘導的基因。該技術由Nedivi等(《自然》(Nature)，363718-722 ；Nedivi等，《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad Sci.USA)，932048-2053 )用于鑒定海馬齒狀回中誘導的新型基因對給予稱作紅藻氨酸(海人草酸)的谷氨酸的神經(jīng)遞質類似物的反應。
通過傳入神經(jīng)元的活性和/或通過神經(jīng)元損傷來調(diào)節(jié)許多神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子諸如NGF、BDNF、NT3、GDNF、bFGF、IGF-1和TGF-β。在海馬的齒狀回中可以觀察到這些基因中的一些對谷氨酸類似物紅藻氨酸的強誘導反應(Isackson，《神經(jīng)生物學中的最新觀點》550-357 )?？雌饋砑t藻氨酸的處理可以增加新型化合物從警覺大鼠的海馬中的釋放，且看起來這種活性不同于公知的神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用(Humpel等，《科學》(Science)，269552-554 )。
鑒于許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病和障礙還沒有公知的療法這一事實，本領域中存在一種對確定用于治療神經(jīng)疾患和疾病的新型化合物的需求，所述疾病諸如帕金森病、肌萎縮性側索硬化(ALS)、阿爾茨海默病、中風、以及影響視覺的各種變性疾病。
本文中另有證據(jù)證明NNT-1化合物可以具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的生物活性、特別是通過使得B-細胞和T-細胞的生產(chǎn)增加的方式。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供可用于促進神經(jīng)元再生并恢復神經(jīng)功能的新型化合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供治療神經(jīng)性疾病、諸如那些本文所列疾病的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供治療免疫性疾病、諸如那些本文所列疾病的方法。
對于本領域普通技術人員來說，從本發(fā)明公開的技術內(nèi)容中，這些和其它的目的是顯而易見的。
發(fā)明概述在一種實施方案中，本發(fā)明提供了編碼多肽的一種核酸分子，它選自如下核酸分子組成的組(a)SEQ ID NO1的核酸分子；(b)SEQ ID NO3的核酸分子；(c)編碼SEQ ID NO2的多肽或其生物活性片段的核酸分子；(d)編碼一種與SEQ ID NO2多肽至少有70％同一性的多肽的核酸分子；(e)在嚴格條件下與上述(a)-(d)中任意一種核酸分子雜交的核酸分子；以及(f)作為上述(a)-(e)中任意一種核酸分子的互補序列的核酸分子。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了編碼多肽的一種核酸分子，它選自如下核酸分子組成的組(a’)SEQ ID NO4的核酸分子；(b’)編碼SEQ ID NO5的多肽或其生物活性片段的核酸分子；(c’)編碼一種與SEQ ID NO5多肽有至少70％同一性的多肽的核酸分子；(d’)在嚴格條件下與上述(a’)-(c’)中任意一種核酸分子雜交的核酸分子；以及
(e’)作為上述(a’)-(d’)中任意一種核酸分子的互補序列的核酸分子。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了含有這些核酸分子的載體和含有該載體的宿主細胞(原核或真核細胞)。
本發(fā)明進一步提供了一種NNT-1多肽，它選自下列多肽組成的組(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQID NO2的1-198位氨基酸的多肽；(c)與(a)或(b)的多肽至少有70％同一性的多肽；以及(d)(a)-(c)中的任意一種多肽的生物活性片段。
本發(fā)明進一步提供了一種NNT-1多肽，它選自下列多肽組成的組(a’)SEQ ID NQ5的多肽；(b’)SEQ ID NO5的1-198位氨基酸的多肽；(c’)與(a’)或(b’)的多肽至少70％同一性的多肽；以及(d)(a’)-(c’)中的任意一種多肽的生物活性片段。
可選擇的情況是，NNT-1多肽可以或可以不含有氨基末端甲硫氨酸。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)NNT-1多肽的方法，其中多肽可以是SEQ ID NO2或SEQ ID NO5、SEQ ID NO2的1-198位氨基酸、SEQ ID NO5的1-198位氨基酸、或它們的生物活性片段，且其中該方法包括下列步驟(a)在一種合適的宿主中表達由NNT-1核酸分子編碼的一種多肽；并且(b)分離該多肽。
本發(fā)明進一步提供了抗NNT-1抗體。
附圖的簡要說明附

圖1描繪了編碼人NNT-1的cDNA的核酸序列(SEQ ID NO1)。
附圖2描繪了針對NNT-1的人體基因組DNA的核酸序列(SEQ IDNO3)。
附圖3描繪了當翻譯自cDNA(SEQ ID NO2)時針對的人NNT-1的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。前27個氨基酸可以代表一個信號肽序列，使得NNT-1的成熟形式起始于如號碼1表示的亮氨酸。*表示終止密碼子。
附圖4描繪了編碼鼠NNT-1的cDNA的核酸序列(SEQ ID NO4)。
附圖5描繪了當翻譯自cDNA(SEQ ID NO4)時針對的鼠NNT-1的氨基酸序列(SEQ ID NO5)。前27個氨基酸可以代表一個信號肽序列，使得鼠NNT-1的成熟形式起始于如號碼1表示的亮氨酸。*表示終止密碼子。
附圖6描繪了NNT-1、IL-11(SEQ ID NO8)、IL-6(SEQ IDNO9)、G-CSF(SEQ ID NO10)、心營養(yǎng)蛋白(cardiotrophin)(SEQ ID NO11)、CNTF(SEQ ID NO12)、制癌蛋白(SEQ IDNO13)和LIF(SEQ ID NO14)的氨基酸的比較情況。在每一種情況中，均比較人體分子。
附圖7描繪了針對與人CNTF相比的人NNT-1的雞運動神經(jīng)元活性檢測結果的示意圖。
附圖8描繪了針對與人CNTF相比的人NNT-1的雞交感神經(jīng)元活性檢測結果的示意圖。
附圖9描繪了來自陰性對照小鼠(#22)的正常脾，20x物鏡，H&E染色。
附圖10描繪了來自患有淋巴增生的NNT-1轉基因小鼠(#62)的脾(箭頭)。
附圖11描繪了來自對照小鼠的正常肝，10x物鏡，H&E染色。
附圖12描繪了來自患有竇狀隙中(箭頭)和周圍血管淋巴聚集的NNT-1轉基因小鼠(#60)的肝，H&E染色。
附圖13描繪了表明NNT-1誘導血清SAA的數(shù)據(jù)(p＜0.001)。每組有5只小鼠。
附圖14描繪了表明NNT-1增強由血清中皮質酮的IL-1的誘導作用的數(shù)據(jù)(p＜0.01)和增加與IL-1無關的皮質酮血清水平的數(shù)據(jù)(p＜0.001)。每組有5只小鼠。
附圖15描繪了表明NNT-1增強由血清中IL-6中的IL-1的誘導作用的數(shù)據(jù)(p＜0.001)。每組有5只小鼠。
附圖16描繪了表明NNT-1阻斷LPS誘導的血清TNF水平增加的數(shù)據(jù)(p＜0.001)。在LPS治療組中有10只小鼠，其它組中有5只小鼠。
附圖17描繪了表明NNT-1增加小鼠體內(nèi)外周淋巴節(jié)中總數(shù)(p＜0.04)的數(shù)據(jù)和CD45-陽性細胞的數(shù)據(jù)(p＜0.001)。
發(fā)明詳述本發(fā)明范圍中所包括的技術內(nèi)容是NNT-1多肽、諸如SEQ ID NO2或SEQ ID NO5的多肽，及其相關生物活性多肽片段和衍生物。本發(fā)明范圍內(nèi)還包括的技術內(nèi)容是編碼這些多肽的核酸分子以及用于制備該多肽的方法。
I.NNT-1蛋白質/多肽、片段及其衍生物本文所用的術語“NNT-1蛋白質”或“NNT-1多肽”指的是具有本文針對NNT-1所述特性的任意蛋白質或多肽。NNT-1多肽可以或可以不含有氨基末端甲硫氨酸，這取決于、例如它的制備方式。通過舉例說明，NNT-1蛋白質或NNT-1多肽指的是(1)由下列任意一項所定義的NNT-1核酸分子編碼的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1的核酸分子；(b)SEQ ID NO3的核酸分子；(c)編碼SEQ ID NO2的多肽或其生物活性片段的核酸分子；(d)編碼一種與SEQ ID NO2多肽至少70％同一性的多肽的核酸分子；(e)在嚴格條件下與上述(a)-(d)中任意一種核酸分子雜交的核酸分子；和(f)作為上述(a)-(e)中任意一種核酸分子的互補序列的核酸分子；以及(a’)SEQ ID NO4的核酸分子；(b’)編碼SEQ ID NO5的多肽或其生物活性片段的核酸分子；(c’)編碼一種與SEQ ID NO5多肽至少70％同一性的多肽的核酸分子；(d’)在嚴格條件下與上述(a’)-(c’)中任意一種核酸分子雜交的核酸分子；和(e’)作為上述(a’)-(d’)中任意一種核酸分子的互補序列的核酸分子；以及(2)與SEQ ID NO2或SEQ ID NO5的NNT-1多肽比較，導致一個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入的NNT-1基因的天然存在的等位變體，和/或(3)如本文所提供的化學修飾的衍生物及其核酸或氨基酸序列變體。
已經(jīng)用于實施本發(fā)明的NNT-1多肽可以是天然存在的全長多肽、或者是截短的多肽或肽(即“片段”)。
多肽可以是成熟形式或者它們可以與天然或異質的信號肽結合。例如，人和小鼠NNT-1分別含有SEQ ID NO2和5的-27位至-1位氨基酸的信號肽。
如下所述，可以將多肽或片段進行化學修飾，即將其糖基化、磷酸化和/或與一種聚合物連接；且它們可以含有一個氨基末端甲硫氨酸，這取決于如何制備它們。此外，該多肽或片段可以是天然存在的NNT-1多肽的變體(即與天然存在的NNT-1比較，它們可以含有一個或多個氨基酸的缺失、插入和/或取代)。
本文所用的術語“NNT-1片段”指的是小于天然存在的NNT-1蛋白質的全長氨基酸序列、而定性地具有與上述NNT-1多肽或NNT-1蛋白質基本相似的生物活性的肽或多肽?？梢詫⑦@類片段在氨基末端、羧基末端或兩個末端進行截短；且可以將這類片段進行化學修飾。這類NNT-1片段可以用或可以不用氨基末端甲硫氨酸來制備。該片段的活性可以大于、或小于全長(成熟)NNT-1多肽的活性、或與之相同。正如標準活性檢測法、諸如本文實施例部分所列的那些方法所測定的，優(yōu)選該片段的活性≥50％、更優(yōu)選≥65％、最優(yōu)選≥80％的全長多肽的活性。本發(fā)明的某些典型片段包括從NNT-1多肽的C末端、N-末端或兩個末端去除了1-20個氨基酸的多肽。
本文所用的術語“NNT-1衍生物”或“NNT-1變體”指的是NNT-1多肽、蛋白質或片段，它們1)例如通過添加一個或多個聚乙二醇分子、糖類、磷酸酯類或其它不與野生型NNT-1多肽天然結合的這類分子已經(jīng)被化學修飾；和/或它們2)與附圖3(人)或附圖5(小鼠)中所列NNT-1氨基酸序列相比，含有一個或多個核酸或氨基酸序列的取代、缺失和/或插入。
本文所用的術語“生物活性多肽”和“生物活性片段”指的是按照以上針對NNT-1描述的肽或多肽，其中NNT-1對于(a)神經(jīng)元(例如運動神經(jīng)元和/或交感神經(jīng)元)或(b)諸如B細胞和T細胞這樣的免疫細胞起到了生長因子的作用。
可以將在活性測定中本身不具備活性的NNT-1片段和/或衍生物用作體外或體內(nèi)NNT-1受體的調(diào)節(jié)劑(例如抑制劑或刺激劑)或用于制備抗NNT-1多肽的抗體。
本發(fā)明NNT-1的氨基酸變體優(yōu)選與SEQ ID NO2或SEQ ID NO5至少有70％同一性、更優(yōu)選與SEQ ID NO2或SEQ ID NO5至少有約80％同一性、甚至更優(yōu)選90％與SEQ ID NO2或SEQ IDNO5至少有約同一性。
通過通常用于比較兩種多肽在氨基酸位置上的相似性的標準方法可以測定序列同一性的百分比。舉例來說、使用諸如BLAST或FASTA這樣的計算機程序，將待測序列同一性百分比的兩種多肽的相應氨基酸排列成最佳配對(“配對廣度”，它可以包括全長的一個或兩個序列或預測定的一個或兩個序列的部分)。每一計算機程序提供一種“默認”開口補償(penalty)和一種“默認”缺口補償，并提供一種得分矩陣、諸如PAM250?？梢詫⒁环N標準得分矩陣(參見Dayhoff等《蛋白質序列和結構圖譜集》(Atlas of Protein Sequence andStructure)第5卷增刊3 )與該計算機程序聯(lián)用。然后使用在如下的諸如FASTA這樣的程序中包含的公式，可以來計算同一性百分比

與野生型NNT-1相比，至少70％相同的多肽一般含有一個或多個氨基酸的取代、缺失和/或插入。取代通常是保守的以便對蛋白質的總凈電荷、極性、或疏水性有較小或沒有影響，而取代可以任意增加NNT-1的活性。保守取代的情況如下表I中所列。
表I保守的氨基酸的取代堿性精氨酸賴氨酸組氨酸酸性谷氨酸天冬氨酸極性谷氨酰胺天冬酰胺疏水性 亮氨酸異亮氨酸纈氨酸芳族的 苯丙氨酸色氨酸酪氨酸小 甘氨酸丙氨酸絲氨酸蘇氨酸甲硫氨酸本發(fā)明還包括NNT-1的種的同系物；例如除人以外，來自諸如狗、貓、小鼠、大鼠、猴、馬、豬、山羊、家兔、綿羊等這樣的哺乳動物物種的NNT-1同系物也是所預計的。將小鼠cDNA和蛋白質的序列定為SEQ ID NOS4和5。
本發(fā)明進一步包括嵌合多肽，諸如與另一種多肽的全部或部分結合的NNT-1。優(yōu)選該嵌合多肽含有與另一種神經(jīng)營養(yǎng)因子的全部或部分結合的NNT-1，所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子諸如BDNF、GDNF、NT-3、NT-4、NT-5、NT-6等?？梢詫⑺龆嚯牡腘與C末端、C與C末端或N與N末端結合。
II.核酸當本文所用的術語“NNT-1”用于描述核酸分子時，該術語指的是如上所述的核酸分子或其片段。
術語“嚴格條件”指的是在僅允許將諸如寡核苷酸或cDNA分子探針這樣的核酸分子與高度同源序列結合的條件下進行的雜交和洗滌。一種嚴格的洗滌溶液是在55℃-65℃的溫度下使用的0.015MNaCl、0.005M檸檬酸鈉和0.1％SDS。另一種嚴格的洗滌溶液是在50℃-65℃的溫度下使用的0.2×SSC和0.1％SDS。在將寡核苷酸探針用于篩選cDNA或基因組文庫的情況下，可以使用下列嚴格的洗滌條件。一種方案是在35℃-62℃的溫度下使用含有0.05％焦磷酸鈉的6×SSC，這取決于寡核苷酸探針的長度。例如，在35-40℃下洗滌14個堿基對的探針、在45-50℃下洗滌17個堿基對的探針、在52-57℃下洗滌20個堿基對的探針、且在57-63℃下洗滌23個堿基對的探針?？梢詫囟壬?-3℃，其中背景非特異性結合看起來很高。第二種方案是使用氯化四甲銨(TMAC)洗滌寡核苷酸探針。一種嚴格的洗滌溶液是3M TMAC、50mM Tris-HCl(pH8.0)和0.2％的SDS。使用該溶液的洗滌溫度是探針長度的函數(shù)。例如，在約45-50℃下洗滌17個堿基對的探針。
對于在哺乳動物組織或體液樣品中NNT-1DNA或RNA的存在來說，可以將自身不編碼在活性測定中有活性的多肽的NNT-1核酸分子、片段、和/或衍生物定性地或定量地用作在用于測試的診斷測定中的雜交探針。
本發(fā)明范圍內(nèi)還包括編碼與上述文本所述天然或異源信號肽和/或嵌合多肽結合的NNT-1多肽的NNT-1核酸分子。
III.用于制備NNT-1多肽的方法A.重組方法使用諸如Sambrook等(《分子克隆實驗室手冊》冷泉港實驗室出版社，冷泉港，NY )和/或Ausubel等編輯(《分子生物學最新技術方案》，Green Publishers Inc.以及Wiley和Sons，NY )所列的那些眾所周知的重組DNA技術方法可以制備全長NNT-1多肽或其片段。例如通過篩選基因組或cDNA文庫或通過PCR擴增可以獲得編碼NNT-1蛋白質或其片段的一種基因或cDNA。另一方面，使用諸如由Engels等所述的那些本領域技術人員眾所周知的方法通過化學合成可以制備編碼NNT-1多肽或片段的一種基因(Angew.Chem.Intl.Ed.，28716-734 )。這些方法尤其包括用于核酸合成的磷酸三酯、亞磷酰胺和H-磷酸酯法。用于這類化學合成的優(yōu)選方法是使用標準亞磷酰胺化學法的聚合物支持的合成法。一般來說，編碼NNT-1多肽的DNA長度為幾百個核苷酸。使用這些方法可以將大于約100個核苷酸的核酸合成為幾個片段。然后可以將所述片段相互連接成全長NNT-1多肽。通常，編碼多肽氨基末端的DNA片段含有ATG，它編碼甲硫氨酸殘基。該甲硫氨酸可以或可以不存在于NNT-1多肽的成熟形式之上，這取決于宿主細胞中產(chǎn)生的多肽是否是從該細胞中分泌的。
在某些情況中，制備天然存在的NNT-1的核酸和/或氨基酸變體可能是所希望的。使用位點定向突變或PCR擴增可以生產(chǎn)核酸變體(其中將一個或多個核苷酸設計成不同于野生型或天然存在的NNT-1的形式)，其中引物具有所需的點突變(參見Sambrook等，見上文；和Ausubel等，見上文，對于突變技術的描述)。也可以將使用上文由Engels等所述方法的化學合成用于制備這類變體。也可以使用本領域技術人員公知的其它方法。優(yōu)選的核酸變體是那些含有核苷酸取代的物質，其中核苷酸的取代導致在用于產(chǎn)生NNT-1的宿主細胞中出現(xiàn)優(yōu)選的密碼子。其它優(yōu)選的變體是那些編碼如上所述與野生型相比為保守的氨基酸變體的物質(例如，其中天然存在的氨基酸側鏈的電荷或極性基本上沒有因用不同氨基酸的取代而改變)、和/或那些設計成在NNT-1上產(chǎn)生新型糖基化和/或磷酸化位點的物質、或那些設計成使NNT-1上缺失存在的糖基化和/或磷酸化位點的物質。
可以將NNT-1基因或cDNA插入用于在宿主細胞中表達的合適的表達載體。所選擇的該載體在所用特定的宿主細胞中起作用(即該載體與宿主細胞機器相容，使得可以發(fā)生NNT-1基因的擴增和/或該基因的表達)?？梢栽谠?、酵母、昆蟲(桿狀病毒系)和/或真核宿主細胞中擴增/表達該NNT-1多肽或其片段。宿主細胞的選擇至少部分取決于NNT-1多肽或其片段是否被糖基化。如果如此，那么酵母、昆蟲或哺乳動物宿主細胞是優(yōu)選的；酵母細胞將使多肽糖基化，且昆蟲和哺乳動物細胞可以使多肽糖基化和/或磷酸化，此時，這種情況自然發(fā)生在NNT-1多肽上(即“天然”糖基化和/或磷酸化)。
一般來說，在任何宿主細胞中所用的載體含有5’側翼序列(也稱作“啟動子”)，和其它調(diào)節(jié)元件，諸如增強子、復制元件起點、轉錄終止元件、含有供體和受體剪接位點的完全內(nèi)含子序列、信號肽序列、核糖體結合位點元件、聚腺苷酸化序列、用于插入編碼待表達多肽的核酸的多接頭區(qū)以及選擇標記元件。下面將討論這些元件中的每一種?？蛇x擇的是，載體可以含有一種“標記”序列，即位于編碼聚-His(諸如六-His)的NNT-1編碼序列的5’或3’末端的寡核苷酸序列或另一種小的免疫原性序列。這種標記物將與蛋白質一起被表達，并且這種標記物可用作用于純化來自宿主細胞的NNT-1多肽的親和標記物?？蛇x擇的是，隨后可以通過各種方式、諸如使用一種選擇的肽酶，將該標記物從純化的NNT-1多肽中去除。
5’側翼序列可以是同源的(即來自與宿主細胞相同的種和/或株)、異源的(即來自不是宿主細胞的種或株的一個種)、雜交的(即來自一種以上來源的5’側翼序列的結合)、合成的、或者它可以是天然NNT-1的5’側翼序列。就此而論，5’側翼序列的來源可以是任意單細胞的原核或真核生物體、任意的脊椎動物或無脊椎動物生物體、或任意的植物，條件是5’側翼序列在宿主細胞機器中起作用并且可以被宿主細胞機器激活。
通過本領域眾所周知的幾種方法的任意一種方法可以獲得用于本發(fā)明載體的5’側翼序列。一般來說，通過做圖譜和/或通過限制酶切消化已經(jīng)預先鑒定了本文所用的5’側翼序列而不是NNT-15’側翼序列且因此可以使用合適的限制酶從適當?shù)慕M織來源中分離本文所用的5’側翼序列。在某些情況中，5’側翼序列的全部核苷酸序列可以是公知的。此處，使用上述用于核酸合成或克隆的方法可以合成5’側翼序列。
如果已知全部或僅部分的5’側翼序列，那么它可以使用PCR和/或通過用來自相同或另一物種的合適的寡核苷酸和/或5’側翼序列片段篩選基因組文庫來獲得。
如果5’側翼序列不是已知的，那么可以從可含有例如編碼序列或者甚至另一種基因或多種基因的更長一段DNA中分離含有5’側翼序列的DNA片段。使用一種或多種仔細選擇的酶、通過限制酶切消化來完成分離過程，從而分離出合適的DNA片段。消化后，通過瓊脂糖凝膠純化、Qiagen柱或其它本領域技術人員公知的方法可以分離所需的片段。達到這一目的的合適酶的選擇對于本領域普通技術人員來說是顯而易見的。
復制元件的起點一般是商購原核表達載體的一部分并且在宿主細胞中輔助該載體的擴增。在某些情況中，將該載體擴增至某一拷貝數(shù)這一過程對于NNT-1多肽的最佳表達來說是重要的。如果選擇的載體不含有復制位點的起點，那么可以以公知的序列為基礎、通過化學方式來合成它并且將它連入載體。
轉錄終止元件一般位于NNT-1多肽編碼序列的3’末端且用于終止NNT-1多肽的轉錄。原核細胞中轉錄終止元件通常是一個G-C富含片段，后面是一個poly T序列。當從一種文庫中簡易克隆該元件或者甚至商購該元件作為載體的部分時，它也可以使用用于核酸合成的方法、諸如那些上述的方法方便地來合成。
選擇標記基因元件編碼對在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞的存活和生長而言所必需的蛋白質。典型的選擇標記基因編碼具有下列特征的蛋白質(a)對于原核宿主細胞來說，對抗菌素或其它毒素賦予了抗性，例如氨芐青霉素、四環(huán)素或卡那霉素；(b)補充細胞的營養(yǎng)缺陷型缺失；或(c)提供不會從復合培養(yǎng)基中得到的關鍵營養(yǎng)物。優(yōu)選的選擇標記是卡那霉素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因。
通常稱作SD序列(原核細胞)或Kozak序列(真核細胞)的核糖體結合元件是mRNA翻譯起始所必需的。該元件一般位于待合成的NNT-1多肽的3’端至啟動子和5’端至編碼序列。SD序列是可變的，但一般是一種聚嘌呤(即含有高含量的A-G)。已經(jīng)鑒定了許多SD序列，使用上述所列的方法可以方便地合成它們中的每一種并將它們用于原核載體。
在希望從宿主細胞中分泌NNT-1的那些情況中，可以將信號序列用于指導NNT-1多肽由其被合成的宿主細胞中出來，且可以使蛋白質羧基末端部分缺失以便防止膜的錨著。一般來說，將信號序列定位在NNT-1核酸序列的編碼區(qū)中、或直接定位在NNT-1編碼區(qū)的5’末端。已經(jīng)鑒定了許多信號序列，且可以將在所選宿主細胞中起作用的它們中的任意一種與NNT-1基因一起使用。因此，該信號序列可以是與NNT-1多肽同源的或異源的。此外，使用上述所列的方法可以以化學方式合成該信號序列。在大多數(shù)情況中，通過存在的信號肽從宿主細胞中分泌多肽這一過程將導致氨基末端甲硫氨酸從該多肽中被除去。用于進行NNT-1多肽的表達和分泌的分泌序列的實例選自tPA前導序列(參見，例如Rickles等《生物化學雜志》(J.Biol.Chem.)2631563-1560 和Feng等《生物化學雜志》(J.Biol.Chem.)2652022-2027 )、BPO前導序列和心營養(yǎng)蛋白(cardiotrophin)前導序列。
在許多情況中，通過載體上存在的一種或多種內(nèi)含子來增加NNT-1多肽的轉錄；在真核宿主細胞、特別是哺乳動物宿主細胞中產(chǎn)生NNT-1這一事實是非常確定的。所用內(nèi)含子可以是NNT-1核酸序列內(nèi)天然存在的，特別是其中所用的NNT-1序列是一種全長基因組序列或其片段。如果在NNT-1 DNA序列(到目前為止最多的是cDNAs)中內(nèi)含子不是天然存在的，那么該內(nèi)含子可以從另一種來源獲得。當將內(nèi)含子必須轉錄成有效的時，相對于5’側翼序列和NNT-1編碼序列的內(nèi)含子的位置是重要的。就此而言，如果NNT-1核酸序列是cDNA序列，那么內(nèi)含子的優(yōu)選位置是3’端至轉錄起始位點和5’端至polyA轉錄終止序列。對于NNT-1 cDNAs來說，優(yōu)選內(nèi)含子位于NNT-1編碼序列的一側或另一側(即5’或3’)上，使得它不切斷該編碼序列?？梢詫碜匀我鈦碓吹娜我鈨?nèi)含子、包括任何病毒、原核和真核(植物或動物)生物體用于實施本發(fā)明，條件是它與插入的宿主細胞相容。本文還包括的是合成的內(nèi)含子?？蛇x擇的是，在載體中可以使用一種以上的內(nèi)含子。
如果上述所列的一種或多種元件已經(jīng)不存在于待用的載體中，那么可以分別獲得它們并將它們連入該載體。用于獲得所述元件中的每一種的方法是本領域技術人員眾所周知的并且可與上述所列方法(即DNA的合成、文庫篩選等)相比擬。
一般由諸如市售可得的載體這樣的起始載體來構建用于實施本發(fā)明的最終載體。這類載體可以含有或可以不含有完整載體中所包括的某些元件。如果沒有任何一種所需元件存在于起始載體中，那么通過用合適的限制酶切割該載體可以分別將每一種元件連入載體，使得所連入元件的末端和載體的末端適于連接。在某些情況中，必須使相互連接的末端“鈍化”，以便獲得一種令人滿意的連接方式。在有所有四種核苷酸存在的情況下，使用Klenow DNA聚合酶或T4 DNA聚合酶通過首先補平“粘端”來實現(xiàn)鈍化。該過程是本領域眾所周知的且例如上文Sambrook等所述。
另一方面，可以首先將待插入載體的兩種或多種元件相互連接(如果它們以相互鄰接的方式定位)，然后將它們連入該載體。
用于構建該載體的一種其它方法是在一種反應混合物中同時進行各種元件的全部連接。此處，將產(chǎn)生許多無義或非功能性載體，原因是不適當?shù)剡B接或插入了這些元件，然而，通過限制酶切消化可以鑒定并選擇功能性載體。
用于實施本發(fā)明的優(yōu)選載體是那些與細菌、昆蟲和/或哺乳動物宿主細胞相容的載體。這類載體尤其包括pCRII(Invitrogen Company，San Diego，CA)、pBSII(Stratagene Company，LaJolla，CA)和pETL(BlueBacII；Invitrogen)。
在已經(jīng)構建載體并已經(jīng)將NNT-1核酸插入該載體的合適位點后，可以將該完整的載體插入用于擴增和/或NNT-1多肽表達的合適的宿主細胞中。
宿主細胞可以是原核宿主細胞(諸如大腸桿菌)或真核宿主細胞(諸如一種酵母細胞、一種昆蟲細胞或一種脊椎動物細胞)。當在合適的條件下培養(yǎng)時，該宿主細胞可以合成NNT-1蛋白質，隨后可以從培養(yǎng)基中收集這種蛋白質(如果宿主細胞將其分泌入培養(yǎng)基)或直接從產(chǎn)生該蛋白質的宿主細胞中收集它(如果它不是分泌的)。收集后，可以使用諸如分子篩層析、親和層析等方法來純化這種NNT-1蛋白質。
宿主細胞的選擇部分取決于NNT-1蛋白質是否被糖基化或磷酸化(其中真核宿主細胞的情況是優(yōu)選的)，且宿主細胞能夠將蛋白質“折疊”成其天然三級結構(例如合適的二硫鍵取向等)的方式使得通過該細胞來制備生物活性蛋白質。然而，如果該宿主細胞不合成生物活性NNT-1，那么使用如下討論的合適的化學條件在合成后可以將NNT-1“折疊”。
合適的細胞或細胞系可以是哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或3T3細胞。合適的哺乳動物宿主細胞的選擇和用于轉化、培養(yǎng)、擴增、篩選和產(chǎn)物的產(chǎn)生和純化的方法是本領域公知的。其它合適的哺乳動物細胞系是猴COS-1和COS-7細胞系以及CV-1細胞系。另外典型的哺乳動物宿主細胞包括靈長類動物細胞系和嚙齒類動物細胞系、其中包括轉化的細胞系。正常的二倍體細胞、來源于初生組織體外培養(yǎng)物的細胞株以及初生外植塊也是合適的。候選的細胞在選擇基因中可以是基因型缺損的或者可以含有顯著作用的選擇基因。其它合適的哺乳動物細胞系包括但不限于HeLa、小鼠L-929細胞、來源于Swiss、Balb-c或NIH小鼠的3T3系、BHK或HaK倉鼠細胞系。
類似用作適于本發(fā)明的宿主細胞是細菌細胞。例如大腸桿菌的各種菌株(例如HB101、DH5α、DH10和MC1061)作為生物技術領域中的宿主細胞是眾所周知的。還可以將枯草芽孢桿菌、假單胞菌屬的種、其它芽孢桿菌屬的種、鏈霉菌屬的種等的各種菌株用于本方法。
為本領域技術人員公知的許多酵母細胞菌株也可以用作用于表達本發(fā)明多肽的宿主細胞。另外，如果需要，可以將昆蟲細胞用作本發(fā)明方法中的宿主細胞(Miller等，《遺傳工程》(GeneticEngineering)8277-298 )。
使用諸如氯化鈣法、電穿孔法、微注射法、脂轉染法或DEAE葡聚糖法這類的方法可以完成將載體插入所選宿主細胞中的過程(也稱作“轉化”或“轉染”)。所選方法部分上是所用宿主細胞類型的函數(shù)。這些方法和其它合適的方法對于本領域技術人員來說是眾所周知的并且例如上文中Sambrook等所列。
使用本領域技術人員眾所周知的標準培養(yǎng)基可以培養(yǎng)含有該載體的宿主細胞(即“轉化”或“轉染”的)。通常該培養(yǎng)基含有細胞生長和存活所必需的全部營養(yǎng)物。用于培養(yǎng)大腸桿菌細胞的合適培養(yǎng)基是、例如Luria肉湯(LB)和/或Terrific肉湯(TB)。用于培養(yǎng)真核細胞的合適培養(yǎng)基是RPMI 1640、MEM、DMEM，可以用作為所培養(yǎng)的具體細胞系所需的血清和/或生長因子補充上述所有培養(yǎng)基。用于昆蟲培養(yǎng)的合適培養(yǎng)基是Grace’s培養(yǎng)基，將該培養(yǎng)基用所需的yeasto1ate、水解乳白蛋白和/或胎牛血清進行了補充。
一般來說，用于轉化細胞選擇性生長的抗菌素或其它化合物僅作為補充物加入培養(yǎng)基。所用化合物由存在于質粒上的選擇標記元件來確定，其中用所述質粒來轉化宿主細胞。例如，如果選擇標記元件是卡那霉素抗性元件，那么加入培養(yǎng)基的化合物將是卡那霉素。
使用本領域公知的標準方法可以估計宿主細胞中產(chǎn)生的NNT-1多肽的量。這類方法包括但不限于蛋白質印跡分析法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法、非變性凝膠電泳法、HPLC分離法、免疫沉淀法和/或諸如DNA結合凝膠位移測定這樣的活性測定法。
如果已經(jīng)將NNT-1多肽設計成從宿主細胞中分泌的話，那么在細胞培養(yǎng)基中可以發(fā)現(xiàn)大部分的多肽。以這種方式制備的多肽一般不含有氨基末端甲硫氨酸，因為在從細胞分泌的過程中它被去除。但是如果NNT-1多肽不從宿主細胞中分泌的話，它將存在于胞質中(對于真核、革蘭氏陽性細菌和昆蟲宿主細胞來說)或周質中(對于革蘭氏陰性細菌宿主細胞來說)并且可以含有氨基末端甲硫氨酸。
對于胞內(nèi)NNT-1蛋白質來說，一般首先將宿主細胞用機械或滲透方式破碎以便將胞質內(nèi)容物釋放入緩沖溶液。然后可以從這種溶液中分離NNT-1多肽。
使用各種技術可以完成從溶液中純化NNT-1多肽。如果已經(jīng)合成的該多肽使得它含有諸如六組氨酸(NNT-1/hexaHis)或在其羧基或氨基末端的其它小肽這樣的標記物，那么它可以通過使該溶液經(jīng)過親和柱以一步法而基本上得到純化，其中柱基質直接對該標記物或對該多肽具有高度的親和性(即特異性識別NNT-1的單克隆抗體)。例如，聚組氨酸以巨大的親和性和特并性與鎳結合，由此可以將鎳親和柱(諸如Qiagen鎳柱)用于純化NNT-1/聚-His。(參見，例如，Ausubel等編輯《最新分子生物學技術方案》(Current Protocols inMolecular Biology)第10.11.8節(jié)，John Wiley & Sons，New York )。
如果NNT-1多肽不含有標記物且沒有得到抗體，那么可以使用用于純化的其它眾所周知的方法。這類方法包括但不限于離子交換層析法、分子篩層析法、HPLC、與凝膠洗脫聯(lián)用的天然凝膠電泳法和制備等電聚焦法(“異原”機/技術，Hoefer Scientific)。在某些情況中，可以將這些技術中的兩種或多種聯(lián)用以便達到增加純度的目的。用于純化的優(yōu)選方法包括與制備等電聚焦法聯(lián)用的聚組氨酸標記法和離子交換層析法。
如果預計主要在細菌周質空間內(nèi)或在真核細胞胞質內(nèi)發(fā)現(xiàn)NNT-1多肽，那么如果所加工的多肽已經(jīng)形成了這類復合物，則使用本領域技術人員公知的任意標準技術可以從宿主細胞中提取包括內(nèi)含體(例如革蘭氏陰性細菌)在內(nèi)的周質或胞質的內(nèi)含物。例如，用弗氏壓碎器、勻漿和/或超聲處理可以將宿主細胞裂解以便釋放周質的內(nèi)含物。然后可以將勻漿進行離心。
如果NNT-1多肽已經(jīng)在周質中形成了內(nèi)含體，那么內(nèi)含體通?？梢耘c細胞內(nèi)和/或外膜結合并由此主要在離心后的沉淀物中得以發(fā)現(xiàn)。然后可以將沉淀物用離液劑、諸如胍或脲處理以便使內(nèi)含體釋放、分裂并溶解。然后使用凝膠電泳法、免疫沉淀法等可以分析目前是可溶形式的NNT-1多肽。如果需要分離NNT-1多肽，那么使用諸如如下所列和由Marston等(《酶法》(Meth.Enz.)182264-275 )所述的標準方法可以完成分離過程。
如果NNT-1多肽內(nèi)含體沒有在宿主細胞的周質中形成到一種顯著的程度，那么主要在離心細胞勻漿后的上清液中發(fā)現(xiàn)NNT-1多肽，且使用如下所列的方法可以從該上清液中分離NNT-1多肽。
在優(yōu)選部分或全部分離NNT-1多肽的那些情況中，使用本領域技術人員眾所周知的標準方法可以實現(xiàn)純化過程。這類方法包括但不限于通過電泳、隨后進行電洗脫的分離法；各種類型的層析法(免疫親和法、分子篩法和/或離子交換法)；和/或高壓液相層析法。在某些情況中，可以優(yōu)選使用用于完全純化的一種以上的這些方法。B.化學合成法除使用重組DNA技術制備并純化NNT-1多肽以外，還可以通過使用諸如由Merrifield等(《美國化學協(xié)會雜志》(J.Am.Chem.Soc.)，852149 )、Houghten等(《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad. Sci.USA)，825132 )以及Stewart和Young(《固相肽的合成》(Solid Phase Peptide Synthesis)，PierceChem Co.，Rockford，IL )所列本領域公知方法的化學合成法(諸如固相肽合成法)來制備NNT-1多肽、其片段和/或其衍生物。這類多肽可以用或可以不用氨基末端上的甲硫氨酸來合成。使用這些參考文獻中所列的方法可以將化學合成的NNT-1多肽或片段氧化以便形成二硫鍵?？梢詫NT-1多肽或片段用作治療和免疫過程中天然純化的NNT-1多肽的生物活性或免疫替代物。IV.化學修飾的NNT-1衍生物在本發(fā)明的范圍內(nèi)包括化學修飾的NNT-1組合物(即“衍生物”)，其中NNT-1多肽與一種聚合物連接(“NNT-1-聚合物”)。所選聚合物一般是水溶性的，使得與之結合的蛋白質不會在水環(huán)境、諸如生理環(huán)境中沉淀。通常將所選聚合物修飾成帶有一種單一反應基團、諸如用于?；幕钚怎セ蛴糜谕榛娜?，使得聚合度可以得到控制而用于本發(fā)明的方法中。該聚合物可以是任意的分子量且可以是支鏈的或非支鏈的。NNT-1-聚合物的范圍中包括聚合物的混合物。對于所制備終產(chǎn)物的治療用途來說，優(yōu)選該聚合物是藥物上可接受的。
水溶性聚合物或其混合物可以選自下列物質組成的組例如聚乙二醇(PEG)、一甲氧基聚乙二醇、葡聚糖、纖維素或其它以碳水化合物為骨架的聚合物、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙基化的多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇。
對于?；磻獊碚f，所選聚合物應含有一個單一的反應的酯基。對于還原性烷基化來說，所選聚合物應含有一個單一反應的醛基。優(yōu)選的具有反應性的醛是水穩(wěn)定性的聚乙二醇丙醛或其單C1-C10的烷氧基或芳氧基衍生物(參見美國專利5,252,714)。
NNT-1的聚乙二醇化(Pegylation)可以通過本領域公知的任何聚乙二醇化反應來進行，正如下列參考文獻中所述《生長因子上的轉化灶》(Focus on Growth Factors)34-10(1992)；EP 0 154316和EP 0 401 384。優(yōu)選的情況是，如下所述通過與一種反應性聚乙二醇分子(或一種類似的反應性水溶性聚合物)的?；磻蛲榛磻獊磉M行該聚乙二醇化過程。
經(jīng)?；木垡叶蓟话惆ㄊ咕垡叶?PEG)的活性酯衍生物與NNT-1蛋白質反應。可以將任意公知的或隨后發(fā)現(xiàn)的反應性PEG分子用于進行NNT-1的聚乙二醇化。優(yōu)選的活化PEG酯是酯化成N-羥基琥珀酰亞胺(“NHS”)的PEG。正如《生物綴合物化學》5133-140(1994)中所述，預計本文所用的“?；卑ǖ幌抻谙铝蠳NT-1與一種諸如PEG這樣的水溶性聚合物的鍵合類型酰胺、氨基甲酸酯、尿烷等。反應條件可以選自聚乙二醇化領域或隨后開發(fā)的任意公知的那些條件，但條件是應當避免使待修飾的NNT-1種類失活的諸如溫度、溶劑和pH這樣的條件。
經(jīng)?；木垡叶蓟ǔ．a(chǎn)生聚-Pegylated的NNT-1產(chǎn)物，其中賴氨酸ε-氨基經(jīng)?；B接基團而被Pegylated。優(yōu)選的連接鍵是酰胺。另外優(yōu)選所得的產(chǎn)物至少有約95％的單、二或三Pegylated的。然而，通常將形成具有高度聚乙二醇化的某些種類(NNT-1的賴氨酸ε-氨基酸基團與NNT-1氨基末端上的一個α-氨基之和達到最大值)，其量取決于所用的具體的反應條件。如果需要，通過標準的純化技術可以從混合物、特別是未反應的種類中分離更加純化的Pegylated的種類，所述的標準技術包括滲析、鹽析、超濾、離子交換層析、凝膠過濾層析和電泳。
經(jīng)烷基化的聚乙二醇化通常包括在有還原劑存在的情況下使PEG的末端醛衍生物與一種諸如NNT-1這樣的蛋白質進行反應。無論聚乙二醇化的程度如何，優(yōu)選將PEG基團通過一種-CH2-NH-基團與該蛋白質結合。特別對于-CH2-基團來說，本文將這類鍵稱作“烷基”鍵。
經(jīng)還原性烷基化產(chǎn)生單Pegylated產(chǎn)物的衍生作用利用了NNT-1中衍生可得的不同類伯氨基(賴氨酸-N-末端)的不同反應性。一般來說，該反應在可以利用賴氨酸殘基的ε-氨基與所述蛋白質N-末端殘基的α-氨基之間的pKa差值的pH(見下文)下來進行。通過這類選擇性衍生作用，含有諸如醛這樣的反應基團的水溶性聚合物與蛋白質的結合得到控制與該聚合物的綴合主要發(fā)生在蛋白質的N-末端而沒有顯著修飾其它的反應基團、諸如賴氨酸側鏈氨基。本發(fā)明提供了NNT-1-單聚合蛋白綴合分子的基本上均勻的制劑(即聚合物分子在NNT-1蛋白質上的單一位置中基本上僅(即至少約95％)與NNT-1蛋白質結合)。更具體地說，如果使用聚乙二醇，那么本發(fā)明還提供了缺乏可能的抗原連接基團并具有與NNT-1蛋白質直接偶聯(lián)的聚乙二醇分子的Pegylated的NNT-1蛋白質。
本文所用的一種特別優(yōu)選的水溶性聚合物是聚乙二醇、縮寫為PEG。本文所用的聚乙二醇指的是包括已經(jīng)用于衍生其它蛋白質的任意形式的PEG，諸如單一(C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇。
一般來說，在用于使生物活性物質與活化的聚合物分子反應的任何合適的條件下可以進行化學衍生。用于制備Pegylated的NNT-1的方法一般包括下列步驟(a)在使得NNT-1與一個或多個PEG基團結合的條件下，使NNT-1多肽與聚乙二醇(諸如PEG的反應性酯或醛的衍生物)反應；和(b)得到反應產(chǎn)物。一般來說，酰化反應的最佳反應條件將根據(jù)公知的參數(shù)和所需結果來確定。例如，PEG與蛋白質的比例越大，則聚Pegylated產(chǎn)物的百分比越高。
產(chǎn)生基本上均勻數(shù)量的單聚合物/NNT-1蛋白質綴合分子的還原性烷基化一般包括下列步驟(a)在還原性烷基化條件和在適于允許對所述NNT-1蛋白質氨基末端上的α-氨基進行選擇性修飾的pH下使NNT-1蛋白質與一種反應性PEG分子反應；和(b)得到反應產(chǎn)物。
對于總體基本上均勻的單聚合物/NNT-1蛋白質綴合分子來說，還原性烷基化反應條件是使得水溶性聚合物部分與NNT-1的N-末端選擇性結合的那些條件。這類反應條件一般在賴氨酸的氨基與N-末端的α-氨基之間產(chǎn)生pKa差(pKa是在使50％的氨基質子化且50％的氨基非質子化時的pH)。該pH還影響所用聚合物與蛋白質之比。一般來說，如果pH越低，那么需要的聚合物與蛋白質之比過量越多(即N-末端α-氨基的反應性越低，則實現(xiàn)最佳條件所需的聚合物的量越大)。如果pH越高，那么聚合物蛋白質之比不需如此之大(即可用的反應性基團越多，則需要的聚合物分子越少)。對于本發(fā)明的目的來說，pH一般在3-5的范圍內(nèi)，優(yōu)選4-5。
另一重要的需考慮的內(nèi)容是聚合物的分子量。一般來說，聚合物的分子量越大，則可以與蛋白質結合的聚合物分子的數(shù)量越少。類似地，當使這些參數(shù)達到最佳值時，應考慮聚合物的分支。一般地，分子量越高(或分支越多)，則聚合物蛋白質之比越高。一般來說，對于本文所預計的聚乙二醇化反應，優(yōu)選的平均分子量是約2kDa-約100kDa(術語“約”表示±1kDa)。優(yōu)選的平均分子量為約5kDa-約50kDa，特別優(yōu)選約12kDa-約25kDa。水溶性聚合物與NNT-1蛋白質之比一般在1∶1-100∶1的范圍內(nèi)，優(yōu)選(對于聚聚乙二醇化)1∶1-20∶1和(對于單聚乙二醇化)1∶1-5∶1。
使用上述條件，還原性烷基化將使得聚合物與在氨基末端帶有α-氨基的任何NNT-1蛋白質選擇性結合并提供單聚合物/NNT-1蛋白質綴合物的基本上均勻的制劑。此處所用的術語“單聚合物/NNT-1蛋白質綴合物”指的是由與NNT-1蛋白質分子結合的單一聚合物分子組成的一種組合物。單聚合物/NNT-1蛋白質綴合物優(yōu)選在位于N-末端而不是在賴氨酸氨基側基上帶有一種聚合物分子。該制劑優(yōu)選是大于90％的單聚合物/NNT-1蛋白質綴合物、且更優(yōu)選是大于95％的單聚合物/NNT-1蛋白質綴合物，剩余的是可觀測到的未反應分子(即缺乏聚合物部分的蛋白質)。下列實例提供了一種至少約90％是單聚合物/蛋白質綴合物且約10％是未反應蛋白質的制劑。這種單聚合物/蛋白質綴合物具有生物活性。
對于本還原性烷基化來說，還原劑在水溶液中應是穩(wěn)定的且優(yōu)選僅能夠還原在還原性烷基化的初始過程中形成的席夫堿。優(yōu)選的還原劑可以選自由下列物質組成的組硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、二甲胺甲硼烷、三甲胺甲硼烷和吡啶甲硼烷。特別優(yōu)選的還原劑是氰基硼氫化鈉。
其它反應參數(shù)諸如溶劑、反應時間、溫度等以及產(chǎn)物純化的方式可以根據(jù)涉及用水溶性聚合物衍生蛋白質的公開的信息來確定。
如上所述，通過?；?或烷基化方法可以制備聚合物-NNT-1蛋白質綴合物分子的一種混合物，且可以對包括在該混合物中的單聚合物/蛋白質綴合物的比例進行選擇。因此，如果需要，可以制備與不同數(shù)量聚合物分子連接的各種蛋白質的混合物(即二、三、四等)并將它們與使用本發(fā)明方法制備的單聚合物/NNT-1蛋白質綴合物合并。
通常通過將本聚合物/NNT-1給藥可緩解或調(diào)節(jié)的疾病包括一般針對NNT-1分子的那些本文所述的疾病。然而，與非衍生的分子相比，本文公開的聚合物/NNT-1分子可以具有另外的活性、即增強或降低的活性或其它特征。V.組合物在治療神經(jīng)或免疫系統(tǒng)疾病的過程中，可以將NNT-1多肽及其片段(不管是否是被化學修飾的)單獨使用或與其它藥物組分一起使用，所述的藥物組分例如神經(jīng)營養(yǎng)因子、細胞因子、干擾素、白細胞介素、生長因子、抗菌素、抗炎藥、神經(jīng)遞質受體興奮劑或拮抗劑和/或抗體。VI.抗體可以將NNT-1多肽、片段和/或其衍生物用于制備由標準方法產(chǎn)生的抗體。因此，還認為與NNT-1多肽反應的抗體以及這類抗體的反應性片段在本發(fā)明的范圍內(nèi)。該抗體可以是多克隆、單克隆、重組、嵌合、單鏈和/或雙特異性抗體。一般來說，抗體或其片段將被“人源化”，即制備抗體或其片段以便當對病人給藥時防止對抗體產(chǎn)生免疫反應或將這種反應減小到最低限度。抗體片段可以是可與本發(fā)明NNT-1反應的任意片段，諸如Fab、Fab，等。本發(fā)明還提供了下列技術內(nèi)容通過將NNT-1或其片段作為抗原給予所選哺乳動物、隨后將哺乳動物細胞(例如脾細胞)與某些癌細胞融合而產(chǎn)生雜交瘤，從而由公知技術生成無限增殖化細胞系。本發(fā)明還包括用于產(chǎn)生這類細胞系的方法和抗本發(fā)明全部或部分人NNT-1多肽的抗體。
可以以治療的方式使用該抗體，諸如抑制NNT-1與其受體的結合?？梢詫⒃摽贵w進一步用于體內(nèi)和體外診斷的目的，諸如以標記的形式用于檢測體液中存在的NNT-1。VII.治療組合物及其給藥本文所用的術語“有效量”和“治療有效量”指的是保持上文所列NNT-1的一種或多種生物活性所必需的NNT-1的用量。
用于治療各種神經(jīng)障礙或疾病的治療組合物在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這類組合物可以含有治療有效量的NNT-1多肽或其片段(兩者均可以被化學修飾)并混有一種藥物上可接受的載體。載體物質可以是注射用水，優(yōu)選用對哺乳動物給藥的溶液中常用的其它物質補充的注射用水。一般來說，以一種組合物的形式將NNT-1治療化合物進行給藥，所述組合物含有純化的NNT-1多肽或片段(可以被化學修飾)并結合一種或多種生理上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。中性緩沖鹽水或混有血清白蛋白的鹽水是典型的合適載體。優(yōu)選使用合適的賦形劑(例如蔗糖)將產(chǎn)物配制成凍干物。根據(jù)需要可以包含其它標準的載體、稀釋劑和賦形劑。一種典型的組合物含有pH約為4.0-4.5的檸檬酸鹽緩沖液，它可以進一步包括NaCl。
可以通過非腸道系統(tǒng)地給予NNT-1組合物。另一方面，可以通過靜脈或皮下給予該組合物。當進行系統(tǒng)性給藥時，用于本發(fā)明的治療組合物可以是無熱原的非腸道可接受的水溶液形式。適當考慮到pH、等滲性、穩(wěn)定性等，這類藥物上可接受的蛋白質溶液的制劑屬于本領域的技術范圍。
對于儲存來說，用于實施本發(fā)明的NNT-1組合物的治療制劑可以通過將所選具有所需純度的組分與任意生理上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑進行混合來制備、劑型為凍干塊或水溶液(Remington’s《藥物科學》(Pharmaceutical Science)第18版，A.R.Gennaro編輯，Mack Publishing Company )。可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑對于接受者來說是無毒性的且優(yōu)選在所用劑量和濃度上是惰性的，且它們包括諸如磷酸、檸檬酸或其它有機酸這樣的緩沖液；諸如抗壞血酸這樣的抗氧化劑；低分子量多肽；諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白這樣的蛋白質；諸如聚乙烯吡咯烷酮這樣的親水聚合物；諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸這樣的氨基酸；包括葡萄糖、甘露糖或糊精在內(nèi)的單糖、二糖和其它碳水化合物；諸如EDTA這樣的螯合劑；諸如甘露醇或山梨醇這樣的糖醇；諸如鈉這樣的形成鹽的平衡離子；和/或諸如吐溫、泊洛沙姆或聚乙二醇(PEG)這樣的非離子表面活性劑。
用于體內(nèi)給藥的NNT-1組合物必須是無菌的。通過無菌濾膜的過濾會方便地完成這一過程。如果NNT-1組合物是凍干的，那么在凍干和再溶解之前或之后可以進行使用這些方法的滅菌。通常將用于非腸道給藥的該組合物以凍干的形式或以體溶液的形式儲存。
一般將治療組合物放入帶有無菌入口的一種容器中、例如帶有皮下注射針頭刺入塞的靜脈溶液袋或小瓶中。
該組合物的給藥途徑與公知的方法一致，例如口服、通過靜脈、腹膜內(nèi)、大腦內(nèi)(實質內(nèi))、腦室、肌內(nèi)、眼內(nèi)、動脈內(nèi)或損害內(nèi)的途徑注射或輸注；或者通過可任意包括使用導管的持續(xù)釋放系統(tǒng)或植入裝置。如果需要，可以通過輸注、造影劑團注射或通過植入裝置連續(xù)給予該組合物?？蛇x擇地或另外，通過植入其上已經(jīng)吸附了NNT-1多肽的膜、海綿或其它合適材料的受侵染區(qū)可以局部給予NNT-1。
如果使用植入裝置，那么可以將該裝置植入任何合適的組織或器官，諸如植入腦室或腦實質，且通過經(jīng)由造影劑團或連續(xù)給藥的裝置或通過使用連續(xù)輸注的導管可以直接運送NNT-1。
可以以持續(xù)釋放的配制品或制劑的形式給予NNT-1多肽。持續(xù)釋放制劑的合適實例包括成型制品的形狀為半透性聚合物基質的形式，例如薄膜或微囊。持續(xù)釋放的基質包括聚酯、水凝膠、polyactide(U.S.3,773,919，EP 58,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酰胺的共聚物(Sidman等《生物聚合物》(Biopolymer)22547-556 )、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等《生物醫(yī)學材料研究雜志》(J.Biomed.Mater.Res.)15167-277 和Langer等《化學技術》(Chem.Tech.)1298-105 )、乙烯基乙酸乙烯酯(Langer等，上文)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)。持續(xù)釋放的組合物還可以包含脂質體、它可以由本領域公知的幾種方法的任一種來制備(例如DE 3,218,121；Epstein等《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad Sci.USA)823688-3692 ；Hwang等《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)774030-4034 ；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP143,949)。
在某些情況中，以來自體內(nèi)的方式使用NNT-1組合物可能是所希望的，即處理已經(jīng)從病人體內(nèi)取出的細胞或組織、然后將它們植回病人體內(nèi)。
在其它情況中，通過向病人體內(nèi)植入某些細胞可以傳遞NNT-1，所述細胞已經(jīng)進行了遺傳工程改造以便表達并分泌NNT-1多肽。這類細胞可以是動物或人體細胞且可以來源于病人自身的組織或來自另一種來源、即人體的或非人體的?？蛇x擇的，細胞可以是無限增殖化的?？梢詫⑦@些細胞植入大腦、腎上腺或植入其它合適的病人的身體組織或器官。
在某些情況中，使用基因療法來對患有某種神經(jīng)性或免疫性障礙的病人給予NNT-1可能是所希望的。在這些情況中，可以將編碼NNT-1或其片段或其變體的基因組DNA、cDNA、和/或合成DNA可操作地與在將注入組合物的組織中起作用的組成型或誘導型啟動子進行連接。可以將這種可插入載體或單獨使用而不需載體的NNT-1 DNA構建體直接注入大腦或其它神經(jīng)或非神經(jīng)組織。
另一方面，可以將NNT-1 DNA構建體直接注入肌肉組織，其中它可以被吸收進入細胞并在該細胞中被表達，條件是將該NNT-1 DNA可操作地與在肌肉組織中起作用的啟動子、諸如巨細胞病毒(CMV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子或肌酸激酶啟動子進行連接。一般來說，該DNA構建體可以包括(除NNT-1 DNA和啟動子外)從諸如腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、逆轉錄病毒載體、和/或皰疹病毒載體這樣的載體中獲得的載體序列。該載體/DNA構建體中可以混有注射用藥物上可接受的載體。
在治療上所用的NNT-1組合物的有效量取決于、例如治療目的，諸如所用NNT-1的適應癥、給藥途徑和病人的具體情況。因此，對于治療學家來說必須根據(jù)需要確定劑量并改變給藥途徑根據(jù)以獲得最佳的療效。一般每日劑量可以在約0.1μg/kg-10mg/kg或更高的范圍，這取決于上述因素。一般來說，臨床醫(yī)生將NNT-1組合物給藥至達到獲得所需療效的劑量為止。因此可以在一段時間內(nèi)將NNT-1組合物作為單一劑量給藥或作為兩倍或更高的劑量(可以含有或可以不含有相同量的NNT-1)給藥、或通過植入裝置或導管的連續(xù)輸注進行給藥。
當進行進一步的研究時，將出現(xiàn)有關用于治療各種病人中不同情況的合適劑量水平的研究資料，且考慮到治療的前后關系、治療過程中的疾病類型、年齡和接受治療者的一般身體狀況，本領域普通技術人員能夠確定合適的用藥劑量。VIII.用NNT-1治療的疾病可以將NNT-1蛋白質、其片段和/或衍生物用于治療中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)疾病和障礙，這些疾病和障礙與NNT-1表達模式中的改變有關或得益于與NNT-1或抗NNT-1抗體的接觸。
可以將NNT-1蛋白質、其片段和/或衍生物用于治療中樞、自主或外周神經(jīng)系統(tǒng)的各種細胞已經(jīng)變性和/或已經(jīng)被下列情況損害的病人先天性疾病、創(chuàng)傷、機械性損傷、外傷、中風、局部出血、感染、代謝性疾病、營養(yǎng)缺乏、惡性腫瘤、和/或毒性劑。更具體地說，可以調(diào)節(jié)NNT-1蛋白質的水平(向上或向下調(diào)節(jié))以便適于下列疾病的適應癥阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮性側索硬化、進行性神經(jīng)病性綜合征、亨廷頓舞蹈病、因糖尿病或其它代謝性障礙誘發(fā)的外周神經(jīng)病和/或營養(yǎng)不良或中樞視網(wǎng)膜變性，諸如色素性視網(wǎng)膜炎、藥物誘發(fā)的視網(wǎng)膜病、夜盲的靜止形式、進行性錐柱變性等。由于在免疫系統(tǒng)細胞中也表達NNT-1(參見下面的實施例V)，所以也可以將NNT-1用于治療因免疫障礙導致的疾病。此外，由于還在造血細胞中表達NNT-1(參見下面的實施例V)，所以還可以將NNT-1用于治療因造血系統(tǒng)障礙導致的疾病。
此外，可以將NNT-1蛋白質、其片段和/或衍生物用于治療涉及B-細胞和/或T細胞、優(yōu)選B-細胞在內(nèi)的免疫系統(tǒng)的疾病和障礙。正如本文實施例IX-XI中所示的，NNT-1具有刺激B-細胞和T細胞(程度較低)產(chǎn)生的活性。
存在作為針對這一因素的潛在靶向物的幾種主要的體液免疫缺陷。盡管比較少見，但是這些疾病都是慢性的且需要長期治療。首先是通常可變的免疫缺陷或CVID，其特征在于有些正常水平的循環(huán)的B-細胞但缺乏正確地分化為免疫球蛋白產(chǎn)生細胞的能力?；糃VID的個體對復發(fā)的細菌感染敏感。
另一種NNT-1靶疾病是還導致感染復發(fā)的選擇性IgA缺失，所述感染通常限于肺、胃腸和尿道。選擇性IgA缺失是在0.03％-0.97％人群中流行的多種常見疾病中的一種。
其它的NNT-1靶疾病包括各種形式的丙球蛋白缺乏血癥、X連鎖丙球蛋白缺乏血癥和/或與這些疾病之一相關的病癥、諸如感染復發(fā)、腎臟缺損或賈第鞭毛蟲病。參見《臨床免疫學和免疫病理學》(Clin.Immunol.and Immunopath.)40(1)13-24(1986)。
提高對某些疫苗的體液免疫反應是NNT-1多肽的另一種用途。例如，在給予口服疫苗后產(chǎn)生的抗體的量往往很低且由此產(chǎn)生的保護期很有限。預計NNT-1的用途是作為接種時增加抗體產(chǎn)生量的佐劑。
由于NNT-1在抑制LPS誘導的TNF-α產(chǎn)生的能力，所以它可以在治療膿毒病中找到用途。盡管還沒有證實對這一非常重要的臨床難題的以修飾基因為主的解決方案產(chǎn)生的許多生物反應具有任何令人信服的可靠性，但是這種可能性還有待于NNT-1在此處的成功，而其它治療選擇方案均已失敗。Jarish-Schwarzmann反應是一種具有與膿毒病相似癥狀的臨床疾病且嚴格來說是TNF毒性作用的結果。已經(jīng)證實抗TNF抗體的應用是對治療這一疾病的臨床上成功的方法。這是一種NNT-1可以根據(jù)其抗TNF和抗炎特性顯示出臨床價值的情況。IX.篩選NNT-1抑制劑的試驗在某些情況中，抑制或顯著降低NNT-1活性的水平可能是所希望?？梢砸韵铝蟹绞浇o予抑制NNT-1活性的化合物來自體內(nèi)的方式、或以通過局部或靜脈注射的體內(nèi)方式、或通過口服轉運的方式、植入裝置等。下述試驗提供了用于鑒定可抑制NNT-1活性的化合物的方法實例。
為了便于理解，本文所用的下列定義用于描述這些試驗“檢測分子”指的是評估中作為NNT-1抑制劑的分子、一般根據(jù)的是其阻斷NNT-1與其受體相互作用的潛在能力。
例如，通過使用標記的(例如碘化的)NNT-1的表達克隆法可以分離NNT-1受體。
可以進行幾種類型的使用純化蛋白質的體外試驗以便鑒定那些破壞NNT-1活性的化合物。通過一種通常抑制NNT-1與其受體相互作用的化合物可以實現(xiàn)這類破壞過程。
在一種試驗中，純化的NNT-1蛋白質或其片段(例如使用上述方法制備的)可以通過與微量滴定板的孔的底部結合而被固定化。然后可以將放射性標記的NNT-1受體以及檢測分子按一次一種或同時添加到孔中。培養(yǎng)后，可以將孔洗滌并使用閃爍計數(shù)器對放射性進行計數(shù)，以便測定在有檢測分子存在的情況下NNT-1/受體的結合程度。一般來說，在一定的濃度范圍內(nèi)檢測該分子，可以將一系列缺乏檢測試驗的一個或多個元素的對照“孔”用于評估結果中的精確度。這種試驗的誤差包括使受體與孔結合并將放射性標記的NNT-1與檢測分子一起添加到孔中。培養(yǎng)并洗滌后，可以對孔進行放射性的計數(shù)。
包括放射性標記法在內(nèi)的幾種方法可以用來“標記”NNT-1。例如，可以使用125-I或35-S對NNT-1蛋白質進行放射性標記。另一方面，在一種NNT-1的融合蛋白質中，編碼NNT-1的DNA與諸如c-myc表位這樣的一種肽的編碼序列融合。用市售可得的抗myc的抗體可以方便地檢測NNT-1-myc融合蛋白質。
一種替換微量滴定平板類結合試驗的方法包括使NNT-1或其受體固定化在瓊脂糖珠、丙烯酸珠或其它類的這類惰性基質上的步驟?？梢詫⒑蠳NT-1或其受體的這種惰性基質放入含有檢測分子與互補組分(受體或NNT-1蛋白質)的溶液中，所述互補組分已經(jīng)被放射性標記或以熒光方式標記；培養(yǎng)后，通過離心可以使惰性基質沉淀并可以使用上述方法估計NNT-1與受體之間結合的量。另一方面，可以將該惰性基質復合物固定在一種柱上并使檢測分子和互補組分通過該柱。然后可以使用上文所列的任何技術、即放射性標記法、抗體結合法等來評價形成的NNT-1/受體復合物。
另一類用于鑒定抑制NNT-1活性的分子的體外試驗是使用表面胞質基因共振檢測器系統(tǒng)并遵循制造商的說明的Biacore檢測系統(tǒng)(Pharmacia，Piscataway，NJ)。這種試驗主要包括使NNT-1或其受體與位于檢測器中的葡聚糖包被的傳感器芯片共價結合的步驟。然后可以將檢測分子和互補組分同時或依次注入含有傳感器芯片的室中并可以根據(jù)分子量的變化來估計NNT-1/受體結合的量，其中所述的分子量變化實際上與傳感器芯片的葡聚糖包被一側有關；通過檢測器系統(tǒng)可以測定分子量的改變。
在某些情況中，一起評價用于降低或抑制NNT-1活性的兩種或多種檢測分子可能是所希望的。在這些情況中，通過同時或依次與第一種檢測分子一起添加這類附加的檢測分子，可以方便地改進上文所列的試驗。本試驗中其余的步驟可以如上文所列。X.轉基因哺乳動物本發(fā)明的范圍還包括的技術內(nèi)容是非人類的哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、家兔、山羊或綿羊，其中編碼相當于人NNT-1的基因(或多種基因)已被破壞(“剔除”)，使得這種基因的表達水平顯著降低或完全消除。使用諸如美國專利5,557,032中所述的技術和方法可以準備這樣的哺乳動物。本發(fā)明進一步包括非人類的哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、家兔、山羊或綿羊，其中編碼NNT-1(哺乳動物NNT-1的天然形式或異源NNT-1基因)的基因(或多種基因)由所述哺乳動物超表達、由此創(chuàng)造了“轉基因”哺乳動物。使用如美國專利5,489,743和PCT專利申請WO94/28122(公開于1994年12月8日)中所述的那些眾所周知的方法可以準備這樣的轉基因哺乳動物。
下列實施例僅用來解釋的目的且不應以任何方式構成對本發(fā)明范圍的限制。
實施例Sambrook等(《分子克隆實驗室手冊》，冷泉港實驗室出版社，冷泉港NY 和Ausubel等編輯《最新分子生物學技術方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，Wiley，New York，NY )列出了用于文庫制備、DNA克隆和蛋白質表達的標準方法。
實施例IcDNA的克隆和針對NNT-1的基因組克隆A.cDNA文庫的構建在37℃下、5％CO2環(huán)境中，使人T-細胞淋巴瘤細胞(Jurkat細胞)在含有10％胎牛血清的RPMI 400培養(yǎng)基中生長。將該培養(yǎng)基用10mM HEPES緩沖(pH7.5)。8次傳代后將細胞分成兩組。使一組生長至匯合(2×107細胞/瓶)，從這些細胞中收獲的RNA用作“驅動子(driver)”RNA。另一組是“試驗物”組并用下列處理方法將其激活。
通過添加超抗原鏈球菌腸毒素B和F(TSST)80ng/ml、PKC激活劑PMA 50ng/ml、鈣離子載體A21832 125ng/ml而將細胞激活8小時。還以1mg/ml的濃度添加蛋白質翻譯抑制劑環(huán)己酰亞胺。在不同的時間點上從不同組的細胞中收獲RNA。
1.總RNA的制備通過以300×g離心5分鐘使細胞沉淀并用PBS(磷酸緩沖鹽溶液)洗滌，將其重新懸浮于Ultraspec II(Biotex，Inc.，TX)、濃度為5×106細胞/ml的Ultraspec II。然后通過4次穿過21號注射器使細胞溶解，將勻漿在冰上培養(yǎng)15分鐘，接著加入0.2體積的氯仿，充分混合，并在冰上進一步再培養(yǎng)10分鐘，在30ml科雷克斯離心管中以12000×g離心30分鐘。離心后保留上清液并棄去殘余物。在加入0.5體積的異丙醇后，添加作為分離試劑盒組成部分的由Biotex銷售的0.05體積的RNA結合樹脂。通過離心沉淀樹脂后(300×g，5分鐘)，用75％不含核糖核酸酶的乙醇將該樹脂洗滌兩次并在50℃下使其在空氣中干燥10分鐘。然后通過下列步驟從該樹脂中洗脫總RNA將樹脂重新懸浮于1體積的不含核糖核酸酶的水中、劇烈攪動1分鐘、接著以13000×g離心1分鐘。然后將總RNA轉入新的Eppendoff管中并棄去樹脂沉淀。
2.poly(A)+RNA的分離根據(jù)制造商所述使用Qiagen’s Oligotex mRNA分離系統(tǒng)；將該過程重復兩次以獲得純poly(A)+RNA。這一過程對于隨機引發(fā)的文庫以便將cDNA中的核糖體RNA的拷貝數(shù)降至最低來說是特別重要的。然后通過光譜法和甲酰胺變性凝膠電泳法來測定mRNA的整合度。
通過遵照BRL cDNA合成方案來合成第一鏈cDNA。為了從靶cDNA中除去殘余的mRNA，用苯酚/氯仿提取第一鏈cDNA反應物并用2M乙酸銨和3體積的乙醇沉淀。然后在有2mM EDTA存在的情況下將cDNA/mRNA雜交體重新懸浮于0.3M NaOH中并在68℃下培養(yǎng)15分鐘。用過量約1.5M的純Tris-HCl中和水解反應。接著用苯酚/氯仿提取cDNA并將其用2M乙酸銨和3體積的乙醇重新沉淀、用75％乙醇沖洗并重新懸浮于7ml無菌水中。通過按照Boehringer Mannheim加尾試劑盒的方案來使單鏈cDNA加尾。
3.驅動子mRNA的制備和光生物素化如上所述分離poly(A)RNA。然后用20mg光生物素乙酸酯(Sigma)使約20mg poly(A)RNA光生物素化兩次，并使其在不含核糖核酸酶的水中以1mg/ml的濃度再溶解。用水飽和的異丁醇萃取過量的光生物素、將其用乙醇沉淀并重新懸浮于30ml DEPC處理的水中。
4.扣除雜交反應使光生物素化的驅動子mRNA與檢測物cDNA共沉淀并重新懸浮于2ml不含核糖核酸酶的水中。為了使核酸進入溶液，在室溫下通過間歇緩慢的攪拌將制備液保持幾小時、隨后在68℃下再溫育20小時。將光生物素化的驅動子溶解成最終濃度為2mg/ml。一般來說，應使用濃度至少為1mg/ml的驅動子RNA。
5.雜交后雜交體的去除雜交后，將鏈霉抗生物素加至最終濃度為0.2mg/ml并在室溫下培養(yǎng)10分鐘。然后用苯酚/氯仿提取法除去鏈霉抗生物素。提取后，用乙醇沉淀cDNA。
在PCR中使用一對引物AGCGCTACGGTCGACCCG GCG TTT TTT TTTTTT TTT TTT TTT(ACG)X(SEQ ID NO15)(Sal I T21錨式引物)和GGA AGG AAA AAA GCG GCC GCT ACA(SEQ ID NO16)(NotI-N9引物)、用來擴增cDNA。使用消耗(expend)PCR試劑盒。將15個循環(huán)用于生成足量用于凝膠分級分離法的物質，使得在文庫中出現(xiàn)的大小相同。為了使第一種引物退火，將PCR初始的5個循環(huán)的退火溫度在35℃下持續(xù)1分鐘。在凝膠上分級分離具有不同大小的級分的cDNA。將SalI銜接頭添加到雙螺旋cDNA中，然后用NotI消化并克隆入pSport載體中。B.cDNA克隆的分離通過表達的序列標記(最有特征的)分析來篩選文庫。隨機從該文庫中挑選單個克隆并使用載體引物和Taq染料終止子反應(應用生物系統(tǒng)公司)在一種應用生物系統(tǒng)373A自動DNA測序儀上將它們進行測序。將從隨機挑取的克隆NNT-1中獲得的所得核苷酸序列進行翻譯，然后使用改版的FASTA程序與公知蛋白質序列的現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫進行比較。
在所翻譯的氨基酸序列水平上，一種克隆(khjl-00008-f2)與CNTF具有約21％的同源性。將cDNA克隆的整個插入片段進行測序并發(fā)現(xiàn)它編碼全長克隆，即它含有在5’末端的Met和Met上游的一種終止密碼予以及在3’末端的另一種終止密碼子。
這種全長cDNA的序列如附圖1中所示。所預測的蛋白質的氨基酸序列如附圖3中所示。推定的信號肽為從第-27位氨基酸(Met)至第-1位氨基酸(Ala)的范圍。C.基因組克隆的分離從人基因組P1文庫(Genome Systems Inc.，St.Louis，MO；目錄號P1-2535)中獲得NNT-1的基因組DNA。使用NNT-1 cDNA作為探針來篩選該文庫。使用Amersham Rediprime試劑盒(Amersham，Arlington Heights，IL；目錄號RPN-1633)對cDNA進行放射性標記，且雜交和預雜交溶液是50％的甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt’s、0.05％焦磷酸鈉、0.1％SDS和100mg/ml鮭精DNA。預雜交進行約1小時且雜交在42℃下進行約16小時。
雜交后，在42℃下于0.2×SSC和0.1％SDS中洗滌濾器約30分鐘，然后使之與膜接觸。鑒定兩種陽性克隆并根據(jù)Genome SystemsInc.的方案純化含有這些克隆的質粒。接著直接對質粒DNA進行測序。
編碼NNT-1的基因組序列如附圖2中所示(SEQ ID NO3)。該基因由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成。用大寫字母表示的是編碼區(qū)，而用小寫字母表示包括5’未翻譯區(qū)、內(nèi)含子和3’未翻譯區(qū)在內(nèi)的非編碼區(qū)。
實施例II重組哺乳動物NNT-1蛋白質的制備通過融合基因的PCR擴增來構建含有人NNT-1 cDNA和旗-標記肽的表達載體。在5’末端帶有Hind III位點的有義引物(5’-AGCAAGCTTCACCATGGACCTCCGAGCAGGGGACTC-3’)(SEQ ID NO6)它編碼第-27位氨基酸(Met)至第-21位氨基酸(Asp)，且在5’末端帶有NotI位點的反義引物編碼旗-標記肽和3’末端的最后8個氨基酸(5’AGCGGGGCCGCACTACTTGRCATCGTCGRCGTCCTTGTACTCGAAGCCATGAGCCCCCAGGTGCAG-3’)(SEQ ID NO7)，在PCR中使用它們以擴增融合基因。將該融合基因與P CEP4載體(Invitrogen Inc.，San Diego，CA)連接。使用制造商建議的方法用脂轉染試劑(BRL，Gaithersburg，MD)將表達載體轉染入EBNA-1-293細胞。轉染48小時后，收集293細胞和條件培養(yǎng)基并通過使用抗旗(anti-flag)-標記抗體(Eastman Kodak Co.，New Haven CT)以蛋白質印跡法來對它們進行分析。在293細胞溶胞產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了大部分的重組蛋白質。因此，將抗旗抗體凝膠(Eastman Kodak Co.，New Haven CT)用于純化來自293細胞溶胞產(chǎn)物的蛋白質。根據(jù)制造商的方案純化28-30kd的蛋白質。在生物功能分析中使用這種重組蛋白質(用于運動神經(jīng)元和交感神經(jīng)元的存活試驗)。測定該蛋白質的N-末端氨基酸為Leu(氨基酸1)，這表明潛在的信號肽被切割了(氨基酸-27至氨基酸-1)。
實施例III重組大腸桿菌NNT-1蛋白質的制備將編碼SEQ ID NO2氨基酸Leu(1)至Phe(198)的NNT-1的cDNA克隆插入載體pAMG21，該載體是pCFM 1656(ATCC登記號69576)的衍生物并含有用于插入來自lux PR啟動子的下游基因的合適的限制位點(參見美國專利5,169,318對lux表達系統(tǒng)的描述)。所用的宿主細胞是大腸桿菌K12、菌株CGSC6159(耶魯大學的遺傳原種，New Haven，CT)。使用標準轉化法用載體轉化該宿主細胞，然后將它們在30℃下在含有約50μl/ml卡那霉素的2XYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過向該培養(yǎng)基中添加自體誘導物N-(3-氧己酰)-DL-高絲氨酸內(nèi)酯至終濃度約為30ng/ml而開始進行NNT-1基因產(chǎn)物的誘導，并將培養(yǎng)物在30℃或37℃下培養(yǎng)約6小時，此后，通過顯微術檢測細胞的內(nèi)含體。
發(fā)現(xiàn)大部分的NNT-1蛋白質位于這種內(nèi)含體中。因此，通過沉淀細胞來制備細胞膏狀物。在低pH下溶解內(nèi)含體并通過順序沉淀法來純化蛋白質。在上樣至SDS-PAGE以評價純度之前透析蛋白質。凝膠的考馬斯染色顯示該蛋白質的純度至少為95％。
實施例IVNNT-1的神經(jīng)生物功能A.雞運動神經(jīng)元試驗由胚胎期為E5.5的雞制備來自腰椎脊髓的富集運動神經(jīng)元(MN)的培養(yǎng)物。通過使用6.8％三碘苯甲酰氨基葡萄糖梯度來富集MN神經(jīng)元。簡單地說，解剖腰椎脊髓、不包括(freed of)腦膜和DRG。在37℃下，在含有L15培養(yǎng)基(Gibco/BRL，Grand Island，NY)的木瓜蛋白酶中將脊髓培養(yǎng)20分鐘(Worthington Biochemical Corp，F(xiàn)reehold，NJ)。通過用吸管移取將經(jīng)酶軟化的脊髓片段分離成單細胞。然后將細胞懸浮液在6.8％三碘苯甲酰氨基葡萄糖(Serva，F(xiàn)einbiochemicala，Germany)墊層上鋪層，并在500g將試管離心20分鐘。收集三碘苯甲酰氨基葡萄糖墊層與細胞懸浮液之間的界面物并將其稀釋入培養(yǎng)基。接著輕輕地將該級分在4％BSA墊層上鋪層并在280g離心10分鐘。將沉淀重新懸浮于含有L15培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中，所述L15培養(yǎng)基含有用3.6mg/ml葡萄糖、5ng/ml亞硒酸鈉、6.25ng/ml孕酮、0.1mg/ml伴清蛋白、16mg/ml腐胺和5mg/ml胰島素進行了補充的10％胎牛血清。將10,000細胞/孔接種入96孔組織培養(yǎng)平板。向該培養(yǎng)物中添加連續(xù)稀釋的神經(jīng)營養(yǎng)因子(NNT-1或CNTF)并培養(yǎng)3天。在第3天時，將MTT加入培養(yǎng)物4.5小時。溶解甲產(chǎn)物并通過650nm處減去570nm波長處的值來對平板讀取以便消除可見干擾。光密度(OD)的讀數(shù)與培養(yǎng)物中存活的神經(jīng)元數(shù)量成正比。將一式三份的孔中570nm處的吸光值(增加神經(jīng)元的存活)作為NNT-1或CNTF最終濃度的函數(shù)來作圖。
將分析結果列在附圖7中。將570nm處的吸光值表示為實際讀數(shù)的1000倍。結果證明NNT-1可以支持雞運動神經(jīng)元的生長。其最高活性達到CNTF活性的約90％。B.雞交感神經(jīng)元試驗制備初生雞胚胎交感鏈神經(jīng)節(jié)的培養(yǎng)物。簡單地說，從已經(jīng)在37.6℃下、濕潤空氣中孵育9天的能育的無病原體的雞卵中取出交感神經(jīng)節(jié)。通過下列步驟以化學方式分離神經(jīng)節(jié)首先在37℃下與不含二價陽離子而含有10mM HEPES緩沖液(pH7.2)的Hanks’平衡鹽溶液接觸10分鐘；然后在37℃下與溶于如上所述修飾的Hanks’平衡鹽溶液的0.125％細菌胰蛋白酶1∶250溶液(Difco，Detroit，Michigan)接觸12分鐘。通過添加胎牛血清至10％的終濃度而終止胰蛋白酶消化。
這種處理完成后，將神經(jīng)節(jié)轉入由含有碳酸氫鹽的Dulbecco氏高葡萄糖改進的Eagle培養(yǎng)基組成的一種溶液中，該培養(yǎng)基含有10％胎牛血清和10mM HEPES(pH7.2)，并通過經(jīng)20號1”雙頭式不銹鋼針頭約14次研磨而將神經(jīng)節(jié)以機械方式分離。
然后將分離的神經(jīng)節(jié)平鋪在直徑為100mm的組織培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基(用10％胎牛血清、4mM谷氨酰胺、60mg/L青霉素G、25mMHEPES，pH7.2進行了補充的Dulbecco氏改進的Eagle培養(yǎng)基)中(約40個分離的神經(jīng)節(jié)/培養(yǎng)皿)2-3小時。進行這種預鋪板以便分離出與培養(yǎng)皿粘附的非神經(jīng)元細胞和不粘附的神經(jīng)細胞。預鋪板后，通過離心收集非粘附性神經(jīng)細胞、將它們重新懸浮于培養(yǎng)基中并以2500個神經(jīng)細胞/孔的密度平鋪在96孔微量滴定組織培養(yǎng)平板上半數(shù)區(qū)域的每一孔中、每孔50ml。在4℃下，使微量滴定孔預先與溶于10mM硼酸鈉(pH8.4)的1mg/ml聚-L-鳥氨酸的溶液接觸過夜，在無菌純水中洗滌并在空氣中干燥。
與細胞接觸的神經(jīng)營養(yǎng)因子的終濃度如下1)對于CNTF標準來說，9點連續(xù)稀釋曲線在100ng/ml-6pg/ml的范圍；2)對于NNT-1蛋白質來說，9點連續(xù)稀釋曲線在100ng/ml-0.12pg/ml的范圍。將25ml用于檢測神經(jīng)營養(yǎng)活性的連續(xù)稀釋的樣品添加到每個孔中并在37℃下、含7.5％CO2的濕潤空氣中將培養(yǎng)皿培養(yǎng)38-46小時。然后每孔添加18ml的溶于含有碳酸氫鹽的Dulbecco氏高葡萄糖改進的Eagle培養(yǎng)基的四氮唑染料MTT的1.5mg/ml溶液，所述Dulbecco氏高葡萄糖改進的Eagle培養(yǎng)基含有(contain)10mM HEPES(pH7.2)，將該培養(yǎng)物放入37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)4.5小時。接著添加含有20％十二烷基硫酸鈉(pH4.7)的50％N，N-二甲基甲酰胺的75ml溶液以便溶解結晶的甲產(chǎn)物，并將平板在37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)最少12小時。對于每一孔來說，使用自動微量滴定平板讀數(shù)器以650nm為參考來測定579nm處的吸光值。所得吸光值與每一孔中的活細胞數(shù)成正比，將所述細胞定義為能夠還原染料的那些神經(jīng)細胞。
將分析結果列在附圖8中。該結果證明NNT-1支持雞交感神經(jīng)元的生長。
實施例V組織分布的Northern印跡分析人體組織的RNA印跡購自Clontech(Palo Alto，CA)。用一種人NNT-1 cDNA探針探測該RNA印跡。標記NNT-15’至3’編碼區(qū)的兩種cDNA片段并將它們用作分析NNT-1基因組織表達的探針。結果證明在脾、淋巴節(jié)的組織和外周血液淋巴細胞、骨髓以及胎兒的肝、腎、肺、結腸腺癌細胞SW480、海拉細胞S3、肺癌A549、慢性髓細胞性白血病K-562細胞、伯基特淋巴Raji細胞中NNT-1被表達為2.2kb轉錄物。該基因的組織分布提示該基因可能還與免疫系統(tǒng)或造血細胞的發(fā)育有關。
實施例VINNT-1基因的染色體定位通過FISH進行基因的染色體定位。使用BRL BioNick標記試劑盒通過dATP使14kb的基因組片段生物素化(15C 1小時)。按照Heng等在《美國國家科學院學報》(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)899509-9513，1992中所述來進行FISH的程序。結果證明該基因位于接近于人CNTF基因座(染色體11 q12)的染色體11 q13上。
實施例VII小鼠cDNA克隆的分離使用人特異性引物、通過從小鼠11天齡胚胎的cDNA(Clontech，Palo Alto，CA)的PCR擴增來分離小鼠部分的cDNA克隆。進一步通過5’RACE和3’RACE來獲得全長cDNA克隆。小鼠cDNA核苷酸序列和氨基酸序列分別如附圖4和5中所示。小鼠蛋白質與人體蛋白質之間具有96％的同一性，這證明在整個進化過程中該蛋白質是高度保守的。類似于人體蛋白質，小鼠蛋白質也在第2位氨基酸(Asn)上含有潛在的N-聯(lián)接的糖基化位點。
實施例VIIINNT-1與該族其它成員的比較NNT-1的氨基酸序列提示該蛋白質屬于CNTF族(SEQ ID NO12)，該族包括IL-11(SEQ ID NO8)、IL-6(SEQ ID NO9)、心營養(yǎng)蛋白(cardiotrophin)(SEQ ID NO11)、制癌蛋白(SEQ ID NO13)和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)(SEQ ID NO10)。我們通過計算機程序PILEUP將NNT-1的氨基酸序列與本族的所有成員進行了比較且結果如附圖6中所示。當與該族的所有其它成員相比，預計NNT-1蛋白質的二級結構含有4個不平行α-螺旋結構。
實施例IXNNT-1轉基因小鼠的表型A.NNT-1轉基因小鼠的表型在骨髓和神經(jīng)細胞試驗中由NNT-1基因編碼的蛋白質具有與CNTF一定的同源性和體外活性。對用NNT-1轉染的骨髓移植的小鼠的研究證實了與胃腸道相關的淋巴組織中的輕度淋巴增生、而沒有其它顯著的表型改變。材料與方法物種小鼠 菌株BDF1 年齡17周(120天)試驗品NNT-1(WX240)性別雄性/雌性治療組

在兩組中沒有檢測到顯著的異常情況。
進行橫向尸體解剖、所選擇的組織固定在福爾馬林鋅緩沖液中而用于組織病理學檢查[腦、心、腎、腎上腺、十二指腸、胰、膀胱、肝、肺、脾、任何大的損害]。在常規(guī)組織學檢查過程前將這些組織固定過夜。使用JMP(SAS Institute，Cary，NC)軟件程序分析數(shù)據(jù)。
檢測范圍器官重、體重、組織病理學、免疫組織學、RNA印跡。
在NNT-1轉基因小鼠中存在下列與治療相關的變化在轉基因小鼠體內(nèi)，脾具有輕度至明顯的反應性淋巴增生(附圖10)、包括濾泡(B細胞)和動脈周(T細胞)區(qū)在內(nèi)。在高度表達的小鼠#62中這種淋巴增生最為顯著(附圖10)，而在尸檢處發(fā)現(xiàn)這種淋巴增生明顯與脾腫大相關。其它高度表達的小鼠#60僅具有淋巴區(qū)的輕度增生、伴隨所有三種譜系的大量彌漫性髓外血細胞生成。盡管根據(jù)這兩種高度表達的小鼠作出有關NNT-1的脾效應的任何一般性結論都是困難的，但是在小鼠#62中觀察到的淋巴增生與我們使用注射蛋白質的發(fā)現(xiàn)(參見如下的實施例X A)相一致，而在小鼠#60中發(fā)現(xiàn)的EMH可以反映出以前在體外骨髓培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的情況與體內(nèi)情況的相互關系。
小鼠#60的肝具有淋巴細胞和漿細胞的多灶聚集物，所述細胞滲入血管周圍的空間并以特有的模式膨脹入鄰近類似于肝內(nèi)“淋巴組織生成島”的竇狀隙中(附圖12)。通過免疫組織化學發(fā)現(xiàn)，淋巴聚集物由B220+細胞和CD3+細胞組成。在小鼠#62中還發(fā)現(xiàn)了類似而輕度的且一般是在血管周圍的淋巴滲入物。在對照組和/或轉基因組中的各個小鼠體內(nèi)偶爾發(fā)生了肝中發(fā)現(xiàn)的其它改變。
胃腸道具有最低限度至中度反應性的派依爾結(與腸相關的淋巴組織)的淋巴增生。類似地，在轉基因小鼠中頸和腸系膜淋巴節(jié)比對照組中更具有反應性，盡管比起我們用注射NNT-1蛋白質進行的研究來這種改變不是最為本研究特征的重點(參見如下的實施例X A)。
轉基因小鼠的骨髓、中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)看起來是正常的。一般地，在陰性對照組和/或轉基因組中的一種或多種動物體內(nèi)偶爾發(fā)現(xiàn)了其它組織中的改變并不將它們解釋為與轉基因有關。
從本研究中獲得的數(shù)據(jù)證明NNT-1轉基因小鼠具有令人感興趣的表型，其特征在于包括脾、淋巴節(jié)、與腸相關的淋巴組織、腎和肝在內(nèi)的多數(shù)外周組織中的T和B淋巴細胞和漿細胞的增殖。在外周血液或骨髓中沒有顯著改變的情況下，NNT-1還可以誘導某些外周組織、諸如脾和胰中的髓外血細胞生成。因此，從NNT-1轉基因小鼠中獲得的數(shù)據(jù)一般支持從我們對7天齡小鼠使用注射用NNT-1蛋白質的研究中的發(fā)現(xiàn)(如下實施例X A)，即誘發(fā)淋巴組織增生而沒有檢測到對骨髓或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用。
令人感興趣的是，在兩種高度表達的NNT-1轉基因雌性小鼠中檢測到的腎小球性腎炎接近類似于在MRL/lpr(Fas缺乏)小鼠中觀察到的自發(fā)腎小球性腎炎，這顯示出早期發(fā)病的SLE類自身免疫綜合征與下列情況有關多克隆B細胞激活、多種自身抗體、循環(huán)免疫復合物和雙陰性(CD4-CD8-TCRab+CD3+)T細胞的非正常群體的蓄積，它們還表達稱作B220+(一般是B細胞的標記物)的CD45R同種型(Singer等《最新免疫學觀點》(Curr.Opin.Immunol.)6913-920，1994)。此外，某些NNT-1的生物效應還模擬白細胞介素-6的那些效應，白細胞介素-6(類似于CNTF、LIF和IL-11)可利用gp130信號轉導物并具有對肝、腎、腦、皮膚、免疫和造血系統(tǒng)的多效作用(Ryffel等，《國際病理學實驗研究》(Int.Rev.Exp.Pathol.)34A79-89，1993)。因此，重要的是通過流式細胞分析法測定在外周血液或組織中發(fā)現(xiàn)的淋巴細胞是否具有帶有二重表達的T和B細胞標記物的非常規(guī)的表型。B.NNT-1轉基因生成物的FACS免疫分型組織分析通過使眼眶后出血獲得外周血液樣品。得到了來自每組原始同窩出生小鼠的對照組和NNT-1陽性(通過PCR)小鼠的9份樣品；沒有凝結現(xiàn)象。首先用各種細胞表面抗原的Fc阻斷抗體、隨后用它們的熒光抗體培養(yǎng)約20-40μl血/樣品。
選擇抗體的標記物以便在循環(huán)的外周血液中區(qū)分多數(shù)造血細胞群體。此外，某些B和T細胞激活/分化標記物根據(jù)用于這種表達的序列標記(最有特征的)的原始文庫來選擇。該文庫由用毒性休克綜合征毒素(TSST)激活的Jurkat細胞(一種T細胞系)來生成。抗體Fc阻斷(CD32/16)-作為阻斷非特異性結合的預培養(yǎng)的一部分，使用的是全部21種抗體。根據(jù)單色柱形圖分析數(shù)據(jù)。大鼠IgG異硫氰酸熒光素(FITC)+大鼠IgG藻紅蛋白(phycoerythren)(PE)Ham IgG FITC+Ham IgG PECD45 FITC+GR-1(CD97)PE-----靈長屬白細胞與有粒白細胞比較CD4 FITC+CD8 PE-----T-細胞亞群輔助細胞與殺傷者比較Th1.2 FITC+B220 PE-----T細胞與靈長屬B細胞標記物比較CD69 FITC+CD28 PE-----用于T和B或僅為T細胞的激活標記物CD3 FITC+CTLA4 PE-----靈長屬T細胞與T細胞激活的比較ckit FITC+Sca-1 PE-----髓樣和先祖細胞與先祖細胞和外周淋巴細胞比較CD40 FITC+CD40L PE-----B細胞Ag差(diff.)與T細胞的相同配體比較CD62L FITC+CD54 PE-----B和T細胞上的活化粘著分子CD34 FITC(未經(jīng)分析的數(shù)據(jù))結果對于B220+、CD40+、CD62L+、和CD54+細胞來說，在NNT-1陽性動物中的4種中觀察到了絕對細胞數(shù)的顯著增加。
稍后通過RNA印跡證實這4種動物(#24、35、60、62)為表達體。B220+和CD40+細胞比上述對照組增加的范圍在2-4倍。CD62L+(LECAM)和CD54+(ICAM)比上述對照組增加的范圍在1.5-3倍。證明4種表達體中3種增加的標記物包括Sca-1(對照組的2-6倍)和ckit(對照組的2-3倍)。盡管不是一致的形式(盡管這些都是T細胞標記物，但是它們在相同的表達體中不全是陽性的)，但是包括CD3、CD4、CD8、Thy1.2在內(nèi)的其它標記物在4種表達體中的2種中表現(xiàn)出最適度的增加。GR1在表達體之一中表現(xiàn)出增加，而在對照組動物之一中甚至有更高數(shù)量的GR1+細胞，所以這可能不值得注意。其余抗體不是陽性的、不具備顯著性差異，或在CD34的情況下不可能分析。總結在這些小鼠中觀察到了循環(huán)淋巴細胞絕對數(shù)量的非常確定的增加。盡管也觀察到了某些T細胞數(shù)量上的增加，但是在淋巴群體上的這種增加看起來主要由B細胞組成。看起來淋巴群體不會表現(xiàn)出活化細胞種類的增加。在循環(huán)髓樣細胞群體上幾乎沒有觀察到作用或沒有作用。ckit和Sca-1的增加不一定與先祖細胞的增加有關，因為在成熟的循環(huán)細胞上也發(fā)現(xiàn)了這些標記物。
數(shù)據(jù)提示了B細胞的定向增殖，因為這些細胞數(shù)量均與表達充分相關。某些動物的T細胞增加可能是由增加的B細胞產(chǎn)生的某些其它因子的次級效應。關于B細胞的一個令人感興趣的觀察結果是在B220+細胞與CD40+細胞數(shù)目之間存在很小而卻非常一致的差異。盡管兩者均是B細胞的標記物，但是在樹突細胞上也發(fā)現(xiàn)了CD40。
實施例X注射有NNT-1的小鼠體內(nèi)的淋巴增生A.在用NNT-1治療的BDF1雌性小鼠中的7天靜脈/皮下研究在骨髓和神經(jīng)細胞檢測中，由NNT-1編碼的蛋白質與CNTF具有某些同源性和體外活性。本研究的目的是確定當持續(xù)7天每日對小鼠給藥時NNT-1蛋白質的系統(tǒng)作用和潛在毒性。材料和方法將20只6周齡的雌性BDF1小鼠用于本研究。將這些小鼠隨機分成下列治療組(n＝5/組)1.PBS緩沖液對照組(每日一次靜脈給藥，持續(xù)7天)2.NNT-1 1.5mg/kg(靜脈給藥)3.NNT-1 0.15mg/kg(靜脈給藥)4.NNT-1 1.5mg/kg(皮下給藥)在橫向尸體解剖前不給小鼠禁食。尸體解剖前1小時(最后一次給藥后24小時)，給小鼠腹膜內(nèi)注射BrdU(對于細胞增殖研究來說為50mg/ml)。通過心臟穿刺獲得血液以便進行血液學測定(血紅蛋白、血細胞比容、血紅細胞計數(shù)、血小板計數(shù)、平均血小板容積、總體和分化的白細胞計數(shù))和臨床化學參數(shù)測定(丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶、葡萄糖、尿素、氮、肌酸酐、總蛋白、白蛋白、球蛋白、鈣、磷、總膽紅素、尿酸、膽固醇和甘油三酯)。
進行橫向尸體解剖、所選擇的組織固定在福爾馬林鋅緩沖液中而用于組織病理學檢查[腎上腺、骨髓、骨(股骨)、腦、盲腸、近端和遠端結腸、十二指腸、食管、心臟、回腸、空腸、腎、肝、肺、乳腺、卵巢、胰、骨骼肌、皮膚、脾、胃、胸腺、甲狀腺、氣管、膀胱、子宮、陰道、白色和棕色脂肪組織、任何大的損害]。在常規(guī)組織學檢查過程前將這些組織固定過夜。獲得脾、肝、胃、腎和胸腺的器官重量。結果脾在NNT-1治療組中具有動脈周(periarteriolar)淋巴鞘(T細胞區(qū))和濾泡(B細胞區(qū))肥大的脾的白髓中存在顯著的淋巴增生。然而，在這些組中髓外造血的程度沒有顯著增加，這提示這種蛋白質可對體內(nèi)淋巴細胞而不是對體內(nèi)造血細胞具有刺激或生長因子這樣的作用。
淋巴節(jié)NNT-1治療的小鼠在淋巴節(jié)皮質的濾泡(B細胞)和副皮質(T細胞)區(qū)具有輕度至明顯的反應性淋巴增生。盡管這種改變可以反映出對重組蛋白質的早期免疫反應，但是在脾、淋巴節(jié)、派依爾結和骨髓中存在的全身化反應性淋巴增生的程度提示這可能是NNT-1特異性治療相關的作用?？偨Y和結論來源于本研究的最明顯的發(fā)現(xiàn)是用NNT-1治療7天的小鼠看起來可誘發(fā)淋巴組織、特別是在脾和淋巴節(jié)中的增生。然而，看起來在本研究條件下這種蛋白質對造血或中樞神經(jīng)系統(tǒng)不具有任何可檢測到的作用。B.NNT-1注射的小鼠的FACS分析試劑和小鼠重組人NNT-1和rhIL-1來自Amgen Inc.，ThousandOaks，CA.。LPS(大腸桿菌0111B4)購自LIST BiologicLaboratories，Campbell，CA。約20g的雌性Balb/c小鼠購自Charles River Laboratories，Wilmington，MA。將小鼠放在維持恒定溫度和濕度的室中并進行12小時的光/暗周期。小鼠接受標準的實驗室飲食并隨意飲水。按照與國家和國際法與政策一致的規(guī)定原則進行涉及動物及其護理的程序(美國國家研究委員會《實驗室動物護理及使用指南》，1996)。
淋巴節(jié)重和細胞計數(shù)連續(xù)7天，小鼠每日接受腹膜內(nèi)注射5mg/Kg的NNT-1或緩沖液。第7次注射后24小時，處死小鼠以收集外周(頸和axyllary)淋巴節(jié)。收集淋巴節(jié)、稱重并勻漿化以便制備一種細胞懸浮液。然后用Sismex細胞計數(shù)器(Toa Medical Corporation，Kobe，Japan)來對細胞計數(shù)、使用大鼠抗小鼠抗CD45R(抗B220)MAb(Pharmingen，San Diego，CA)通過直接IF對其染色并以應用細胞探測軟件(Becton和Dickinson，San Jose，CA)的FACSCAN來對其進行分析。
統(tǒng)計學分析將結果表示為平均值±SD。將TNF值進行對數(shù)轉化以減小其斜率分布并使之達到正常值。將Shapiro-Wilks試驗用于分析在轉化之前和之后分布的正常值。通過“Student’s”t檢驗來分析組間的差異。由于對每一個體重復測定BW，所以通過對重復測定的誤差(ANOVA)的分析來檢測組間和組內(nèi)BW的差異。
淋巴節(jié)重和細胞計數(shù)NNT-1的治療增加了總體和CD45陽性細胞在外周淋巴節(jié)中的計數(shù)(附圖17)。實施例XINNT-1表現(xiàn)出以IL-6族細胞因子為特征的體內(nèi)活性試劑、小鼠和統(tǒng)計學分析如上述實施例XB中所列。
通過IL-1的血清類淀粉蛋白A(SAA)的誘導、皮質酮的強化和IL-6的誘導以及LPS誘導的TNF的抑制作用。以5mg/Kg的劑量單獨、或與IL-1(100ng/小鼠)或LPS(100ng/小鼠)聯(lián)合腹膜內(nèi)給予NNT-1。對照組小鼠接受NNT-1的溶劑(10mM溶于鹽水的乙酸鹽)。在給予NNT-1或鹽水8小時后從眼眶后叢中取血而用于SAA測定，給藥2小時后測定皮質酮和IL-6且在1.5小時后測定TNF。在5-10只小鼠的組中進行實驗。
使用商購的試劑盒(Biogen，Camarillo，CA)、通過ELISA來測定血清中的SAA、IL-6和TNF；結果分別用μg、ng和Pg/ml表示。使用商購的試劑盒(ICB Biomedical，Costa Mesa，CA)、通過RIA來測定皮質酮；結果用ng/ml表示。
通過IL-1的SAA的誘導、皮質酮的強化和IL-6的誘導以及LPS誘導的TNF的抑制作用。NNT-1誘導循環(huán)的SAA(附圖13)。
NNT-1強化了低劑量的IL-1對血清皮質酮或IL-6的誘導(附圖14和15)。當進行單獨注射時，NNT-1還表現(xiàn)出增加皮質酮循環(huán)水平的能力。
NNT-1通過血清TNF的LPS抑制了誘導作用(附圖16)。結果總結發(fā)炎過程伴隨TNF的產(chǎn)生，細胞因子主要導致區(qū)別與炎癥有關的病理情況的組織損害和功能性損害。通常IL-1與TNF一起產(chǎn)生且它還被認為在發(fā)炎過程中是致病介體。皮質類固醇是廣譜和非常強的抗炎劑，它們可由IL-1通過一種有效的陰性反饋路線來誘導。皮質類固醇抑制TNF和IL-1的產(chǎn)生。也由TNF和IL-1誘導的IL-6還能夠通過另一種陰性反饋路線來抑制TNF和IL-1的產(chǎn)生。
至少在有IL-1存在的情況下，NNT-1誘導皮質類固醇和IL-6的能力提示這種分子具有強化兩種生理抗炎癥路線的能力。這可能導致加速抑制TNF和IL-1的產(chǎn)生且由此加速消退炎癥過程。除與皮質類固醇和IL-6的產(chǎn)生的誘導作用無關外，NNT-1還表現(xiàn)出直接阻斷TNF產(chǎn)生的特性。令人感興趣的是這提高了上述概括的抗炎特征。DNA的保藏在1997年1月21日已經(jīng)將含有編碼NNT-1人基因組DNA的載體P1(NNT-g-PI)的大腸桿菌細胞DH10B和含有編碼NNT-1人cDNA的載體PSPORT的大腸桿菌細胞DH10B保藏在ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD，USA)并分別給予它們登記號98294和98295。
序列表(1)一般信息(i)申請人CHANG，MING-SHIELLIOTT，GARY S.
SARMIENTO，ULLASENALDI，GIORGIO(ii)發(fā)明名稱神經(jīng)營養(yǎng)因子NNT-1(iii)序列數(shù)16(iv)通信地址(A)地址AMGEN INC.
(B)街道ONE AMGEN CENTER(C)城市THOUSAND OAKS(D)州CA(E)國家USA(F)郵政編碼91320(v)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(vi)當前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S(B)申請日(C)分類(vii)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S 08/792,019(B)申請日1997年2月3日(viii)律師/代理人信息(A)姓名COOK，ROBERT R.
(B)注冊號31,602(C)參考/記錄號A-442B(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度797個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構；線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置90..764(ix)特征(A)名稱/關鍵詞mat_peptide(B)位置171..764(ix)特征(A)名稱/關鍵詞sig_peptide(B)位置90..170(xi)序列描述SEQ ID NO1ATTAAAGCTT CGCCGGAGCC GCGGCTCGCC CTCCCACTCC GCCAGCCTCC GGGAGAGGAG 60CCGCACCCGG CCGGCCCAGC CCCAGCCCC ATG GAC CTC CGA GCA GGG GAC TCG 113Met Asp Leu Arg Ala Gly Asp Ser-27 -25 -20TGG GGG ATG TTA GCG TGC CTG TGC ACG GTG CTC TGG CAC CTC CCT GCA 161Trp Gly Met Leu Ala Cys Leu Cys Thr Val Leu Trp His Leu Pro Ala-15 -10 -5GTG CCA GCT CTC AAT CGC ACA GGG GAC CCA GGG CCT GGC CCC TCC ATC 209Val Pro Ala Leu Asn Arg Thr Gly Asp Pro Gly Pro Gly Pro Ser Ile1 5 10CAG AAA ACC TAT GAC CTC ACC CGC TAC CTG GAG CAC CAA CTC CGC AGC 257Gln Lys Thr Tyr Asp Leu Thr Arg Tyr Leu Glu His Gln Leu Arg Ser15 20 25TTG GCT GGG ACC TAT CTG AAC TAC CTG GGC CCC CCT TTC AAC GAG CCA 305Leu Ala Gly Thr Tyr Leu Asn Tyr Leu Gly Pro Pro Phe Asn Glu Pro30 35 40 45GAC TTC AAC CCT CCC CGC CTG GGG GCA GAG ACT CTG CCC AGG GCC ACT 353Asp Phe Asn Pro Pro Arg Leu Gly Ala Glu Thr Leu Pro Arg Ala Thr50 55 60GTT GAC TTG GAG GTG TGG CGA AGC CTC AAT GAC AAA CTG CGG CTG ACC 401Val Asp Leu Glu Val Trp Arg Ser Leu Asn Asp Lys Leu Arg Leu Thr65 70 75CAG AAC TAC GAG GCC TAC AGC CAC CTT CTG TGT TAC TTG CGT GGC CTC 449Gln Asn Tyr Glu Ala Tyr Ser His Leu Leu Cys Tyr Leu Arg Gly Leu80 85 90AAC CGT CAG GCT GCC ACT GCT GAG CTG CGC CGC AGC CTG GCC CAC TTC 497Asn Arg Gln Ala Ala Thr Ala Glu Leu Arg Arg Ser Leu Ala His Phe95 100105TGC ACC AGC CTC CAG GGC CTG CTG GGC AGC ATT GCG GGC GTC ATG GCA 545Cys Thr Ser Leu Gln Gly Leu Leu Gly Ser Ile Ala Gly Val Met Ala110 115 120 125GCT CTG GGC TAC CCA CTG CCC CAG CCG CTG CCT GGG ACT GAA CCC ACT 593Ala Leu Gly Tyr Pro Leu Pro Gln Pro Leu Pro Gly Thr Glu Pro Thr130 135 140TGG ACT CCT GGC CCT GCC CAC AGT GAC TTC CTC CAG AAG ATG GAC GAC 641Trp Thr Pro Gly Pro Ala His Ser Asp Phe Leu Gln Lys Met Asp Asp145 150 155TTC TGG CTG CTG AAG GAG CTG CAG ACC TGG CTG TGG CGC TCG GCC AAG 689Phe Trp Leu Leu Lys Glu Leu Gln Thr Trp Leu Trp Arg Ser Ala Lys160 165 170GAC TTC AAC CGG CTC AAG AAG AAG ATG CAG CCT CCA GCA GCT GCA GTC 737Asp Phe Asn Arg Leu Lys Lys Lys Met Gln Pro Pro Ala Ala Ala Val175 180 185ACC CTG CAC CTG GGG GCT CAT GGC TTC TGACTTCTGA CCTTCTCCTC784Thr Leu His Leu Gly Ala His Gly Phe190 195TTCGCTCCCC CCC 797(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度225個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構；線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Asp Leu Arg Ala Gly Asp Ser Trp Gly Met Leu Ala Cys Leu Cys-27 -25 -20 -15Thr Val Leu Trp His Leu Pro Ala Val Pro Ala Leu Asn Arg Thr Gly-10 -51 5Asp Pro Gly Pro Gly Pro Ser Ile Gln Lys Thr Tyr Asp Leu Thr Arg10 15 20Tyr Leu Glu His Gln Leu Arg Ser Leu Ala Gly Thr Tyr Leu Asn Tyr25 30 35Leu Gly Pro Pro Phe Asn Glu Pro Asp Phe Asn Pro Pro Arg Leu Gly40 45 50Ala Glu Thr Leu Pro Arg Ala Thr Val Asp Leu Glu Val Trp Arg Ser55 60 65Leu Asn Asp Lys Leu Arg Leu Thr Gln Asn Tyr Glu Ala Tyr Ser His70 75 80 85Leu Leu Cys Tyr Leu Arg Gly Leu Asn Arg Gln Ala Ala Thr Ala Glu90 95 100Leu Arg Arg Ser Leu Ala His Phe Cys Thr Ser Leu Gln Gly Leu Leu105 110 115Gly Ser Ile Ala Gly Val Met Ala Ala Leu Gly Tyr Pro Leu Pro Gln120 125 130Pro Leu Pro Gly Thr Glu Pro Thr Trp Thr Pro Gly Pro Ala His Ser135 140 145Asp Phe Leu Gln Lys Met Asp Asp Phe Trp Leu Leu Lys Glu Leu Gln150 155 160 165Thr Trp Leu Trp Arg Ser Ala Lys Asp Phe Asn Arg Leu Lys Lys Lys170 175 180Met Gln Pro Pro Ala Ala Ala Val Thr Leu His Leu Gly Ala His Gly185 190 195Phe(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度5087個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構；線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc_feature(B)位置137..138(D)其它信息/產(chǎn)物＝“＞1 KB的間插非測序區(qū)”(xi)序列描述SEQ ID NO3AACCTGCGAG TGGGCCTGGC GGATGGGATT ATTAAAGCTT CGCCGGAGCC GCGGCTCGCC 60CTCCCACTCC GCCAGCCTCC GGGAGAGGAG CCGCACCCGG CCGGCCCAGC CCCAGCCCCA120TGGACCTCCG AGCAGGTTGA AAACCCAAAC TAGCCCTGCT CTTCATAACA TGACAAGCAG180CGCCCCATCT GATACCTAAA CCGACCAAGT CACAGCCCTC CAACTCACCC TCTGCCTGCC240CAGACCTCAC CACATCCTTG TGGACTCAAA CCTCAACCGC ACTAAATCAA CCAAATCCCA300AGTCTAAACT AATCTGAAAC TTTTAAAGTA ACCCAGTCCT TAAACCTAAC CTAGCCCAAT360GCCAATTATA TCTACCCTAG CCAAACCCTA ACTGCCTTTG CCAGTCCAAA GTGTCCACTG420AATCCTCACC TTGGTCCTCA CTGAAAATCC CAGAAAAGCA TATTTCCCCA CTGCCCACAT480CCCTCCTTAC AGCACCCAAC CCTGGCCTCT GGACTCCTGG TATCCTGGGA TGTCCAAACT540CTGCAGTGCC ATCAGCCAAC AAGCCCGACT CGTCAAATGC ACCTCTCTCC CTTCCTGTCC600CCACCCTTGC AGGCTGATGG AAAGGCCTCA TTGAAGTCCA ACTTTTCCCC ACCTAACACC660AAGAACGGGG TGAACCTCCA CACTGCCACC GTTCCCTGAG AGTGAGCACT AAATCTCCTT720CAATCTAACC CCACCCTACA CTTCCCACAC TCAGGAATCA CATCCTAGAA 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CCTCCTGTCC TACTCATGAG ACTGCCTCCA TTTCTTCCTT 2520CTGCAACCCT GCTCCTATCA GCTGAACCCT TCTTTCGGAG TGTTAGTGAG TACCCGTCTC 2580TCCCCAGCCC CTCAGCTGGT GGGCCTGGGT GTGTCAGCGG CAAATGGGGC TCTGGTTCCA 2640ATGGGCCACT CTCATCTCTC TCTTGTTCCT TGTGCAGAAA ACCTTTGCTT CACTCCACTG 2700CCCTCTCTAG TTCCCGACCC TTTTTCTCTC CTGGCTTTCC CTGCCAAATT TCTCCAAGGA 2760GTGGTCTACA CCCTCTGCCT CCACTTCCTC TCCACCCACT CACTTCTTAA CCCCCTGCAA 2820TCTGGCTTCC AGGCCCCAGC AATGGTTCTC TCCAAGGTCG TCAGGCACCT CCTTGCCAAG 2880CCCGACAGTG TTTTGAAGGC TCATTCTCCT TGCTGTCTGT TTTGCAGCCA CACTGCTGAG 2940CGCTGCTGCC TTCTCGAACT CCTCTTCCTT GGTCTCTGCA CTCTCCTGGG CCACCTTCTA 3000CCTCTCCAGC TCCTCCAGGC TCCTCTTCCT CTCTGTCCTG CCCCCACAGC GGGCACTCTC 3060CCAAGGTTTG CCCACCCAGC CAATCAGCAC GTCCTTCCTG AGCGTCTTGT GCGTCTCCTC 3120CTCCTCCTTT TTCTACGCCT CTCCATTGGA GAGCTCACCA CCGCCACTGC TTCAACTGTC 3180ACCTGCATAC AAATGATATC CTTATTGGAA AAACTCAGGG AGGCCATGAA CAAAGAAGCC 3240TAGCATGGAG ACAGGGCCAG TGTCAGGGGA CACAAAAAAT AGAAACTTTG GGAGCAGGTA 3300TCTCCTTGGT GGTGAGCCAG CGGCTCTGCC 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ACCCAGCCCC TCAGGTGGCA 4200CATCTGGAGG GCAGGGGTTG AGGGGCCACC ACCACACATG CCTTTCTGGG GTGAAGCCCT 4260TTGGCTGCCC CACTCTCCTT GGATGGGTGT TGCTCCCTTA TCCCCAAATC ACTCTATACA 4320TCCAATTCAG GAAACAAACA TGGTGGCAAT TCTACACAAA AAGAGATGAG ATTAACAGTG 4380CAGGGTTGGG GTCTGCATTG GAGGTGCCCT ATAAACCAGA AGAGAAAATA CTGAAAGCAC 4440AGGGGCAGGG ACAGACCAGA CCAGACCCAG GAGTCTCCAA AGCACAGAGT GGCAAACAAA 4500ACCCGAGCTG AGCATCAGGA CCTTGCCTCG AATTGTCTTC CAGTATTACG GTGCCTCTTC 4560TCTGCCCCCT TTCCCAGGGT ATCTGTGGGT TGCCAGGCTG GGGAGGGCAA CCATAGCCAC 4620ACCACAGGAT TTCCTGAAAG TTTACAATGC AGTAGCATTT TGGGGTGTAG GGTGGCAGCT 4680CCCCAAGGCC CTGCCCCCCA GCCCCACCCA CTCATGACTC TAAGTGTGTT GTATTAATAT 4740TTATTTATTT GGAGATGTTA TTTATTAGAT GATATTTATT GCAGAATTTC TATTCTTGTA 4800TTAACAAATA AAATGCTTGC CCCAGAACTT AGTCTCTTTG CCCAGCCTCA CCCCTCCTGG 4860TGCTCATCAG ACTCTTGCCA CCCCTGGCTC CCACTCCCTG CTTGCCTCTG GTGGAGCTGC 4920ACAGAGCTCT GGGAAGAGGC CCTCTTCCTC CCCGCACTGG GGCGATGGGC GCACCTCAGA 4980CTTACCCACT GCTGCTGCCA CCACCAACCC CTTGATCCCT CAGTCCTCCC ACACAGCTTC 5040TGTCCACCCC AGGTTTCCCT CACCCCACCT TTGCTAAGTC TTCCTCA 5087(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度819個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構；線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置95..769(ix)特征(A)名稱/關鍵詞mat_peptide(B)位置176..769(ix)特征(A)名稱/關鍵詞sig_peptide(B)位置95..175(xi)序列描述SEQ ID NO4TATTATTAAA GCTTCGCCGG AGCCGCGGCT CGCCCTCCCA CTCCGCCAGC CTCTGGGAGA 60GGAGCCGCGC CCGGCCGGCC CGGCCCCCAG CCCC ATG GAC CTC CGA GCA GGG112Met Asp Leu Arg Ala Gly-27 -25GAC TCG TGG GGG ATG TTA GCT TGC CTA TGC ACG GTG CTG TGG CAC CTC 160Asp Ser Trp Gly Met Leu Ala Cys Leu Cys Thr Val Leu Trp His Leu-20 -15 -10CCT GCA GTG CCA GCT CTT AAT CGC ACA GGA GAT CCA GGC CCT GGC CCC 208Pro Ala Val Pro Ala Leu Asn Arg Thr Gly Asp Pro Gly Pro Gly Pro-5 1 5 10TCC ATC CAG AAA ACC TAT GAC CTC ACC CGC TAC CTG GAG CAT CAA CTC 256Ser Ile Gln Lys Thr Tyr Asp Leu Thr Arg Tyr Leu Glu His Gln Leu15 20 25CGC AGC TTA GCT GGG ACC TAC CTG AAC TAC CTG GGG CCC CCT TTC AAC 304Arg Ser Leu Ala Gly Thr Tyr Leu Asn Tyr Leu Gly Pro Pro Phe Asn30 35 40GAG CCT GAC TTC AAT CCT CCT CGA CTG GGG GCA GAA ACT CTG CCC AGG 352Glu Pro Asp Phe Asn Pro Pro Arg Leu Gly Ala Glu Thr Leu Pro Arg45 50 55GCC ACG GTC AAC TTG GAA GTG TGG CGA AGC CTC AAT GAC AGG CTG CGG 400Ala Thr Val Asn Leu Glu Val Trp Arg Ser Leu Asn Asp Arg Leu Arg60 65 70 75CTG ACC CAG AAC TAT GAG GCG TAC AGT CAC CTC CTG TGT TAC TTG CGT 448Leu Thr Gln Asn Tyr Glu Ala Tyr Ser His Leu Leu Cys Tyr Leu Arg80 85 90GGC CTC AAC CGT CAG GCT GCC ACA GCT GAA CTC CGA CGT AGC CTG GCC 496Gly Leu Asn Arg Gln Ala Ala Thr Ala Glu Leu Arg Arg Ser Leu Ala95 100 105CAC TTC TGT ACC AGC CTC CAG GGC CTG CTG GGC AGC ATT GCA GGT GTC 544His Phe Cys Thr Ser Leu Gln Gly Leu Leu Gly Ser Ile Ala Gly Val110 115 120ATG GCG ACG CTT GGC TAC CCA CTG CCC CAG CCT CTG CCA GGG ACT GAG 592Met Ala Thr Leu Gly Tyr Pro Leu Pro Gln Pro Leu Pro Gly Thr Glu125 130 135CCA GCC TGG GCC CCT GGC CCT GCC CAC AGT GAC TTC CTC CAG AAG ATG 640Pro Ala Trp Ala Pro Gly Pro Ala His Ser Asp Phe Leu Gln Lys Met140 145 150 155GAT GAC TTC TGG CTG CTG AAG GAG CTG CAG ACC TGG CTA TGG CGT TCA 688Asp Asp Phe Trp Leu Leu Lys Glu Leu Gln Thr Trp Leu Trp Arg Ser160 165 170GCC AAG GAC TTC AAC CGG CTT AAG AAG AAG ATG CAG CCT CCA GCA GCT 736Ala Lys Asp Phe Asn Arg Leu Lys Lys Lys Met Gln Pro Pro Ala Ala175 180 185TCA GTC ACC CTG CAC TTG GAG GCA CAT GGT TTC TGACCTCTGA CCCTTAACCC789Ser Val Thr Leu His Leu Glu Ala His Gly Phe190 195CCACACCTCC AGGCCCAGTC AGCTGTGCTT819(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度225個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構；線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO5Met Asp Leu Arg Ala Gly Asp Ser Trp Gly Met Leu Ala Cys Leu Cys-27 -25 -20 -15Thr Val Leu Trp His Leu Pro Ala Val Pro Ala Leu Asn Arg Thr Gly-10 -51 5Asp Pro Gly Pro Gly Pro Ser Ile Gln Lys Thr Tyr Asp Leu Thr Arg10 15 20Tyr Leu Glu His Gln Leu Arg Ser Leu Ala Gly Thr Tyr Leu Asn Tyr25 30 35Leu Gly Pro Pro Phe Asn Glu Pro Asp Phe Asn Pro Pro Arg Leu Gly40 45 50Ala Glu Thr Leu Pro Arg Ala Thr Val Asn Leu Glu Val Trp Arg Ser55 60 65Leu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Thr Gln Asn Tyr Glu Ala Tyr Ser His70 75 80 85Leu Leu Cys Tyr Leu Arg Gly Leu Asn Arg Gln Ala Ala Thr Ala Glu90 95 100Leu Arg Arg Ser Leu Ala His Phe Cys Thr Ser Leu Gln Gly Leu Leu105 110 115Gly Ser Ile Ala Gly Val Met Ala Thr Leu Gly Tyr Pro Leu Pro Gln120 125 130Pro Leu Pro Gly Thr Glu Pro Ala Trp Ala Pro Gly Pro Ala His Ser135 140 145Asp Phe Leu Gln Lys Met Asp Asp Phe Trp Leu Leu Lys Glu Leu Gln150 155 160 165Thr Trp Leu Trp Arg Ser Ala Lys Asp Phe Asn Arg Leu Lys Lys Lys170 175 180Met Gln Pro Pro Ala Ala Ser Val Thr Leu His Leu Glu Ala His Gly185 190 195Phe(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構；線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO6AGCAAGCTTC ACCATGGACC TCCGAGCAGG GGACTC 36(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度64個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構；線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO7AGCGGGGCCG CACTACTTGC ATCGTCGCGT CCTTGTACTC GAAGCCATGA GCCCCCAGGT 60GCAG 64(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度199個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構；線性(ii)分子類型蛋白質(ix)特征(A)名稱/關鍵詞Protein(B)位置1..178(ix)特征(A)名稱/關鍵詞Region(B)位置-21..0(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu Trp Pro-20 -15 -10Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser-5 1 5 10Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser15 20 25Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe30 35 40Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met45 50 55Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg60 65 70 75Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg80 85 90Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr95 100 105Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met110 115 120Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro125 130 135Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp G1y Gly Ile Arg Ala Ala His Ala140 145 150 155Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu160 165 170Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu175(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度212個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構；線性(ii)分子類型蛋白質(ix)特征(A)名稱/關鍵詞Protein(B)位置1..182(ix)特征(A)名稱/關鍵詞Region(B)位置-30..0(xi)序列描述SEQ ID NO9Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu-30 -25 -20 -15Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro-10 -5 1Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr5 10 15Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile20 25 30Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser35 40 45 50Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala55 60 65Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu70 75 80Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr85 90 95Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln100 105 110Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn115 120 125 130Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu135 140 145Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His150 155 160Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala165 170 175Leu Arg Gln Met180(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度204個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構；線性(ii)分子類型蛋白質(ix)特征(A)名稱/關鍵詞Protein(B)位置1..174(ix)特征(A)名稱/關鍵詞Region(B)位置-30..0(xi)序列描述SEQ ID NO10Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln-30 -25 -20 -15Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro-10 -5 1Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu5 10 15Glu Gln Val Arg Lys Ile Gin Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys20 25 30Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu35 40 45 50Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser55 60 65Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu70 75 80Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu85 90 95Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala100 105 110Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu115 120 125 130Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg135 140 145Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu150 155 160Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro165 170(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度201個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構；線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO11Met Ser Arg Arg Glu Gly Ser Leu Glu Asp Pro Gln Thr Asp Ser Ser1 5 10 15Val Ser Leu Leu Pro His Leu Glu Ala Lys Ile Arg Gln Thr His Ser20 25 30Leu Ala His Leu Leu Thr Lys Tyr Ala Glu Gln Leu Leu Gln Glu Tyr35 40 45Val Gln Leu Gln Gly Asp Pro Phe Gly Leu Pro Ser Phe Ser Pro Pro50 55 60Arg Leu Pro Val Ala Gly Leu Ser Ala Pro Ala Pro Ser His Ala Gly65 70 75 80Leu Pro Val His Glu Arg Leu Arg Leu Asp Ala Ala Ala Leu Ala Ala85 90 95Leu Pro Pro Leu Leu Asp Ala Val Cys Arg Arg Gln Ala Glu Leu Asn100 105 110Pro Arg Ala Pro Arg Leu Leu Arg Arg Leu Glu Asp Ala Ala Arg Gln115 120 125Ala Arg Ala Leu Gly Ala Ala Val Glu Ala Leu Leu Ala Ala Leu Gly130 135 140Ala Ala Asn Arg Gly Pro Arg Ala Glu Pro Pro Ala Ala Thr Ala Ser145 150 155 160Ala Ala Ser Ala Thr Gly Val Phe Pro Ala Lys Val Leu Gly Leu Arg165 170 175Val Cys Gly Leu Tyr Arg Glu Trp Leu Ser Arg Thr Glu Gly Asp Leu180 185 190Gly Gln Leu Leu Pro Gly Gly Ser Ala195 200(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度199個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構；線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO12Met Ala Phe Thr Glu His Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp Leu Cys1 5 10 15Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr Ala20 25 30Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile Asn35 40 45Leu Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser Thr Asp Gln Trp Ser50 55 60Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Glu Asn Leu Gln Ala Tyr Arg65 70 75 80Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gln Gln Val His85 90 95Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala Ile His Thr Leu Leu100 105 110Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile Leu115 120 125Leu Glu Tyr Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile Asn130 135 140Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys Val145 150 155 160Leu Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu Arg165 170 175Phe Ile Ser Ser His Gln Thr Gly Ile Pro Ala Arg Gly Ser His Tyr180 185 190Ile Ala Asn Asn Lys Lys Met195(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度252個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構；線性(ii)分子類型蛋白質(ix)特征(A)名稱/關鍵詞Protein(B)位置1..227(ix)特征(A)名稱/關鍵詞Region
(B)位置-25..0(xi)序列描述SEQ ID NO13Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala-25 -20 -15 -10Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Ala Ile Gly Ser Cys Ser-5 1 5Lys Glu Tyr Arg Val Leu Leu Gly Gln Leu Gln Lys Gln Thr Asp Leu10 15 20Met Gln Asp Thr Ser Arg Leu Leu Asp Pro Tyr Ile Arg Ile Gln Gly25 30 35Leu Asp Val Pro Lys Leu Arg Glu His Cys Arg Glu Arg Pro Gly Ala40 45 50 55Phe Pro Ser Glu Glu Thr Leu Arg Gly Leu Gly Arg Arg Gly Phe Leu60 65 70Gln Thr Leu Asn Ala Thr Leu Gly Cys Val Leu His Arg Leu Ala Asp75 80 85Leu Glu Gln Arg Leu Pro Lys Ala Gln Asp Leu Glu Arg Ser Gly Leu90 95 100Asn Ile Glu Asp Leu Glu Lys Leu Gln Met Ala Arg Pro Asn Ile Leu105 110 115Gly Leu Arg Asn Asn Ile Tyr Cys Met Ala Gln Leu Leu Asp Asn Ser120 125 130 135Asp Thr Ala Glu Pro Thr Lys Ala Gly Arg Gly Ala Ser Gln Pro Pro140 145 150Thr Pro Thr Pro Ala Ser Asp Ala Phe Gln Arg Lys Leu Glu Gly Cys155 160 165Arg Phe Leu His Gly Tyr His Arg Phe Met His Ser Val Gly Arg Val170 175 180Phe Ser Lys Trp Gly Glu Ser Pro Asn Arg Ser Arg Arg His Ser Pro185 190 195His Gln Ala Leu Arg Lys Gly Val Arg Arg Thr Arg Pro Ser Arg Lys200 205 210 215Gly Lys Arg Leu Met Thr Arg Gly Gln Leu Pro Arg220 225(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度202個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構；線性(ii)分子類型蛋白質(ix)特征(A)名稱/關鍵詞Protein(B)位置1..180(ix)特征(A)名稱/關鍵詞Region(B)位置-22..0(xi)序列描述SEQ ID NO14Met Lys Val Leu Ala Ala Gly Val Val Pro Leu Leu Leu Val Leu His-20 -15 -10Trp Lys His Gly Ala Gly Ser Pro Leu Pro Ile Thr Pro Val Asn Ala-5 1 5 10Thr Cys Ala Ile Arg His Pro Cys His Asn Asn Leu Met Asn Gln Ile15 20 25Arg Ser Gln Leu Ala Gln Leu Asn Gly Ser Ala Asn Ala Leu Phe Ile30 35 40Leu Tyr Tyr Thr Ala Gln Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Leu Asp Lys45 50 55Leu Cys Gly Pro Asn Val Thr Asp Phe Pro Pro Phe His Ala Asn Gly60 65 70Thr Glu Lys Ala Lys Leu Val Glu Leu Tyr Arg Ile Val Val Tyr Leu75 80 85 90Gly Thr Ser Leu Gly Asn Ile Thr Arg Asp Gln Lys Ile Leu Asn Pro95 100 105Ser Ala Leu Ser Leu His Ser Lys Leu Asn Ala Thr Ala Asp Ile Leu110 115 120Arg Gly Leu Leu Ser Asn Val Leu Cys Arg Leu Cys Ser Lys Tyr His125 130 135Val Gly His Val Asp Val Thr Tyr Gly Pro Asp Thr Ser Gly Lys Asp140 145 150Val Phe Gln Lys Lys Lys Leu Gly Cys Gln Leu Leu Gly Lys Tyr Lys155 160 165 170Gln Ile Ile Ala Val Leu Ala Gln Ala Phe175 180(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度45個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構；線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO15AGCGCTACGG TCGACCCGGC GTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTACG 45(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構；線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO16GGAAGGAAAA AAGCGGCCGC TACA2權利要求
1.一種編碼多肽的核酸分子，選自如下核酸分子組成的組(a)SEQ ID NO1的核酸分子；(b)SEQ ID NO3的核酸分子；(c)編碼SEQ ID NO2的多肽或其生物活性片段的核酸分子；(d)編碼一種與SEQ ID NO2多肽至少有70％同一性的多肽的核酸分子；(e)在嚴格條件下與上述(a)-(d)中任意一種核酸分子雜交的核酸分子；以及(f)作為上述(a)-(e)中任意一種核酸分子的互補序列的核酸分子。
2.一種編碼多肽的核酸分子，選自如下核酸分子組成的組(a’)SEQ ID NO4的核酸分子；(b’)編碼SEQ ID NO5的多肽或其生物活性片段的核酸分子；(c’)編碼一種與SEQ ID NO5多肽至少有70％同一性的多肽的核酸分子；(d’)在嚴格條件下與上述(a’)-(c’)中任意一種核酸分子雜交的核酸分子；以及(e’)作為上述(a’)-(d’)中任意一種核酸分子的互補序列的核酸分子。
3.SEQ ID NO1的核酸分子。
4.SEQ ID NO3的核酸分子。
5.一種編碼SEQ ID NO2的多肽的核酸分子。
6.一種編碼SEQ ID NO2的1-198位氨基酸的核酸分子。
7.一種含有權利要求1-6中任意一項的核酸分子的載體。
8.一種含有權利要求7的載體的宿主細胞。
9.一種用于生產(chǎn)NNT-1多肽的方法，包括下列步驟(a)在一種合適的宿主中表達由權利要求1-6中任意一項的核酸編碼的多肽；(b)分離該多肽。
10.一種NNT-1多肽，選自下列多肽組成的組(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO2的1-198位氨基酸的多肽；(c)與(a)或(b)的多肽至少有70％同一性的多肽；以及(d)(a)-(c)中的任意一種多肽的生物活性片段。
11.一種NNT-1多肽，選自下列多肽組成的組(a’)SEQ ID NO5的多肽；(b’)SEQ ID NO5的1-198位氨基酸的多肽；(c’)與(a’)或(b’)的多肽至少有70％同一性的多肽；以及(d)(a’)-(c’)中的任意一種多肽的生物活性片段。
12.一種是SEQ ID NO2多肽的NNT-1多肽或其生物活性片段。
13.一種是SEQ ID NO5多肽的NNT-1多肽或其生物活性片段。
14.權利要求12或13的NNT-1多肽，它不含有氨基末端甲硫氨酸。
15.權利要求12或13的NNT-1多肽，它另外含有氨基末端甲硫氨酸。
16.一種特異性結合人NNT-1的抗體或其片段。
17.權利要求16的抗體，它是一種單克隆抗體。
18.一種治療患有神經(jīng)或免疫疾病或障礙的病人的方法，包括對所述病人給予有效量的權利要求12-15中任意一項的NNT-1多肽。
19.一種根據(jù)權利要求18的方法，其中所述的疾病或障礙選自阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮性側索硬化、進行性神經(jīng)病性綜合征、亨廷頓舞蹈病、外周神經(jīng)病、營養(yǎng)不良、或神經(jīng)視網(wǎng)膜變性。
20.一種根據(jù)權利要求18的方法，其中所述疾病或障礙的特征在于缺乏B-細胞或T細胞。
21.一種根據(jù)權利要求20的方法，其中所述的疾病或障礙是常見的可變性免疫缺陷(CVID)、選擇性IgA缺失、血丙球蛋白過少、和X連鎖丙球蛋白缺乏血癥(aggammaglobulinemia)。
22.一種在接種時提高免疫反應性以及產(chǎn)生抗體的方法，包括對需要的病人給予有效量的權利要求12-15中任意一項的NNT-1多肽。
23.一種治療需要的病人中的炎癥疾病的方法，包括對所述病人給予有效量的權利要求12-15中任意一項的NNT-1多肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了編碼命名為NNT－1的新型神經(jīng)營養(yǎng)因子的核酸。本發(fā)明還公開了針對NNT－1多肽的氨基酸序列、用于制備NNT－1多肽的方法以及其它相關的方面。這類多肽對刺激B－細胞和/或T細胞的產(chǎn)生以及減輕炎癥的反應具有活性。
文檔編號C07K14/435GK1251134SQ98803642
公開日2000年4月19日 申請日期1998年2月2日 優(yōu)先權日1997年2月3日
發(fā)明者張明熙, G·S·埃利奧特, G·塞納爾迪, U·薩米恩托 申請人:安姆根有限公司