專利名稱：氮雜癸間五烯基酮類化合物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氮雜癸間五烯基酮類化合物在制備藥物中的用途，具體地說(shuō)，涉及它作為五羥色胺和去甲腎上腺素雙重轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白再攝取抑制劑在制備治療哺乳動(dòng)物各種與5-羥色胺和去甲腎上腺素神經(jīng)遞質(zhì)降低有關(guān)的疾病(包括肥胖、酒精中毒、疼痛、尿失禁、喪失記憶、焦慮、吸煙等)的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在過(guò)去四十年中，對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)單胺類遞質(zhì)與各種疾病和狀態(tài)的關(guān)系進(jìn)行了評(píng)價(jià)和研究。研究發(fā)現(xiàn)，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)尤其是5-羥色胺和去甲腎上腺素在控制及治療肥胖、抑郁、酒精中毒、疼痛、尿失禁、喪失記憶、焦慮、吸煙等方面有重要作用(美國(guó)專利5026707)。而選擇性單胺類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白再攝取抑制劑的發(fā)現(xiàn)為治療上述生理和心理上的疾病提供了新的工具。單胺類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白再攝取抑制劑通過(guò)抑制單胺類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而不干擾神經(jīng)突觸后受體的功能，使突觸間隙中內(nèi)源的單胺類遞質(zhì)恢復(fù)至正常范圍內(nèi)，從而達(dá)到治療上述疾病的效果。例如鹽酸氟西汀是選擇性和特異性的5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白再攝取抑制劑(SSRIs)，于1987年作為第一個(gè)SSRIs的抗抑郁藥被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，隨后幾年氟西汀新增適應(yīng)癥用于焦慮癥的治療，目前對(duì)食欲不振以及其它失調(diào)的治療正在進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)。與此相似托莫西汀是選擇性和特異性的去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白再攝取抑制劑，也已用于治療抑郁癥，正在對(duì)其治療尿失禁進(jìn)行臨床觀察。在美國(guó)專利4018895，4194009，4314081和5026707等號(hào)中公開的許多化合物是作為5-羥色胺、去甲腎上腺素和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有效的再攝取抑制劑。
目前科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)抑制5-羥色胺、去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白再攝取的藥物，可能會(huì)有更好的療效，更廣的適應(yīng)癥以及更少的毒副作用。例如，美國(guó)家用產(chǎn)品公司于97年推出了第一個(gè)同時(shí)能抑制5-羥色胺、去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白雙重?cái)z取的抗抑郁藥(SNRI)文拉法辛(venlafaxine)，該藥的最突出的特點(diǎn)是起效迅速，而現(xiàn)代抗抑郁藥面臨的一個(gè)主要難題是如何解決其快速起效的問(wèn)題，文拉法辛對(duì)重癥抑郁癥、難治性抑郁癥、焦慮癥均有明顯療效。與此類似，西布曲明(sibutramine)是Knoll公司于1997年上市的5-羥色胺和去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白雙重?cái)z取的抗抑郁藥，臨床上用于抑郁癥和肥胖癥的治療，并于2000年成功在中國(guó)上市銷售，該藥顯示了良好療效。最為欣慰的是美國(guó)禮來(lái)制藥公司生產(chǎn)的對(duì)5-羥色胺和去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白雙重抑制的化合物度羅西汀(duloxetine)，現(xiàn)有研究資料表明，該藥對(duì)緊張性尿失禁、抑郁癥、肥胖癥、疼痛等均有良好的療效，并在2002年9月由美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于重癥抑郁癥，在2004年初度羅西汀(duloxetine)用于治療緊張性尿失禁的申請(qǐng)已獲批準(zhǔn)。與SSRI相比，目前對(duì)SNRI類化合物的探索較少。一系列該類藥物的上市促使科學(xué)家們更大力度開發(fā)作用于5-HT和去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)雙重途徑的新型藥物。
因此，本領(lǐng)域迫切需要能針對(duì)5-HT和去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)雙重途徑的新型藥物。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明提供氮雜癸間五烯基酮類化合物的一種制備治療5-羥色胺和去甲腎上腺素神經(jīng)遞質(zhì)降低所導(dǎo)致的疾病的藥物，優(yōu)選是治療肥胖、酒精中毒、疼痛、尿失禁、喪失記憶、焦慮或吸煙的藥物。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，該藥物是五羥色胺和去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白雙重再攝取抑制劑。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該藥物是片劑、顆粒劑、針劑、粉劑或膠囊。
在該方面的一個(gè)優(yōu)選例中，化合物選自普羅托品、紫堇胺、紫堇維定、紫堇文堿、4，6，7，14-四氫-12-甲氧基-5-甲基雙[1，3]-苯二氧合橋[4，5-c5’，6’-g]氮雜癸間五烯基-13(5H)-酮、克利多平、崖椒堿I、崖椒堿II、紅乃馬草堿、4，6，7，13-四氫-9-羥基-10-甲氧基-5-甲苯基[e]-1，3-二氧合橋[4，5-1][2]苯氮雜癸間五烯基-12(5H)-酮、5，7，8，14-四氫-3，4，10，11-四甲氧基-6-甲基二苯基[c，g]氮雜癸間五烯基-13(6H)-酮、N-氧代普羅托品、5，7，8，14-四氫-4-羥基-3，10，11-三甲氧基-6-甲基二苯基[c，g]氮雜癸間五烯基-13(6H)-酮、5，7，8，15-四氫-6-甲基雙[1，3]-苯二氧合橋[5，6-c，5’，6’-g]氮雜癸間五烯基-14(6H)-酮、5，7，8，15-四氫-3-羥基-4-甲氧基-6-甲苯基[e]-1，3-二氧合橋[4，5-k][3]苯氮雜癸間五烯基-14(6H)-酮、5，7，8，14-四氫-10，11-二羥基-3，4-二甲氧基-6-甲基二苯基[c，g]氮雜癸間五烯基-13(6H)-酮、二氫普羅托品、崖椒堿III、1-甲氧基-13氧代別克利多平、13-氧代克利多平、13-氧代-5，7，8，14-四氫-3，4，10，11-四甲氧基-6-甲基二苯基[c，g]氮雜癸間五烯基-13(6H)-酮、13-氧代普羅托品。
在該方面的一個(gè)具體實(shí)施方案中，這些氮雜癸間五烯基酮類化合物以藥物學(xué)上可接受的鹽形式配制，優(yōu)選鹽選自鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、三氟醋酸鹽或甲磺酸鹽。更優(yōu)選鹽選自鹽酸鹽和氫溴酸鹽。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，上述鹽含0.5-3分子的結(jié)晶水。


圖1顯示了單克隆細(xì)胞[3H]標(biāo)記的去甲腎上腺素?cái)z取量。通過(guò)同位素流量的鑒定，挑選了四個(gè)單克隆細(xì)胞，其中4號(hào)克隆為高表達(dá)細(xì)胞株。
圖2顯示了不同濃度的各種5-HT抑制劑對(duì)同位素標(biāo)記的5-HT攝取的效果。普羅托品對(duì)高表達(dá)五羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白細(xì)胞株的活性作用在10ug/ml濃度抑制活性同1ug/ml氟西汀有相同藥效。而同不加藥組(S6)比較顯示較強(qiáng)的抑制作用***P＜0.001。
圖3顯示了普羅托品對(duì)高表達(dá)去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白細(xì)胞株的活性作用的抑制作用。在10ug/ml濃度抑制活性同不加藥組(N1)比較顯示較強(qiáng)的抑制作用***P＜0.001。
圖4顯示了普羅托品對(duì)不同細(xì)胞的選擇性。高表達(dá)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白細(xì)胞株的活性同不加藥組D8相比無(wú)顯著性差異，無(wú)抑制活性。
圖5顯示了普羅托品對(duì)高表達(dá)γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白細(xì)胞株的活性同不加藥組G1相比無(wú)顯著性差異，無(wú)抑制活性，說(shuō)明普羅托品對(duì)不同細(xì)胞系有選擇性。圖中NO-711為GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑。
圖6顯示了普羅托品的安全性。無(wú)論在10ug/ml還是在1ug/ml的濃度，細(xì)胞存活率在96％以上，同不加藥組無(wú)顯著性差異。說(shuō)明對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性。
圖7顯示了小鼠甩頭綜合征的抑制。氟西汀為陽(yáng)性對(duì)照藥。普羅托品在三個(gè)濃度組里同鹽水組均有顯著性差異***P＜0.001。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了氮雜癸間五烯基酮類化合物的新用途，它們作為5-HT和去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為靶標(biāo)的雙重抑制劑，對(duì)5-HT和去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的攝取具有明顯的抑制作用。
本發(fā)明提供了氮雜癸間五烯基酮類化合物，及它們可用作藥物的鹽，鹽為鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、三氟醋酸鹽或甲磺酸鹽等，優(yōu)選的鹽為鹽酸鹽、氫溴酸鹽。
這些化合物的化學(xué)式、分子式和分子量如下1.普羅托品4，6，7，14-四氫-5-甲基雙[1，3]-苯二氧合橋[4，5-c5’，6’-g]氮雜癸間五烯基-13(5H)-酮，分子式為C20H19NO5，分子量353.374。
2.紫堇胺4，6，7，14-四氫-5，14-二甲基雙[1，3]-苯二氧合橋[4，5-c5’，6’-g]氮雜癸間五烯基-13(5H)-酮(+)-形式；分子式C21H21NO5；分子量367.401。
3.紫堇維定5，7，8，15-四氫-3，4-二甲氧基-6，15-二甲苯基[e][1，3]二氧合橋[4，5-k][3]苯氮雜癸間五烯基-14(6H)-酮(+)-形式；分子式C22H25NO5；分子量383.4434.紫堇文堿4，6，7，14-四氫-5，14-二甲基雙[1，3]-苯二氧合橋[4，5-c5’，6’-g]氮雜癸間五烯基-13(5H)-酮(±)-形式；分子式C21H21NO5；分子量367.4015.考特羅平(coulteropine)4，6，7，14-四氫-12-甲氧基-5-甲基雙[1，3]-苯二氧合橋[4，5-c5’，6’-g]氮雜癸間五烯基-13(5H)-酮；分子式C21H21NO6；分子量383.4006.克利多平4，6，7，13-四氫-9，10-二甲氧基-5-甲苯基[e][1，3]二氧合橋[4，5-1][2]苯氮雜癸間五烯基-12(5H)-酮；分子式C21H23NO5；分子量369.4167.崖椒堿I5，7，8，15-四氫-3，4-二甲氧基-6-甲苯基[e][1，3]二氧合橋[4，5-k][3]苯氮雜癸間五烯基-14(6H)-酮；分子式C21H23NO5；分子量369.416；8.崖椒堿II5，7，8，15-四氫-2，3-二甲氧基-6-甲苯基[e][1，3]二氧合橋[4，5-k][3]苯氮雜癸間五烯基-14(6H)-酮；分子式C21H23NO5；分子量369.416；9.紅乃馬草堿5，7，8，15-四氫-4-羥基-3-甲氧基-6-甲苯基[e][1，3]二氧合橋[4，5-k][3]苯氮雜癸間五烯基-14(6H)-酮；分子式C20H21NO5；分子量355.390；10.依茲滅靈(izmirine)4，6，7，13-四氫-9-羥基-10-甲氧基-5-甲苯基[e]-1，3-二氧合橋[4，5-1][2]苯氮雜癸間五烯基-12(5H)-酮；分子式C20H21NO5；分子量355.39；11.木拉敏(muramine)5，7，8，14-四氫-3，4，10，11-四甲氧基-6-甲基二苯基[c，g]氮雜癸間五烯基-13(6H)-酮；分子式C22H27NO5；分子量385.459；12.N-氧代普羅托品4，6，7，14-四氫-5-甲基-5-氧-雙[1，3]-苯二氧合橋[4，5-c5’，6’-g]氮雜癸間五烯基-13(5H)-酮；分子式C20H19NO6；分子量369.373；13.普沙利平(protothalipine)5，7，8，14-四氫-4-羥基-3，10，11-三甲氧基-6-甲基二苯基[c，g]氮雜癸間五烯基-13(6H)-酮；分子式C21H25NO5；分子量371.432；14.假普羅托品(pseudoprotopine)5，7，8，15-四氫-6-甲基雙[1，3]-苯二氧合橋[5，6-c，5’，6’-g]氮雜癸間五烯基-14(6H)-酮；分子式C20H19NO5；分子量353.374；
15.騰松草寧堿(thalictrisine)5，7，8，15-四氫-3-羥基-4-甲氧基-6-甲苯基[e]-1，3-二氧合橋[4，5-k][3]苯氮雜癸間五烯基-14(6H)-酮；分子式C20H21NO5；分子量355.39；16.韋蘭汀(vaillantine)5，7，8，14-四氫-10，11-二羥基-3，4-二甲氧基-6-甲基二苯基[c，g]氮雜癸間五烯基-13(6H)-酮；分子式C20H23NO5；分子量357.405。
17.二氫普羅托品；分子式C20H21NO5；分子量355.390。
18.崖椒堿III；結(jié)構(gòu)未知；分子式C22H26NO4；分子量368.452。
19.奧利酮(oreonone)；1-甲氧基-13氧代別克利多平；分子式C22H25NO6；分子量399.443。
20.13-氧代克利多平；分子式C21H21NO6；分子量383.400。
21.13-氧代木拉敏(muramine)13-氧代-5，7，8，14-四氫-3，4，10，11-四甲氧基-6-甲基二苯基[c，g]氮雜癸間五烯基-13(6H)-酮；分子式C22H25NO6；分子量399.443。
22.13-氧代普羅托品；分子式C20H17NO6；分子量367.357。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供了應(yīng)用本發(fā)明化合物有選擇地抑制5-HT和去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白攝取的方法以及治療哺乳動(dòng)物各種與5-羥色胺和去甲腎上腺素神經(jīng)遞質(zhì)降低有關(guān)的疾病(包括肥胖、抑郁、酒精中毒、疼痛、尿失禁、喪失記憶、焦慮、吸煙等)藥物中的用途及方法。
本項(xiàng)發(fā)明的氮雜癸間五烯基酮類化合物作為治療哺乳動(dòng)物各種與5-羥色胺和去甲腎上腺素神經(jīng)遞質(zhì)降低有關(guān)的疾病(包括肥胖、抑郁、酒精中毒、疼痛、尿失禁、喪失記憶、焦慮、吸煙等)藥物用途，現(xiàn)以普羅托品為例闡述該發(fā)明，著重闡述其在抑郁、焦慮、肥胖方面的用途。普羅托品的化學(xué)名稱為4，6，7，14-四氫-5-甲基雙[1，3]-苯二氧合橋[4，5-c5’，6’-g]氮雜癸間五烯基-13(5H)-酮，分子式為C20H19NO5，分子量353.374。本發(fā)明的普羅托品化合物是從天然產(chǎn)物中分離純化得到的。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，選用從中國(guó)云南省產(chǎn)的藥用植物紫金龍(Dactylicapnosscandens huth)用現(xiàn)有技術(shù)提取的純天然產(chǎn)物普羅托品。它是通過(guò)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的活性篩選，然后反復(fù)進(jìn)行分離和活性評(píng)價(jià)跟蹤得到單體化合物。
本發(fā)明人從天然產(chǎn)物中利用活性追蹤分離純化得到該類抑制劑，通過(guò)體外的抑制結(jié)合實(shí)驗(yàn)，以及動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究證明，該類化合物具有明顯的抗抑郁、抗焦慮和減肥作用，并且該類化合物未發(fā)現(xiàn)有成癮、耐藥性和過(guò)敏現(xiàn)象。它們作為藥物是安全的。
劑量在本發(fā)明中，對(duì)該類抑制劑的劑量沒有特別限制，可用任何合適的劑量。在使用五羥色胺和去甲腎上腺素雙重再攝取抑制劑治療哺乳動(dòng)物各種與5-羥色胺和去甲腎上腺素神經(jīng)遞質(zhì)降低有關(guān)的疾病，藥物的用量取決于疾病的性質(zhì)、病程、輕重、藥物反應(yīng)情況以及病人接受治療的情況等，最終由處方醫(yī)生決定給予病人多少劑量。
一般，合適的含量是五羥色胺和去甲腎上腺素雙重再攝取抑制劑占藥物組合物總重量的0.01％～99％，較佳地0.1-90％。
劑量單元包括一種五羥色胺和去甲腎上腺素雙重再攝取抑制劑化合物，劑量單元還可含有稀釋劑、填充劑、載體等。劑量單位是固體或凝膠形式，如丸劑、片劑、膠囊等，或者是液體形式，它們適合口服給藥、直腸給藥、局部給藥或腸胃外給藥、或者靜脈內(nèi)給藥。
劑型本發(fā)明的經(jīng)口給藥的固體組合物可來(lái)用片劑、丸劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、滴劑等形式。這些固體組合物中混合了1種或1種以上的活性物質(zhì)和至少1種惰性稀釋劑，例如，乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、羥丙基纖維素、微晶纖維素、淀粉、聚乙烯毗咯烷酮、瓊脂、果膠、硅鋁酸鎂、鋁酸鎂。還可按照常用方法使組合物中含有除了惰性稀釋劑之外的添加劑，例如，硬脂酸鎂等潤(rùn)滑劑、纖維素乙醇酸鈣等崩解劑、乳糖等穩(wěn)定劑、谷氨酸或天一氨酸等助溶劑。如是片劑或丸劑，還可根據(jù)需要，在其外部包裹上蔗糖、明膠、羥甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、鄰苯二甲酸酯等糖衣或胃溶性、腸溶性薄膜。
經(jīng)口給藥的液體組合物包括藥劑上允許的乳濁劑、溶液劑、懸浮劑、糖漿劑、酏劑等，通常使用的惰性稀釋劑包括精制水、乙醇。該組合物中除了惰性稀釋劑之外，還可包含濕潤(rùn)劑、懸浮劑等助劑，甜味劑、矯味劑、芳香劑和防腐劑。
非經(jīng)口給藥的注射劑包括無(wú)菌水性或非水性溶液劑、懸浮劑和乳濁劑。水性溶液劑和懸浮劑中包含注射劑用蒸餾水及生理鹽水。非水溶性溶液劑和懸浮劑中包含兩二醇，聚乙二醇，可可脂、橄攬油、蓖麻油等植物油，乙醇等醇類，阿拉伯膠、吐溫80(商品名)等。這些組合物中還可包含等滲劑、防腐劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、分散劑、穩(wěn)定劑(例如，乳糖)、助溶劑(例如，谷氨酸、天冬氨酸)。用德菌膜過(guò)濾上述組合物，再配合使用滅菌劑就可達(dá)到無(wú)菌的目的。然后，利用上述組合物制得無(wú)菌的固體組合物，在使用前用水或無(wú)菌莊射用溶劑溶解就可加以利用。
可用于配制本友明口服劑型的、具體的藥學(xué)上可接受的載體和賦形劑例子，在美國(guó)專利No 3,903,297(1975年9月2日授予Robert)中有描述。用于制造本發(fā)明的有用劑型的技術(shù)和組合物，在下列文獻(xiàn)中有描述7種現(xiàn)代制劑(7ModernPharmaceutics)第9和10章(Banker & Rhodes編輯，1979)Lieberman等人，藥物劑型片劑(Pharmaceutical Dosage FormsTablets)(1981)；和Ansel，藥物劑型導(dǎo)論(Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms)2版(1976)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
實(shí)施例1天然產(chǎn)物中活性化合物普羅托品的分離純化中國(guó)藥用植物紫金龍作為民間傳統(tǒng)藥物使用產(chǎn)自中國(guó)云南省西部云龍的植物。其干燥植物根部粗粉在室溫下用10％氨水浸潤(rùn)，加苯提取3次每次3天，合并三次苯提液，用2％鹽酸中和至出現(xiàn)白色混濁，過(guò)濾去掉沉淀物，稀鹽酸液用0.5MNaOH堿化，調(diào)pH至8，用氯仿萃取其中生物堿，直至無(wú)生物堿顯色反應(yīng)。所得氯仿液在50℃減壓蒸餾除去氯仿，得抽提物用甲醇和少許丙酮溶解，放置過(guò)夜后析出塊狀結(jié)晶。此生物堿經(jīng)核磁共振等鑒定，證明其為化合物普羅托品。
實(shí)施例2以五羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺、Y-氨基丁酸四種神經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(5-HTT、NET、DAT、GAT-1)為靶標(biāo)的活性篩選細(xì)胞系的建立。(以DAT為例)通過(guò)將5-HTT、NET、DAT、GAT-1全長(zhǎng)編碼序列克隆于pCDNA3載體(美國(guó)invitrogen公司)適合位置的酶切位點(diǎn)上，用電穿孔方法轉(zhuǎn)染導(dǎo)入細(xì)胞，48小時(shí)后用含G418的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。10天后對(duì)照組細(xì)胞全部死亡，而實(shí)驗(yàn)組形成許多細(xì)胞克隆。挑取克隆培養(yǎng)一周后，待細(xì)胞鋪滿孔底，吸去培養(yǎng)基，同上用胰酶消化。每孔中的細(xì)胞分別接種于兩塊96孔平板的相應(yīng)的孔中.待細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底后，其中一塊板用于同位素流量測(cè)定。將對(duì)應(yīng)的另一塊板中轉(zhuǎn)運(yùn)活性高的孔中的細(xì)胞逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，每一級(jí)都進(jìn)行同位素流量測(cè)定后選取轉(zhuǎn)運(yùn)活力較高細(xì)胞株培養(yǎng)，最后選取轉(zhuǎn)運(yùn)活力最高的細(xì)胞克隆(起名D8)保種。對(duì)于建立永久表達(dá)(5-HTT、NET、DAT、GAT-1)的CHO細(xì)胞系，用類似以上的方法就能獲得一株高效表達(dá)5-HTT、NET及GAT-1的CHO細(xì)胞，分別取名為S6，N1，G1。
結(jié)果通過(guò)同位素流量的測(cè)定，獲得了高表達(dá)5-HTT、NET、DAT、GAT-1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的細(xì)胞系。建立了針對(duì)5-HTT、NET為靶標(biāo)的抗抑郁藥物篩選的細(xì)胞篩選平臺(tái)。
圖1顯示了結(jié)果。以NET為例作圖，挑選了4個(gè)細(xì)胞克隆，CHO為陰性對(duì)照，根據(jù)NET的表達(dá)量，4號(hào)克隆表達(dá)量最高。最后我們選取4號(hào)克隆作為高效表達(dá)細(xì)胞株(N1)。
實(shí)施例3普羅托品化合物的體外活性及選擇專一性的測(cè)定。
培養(yǎng)S6、N1、D8細(xì)胞于48孔板(Costar)至平板鋪滿(大約每孔6萬(wàn)細(xì)胞)。棄培液。用PBS洗滌一次，吸去PBS溶液，每孔加入90ul HBS(10mM Hepes，100mM NaCl，PH8.0)，25℃溫育10分鐘，每孔加入10ul HBS反應(yīng)液。實(shí)驗(yàn)組及陽(yáng)性對(duì)照藥加入80ul HBS，10ul不同濃度的實(shí)驗(yàn)用藥及陽(yáng)性對(duì)照藥，及10ul3H標(biāo)記的同位素。25℃溫育20分鐘，用冰浴的PBS溶液洗滌三遍，用裂解液裂解30分鐘，吸取各孔的裂解液加入到1.6ml的閃爍液中，放入液閃計(jì)數(shù)儀(Beckman LS5000TA)中檢測(cè)同位素的含量，以此來(lái)衡量普羅托品對(duì)五羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性。對(duì)于GABA轉(zhuǎn)運(yùn)檢測(cè)，方法類似于多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，50nM3H GABA(Amersham Pharmacia Biotech)取代了反應(yīng)體系中的3H DA或NE或5-HT和維生素C及帕吉林。
結(jié)果顯示了普羅托品只對(duì)5-HTT及NET轉(zhuǎn)基因高表達(dá)細(xì)胞系顯示了較好的藥效，而對(duì)多巴胺及γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白高表達(dá)細(xì)胞系沒有活性，由此說(shuō)明普羅托品具有一定的選擇性和較強(qiáng)的活性。
圖2-5顯示了結(jié)果。
圖2顯示了普羅托品對(duì)高表達(dá)去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白細(xì)胞株的活性作用的抑制作用。在10ug/ml濃度抑制活性同不加藥組(N1)比較顯示較強(qiáng)的抑制作用***P＜0.001。
圖3顯示了普羅托品對(duì)高表達(dá)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白細(xì)胞株的活性同不加藥組D8相比無(wú)顯著性差異，無(wú)抑制活性。圖4顯示了普羅托品對(duì)高表達(dá)γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白細(xì)胞株的活性同不加藥組G1相比無(wú)顯著性差異，無(wú)抑制活性，說(shuō)明普羅托品對(duì)不同細(xì)胞系有選擇性。
圖5顯示了普羅托品的安全性。無(wú)論在10ug/ml還是在1ug/ml的濃度，細(xì)胞存活率在96％以上，同不加藥組無(wú)顯著性差異。說(shuō)明對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性。
實(shí)施例4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率MTT檢測(cè)方法按已有報(bào)道進(jìn)行并略有改進(jìn)(J.Biol.Chem.1999，27426217-24)。在96孔平板中接種細(xì)胞至每孔2000至3000細(xì)胞，培養(yǎng)體積200ul，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，每孔加入相應(yīng)濃度的藥物，不加藥物和不加細(xì)胞的孔作為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。換新的已預(yù)熱的培液，加MTT至終濃度為0.5mg/ml。37℃培養(yǎng)4小時(shí)后棄上清，每孔加入200ulDMSO，37℃溫浴10分鐘，使沉淀溶解。在酶標(biāo)儀上測(cè)570nm下的O.D.值。細(xì)胞存活率計(jì)算公式為存活率＝(加藥組O.D.-不加細(xì)胞組O.D.)×100％/(不加藥對(duì)照組O.D.-不加細(xì)胞組O.D.)。
結(jié)果普羅托品在10ug/ml、1ug/ml對(duì)細(xì)胞的存活率都達(dá)到了96％以上，說(shuō)明普羅托品不會(huì)影響細(xì)胞的存活率，從另一方面也說(shuō)明了普羅托品對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性。圖6顯示了結(jié)果。普羅托品在三個(gè)濃度組里同鹽水組均有顯著性差異***P＜0.001。
實(shí)施例5普羅托品對(duì)5-HTP誘導(dǎo)的甩頭行為的影響。
1概述該模型最早由Corne等在1963年提出(J Pharmacol Exp Ther.247(3)1032-8)。5-HT受體興奮引起的甩頭綜合征可能通過(guò)5-HT2受體介導(dǎo)。小鼠中由5-HTP誘導(dǎo)的甩頭行為對(duì)于具有不同作用機(jī)制的抗抑郁及抗焦慮的藥均比較敏感如西酞普蘭(Citalopram)、氟伏沙明(fluvoxamine)等5-HT重?cái)z取抑制劑，去甲丙咪嗪(desipramine)、麥普替林(maprotiline)、諾米芬辛(nomifensine)等NA重?cái)z取抑制劑及混合作用于5-HT和NA系統(tǒng)的丙咪嗪(imipramine)。
2方法步驟及指標(biāo)選用20-24g雄性balbc/fj小鼠(中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。首先在測(cè)試前3小時(shí)腹腔注射100mg/kg帕吉林。之后腹腔注射受試藥或生理鹽水，30分鐘后再注射5-HTP(5mg/kg，腹膜內(nèi))，10分鐘后開始觀察，記錄6分鐘內(nèi)小鼠甩頭次數(shù)。比較實(shí)驗(yàn)組和生理鹽水對(duì)照組甩頭次數(shù)的差異。
陰性對(duì)照物生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照物氟西汀，劑量為1mg/kg、5mg/kg，試驗(yàn)用藥本發(fā)明的藥物普羅托品給藥劑量分別是5mg/kg，10mg/kg，20mg/kg3.結(jié)果在5-HTP誘導(dǎo)的甩頭行為中，普羅托品能顯著增強(qiáng)小鼠的甩頭次數(shù)，顯示出劑量效應(yīng)關(guān)系，并與生理鹽水組比有顯著性差異(P＜0.01)，10mg/kg的普羅托品產(chǎn)生的藥效與1mg/kg的氟西汀相比有顯著性差異。
圖7顯示了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
實(shí)施例6普羅托品對(duì)行為絕望模型動(dòng)物的作用效果1.概述 盡管70年代已出現(xiàn)了一些較好的抑郁動(dòng)物模型，如獲得性無(wú)助模型、分離模型，但由于花費(fèi)或可行性問(wèn)題，這些模型尚未用于常規(guī)的藥物初篩。藥物篩選迫切需要一些。簡(jiǎn)單、快速、敏感的動(dòng)物模型。在此背景下，Pormlt等1977年分別發(fā)展了大鼠、小鼠強(qiáng)迫游泳模型。在強(qiáng)迫游泳模型中，大鼠和小鼠被迫在一局限的空間游泳，它們首先掙扎試圖逃跑。隨后處于一種不動(dòng)的狀態(tài)，這種狀態(tài)被稱為行為絕望。除了一些5-HT重?cái)z取抑制劑之外，多數(shù)抗抑郁藥在此模型中均能減少動(dòng)物的不動(dòng)時(shí)間，且其藥效與臨床上藥效顯著相關(guān)。而在亞活性劑量理鹽輔助下，5-HT重?cái)z取抑制劑類抗抑郁藥在此模型中也往往有效。繼強(qiáng)迫游泳模型之后，陸續(xù)衍生出了其它一些模型，在這些進(jìn)展中最突出的是小鼠懸尾模型。懸尾小鼠為克服不正常的體位而掙扎活動(dòng)。但活動(dòng)一定時(shí)間后出現(xiàn)間斷性不動(dòng)，顯示”失望”狀態(tài)。有效藥物包括三環(huán)抗抑郁藥、單胺氧化酶抑制劑及非典型抗抑郁藥(包括5-HT重?cái)z抑制劑)。
2小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)選體重20-24克雄性balbc/fj小鼠，將其尾端2cm的部位貼在一水平木棍上，使動(dòng)物成倒掛狀態(tài)，其頭部離臺(tái)面約5cm。懸掛兩側(cè)用板隔開動(dòng)物視線。比較給藥組及對(duì)照組在6分鐘內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間。
陰性對(duì)照物生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照物地昔帕明，劑量為10mg/kg試驗(yàn)用藥本發(fā)明的藥物普羅托品給藥劑量分別是3.75mg/kg，7.5mg/kg，30mg/kg3.結(jié)果在小鼠懸掛實(shí)驗(yàn)中，普羅托品能明顯縮短小鼠因絕望而不動(dòng)的時(shí)間。其降低絕對(duì)不動(dòng)時(shí)間的作用呈明顯的量效關(guān)系且有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，其中以高劑量(30mg/kg)為最好。結(jié)果見表1。
表1 普羅托品對(duì)小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)絕對(duì)不動(dòng)時(shí)間的影響

結(jié)果由均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，樣本數(shù)為10，與鹽水對(duì)照比較*P＜0.05，**P＜0.01。
實(shí)施例7普羅托品對(duì)大鼠營(yíng)養(yǎng)性肥胖的治療預(yù)防作用1.實(shí)驗(yàn)方法斷乳SD大鼠體重50-55g，雌雄各半，每日早晨灌胃給藥，給藥組分大劑量(20mg/kg)小劑量組(8mg/kg)，空白對(duì)照組為生理鹽水，每組10只大鼠。飼料為高脂飼料。第一、第二星期每只每日13g，第三星期14g，第四星期16g，第五星期18g，第六星期20g，每日飼料分兩次供給，吃完不再添加。連續(xù)飼養(yǎng)6星期后觀察各項(xiàng)指標(biāo)。
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，表3。
表2 普羅托品對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

N＝10，與對(duì)照組生理鹽水比較*P＜0.05表3 普羅托品對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠脂類的影響

N＝10，與對(duì)照組生理鹽水比較*P＜0.01從以上結(jié)果表明大鼠服用普羅托品后，它能顯著降低血膽固醇和血三酰甘油的含量，并且大鼠相應(yīng)體重減少20％左右，達(dá)到了減脂的目的。可見，五羥色胺和去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白雙重抑制劑普羅托品具有減肥、調(diào)節(jié)血脂的功效。
權(quán)利要求
1.氮雜癸間五烯基酮類化合物的用途，其特征在于，用于制備治療5-羥色胺和去甲腎上腺素神經(jīng)遞質(zhì)降低所導(dǎo)致的疾病的藥物。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，該疾病選自肥胖、酒精中毒、疼痛、尿失禁、喪失記憶、焦慮或吸煙。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，該藥物是五羥色胺和去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白雙重再攝取抑制劑。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，該藥物是片劑、顆粒劑、針劑、粉劑或膠囊。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述化合物選自普羅托品、紫堇胺、紫堇維定、紫堇文堿、4，6，7，14-四氫-12-甲氧基-5-甲基雙[1，3]-苯二氧合橋[4，5-c5’，6’-g]氮雜癸間五烯基-13(5H)-酮、克利多平、崖椒堿I、崖椒堿II、紅乃馬草堿、4，6，7，13-四氫-9-羥基-10-甲氧基-5-甲苯基[e]-1，3-二氧合橋[4，5-1][2]苯氮雜癸間五烯基-12(5H)-酮、5，7，8，14-四氫-3，4，10，11-四甲氧基-6-甲基二苯基[c，g]氮雜癸間五烯基-13(6H)-酮、N-氧代普羅托品、5，7，8，14-四氫-4-羥基-3，10，11-三甲氧基-6-甲基二苯基[c，g]氮雜癸間五烯基-13(6H)-酮、5，7，8，15-四氫-6-甲基雙[1，3]-苯二氧合橋[5，6-c，5’，6’-g]氮雜癸間五烯基-14(6H)-酮、5，7，8，15-四氫-3-羥基-4-甲氧基-6-甲苯基[e]-1，3-二氧合橋[4，5-k][3]苯氮雜癸間五烯基-14(6H)-酮、5，7，8，14-四氫-10，11-二羥基-3，4-二甲氧基-6-甲基二苯基[c，g]氮雜癸間五烯基-13(6H)-酮、二氫普羅托品、崖椒堿III、1-甲氧基-13-氧代別克利多平、13-氧代克利多平、13-氧代-5，7，8，14-四氫-3，4，10，11-四甲氧基-6-甲基二苯基[c，g]氮雜癸間五烯基-13(6H)-酮、13-氧代普羅托品。
6.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述氮雜癸間五烯基酮類化合物以藥物學(xué)上可接受的鹽形式配制。
7.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的鹽選自鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、三氟醋酸鹽或甲磺酸鹽。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的鹽選自鹽酸鹽和氫溴酸鹽。
9.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的鹽含0.5-3分子的結(jié)晶水。
全文摘要
公開了氮雜癸間五烯基酮類化合物的用途，用于制備治療5－羥色胺和去甲腎上腺素神經(jīng)遞質(zhì)降低所導(dǎo)致的疾病的藥物。
文檔編號(hào)A61P3/00GK1748794SQ20041006632
公開日2006年3月22日 申請(qǐng)日期2004年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月13日
發(fā)明者郭禮和, 徐林峰, 褚文靜, 王雪松, 段書慧, 秦國(guó)偉, 費(fèi)儉 申請(qǐng)人:上海賽達(dá)生物技術(shù)研究中心有限公司