專利名稱：人血清白蛋白與人甲狀旁腺激素(1－34)融合蛋白及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說(shuō)是涉及用DNA重組技術(shù)合成一種人血清白蛋白和人甲狀旁腺激素(hPTH)(1-34)融合蛋白、含有該基因的重組載體、用該載體轉(zhuǎn)化的宿主。
背景技術(shù)：
甲狀旁腺激素(Parathyroid hormone，PTH)是生物體內(nèi)調(diào)節(jié)鈣、磷代謝的一種重要因子。人甲狀旁腺素(hPTH)是由84個(gè)氨基酸組成的多肽激素，分子量為9500，是甲狀旁腺主細(xì)胞分泌的，最初合成產(chǎn)物是115個(gè)的前甲狀旁腺素原preprohPTH在分泌過(guò)程中切除N端的31個(gè)殘基后形成成熟的由84個(gè)氨基酸組成直鏈多肽激素。早在70年代末Tregear等就證明了hPTH發(fā)揮鈣磷調(diào)節(jié)作用僅需N端的34個(gè)氨基酸殘基。即只需要氨基端1-34肽就已具有完整的生物學(xué)功能，目前研究應(yīng)用最多的是人hPTH氨基端1-34片段(human PTH1-34，hPTH(1-34))，它被認(rèn)為是hPTH在體內(nèi)的自然分解產(chǎn)物，同時(shí)在檢測(cè)中保留了自然hPTH所有可測(cè)的生物活性。理想的治療骨質(zhì)疏松的藥物應(yīng)同時(shí)具有抗骨重吸收和促骨形成雙重作用，hPTH正是同時(shí)具有這兩種活性的多肽分子。通過(guò)受體介導(dǎo)，hPTH能夠激活腺苷酸環(huán)化酶、蛋白激酶A、蛋白激酶C、磷脂酶C等產(chǎn)生cAMP、IP3、Ca2+和二?；视偷劝麅?nèi)二級(jí)信使。[1]大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí)hPTH(1-34)對(duì)預(yù)防和治療婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松療效喜人，能顯著降低脊椎骨和非脊椎骨骨折風(fēng)險(xiǎn)。[2]目前hPTH(1-34)注射劑已經(jīng)在美國(guó)上市。由于hPTH(1-34)分子量較小，體內(nèi)的吸收消除速度比較快。肌肉注射半衰期為1小時(shí)，靜脈注射半衰期只有5min，在血漿中30min即達(dá)到血濃峰值。目前已有的hPTH(1-34)制劑價(jià)格昂貴，需要每天皮下注射給藥，限制了其長(zhǎng)期應(yīng)用。因此開(kāi)發(fā)經(jīng)濟(jì)、方便的hPTH(1-34)制劑十分必要。
人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是血漿的重要成分，也是許多內(nèi)源因子和外源藥物的載體，正常情況下不易透過(guò)腎小球。它是由585個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，其分子量約為66.5KD，在血漿中的半衰期較長(zhǎng)，長(zhǎng)達(dá)2周體內(nèi)分布極廣而且沒(méi)有酶學(xué)和免疫學(xué)活性，因而是一種理想的生物活性蛋白載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種集血清白蛋白與hPTH(1-34)的特性為一體的人血清白蛋白與人甲狀旁腺激素(hPTH)(1-34)的融合蛋白，SEQ ID NO1為該融合蛋白的蛋白質(zhì)序列和基因序列。
本發(fā)明的人血清白蛋白和人甲狀旁腺素(1-34)融合蛋白，包含與人血清白蛋白至少85％序列同源的第一區(qū)和與hPTH(1-34)至少85％序列同源的第二區(qū)。
其中優(yōu)選的是包括與人血清白蛋白至少95％序列同源的第一區(qū)和與hPTH(1-34)至少95％序列同源的第二區(qū)。
最優(yōu)選的是包括與人血清白蛋白氨基酸殘基序列相同的第一區(qū)和與hPTH(1-34)氨基酸殘基序列相同的第二區(qū)，或上述二區(qū)的功能等同物。
所述的功能等同物是在不改變所述融合蛋白特性的前提下，對(duì)融合蛋白個(gè)別的氨基酸殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。
在本發(fā)明的融合蛋白中，是與人血清白蛋白同源的第一區(qū)位于融合蛋白的N-末端，所述與hPTH(1-34)序列同源的第二區(qū)位于融合蛋白的C-末端。
本發(fā)明提供的融合蛋白，包括與人血清白蛋白氨基酸殘基序列相同的第一區(qū)和與hPTH(1-34)氨基酸殘基序列相同的第二區(qū)的融合蛋白的蛋白質(zhì)序列，中間設(shè)有Gly Gly Gly Gly Ser連接肽。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供攜帶編碼本發(fā)明的融合蛋白的編碼基因序列的重組表達(dá)載體，包括pPIC9-HSA-hPTH(1-34)，pPIC9K-HSA-hPTH(1-34)。
SEQ ID NO1為融合蛋白的基因和蛋白質(zhì)序列g(shù)at gca cac aag agt gag gtt gct cat cgg ttt aaa gat ttg gga gaa 48Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu1 5 10 15gaa aat ttc aaa gcc ttg gtg ttg att gcc ttt gct cag tat ctt cag 96Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln20 25 30cag tgt cca ttt gaa gat cat gta aaa tta gtg aat gaa gta act gaa 144Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu35 40 45ttt gca aaa aca tgt gtt gct gat gag tca gct gaa aat tgt gac aaa 192Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys50 55 60tca ctt cat acc ctt ttt gga gac aaa tta tgc aca gtt gca act ctt 240Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80cgt gaa acc tat ggt gaa atg gct gac tgc tgt gca aaa caa gaa cct 288Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro85 90 95gag aga aat gaa tgc ttc ttg caa cac aaa gat gac aac cca aac ctc 336Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu100 105 110ccc cga ttg gtg aga cca gag gtt gat gtg atg tgc act gct ttt cat 384Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His115 120 125gac aat gaa gag aca ttt ttg aaa aaa tac tta tat gaa att gcc aga 432Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg130 135 140aga cat cct tac ttt tat gcc ccg gaa ctc ctt ttc ttt gct aaa agg 480Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg145 150 155 160tat aaa gct gct ttt aca gaa tgt tgc caa gct gct gat aaa gct gcc 528Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala165 170 175tgc ctg ttg cca aag ctc gat gaa ctt cgg gat gaa ggg aag gct tcg 576Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser180 185 190tct gcc aaa cag aga ctc aag tgt gcc agt ctc caa aaa ttt gga gaa 624Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu195 200 205aga gct ttc aaa gca tgg gca gta gct cgc ctg agc cag aga ttt ccc 672Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro210 215 220aaa gct gag ttt gca gaa gtt tcc aag tta gtg aca gat ctt acc aaa 720Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys225 230 235 240gtc cac acg gaa tgc tgc cat gga gat ctg ctt gaa tgt gct gat gac 768Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp245 250 255agg gcg gac ctt gcc aag tat atc tgt gaa aat caa gat tcg atc tcc 816Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser260 265 270agt aaa ctg aag gaa tgc tgt gaa aaa cct ctg ttg gaa aaa tcc cac 864Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His275 280 285tgc att gcc gaa gtg gaa aat gat gag atg cct gct gac ttg cct tca 912Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser290 295 300tta gct gct gat ttt gtt gaa agt aag gat gtt tgc aaa aac tat gct 960Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala305 310 315 320
gag gca aag gat gtc ttc ctg ggc atg ttt ttg tat gaa tat gca aga 1008Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg325 330 335agg cat cct gat tac tct gtc gtg ctg ctg ctg aga ctt gcc aag aca 1056Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr340 345 350tat gaa acc act cta gag aag tgc tgt gcc gct gca gat cct cat gaa 1104Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu355 360 365tgc tat gcc aaa gtg ttc gat gaa ttt aaa cct ctt gtg gaa gag cct 1152Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro370 375 380cag aat tta atc aaa caa aat tgt gag ctt ttt gag cag ctt gga gag 1200Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu385 390 395 400tac aaa ttc cag aat gcg cta tta gtt cgt tac acc aag aaa gta ccc 1248Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro405 410 415caa gtg tca act cca act ctt gta gag gtc tca aga aac cta gga aaa 1296Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys420 425 430gtg ggc agc aaa tgt tgt aaa cat cct gaa gca aaa aga atg ccc tgt 1344Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys435 440 445gca gaa gac tat cta tcc gtg gtc ctg aac cag tta tgt gtg ttg cat 1392Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His450 455 460gag aaa acg cca gta agt gac aga gtc acc aaa tgc tgc aca gaa tcc 1440Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser465 470 475 480ttg gtg aac agg cga cca tgc ttt tca gct ctg gaa gtc gat gaa aca 1488Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys485 490 495tac gtt ccc aaa gag ttt aat gct gaa aca ttc acc ttc cat gca gat 1536Leu Val Asn Arg Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp500 505 510ata tgc aca ctt tct gag aag gag aga caa atc aag aaa caa act gca 1584Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala515 520 525ctt gtt gag ctc gtg aaa cac aag ccc aag gca aca aaa gag caa ctg 1632Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu530 535 540aaa gct gtt atg gat gat ttc gca gct ttt gta gag aag tgc tgc aag 1680Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys545 550 555 560
gct gac gat aag gag acc tgc ttt gcc gag gag ggt aaa aaa ctt gtt 1728Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val565 570 575gct gca agt caa gct gcc tta ggc tta gga tcc ggt ggt ggt ggt agt 1776Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser580 585 590tct gtt tct gaa atc cag ctg atg cac aac ctt ggt aaa cac ctg aac 1824Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Glu Lys His Leu Asn595 600 605tcc atg gaa cgt gtt gaa tgg ctg cgt aag aaa ctg cag gat gtc cat 1872Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His610 615 620aac ttcAsn Phe本發(fā)明的宿主可以是被重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，含有本發(fā)明融合蛋白編碼基因的細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞其中優(yōu)選的是酵母，更優(yōu)選的畢赤酵母。
編碼HSA多聚核苷酸和編碼hPTH(1-34)的多聚核苷酸可以用本領(lǐng)域周知的方法，如PCR、RT-PCR方法、人工合成的方法和構(gòu)建篩選cDNA文庫(kù)的方法等獲得。用作PCR模板和用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)的mRNA或cDNA可以來(lái)源于任何含有相應(yīng)mRNA或cDNA的組織、細(xì)胞、及文庫(kù)等。人工合成時(shí)可以選用宿主偏愛(ài)的密碼子，這樣可以提高產(chǎn)物的表達(dá)。若需要可用本領(lǐng)域公知的方法對(duì)多聚核苷酸進(jìn)行突變、缺失、插入、和其他多聚核苷酸連接。編碼HSA和編碼hPTH(1-34)多聚核苷酸的融合，在保持各自閱讀框架不變的前提下，可用如PCR方法，在編碼序列的兩側(cè)引入限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，通過(guò)酶切產(chǎn)生粘性末端用DNA連接酶連接后從而獲得編碼融合蛋白的基因。
許多表達(dá)載體和其對(duì)應(yīng)的宿主可以購(gòu)買商品化的如酵母表達(dá)載體pPIC9，pPIC9K，pPICZα等分泌型載體。這些質(zhì)粒為酵母整合型質(zhì)粒，帶有組氨酸缺陷型選擇性標(biāo)記。醇氧化酶操縱子(AOX1)5’序列和3’序列，用于方便編碼基因整合至酵母基因組，和控制編碼基因的表達(dá)。
表達(dá)融合蛋白的宿主可以是酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌、動(dòng)物、植物等。融合蛋白或多肽可以存在于宿主細(xì)胞內(nèi)，也可以是從宿主中分泌出來(lái)的，優(yōu)選的是從宿主中分泌出來(lái)的。分泌所用的信號(hào)肽優(yōu)選的是天然的人血清白蛋白的信號(hào)肽或釀酒酵母α-交配因子信號(hào)肽，或這兩種信號(hào)肽的類似物。用這兩種信號(hào)肽融合蛋白表達(dá)水平較高。也可以不用信號(hào)肽在酵母中以胞內(nèi)可溶形式表達(dá)。編碼融合蛋白的核酸，可以插入至宿主染色體，或以游離質(zhì)粒形式存在。
轉(zhuǎn)化所需要核酸至宿主細(xì)胞中可用電穿孔或化學(xué)法制作的酵母感受態(tài)細(xì)胞。成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的細(xì)胞，可以通過(guò)提取基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，或者，細(xì)胞培養(yǎng)上清中或細(xì)胞破碎液中蛋白可用抗HSA或hPTH(1-34)的抗體檢測(cè)。
可以通過(guò)培養(yǎng)本發(fā)明DNA構(gòu)建的宿主，如重組酵母、重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞、重組細(xì)菌、轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物等，生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白。具體的培養(yǎng)方法，可以用搖瓶或生物反應(yīng)器等，優(yōu)選的是生物反應(yīng)器。
可以用各種蛋白分離的方法自含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離、純化融合蛋白。如鹽析、沉淀、超濾、液相層析等技術(shù)及其組合，液相層析可以用凝膠排阻、親和、離子交換、疏水、反相等層析技術(shù)。
通過(guò)基因工程技術(shù)改造了hPTH(1-34)多肽分子，使其在不喪失受激活受體和刺激骨重建的功能的情況下，血漿中的半衰期將會(huì)得到顯著地延長(zhǎng)。[3]這樣HSA-hPTH(1-34)就會(huì)降低了給藥頻率和劑量，卻發(fā)揮出與hPTH(1-34)相似的藥效作用。重組表達(dá)HSA作為載體蛋白還避免血源中純化可能帶來(lái)的病毒污染。
本發(fā)明另一個(gè)目的是在制備治療骨質(zhì)疏松癥藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明將血清白蛋白，或其至少85％序列同源的類似物或片段與hPTH(1-34)或其至少85％序列同源的類似物或片段融合，所形成的融合蛋白不僅保留了hPTH(1-34)激活受體和刺激骨重建的功能的作用，而且在血漿中的半衰期將會(huì)得到顯著地延長(zhǎng)。HSA-hPTH(1-34)融合蛋白將是一種很有前景的能夠治療骨質(zhì)疏松癥的藥用蛋白質(zhì)。
人血清白蛋白天然存在多態(tài)性，本發(fā)明融合蛋白中的人血清白蛋白部分也包括這種多態(tài)性。
本發(fā)明提供的融合蛋白適用于畢赤酵母菌中表達(dá)，構(gòu)建的載體整合至畢赤酵母菌的基因組中，十分穩(wěn)定，不易丟失。而且醇氧化酶可調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子，能高密度發(fā)酵，重組蛋白表達(dá)高。同時(shí)，高效分泌表達(dá)質(zhì)粒能將外源蛋白表達(dá)后進(jìn)行翻譯后加工處理，將外源蛋白分泌到細(xì)胞外，不但提高表達(dá)蛋白的活性，而且非常有利于重組蛋白的純化。純化步驟簡(jiǎn)潔高效，終產(chǎn)品內(nèi)毒素含量低，有利于臨床使用。
通過(guò)基因工程技術(shù)改造了hPTH(1-34)多肽分子，使其在不喪失受激活受體和刺激骨重建的功能的情況下，血漿中的半衰期將會(huì)得到顯著地延長(zhǎng)。這樣HSA-hPTH(1-34)就會(huì)降低給藥頻率和劑量卻發(fā)揮出與hPTH(1-34)相似的藥效作用。重組表達(dá)HSA作為載體蛋白還避免血源中純化可能帶來(lái)的病毒污染。
該套表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于設(shè)計(jì)的融合基因適用于畢赤酵母菌中表達(dá)，構(gòu)建的載體整合至畢赤酵母菌的基因組中，十分穩(wěn)定，不易丟失。而且醇氧化酶可調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子，能高密度發(fā)酵，重組蛋白表達(dá)量高。同時(shí)，高效分泌表達(dá)質(zhì)粒能將外源蛋白表達(dá)后進(jìn)行翻譯后加工處理，將外源蛋白分泌到細(xì)胞外，不但提高表達(dá)蛋白的活性，而且非常有利于重組蛋白的純化。純化步驟簡(jiǎn)潔高效，終產(chǎn)品內(nèi)毒素含量低，有利于臨床使用。
因此，本發(fā)明用于由遺傳工程酵母巴斯德畢赤酵母分泌生產(chǎn)HSA-hPTH(1-34)的方法簡(jiǎn)單、有效，并且容易放大進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明并不局限于本文所說(shuō)明和披露的各部分的特定結(jié)構(gòu)和排列順序，而且包括可以從權(quán)利要求書(shū)范圍中得出的它的改進(jìn)形式。


圖1為合成的hPTH(1-34)基因測(cè)序圖；圖2為pPIC9-HSA-hPTH(1-34)質(zhì)粒的構(gòu)建圖；圖3為pPIC9-HSA-hPTH(1-34)質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖；圖4為pGEMT-HSA質(zhì)粒雙酶切和hPTH(1-34)的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析；圖5為對(duì)重組菌酵母pPIC9-HSA-hPTH(1-34)基因組PCR結(jié)果；圖6為重組菌不同誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間取樣蛋白質(zhì)電泳結(jié)果；圖7為純化后的融合蛋白HSA-hPTH(1-34)的SDS-PAGE分析；圖8為融合蛋白PVDF膜免疫印跡分析；圖9為融合蛋白對(duì)兔腎皮質(zhì)細(xì)胞的刺激活性分析；圖10為HSA-hPTH(1-34)血藥濃度—時(shí)間曲線示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。通過(guò)下列實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)特征做詳細(xì)的描述，但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1 生產(chǎn)HSA與hPTH(1-34)融合蛋白酵母工程菌的構(gòu)建一材料和方法(一)實(shí)驗(yàn)材料酵母菌Pichia Pastoris GS115(his4 Mut+)，表達(dá)質(zhì)粒pPIC9為Invitrogen公司的產(chǎn)品?？寺≥d體pGEM-T為Promega公司的產(chǎn)品。
TRIzol試劑、TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司代為合成，測(cè)序服務(wù)由上海聯(lián)合基因生物技術(shù)服務(wù)公司完成。
酵母培養(yǎng)基YPD、BMGY、BMMY、RDB、MM、MD成分均同Invitrogen畢赤酵母實(shí)驗(yàn)手冊(cè)。羊抗人血清白蛋白多抗為Beckman公司的產(chǎn)品，羊抗人hPTH(1-34)多抗為美國(guó)DSL公司的產(chǎn)品。cAMP酶免試劑盒購(gòu)置于上海晶美公司。
(二)實(shí)驗(yàn)方法1.HSA cDNA的克隆構(gòu)建提取人肝組織的mRNA，取1mg左右加TRIzol試劑1ml，勻漿30s。4℃(≤12000g)離心10min，取上清。加入0.2ml氯仿，蓋緊離心管蓋，手搖劇烈振蕩15秒，然后冰浴放置15分鐘，于4℃離心(≤12000g)15分鐘，RNA存在于上層水相中。轉(zhuǎn)移水相至另一個(gè)干凈離心管中，加異丙醇0.5ml，混勻，室溫放置10分鐘以沉淀RNA，然后于4℃離心(≤12000g)10分鐘。移去上清液，加75％乙醇1ml洗滌沉淀，經(jīng)旋渦振蕩，于4℃離心(≤7500g)5分鐘，回收RNA沉淀。移去上清液，將離心管置空氣中干燥，揮去乙醇，沉淀用50μl無(wú)核糖核酸酶(RNase)的水(焦碳酸二乙酯處理)溶解，65℃放置15分鐘使變性，立即置冰上備用或凍于-70℃冰箱中保存。肝組織總RNA2μl，水4μl，隨機(jī)引物4μl，總體積20μl振蕩混勻。
按照GENEBANK中的人血清白蛋白成熟肽序列合成引物，上下游引物分別引入EcoRI和BamHI位點(diǎn)和保護(hù)堿基。
上游引物序列5’ATGCGAATTCGATGCACACAAGAGTGAGGTT 3’下游引物序列5’ATGC GGATCCTAAGCCTAAGGCAGCTTGACT 3’聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)條件為100μl反應(yīng)體系中，加入1.5μl肝組織cDNA，20μmol/L的上下游引物各1.5μl，10mmol/L的dNTP1μl，10×反應(yīng)緩沖液10μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，剩余用ddH2O補(bǔ)足。用EPPENDORF公司的(型號(hào)為Matstercycler Gradient)PCR儀，PCR條件為94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性40秒；54℃退火45秒；72℃延伸2分鐘，共33個(gè)循環(huán)以后，再72℃延伸10分鐘。通過(guò)0.8％凝膠電泳分析得到預(yù)期為1.8kb的條帶。PCR產(chǎn)物電泳純化用DNA片段回收試劑盒回收純化目的條帶。取純化的HSA cDNA 3μl，加入1μl pGEM-T載體，5μl 2×反應(yīng)緩沖液，1μl T4 DNA連接酶，16℃反應(yīng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)化新鮮制作的DH5α感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化菌鋪于x-gal、IPTG和氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落，接種至5mL含50μg/ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，用小量質(zhì)粒提取試劑盒，用EcoRI和BamHI雙酶切后進(jìn)行電泳鑒定，參見(jiàn)圖4，其中泳道1顯示的是pGEMT-HSA質(zhì)粒經(jīng)過(guò)EcoRI和BamHI雙酶切的產(chǎn)物，泳道2顯示的是用引物PTH-up和PTH-down進(jìn)行hPTH(1-34)的PCR產(chǎn)物。用pGEM-T通用引物對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，走了一次walking后完成HSA cDNA全長(zhǎng)測(cè)序，經(jīng)過(guò)DNASTAR軟件與genebank中NM 000477序列進(jìn)行比對(duì)后，證明已獲得序列完全正確的血清白蛋白cDNA的克隆。
2.含有連接肽的hPTH(1-34)cDNA的克隆根據(jù)hPTH(1-34)氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，[4]設(shè)計(jì)hPTH(1-34)全長(zhǎng)基因，并在其中設(shè)計(jì)一個(gè)PstI內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，以備下面的步驟中篩選克隆。參見(jiàn)SEQ ID NO2，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成含有hPTH(1-34)全長(zhǎng)序列基因gga tcc ggt ggt ggt ggt agt tct gtt tct gaa atc cag ctg atg cac 48Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met Hisaac ctt ggt aaa cac ctg aac tcc atg gaa cgt gtt gaa tgg ctg cgt 96Asn Leu Glu Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Argaag aaa ctg cag gat gtc cat aac ttc tag 126Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe Ter測(cè)序結(jié)果顯示正確，參見(jiàn)圖1。
設(shè)計(jì)含有編碼連接肽Gly Gly Gly Gly Ser基因的引物，并且在上下游引物引入BamHI和NotI酶切和保護(hù)堿基。上游引物序列5‘GCGCGGATCCGGTGGTGGTGGTAGTTCTGTTTCTGAAATCCAGCTG 3’下游引物序列5‘GCGCGCGGCCGCTTAGAAGTTATGGACATCCTGCAG 3’PCR條件為100μl反應(yīng)體系中，加入1.5μl合成的cDNA，20μmol/L的上下游引物各1.5μl，10mmol/L的dNTP 0.5μl，10×反應(yīng)緩沖液10μl，TaqDNA聚合酶0.5μl，剩余用ddH2O補(bǔ)足。用EPPENDORF公司的(型號(hào)為Matstercycler Gradient)PCR儀，PCR條件為94℃預(yù)變性3分鐘；94℃變性30秒；58℃退火45秒；72℃延伸2分鐘，共33個(gè)循環(huán)以后，再72℃延伸10分鐘。通過(guò)1.0％凝膠電泳分析得到預(yù)期為約150bp的條帶，參見(jiàn)圖4的泳道2。
PCR產(chǎn)物電泳純化用DNA片段回收試劑盒回收純化目的條帶。純化后的hPTH(1-34)cDNA用BamHI和NotI過(guò)夜酶切后，再進(jìn)行膠回收純化。-20℃凍存?zhèn)溆靡院虷SA片段及酵母表達(dá)載體pPIC9相連。
實(shí)施例2 pPIC9-HSA-hPTH(1-34)重組酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建為了將HSA與hPTH(1-34)以融合蛋白的形式從畢赤酵母分泌表達(dá)，參見(jiàn)圖2，選擇pPIC9質(zhì)粒作為載體，在該載體的醇氧化酶AOX啟動(dòng)子下游的EcoRI和NotI位點(diǎn)插入融合蛋白的基因。將載體pPIC9用EcoRI和NotI進(jìn)行過(guò)夜雙酶切后，膠回收備用。將前述的pGEM-HSA質(zhì)粒用EcoRI和BamHI雙酶切，回收約1.8kb的片段。將酶切后線性化的pPIC9載體與含有HSA cDNA、hPTH(1-34)cDNA片段按照合適的摩爾比放入連接體系中，用T4連接酶催化，16℃反應(yīng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)化新鮮制作的DH5α感受態(tài)細(xì)胞，鋪于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上挑取陽(yáng)性克隆。用PstI酶切進(jìn)行鑒定后，參見(jiàn)圖3(泳道1DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2pPIC9經(jīng)PstI酶切后，泳道3-4pPIC9-HSA-hPTH(1-34)經(jīng)PstI酶切后)，送上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行測(cè)序，用pPIC9載體的3′AOX1測(cè)序引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果證實(shí)含有連接肽的hPTH(1-34)基因正確無(wú)誤并和載體及HSA基因順利連接。
實(shí)施例3 HSA與hPTH(1-34)融合基因其他類型酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建基于其他不同酵母表達(dá)載體如pPIC9，pPIC9K，pPICZα，pHIL-S1，pPIC6α，pGAPZα等酵母分泌型載體及其他pPIC3.5K，pPAO815，pPICZ，pHIL-D2，pPIC6，pGAPZ等酵母胞內(nèi)表達(dá)載體的酶切位點(diǎn)，對(duì)HSA-hPTH(1-34)的融合基因進(jìn)行5’和(或)3’端的改造，運(yùn)用分子生物學(xué)的常規(guī)手段如PCR，補(bǔ)平末端，平末端連接等，以插入表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)。構(gòu)建工作按連接，轉(zhuǎn)化，酶切鑒定，測(cè)序步驟均同實(shí)施例2。
實(shí)施例4 pPIC9-HSA-hPTH(1-34)重組酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115細(xì)胞、篩選及表達(dá)電擊轉(zhuǎn)化及克隆篩選方法參照Invitrogen畢赤酵母實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，其中宿主細(xì)胞采用畢赤酵母GS115菌株。根據(jù)目的基因和載體選擇合適的線性化位點(diǎn)，最后我們選用了StuI進(jìn)行酶切，回收含有融合蛋白基因的表達(dá)盒片段，此回收的表達(dá)盒片段用于電擊轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的GS115，鋪于含有山梨醇RDB瓊脂平板，30℃培養(yǎng)1-2天，挑取His+克隆。接種至裝有25mlBMGY培養(yǎng)基250ml錐形瓶，250轉(zhuǎn)/分鐘30℃培養(yǎng)48小時(shí)至OD600＝2-6。離心后收集菌體用BMMY培養(yǎng)基使OD600＝1.0左右(約100-200mL)，繼續(xù)30℃培養(yǎng)，加甲醇1％每24小時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)120小時(shí)，每天取樣離心上清進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。畢赤酵母GS115重組細(xì)胞接種3mLYPD，30℃搖床培養(yǎng)到OD600約5-8之間；室溫離心收集菌體于1.5mL離心管中；用滅菌水洗滌一次后再用0.5mL的SCE(1M山梨醇，1mM EDTA，10mM檸檬酸緩沖鹽pH8.5)溶液懸浮菌體，并添加40μL濃度為5mg/mL的溶細(xì)胞酶和10μL巰基乙醇；37μL200r/min振蕩處理1h后離心去上清，沉淀的菌體用0.5mLTris-EDTA(含50mmol/L Tris-HCl，20mmol/L乙二胺四乙酸鈉)重新懸浮并添加50μL10％十二烷基磺酸鈉；65℃處理20min后溶液變得粘稠，此時(shí)加入200μL 5M的醋酸鉀，倒置混勻后放冰上30-60min；然后室溫離心，上清加1mL無(wú)水乙醇，室溫離心10s，倒去上清后倒置揮干DNA沉淀。所得的DNA用300μL的Tris-EDTA重新溶解并加入適量的Rnase A消化。37℃保溫1h降解RNA。最后加入0.5mL的異丙醇，DNA沉淀析出后用滅菌的牙簽挑出并置入新的離心管中，加入100μLTris-EDTA溶解后，用于擴(kuò)增融合基因的表達(dá)盒。用5’AOX1測(cè)序引物和3’AOX1測(cè)序引物對(duì)基因組進(jìn)行PCR操作驗(yàn)證，結(jié)果參見(jiàn)圖5，泳道1-4是用5’、3’AOX1測(cè)序引物對(duì)融合蛋白酵母基因組的PCR結(jié)果，泳道5是用5’、3’AOX1測(cè)序引物對(duì)表達(dá)HSA酵母基因組的PCR結(jié)果。
實(shí)施例5其他生產(chǎn)HSA與hPTH(1-34)融合蛋白重組酵母工程菌的構(gòu)建及篩選不同類型的表達(dá)載體pPIC9，pPIC9K，pPICZα，pHIL-S1，pPIC6α，pGAPZα等分泌型載體及其他pPIC3.5K，pPAO815，pPICZ，pHIL-D2，pPIC6，pGAPZ等胞內(nèi)表達(dá)載體。它們的不同基于表達(dá)啟動(dòng)子，篩選標(biāo)記，分泌信號(hào)肽等特點(diǎn)的不同。因此實(shí)施例3中的插入融合基因的重組表達(dá)質(zhì)粒也攜帶了這些特點(diǎn)，選用與其相應(yīng)的畢赤酵母宿主如GS115，X-33，KM71，KM71H，SMD1168，SMD1168H進(jìn)行下一步的轉(zhuǎn)化構(gòu)建工作?？梢詤⒄誌nvitrogen酵母實(shí)驗(yàn)手冊(cè)按實(shí)施例4中進(jìn)行相同或相似的構(gòu)建和篩選。
實(shí)施例6HSA與hPTH(1-34)融合蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)和純化以實(shí)施例4中構(gòu)建的表達(dá)融合蛋白的工程酵母和融合蛋白純化為例，其他的實(shí)施例5中工程酵母菌的發(fā)酵和融合蛋白的純化可用相同的或類似的方法。
將重組酵母菌接種于25mL YPB培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)生長(zhǎng)。將含57.8g(NH4)2SO4，46.6g KCl，30.8g MgSO4·7H2O，8.6g CaSO4·2H2O和2.0g的NaCl的2.5升溶液加入發(fā)酵罐中，高壓滅菌。冷卻至29℃，加入350mL 50％葡萄糖，210mL 30％六甲基磷酸酯鈉溶液和250mL 10倍濃度的微量元素溶液。10倍濃度的微量元素濃度為每升含27.8g FeSO4·7H2O，0.5g CuSO4·5H2O，1.09gZnCl2，1.35g MnSO4·2H2O，0.48g CoCl2·6H2O，0.24g Na2MoO4·2H2O，0.5gH3BO3，0.08g KI，5mg生物素，0.5g的維生素B1，2.5mL的硫酸，用10％的NH4OH和10％H3PO4將發(fā)酵液pH調(diào)成5.0，調(diào)節(jié)無(wú)菌壓縮空氣，流程為50升/分，轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速為300rpm；調(diào)節(jié)溶氧至30％，攪拌速度300-800rpm，攪拌速度大于800rpm時(shí)，將自動(dòng)供應(yīng)純氧。培養(yǎng)24-36h以后，以60mL/h速度補(bǔ)加補(bǔ)加液(補(bǔ)加液由50％葡萄糖，300mM(NH4)2SO4和1倍濃度的微量元素組成)，此階段共培養(yǎng)24小時(shí)；以20mL/h速度加入50％葡萄糖，以25mL/h速度加入純甲醇，此階段為誘導(dǎo)AOX1啟動(dòng)子啟動(dòng)，進(jìn)行融合蛋白合成，收集不同誘導(dǎo)時(shí)間的培養(yǎng)基待檢測(cè)。
取誘導(dǎo)培養(yǎng)的24h、48h、72h、120h培養(yǎng)液樣品，離心上清，12％聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，結(jié)果參見(jiàn)圖6，其中自右向左是誘導(dǎo)120h，72h，48h，24h培養(yǎng)液上清。發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)的融合蛋白在培養(yǎng)上清中的百分含量大于50％，經(jīng)Lowery(Folin-酚試劑法)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度約為2g/L。50mL培養(yǎng)液中離心取上清加入硫酸銨至85％的飽和度，混勻后4℃靜置過(guò)夜，12000r/min、4℃離心20min，沉淀用去離子H2O溶解。過(guò)脫鹽柱。用Amersham的HiPrep Desalting柱，流動(dòng)相為20mM Na3PO4，0.15M NaCl pH7.0，流速為15mL/min，紫外檢測(cè)收集第一個(gè)峰為純化的融合蛋白，SDS-PAGE分析顯示均一條帶，分子量大約在71KD。結(jié)果參見(jiàn)圖7，右邊顯示的是純化后的融合蛋白。
實(shí)施例7HSA-hPTH(1-34)活性測(cè)定1.融合蛋白的免疫學(xué)活性測(cè)定通過(guò)測(cè)定HSA免疫比濁法對(duì)融合蛋白進(jìn)行測(cè)定?？乖贵w反應(yīng)中形成免疫復(fù)合物，懸浮在緩沖液中使散射光信號(hào)發(fā)生變化，通過(guò)測(cè)定信號(hào)增長(zhǎng)的速率測(cè)定血清白蛋白的抗原濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明表達(dá)融合蛋白具有HSA的抗原性。
對(duì)hPTH(1-34)免疫學(xué)活性的檢測(cè)通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡(western blot)方法進(jìn)行檢測(cè)。用羊抗hPTH(1-34)抗體做一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗羊的IgG作為二抗，二氨基聯(lián)苯胺做顯色底物，檢測(cè)融合蛋白的hPTH(1-34)免疫活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明表達(dá)融合蛋白具有hPTH(1-34)的抗原性。顯色結(jié)果參見(jiàn)圖8。
2.HSA-hPTH(1-34)融合蛋白的生物學(xué)活性測(cè)定HSA-hPTH(1-34)的活性是通過(guò)檢測(cè)由于腺苷酸環(huán)化酶的活化而產(chǎn)生的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的量來(lái)衡量的。為此，從兔的腎組織中分離純化了腎皮質(zhì)細(xì)胞。[5]采用化學(xué)合成的hPTH(1-34)肽作為測(cè)活的對(duì)照品。結(jié)果參見(jiàn)圖9，實(shí)線是合成的hPTH(1-34)對(duì)兔腎皮質(zhì)細(xì)胞刺激的濃度效應(yīng)曲線，虛線HSA-hPTH(1-34)對(duì)兔腎皮質(zhì)細(xì)胞刺激的濃度效應(yīng)曲線。
實(shí)施例8HSA-hPTH(1-34)體內(nèi)半衰期初步研究取相同活性劑量的HSA-hPTH(1-34)融合蛋白和hPTH(1-34)標(biāo)準(zhǔn)品小鼠尾靜脈給藥，取不同時(shí)間取鼠尾靜脈給藥，不同時(shí)間取血清用抗hPTH(1-34)酶免試劑盒檢測(cè)其中的hPTH(1-34)的濃度。融合蛋白在小鼠血漿中的代謝速度明顯比hPTH(1-34)慢。注射后10分鐘，兩者在血漿中的活性相差不大，而1小時(shí)后，hPTH(1-34)的濃度下降了近十倍，而融合蛋白的血漿中濃度繼續(xù)上升；20小時(shí)后，注射融合蛋白的小鼠仍能測(cè)到hPTH(1-34)。結(jié)果參見(jiàn)圖10，融合蛋白在小鼠血漿中的半衰期明顯延長(zhǎng)。可作為原料，在制備治療骨質(zhì)疏松癥的長(zhǎng)效藥物中應(yīng)用。
無(wú)需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所公開(kāi)的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此，前面的實(shí)施方案應(yīng)理解為僅是舉例說(shuō)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明涉及的部分參考文獻(xiàn)[1]Takasu H.，Gardella T.J.，Luck M.D.，Biochemistry.1999，3813453[2]Brommage R.，Hotchkiss C.E.，Lees C.J.，etal..J.Clin.Endocrinol.Metab.1999，843757[3]Blaire L.O.，Les S.，Marta C.，Carol P.，etal..Eur.J.Pharmacol.2002，456149[4]Hendy GN.，Kronenberg H.M.，Potts J.T.，etal.Proc.Natl.Acad.Sci.1981，787365[5]Mohr，H.，Hesch，R.D.Biochem.J.1980，188649
權(quán)利要求
1.人血清白蛋白和人甲狀旁腺素(1-34)融合蛋白，SEQ ID NO1為該融合蛋白的基因和蛋白質(zhì)序列，該融合蛋白包含與人血清白蛋白至少85％序列同源的第一區(qū)和與人甲狀旁腺素(1-34)至少85％序列同源的第二區(qū)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血清白蛋白和人甲狀旁腺素(1-34)融合蛋白，其特征是所述的融合蛋白包含與人血清白蛋白至少95％序列同源的第一區(qū)和與人甲狀旁腺素(1-34)至少95％序列同源的第二區(qū)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的人血清白蛋白和人甲狀旁腺素(1-34)融合蛋白，其特征是所述的融合蛋白包含與人血清白蛋白氨基酸殘基序列相同的第一區(qū)和與人甲狀旁腺素(1-34)氨基酸殘基序列相同的第二區(qū)，或上述二區(qū)的功能等同物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人血清白蛋白和人甲狀旁腺素(1-34)融合蛋白，其特征是所述的功能等同物是在不改變所述的融合蛋白特性的前提下，對(duì)融合蛋白的個(gè)別氨基酸的殘基的取代，缺失或加入得到的多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的人血清白蛋白和人甲狀旁腺素(1-34)融合蛋白，其特征是所述與人血清白蛋白同源的第一區(qū)位于融合蛋白的N-末端，所述與人甲狀旁腺素(1-34)序列同源的第二區(qū)位于融合蛋白的C端。
6.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的人血清白蛋白和人甲狀旁腺素(1-34)融合蛋白，其特征在于所述與人甲狀旁腺素(1-34)序列同源的第二區(qū)位于融合蛋白的N-末端，所述與人血清白蛋白同源的第一區(qū)位于融合蛋白C端。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)所述的人血清白蛋白與人甲狀旁腺素(1-34)融合蛋白，其特征是所述與人血清白蛋白同源的第一區(qū)與人甲狀旁腺素(1-34)序列同源的第二區(qū)之間設(shè)有連接肽，連接肽為Gly Gly Gly Gly Ser。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血清白蛋白和人甲狀旁腺素(1-34)融合蛋白，其特征是提供攜帶編碼融合蛋白的基因序列的重組表達(dá)載體，pPIC9-HAS-hPTH，pPIC9K-HAS-hPTH。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血清白蛋白和人甲狀旁腺素(1-34)融合蛋白，其特征是表達(dá)融合蛋白的宿主優(yōu)選是酵母，尤其是畢赤酵母。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的人血清白蛋白和人甲狀旁腺素(1-34)融合蛋白，在制備治療骨質(zhì)疏松癥藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種血清白蛋白和人甲狀旁腺素(1－34)融合蛋白，編碼融合蛋白的DNA序列，攜帶該基因序列的細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞。本發(fā)明的融合蛋白包含與人血清白蛋白至少85％序列同源的第一區(qū)和與hPTH(1－34)至少85％序列同源的第二區(qū)，該融合蛋白可以在不改變?nèi)诤系鞍椎奶匦缘那疤嵯拢M(jìn)行個(gè)別氨基酸的殘基的取代，缺失或加入；本發(fā)明融合蛋白的第一區(qū)和第二區(qū)之間設(shè)有連接肽；本發(fā)明的融合蛋白不僅保留了hPTH(1－34)激活受體和刺激骨重建的功能的作用，而且顯著延長(zhǎng)在體內(nèi)的半衰期，是一種很有前景的能夠治療骨質(zhì)疏松癥的藥用蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)A61K38/29GK1597965SQ200410066459
公開(kāi)日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2004年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月14日
發(fā)明者陳樞青, 陳靜 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)