專利名稱：一種與人血清白蛋白結(jié)合的七肽與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種與人血清白蛋白結(jié)合的七肽與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
藥物肽通常通過作用于特異性受體，以特定的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮其特定的生 物學(xué)功能，但許多藥物肽因含有特定氨基酸組成或其分子量小，通過自身的代謝和腎的濾 過作用，在生物體內(nèi)被迅速降解或清除而喪失生理活性。提高肽類等分子藥物的穩(wěn)定性、 延長(zhǎng)其在生物體內(nèi)的半衰期是現(xiàn)在許多新型分子藥物研發(fā)的目標(biāo)。適當(dāng)增加、修飾或突變 某些特定的氨基酸可以改善和提高某些肽分子藥物的穩(wěn)定性；而分子量小的藥物肽與某些 血漿組成成份融合表達(dá)或在生物體內(nèi)與半衰期長(zhǎng)的、可以作為藥物運(yùn)輸載體的血漿蛋白結(jié) 合，可顯著改善他們的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性，提高藥物肽在體內(nèi)的半衰期和生理活性。人血清白蛋白(HSA，分子量為66. 478kDa.)是人體血漿中含量最為豐富的蛋白種 類，濃度約為600μΜ，它也是人體血漿中主要的藥物運(yùn)輸?shù)鞍?，在人體內(nèi)的半衰期可達(dá)19 天。許多藥物肽或蛋白在生物體內(nèi)與人血清白蛋白結(jié)合能有效的改善其代謝動(dòng)力學(xué)特性， 延長(zhǎng)其半衰期，提高其穩(wěn)定性和生理活性。篩選與人血清白蛋白具有較高的專一親和作用的短肽，專一親和性短肽在血液中 與人血清白蛋白結(jié)合，可使某些藥物肽與專一親和性短肽融合表達(dá)的融合多肽或蛋白在生 物體內(nèi)的半衰期有效延長(zhǎng)。而目前篩選的人血清白蛋白親和性短肽多為20個(gè)氨基酸或12 個(gè)氨基酸的短肽，且較少有與人血清白蛋白具有高親和力的短肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種與人血清白蛋白具 有高親和力的七肽。本發(fā)明的另一目的在于提供所述與人血清白蛋白結(jié)合的七肽的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種與人血清白蛋白結(jié)合的七肽，其氨基 酸序列如下所示W(wǎng)QRPSSW ；所述與人血清白蛋白結(jié)合的七肽的編碼核苷酸序列為TGG CAG CGC CCG AGCAGC TGG ；所述與人血清白蛋白結(jié)合的七肽應(yīng)用于與多肽構(gòu)建融合蛋白；該融合蛋白可以與 人血清白蛋白結(jié)合；所述的多肽優(yōu)選為藥物多肽；該七肽與藥物多肽融合后，顯著提高藥物肽在生物 體內(nèi)的穩(wěn)定性及生理活性周期；所述的藥物多肽包括治療糖尿病的藥物多肽如PACAP及其衍生物；抗腫瘤的多 肽如TNF及其衍生物以及某些促進(jìn)細(xì)胞凋亡的多肽等。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果
本發(fā)明首次提供了由7個(gè)氨基酸組成的、且與人血清白蛋白專一親和的、具有較 高親和力的短肽。短肽與某些藥物多肽融合后，短肽的氨基酸個(gè)數(shù)越少，不僅有利于該短肽 不易造成藥物多肽作用位點(diǎn)的位阻，而且在生物體內(nèi)不會(huì)存在抗原性影響。


圖1為含所選7-mer肽的噬菌體與人血清白蛋白的親和作用曲線。圖2為重組多肽MHDBAY的制備示意圖。圖3為MHDBAY基因合成及重組表達(dá)質(zhì)粒pKY_MHDBAY構(gòu)建示意圖；圖中MCS_多克隆位點(diǎn)；CBD-幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域；intein-內(nèi)含肽。圖4為SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白htein-CBD-MHDBAY表達(dá)的鑒定圖；其中，泳道1 是IPTG誘導(dǎo)后菌體破碎上清液；泳道2是IPTG誘導(dǎo)前菌體破碎上清液。圖5為制備的重組多肽MHDBAY的飛行質(zhì)譜鑒定圖。圖6為重組多肽MHDBAY與BAY55-9837的穩(wěn)定性比較與檢測(cè)結(jié)果圖。圖7為重組多肽MHDBAY/BAY55-9837和[125I]PACAP38對(duì)VPAC2受體的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié) 合檢測(cè)結(jié)果圖。圖8為重組多肽MHDBAY和BAY55-9837對(duì)ICR小鼠的急性糖耐量試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。實(shí)施例1人血清白蛋白親和結(jié)合7-mer肽的淘選利用New England Biolabs, Inc公司的隨機(jī)七肽噬菌體展示文庫(kù)(Ph. D. _7噬菌 體展示肽庫(kù))篩選人血清白蛋白高親和7-mer肽。Ph.D.-7噬菌體展示肽庫(kù)是將隨機(jī)七肽融合到M13噬菌體次要衣殼蛋白 (PiII)上，是一個(gè)組合文庫(kù)，本文庫(kù)包含的隨機(jī)七肽序列數(shù)在IO9以上，本文庫(kù)的滴度為 2X1013pfu/mLo用固定靶分子直接包被平板法進(jìn)行四輪淘選。第一輪淘選(1)將人血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司)溶于0. IM的NaHCO3溶液(ρΗ8· 6)， 配制濃度為100μ g/mL的人血清白蛋白溶液(pH 8. 6)；(2)在單個(gè)滅菌聚苯乙烯培養(yǎng)皿平板(60X 15mm,Coring hcorporated公司)中 加入1. 5mL上述人血清白蛋白溶液溶液，反復(fù)旋轉(zhuǎn)直到表面完全濕潤(rùn)，在增濕容器中4°C輕 微震蕩，孵育過夜，平板可在此容器中4°C貯存?zhèn)溆茫?3)用ImL的TBST緩沖液(TBS緩沖液中含0. 1% [ν/ν]的吐溫-20, pH 7. 5)稀 釋2Χ1011的噬菌體(即IOyL的原始文庫(kù))，然后加到已包被和封閉好的平板上，室溫溫 和搖動(dòng)50min ；(4)傾倒除去未結(jié)合噬菌體并拍甩除去殘余溶液，用上述TBST緩沖液洗板10次；將人血清白蛋白溶于TBS緩沖液(pH 7. 5)中，配制濃度為100 μ g/mL的溶液，用此溶液ImL 將結(jié)合的噬菌體競(jìng)爭(zhēng)性洗脫下來，洗脫時(shí)間為40min ；(5)取少量洗脫的噬菌體按照試劑盒說明書方法進(jìn)行滴度測(cè)定，其余洗脫的噬菌 體按照試劑盒說明書方法進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)定滴度；第二輪淘選按照第一輪淘選方法，取包被好的聚苯乙烯培養(yǎng)皿平板，封閉后加入第一輪淘選 擴(kuò)增后的噬菌體，加入噬菌體量為2 X IO11Pfu,進(jìn)行第二輪淘選，方法與第一輪淘選相同；第三輪淘選按照第一輪淘選方法，取包被好的聚苯乙烯培養(yǎng)皿平板，封閉后加入第二輪淘選 擴(kuò)增后的噬菌體，加入噬菌體量為2 X IO11Pfu,進(jìn)行第三輪淘選，方法與第一輪淘選略有改 動(dòng)在清洗步驟中將TBST緩沖液中吐溫-20的濃度增至0. 3% [ν/ν]；第四輪淘選按照第一輪淘選方法，取包被好的聚苯乙烯培養(yǎng)皿平板，封閉后加入第三輪淘選 擴(kuò)增后的噬菌體，加入噬菌體量為2Χ IO11Pfu,進(jìn)行第四輪淘選，方法與第一輪淘選有部分 改動(dòng)在清洗步驟中將TBST緩沖液中吐溫-20的濃度增至0. 3% [ν/ν]；包被平板時(shí)所用 人血清白蛋白溶液的濃度降低為10 μ g/mL;噬菌體與平板的結(jié)合時(shí)間由前三輪篩選時(shí)的 50min縮短為20min，洗脫時(shí)間由前三輪篩選時(shí)的40min增加為60min。在第四輪淘選出的噬菌體中隨機(jī)選擇10個(gè)噬菌斑進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序引物 為-96gIII 測(cè)序引物(其 DNA 序列為5'-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3，)，根據(jù) DNA 測(cè) 序結(jié)果推演為氨基酸序列，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與人血清白蛋白親和結(jié)合7-mer肽的氨基酸序 列為WQRPSSW。實(shí)施例2人血清白蛋白親與所淘選的7-mer肽的親和力測(cè)定利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)方法檢測(cè)淘選得到的7-mer肽與人血清白蛋白的 親和力，具體步驟如下對(duì)要鑒定的含有與人血清白蛋白親和結(jié)合7-mer肽(其氨基酸序列為=WQRPS Sff)的噬菌斑克隆進(jìn)行純培養(yǎng)并測(cè)定滴度。將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌ER2738(New England Biolabs公司)按1 100的體積比例稀釋于20mLLuria_Bertani (broth)培養(yǎng)基(LB)中， 于每管ER2738培養(yǎng)液中加入5 μ L噬菌體上清，37°C通氣培養(yǎng)4. 5h。上述培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入離心管中，10，OOOrpm離心lOmin，上清移入新鮮離心管，再離 心，取體積百分比80%上清于新鮮離心管中，加1/6體積的PEG-8000/NaCl (20 % [w/v] PEG-8000,2. 5M NaCl)，4°C沉淀過夜后，10, OOOrpm離心沉淀15min，棄上清，沉淀重懸于ImL TBS緩沖液中，懸液轉(zhuǎn)入微量離心管，4°C離心5min，上清轉(zhuǎn)入新鮮微量離心管，加1/6體積 的PEG-8000/NaCl再沉淀，冰上作用30min，4°C離心lOmin，棄上清；沉淀重懸于50 μ L TBS 緩沖液中，測(cè)定噬菌體滴度，4°C貯存。將人血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司)溶于0. IM的NaHCO3溶液(pH 8. 6)，配制 濃度為100 μ g/mL的人血清白蛋白溶液(pH 8. 6)，用此溶液包被ELISA板的一排空，每空加 入200 μ L，作為陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組；用另一 ELISA板連續(xù)四倍稀釋噬菌體，由第12孔加入IO12個(gè) 病毒子，進(jìn)行4倍系列稀釋至第1孔為2. 4 X IO5個(gè)病毒子；這兩個(gè)多孔板均用[w/v]酶水解干酪素封閉。用多通道移液器將稀釋好的噬菌體加入包被有人血清白蛋白的板中，室溫震蕩作 用2h ；用TBST緩沖液(TBS緩沖液中含0. 3% [ν/ν]的吐溫-20，ρΗ 7. 5)洗板6次。在封阻液中以1 5，000的比例稀釋HRP標(biāo)記的抗-Μ13抗體(Pharmacia #27-9411-01)。每孔加入200 μ L稀釋抗體，室溫震蕩作用lh，用TBST緩沖液(TBS緩沖液 中含 0.3% [ν/ν]的吐溫 _20，ρΗ 7.5)洗板 6 次，然后加入 ABTS/H202 (Sigma #A1888)底物 溶液200 μ L，室溫作用40min，用酶標(biāo)儀記錄405nm處的吸光值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取其平均 值；對(duì)照實(shí)驗(yàn)組，不加入噬菌體，其他同陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組，以測(cè)定底物背景吸光值。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，表1為陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組在405nm處各空的吸光值；圖1顯 示了含有親和結(jié)合7-mer肽(其氨基酸序列為WQRPSSW)的噬菌體與與人血清白蛋白的親 和力曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所淘選到的7-mer肽與人血清白蛋白具有較高的親和力。表1利用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)檢測(cè)所選7-mer肽與人血清白蛋白的親和作用
\噬菌體
\ I^a 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
樣品\
OD405nm\
陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組0.1120.1530.1900.2530.2810.3270.3950.6091.1601.5111.8921.930空內(nèi)對(duì)照組0.0510.0480.0520.0520.0500.0490.0480.0460.0490.0480.0500.046注1表中數(shù)字1，2，3......12表示4倍系列稀釋后依次升高的噬菌體數(shù)目.如1
表示 2. 4X105，12 表示 IO12.2實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.表中數(shù)值為3次的平均值.實(shí)施例3重組VPAC2型受體特異激動(dòng)劑MHDBAY的制備高穩(wěn)定性VPAC2型受體特異激動(dòng)劑MHDBAY的制備過程如圖2所示，具體步驟如 下(1) MHDBAY編碼序列的獲得按照大腸桿菌的密碼偏好性設(shè)計(jì)編碼MHDBAY的cDNA，設(shè)計(jì)3條引物，采用兩步法 獲得該序列(如圖2所示)引物Fl:5，GGT GGT CAT ATG TGG CAG CGC CCG AGC AGC TGG ATT GM GGT CGC TTT CCGCAT AGC GAT-3'；引物F2:5' -CGC CAG CTG TTT ACG CAG ACG GGT ATA CTG ATC GGT AAA CAC CGC ATC GCTATG CGG AAA-3'；引物F3:5' -CCA CCA TGC TCT TCC GCA ATA ACG TTT CTG TTT AAT GCT CTG CAG ATA TTTTTT CGC CGC CAG CTG TTT-3'
其中，GGTGGT 或 CCA CCA 為保護(hù)堿基,CATATG 為 NdeI 酶切位點(diǎn)，TGC TCTTCC GCA 為SapI酶切位點(diǎn)；①鏈延伸反應(yīng)反應(yīng)體系為引物Fl(250yM/L)2y L，弓丨物 F2 (250 μ M/L) 2 μ L， 10 X TaKaRaBuffer (含有 4mmol/L MgCl2) 2 μ L, dNTP 2 μ L, H2O 11. 5 μ L，TaKaRa Taq 酶 0. 5μ L ；反應(yīng)條件為94°C，IOmin；降至 58°C 5min ；72°C IOmin ；得到延伸反應(yīng)液。②PCR 反應(yīng)反應(yīng)體系為以延伸反應(yīng)液為DNA模板，引物Fl (25 μ M/L) 2 μ L，F(xiàn)3 (25 μ M/ L) 2 μ L，延伸反應(yīng)液 1· 5 μ L，dNTP 2 μ L，10XTaKaRa Ex Buffer 2 μ L, TaKaRa Taq 酶 0. 5μ L, H2O 10μ L ；反應(yīng)條件為94"C 5min ；94 "C 30s, 55 "C 30s, 72 "C 30s, 30 個(gè)循環(huán)；72 °C 延伸 IOmin ；得到長(zhǎng)度為162bp的PCR產(chǎn)物。(2)構(gòu)建重組載體pKY-MHDBAY，如圖3所示用NdeI和SapI進(jìn)行酶切步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物，利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn) 行純化(根據(jù)說明書進(jìn)行操作)。純化后的PCR產(chǎn)物先進(jìn)行LguI (SapI的同功酶，F(xiàn)ermatas 產(chǎn)品)單酶切，酶切條件為在IXTango buffer反應(yīng)體系中，1 μ g PCR產(chǎn)物加入15unit LguI (3 μ L), 37°C酶切4h ；LguI單酶切完成后，加入適量體積的10 X Tango buffer,使得 反應(yīng)體系成為 2 X Tango buffer 體系，加入 20unit NdeI (2 μ L, Fermatas 產(chǎn)品)，37°C酶 切4h ；質(zhì)粒pKYB(New England Biolabs(NEB)公司)的雙酶切=LguI (SapI 的同功酶)和 NdeI的雙酶切條件同上。將雙酶切后的MHDBAY基因和雙酶切后的質(zhì)粒pKYB連接，連接體系和連接時(shí)間、大 腸桿菌DH5ci (購(gòu)自大連寶生物公司)感受態(tài)細(xì)胞的制作、轉(zhuǎn)化以及篩選(卡那霉素)，根據(jù) 《分子克隆》進(jìn)行操作。將MHDBAY基因克隆到質(zhì)粒pKYB的NdeI和SapI位點(diǎn)間，得到重組 載體pKY-MHDBAY，測(cè)序，目的序列如下ATG TGG CAG CGC CCG AGC AGC TGG ATT GM GGT CGC TTT CCG CAT AGC GATGCG GTG TTT ACC GAT CAG TAT ACC CGT CTG CGT AAA CAG CTG GCG GCG AAA AMTAT CTG CAG AGC ATT AAA CAG AAA CGT TAT ；其表達(dá)蛋白序列如下 MWQRPSSWIEGRFPHSDAVFTDQYTRLRKQLAAKKYLQSLKQKRY。(3)表達(dá)和純化①將重組質(zhì)粒pKY-MHDBAY 轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌 E. coli Strain ER2566 (New England Biolabs (NEB)公司)，得到表達(dá)工程菌pKY_MHDBAY/ER2566 ；挑取單克隆于5mL含50 μ g/mL 卡那霉素的Luria-Bertani (broth)培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱LB培養(yǎng)基)，搖菌培養(yǎng)過夜，再擴(kuò)大，以體 積比為1 100的比例接于IL含50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37°C搖菌至OD6tltl為0. 6， 加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG))至終濃度0. 6mmol/L，37°C誘導(dǎo)表達(dá)6h。8000rpm離心 20min 收集菌體，將菌體重懸于60mL Buffer A溶液(20mM Tris-HCl, 500mM NaCI, ImM EDTA, pH 8.0)中，然后用低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破碎，破碎條件為=BufferA溶 液稀釋菌體的濃度為18% (m/v)，破碎壓力為1700bar，制冷溫度為3°C。破碎產(chǎn)物在4°C，IOOOOrpm離心30min，收集上清，該上清稱為破碎上清。SDS-PAGE 檢測(cè)融合蛋白Intein-CBD-MHDBAY的表達(dá)，鑒定結(jié)果如圖4所示。取25mL幾丁質(zhì)珠(NEB公司產(chǎn)品#S6651L)裝填4. 5X 20cm層析柱，以10倍柱體 積的BufferA溶液洗柱；破碎上清以0. 5mL/min的流速上注；用10倍柱體積的Buffer A溶 液以2mL/min過柱，以洗去雜蛋白或未親和結(jié)合的融合蛋白，用80mL Buffer B溶液(20mM Tris-HCI,0. 5M NaCl,lmM EDTA，50mM β -巰基乙醇，pH 8.0)自然過柱，使β-巰基乙醇均 勻分布并浸泡柱內(nèi)填料，然后封閉進(jìn)、出口端，上述反應(yīng)體系在16°C反應(yīng)24h，以誘導(dǎo)蛋白 內(nèi)含肽的N端切割，釋放目的多肽C端硫酯。用Buffer A溶液洗脫并用潔凈的燒杯收集 目的多肽溶液C端硫酯，4°C透析過夜除去β -巰基乙醇并使目的多肽C端硫酯水解，再經(jīng) 高效液相色譜(HPLC)純化、制備得到純度為質(zhì)量百分比95%以上的VPAC2型受體特異激 動(dòng)劑MHDBAY，目的多肽的制備條件為流動(dòng)相A [在體積百分比10%乙腈(CNCH3，溶質(zhì)為純 水)中添加三氟乙酸(TFA)得到，TFA的終濃度為體積百分比0. 1% ]，流動(dòng)相Β[100%乙腈 (CNCH3)中添加三氟乙酸(TFA)，TFA的終濃度為體積百分比0. 1% ]，流速lmL/min, 20min 線性梯度洗脫，線性梯度洗脫中流動(dòng)相B由O 60% (ν/ν)，收集目的多肽洗脫峰，光吸收 檢測(cè)波長(zhǎng)為218nm。目的多肽MHDBAY的純度通過分析性HPLC測(cè)定(條件同目的多肽的制 備條件)。制備的高穩(wěn)定性VPAC2型受體特異激動(dòng)劑MHDBAY利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定(如圖5所 示)，質(zhì)譜檢測(cè)分子量為5544. 2kDa.，與其理論值相符合。實(shí)施例4重組肽MHDBAY (即實(shí)施例3制備的MHDBAY)的體外穩(wěn)定性測(cè)定重組肽MHDBAY、化學(xué)合成MHDBAY (與重組肽MHDBAY相比，其N端無甲硫氨酸)和 BAY55-9837 (Tocris Bioscience 公司產(chǎn)品 #2711)以終濃度 lmg/ml 分別溶解在 2OmM 磷 酸鈉緩沖液(PH 8.0，含150mM氯化鈉)，37°C水浴鍋中孵育，在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣，利用液 相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)檢測(cè)多肽在水溶液環(huán)境中隨時(shí)間的存留量，以確定重組 肽MHDBAY在體外水溶液環(huán)境中的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖6所示孵育1周時(shí)，BAY55-9837消 減33. 7%，孵育2周時(shí)，BAY55-9837消減73. 9%，孵育3周和4周時(shí)，BAY55-9837分別消 減86. 5%和95. 9% ；化學(xué)合成MHDBAY多肽在孵育2周時(shí)，消減23. 2%，孵育4周時(shí)，消減 48. 0% ；而重組肽MHDBAY在孵育2周時(shí)，僅消減2. 1 %，孵育4周時(shí)，僅消減6. 7%。實(shí)驗(yàn)結(jié) 果統(tǒng)計(jì)學(xué)處理表明，重組肽MHDBAY的體外穩(wěn)定性比BAY55-9837提高約25倍，比化學(xué)合成 MHDBAY多肽提高約8倍。實(shí)施例5重組肽MHDBAY對(duì)VPAC2受體的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合活性測(cè)定用200 μ L PBS (ΡΗ7. 4)溶解重組肽 MHDBAY 至終濃度分別為 10 μ Μ、1 μ M、0. 1 μ Μ、 0. 01 μ Μ、0· 001 μ Μ、0· 0001 μ Μ、0· 00001 μ M置冰上冷卻20min,保持樣品在冰上，然后加入 IOunit凝血因子Xa酶/ (每毫克重組肽MHDBAY)和Ing人源二肽基肽酶(DPPIV) / (1 μ M重 組肽MHDBAY)，37°C水浴中反應(yīng)24h，以釋放活性多肽MBAY(作用于VPAC2受體)。然后加 入 Rivaroxaban (Toronto Research Chemicals，Inc 公司產(chǎn)品 #2711 L28828775)禾口 DPP-IVinhibitor (Linco, St. Charles, MO)均至終濃度為50 μ M以終止酶切反應(yīng)。VPAC2-CH0細(xì)胞Qnvitrogen公司)接種至12孔板上培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前2h，用0. 5mL無 血清Ham’ s F-12培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次。然后，細(xì)胞用含2% (mg/ml)牛血清白蛋白(BSA) 和IOmM葡萄糖的Ham，s F-12培養(yǎng)液4°C培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)液中加入0. InM[125I]PACAP38和 待測(cè)多肽(即為BAY55-9837或不同濃度組重組肽MHDBAY的雙酶切反應(yīng)液)，并逐步提高 待測(cè)多肽濃度(10_nM I(TM)。培養(yǎng)完畢后，棄掉上清液，用冰冷PBS (0. 01Μ，ρΗ值為7. 4) 洗細(xì)胞3次，細(xì)胞在室溫下用0. 5mL 0. 5M NaOH和0. 1 % (mg/ml) SDS混合lOmin，然后用 Y計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞裂解物放射量，計(jì)算重組肽MHDBAY或BAY55-9837的半抑制量(IC50， half-maximal inhibitory concentration),每組實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7，BAY55-9837對(duì)VPAC2受體的半抑制量IC50為68. 3 士8. InM ；重 組肽MHDBAY釋放多肽MBAY的對(duì)VPAC2受體的半抑制量IC50為49. 8士7. 5nM ；結(jié)果表明， 重組肽MHDBAY對(duì)VPAC2受體的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合活性高于VPAC2受體特異激動(dòng)劑BAY55-9837。實(shí)施例6重組多肽MHDBAY對(duì)正常ICR小鼠口服葡萄糖耐量影響的檢測(cè)正常雄性ICR小鼠(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào) SCXK[京]2002-0003)按體重均分為4組，正常對(duì)照組、BAY55-9837組(0. 5mg/kg)、重組 肽MHDBAY組(0. 5mg/kg)。動(dòng)物禁食過夜(1 )，取空腹血(Omin)后，靜脈注射給藥，正常 對(duì)照組靜脈注射生理鹽水，分別于給藥后15min灌胃給予葡萄糖溶液Og/kg)，并在給糖后 30min、60min及120min時(shí)取血測(cè)定血糖值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示重組肽MHDBAY給藥15min后，可顯著降低正常小鼠葡萄糖 負(fù)荷后30min、60min及120min血糖水平(ρ < 0. 05)，曲線下面積顯著降低；ΒΑΥ55-9837 也可降低正常小鼠葡萄糖負(fù)荷后30min血糖，但不能降低正常小鼠葡萄糖負(fù)荷后60min及 120min血糖水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組肽MHDBAY可明顯降低葡萄糖依賴的血糖水平，效果 明顯優(yōu)于BAY55-9837。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種與人血清白蛋白結(jié)合的七肽，其特征在于該七肽的氨基酸序列如下所示 WQRPSSW。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述與人血清白蛋白結(jié)合的七肽，其特征在于該七肽的編碼核苷酸 序列為TGG CAG CGC CCG AGC AGC TGG。
3.權(quán)利要求1或2所述與人血清白蛋白結(jié)合的七肽的應(yīng)用，其特征在于所述與人血 清白蛋白結(jié)合的七肽應(yīng)用于與多肽構(gòu)建融合蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的多肽為藥物多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物多肽為治療糖尿病的藥物多 肽或抗腫瘤的多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述治療糖尿病的藥物多肽為PACAP或其衍生物； 所述抗腫瘤的多肽為TNF或其衍生物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與人血清白蛋白結(jié)合的七肽與應(yīng)用。該短肽的氨基酸序列組成為WQRPSSW。該短肽由7個(gè)氨基酸組成的、且與人血清白蛋白專一親和的、具有較高親和力。本發(fā)明所述與人血清白蛋白結(jié)合的七肽應(yīng)用于與多肽構(gòu)建成融合蛋白，注射到人體中后，可顯著提高多肽的穩(wěn)定性及生理活性周期。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102060913SQ201010565230
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者洪岸, 馬義 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)