專利名稱：胡蘆巴種子提取物，其提取方法，及治療糖尿病及其并發(fā)癥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胡蘆巴種子提取物，提取方法，含有它們的藥物組合物及其作為治療糖尿病和并發(fā)癥，尤其作為降血糖和降血脂產(chǎn)品中的用途。
背景技術(shù)：
胡蘆巴種子是一種傳統(tǒng)的中藥材，具有溫腎、祛寒、止痛之功效。已有報(bào)道從胡蘆巴中分離到甾體皂甙、黃酮、生物堿等多種成分(尚明英，中草藥，1998，29(10)655；藥學(xué)學(xué)報(bào)，2001，36(11)837；中國(guó)中藥雜志，2002，27(4)277；徐學(xué)民，中草藥，2003，34(8)678；I.P.Varshney，Indian J.Chem.，1978，16B1134；M.Yoshikawa，Chem.Pharm.Bull.，1997，45(1)81-87)。有關(guān)胡蘆巴種子具有降血糖活性在國(guó)內(nèi)外較早已有研究報(bào)道(G.Ribes，Proceedingsof the Society for Experimental Biology and Medicine，1986，182159-166；M.A.Riyad，Planta Med.，1988，54286；R.D.Sharma，Nutrition Res.，1996，16(8)1331；L.Ali，Planta Med.，1995，61358；朱鎮(zhèn)海，四川中醫(yī)，2000，18(11)20；陳軼玉，鎮(zhèn)江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，11(2)163)，但其中有效部位和有效成分報(bào)道很少，尚未明確。G.Ribes發(fā)現(xiàn)種皮中纖維是降血糖活性成分。L.Ali發(fā)現(xiàn)種子中可溶性半乳甘露聚糖有降血糖作用。文獻(xiàn)報(bào)道胡蘆巴種子降低膽固醇活性，其中活性成分是皂苷類化合物(G.Valette，Atherosclerosis，1984，50105；R.D.Sharma，Nutrition Reports International，1986，33(4)669；Pierre R.P.，Steroids，1995，60674)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人經(jīng)研究現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，不含纖維素或半乳甘露聚糖等多糖成分的胡蘆巴種子提取物，該提取物具有較強(qiáng)降血糖和降血脂作用，能刺激胰島素分泌，該結(jié)果未見相同研究報(bào)道。
本發(fā)明一方面涉及一種胡蘆巴種子提取物，其特征在于不含纖維素及半乳甘露聚糖。
本發(fā)明還涉及胡蘆巴種子提取物的制備方法，其包括將生藥胡蘆巴種子干燥粉碎，常溫、常壓下，用有機(jī)溶劑、含水有機(jī)溶劑或水浸提獲得胡蘆巴種子提取浸膏；浸膏再用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇連續(xù)萃取，萃取液減壓濃縮，分別獲得石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取物，只保留正丁醇提取物。
本發(fā)明還涉及用于治療糖尿病及其并發(fā)癥以及降低血脂的產(chǎn)品，其包括胡蘆巴種子提取物及對(duì)人體無(wú)害的載體，其中所述胡蘆巴種子提取物不含纖維素及半乳甘露聚糖。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及胡蘆巴種子提取物在制備用于治療糖尿病及其并發(fā)癥以及降血脂的產(chǎn)品中用途，其中所述胡蘆巴種子提取物不含纖維素及半乳甘露聚糖。
進(jìn)一步講，在本發(fā)明制備方法中，生藥胡蘆巴種子粉末與浸泡用有機(jī)溶劑、含水有機(jī)溶劑或水的重量體積比一般為1∶5-15(千克/升)。浸泡時(shí)間一般大于24小時(shí)，浸泡溫度一般0℃-60℃。所用有機(jī)溶劑包括甲醇、乙醇、丙醇、丙酮。
萃取，提取物浸膏萃取分為三步，第一步采用低極性溶劑萃取，包括石油醚、四氯化碳、環(huán)己烷和苯，優(yōu)選用石油醚。第二步采用中極性溶劑包括乙酸乙酯，氯仿、乙醚，優(yōu)選用乙酸乙酯。第三步采用較大極性溶劑正丁醇。
胡蘆巴種子提取物浸膏重量與萃取溶劑體積比1∶5～15(克/毫升)。先用石油醚室溫萃取2次，石油醚萃取液減壓濃縮，獲得石油醚部位。萃取殘?jiān)靡宜嵋阴ポ腿?次，乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，獲得乙酸乙酯部位。乙酸乙酯萃取殘?jiān)儆谜〈驾腿?次，正丁醇萃取液減壓濃縮，獲得正丁醇部位或正丁醇提取物。
濃縮及萃取液減壓濃縮的溫度一般等于或低于60℃。
本發(fā)明的胡蘆巴種子提取物中的正丁醇部位，主要含有黃酮、三萜皂苷和甾體皂苷。如含小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖甙，三糖的齊墩果烷型三萜皂苷(大豆皂苷I)，大豆皂苷I甲酯，胡蘆巴甾體皂苷等成分。
本發(fā)明所述產(chǎn)品包括口服使用和非腸道使用的產(chǎn)品，如口服液，片劑，顆粒劑，膠囊或注射劑。本發(fā)明所述產(chǎn)品也可理解功能性食品或保健品。進(jìn)一步講，本發(fā)明中對(duì)人體無(wú)害載體是指制藥或食品領(lǐng)域允許使用的已知載體。
進(jìn)一步講，本發(fā)明中胡蘆巴種子提取物可理解為胡蘆巴種子的正丁醇提取物。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1胡蘆巴種子2kg，粉碎，過(guò)篩(20目)，加入95％醫(yī)用乙醇16L室溫浸泡72小時(shí)，不斷攪拌。四層紗布過(guò)濾，殘?jiān)^續(xù)用95％乙醇8L浸泡48小時(shí)，過(guò)濾。合并濾液，離心，上清液45℃減壓濃縮得到乙醇浸膏155.6克，得率為7.8％。胡蘆巴種子醇提浸膏500g，加100ml水研磨成乳濁液，用5000ml石油醚萃取三次，收集醚層溶液減壓濃縮，得到石油醚部位。殘留液用乙酸乙酯2000ml萃取三次，萃取液減壓濃縮，得到乙酸乙酯部位。殘留液再用3000ml正丁醇萃取三次，萃取液減壓濃縮，得到正丁醇部位或正丁醇提取物69.17克，得率為1.8％。
胡蘆巴95％乙醇提取殘?jiān)?kg用蒸餾水8L室溫浸泡72h，不斷攪拌。浸泡液過(guò)濾，殘?jiān)谜麴s水4L再繼續(xù)浸泡24h，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮，55℃烘干得水提浸膏177.4g，得率為17.7％.
實(shí)施例2將實(shí)施例得到的胡蘆巴種子的正丁醇部位少許，溶于甲醇中，進(jìn)行薄層層析。
層析板G254硅膠板，展開劑條件(1)乙酸乙酯∶甲醇＝1∶3(2)乙酸乙酯∶甲醇∶水＝1∶2∶1顯色條件熒光，λ＝254，365。
碘熏法方法(1)Rf值0.55(λ365，I2) 方法(2)Rf值0.83(λ365)0.47(I2)0.79(I2)0.43(λ254，I2)0.58(λ254，I2)0.39(I2)0.37(I2)0.20(I2)0.28(λ254，I2)0.09(λ254，I2)0.20(λ365，I2)0.06(I2)0.09(I2)采用鹽酸-鎂粉檢驗(yàn)方法鑒別出正丁醇部位呈陽(yáng)性，表明含有黃酮類化合物；醋酐-濃硫酸反應(yīng)呈陽(yáng)性，表明含皂苷類化合物；氯仿-濃硫酸反應(yīng)呈陽(yáng)性，表明含萜類和甾體類化合物；α-萘酚濃硫酸反應(yīng)呈陽(yáng)性，表明含還原糖苷類化合物。
濃硫酸-苯酚法檢驗(yàn)水提物中多糖，呈陽(yáng)性反應(yīng)。
實(shí)施例3將實(shí)施例1得到的胡蘆巴種子提取物的正丁醇部位經(jīng)D101大孔樹脂柱層析，分別以水，30％，50％，70％，95％乙醇洗脫，50％乙醇部分經(jīng)硅膠色譜柱分離，氯仿-甲醇-水梯度洗脫，得到一個(gè)黃酮類化合物為小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖甙，特征為黃色針晶，熔點(diǎn)246-248℃，IR(KBr)cm-13378，1655，1598，1491。1H-NMR(DMSO)δ12.96，9.40，3.88，6.46，6.87，7.08，7.36，5.05，3.24，-3.73。13C-NMR(DMSO)δ182.1，56.4，100.1，60.6-77.4。
30％乙醇部分經(jīng)硅膠色譜柱分離，氯仿-甲醇-水梯度洗脫，得到3個(gè)三萜皂苷和1個(gè)甾體皂苷。三萜皂苷為2個(gè)三糖的齊墩果烷型三萜皂苷(大豆皂苷I)和1個(gè)大豆皂苷I甲酯。其中一個(gè)三萜皂苷特征為白色粉末，熔點(diǎn)228-231℃，IR(KBr)cm-13410，1625，1355-1392。1H-NMR(C5D5N)δ0.69，0.95，1.00，1.22，1.29，1.39，1.75，2.40，3.23，4.23，3.74，6.25。13C-NMR(DMSO)δ122.3，144.8，172.3，105.3，102.3，101.7。另一三萜皂苷特征白色粉末，熔點(diǎn)280-282℃，初步鑒定為三糖齊墩果烷型三萜皂苷。大豆皂苷I甲酯特征為白色粉末，熔點(diǎn)247-249℃，IR(KBr)cm-13424，2926，1731，1619，1382，1050。1H-NMR(DMSO)δ0.75-1.14，3.67，4.74，4.95，5.16；13C-NMR(DMSO)δ169.2，144.1，121.5，103.7，100.2，100.0，51.7。甾體皂苷特征為無(wú)色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)173-175℃，IR(KBr)cm-13390，1627，1033。1H-NMR(DMSO)δ4.96，4.83，4.97，3.94，3.62，3.95，3.68，1.62，1.03，0.73，0.70；13C-NMR(DMSO)δ152.3，104.8，103.6，105.3，17.3，14.4，13.2，11.7。
實(shí)施例450只昆明小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10只)和待造模組(40只)。待造模組小鼠禁食24小時(shí)后(不禁水)，尾靜脈快速注射四氧嘧啶生理鹽水溶液，劑量為60mg·kg-1。72h后尾尖取血測(cè)定小鼠血糖，血糖值＞20.0mmol·L-1的小鼠被選為糖尿病小鼠，分成模型組(10只)和實(shí)施例1正丁醇提取物組(今后簡(jiǎn)稱組A)1g.kg-1組(10只)，水提物組1g.kg-1組(10只)，連續(xù)灌胃給藥20天，第7天測(cè)定血糖，第20天測(cè)定血糖。數(shù)據(jù)以X±SD表示，二組均數(shù)間差異用t檢驗(yàn)。
表1胡蘆巴種子95％乙醇提取物降血糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注與模型組比較，*p＜0.05。
實(shí)施例5100只昆明小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10只)和待造模組(90只)。待造模組小鼠禁食24小時(shí)后(不禁水)，尾靜脈快速注射四氧嘧啶生理鹽水溶液，劑量為60mg·kg-1。72h后尾尖取血測(cè)定小鼠血糖，血糖值＞20.0mmol·L-1的小鼠被選為糖尿病小鼠，分成模型組(10只)和石油醚部位(10只)，乙酸乙酯部位1g.kg-1組(10只)，實(shí)施例1的正丁醇部位(10只)。灌胃，劑量800mg/kg，連續(xù)給藥20天，第7天測(cè)定血糖，第21天測(cè)定血糖后，眼眶取血，處死，測(cè)定小鼠血清中甘油三脂和胰島素水平。數(shù)據(jù)以X±SD表示，二組均數(shù)間差異用t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明正丁醇部位具有顯著降血糖和降血脂作用，對(duì)糖尿病小鼠有促進(jìn)胰島素分泌作用。
表2胡蘆巴種子正丁醇部位降血糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注與模型組比較，*p＜0.05，**p＜0.01.
表3胡蘆巴種子正丁醇部位降血脂和促進(jìn)胰島素分泌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注與模型組比較，*p＜0.05，***p＜0.001.
權(quán)利要求
1.一種胡蘆巴種子提取物，其特征在于不含纖維素及半乳甘露聚糖。
2.胡蘆巴種子提取物的制備方法，其包括將生藥胡蘆巴種子干燥粉碎，常溫、常壓下，用有機(jī)溶劑、含水有機(jī)溶劑或水浸提獲得胡蘆巴種子提取浸膏；浸膏再用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇連續(xù)萃取，萃取液減壓濃縮，分別獲得石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取物，只保留正丁醇提取物。
3.用于治療糖尿病及其并發(fā)癥以及降低血脂的產(chǎn)品，其包括胡蘆巴種子提取物及對(duì)人體無(wú)害的載體，其中所述胡蘆巴種子提取物不含纖維素及半乳甘露聚糖。
4.胡蘆巴種子提取物在制備用于治療糖尿病及其并發(fā)癥以及降血脂的產(chǎn)品中用途，其中所述胡蘆巴種子提取物不含纖維素及半乳甘露聚糖。
5.權(quán)利要求1的胡蘆巴種子提取物，其中所述提取物為胡蘆巴種子的正丁醇提取物。
全文摘要
本發(fā)明涉及胡蘆巴種子提取物，提取方法，含有它們的藥物組合物及其作為治療糖尿病和并發(fā)癥，尤其作為降血糖和降血脂產(chǎn)品中的用途。
文檔編號(hào)A61P3/10GK1726952SQ200410071030
公開日2006年2月1日 申請(qǐng)日期2004年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月27日
發(fā)明者單俊杰, 趙毅民, 楊明, 楊靜, 任晉瑋 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所