專利名稱：一種穩(wěn)定蛋白藥物的方法及其在微球制備中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬藥物制劑領(lǐng)域，涉及一種提高蛋白藥物穩(wěn)定性的方法，以及該方法在微球制備中的應用。
背景技術(shù)：
近年來，隨著生命相關(guān)學科的迅猛發(fā)展，涌現(xiàn)出了大量的蛋白質(zhì)和多肽藥物。與傳統(tǒng)的小分子有機藥物相比，蛋白質(zhì)及多肽類藥物的物理和化學穩(wěn)定性差，容易發(fā)生聚集、氧化和脫酰胺等反應而失去生物活性，其中聚集對蛋白藥物活性的影響較為突出。
蛋白藥物均具有一定的三維空間構(gòu)象，這種構(gòu)象是確保其與受體結(jié)合，進而發(fā)揮治療作用的重要條件。但是，在制劑制備過程中蛋白結(jié)構(gòu)很容易受到破壞，導致蛋白聚集并且形成不溶性沉淀。蛋白的多聚體不僅沒有生物活性，而且還能夠誘發(fā)人體的免疫反應，因此在蛋白制劑制備過程中應盡量避免。
除了不穩(wěn)定的性質(zhì)之外，蛋白及多肽類藥物還具有分子量大，脂溶性差，難以透過生物膜等特點，一般只能通過注射途徑給藥。某些用于激素替代治療的蛋白質(zhì)或多肽藥物往往治療周期長而且使用頻繁，給患者造成嚴重的肌體損傷和精神壓力。對于此類藥物通常需要將其制成長效注射劑以改善患者的順應性。目前，所謂的長效注射劑主要指可生物降解微球，如載有重組人生長激素(rhGH)的乳酸-羥基乙酸共聚物微球(CN1187120A)。
生物降解微球大多由人工合成的親脂性材料制成，因此制備微球時需要使用二氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮等有機溶劑。在制備過程中，蛋白藥物暴露于大面積的油水兩相介面，導致其發(fā)生嚴重的聚集并沉淀。與有機溶劑接觸后，可溶性蛋白中的一部分轉(zhuǎn)變?yōu)槎垠w，這種存在形式其穩(wěn)定性較天然構(gòu)象的蛋白大大降低，為制劑的穩(wěn)定性埋下了隱患。由此可見，提高蛋白藥物在包封過程中的穩(wěn)定性是設(shè)計長效制劑需要解決的關(guān)鍵問題之一。目前普遍被人們接受的解決方法是在處方中加入聚氧乙烯單月桂酸山梨醇酯(Tween)(Bam N.B.，Cleland J.L.et al，J.Pharm.Sci.871554)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定蛋白藥物的方法，該方法用于蛋白藥物微球的制備，可提高蛋白藥物的穩(wěn)定性。尤其可提高蛋白藥物與有機溶劑接觸時的穩(wěn)定性。
在制備生物降解微球時，通常需要將蛋白藥物的水溶液與含有生物降解材料的有機溶劑制成油包水(w/o)型乳劑。本發(fā)明采用在水相中加入非離子型表面活性劑提高微球制備過程中蛋白藥物的穩(wěn)定性。
本發(fā)明所述的用于穩(wěn)定蛋白藥物的非離子型表面活性劑為聚氧乙烯與聚氧丙稀的ABA型嵌段共聚物(商品名為泊洛沙姆，poloxamer)。共聚物的平均分子量為5,000-16,000，其中，聚氧乙烯的含量為60％-80％。優(yōu)選平均分子量12,600、聚氧乙烯含量為70％的共聚物(泊洛沙姆407)。所述共聚物用作蛋白藥物穩(wěn)定劑在內(nèi)水相中的濃度為0.2％-15％，優(yōu)選2％-10％，可以在蛋白藥物之前或之后加入到內(nèi)水相中。
所述內(nèi)水相用于溶解蛋白藥物與穩(wěn)定劑，可選自磷酸鹽、枸櫞酸鹽、醋酸鹽、碳酸鹽、硼酸鹽和三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖溶液，以及上述任意兩種緩沖鹽的混合溶液。
內(nèi)水相中可以選擇性加入寡聚糖或糖醇以進一步提高蛋白藥物在微球中的穩(wěn)定性，包括海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇和山梨醇。
本發(fā)明所述的與內(nèi)水相進行乳化的有機溶劑包括二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、二氧六環(huán)和乙醚，以及上述溶劑的混合物。
本發(fā)明涉及的用于制備生物降解微球的材料包括乳酸和羥基乙酸的單聚或共聚物、丙交酯和乙交酯的單聚或共聚物、聚己內(nèi)酯、聚酸酐、聚原酸酯、聚氨酯和聚碳酸酯，以及上述材料的混合物和共聚物。
上述成球材料優(yōu)選乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)，平均分子量范圍為4,000-1,000,000，其中乳酸單體的含量為1％-99％，末端為游離羧基或其它封閉基團。成球材料占微球總重量的60％-99％。為了獲得理想的釋放與降解速度，可以將具有不同分子量、乳酸單體含量和末端基團的PLGA混合使用。
上述微球制備中，為了提高釋放過程中藥物的穩(wěn)定性，抑制聚合物降解產(chǎn)生的酸性物質(zhì)對藥物的破壞，微球中可以加入適量的抗酸劑，如Mg(HO)2、MgCO3、Mg(OAc)2、Ca(HO)2、CaCO3、Ca(OAc)2、Zn(HO)2、ZnCO3和Zn(OAc)2。抗酸劑的用量占微球總重的0.1％-10％，其最佳范圍為1％-5％。
本發(fā)明采用藥劑學領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的方法制備微球，包括乳化-溶劑揮發(fā)法(又稱液中干燥法)、噴霧干燥法、低溫噴霧萃取法，超臨界萃取技術(shù)等。具體步驟是，將本發(fā)明的含有聚氧乙烯-聚氧丙稀嵌段共聚物的蛋白藥物水溶液分散于生物降解聚合物的有機溶液中，再利用上述方法或技術(shù)使聚合物溶液分散至所需的粒徑范圍，除去有機溶劑使聚合物固化形成微球。除去聚合物溶劑的過程可利用水性溶劑、低溫有機溶劑或超臨界狀態(tài)氣體進行萃取來完成。所述噴霧干燥法，可通過將聚合物溶液直接噴射到高溫環(huán)境中實現(xiàn)。所述乳化-溶劑揮發(fā)法，其中剩余的少量藥物溶劑或聚合物溶劑可采用冷凍干燥或真空干燥的方法除去。所述微球粒徑控制在500μm以下，最佳的粒徑范圍為1-200μm。
上述微球中可以包封任何對有機溶劑不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)或多肽類藥物，其用量占微球總重的1％-40％，包括激素類藥物如生長激素和胰島素；細胞因子如干擾素、白細胞介素、紅細胞生成素和腫瘤壞死因子等；溶血栓藥物如鏈激酶、尿激酶和纖溶酶原激活劑等；治療性抗體、細胞受體和疫苗，以及上述任意二種或二種以上藥物的組合物。其中優(yōu)選生長激素。
實驗證實，本發(fā)明具有下述優(yōu)點在內(nèi)水相中加入聚氧乙烯-聚氧丙稀嵌段共聚物可以顯著提高蛋白藥物對有機溶劑的穩(wěn)定性，避免蛋白藥物因在微球制備過程中被破壞而失去活性，進而提高蛋白藥物制劑的穩(wěn)定性與有效性，使得將更多的蛋白藥物制成長效制劑成為可能。


圖1是rhGH溶液與二氯甲烷劇烈攪拌1min后的SEC色譜圖，其中，虛線為未與有機溶劑接觸的rhGH溶液，實線為實驗組。箭頭所指色譜峰先后為rhGH的二聚體和單體，二聚體之前的色譜峰為rhGH的可溶性多聚體。下同。
圖2是rhGH溶液與二氯甲烷超聲混合1min后的SEC色譜圖。
圖3是含50mg/ml泊洛沙姆407的rhGH溶液與二氯甲烷劇烈攪拌1min后的SEC色譜圖。
圖4是含50mg/ml泊洛沙姆407的rhGH溶液與二氯甲烷超聲混合1min后的SEC色譜圖。
具體實施例方式
以下為本發(fā)明的實施例。給出具體實施例的目的是為了進一步闡明本發(fā)明，但并不限制其保護范圍。
實施例1生長激素穩(wěn)定性實驗配制含有各種穩(wěn)定劑與50mg/ml重組人生長激素(rhGH)的磷酸緩沖溶液(PBS，10mM，pH8.0)，取該溶液與二氯甲烷各0.2ml混合，劇烈攪拌或超聲1min，立即轉(zhuǎn)移水相并用PBS(pH8.0)反復萃取油相8至10次，合并萃取液后定容至10ml。將該溶液在4℃、3000rpm條件下離心30min，取上清液注入高效液相色譜系統(tǒng)進行測定。
樣品中rhGH的濃度采用分子排阻色譜(SEC)測定。色譜系統(tǒng)Agilent1100series；色譜柱TSK-Gel G2000SWXL(配備TSK-Guardcolumn SWXL預柱)；柱溫25℃；流動相3％異丙醇/97％磷酸緩沖溶液(0.063M，pH7.0)；流速0.6ml/min；檢測波長214nm；進樣量20μl。
由圖1和圖2可見，rhGH溶液與二氯甲烷混合后，無論攪拌還是超聲均可誘導rhGH發(fā)生嚴重的聚集，導致接近2/3的rhGH形成二聚體、可溶性多聚體與不溶性多聚體。
溶液中加入泊洛沙姆407可顯著提高rhGH對有機溶劑的耐受性，表現(xiàn)為與二氯甲烷接觸后，溶液中剩余的可溶性蛋白與單體蛋白含量顯著高于對照組以及其它處方。與對照組相比，泊洛沙姆188雖然未能增加水相中可溶性蛋白的含量，但卻使單體蛋白所占的比例明顯增大。由此可見，在乳化過程中，聚氧乙烯-聚氧丙稀嵌段共聚物，特別是泊洛沙姆407，對蛋白藥物具有穩(wěn)定作用。表1是rhGH與有機溶劑二氯甲烷接觸后的穩(wěn)定性。
表1高速攪拌 超聲混合濃度穩(wěn)定劑可溶性蛋白單體可溶性蛋白單體mg/ml％(a)％ ％％對照(b)70.3 31.666.7 35.8甘露醇 45 64.7 28.459.2 25.3海藻糖 45 66.2 29.061.0 23.7蔗糖 45 70.0 30.566.0 24.6吐溫20 20 80.2 54.2-(c)-聚乙烯醇 10 87.8 48.2- -聚乙二醇400 250 69.4 33.1- -牛血清白蛋白 20 69.3 32.6- -泊洛沙姆188 20 67.2 53.3- -泊洛沙姆407 20 96.4 84.5- -其中(a)可溶性蛋白指rhGH單體、二聚體以及單體-二聚體中間體；(b)對照組為經(jīng)有機溶劑處理過的rhGH-PBS溶液；(c)-代表未進行測定。
實施例2泊洛沙姆濃度對生長激素穩(wěn)定性的影響在含有50mg/ml rhGH的PBS(10mM，pH8.0)溶液中加入不同濃度的泊洛沙姆407，將該溶液作為內(nèi)水相與二氯甲烷混合，其余操作及測定方法同實施例1。表2是非離子型表面活性劑對rhGH穩(wěn)定性的影響。
表2高速攪拌 超聲混合濃度穩(wěn)定劑 可溶性蛋白 單體 可溶性蛋白 單體mg/ml％(a)％ ％ ％對照(b)64.1 30.164.223.62 57.9 34.263.133.6泊洛沙姆40720 87.2 73.056.648.650 97.5 90.097.089.120 74.9 59.386.163.7吐溫20 50 41.3 38.1-(c)-
其中(a)可溶性蛋白指rhGH單體、二聚體以及單體-二聚體中間體；(b)對照組為經(jīng)有機溶劑處理過的rhGH-PBS溶液；(c)-代表未進行測定。
結(jié)果表明，泊洛沙姆對蛋白的穩(wěn)定作用呈現(xiàn)濃度依賴性，泊洛沙姆濃度越高，蛋白穩(wěn)定效果越好，而且穩(wěn)定效果優(yōu)于同濃度的Tween 20溶液。由SEC圖譜(圖3和圖4)可見，含有泊洛沙姆407的溶液與有機溶劑接觸后，絕大多數(shù)蛋白藥物能夠保持其天然構(gòu)象，接近90％的蛋白仍然以單體形式存在(原料藥中原本含有約4.5％的非單體形式蛋白)。該結(jié)果再次證實聚氧乙烯-聚氧丙稀嵌段共聚物對蛋白藥物具有穩(wěn)定作用。
實施例3重組人生長激素微球的制備1取0.75grhGH溶解于8ml含有50mg/ml泊洛沙姆407和45mg/ml蔗糖的PBS溶液(10mM，pH8.0)中。將此溶液逐漸滴加至20ml含5g PLGA(75∶25，MW 15kD)的二氯甲烷溶液中，5000rpm乳化1min后，將形成的初乳滴加到300ml聚乙烯醇溶液(6％g/ml)中，1800rpm條件下攪拌1min，將該溶液傾入到2L蒸餾水中繼續(xù)以較低的速度攪拌4h，使有機溶劑揮發(fā)完全，得到載有生長激素的PLGA微球。將所得微球在抽濾器上抽濾收集，先后用蒸餾水和0.2％的泊洛沙姆188溶液各洗滌3次，真空干燥24h得微球粉末。
實施例4重組人生長激素微球的制備2取0.6g rhGH溶解于3ml含有40mg/ml泊洛沙姆407的PBS溶液(10mM，pH8.0)中。將此溶液逐漸滴加至20ml含4g PLGA(50∶50，MW 10kD)和0.12g ZnCO3的二氯甲烷溶液中，超聲乳化45s后，將形成的初乳滴加到300ml聚乙烯醇溶液(4.5％ g/ml)中，1500rpm條件下攪拌1min，將該溶液傾入到2L蒸餾水中繼續(xù)以較低的速度攪拌4h，使有機溶劑揮發(fā)完全，得到載有生長激素的PLGA微球。將所得微球在抽濾器上抽濾收集，先后用蒸餾水和0.2％的Tween 20溶液各洗滌3次，冷凍干燥24h得微球粉末。
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定蛋白藥物的方法，其特征在于采用在水相中加入非離子型表面活性劑提高微球制備過程中蛋白藥物的穩(wěn)定性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定蛋白藥物的方法，其特征在于所述非離子型表面活性劑為聚氧乙烯與聚氧丙稀的共聚物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的穩(wěn)定蛋白藥物的方法，其特征在于所述非離子型表面活性劑為聚氧乙烯與聚氧丙稀的ABA型嵌段共聚物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的穩(wěn)定蛋白藥物的方法，其特征在于所述聚氧乙烯與聚氧丙烯共聚物，其平均分子量為5,000-16,000，其中聚氧乙烯含量為60％-80％。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的穩(wěn)定蛋白藥物的方法，其特征在于所述聚氧乙烯與聚氧丙烯共聚物，其平均分子量為12,600，其中聚氧乙烯含量為70％。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的穩(wěn)定蛋白藥物的方法，其特征在于所述聚氧乙烯與聚氧丙烯共聚物，在水相中的濃度為0.2％-15％。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的穩(wěn)定蛋白藥物的方法，其特征在于所述聚氧乙烯與聚氧丙烯共聚物，在水相中的濃度為2％-10％。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定蛋白藥物的方法，其特征在于所述蛋白藥物為任何與有機溶劑接觸后易發(fā)生聚集的蛋白質(zhì)或多肽藥物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的穩(wěn)定蛋白藥物的方法，其特征在于所述蛋白藥物為重組人生長激素。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定蛋白藥物的方法，其特征在于所述微球制備過程包括將蛋白藥物的水溶液與含有生物降解材料的有機溶劑制成油包水型乳劑，所述的有機溶劑為二氯甲烷、氯仿和乙酸乙酯。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定蛋白藥物的方法，其特征在于所述微球制備材料為乳酸和羥基乙酸的單聚或共聚物、丙交酯和乙交酯的單聚或共聚物、聚己內(nèi)酯、聚酸酐、聚原酸酯、聚氨酯和聚碳酸酯，以及上述任意二種或二種以上材料的混合物或共聚物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的穩(wěn)定蛋白藥物的方法，其特征在于所述微球制備材料為乳酸-羥基乙酸共聚物，其平均分子量為4,000-1,000,000，末端為游離羧基或其它封閉基團，其中乳酸單體含量為1％-99％。
全文摘要
本發(fā)明屬藥物制劑領(lǐng)域，涉及一種提高蛋白藥物穩(wěn)定性的方法，以及該方法在微球制備中的應用。本發(fā)明采用在水相中加入非離子型表面活性劑聚氧乙烯與聚氧丙稀共聚物提高微球制備過程中蛋白藥物的穩(wěn)定性。本發(fā)明方法可以顯著提高蛋白藥物對有機溶劑的耐受性，避免蛋白藥物因在微球制備過程中發(fā)生聚集而失去活性，進而提高蛋白藥物制劑的穩(wěn)定性與有效性，使得將更多的蛋白藥物制成長效制劑成為可能。
文檔編號A61K47/32GK1575792SQ20041007171
公開日2005年2月9日 申請日期2004年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月25日
發(fā)明者魏剛, 陸麗芳, 陸偉躍 申請人:復旦大學, 上海復康醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司