專利名稱：一種華蟾素凍干粉針劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬中藥制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種華蟾素凍干粉針劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
華蟾素為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍等的干蟾皮經(jīng)提取制得的制劑，具解毒、消腫、止痛功效，用于中晚期腫瘤，慢性乙型肝炎等癥，其水溶性成分中除含有有效成分吲哚類生物堿外，如5-羥色胺，蟾蜍色胺、蟾蜍特尼、蟾蜍硫磺等，另外還含有一定量的氨基酸、還原糖、甾類、肽類、蟾蜍毒甙元與精氨酸復(fù)合物，研究表明蟾皮中含有的蟾毒內(nèi)酯類成分是其抗腫瘤的重要活性成分，又是毒性成分。近年來的藥理和臨床研究證明華蟾素除用于抗腫瘤和肝炎等之外還可用于頑固性呃逆、腦膜炎、扁平疣及銀屑病等。目前以華蟾素為主要成分的制劑有華蟾素口服液、華蟾素片、華蟾素注射液等。
華蟾素注射液(WS3-B-30)是干蟾皮經(jīng)提取加工的滅菌水溶液，該注射液制備方法未能有效提取蟾毒內(nèi)酯類成分，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只測(cè)定了以5-羥色胺計(jì)的吲哚類總生物堿的量，而沒有對(duì)另一重要既是毒性又是活性成分的蟾毒內(nèi)酯類成分進(jìn)行測(cè)定和控制，難以保證注射液的質(zhì)量和療效，注射液對(duì)穩(wěn)定性要求高，而水針劑存在的固有缺陷就是穩(wěn)定性問題和攜帶、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸時(shí)容易破碎，帶來許多麻煩。
專利(申請(qǐng)?zhí)?8103562)“一種華蟾素膠囊及其制備方法”用水提醇沉法提取有效成分制成膠囊劑，該發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，沒有新穎性；專利(申請(qǐng)?zhí)?0136668)“一種納米華蟾素制劑藥物及其制備方法”采用微波萃取、減壓濃縮、超音速射流技術(shù)制成納米華蟾素制劑藥物，此工藝的最大缺陷是未進(jìn)行精制，提取物中有害及無效雜質(zhì)多，制成注射劑型比較困難，同時(shí)該工藝的可實(shí)施性存在問題。
在資料檢索中未發(fā)現(xiàn)有關(guān)華蟾素凍干粉針劑的任何報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開一種有效成分含量高、療效好、毒性小、方便使用的華蟾素凍干粉針制劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述凍干粉針制劑的制備方法。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
一、制備方法(1)原料藥干蟾皮。
(2)取干蟾皮，洗凈，加5～6倍80％乙醇回流提取二次，第一次45分鐘，第二次30分鐘，合并乙醇液，濾過，濾液濃縮至含1g生藥/ml，濃縮液離心30分鐘(2500r/min)，取上清液，上大孔吸附樹脂柱吸附，先用3-4倍柱體積水洗脫，再用3-5倍柱體積30％-50％乙醇洗脫，取乙醇洗脫液減壓濃縮，干燥，得華蟾素醇提物。
(3)制劑處方華蟾素醇提物5.5-7.5重量份，藥用輔料90-100重量份。
(4)取上述華蟾素醇提物和藥用輔料混合，加注射用水溶解，加注射用水至規(guī)定量，調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0，超濾，灌裝，冷凍干燥，即得。
在華蟾素凍干粉針劑的制備中，我們采用乙醇回流提取，大孔樹脂分離純化得到華蟾素醇提物，該提取工藝既可以提取干蟾皮水溶性的吲哚類總生物堿，又可以提取出干蟾皮中的蟾毒內(nèi)酯類成分，最大程度地保留了發(fā)揮作用的活性成分，同時(shí)采用大孔樹脂純化，最大程度地除去了提取物中含有的雜質(zhì)，使華蟾素醇提物中吲哚類總生物堿的含量達(dá)到30％以上，蟾毒內(nèi)酯類成分華蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量分別達(dá)到0.02％和0.014％。由于蟾毒內(nèi)酯類既是重要的活性成分，又是毒性成分，我們對(duì)華蟾酥毒基和脂蟾毒配基進(jìn)行定量檢測(cè)，能更好保證制劑的有效性、安全性和穩(wěn)定性。
超濾技術(shù)是通過膜表面的微孔結(jié)構(gòu)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行選擇性分離。當(dāng)液體混合物在一定壓力下流經(jīng)膜表面時(shí)，小分子溶質(zhì)透過膜(稱為超濾液)，而大分子物質(zhì)則被截留，使原液中大分子濃度逐漸提高(稱為濃縮液)，從而實(shí)現(xiàn)大、小分子的分離濃縮、凈化的目的。中藥中的有效成分如生物堿、黃酮類、苷類等分子量較小，而無效成分通常如蛋白質(zhì)、糅質(zhì)、樹脂、淀粉等分子量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，通過選擇性截留，可以更好純化藥物有效成分。為更有效地除去藥液中的細(xì)菌、熱原及一些大分子雜質(zhì)，本發(fā)明經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，制劑工藝中采用截留分子量10000-30000的超濾膜進(jìn)行超濾，進(jìn)一步提高了制劑質(zhì)量，其中超濾膜材料可以為聚丙烯腈(PAN)或聚醚砜(PES)中的一種。
藥理實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的華蟾素凍干粉針劑具有更好的藥理作用。
二、制劑含量分析1、制劑中的吲哚類總生物堿含量1.1儀器與試藥Hitach UV-2000紫外分光光度計(jì)，華蟾素注射液(安徽金蟾藥業(yè)總公司)；本發(fā)明華蟾素凍干粉針劑(廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實(shí)驗(yàn)室提供)；5-羥色胺對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。
1.2實(shí)驗(yàn)方法參照華蟾素注射液(WS3-B-30)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1。
表1 制劑中吲哚類總生物堿(以5-羥色胺計(jì))含量組 別 吲哚類總生物堿含量(mg/支)華蟾素注射液 2.62本發(fā)明華蟾素凍干粉針劑 3.90
以上制劑含量測(cè)定結(jié)果說明，本發(fā)明的華蟾素凍干粉針劑由于采用新的制備方法，主要有效成分吲哚類總生物堿(以5-羥色胺計(jì))含量比華蟾素注射液有顯著提高。
2、制劑中蟾酥毒基和脂蟾毒配基類成分含量2.1儀器與試藥Waters高效液相色譜儀(600泵，2487檢測(cè)器)，Millinium32色譜處理軟件；華蟾素注射液(安徽金蟾藥業(yè)總公司)；本發(fā)明華蟾素凍干粉針劑(廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實(shí)驗(yàn)室提供)；華蟾酥毒基對(duì)照品和脂蟾毒配基對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。
2.2實(shí)驗(yàn)方法參照《中國(guó)藥典》2000版一部316頁(yè)蟾酥項(xiàng)下含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。
表2 制劑中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量組 別華蟾酥毒基(μg/支) 脂蟾毒配基(μg/支)華蟾素注射液 0.318 0.220本發(fā)明華蟾素凍干粉針劑1.203 0.814以上含量測(cè)定結(jié)果表明，華蟾素注射液中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量較少，本發(fā)明華蟾素凍干粉針劑華蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量明顯提高。
三、華蟾素醇提物含量分析提取物1(本發(fā)明華蟾素醇提物)；提取物2(按照華蟾素注射液的制備方法制備)。
根據(jù)制劑的含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，華蟾素醇提物的含量測(cè)定結(jié)果如表3。
表3 提取物的含量測(cè)定組 別 提取物1 提取物2吲哚類總生物堿(％) 32.5 15.4
華蟾酥毒基(％)0.0200.0037脂蟾毒配基(％)0.0140.0026以上含量測(cè)定結(jié)果表明，本發(fā)明華蟾素凍干粉提取物純度明顯提高，其中吲哚類總生物堿(以5-羥色胺計(jì))含量大于30％。
四、藥理毒理實(shí)施例1.抗乙型肝炎病毒實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用垂直傳播感染DHBV脫氧核糖核酸(DNA)陽(yáng)性麻鴨，每組均為10只隨機(jī)選擇的5月齡麻鴨。各組麻鴨體重和性別比相近。都在相同條件下飼養(yǎng)。
實(shí)驗(yàn)藥物生理鹽水(廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實(shí)驗(yàn)室提供)；華蟾素注射液(安徽金蟾藥業(yè)總公司)；本發(fā)明華蟾素凍干粉針劑(廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實(shí)驗(yàn)室提供)實(shí)驗(yàn)方法麻鴨腿部肌肉注射給藥劑量為1.5g生藥/kg，連續(xù)12周，每周3次隔日給藥，DHBV陽(yáng)性對(duì)照組給藥時(shí)注射2ml/kg生理鹽水，以上各組分別在給藥前、給藥后第4周、第8周、第12周和停藥后第2周靜脈采血，用32p標(biāo)記的HBV DNAt探針作血清斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。
表4 麻鴨血清DHBV DNA測(cè)定結(jié)果采血時(shí)間組別給藥前 第4周第8周第12周 停藥后2周A1 +++ +++A2 +++++A3 +++ ++ ++A4 +++++ +對(duì)照組A5 ++ +++ ++ ++A6 ++-++A7 +++++A8 +++ ++ +++A9 +++++A10 +++++華蟾素 B1 +----注射液組B2 +----
B3 +++ ++ + ++B4 ++++ +++ ++++B5 +-- --B6 +++ +-B7 ++- --B8 +-- --B9 +-- --B10 +++ --C1 +-- --C2 +-- --C3 +-- --C4 ++ ++ + ++本發(fā)明華蟾素C5 +++ +-凍干粉針組C6 +-- --C7 +-- --C8 +-- --C9 +-- --C10 ++++ ++ + --++++相當(dāng)于DHBV DNA含量為100pg，+++為50pg，++為25pg，+為10pg，2.對(duì)小鼠移植性腫瘤S180的生長(zhǎng)抑制作用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康小鼠，體重18-22g，雌雄各半。
瘤株肉瘤S180，由廣東藥物所引進(jìn)，廣州腫瘤研究所傳代接種。
實(shí)驗(yàn)藥物生理鹽水(廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實(shí)驗(yàn)室提供)；華蟾素注射液(安徽金蟾藥業(yè)總公司)；本發(fā)明華蟾素凍干粉針劑(廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實(shí)驗(yàn)室提供)實(shí)驗(yàn)方法取健康、腫瘤生長(zhǎng)旺盛的肉瘤S180荷瘤小鼠，處死后取出瘤塊，在勻漿器中加入生理鹽水，制成腫瘤勻漿液，再以生理鹽水1∶3稀釋，然后取0.2ml注入小鼠左腋下皮下，24小時(shí)稱重，取實(shí)驗(yàn)藥物，注射給藥劑量為0.65g生藥/kg，每日小鼠尾靜脈給藥一次，對(duì)照組給藥時(shí)注射0.2ml生理鹽水，連續(xù)給藥10天。停藥次日處死小鼠，稱體重并小心剝離皮下瘤塊，于EM50電子天平稱取瘤重。結(jié)果見表5。
表5 對(duì)小鼠肉瘤S180的生長(zhǎng)抑制作用組別 瘤體重量(g) 抑瘤率％
生理鹽水2.0214華蟾素注射液1.0476 48.17*本發(fā)明華蟾素凍干粉針劑 0.9169 54.64*#注與生理鹽水組比較*P＜0.01，與陽(yáng)性對(duì)照組比較#P＜0.05以上藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明華蟾素凍干粉針劑與華蟾素注射液相比具有更好的藥理作用。
3.長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)取健康大鼠80只(wistar種)，分大劑量(3g生藥/kg)、中劑量(1.5g生藥/kg)和小劑量(0.8g生藥/kg)和空白對(duì)照組4組，每組20只，雌雄各半，每天尾靜脈給藥一次，給藥7天后停一天，繼續(xù)給藥，連續(xù)給藥7周，對(duì)照組給予生理鹽水，觀察給藥前期、中期、后期、停藥15天后的外觀行為、活動(dòng)、毛皮、食量、分辯等變化，并進(jìn)行血常規(guī)化驗(yàn)及肝、腎功能檢查，記錄心電圖、每隔10天稱重，調(diào)整給藥劑量，各組實(shí)驗(yàn)大鼠分批處死，第一批停藥后2天處死一半，其余停藥后15天處死，處死后取心肝脾胃肺腎腎上腺淋巴結(jié)胰胸腺和睪丸或子宮、卵巢等器官，并常規(guī)石蠟切片，HE染色的病理切片進(jìn)行光鏡檢查，結(jié)果表明，各劑量組血液生化指標(biāo)、肝腎功能及各器官組織切片與對(duì)照組比較，均屬正常范圍，未見明顯中毒病變。
五、制備實(shí)施例實(shí)施例1(1)原料藥為干蟾皮500g。
(2)取干蟾皮，洗凈，加5倍80％乙醇回流提取二次，第一次45分鐘，第二次30分鐘，合并乙醇液，濾過，濾液濃縮至含1g生藥/ml，濃縮液離心30分鐘(2500r/min)，取上清液，上D101大孔吸附樹脂吸附，先用3倍柱體積水洗脫，再用4倍柱體積40％乙醇洗脫，取乙醇洗脫液減壓濃縮，干燥，得華蟾素醇提物6.1g。
(3)制劑處方華蟾素醇提物6.1g，甘露醇90g。
(4)取上述華蟾素醇提物和藥用輔料混合，加注射用水溶解，加注射用水至規(guī)定量，調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0，用截留分子量10000的超濾膜超濾，灌裝，冷凍干燥，即得。
實(shí)施例2(1)原料藥原料藥為干蟾皮450g。
(2)取干蟾皮，洗凈，加6倍80％乙醇回流提取二次，第一次45分鐘，第二次30分鐘，合并乙醇液，濾過，濾液濃縮至含1g生藥/ml，濃縮液離心30分鐘(2500r/min)，取上清液，上AB-8大孔吸附樹脂吸附，先用4倍柱體積水洗脫，再用3倍柱體積35％乙醇洗脫，取乙醇洗脫液減壓濃縮，干燥，得華蟾素醇提物5.5g。
(3)制劑處方華蟾素醇提物5.5g，聚乙烯吡咯烷酮95g。
(4)取上述華蟾素醇提物和藥用輔料混合，加注射用水溶解，加注射用水至規(guī)定量，調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0，用截留分子量20000的超濾膜超濾，灌裝，冷凍干燥，即得。
實(shí)施例3(1)原料藥原料藥為干蟾皮550g。
(2)取干蟾皮，洗凈，加6倍80％乙醇回流提取二次，第一次45分鐘，第二次30分鐘，合并乙醇液，濾過，濾液濃縮至含1g生藥/ml，濃縮液離心30分鐘(2500r/min)，取上清液，上NKA-9大孔吸附樹脂吸附，先用4倍柱體積水洗脫，再用5倍柱體積30％乙醇洗脫，取乙醇洗脫液減壓濃縮，干燥，得華蟾素醇提物。
(3)制劑處方華蟾素醇提物7.5g，果糖90g。
(4)取上述華蟾素醇提物和藥用輔料混合，加注射用水溶解，加注射用水至規(guī)定量，調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0，用截留分子量30000的超濾膜超濾，灌裝，冷凍干燥，即得。
實(shí)施例4(1)原料藥原料藥為干蟾皮500g。
(2)取干蟾皮，洗凈，加6倍80％乙醇回流提取二次，第一次45分鐘，第二次30分鐘，合并乙醇液，濾過，濾液濃縮至含1g生藥/ml，濃縮液離心30分鐘(2500r/min)，取上清液，上AB-8大孔吸附樹脂吸附，先用4倍柱體積水洗脫，再用3倍柱體積50％乙醇洗脫，取乙醇洗脫液減壓濃縮，干燥，得華蟾素醇提物。
(3)制劑處方華蟾素醇提物6.4g，乳糖100g。
(4)取上述華蟾素醇提物和藥用輔料混合，加注射用水溶解，加注射用水至規(guī)定量，調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0，超濾，用截留分子量10000的超濾膜灌裝，冷凍干燥，即得。
實(shí)施例5(1)原料藥原料藥為干蟾皮480g。
(2)取干蟾皮，洗凈，加6倍80％乙醇回流提取二次，第一次45分鐘，第二次30分鐘，合并乙醇液，濾過，濾液濃縮至含1g生藥/ml，濃縮液離心30分鐘(2500r/min)，取上清液，上D101大孔吸附樹脂吸附，先用4倍柱體積水洗脫，再用4倍柱體積40％乙醇洗脫，取乙醇洗脫液減壓濃縮，干燥，得華蟾素醇提物。
(3)制劑處方華蟾素醇提物5.8g，葡聚糖94.2g。
(4)取上述華蟾素醇提物和藥用輔料混合，加注射用水溶解，加注射用水至規(guī)定量，調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0，用截留分子量20000的超濾膜超濾，灌裝，冷凍干燥，即得。
實(shí)施例6(1)原料藥原料藥為干蟾皮520g。
(2)取干蟾皮，洗凈，加5倍80％乙醇回流提取二次，第一次45分鐘，第二次30分鐘，合并乙醇液，濾過，濾液濃縮至含1g生藥/ml，濃縮液離心30分鐘(2500r/min)，取上清液，上NKA-9大孔吸附樹脂吸附，先用4倍柱體積水洗脫，再用5倍柱體積35％乙醇洗脫，取乙醇洗脫液減壓濃縮，干燥，得華蟾素醇提物。
(3)制劑處方華蟾素醇提物7.2g，甘露醇92.8g。
(4)取上述華蟾素醇提物和藥用輔料混合，加注射用水溶解，加注射用水至規(guī)定量，調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0，用截留分子量10000的超濾膜超濾，灌裝，冷凍干燥，即得。
權(quán)利要求
1.一種華蟾素凍干粉針劑，其特征在于它是由華蟾素醇提物5.5-7.5重量份和藥用輔料90-100重量份制成，其中華蟾素有效部位中吲哚類總生物堿含量大于或等于30％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種華蟾素凍干粉針劑，其制備方法包括以下步驟(1)原料藥為干蟾皮；(2)取干蟾皮，洗凈，加5～6倍80％乙醇回流提取二次，第一次45分鐘，第二次30分鐘，合并乙醇液，濾過，濾液濃縮至含1g生藥/ml，以2500r/min轉(zhuǎn)速濃縮液離心30分鐘，取上清液，上大孔吸附樹脂吸附，先用3-4倍柱體積水洗脫，再用3-5倍柱體積30％-50％乙醇洗脫，取乙醇洗脫液減壓濃縮，干燥，得華蟾素醇提物；(3)取上述華蟾素有效部位和藥用輔料混合，加注射用水溶解，加注射用水至規(guī)定量，調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0，超濾，灌裝，冷凍干燥，即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的華蟾素凍干粉針劑，其中藥用輔料為甘露醇、乳糖、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的華蟾素凍干粉針劑，其中大孔吸附樹脂為非極性或弱極性。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的華蟾素凍干粉針劑，其中大孔吸附樹脂洗脫的乙醇濃度為35％-45％。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的華蟾素凍干粉針劑，其中超濾用超濾膜截留分子量為10000-30000。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的華蟾素凍干粉針劑，其中超濾所用超濾膜材料為聚丙烯腈或聚醚砜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種華蟾素凍干粉針劑及其制備方法。它是由干蟾皮提取的華蟾素有效部位和藥用輔料制備而成。華蟾素有效部位采用乙醇提取、離心、大孔吸附樹脂分離純化的方法獲得，其中的主要有效成分吲哚類總生物堿含量大于30％。含量測(cè)定結(jié)果和藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明華蟾素凍干粉針劑的有效成分含量更高，藥理作用更強(qiáng)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1634577SQ20041008399
公開日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2004年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月15日
發(fā)明者張平 申請(qǐng)人:張平