專利名稱：一種疏血通凍干粉針制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種疏血通凍干粉針制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
地龍為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、威廉毛蚓或拮盲環(huán)毛蚓的全身，具有清熱定驚、通絡(luò)、平喘、利尿的作用，用于高熱神昏、驚癇、關(guān)節(jié)痹痛、肢體麻木、半身不遂、肺熱喘咳、尿少水腫、高血壓病，已有數(shù)千年的使用歷史，1983年Mihara等首次發(fā)現(xiàn)蚯蚓水提物有直接溶解纖維蛋白及激活纖溶酶原的作用，并命名為“蚓激酶”，健康人應(yīng)用本品后，纖維蛋白平板法測得外周血優(yōu)球蛋白的纖溶活性明顯增高，優(yōu)球蛋白溶解時間明顯縮短，認為該提取物是新型溶栓劑，地龍富含蚓激酶，蚓激酶為具有激酶和纖溶酶雙重功能的絲氨酸蛋白酶，富含酸性氨基酸，等電點3-5，相對分子質(zhì)量為2.0×104-4.0×104，纖溶活性強，藥理作用廣泛，口服有效，不良反應(yīng)輕；水蛭是我國傳統(tǒng)中藥，1800年前《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載。中醫(yī)認為它有破血、逐瘀、通經(jīng)的療效，主要用于治療瘕癥、痞塊、血瘀、閉經(jīng)和跌打損傷，西方也常用水蛭吸血以治療某些疾病。從水蛭及其唾液腺中已提取出多種活性成分，水蛭素是其中活性最顯著并且研究得最多的一種成分，它是由65-66個氨基酸組成的小分子蛋白質(zhì)(多肽)，水蛭素對凝血酶有極強的抑制作用，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)最強的凝血酶天然特異抑制劑，動物試驗與臨床研究表明，水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成，以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反應(yīng)等進一步血瘀現(xiàn)象，此外，它還能抑制凝血酶誘導(dǎo)的成纖維細胞的增殖和凝血酶對內(nèi)皮細胞的刺激。與肝素相比，它不僅用量少，不會引起出血，也不依賴于內(nèi)源性輔助因子，而肝素則有引起出血的危險，在彌漫性血管內(nèi)凝血的發(fā)病過程中抗凝血酶III往往減少，這將限制肝素的療效，采用水蛭會有較好的效果，水蛭素是一類很有前途的抗凝化瘀藥物，它可用于治療各種血栓疾病尤其是靜脈血栓和彌漫性血管凝血的治療；也可用于外科手術(shù)后預(yù)防動脈血栓的形成，預(yù)防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成，改善體外血液循環(huán)和血液透析過程，水蛭素比較穩(wěn)定，胰蛋白酶和糜蛋白酶并不破壞其活性，而且水蛭素的某些水解片段仍有抑制凝血酶的作用；凝血酶是導(dǎo)致血栓的主要因素之一，而血栓的形成是導(dǎo)致心腦血管疾病的主要原因。心腦血管疾病是目前危害人類生命和健康的主要疾病之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，全世界每年大約有1700萬人死于心腦血管病，即全球每3個死亡者中就有1個死于心腦血管疾病。預(yù)計到2020年，因心腦血管疾病死亡的的人數(shù)將比該數(shù)字增加50％，高達2500萬人。我國60歲以上人口已超過一億，這個年齡層次發(fā)病率每年在5％以上，即我國每年有500萬人以上需用抗凝藥物來防治和治療心腦血管疾病，并且這類疾病已經(jīng)向年輕化發(fā)展。若按1％人數(shù)計算，發(fā)病率的基數(shù)會更大。
專利“治療心腦血管疾病的注射制劑的制造方法及其產(chǎn)品”(申請?zhí)?3148281.3)公開了應(yīng)用水蛭、地龍制備注射制劑的工藝方法，該專利在分離純化過程中應(yīng)用105-136℃熱壓10-45分鐘，在此劇烈條件下，水蛭素、蚓激酶將全部失去活性。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述原因，本發(fā)明采用水為溶劑提取水蛭素、蚓激酶，采用超濾法、陰離子交換和陽離子交換柱層析法進行除雜，再用反滲透膜技術(shù)除去提取過程產(chǎn)生的鹽類物質(zhì)，使水蛭素、蚓激酶的純度大大提高，加入我們在實驗過程中發(fā)現(xiàn)的酶保護劑酪氨酸，延長了水蛭素、蚓激酶保持活性的時間，制備成凍干粉針劑，具有更好的藥理作用。
酪氨酸是一種基本氨基酸，我們在研究疏血通凍干粉針劑的過程中，加入酪氨酸，對該制劑中的水蛭素、蚓激酶的活性有保護作用，大大延長其活性的保持時間。
本發(fā)明提供了一種地龍、水蛭制成的凍干粉針劑，其中水蛭素、蚓激酶在活性成分中的含量不小于90％。
本發(fā)明還提供了上述藥物的一種制備方法。
一.工藝制法(1)本發(fā)明原料藥重量配比為水蛭6-7.5重量份，地龍2.5-4重量份；(2)取鮮水蛭、地龍，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動絞肉機破碎，再用超聲波低溫破碎；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-30℃冰柜凍結(jié)24小時，再用流水解凍，再次凍結(jié)，反復(fù)凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機離心沉淀，吸取上清液備用；(3)將上清液用截留分子量為50000-100000的中空纖維柱進行超濾，超濾至原溶液體積的1/3-1/2時，加水至原體積，反復(fù)操作3-5次，合并透過液，20℃時濃縮至相對密度為1.05-1.10的溶液；(4)將濃縮的過濾液用緩沖液調(diào)PH值為6.0-7.0，離子強度為0.01mol/l通過陽離子交換柱，用緩沖液洗4-6倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調(diào)PH值為6.0-7.0通過陰離子交換柱，分別用PH值為6.0-7.0的緩沖液洗3倍柱體積，洗脫液棄去，最后用PH值為6.0-7.0的緩沖液加入0.2-0.5mol/l的氯化鈉進行洗脫，收集洗脫液，洗脫至紫外檢測器檢測不到吸收為止；(5)洗脫液濃縮脫鹽，得到半成品；(6)將半成品加入酶保護劑酪氨酸和藥用輔料，用注射用水調(diào)整濃度后，分裝到西林瓶中，進行冷凍干燥，軋蓋，檢測，得到凍干粉針劑。
其中，步驟(3)中透過液的濃縮，是采用反滲透膜法濃縮。
步驟(4)中緩沖液為磷酸鹽緩沖液和三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCL)的一種；陽離子交換柱為選自CM-交聯(lián)葡聚糖、CM-瓊脂糖、CM-纖維素、SP-交聯(lián)葡聚糖、SP-瓊脂糖、SP-纖維素中的一種；陰離子交換柱為選自DEAE-交聯(lián)葡聚糖、DEAE-瓊脂糖、DEAE-纖維素、Q-交聯(lián)葡聚糖、Q-瓊脂糖、Q-纖維素中的一種。
二.檢測分析采用高效液相色譜法對水蛭素、蚓激酶(以黃嘌呤計)進行檢測。
1.實驗儀器waters600E型高效液相色譜儀，996PDA檢測器，色譜柱日本TOSOHTSK2000SW 7.5*3002.實驗藥物本發(fā)明凍干粉針劑(廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實驗室提供)2.色譜條件工作站millennium chromatogvaph流動相0.01mol/L、PH值7.2的磷酸緩沖溶液(配制方法按照中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標準2000年版，中國生物制品標準委員會編，化學(xué)工業(yè)出版社，P13-14配置) 。
3.樣品制備取本發(fā)明動干粉針劑，加入注射用水溶解完全，用多肽純化離心管，進行離心分離，取離心液體即為樣品。
4.上樣取上述處理的樣品用微量注射器吸取定量液體，注入進樣器進行檢測。
5.結(jié)果經(jīng)過計算水蛭素、蚓激酶的占活性成分的含量為91.3％。
三.本發(fā)明凍干粉針劑比活的檢測1.實驗原理天然水蛭素、蚓激酶的活性檢測國家尚未公布標準的檢測方法，根據(jù)凝血酶活性的檢測方法(中國生物制品規(guī)程2000年版附錄1)，依據(jù)水蛭素、蚓激酶與凝血酶是成比例結(jié)合，消耗一個凝血酶單位相等于一個抗凝血單位(ATU)的原則，采用試管法(連續(xù)稀釋法)檢測水蛭素、蚓激酶的抗凝血單位的效價。
2.實驗材料5g/L纖維蛋白原的生理鹽水溶液，注射用生理鹽水(廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實驗室實驗室提供)冷凍干燥凝血酶(安徽桑原生物技術(shù)研究所購買，每瓶含量為500IU，用時用生理鹽水稀釋至每毫升含凝血酶0.5IU)3.待測樣品本專利凍干粉針劑(廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實驗室提供)4.檢測方法取10×80mm試管8支，在每支試管中加入生理鹽水0.2ml(第一管不加)，于第一管中加入待測樣品0.2ml；第二管中加入0.2ml，充分混勻后吸取0.2ml加入第三管，以次例推，直至加到第7管，將多余的0.2ml混合液廢棄，此時各試管都為0.2ml，但濃度依次為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64，第8管因不含水蛭素、蚓激酶，作為試驗對照，加樣結(jié)束后，放到37℃水浴使樣品與凝血酶作用5-10min，再于各試管中加入5g/l纖維蛋白原溶液0.2ml，再放入37℃水浴，觀察記錄1-24小時結(jié)果，并進行計算。計算方法為發(fā)生凝固或沉淀的試管為無抗凝血酶活性(陰性)，不凝固或無沉淀產(chǎn)生的試管為具有抗凝血酶活性。
5.比活性計算采用中國生物制品規(guī)程(一部)微量法，用BCATM Protein Assay測定分離組分的蛋白質(zhì)含量，根據(jù)抗凝血酶活性測定結(jié)果計算每毫克蛋白質(zhì)的抗凝血酶比活性。根據(jù)實驗發(fā)現(xiàn)，天然水蛭素、蚓激酶體外測定結(jié)果與體內(nèi)測定結(jié)果有正相關(guān)性。
6.實驗結(jié)果本發(fā)明凍干粉針劑的比活為203.1IU/mg.
四.不同制劑活性保持時間比較實驗藥物本發(fā)明凍干粉針劑為實驗組1、采用本發(fā)明提取純化工藝進行制備的半成品不加入酪氨酸制備的凍干粉針劑為實驗組2(廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實驗室提供)實驗方法將不同制劑放置在相同條件下0個月、3個月、6個月、12個月、18個月、24個月，按照上述實驗三的方法進行比活檢測，檢測結(jié)果見表1.
表1 不同制劑的比活比較24個月的0個月的比活 3個月的比活 6個月的比活 12個月的比活 18個月的比活組別 比活(IU/mg) (IU/mg) (IU/mg) (IU/mg)(IU/mg)(IU/mg)實驗組1203.1202.0 198.7190.4 185.6 179.9實驗組2203.2185.3 161.9130.2 112.7 107.3結(jié)論本發(fā)明凍干粉針劑在24個月時保持80％的活性，而不加入酪氨酸的凍干粉針劑在24個月時只剩50％左右的活性，充分說明本發(fā)明工藝中加入酶保護劑酪氨酸的重要意義。
五.毒理實驗研究1.急性毒性實驗實驗動物健康小鼠18-22g，，雌雄各半。
實驗藥物本發(fā)明凍干粉針劑(廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實驗室提供)實驗方法按照人體給藥的500倍、1000倍、1500倍、2000倍、2500倍、3000倍、4000倍的給藥量尾靜脈給小鼠，陰性對照組給予對應(yīng)劑量的生理鹽水，動物自由攝水飲食觀察動物的生命活動及死亡情況，給藥后10d將存活的小鼠宰殺，取其全血測定其外周血的各項指標的變化，采用改良寇氏法(第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2002年第7期，667-669)求LD50。
實驗結(jié)果本發(fā)明凍干粉針劑的LD50為117.9g/kg，為臨床用藥量的2947倍，表明本發(fā)明凍干粉針劑的毒性較低，臨床用藥屬于安全。
2.長期毒性實驗實驗動物健康大鼠300-400克，，雌雄各半。
實驗藥物本發(fā)明凍干粉針劑(廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實驗室提供)實驗方法將本發(fā)明凍干粉針劑按照人體給藥10倍、63倍、375倍的三個劑量給大鼠尾靜脈注射，空白組給予對應(yīng)劑量的生理鹽水，連續(xù)30天，檢測各項指標。
實驗結(jié)果各給藥組的一般行為表現(xiàn)、攝食量、體重增長率、血液學(xué)、血清生化檢查、臟器系數(shù)、組織病理學(xué)檢查等指標，與空白對照組比較，均無明顯差異，說明本發(fā)明凍干粉針劑在臨床應(yīng)用量10-375倍劑量范圍內(nèi)，對大鼠無明顯毒副作用。
六.藥理實施例實施例1抑制血小板聚集的實驗實驗動物SD大鼠，體重200～250g，雌雄各半。
實驗藥物疏血通注射液(牡丹江友搏藥業(yè)有限責(zé)任公司)本發(fā)明凍干粉針劑(廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實驗室提供)生理鹽水實驗方法取大鼠，分為本發(fā)明凍干粉針劑組、疏血通注射液組、生理鹽水組，給藥劑量40mg/kg，生理鹽水等容不等量2次/日，次日給藥1次后用1％戊巴比妥鈉(劑量0 5ml/100g)腹腔注射麻醉。按文獻(朱益棟主編彌散性血管內(nèi)凝血北京人民衛(wèi)生出版社，1982；279 293)的方法復(fù)制大鼠高凝血癥模型。復(fù)制模型后即刻從頸動脈取血3ml，38％枸櫞酸鈉抗凝(1∶10)，制成富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)，計算血小板凝集率，血小板聚集率用SPA-4型血小板聚集儀測定，促聚劑用二磷酸腺苷，(ADP)，濃度10μmol/L。測定指標有一分鐘聚集率(A1，)、最大聚集率(Amax)和最大聚集時間(Tmax)。見表2表2不同制劑血小板凝集率的比較動物數(shù) A1AmaxTmax組別(只) (％) (％)(s)生理鹽水組 10 28±726±964±29疏血通注射液組 10 13±10*15±10*60±28本發(fā)明凍干粉針劑組 10 8±3**7±4**55±21注與生理鹽水組比較**P＜0.01，*P＜0.05實施例2利用血栓法測定對大白鼠血栓形成的影響。
實驗藥物生理鹽水(空白組)疏血通注射液(牡丹江友搏藥業(yè)有限責(zé)任公司)本發(fā)明凍干粉針劑(廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實驗室提供)實驗動物體重300-400克的大白鼠30只，雌雄不分。分成三組，每組10只。
實驗方法將大鼠給藥，給藥劑量40mg/kg，生理鹽水等容不等量，給藥后將大白鼠麻醉(戊巴比妥鈉30-40mg/kg，ip)，仰臥位固定，分離氣管，插入一塑料套管，并分離右頸總動脈及左頸外靜脈，在聚乙烯管的中段放入一根長6厘米的絲線，以肝素生理鹽水溶液，充滿聚乙烯管，當聚乙烯管的一端插入左頸外靜脈后，由聚乙烯管準確的注入肝素抗凝，然后再將聚乙烯管的另一端插入右頸總動脈，打開動脈夾，血液從右頸總動脈流至聚乙烯管，返回左頸外靜脈，開放血流15分鐘后斷血流，迅速取出絲線稱重，總重量減去絲線重量即得血栓重量。將空白組和另外兩組給藥組的動物血栓濕重進行記錄，進行計算，如表3所示
表3各給藥組的血栓重量動物數(shù)血栓濕重組別(只)(mg)生理鹽水組10 35.12±0.91疏血通注射液組10 24.38±0.77*本發(fā)明凍干粉針劑組10 11.16±0.09**注與生理鹽水組比較**P＜0.01，*P＜0.05實施例3對小鼠ADP誘導(dǎo)的血栓性死亡的影響實驗藥物生理鹽水(空白組)疏血通注射液(牡丹江友搏藥業(yè)有限責(zé)任公司)本發(fā)明凍干粉針劑(廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實驗室提供)實驗方法取健康小鼠60只，雌雄各半，隨機分成3組生理鹽水組、本發(fā)明凍干粉針劑組、市售疏血通注射液組每日尾靜脈給藥，給藥量57mg/kg，連續(xù)7d，于末次給藥后1h尾靜脈注射ADP48.0mL/kg，記錄動物死亡情況。見表4表4各組制劑對小鼠ADP誘導(dǎo)的血栓性死亡的影響比較組別總數(shù)/只 死亡數(shù)/只死亡率生理鹽水組 2020100％疏血通注射液組 201470.0％本發(fā)明凍干粉針劑組 208 40.0％實施例4利用在體心肌梗死法測定本發(fā)明凍干粉針劑和對大白鼠心肌梗死情況的影響。
實驗藥物疏血通注射液(牡丹江友搏藥業(yè)有限責(zé)任公司)本發(fā)明凍干粉針劑(廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實驗室提供2.實驗動物雄性大鼠250-300克20只，分成兩組。
3.實驗方法取雄性大鼠20只，烏拉坦0.65g/kg腹腔淺麻醉后，背位固定，用大半個橡皮球連接到人工呼吸機，進行人工呼吸，大鼠胸部去毛、消毒，沿左鎖骨中線切開皮膚約2厘米，在第四或第五肋間鈍性分離基層，打開胸腔，剪開心包，輕壓右側(cè)胸廓，擠出心臟，在動脈圓錐與左心耳之間冠狀靜脈處節(jié)扎左冠脈后，把心臟放回胸腔，迅速縫合胸腔，停止人工呼吸，分別用兩種制劑對10只大鼠進行實驗，得到數(shù)據(jù)計算如表5所示表5兩組制劑的藥理學(xué)比較組別 顯效率有效率無效率總有效率疏血通注射液18.3％ 54.0％27.7％72.3％本發(fā)明凍干粉針劑34.1％ 58.2％7.7％ 92.3％結(jié)論從實驗我們可以得知，本發(fā)明凍干粉針劑與疏血通注射液相比較具有更好的藥理作用。
四.制備實施例實施例1(1)本發(fā)明原料藥重量配比為水蛭6000克，地龍4000克；(2)取鮮水蛭、地龍，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動絞肉機破碎，再用超聲波低溫破碎；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-30℃冰柜凍結(jié)24小時，再用流水解凍，再次凍結(jié)，反復(fù)凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機離心沉淀，吸取上清液備用；(3)將上清液用截留分子量為50000的中空纖維柱進行超濾，超濾至原溶液體積的1/3時，加水至原體積，反復(fù)操作3次，合并透過液，20℃時濃縮至相對密度為1.05的溶液；
(4)將濃縮的過濾液用磷酸鹽緩沖液調(diào)PH值為6.0，離子強度為0.01mol/l通過CM-交聯(lián)葡聚糖陽離子交換柱，用緩沖液洗4倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調(diào)PH值為6.0通過DEAE-交聯(lián)葡聚糖陰離子交換柱，分別用PH值為6.0的緩沖液洗3倍柱體積，洗脫液棄去，最后用PH值為6.0的緩沖液加入0.2mol/l的氯化鈉進行洗脫，收集洗脫液，洗脫至紫外檢測器檢測不到吸收為止；(5)洗脫液反滲透膜法濃縮脫鹽，得到半成品9.6克；(6)將半成品9.6克加入酶保護劑酪氨酸10克和藥用輔料甘露醇30.4克，用注射用水溶解完全后，分裝到西林瓶中，進行冷凍干燥，軋蓋，檢測，得到凍干粉針劑1000瓶。
實施例2(1)本發(fā)明原料藥重量配比為水蛭7500克，地龍2500克；(2)取鮮水蛭、地龍，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動絞肉機破碎，再用超聲波低溫破碎；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-30℃冰柜凍結(jié)24小時，再用流水解凍，再次凍結(jié)，反復(fù)凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機離心沉淀，吸取上清液備用；(3)將上清液用截留分子量為100000的中空纖維柱進行超濾，超濾至原溶液體積的1/2時，加水至原體積，反復(fù)操作5次，合并透過液，20℃時濃縮至相對密度為1.10的溶液；(4)將濃縮的過濾液用三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCL)緩沖液調(diào)PH值為7.0，離子強度為0.01mol/l通過CM-瓊脂糖陽離子交換柱，用緩沖液洗6倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調(diào)PH值為7.0通過DEAE-瓊脂糖陰離子交換柱，分別用PH值為7.0的緩沖液洗3倍柱體積，洗脫液棄去，最后用PH值為7.0的緩沖液加入0.5mol/l的氯化鈉進行洗脫，收集洗脫液，洗脫至紫外檢測器檢測不到吸收為止；(5)洗脫液反滲透膜法濃縮脫鹽，得到半成品9.2克；(6)將半成品9.2克加入酶保護劑酪氨酸9克和藥用輔料蔗糖31.8克，用注射用水調(diào)整濃度后，分裝到西林瓶中，進行冷凍干燥，軋蓋，檢測，得到凍干粉針劑1000瓶。
實施例3(1)本發(fā)明原料藥重量配比為水蛭6500克，地龍3500克；(2)取鮮水蛭、地龍，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動絞肉機破碎，再用超聲波低溫破碎；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-30℃冰柜凍結(jié)24小時，再用流水解凍，再次凍結(jié)，反復(fù)凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機離心沉淀，吸取上清液備用；(3)將上清液用截留分子量為80000的中空纖維柱進行超濾，超濾至原溶液體積的1/3時，加水至原體積，反復(fù)操作4次，合并透過液，20℃時濃縮至相對密度為1.08的溶液；(4)將濃縮的過濾液用磷酸鹽緩沖液調(diào)PH值為6.5，離子強度為0.01mol/l通過CM-纖維素陽離子交換柱，用緩沖液洗5倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調(diào)PH值為6.5通過DEAE-纖維素陰離子交換柱，分別用PH值為6.5的緩沖液洗3倍柱體積，洗脫液棄去，最后用PH值為6.5的緩沖液加入0.3mol/l的氯化鈉進行洗脫，收集洗脫液，洗脫至紫外檢測器檢測不到吸收為止；(5)洗脫液反滲透膜法濃縮脫鹽，得到半成品9.4克；
(6)將半成品9.4克加入酶保護劑酪氨酸9.5克和藥用輔料乳糖31.1克，用注射用水調(diào)整濃度后，分裝到西林瓶中，進行冷凍干燥，軋蓋，檢測，得到凍干粉針劑1000瓶。
實施例4(1)本發(fā)明原料藥重量配比為水蛭7000克，地龍3000克；(2)取鮮水蛭、地龍，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動絞肉機破碎，再用超聲波低溫破碎；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-30℃冰柜凍結(jié)24小時，再用流水解凍，再次凍結(jié)，反復(fù)凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機離心沉淀，吸取上清液備用；(3)將上清液用截留分子量為50000的中空纖維柱進行超濾，超濾至原溶液體積的1/3時，加水至原體積，反復(fù)操作5次，合并透過液，20℃時濃縮至相對密度為1.09的溶液；(4)將濃縮的過濾液用三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCL)緩沖液調(diào)PH值為6.3，離子強度為0.01mol/l通過SP-交聯(lián)葡聚糖陽離子交換柱，用緩沖液洗4倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調(diào)PH值為6.3通過Q-交聯(lián)葡聚糖陰離子交換柱，分別用PH值為6.3的緩沖液洗3倍柱體積，洗脫液棄去，最后用PH值為6.3的緩沖液加入0.35mol/l的氯化鈉進行洗脫，收集洗脫液，洗脫至紫外檢測器檢測不到吸收為止；(5)洗脫液濃縮脫鹽，得到半成品9.2克；(6)將半成品9.2克加入酶保護劑酪氨酸9.2克和藥用輔料甘露醇、蔗糖31.6克，用注射用水調(diào)整濃度后，分裝到西林瓶中，進行冷凍干燥，軋蓋，檢測，得到凍干粉針劑1000瓶。
實施例5(1)本發(fā)明原料藥重量配比為水蛭7200克，地龍2800克；(2)取鮮水蛭、地龍，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動絞肉機破碎，再用超聲波低溫破碎；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-30℃冰柜凍結(jié)24小時，再用流水解凍，再次凍結(jié)，反復(fù)凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機離心沉淀，吸取上清液備用；(3)將上清液用截留分子量為100000的中空纖維柱進行超濾，超濾至原溶液體積的1/3時，加水至原體積，反復(fù)操作3次，合并透過液，20℃時濃縮至相對密度為1.07的溶液；(4)將濃縮的過磷酸鹽濾液用緩沖液調(diào)PH值為6.8，離子強度為0.01mol/l通過SP-瓊脂糖陽離子交換柱，用緩沖液洗4倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調(diào)PH值為6.8通過Q-瓊脂糖陰離子交換柱，分別用PH值為6.8的緩沖液洗3倍柱體積，洗脫液棄去，最后用PH值為6.8的緩沖液加入0.40mol/l的氯化鈉進行洗脫，收集洗脫液，洗脫至紫外檢測器檢測不到吸收為止；(5)洗脫液反滲透膜法濃縮脫鹽，得到半成品9.2克；(6)將半成品9.2克加入酶保護劑酪氨酸10克和藥用輔料蔗糖、乳糖30.8克，用注射用水調(diào)整濃度后，分裝到西林瓶中，進行冷凍干燥，軋蓋，檢測，得到凍干粉針劑1000瓶。
實施例6(1)本發(fā)明原料藥重量配比為水蛭6800克，地龍3200克；(2)取鮮水蛭、地龍，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動絞肉機破碎，再用超聲波低溫破碎；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-30℃冰柜凍結(jié)24小時，再用流水解凍，再次凍結(jié)，反復(fù)凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機離心沉淀，吸取上清液備用；(3)將上清液用截留分子量為80000的中空纖維柱進行超濾，超濾至原溶液體積的1/2時，加水至原體積，反復(fù)操作4次，合并透過液，20℃時濃縮至相對密度為1.06的溶液；(4)將濃縮的過濾液用三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCL)緩沖液調(diào)PH值為6.2，離子強度為0.01mol/l通過SP-纖維素陽離子交換柱，用緩沖液洗5倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調(diào)PH值為6.2通過Q-纖維素陰離子交換柱，分別用PH值為6.2的緩沖液洗3倍柱體積，洗脫液棄去，最后用PH值為6.2的緩沖液加入0.45mol/l的氯化鈉進行洗脫，收集洗脫液，洗脫至紫外檢測器檢測不到吸收為止；(5)洗脫液反滲透膜法濃縮脫鹽，得到半成品9.3克；(6)將半成品9.3克加入酶保護劑酪氨酸9.5克和藥用輔料甘露醇、乳糖31.2克，用注射用水調(diào)整濃度后，分裝到西林瓶中，進行冷凍干燥，軋蓋，檢測，得到凍干粉針劑1000瓶。
實施例7(1)本發(fā)明原料藥重量配比為水蛭6200克，地龍2800克；(2)取鮮水蛭、地龍，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動絞肉機破碎，再用超聲波低溫破碎；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-30℃冰柜凍結(jié)24小時，再用流水解凍，再次凍結(jié)，反復(fù)凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機離心沉淀，吸取上清液備用；
(3)將上清液用截留分子量為50000的中空纖維柱進行超濾，超濾至原溶液體積的1/2時，加水至原體積，反復(fù)操作5次，合并透過液，20℃時濃縮至相對密度為1.09的溶液；(4)將濃縮的過濾液用磷酸鹽緩沖液調(diào)PH值為6.4，離子強度為0.01mol/l通過CM-交聯(lián)葡聚糖陽離子交換柱，用緩沖液洗6倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調(diào)PH值為6.4通過Q-纖維素陰離子交換柱，分別用PH值為6.4的緩沖液洗3倍柱體積，洗脫液棄去，最后用PH值為6.4的緩沖液加入0.25mol/l的氯化鈉進行洗脫，收集洗脫液，洗脫至紫外檢測器檢測不到吸收為止；(5)洗脫液濃縮脫鹽，得到半成品9.5克；(6)將半成品9.5克加入酶保護劑酪氨酸10克和藥用輔料甘露醇、蔗糖、乳糖30.5克，用注射用水調(diào)整濃度后，分裝到西林瓶中，進行冷凍干燥，軋蓋，檢測，得到凍干粉針劑1000瓶。
實施例8(1)本發(fā)明原料藥重量配比為水蛭70公斤，地龍30公斤；(2)取鮮水蛭、地龍，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動絞肉機破碎，再用超聲波低溫破碎；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-30℃冰柜凍結(jié)24小時，再用流水解凍，再次凍結(jié)，反復(fù)凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機離心沉淀，吸取上清液備用；(3)將上清液用截留分子量為80000的中空纖維柱進行超濾，超濾至原溶液體積的1/3時，加水至原體積，反復(fù)操作3次，合并透過液，20℃時濃縮至相對密度為1.09的溶液；
(4)將濃縮的過濾液用三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCL)緩沖液調(diào)PH值為6.9，離子強度為0.01mol/l通過SP-纖維素陽離子交換柱，用緩沖液洗4倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調(diào)PH值為6.9通過DEAE-交聯(lián)葡聚糖陰離子交換柱，分別用PH值為6.9的緩沖液洗3倍柱體積，洗脫液棄去，最后用PH值為6.9的緩沖液加入0.4mol/l的氯化鈉進行洗脫，收集洗脫液，洗脫至紫外檢測器檢測不到吸收為止；(5)洗脫液反滲透膜法濃縮脫鹽，得到半成品92.3克；(6)將半成品92.3克加入酶保護劑酪氨酸95克和藥用輔料甘露醇312.7克，用注射用水調(diào)整濃度后，分裝到西林瓶中，進行冷凍干燥，軋蓋，檢測，得到凍干粉針劑10000瓶。
注本發(fā)明鮮地龍放入清水中饑餓數(shù)天，使地龍吐出體內(nèi)雜質(zhì)再進行提取分離。
權(quán)利要求
1.一種疏血通凍干粉針劑，其特征在于其中水蛭素、蚓激酶占活性成分的含量不小于90％。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的疏血通凍干粉針劑的制備方法，其特征在于是從鮮水蛭中提取水蛭素，從鮮蚯蚓中提取蚓激酶，純化后加入酶保護劑酪氨酸和藥用輔料制備成凍干粉針劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疏血通凍干粉針劑的制備方法，其特征包括以下步驟(1)原料藥重量配比為水蛭6-7.5重量份，地龍2.5-4重量份；(2)取鮮水蛭、地龍，加入注射用水，洗去雜質(zhì)，用電動絞肉機破碎，再用超聲波低溫破碎；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-30℃冰柜凍結(jié)24小時，再用流水解凍，再次凍結(jié)，反復(fù)凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機離心沉淀，吸取上清液備用；(3)將上清液用截留分子量為50000-100000的中空纖維柱進行超濾，超濾至原溶液體積的1/3-1/2時，加水至原體積，反復(fù)操作3-5次，合并透過液，20℃時濃縮至相對密度為1.05-1.10的溶液；(4)將濃縮的過濾液用緩沖液調(diào)PH值為6.0-7.0，離子強度為0.01mol/l通過陽離子交換柱，用緩沖液洗4-6倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調(diào)PH值為6.0-7.0通過陰離子交換柱，分別用PH值為6.0-7.0的緩沖液洗3倍柱體積，洗脫液棄去，最后用PH值為6.0-7.0的緩沖液加入0.2-0.5mol/l的氯化鈉進行洗脫，收集洗脫液，洗脫至紫外檢測器檢測不到吸收為止；(5)洗脫液濃縮脫鹽，得到半成品；(6)將半成品加入酶保護劑酪氨酸和藥用輔料，用注射用水調(diào)整濃度后，分裝到西林瓶中，進行冷凍干燥，軋蓋，檢測，得到凍干粉針劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其中步驟(4)緩沖液為磷酸鹽緩沖液和三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCL)的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其中步驟(4)陽離子交換柱是CM-交聯(lián)葡聚糖、CM-瓊脂糖、CM-纖維素、SP-交聯(lián)葡聚糖、SP-瓊脂糖、SP-纖維素中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其中步驟(4)陰離子交換柱是DEAE-交聯(lián)葡聚糖、DEAE-瓊脂糖、DEAE-纖維素、Q-交聯(lián)葡聚糖、Q-瓊脂糖、Q-纖維素中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其中步驟(3)透過液的濃縮，是采用反滲透膜法濃縮。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種疏血通凍干粉針制劑及其制備方法，其特征在于從鮮水蛭提取水蛭素，從鮮蚯蚓中提取蚓激酶，純化后加藥用輔料，制備成凍干粉針制劑；其特征還在于本制備方法采用超濾、離子交換柱層析、反滲透濃縮有機結(jié)合的方法純化，得到純度較高的水蛭素、蚓激酶，加入酶保護劑酪氨酸和藥用輔料制備成凍干粉針劑，藥理實驗結(jié)果表明，本發(fā)明凍干粉針劑具有更好的藥理作用。
文檔編號A61K9/19GK1651079SQ200410101538
公開日2005年8月10日 申請日期2004年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月23日
發(fā)明者吳梅春 申請人:吳梅春