專利名稱：用于預(yù)防或治療病毒感染的組合物和方法
導(dǎo)言本發(fā)明是在國(guó)立過(guò)敏反應(yīng)和傳染病研究所資助的研究過(guò)程中完成的(NIAID資助號(hào)AI-46457和AI-13989)。美國(guó)政府可在本發(fā)明中擁有一定權(quán)利。
背景技術(shù)：
在A型流感病毒粒子和病毒感染的細(xì)胞的膜上表達(dá)了三種類型的跨膜蛋白。紅細(xì)胞凝集素和神經(jīng)氨酸酶是分別具有大約510個(gè)和大約420個(gè)氨基酸的大胞外結(jié)構(gòu)域的糖蛋白。紅細(xì)胞凝集素以同型三聚體的形式裝配，而神經(jīng)氨酸酶以同型四聚體的形式裝配，在病毒的膜和病毒成熟的細(xì)胞位點(diǎn)上形成13-14nm長(zhǎng)的桿狀表面突起物的致密層。目前的流感病毒疫苗的目標(biāo)在于誘導(dǎo)針對(duì)這些糖蛋白，特別是紅細(xì)胞凝集素的強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)，就這一點(diǎn)來(lái)說(shuō)，已知這些抗體對(duì)于感染具有高度保護(hù)性。問(wèn)題在于A型流感病毒具有改變被這些保護(hù)性抗體所識(shí)別的抗原決定簇的高度傾向性，從而需要使用反映了這些抗原性變化的更新的疫苗株進(jìn)行重復(fù)免疫接種。相比之下，第三個(gè)病毒跨膜蛋白為基質(zhì)蛋白2(M2)，它含有的胞外結(jié)構(gòu)域(M2e)在人類的流感病毒株中是高度保守的。利用M2對(duì)A型流感病毒感染的廣泛的保護(hù)性免疫已經(jīng)被研究(Slepushkin等，(1995)Vaccine 131399-1402；Frace等，(1999)Vaccine 172237-44；Neirynck等，(1999)Nature Med.51157-63；Okuda等，(2001)Vaccine 193681-91)。
M2是97個(gè)氨基酸的非糖基化跨膜蛋白(Lamb等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 784170-4；Lamb等，(1985)Cell 40627-33)。它形成同型四聚體(Holsinger和Lamb(1991)Virology 18332-43；Sugrue和Hay(1991)Virology 180617-24)，在病毒顆粒的膜上以低密度表達(dá)(平均每個(gè)病毒粒子有大約10個(gè)M2四聚體，與此相比有大約400個(gè)紅細(xì)胞凝集素三聚體和大約100個(gè)神經(jīng)氨酸酶四聚體)，但是在被感染的細(xì)胞的質(zhì)膜上以高密度表達(dá)(與紅細(xì)胞凝集素密度相同)(Zebedee和Lamb(1988)J.Virol.622762-72)。M2四聚體表現(xiàn)出pH誘導(dǎo)的質(zhì)子運(yùn)輸活性(Steinhauer等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8811525-9；Pinto等，(1992)Cell 69517-28)，這似乎利于RNP復(fù)合物融合后從病毒膜上的釋放(Zhirnov(1990)Virology 176274-9)，防止在病毒跨膜蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向質(zhì)膜外運(yùn)的過(guò)程中運(yùn)輸泡內(nèi)pH的過(guò)度降低，從而防止紅細(xì)胞凝集素在成熟前受酸誘導(dǎo)的構(gòu)象變化(Steinhauer等，(1991)同上)。在23個(gè)氨基酸長(zhǎng)的M2e中，N-端的9個(gè)氨基酸是完全保守的，在它靠近膜的15個(gè)氨基酸長(zhǎng)的部分中僅顯示出相對(duì)低程度的結(jié)構(gòu)多樣性(Zebedee和Lamb(1988)同上；Ito等，(1991)J.Virol.655491-8)。在人類分離株H1N1、H2N2、H3N2和H5N1亞型中，在7個(gè)位置發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)可以互相替換的氨基酸，但是這些人類分離株的大部分實(shí)際上具有同樣的序列。
M2e特異性單克隆抗體14C2在體外不能防止病毒感染，但在摻入培養(yǎng)基或瓊脂覆蓋層中時(shí)能降低病毒的產(chǎn)量，和減小噬菌斑的大小(Zebedee和Lamb(1988)同上；Hughey等，(1995)Virology 212411-21)。不是所有的M2e特異性抗體都表現(xiàn)出這種活性(Hughey等，(1995)同上)，不是所有的病毒株都對(duì)它敏感(Zebedee和Lamb(1988)同上)。在體內(nèi)，被動(dòng)的單克隆抗體14C2同樣減少了病毒的生長(zhǎng)(Treanor等，(1990)J.Virol.641375-7)，針對(duì)PR8也是有效的(Mozdzanowska等，(1999)Virology 254138-46)，而PR8在體外對(duì)抗體介導(dǎo)的生長(zhǎng)限制是不敏感的(Zebedee和Lamb(1988)同上；Mozdzanowska等，(1999)同上)，這表明抗體介導(dǎo)的病毒生長(zhǎng)限制在體外和體內(nèi)是通過(guò)不同機(jī)制進(jìn)行的。
使用各種不同類型的疫苗結(jié)構(gòu)和接種形式已經(jīng)測(cè)試了主動(dòng)誘導(dǎo)的M2特異性免疫的保護(hù)效力。在最初的研究中，使用表達(dá)M2的重組痘苗病毒免疫接種小鼠和白鼬，沒(méi)有顯示出保護(hù)的征象(Epstein等，(1993)J.Immunol.1505484-93；Jakeman等，(1989)J.Gen.Virol.701523-31)，盡管M2特異性免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)未被證實(shí)。隨后的研究測(cè)試了含有完整的M基因區(qū)段(編碼M1和M2蛋白)的質(zhì)粒DNA(Okuda等，(2001)同上)、完整的重組M2蛋白膜制品(Slepushkin等，(1995)同上)、刪除了跨膜部分的M2蛋白(以減少毒性并增加溶解度)(Frace等，(1999)同上)、以及M2e與乙肝病毒核心蛋白融合形成的結(jié)構(gòu)(Neirynck等，(1999)同上)。這些后來(lái)的免疫接種方案誘導(dǎo)了保護(hù)作用，其根據(jù)是病毒生長(zhǎng)和死亡率的減少。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)含有與輔助性T細(xì)胞決定簇連接的M2e的多重抗原因子是誘導(dǎo)病毒保護(hù)的有效疫苗。M2e-MAAs與霍亂毒素(CT)和帶有刺激性的CpG基序的合成寡聚脫氧核苷酸(ODN)一起在小鼠血清中誘導(dǎo)強(qiáng)烈的M2e特異性抗體滴度，并導(dǎo)致針對(duì)流感病毒攻擊的顯著的保護(hù)。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的一個(gè)方面是一種多抗原因子(MAA)，其結(jié)構(gòu)如下 (SEQ ID NO1)，其中R1是0-2個(gè)氨基酸殘基，包含Cys或Gly或核酸序列；m至少為1；n至少為1；Xaa1是0-1個(gè)氨基酸殘基，包含Lys-R4；R2、R3和R4可以互相獨(dú)立的是B細(xì)胞決定簇、T細(xì)胞決定簇或定向分子；以及R5是任何氨基酸、肽或核酸序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，B細(xì)胞決定簇是基質(zhì)蛋白2的胞外結(jié)構(gòu)域或其類似物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，位于第一個(gè)MAA N-端的Cys殘基通過(guò)二硫鍵與通式1中第二個(gè)MAA N-端的第二個(gè)Cys殘基共價(jià)結(jié)合，產(chǎn)生通式1的MAA二聚體。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是含有MAA和可藥用載體的組合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，含有MAA和可藥用載體的組合物還可以含有佐劑。這樣的組合物可用于預(yù)防或治療病毒感染。因此提供了一種預(yù)防或治療病毒感染的方法，包括對(duì)易受感染的對(duì)象或表現(xiàn)出病毒感染信號(hào)或癥狀的對(duì)象給藥有效劑量的本發(fā)明的組合物，以預(yù)防或治療病毒感染的信號(hào)或癥狀。在優(yōu)選情況下，該病毒感染是A型流感病毒。
本發(fā)明的這些和其它的方面在后面的本發(fā)明的描述中將被更詳細(xì)地闡述。
發(fā)明詳述現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，用含有多個(gè)B細(xì)胞決定簇和輔助性T細(xì)胞(Th)決定簇的多抗原因子(MAAs)接種的動(dòng)物，對(duì)隨后用傳染性病毒進(jìn)行的攻擊表現(xiàn)出顯著的抗性。根據(jù)本文的定義，多抗原因子是含有一種以上能夠在動(dòng)物中誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)的肽或核酸部分的因子。B細(xì)胞決定簇誘導(dǎo)抗體反應(yīng)，也可以誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)。本文提供的MAAs的優(yōu)點(diǎn)是大量的抗原側(cè)鏈可以被連接到含有Lys-Gly重復(fù)單元的核心肽上，從而能夠呈遞幾個(gè)結(jié)構(gòu)上相連的決定簇。此外，當(dāng)Cys殘基被連接到核心肽的N-端時(shí)，兩個(gè)核心肽可以通過(guò)二硫鍵共價(jià)連接，從而有效地加倍了抗原側(cè)鏈的數(shù)量，因而在哺乳動(dòng)物中增強(qiáng)了免疫反應(yīng)。此外，因?yàn)楸疚奶峁┑腗AA可以容易地進(jìn)行化學(xué)合成，MAA的生產(chǎn)是高度受控的，并且使污染最小化。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種MAA，其結(jié)構(gòu)如下 (SEQ ID NO1)，其中m至少為1，n至少為1。在優(yōu)選實(shí)施方案中，m和n的總和是大約10到30，優(yōu)選為大約10。
在通式1的MAA中，氨基酸部分Xaa1是0到1個(gè)氨基酸殘基，其中該氨基酸殘基是Lys-R4。
在通式1的MAA中，R1部分是0到2個(gè)氨基酸殘基，其中該氨基酸殘基可以是Gly或Cys，或是核酸序列，例如帶有刺激性的CpG基序的寡聚脫氧核苷酸(ODN)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，R1是二肽Cys-Gly。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)MAA的N-端氨基酸是Cys殘基時(shí)，它優(yōu)選與通式1中的第二個(gè)MAA N-端的第二個(gè)Cys殘基共價(jià)連接。第一和第二個(gè)半胱氨酸殘基之間的二硫鍵產(chǎn)生了通式1中的共價(jià)連接的MAA二聚體。可以預(yù)料，二聚體的肽在Lys-Gly重復(fù)單元的數(shù)量(即m和n的數(shù)量)、Xaa1、R2、R3、R4或R5上可以相同，也可以不同。
在通式1的MAA中，R2、R3和R4可以互相獨(dú)立的是B細(xì)胞決定簇、T細(xì)胞決定簇或定向分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在通式1的MAA中存在至少一個(gè)B細(xì)胞決定簇和一個(gè)T細(xì)胞決定簇。例如，本發(fā)明的單體MAA可以含有5個(gè)B細(xì)胞決定簇，兩個(gè)T細(xì)胞決定簇和兩個(gè)定向分子側(cè)鏈。此外，本發(fā)明的單體MAA可以含有例如8個(gè)B細(xì)胞決定簇、一個(gè)T細(xì)胞決定簇和一個(gè)定向分子側(cè)鏈。它們的組合沒(méi)有特別的限制，可以隨著選定的B細(xì)胞決定簇、T細(xì)胞決定簇或定向分子而改變。此外，在一個(gè)Lys-Gly重復(fù)單元中的R基團(tuán)，由m和n標(biāo)明，也可以改變。例如，如果m＝3，第一個(gè)Lys-Gly重復(fù)單元的R2可以是B細(xì)胞決定簇，第二個(gè)Lys-Gly重復(fù)單元的R2可以是T細(xì)胞決定簇，以及第三個(gè)Lys-Gly重復(fù)單元的R2可以是定向分子。
在本文中使用的B細(xì)胞決定簇，在優(yōu)選情況下引發(fā)可測(cè)量的B細(xì)胞反應(yīng)，例如通過(guò)針對(duì)產(chǎn)生的天然病毒蛋白的抗體來(lái)確定?？梢杂糜谕ㄊ?的MAA中的B細(xì)胞決定簇包括那些在本領(lǐng)域內(nèi)已知的以及任何其它的抗原，例如可以引發(fā)B細(xì)胞反應(yīng)的聚糖、多肽或核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原來(lái)自有包膜病毒或無(wú)包膜病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原所來(lái)自的病毒包括但不限于腺病毒科、砂粒病毒科(例如淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒)、動(dòng)脈病毒科(例如馬動(dòng)脈炎病毒)、星狀病毒科(人類星狀病毒1)、雙RNA病毒科(例如傳染性胰腺壞死病毒、傳染性囊病病毒)、布尼亞病毒科(例如加利福尼亞腦炎病毒屬)、杯狀病毒科(例如杯狀病毒)、冠狀病毒科(例如人類冠狀病毒299E和OC43)、delta病毒科(例如肝炎delta病毒)、線狀病毒科(例如馬爾堡病毒、埃博拉霍亂病毒)、黃病毒科(例如黃熱病病毒屬、丙型肝炎病毒)、嗜肝DNA病毒科(例如乙型肝炎病毒)、皰疹病毒科(例如EB病毒、單純皰疹病毒、Varicellovirus、細(xì)胞肥大病毒、玫瑰疹病毒(Roseolovirus)、淋巴濾泡病毒、猴病毒(Rhadinovirus)、正粘液病毒科(例如A、B、C型流感病毒)、乳多空病毒科(例如乳頭瘤病毒)、副粘液病毒科(諸如人類副流感病毒1等的副粘液病毒、諸如麻疹病毒等的麻疹病毒、諸如流行性腮腺炎病毒等的Rubulavirus、諸如人類呼吸道合胞病毒等的肺炎病毒(Pneumovirus)、微小RNA病毒科(諸如鼻病毒1A等的鼻病毒、諸如人類甲肝病毒等的肝病毒、人類脊髓灰質(zhì)炎病毒、諸如腦心肌炎病毒等的心病毒、諸如口蹄疫病毒O等的口瘡病毒(Aphthovirus)、科賽奇病毒)、痘病毒科(諸如天花病毒等的正痘病毒)、呼吸道腸道病毒科(例如，諸如A-F族輪狀病毒等的輪狀病毒)、反轉(zhuǎn)錄病毒科(諸如人類免疫缺陷病毒1和2等的靈長(zhǎng)目慢病毒屬)、桿狀病毒科(例如狂犬病病毒)和披膜病毒科(例如，諸如風(fēng)疹病毒等的Rubivirus)的病毒。
可以用于通式1的MAA中的示例性B細(xì)胞決定簇包括但不限于M2e及其類似物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通式1的MAA中的B細(xì)胞決定簇是來(lái)自A型流感病毒的M2e。在另一個(gè)實(shí)施方案中，B細(xì)胞決定簇來(lái)自于象B型流感病毒的NB或C型流感病毒的CM2這樣的病毒跨膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域。
T細(xì)胞決定簇意思是包括了Th和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的決定簇。T細(xì)胞反應(yīng)的引發(fā)可以通過(guò)例如本文示例的方法或通過(guò)測(cè)量產(chǎn)生的細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5或IL-10而檢測(cè)?？梢杂糜谕ㄊ?的MAA中的示例性T細(xì)胞決定簇包括但不限于，血細(xì)胞凝集素T細(xì)胞決定簇和限于人類II類MHC蛋白的T細(xì)胞決定簇，優(yōu)選限于廣范圍的單倍型的T細(xì)胞決定簇。
與抗原共價(jià)連接的定向分子作為R2、R3或R4部分一般是能夠?qū)⒖乖斔偷剿栉稽c(diǎn)的糖、脂類、肽或寡聚核苷酸?？梢员话诒景l(fā)明的MAAs中的定向分子包括但不限于霍亂毒素、帶有刺激性CpG基序的ODNs、以及內(nèi)源的人類免疫調(diào)節(jié)因子，例如IL-2、IL-12和GM-CSF。
通式1的MAA中的R5部分沒(méi)有特別的限制，可以是任何氨基酸(例如β-連接的丙氨酸)、肽或核酸序列，例如帶有刺激性CpG基序的ODN。
當(dāng)核酸序列被包含在通式1中時(shí)，該核酸序列可以通過(guò)隔離或連接分子例如羥基-羧酸來(lái)連接。
通式1的MAA可以按照本文示例的方法或任何其它合適的化學(xué)合成肽和肽結(jié)合物的方法來(lái)制備。
本文提供的例子公開了通式1的MAA的各種不同衍生物，用于在小鼠中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，其目的是為了說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明范圍內(nèi)的其它方面、優(yōu)點(diǎn)和修飾對(duì)于本發(fā)明所屬的領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的。
M2e-MAAs通過(guò)鼻內(nèi)途徑以50μl的劑量給藥麻醉的小鼠。初次接種物和加強(qiáng)接種物包含3μg MAA、3μg硫代磷酸酯化的寡聚脫氧核苷酸(ODN)1826和0.5μg霍亂毒素(CT)的磷酸鹽緩沖液，以4到5周的間隔給藥。單獨(dú)或與感染性病毒一同通過(guò)鼻內(nèi)接種ODN和CT的小鼠被分別用作陰性和陽(yáng)性對(duì)照。在后者的情況下，第一次感染使用PR8，第二次感染使用PR8-SEQ14，PR8-SEQ14是PR8的變體，在被保護(hù)性單克隆抗體識(shí)別的血細(xì)胞凝集素決定簇中有14個(gè)氨基酸的取代，并可以在PR-8免疫的小鼠中容易地誘導(dǎo)感染。
在加強(qiáng)后10到30天，來(lái)自縱隔淋巴結(jié)(MedLNs)的細(xì)胞被測(cè)試它們對(duì)游離的S1肽、血細(xì)胞凝集素和M2e作出反應(yīng)而增殖的能力。來(lái)自導(dǎo)流上呼吸道的脾臟和淋巴結(jié)的細(xì)胞給出較小的反應(yīng)，沒(méi)有進(jìn)行進(jìn)一步研究。M2e-MAA免疫的小鼠的反應(yīng)總是超過(guò)用佐劑引發(fā)的對(duì)照小鼠的反應(yīng)。數(shù)據(jù)組中只有兩個(gè)在統(tǒng)計(jì)基礎(chǔ)上超出了對(duì)照小鼠的反應(yīng)(成對(duì)t試驗(yàn)，p≥0.05)。然而，作為一個(gè)整體，M2e-MAA免疫的小鼠表現(xiàn)出明顯比對(duì)照小鼠高的S1-和血細(xì)胞凝集素特異性的反應(yīng)(非成對(duì)t試驗(yàn)，p≤0.05)。M2e-MAA免疫的小鼠的血細(xì)胞凝集素特異性反應(yīng)在大小上與一個(gè)感染免疫的小鼠相同，但是在細(xì)節(jié)特征上有所不同，其中在M2e-MAA免疫的小鼠中檢測(cè)到了S1-特異性的Th，但是在感染免疫的小鼠中沒(méi)有檢測(cè)到。甘露糖基化的MAA在體內(nèi)誘導(dǎo)S1-特異性的Th反應(yīng)方面并不優(yōu)于非甘露糖基化的MAA，這顯然與它在體外較大的刺激潛力相反。此外，M2e-MAA免疫的小鼠而不是感染免疫的小鼠含有M2e特異性增殖T細(xì)胞，表明M2e本身含有至少一個(gè)H2d限制性的Th決定簇。
沒(méi)有證據(jù)表明M2e-MAAs誘導(dǎo)了I類MHC限制性的細(xì)胞毒性記憶T細(xì)胞(Tc)反應(yīng)，這與在M2e中缺少特征性的Kd限制性、Dd限制性或Ld限制性基序一致(Engelhard(1994)Curr.Opin.Immunol.613-23；Corr等，(1993)J.Exp.Med.1781877-92)。記憶性Tc在感染免疫的小鼠中可以容易地檢測(cè)。
M2e特異性的血清抗體滴度通過(guò)在固相免疫吸附劑(1)M2e-MAA和JAP-MDCK細(xì)胞單層上通過(guò)ELISA進(jìn)行測(cè)量。每個(gè)分析被標(biāo)準(zhǔn)化并通過(guò)同時(shí)滴定純化的M2e特異性單克隆抗體14C2而定量，測(cè)試樣品中抗體的滴度被定義為每毫升血清的M2e特異性抗體的當(dāng)量微克數(shù)。
來(lái)自四個(gè)獨(dú)立的免疫實(shí)驗(yàn)的組合數(shù)據(jù)提供了不同免疫實(shí)驗(yàn)的成組滴度的平均值和SEM，這些實(shí)驗(yàn)中小鼠在引發(fā)后2周和4周、第二次免疫后2周和4-5周，以及第三次免疫后2周和5周被抽血。數(shù)據(jù)表明(4)M2e-MAA比(1)M2e-MAA誘導(dǎo)了更迅速和更強(qiáng)烈的反應(yīng)，甘露糖的存在導(dǎo)致抗體反應(yīng)的進(jìn)一步減少。這在用(1)M2e-MAA和JAP-MDCK細(xì)胞測(cè)量的抗體滴度中都適用。用(4)M2e-MAA進(jìn)行的免疫總是在第二次免疫后2周誘導(dǎo)明顯的抗體滴度，有時(shí)早在初次免疫后4周就誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的反應(yīng)(在4個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，在第一次免疫后4周的平均滴度是1.0、2.0、4.6和1035μg/ml)。(2)M2e-MAA僅僅包含在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，誘導(dǎo)的反應(yīng)介于(4)M2e-MAA和(1)M2e-MAA之間。這個(gè)發(fā)現(xiàn)表明M2e多聚體的呈遞通過(guò)促進(jìn)M2e特異性B細(xì)胞上膜Ig的交聯(lián)增強(qiáng)了B細(xì)胞反應(yīng)(Bachmann和Zinkernagel(1997)Annu.Rev.Immunol.15235-70)。
數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明來(lái)自M2e-MAA免疫的小鼠的血清對(duì)M2e-MAA總是表現(xiàn)出比對(duì)JAP-MDCK細(xì)胞更高的滴度。血清中M2e-MAA反應(yīng)性抗體與JAP-MDCK反應(yīng)性抗體的比率平均是10，在個(gè)體的血清中范圍為從2到31。這表明M2e-MAA免疫后抗體反應(yīng)的特異性在每個(gè)小鼠中是不同的，平均大約10％的M2e-MAA特異性抗體與感染細(xì)胞上病毒誘導(dǎo)的M2e發(fā)生交叉反應(yīng)。剩余的抗體可能針對(duì)Th決定簇、支架肽、合成的M2e肽上病毒誘導(dǎo)的M2四聚體所不具備的決定簇、或是這些結(jié)構(gòu)的組合。
針對(duì)M2e-MAA的ELISA還表明來(lái)自病毒感染的小鼠的血清中含有非常低的M2e特異性抗體滴度。針對(duì)JAP-MDCK的ELISA檢測(cè)到針對(duì)許多病毒蛋白的抗體，因而不能用于在感染免疫的小鼠中定量M2特異性反應(yīng)。唯一的例外是一組通過(guò)3次連續(xù)的感染已被免疫的小鼠，首先用PR8，第二次用JAP，第三次用X31，表現(xiàn)出大約30μg/ml的M2e-MAA特異性滴度，這與在(4)M2e-MAA免疫的小鼠中觀察到的病毒M2e特異性抗體滴度(對(duì)JAP-MDCK)在同樣的范圍內(nèi)。數(shù)據(jù)表明(4)M2e-MAA在誘導(dǎo)M2e特異性抗體反應(yīng)方面比病毒感染更有效。
M2e特異性免疫效應(yīng)子在用兩次連續(xù)的感染免疫的小鼠中幾乎是不存在的?？紤]到M2在被感染細(xì)胞的質(zhì)膜中是高密度表達(dá)的(Lamb等，(1985)同上；Zebedee和Lamb(1988)同上)，以及在全呼吸道感染的過(guò)程中有大量的上皮細(xì)胞被感染(Yilma等，(1979)J.Inf.Disease139458-64)，這種情況是令人吃驚的。這個(gè)發(fā)現(xiàn)表明異源亞型保護(hù)的強(qiáng)度可以通過(guò)伴隨誘導(dǎo)由感染和M2e特異性接種誘導(dǎo)的效應(yīng)子而增強(qiáng)。
在第二次免疫后4到5周，小鼠用X31攻擊，3天后測(cè)定鼻、氣管和肺組織中的病毒滴度。用含有單個(gè)M2e、帶有或不帶甘露糖的MAAs免疫的小鼠與只用佐劑引發(fā)的小鼠相比，對(duì)鼻和肺組織中病毒的復(fù)制沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的抗性(ns，斯氏t試驗(yàn)得到的p＞0.01)，但是顯示出氣管中病毒的復(fù)制減少。相反，用(4)M2e-MAA免疫的小鼠顯示出在呼吸道的所有部分減少了病毒的生長(zhǎng)。與感染免疫的小鼠相比，在(4)M2e-MAA免疫的小鼠中的抗性強(qiáng)度在鼻和氣管組織中是相同的，但是在肺組織中強(qiáng)度較低。
為了與病毒滴度建立相關(guān)性測(cè)試了小鼠個(gè)體中M2e特異性血清抗體的滴度。在(4)M2e-MAA免疫的小鼠中抗體滴度與鼻和肺的病毒滴度反向相關(guān)，但是與氣管中的病毒滴度不是(鼻和肺的相關(guān)系數(shù)R2分別為0.53和0.51，p＜0.001)。但是，相關(guān)性的主要部分是由于單個(gè)一只遠(yuǎn)離中心的小鼠，它在每毫升血清中含有大約90μg抗M2e抗體。將它排除后抗體和病毒滴度的相關(guān)性在鼻中減少到了不顯著的值，但是在肺中，相關(guān)性仍顯著(R20.41，p＝0.002)。在氣管中和由感染免疫的小鼠中M2e特異性抗體和病毒滴度之間沒(méi)有觀察到相關(guān)性。
在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了使用MAAs作為治療和預(yù)防劑以治療或預(yù)防病毒感染。一般來(lái)說(shuō)，這包括以適當(dāng)?shù)男问綄⒂行┝康囊环N或多種本發(fā)明的MAAs給藥易感對(duì)象或表現(xiàn)出病毒感染的信號(hào)或癥狀的對(duì)象。
正如專業(yè)技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到的那樣，為通式1的MAA選擇B細(xì)胞決定簇將依賴于將要預(yù)防或治療的病毒感染。例如為了預(yù)防或治療流感病毒感染，通式1的MAA的B細(xì)胞決定簇應(yīng)該來(lái)自流感病毒(例如M2e)。在使用同源的B細(xì)胞決定簇時(shí)，預(yù)計(jì)通式1的MAA將能夠有效產(chǎn)生針對(duì)有包膜或無(wú)包膜病毒的免疫反應(yīng)，這些病毒包括但不限于腺病毒科、砂粒病毒科(例如淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒)、動(dòng)脈病毒科(例如馬動(dòng)脈炎病毒)、星狀病毒科(人類星狀病毒1)、雙RNA病毒科(例如傳染性胰腺壞死病毒、傳染性囊病病毒)、布尼亞病毒科(例如加利福尼亞腦炎病毒屬)、杯狀病毒科(例如杯狀病毒)、冠狀病毒科(例如人類冠狀病毒299E和OC43)、delta病毒科(例如肝炎delta病毒)、線狀病毒科(例如馬爾堡病毒、埃博拉霍亂病毒)、黃病毒科(例如黃熱病病毒屬、丙型肝炎病毒)、嗜肝DNA病毒科(例如乙型肝炎病毒)、皰疹病毒科(例如Epstein-Bar病毒、單純皰疹病毒、Varicellovirus、細(xì)胞肥大病毒、玫瑰疹病毒、淋巴濾泡病毒、猴病毒)、正粘液病毒科(例如A、B、C型流感病毒)、乳多空病毒科(例如乳頭瘤病毒)、副粘液病毒科(例如人類副流感病毒1這樣的副粘液病毒、麻疹病毒這樣的麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒這樣的Rubulavirus、人類呼吸道合胞病毒這樣的Pneumovirus)、微小RNA病毒科(例如人鼻病毒1A這樣的鼻病毒、人類甲肝病毒這樣的肝病毒、人類脊髓灰質(zhì)炎病毒、腦心肌炎病毒這樣的心病毒、口蹄疫病毒O這樣的Aphthovirus、科賽奇病毒)、痘病毒科(例如天花病毒這樣的正痘病毒)、呼吸道腸道病毒科(例如A-F族輪狀病毒這樣的輪狀病毒)、反轉(zhuǎn)錄病毒科(例如人類免疫缺陷病毒1和2這樣的靈長(zhǎng)目慢病毒屬)、棒狀病毒科(例如狂犬病病毒)和披膜病毒科(例如風(fēng)疹病毒這樣的Rubivirus)的病毒。
對(duì)具有病毒感染的個(gè)體的治療包括鑒定表現(xiàn)出病毒感染的信號(hào)或癥狀的對(duì)象，然后給該對(duì)象給藥有效劑量的本發(fā)明通式1的MAA。病毒感染的信號(hào)或癥狀一般依賴于具體的病毒，這對(duì)于專業(yè)臨床醫(yī)生來(lái)說(shuō)是熟知的。例如，病毒感染的典型癥狀包括但不限于高燒、嚴(yán)重的疼痛、頭痛和咽喉痛。用于治療病毒感染的MAAs可以作為混合物例如以相同的量混合使用或給藥，或者分別地按順序提供，或者馬上全部給藥，并可以以足夠使病毒感染的信號(hào)或癥狀減輕的劑量通過(guò)口服、局部或腸胃外的方式給藥。此外，本發(fā)明的MAAs可以與其它已知的抗原、疫苗或佐劑共同給藥。
同樣地，針對(duì)病毒感染的預(yù)防性或保護(hù)性主動(dòng)免疫包括將一種或多種MAAs作為疫苗組分給藥。接種可以以口服、局部或腸胃外的方式進(jìn)行，使用能夠使接受的對(duì)象產(chǎn)生針對(duì)目的病毒的保護(hù)性免疫以阻止病毒感染的信號(hào)或癥狀的足夠的劑量。如果MAA的劑量、給藥途徑等足夠影響阻止病毒感染的信號(hào)或癥狀這樣的反應(yīng)，這個(gè)劑量就被稱為足夠阻止病毒感染的信號(hào)或癥狀。對(duì)MAA給藥的反應(yīng)可以通過(guò)分析對(duì)象的重要信號(hào)來(lái)測(cè)量。
適合于給藥的MAA組合物是能夠使接受的對(duì)象耐受的組合物。這樣的MAA組合物可以按照現(xiàn)有的生產(chǎn)制劑來(lái)制備，其中的MAAs與可藥用的載體組合成混合物?？伤幱玫妮d體例如在Remington的《藥物科學(xué)和實(shí)踐》，Alfonso R.Gennaro主編，第20版，Lippingcott Williams& Wilkins出版社，Philadelphia，PA，2000中提供了。為了形成適合給藥的MAA組合物，這樣的組合物將包含有效劑量的MAAs，以及適當(dāng)量的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，它們?cè)谑褂玫膭┝亢蜐舛认聦?duì)于它們所接觸的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物是無(wú)毒性的。一般來(lái)說(shuō)，制劑將含有MAA，終濃度在0.2μg/ml到2mg/ml的范圍內(nèi)，優(yōu)選為5μg/ml到500μg/ml，最優(yōu)選為大約100μg/ml。通常載體是一種pH緩沖的水溶液?？伤幱玫妮d體的例子包括緩沖液例如磷酸、檸檬酸和其它有機(jī)酸緩沖液；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(少于大約10個(gè)殘基)的多肽；蛋白，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、雙糖和其它糖類包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑例如EDTA；糖醇例如甘露糖醇或山梨糖醇；形成鹽的平衡離子例如鈉；和/或非離子表面活性劑例如TWEEN、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS。
MAAs、或含有本發(fā)明的MAA的組合物或制劑還可以含有佐劑以增強(qiáng)對(duì)象對(duì)抗原的T細(xì)胞反應(yīng)。這樣的佐劑的例子包括但不限于白蛋白鹽、不完全弗氏佐劑、胞壁酰二肽的蘇氨酰和正丁基衍生物、胞壁酰三肽的親脂性衍生物、單磷酰脂A、3’-脫氧-乙酰化單磷酰脂A、霍亂毒素、帶有CpG基序的硫代磷酸酯化的寡聚脫氧核苷酸、以及例如在美國(guó)專利No.6558670中公開的那些佐劑。
MAAs、或含有本文公開的MAA的組合物或制劑的給藥可以通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆绞綄?shí)施，包括腸胃外的注射(例如腹膜內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)注射)、口服、或?qū)AAs(一般攜帶于藥物制劑中)局部使用于導(dǎo)氣管的表面。將MAAs局部使用于導(dǎo)氣管的表面可以通過(guò)鼻內(nèi)給藥來(lái)進(jìn)行(例如通過(guò)使用滴管、拭子或吸入器將藥物組合物沉積到鼻內(nèi))。將MAAs局部使用于導(dǎo)氣管的表面也可以通過(guò)吸入給藥來(lái)進(jìn)行，例如通過(guò)將含有MAAs的藥物組合物的可呼吸的微粒(包括固相微粒和液相微粒)制成氣溶膠懸液，然后使對(duì)象吸入可呼吸的微粒。用藥物組合物的可呼吸微粒進(jìn)行給藥的方法和裝置是眾所周知的，任何常規(guī)的技術(shù)都可以使用。
口服給藥可以以溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋制劑或粉末的方式進(jìn)行，含有10％到95％的活性成分，優(yōu)選為25％到70％。用于口服給藥對(duì)象的膠囊、片劑和丸劑可以提供有腸衣，包括例如甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的共聚物、醋酸纖維素、醋酸纖維素鄰苯二甲酸酯或羥基丙基甲基纖維素。
本發(fā)明的組合物可以以與劑型相容的方式給藥，其劑量將是預(yù)防和/或治療有效的。給藥的劑量一般在每劑5μg到250μg MAA的范圍內(nèi)，依賴于被治療的對(duì)象、對(duì)象的免疫系統(tǒng)合成抗體的能力以及所需的保護(hù)程度。優(yōu)選的范圍是從每劑大約15μg到大約50μg。
合適的劑量大小是大約0.5ml。因此，例如用于肌肉內(nèi)注射的劑量將為0.5ml，其中含有20μg MAA，與0.5％的佐劑混合。
準(zhǔn)確的劑量將由有經(jīng)驗(yàn)的開業(yè)醫(yī)生根據(jù)與需要治療的對(duì)象有關(guān)的因素來(lái)確定。劑量和給藥方式被調(diào)整以提供足夠水平的活性MAA或維持所需的預(yù)防或減輕病毒信號(hào)或癥狀的效力、或減輕病毒感染的嚴(yán)重性。可能需要考慮的因素包括疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性、對(duì)象的整體健康狀況、對(duì)象的年齡、體重和性別、飲食、給藥的時(shí)間和頻率、藥物的組合、反應(yīng)靈敏性和對(duì)治療的耐受性/反應(yīng)。
組合物可以以單劑的方式提供，也可以以多劑的方式提供。多劑的方式是在最初的給藥過(guò)程中使用1-10劑，隨后在維持或加強(qiáng)免疫反應(yīng)所需的時(shí)間間隔使用其它劑量，例如在1到4個(gè)月內(nèi)使用第二劑，如果需要，在幾個(gè)月后使用后續(xù)劑量。服藥方案也將至少部分由個(gè)體的需要所確定，并依賴于開業(yè)醫(yī)生的判斷。
本發(fā)明將在下面的非限制性的實(shí)施例中進(jìn)行更詳細(xì)的描述。
實(shí)施例1多抗原因子結(jié)構(gòu)(MAAs)的合成利用現(xiàn)有的方法(Kragol和Otvos(2001)Tetrahedron 57957-66)，通過(guò)3個(gè)準(zhǔn)正交的可移除氨基保護(hù)基團(tuán)的組合，固相合成了多價(jià)的甘露糖基化的(1)M2e-Man-MAA，結(jié)構(gòu)如下
(SEQ ID NO2)以及非甘露糖基化的肽結(jié)構(gòu)(1)M2e-MAA，結(jié)構(gòu)如下 (SEQ ID NO3)和(2)M2e-MAA，結(jié)構(gòu)如下 (SEQ ID NO4)。二硫鍵連接的八聚體肽結(jié)構(gòu)(4)M2e-MAA的結(jié)構(gòu)如下 (SEQ ID NO5)帶有4個(gè)拷貝的M2e以及輔助性T細(xì)胞決定簇S1和S2各2個(gè)拷貝，它是通過(guò)帶有游離巰基的半胱氨酸衍生物在溶液中形成分子間二硫鍵而制成的(Kragol等，(2001)Bioorg.Med.Chem.Lett.111417-20)。組成為Cys-Gly-Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-β-Ala(SEQ ID NO6)的Cys骨架和組成為
(SEQ ID NO7)的Cys-M2e的肽結(jié)構(gòu)是在連續(xù)流動(dòng)的自動(dòng)肽合成儀Miligen 9050上使用常規(guī)的Fmoc化學(xué)來(lái)裝配的(Fields和Noble(1990)Int.J.Pept.Protein Res.35161-214)。在這些結(jié)構(gòu)中，S1是Ser-Phe-Glu-Arg-Phe-Glu-Ile-Phe-Pro-Lys-Glu(SEQ ID NO8)，S2是His-Asn-Thr-Asn-Gly-Val-Thr-Ala-Ala-Ser-Ser-His-Glu(SEQ ID NO9)，以及M2e是Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Ser-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp-Pro(SEQ ID NO10)。使用起始裝載量為0.3mmol/g的Fmoc TentaGel S RAM樹脂(Advanced Chem Tech，Louisville，KY)。對(duì)于鏈的延伸，4摩爾過(guò)量的氨基酸在原位用HATU活化。偶聯(lián)的時(shí)間從1到2.5小時(shí)，這由肽參考算法(peptide companionalgorithm)(Windowchem，F(xiàn)airfield，CA)所預(yù)測(cè)的偶聯(lián)難度所決定。在合成Cys骨架的肽結(jié)構(gòu)中，半胱氨酸N-端的氨基基團(tuán)用Boc基團(tuán)保護(hù)，而賴氨酸的側(cè)鏈氨基基團(tuán)帶有Aloc保護(hù)。通過(guò)催化脫氫選擇性地移除Aloc基團(tuán)，然后同時(shí)進(jìn)行兩個(gè)24-聚體的M2e肽的肽鏈裝配，給出了完全保護(hù)的肽結(jié)構(gòu)Cys-M2e。在存在5％thioanisol和5％水的情況下使用三氟乙酸將肽從樹脂上切下，然后用PR-HPLC純化。肽的純度通過(guò)RP-HPLC和MALDI質(zhì)譜來(lái)確認(rèn)。
肽-DNA嵌合體使用兩種方法之一來(lái)制備。一種方法包括使用傳統(tǒng)的Fmoc化學(xué)和適當(dāng)?shù)牧u基羧酸連接子將肽或核酸片段共合成(Soukchareun等，(1995)Bioconjugate Chemistry 643-53)。第二種方法包括使用含有巰基(thiol)的雙功能偶聯(lián)試劑來(lái)進(jìn)行化學(xué)連接(Soukchareun等，(1998)Bioconjugate Chemistry 9466-475；Stetsenko和Gait(2000)J.Org.Chem.654900-4908)。
實(shí)施例2培養(yǎng)基和溶液ISC-CM的組成為Iscove’s Dulbecco’s培養(yǎng)基(Life Technologies，Gaithersburg，MD)，添加有0.05mM 2-巰基乙醇、0.005mg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma，St.Louis，MO)、2mM谷氨酰胺(JRH Biosciences，Lenexa，KS)和0.05mg/ml慶大霉素(Mediatech，Herndon，VA)。當(dāng)指明時(shí)，ISC-CM中還進(jìn)一步添加有胎牛血清(FCS)(HyClone Laboratories，Logan，UT)或牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，St.Louis，MO)。pH7.2的磷酸鹽緩沖液中添加有3mM NaN3(PBSN)。
實(shí)施例3病毒PR8(A/PR/8/34(H1N1))是適應(yīng)小鼠的病毒株。PR8-SEQ14是在存在14個(gè)不同的PR8(HA)特異性單克隆抗體的情況下從PR8通過(guò)連續(xù)篩選獲得的野化突變株。X31是重排病毒，含有除了編碼H3和N2的基因以外所有來(lái)自PR8的基因，它們來(lái)自(A/Aichi/68(H3N2))(Kilbourne(1969)Bull.WHO 41643-5)。JAP是(A/Japan/305/57(H2N2))，B/LEE是B型流感病毒株B/Lee/40。
實(shí)施例4M2e特異性雜交瘤的產(chǎn)生三個(gè)M2e特異性雜交瘤(M2-56、M2-80、M2-86)來(lái)自已用兩次連續(xù)的感染攻擊的BALB/c小鼠，第一次用PR8，第二次用X31。在融合前3天，給小鼠通過(guò)靜脈內(nèi)注射5μg(4)M2e-MAA的PBS，將脾細(xì)胞與Sp2/O骨髓瘤細(xì)胞融合。兩個(gè)雜交瘤(M2-1、M2-15)來(lái)自于已經(jīng)從三次連續(xù)的異源亞型感染(第一次用PR8、第二次用X31、第三次用JAP)中恢復(fù)、并用5μg(4)M2e-MAA與3μg硫代磷酸酯化的寡聚脫氧核苷酸(ODN)c1826和0.5μg霍亂毒素(CT)一起通過(guò)鼻內(nèi)加強(qiáng)的小鼠。三天后將來(lái)自導(dǎo)流淋巴結(jié)(頸淺動(dòng)脈和縱隔淋巴結(jié))的細(xì)胞融合。從雜交培養(yǎng)液中篩選能夠在ELISA中與(1)M2e-MAA和/或JAP感染的Madin Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞反應(yīng)的抗體的分泌。通過(guò)這些步驟產(chǎn)生的所有M2e特異性雜交瘤都與M2e-MAA和JAP感染的MDCK細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)。雜交瘤14C2在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的(Zebedee和Lamb(1988)同上)。
實(shí)施例5通過(guò)ELISA測(cè)量抗體Costar血清簇的圓底聚乙烯板的孔用(1)M2e-MAA包被，這是通過(guò)用25μl濃度為0.5μg/ml的(1)M2e-MAA的PBSN在室溫保溫過(guò)夜(蓋上以避免蒸發(fā))來(lái)進(jìn)行的。在分析前板用含有1％BSA的PBSN封閉1到2小時(shí)。JAP-MDCK ELISA板的制備如下MDCK細(xì)胞在Falcon的平底96孔聚苯乙烯微量試驗(yàn)tc板中生長(zhǎng)至匯合成片，這通常是通過(guò)在每個(gè)孔中，接種4×104MDCK細(xì)胞的100μl含有5％FCS的ISC-CM來(lái)進(jìn)行的。在保溫(37℃，6％CO2)一天后，用PBS清洗單層細(xì)胞以除去血清成分，再與50μl含有大約106TCID50的JAP病毒的ISC-CM保溫(37℃)以進(jìn)行感染。1小時(shí)后，在每個(gè)孔中加入100μl含有5％FCS的ISC-CM，如上述繼續(xù)保溫6到7小時(shí)。然后用PBS清洗單層細(xì)胞，用5％緩沖的Formalde-Fresh(FisherChemical，Pittsburgh，PA)在室溫保溫5分鐘進(jìn)行固定，用PBSN清洗，并用含有1％BSA的PBSN在4℃封閉和儲(chǔ)存。在ELISA中，所有的測(cè)試樣品和試劑都用含有1％BSA的PBSN稀釋，每個(gè)圓底孔使用25μl，每個(gè)平底孔使用50μl，在室溫保溫90分鐘。結(jié)合的小鼠抗體一般使用生物素化的大鼠抗小鼠Cκ單克隆抗體187.1、然后用鏈親和素標(biāo)記的AP(Sigma，St.Louis，MO)和pNPP(Sigma，St.Louis，MO)來(lái)檢測(cè)。pNPP溶液在每個(gè)圓底和平底孔中分別使用50μl和100μl。一般在保溫30-45分鐘后，使用EMAX讀板器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)測(cè)量光吸收，OD405和OD750之間的差(OD405-750)被記錄下來(lái)。所有的分析中都包括了對(duì)具有適當(dāng)特異性的純化的單克隆抗體的滴定，以便對(duì)測(cè)試樣品進(jìn)行定量。ELISA數(shù)據(jù)用SOFTMAX PRO軟件(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)進(jìn)行分析。
實(shí)施例6CD4+T細(xì)胞反應(yīng)的分析抗原呈遞細(xì)胞(APC)從首次用于實(shí)驗(yàn)的BALB/c小鼠的脾臟制備。PERCOLLTM(PHARMACIA，Uppsala，Sweden)被添加到細(xì)胞懸浮液中至終濃度為33％。懸浮液用少量體積的70％PERCOLLTM覆蓋，離心(10分鐘，600g，室溫)以除去細(xì)胞碎片和紅細(xì)胞。處于33％/70％界面的細(xì)胞被收獲、清洗、輻射照射(2200拉德)，以5×106細(xì)胞/ml的濃度懸浮于ISC-CM中。在平底的組織培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入100μl。每個(gè)孔中以50μl體積加入抗原的ISC-CM。在每個(gè)孔中加入50μl反應(yīng)細(xì)胞懸浮液，這一般是107/ml MedLN細(xì)胞或4×105/ml Th克隆的ISC-CM。在保溫的第三天(Th克隆)或第四天(LN反應(yīng)細(xì)胞)加入1μCi H3標(biāo)記的胸苷。然后將板凍融一次，細(xì)胞用Skatron細(xì)胞收集器(Skatron Instruments Inc.，Sterling，VA)在濾層(Skatron Instruments Inc.，Sterling，VA)上收集。用打孔機(jī)打下的濾層片轉(zhuǎn)移到閃爍液中計(jì)數(shù)以測(cè)定放射活性。
實(shí)施例7CD8+記憶性T細(xì)胞反應(yīng)的分析來(lái)自免疫接種小鼠的脾臟細(xì)胞象在33％/70％PERCOLLTM梯度中那樣純化，并用作反應(yīng)細(xì)胞。A20細(xì)胞(H2d，II類MHC陽(yáng)性)用PR8感染(106TCID50/106A20，37℃，1小時(shí))，用4400拉德進(jìn)行輻射照射，清洗，并用作刺激細(xì)胞。培養(yǎng)物(6ml)提供在T25Falcon瓶中，包括25×106反應(yīng)細(xì)胞和106刺激細(xì)胞的含有5％FCS的ISC-CM。在培養(yǎng)(靜置，向上)5天后，活細(xì)胞在33％/70％PERCOLLTM梯度中純化，計(jì)數(shù)，在4小時(shí)的保溫期間使用標(biāo)準(zhǔn)的方法(Mozdzanowska等，(1997)Virology 239217-25)測(cè)試它們誘導(dǎo)從PR8和B/Lee感染的P1.HTR靶細(xì)胞中釋放51Cr的能力。
實(shí)施例8免疫方案M2e-MAAs和佐劑，總體積為50μl，被放置在麻醉小鼠的鼻孔上(氯胺酮和甲苯噻嗪分別以每公斤體重70mg和7mg的量腹膜內(nèi)注射)，使其被吸入到呼吸道內(nèi)。每劑為50μl，含有3μg M2e-MAA、3μg ODN1826(Krieg等，(1995)Nature 374546-9；Yi等，(1998)J.Immunol.1604755-61)和0.5μg CT(Sigma，St.Louis，MO)。佐劑的組成和服藥基于標(biāo)準(zhǔn)的方法(Mozdzanowska等，(1999)，同上)。以4到5周的間隔給藥加強(qiáng)接種。接受不含M2e-MAA的佐劑溶液的小鼠被用作陰性對(duì)照，而已進(jìn)行兩次連續(xù)的呼吸道感染、第一次用PR8和第二次用PR8-SEQ14的小鼠被用作陽(yáng)性對(duì)照。
實(shí)施例9病毒攻擊實(shí)驗(yàn)疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)的強(qiáng)度通過(guò)用大約103MID50(50％小鼠感染劑量)的X31鼻內(nèi)攻擊小鼠來(lái)測(cè)試。三天后，將小鼠麻醉，通過(guò)心臟穿刺放血，解剖以收集鼻、氣管和肺組織。感染性病毒的滴度通過(guò)在MDCK細(xì)胞培養(yǎng)液中或含胚的雞蛋中使用標(biāo)準(zhǔn)的方法(McCluskie和Davis(2000)同上)滴定組織勻漿液來(lái)測(cè)定。
實(shí)施例10針對(duì)MAAs的免疫反應(yīng)的體外分析為了誘導(dǎo)針對(duì)天然病毒M2e的Th依賴性抗體反應(yīng)，M2e-MAAs帶有與天然病毒誘導(dǎo)的M2e相同的B細(xì)胞決定簇，并含有能夠呈遞到Th細(xì)胞的決定簇。在ELISA中比較了JAP-MDCK細(xì)胞和M2e-MAAs與幾種M2e特異性單克隆抗體的反應(yīng)。14C2單克隆抗體從用純化的病毒M2免疫的小鼠中產(chǎn)生(Zebedee和Lamb(1988)同上)，所有其它的抗體是從連續(xù)的A型流感病毒感染中恢復(fù)、并在融合前三天用(4)M2E-MAA加強(qiáng)的小鼠中分離。最后用(4)M2e-MAA加強(qiáng)是為了增加M2e特異性雜交瘤的分離頻率。所有6種M2e特異性的單克隆抗體與M2e-MAA和JAP-MDCK反應(yīng)都很好，盡管其中有4個(gè)與JAP-MDCK結(jié)合比與用1.5ng/孔的(1)M2e-MAA包被的孔的結(jié)合稍微有效一些，而另外2個(gè)結(jié)合稍微低一些。這些數(shù)據(jù)表明M2e-MAAs有效地模擬了幾個(gè)天然的病毒誘導(dǎo)的四聚體M2e的B細(xì)胞決定簇。
結(jié)構(gòu)上有所不同的M2e-MAAs，當(dāng)使用與M2e相同的摩爾濃度時(shí)，在與M2e特異性單克隆抗體反應(yīng)時(shí)沒(méi)有明顯的不同。
為了最適化Th介導(dǎo)的幫助，兩個(gè)不同的Th決定簇被整合到MAAs中，一個(gè)(S1)被Ed呈遞，另一個(gè)(S2)被Ad呈遞。這兩個(gè)決定簇被鑒定為BALB/c(H-2d)小鼠HA(PR8)特異性Th反應(yīng)的兩個(gè)免疫顯性靶(Gerhard等，(1991)J.Virol.65364-72)。S1對(duì)應(yīng)于HA的110-120區(qū)域，S2對(duì)應(yīng)于126-138區(qū)域。但是，現(xiàn)在結(jié)構(gòu)中的S2肽與天然的S2相比發(fā)生了改變，135位的半胱氨酸被絲氨酸所取代，以避免在S2和包含在M2e肽中的半胱氨酸之間形成二硫鍵。
MAAs刺激S1和S2特異性Th克隆的效力在含有被輻射的BALB/c脾細(xì)胞作為APCs、S1或S2特異性Th克隆作為反應(yīng)細(xì)胞、以及不同濃度的游離S1或S2肽、M2e-MAAs或純化的HA的培養(yǎng)物中測(cè)定。Th克隆的增殖通過(guò)在培養(yǎng)的第三天摻入的3H標(biāo)記的胸苷的量來(lái)評(píng)估。所有的M2e-MAAs都刺激S1特異性Th克隆V2.1，與游離的S1肽相比能力相當(dāng)或更高。甘露糖基化的MAA被觀察到了高100倍的刺激能力，這很可能是由于在APCs上表達(dá)的甘露糖受體提高了該MAA的捕獲(Engering等，(1997)Eur.J.Immunol.272417-2；Tan等，(199)Eur.J.Immunol.272426-35)。該MAA的刺激活性在摩爾的基礎(chǔ)上與也含有甘露糖基化的糖側(cè)鏈的HA分子的活性相同(Keil等，(1985)EMBO J.42711-20)。
相反，沒(méi)有MAAs刺激了S2特異性的Th克隆5.1-5R6。該Th克隆對(duì)分離的天然S2肽和完整的HA的刺激反應(yīng)良好，因此135位的半胱氨酸改變?yōu)榻z氨酸可能減小了它對(duì)該Th克隆的刺激能力。另外兩個(gè)不相干克隆的S2特異性Th克隆被測(cè)驗(yàn)，也不能對(duì)MAAs發(fā)生反應(yīng)。因?yàn)?35位的半胱氨酸改變?yōu)榻z氨酸不影響肽結(jié)合Ad的能力(Sette等，(1989)J.Immunol.14235-40)，它可能形成了抗原性為新的Th決定簇，該決定簇不能被特異于天然S2決定簇的Th所識(shí)別。S2/Ad復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)分析表明135位的氨基酸不是錨定殘基(Scott等，(1998)Immunity 8319-29)。
因此，體外分析表明M2e-MAAs模擬了天然病毒誘導(dǎo)的M2e的B細(xì)胞決定簇，并且含有至少一個(gè)功能性的Th決定簇。
序列表<110>威斯特研究所(THE WISTAR INSTITUTE)預(yù)防或治療病毒感染的組合物和方法<120>(COMPOSITION AND METHOD FOR PREVENTING ORTREATING A VIRUSINFECTION)<130>SCT052929-47<150>US 60/441,374<151>2003-01-16<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetic multiple antigenic agent<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>N-terminal amino qroup has attached R1which is 0 to 2 aminoacid residues，wherein said amino acid residue may be a Gly or Cys，or a nucleic acid sequence.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>Side chain amino group has attached R2 which is a B celldeterminant，a T cell determinant，or a targeting molecule.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>Side chain amino group has attached R3 which is a B celldeterminant，a T cell determinant，or a targeting molecule.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>″Xaa″represents 0 to 1 amino acid residue of Lys-R4，wherein R4is a B cell determinant，a T cell determinant，or a targeting molecule.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)
<223>C-terminus has attached R5 group which is an amino acid，peptide，or nucleic acid sequence.
<400>1Lys Gly Lys Gly Xaa1 5<210>2<211>14<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetic multiple antigenic agent<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>Mannosylated residue<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>Mannosylated serine residue attached to side chain amino group<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>Mannosylated serine residue attached to side chain amino group<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>Mannosylated serine residue attached to side chain amino group<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>S2 peptide attached to side chain amino group<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>S1 peptide attached to side chain amino group<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>M2e peptide attached to side chain amino group
<400>2Ser Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Ala1 5 10<210>3<211>13<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetic multiple antigenic agent<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>Serine attached to side chain amino group<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>Serine attached to side chain amino group<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>S2 peptide attached to side chain amino group<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(9)..(9)<223>S1 peptide attached to side chain amino group<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>M2e peptide attached to side chain amino group<400>3Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Ala1 5 10<210>4<211>12<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetic multiple antigenic agent<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)<223>Serine residue attached to side chain<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>S2 peptide attached to side chain amino group<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>S1 peptide attached to side chain amino group<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>M2e peptide attached to side chain amino group<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>M2e peptide attached to side chain amino group<400>4Ser Cys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Ala1 5 10<210>5<211>11<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetic multiple antigenic agent<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>Dimer created by disulfide linkage<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>S2 peptide attached to side chain amino group<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>S1 peptide attached to side chain amino group
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>M2e peptide attached to side chain amino group<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(9)..(9)<223>M2e peptide attached to side chain amino group<400>5Cys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Ala1 5 10<210>6<211>8<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetic multiple antigenic agent<400>6Cys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Ala1 5<210>7<211>8<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetic multiple antigenic agent<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>M2e petide attached to side chain amino group<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>M2e petide attached to side chain amino group<400>7Cys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Ala1 5<210>8<211>11
<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetic S1 peptide<400>8Ser Phe Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu1 5 10<210>9<211>13<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetic S2 peptide<400>9His Asn Thr Asn Gly Val Thr Ala Ala Ser Ser His Glu1 5 10<210>10<211>24<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetic M2e peptide<400>10Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys1 5 10 15Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Pro20
權(quán)利要求
1.一種多抗原因子，其中包含如下結(jié)構(gòu) (SEQ ID NO1)，其中R1是0-2個(gè)氨基酸殘基，包含Cys或Gly或核酸序列；m至少為1；n至少為1；Xaa1是0-1個(gè)氨基酸殘基，包含Lys-R4；R2、R3和R4互相獨(dú)立的是B細(xì)胞決定簇、T細(xì)胞決定簇或定向分子；以及R5是任何氨基酸、肽或核酸序列。
2.權(quán)利要求1中的多抗原因子，其中的B細(xì)胞決定簇包含基質(zhì)蛋白2的胞外結(jié)構(gòu)域或其類似物。
3.權(quán)利要求1中的多抗原因子，其中的第一個(gè)和第二個(gè)多抗原因子的R1是Cys-Gly，以及該第一個(gè)和第二個(gè)多抗原因子的該Cys殘基共價(jià)結(jié)合產(chǎn)生二聚體。
4.含有權(quán)利要求1中的多抗原因子和可藥用的載體的組合物。
5.權(quán)利要求4中的組合物，其中的組合物還含有佐劑。
6.權(quán)利要求4中的組合物，其中的組合物含有疫苗。
7.權(quán)利要求5中的組合物，其中的組合物含有疫苗。
8.一種預(yù)防或治療病毒感染的方法，包括給對(duì)象施用有效劑量的權(quán)利要求4中的組合物，以預(yù)防或治療病毒感染的信號(hào)或癥狀。
9.一種預(yù)防或治療病毒感染的方法，包括給對(duì)象施用有效劑量的權(quán)利要求5中的組合物，以預(yù)防或治療病毒感染的信號(hào)或癥狀。
10.一種預(yù)防或治療病毒感染的方法，包括給對(duì)象施用有效劑量的權(quán)利要求6中的組合物，以預(yù)防或治療病毒感染的信號(hào)或癥狀。
11.一種預(yù)防或治療病毒感染的方法，包括給對(duì)象施用有效劑量的權(quán)利要求7中的組合物，以預(yù)防或治療病毒感染的信號(hào)或癥狀。
12.權(quán)利要求8中的方法，其中的病毒感染包括A型流感病毒。
13.權(quán)利要求9中的方法，其中的病毒感染包括A型流感病毒。
14.權(quán)利要求10中的方法，其中的病毒感染包括A型流感病毒。
15.權(quán)利要求11中的方法，其中的病毒感染包括A型流感病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供多抗原因子組合物及其用于預(yù)防或治療病毒感染。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1738643SQ200480002408
公開日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2004年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月16日
發(fā)明者沃爾特·格哈德, 拉斯洛·厄特沃什 申請(qǐng)人:威斯特研究所