專利名稱：Hpv31l1在酵母中的優(yōu)化表達的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及人乳頭瘤病毒(HPV)的治療。更具體地，本發(fā)明涉及編碼HPV31 L1蛋白質的合成多核苷酸，還涉及含有所述多核苷酸的重組載體和宿主。本發(fā)明還涉及HPV31病毒類似顆粒(VLPs)和它們在用于預防和治療HPV的疫苗和藥物組合物中的用途。
背景技術：
有80種以上的人乳頭瘤病毒(HPV)，許多與多種生物表型有關，這些表型從良性增殖性瘤到惡性癌(綜述見McMurray等人，Int.J.Exp.Pathol.82(1)15-33(2001))。HPV6和HPV11是最通常與良性瘤、非惡性尖銳濕疣和/或生殖或呼吸粘膜的低等發(fā)育異常相關的類型。HPV16和HPV18是高危險類型，最經(jīng)常與宮頸、陰道、陰門和肛管的原位和侵染性癌相關。90％以上的宮頸癌與HPV16、HPV18或者較不普遍的致癌類型HPV31、-33、-45、-52和-58有關(Schiffman等人，J.Natl.Cancer Inst.85(12)958-64(1993))。觀察到在90-100％宮頸癌中檢測到HPV DNA，該觀察提供了有力的疫學證據(jù)證明HPVs導致宮頸癌(見Bosch等人，J.Clin.Pathol.55244-265(2002))。
乳頭瘤病毒是小的(50-60nm)、無被膜的十二面體DNA病毒，其編碼多達8種早基因和2種晚基因。病毒基因組的可讀框(ORFs)稱作E1到E7，和L1和L2，其中“E”代表早，“L”代表晚。L1和L2編碼病毒殼體蛋白質，而E基因與諸如病毒復制和細胞轉化的功能有關。
L1蛋白質是主要的殼體蛋白并且具有55-60kDa的分子量。L2蛋白質是次要的殼體蛋白。免疫學數(shù)據(jù)表明多數(shù)L2蛋白質是L1蛋白質內(nèi)部的。L1和L2蛋白質在不同乳頭瘤病毒中都高度保守。
L1蛋白質或者L1和L2蛋白質在酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞或者細菌中的表達導致病毒類似顆粒(VLPs)的自裝配(綜述見Schiller和Roden，Papillomavirus ReviewsCurrent Research onPapillomaviruses；Lacey，編者Leeds，UKLeeds MedicalInformation，101-12頁(1996))。VLP在形態(tài)上與真實的病毒體相似并且當施用于動物或者人時能夠誘導高效價中和抗體。因為VLPs不含有潛在的致癌病毒基因組，所以它們提供了HPV疫苗開發(fā)中對活病毒使用的安全的備選方案(綜述見Schiller和Hidesheim，J.Clin.Virol.1967-74(2000))。為此，已經(jīng)將L1和L2基因鑒定為開發(fā)HPV感染和疾病的預防和治療性疫苗的免疫靶標。
HPV疫苗開發(fā)和商業(yè)化受到了與在成功轉化的宿主生物中得到殼體蛋白的高表達水平有關困難的阻礙，限制了純化蛋白質的生產(chǎn)。因此，盡管鑒定了編碼HPV L1蛋白質如HPV31 L1蛋白質的野生型核苷酸序列(Goldsborough等人，Virology 171(1)306-311(1989)，將非常希望開發(fā)粗品HPV蛋白質的容易更新的來源，所述來源利用在目標宿主細胞中優(yōu)化表達的HPV31 L1編碼核苷酸序列。此外，有用的是產(chǎn)生大量具有天然蛋白質的免疫賦予性質的HPV31 L1 VLPs以用于疫苗開發(fā)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于引起或增強對HPV31 L1基因表達的蛋白質產(chǎn)物的免疫性的組合物和方法，其中HPV31 L1基因與宮頸癌有關。具體地，本發(fā)明提供了編碼HPV31 L1蛋白質的多核苷酸，其中所述多核苷酸沒有酵母識別的內(nèi)部轉錄終止信號。還提供了編碼HPV31 L1的合成多核苷酸，其中所述多核苷酸已經(jīng)經(jīng)密碼子優(yōu)化以在酵母細胞中高水平表達。本發(fā)明還提供了HPV31病毒類似顆粒(VLP)并公開了所述VLPs在用于預防和/或治療HPV疾病或者HPV-相關的癌癥的免疫原性組合物和疫苗中的用途。
本發(fā)明還涉及編碼HPV31 L1蛋白質的合成DNA分子。在本發(fā)明的一方面，改變合成分子的核苷酸序列以除去酵母識別的轉錄終止信號。另一方面，設計合成分子的密碼子使得使用酵母細胞優(yōu)選的密碼子。所述合成分子可用作HPV31 L1蛋白質的來源，所述蛋白質可以自身裝配成VLPs。所述VLPs可以用于基于VLP的疫苗。
本發(fā)明的具體實施方案包括合成的核酸分子，其編碼如SEQ IDNO4中提出的HPV31 L1蛋白質，所述核酸分子含有如SEQ ID NO2或SEQ ID NO3中提出的核苷酸序列。
如上所述，文中提供了編碼HPV31 L1基因的合成的多核苷酸，其沒有酵母識別的轉錄終止信號。本發(fā)明還提供了編碼如所述的HPV31 L1的合成多核苷酸，將其進一步改變以含有酵母細胞優(yōu)選的密碼子。
還提供了含有整個說明書中公開的核酸分子的重組載體和重組宿主細胞，該宿主細胞可以是原核或者真核的。
本發(fā)明涉及在重組宿主細胞中表達HPV31 L1蛋白質的方法，其包括(a)將含有編碼HPV31 L1蛋白質的核酸導入酵母宿主細胞；其中所述核酸分子沒有酵母識別的內(nèi)部轉錄終止信號和；(b)在允許所述HPV31 L1蛋白質表達的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞。
本發(fā)明還涉及在重組宿主細胞中表達HPV31 L1蛋白質的方法，其包括(a)將含有編碼HPV31 L1蛋白質的載體導入酵母宿主細胞；其中所述核酸分子受到密碼子優(yōu)化以在酵母宿主細胞中最佳表達和；(b)在允許所述HPV31 L1蛋白質表達的條件下培養(yǎng)酵母宿主細胞。
在優(yōu)選實施方案中，所示核酸含有如SEQ ID NO2或SEQ IDNO3中提出的核苷酸序列。
本發(fā)明還涉及HPV31病毒類似顆粒(VLPs)、產(chǎn)生HPV31 VLP的方法，和使用HPV31 VLP的方法。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，在酵母中產(chǎn)生HPV31 VLP。在進一步優(yōu)選的實施方案中，酵母選自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)、胞壁克魯維氏酵母(Kluyvermyces fragilis)、乳克魯維氏酵母(Kluyveromyces lactis)、和粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
本發(fā)明的另一方面是HPV31 VLP，其含有無酵母識別的轉錄終止信號的HPV31 L1基因產(chǎn)生的HPV31 L1蛋白質。
本發(fā)明的另一方面是HPV31 VLP，其含有經(jīng)密碼子優(yōu)化的HPV31L1基因產(chǎn)生的HPV31 L1蛋白質。在本發(fā)明的該方面的優(yōu)選實施方案中，經(jīng)密碼子優(yōu)化的HPV31 L1基因基本上由SEQ ID NO2或SEQID NO3中提出的核苷酸序列組成。
本發(fā)明還提供了在動物中誘導免疫應答的方法，該方法包括對該動物施用HPV31病毒類似顆粒。在優(yōu)選實施方案中，通過密碼子優(yōu)化的基因產(chǎn)生HPV31 VLP。在進一步優(yōu)化的實施方案中，通過無酵母識別的轉錄終止序列的基因產(chǎn)生HPV31 VLP。
本發(fā)明的另一方面是防止或治療HPV-相關的宮頸癌的方法，該方法包括對哺乳動物施用含有HPV31 VLP的疫苗。在本發(fā)明的該方面的優(yōu)選實施方案中，在酵母中產(chǎn)生HPV31 VLP。
本發(fā)明還涉及含有HPV31病毒類似顆粒(VLPs)的疫苗。
在本發(fā)明的該方面的備選實施方案中，所述疫苗還含有至少一種額外HPV類型的VLPs。在優(yōu)選實施方案中，至少一種額外的HPV類型選自HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59、和HPV68。
如說明書全文和所附權利要求書中所用的，除非明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復數(shù)。
如說明書全文和所附權利要求書中所用的，應用下面的定義和簡寫術語“啟動子”指DNA鏈上RNA聚合酶結合的識別位點。啟動子與RNA聚合酶形成起始復合體以開始和驅動轉錄活性。通過稱作“增強子”或者“上游活化序列”的活化序列或者稱作“沉默子”的抑制序列可以修飾該復合體。
術語“載體”指某些工具，通過它們可以將DNA片段導入宿主生物或者宿主組織中。有多種類型的載體，包括質粒、病毒(包括腺病毒)、噬菌體和粘粒。
名稱“31 L1野生型序列”指如SEQ ID NO1中公開的HPV31 L1序列。盡管HPV 31 L1野生型序列以前已被描述，但是在從臨床分離物所得的DNA之間發(fā)現(xiàn)小的序列差異并不罕見。因此，代表性HPV31L1野生型序列從以前表明含有HPV31 DNA的臨床樣品分離(見實施例1)。31 L1野生型序列用作參考序列以比較文中公開的經(jīng)密碼子優(yōu)化的HPV31 L1序列(見

圖1)。
名稱“31 L1部分重建”指文中公開的構建體(SEQ ID NO2)，其中HPV31 L1核苷酸序列經(jīng)部分重建而含有用于在酵母中最佳表達的酵母優(yōu)化的密碼子。31 L1部分重建包括在HPV 31 L1野生型核苷酸序列的中間部分(核苷酸697-1249)改變。重建帶有酵母優(yōu)選的密碼子的完整HPV 31 L1序列，其在文中也稱作“31 L1完全重建”(SEQ ID NO3)。
術語“有效量”指導入足夠疫苗組合物以產(chǎn)生足夠水平的多肽，從而導致免疫應答。本領域技術人員將認識到該水平可以改變。
“保守氨基酸替換”指將一個氨基酸殘基通過另一個化學上相似的氨基酸代替。這種保守替換的實例為用一個疏水殘基(異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸或者甲硫氨酸)替換另一疏水殘基；用一個極性殘基替換相同電荷的另一個極性殘基(例如，精氨酸替換賴氨酸；谷氨酸替換天冬氨酸)。
術語“哺乳動物”指任意哺乳動物，包括人類。
“VLP”或者“VLPs”指病毒類似顆粒。
“合成的”指HPV31 L1基因已經(jīng)受到修飾從而其含有與天然發(fā)生的野生型HPV31 L1基因中存在的核苷酸序列不同的核苷酸序列。如上文所述，文中提供了合成分子，其含有經(jīng)改變而除去酵母識別的轉錄終止信號的核苷酸序列。文中還提供了含有酵母細胞表達所優(yōu)選的密碼子的合成分子。文中提供的合成分子編碼與野生型HPV31 L1基因相同的氨基酸序列。
附圖簡述圖1是序列比對，其顯示了部分改變的(SEQ ID NO2)和完全重建的(SEQ ID NO3)的31 L1基因的核苷酸(見實施例2)。參考序列為31 L1野生型序列(SEQ ID NO1，見實施例1)。與參比序列相同的31 L1部分和完全重建序列中的核苷酸以點表示。經(jīng)改變的核苷酸在它們相應位置指出。括號中含有核苷酸編號。
圖2顯示了31 L1完全重建核苷酸序列(SEQ ID NO3)和氨基酸序列(SEQ ID NO4)。在左邊指出核苷酸編號。
圖3概述了三種HPV31 L1序列構建體之間的改變，其在左邊列出。第四欄指出所示構建體和31 L1野生型序列之間的百分數(shù)核苷酸同一性，第五欄指出氨基酸同一性。最后一欄指出改變成酵母優(yōu)選的密碼子序列的核苷酸編號和作出改變的區(qū)域。
圖4顯示了在高度嚴格條件下對HPV31 L1特異的RNA印跡(見實施例4)。左邊的箭頭指出HPV31 L1全長和截短的轉錄物的位置。標記“31wt”的泳道來自含有31L1野生型序列的酵母的相同RNA制備物。標記“16”的泳道含有來自HPV16的RNA，由于高度嚴格條件，所述RNA不被HPV31 L1探針識別。標記“Neg”的泳道是不含有L1編碼序列的酵母提取物。標記“31R”的泳道來自兩種單獨分離的表達31 L1部分重建序列的菌落的RNA。
圖5顯示了來自兩種捕獲放射免疫測定法(RIA)實驗的數(shù)據(jù)的部分，其以計數(shù)/分鐘(cpm)/mg總蛋白質表示(見實施例7)。RIA中所得Cpm是HPV31 L1 VLPs的相對指示。RIA數(shù)據(jù)表明來自酵母優(yōu)選的密碼子重建基因序列的酵母蛋白質提取物中增加的31 L1 VLP表達。
圖6顯示了通過透射電鏡術顯現(xiàn)的文中描述的31 L1 VLPs的代表性樣品(見實施例8)。條形代表100nm。
發(fā)明詳述多數(shù)宮頸癌與人乳頭瘤病毒(HPV)的特定致癌類型的感染有關。本發(fā)明涉及用于引起或增強對致癌HPV類型的基因表達的蛋白質產(chǎn)物的免疫的組合物和方法。具體地，本發(fā)明提供了編碼HPV31 L1蛋白質的多核苷酸和HPV31病毒類似顆粒(VLP)，并公開了所述多核苷酸和VLPs在用于預防和/或治療HPV相關癌癥的免疫原性組合物和疫苗中的用途。
已經(jīng)報導了野生型HPV31 L1核苷酸序列(Goldsborough等人，Virology 171(1)306-311(1989)；Genbank保藏號J04353)。本發(fā)明提供了編碼HPV31 L1蛋白質的合成的DNA分子。本發(fā)明的合成分子含有核苷酸序列，其中一些核苷酸已經(jīng)經(jīng)改變從而除去了酵母識別的轉錄終止信號。在備選實施方案中，設計合成分子的密碼子從而使用酵母細胞優(yōu)選的密碼子以便高水平表達。合成分子可用作HPV31 L1蛋白質的來源，所述蛋白質可以自裝配成VLPs。所述VLPs可用于基于VLP的疫苗以通過中和抗體和細胞介導的免疫提供針對乳頭瘤病毒感染的有效免疫預防。此類基于VLP的疫苗也可用于治療已經(jīng)確定的HPV感染。
在酵母細胞中表達HPV VLPs的優(yōu)點是效能成本合算并且容易適于在發(fā)酵罐中大規(guī)模生長。然而，許多HPV L1蛋白質，包括HPV31L1(見實施例4)，在酵母細胞中低水平表達。根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)確定HPV31 L1的低水平表達是由于存在酵母識別的轉錄終止信號導致mRNA轉錄物的截短。通過改變HPV31 L1 DNA以除去類似酵母轉錄終止位點的任何可能的序列，有可能促進全長mRNA的轉錄，從而增加HPV31 L1蛋白質表達。
因此，在本發(fā)明的一些實施方案中，已經(jīng)對HPV31 L1 DNA進行了改變以除去類似酵母轉錄終止信號的任何可能的序列。這些改變使得可以表達全長HPV31轉錄物，相對于截短的轉錄物(見實施例4)，提高了表達產(chǎn)率。
如上文提到的，本發(fā)明的合成DNA含有對野生型HPV31 L1序列的改變，所述改變用于除去酵母識別的轉錄終止位點。本領域中技術人員將認識到可以構建編碼HPV31 L1蛋白質的額外的DNA分子，但是其不含有酵母轉錄終止位點。關于發(fā)現(xiàn)酵母轉錄終止序列的技術是本領域中熟知的。酵母mRNA的轉錄終止和3’末端形成需要存在三種信號(1)效率元件，如TATATA或者相關序列，所述效率元件增強位于下游的定位元件(positioning elements)的效率；(2)定位元件，其確定poly(A)位點的位置和(3)多聚腺苷酸化位點(通常Py(A)n)。
有大量科學文獻描述編碼酵母轉錄終止信號的序列。見，例如，Guo和Sherman，Trends Biochem.Sci.21477-481(1986)；Guo和Sherman，Mol.Cell.Biol.16(6)2772-2776(1996)；Zaret等人，Ceull 28563-573(1982)；Henikoff等人，Cell 33607-614(1983)；Thalenfeld等人，J.Biol.Chem.258(23)14065-14068(1983)；Zaret等人，J.Mol.Biol.176107-135(1984)；Heidmann等人，Mol.Cell Biol 144633-4642(1984)；和Russo，Yeast 11447-453(1985)。因此，本領域技術人員對于確定避免哪些序列以構建產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的全長mRNA轉錄物的合成的HPV31 L1基因是沒有困難的。此外，用于評估合成序列中是否存在酵母轉錄終止序列的測定法和步驟是本領域中成熟的，因此，普通技術人員將能夠確定所構建的HPV31 L1序列是否含有需要除去的終止序列。
如上述，本發(fā)明涉及編碼HPV型31 L1蛋白質的核酸分子，該核酸分子沒有酵母識別的內(nèi)部轉錄終止信號。在本發(fā)明的代表性實施方案中，合成的核酸分子含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO3中給出的核苷酸序列。
在本發(fā)明的備選實施方案中，HPV31 L1基因序列經(jīng)“優(yōu)化”以在酵母細胞環(huán)境中高水平表達。本發(fā)明預期的經(jīng)密碼子優(yōu)化的HPV31L1基因包括編碼無酵母識別的內(nèi)部轉錄終止信號的HPV31 L1的合成分子，還包括經(jīng)密碼子優(yōu)化以在酵母細胞中高水平表達的至少一種密碼子。
四種可能的核苷堿基的“三聯(lián)體”密碼子可以以60種以上的變體形式存在。因為這些密碼子為僅20種不同的氨基酸提供信息(以及轉錄起始和終止信息)，一些氨基酸可以由一種以上的密碼子編碼，該現(xiàn)象稱作密碼子冗余。由于不完全了解的原因，備選密碼子不均勻地存在于不同類型細胞的內(nèi)源DNA中。實際上，在某種類型細胞中似乎存在可變的天然級別或者對某些密碼子的“優(yōu)選”。作為一個實例，氨基酸亮氨酸由包括CTA、CTC、CTG、CTT、TTA、和TTG的六種DNA密碼子的任一個指定。對微生物的基因組密碼子頻率的徹底分析已經(jīng)揭示大腸桿菌(E.coli)的內(nèi)源DNA最通常含有CTG亮氨酸指定密碼子，而酵母和粘液菌類的DNA最通常包括TTA亮氨酸指定密碼子?？紤]到該級別，通常認為通過大腸桿菌宿主得到富含亮氨酸的多肽的高水平表達將在某種程度上取決于密碼子使用頻率。例如，可能富含TTA密碼子的基因在大腸桿菌中的表達將很差，而富含CTG的基因可能在該宿主中高水平表達。類似地，在酵母宿主細胞中富含亮氨酸的多肽的表達的優(yōu)選密碼子將是TTA。
密碼子優(yōu)選現(xiàn)象對重組DNA技術的含義是顯然的，并且該現(xiàn)象可以用于解釋為了實現(xiàn)在成功轉化的宿主生物中高水平表達外源基因的許多以前的失敗—所插入的基因中可能重復存在較不“優(yōu)選”的密碼子并且進行表達的宿主細胞機器不能有效運行。該現(xiàn)象暗示經(jīng)設計而包括計劃的宿主細胞優(yōu)選密碼子的合成基因將提供用以實施重組DNA技術的外來遺傳物質的優(yōu)選形式。從而，本發(fā)明的一方面是經(jīng)密碼子優(yōu)化以在酵母細胞中表達的HPV31 L1基因。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用編碼相同蛋白質序列的備選密碼子可以除去對酵母細胞表達HPV31 L1蛋白質的抑制。
根據(jù)本發(fā)明，將HPV31 L1基因節(jié)段轉化成具有相同的翻譯序列但是具有如Sharpand Cowe(Synonymous Codon Usage inSaccharomyces cerevisiae.Yeast 7657-678(1991))所描述的備選密碼子選擇的序列，將所述文獻并入本文作為參考。該方法通常由鑒定野生型序列中通常不與高水平表達的酵母基因相關的密碼子并將這些密碼子由最佳密碼子替換以在酵母細胞中高水平表達組成。然后檢查新基因序列中通過這些密碼子替換產(chǎn)生的不想要的序列(例如，“ATTTA”序列、不小心產(chǎn)生的內(nèi)含子剪接識別位點、不想要的限制性酶位點，等等)。通過將現(xiàn)有密碼子用編碼相同氨基酸的不同密碼子替換除去不想要的序列。然后檢驗所合成的基因節(jié)段的提高的表達。
用上述方法產(chǎn)生合成的HPV31 L1基因節(jié)段，導致含有為高水平表達優(yōu)化的密碼子的基因。盡管上面的方法提供了我們關于設計用于HPV疫苗中的經(jīng)密碼子優(yōu)化基因的方法學概述，但是本領域技術人員可以理解通過該方法中的微小改變或者通過序列中的小的變化可以實現(xiàn)相似的疫苗功效或者增加的基因表達。
因此，本發(fā)明涉及合成的核苷酸序列，其含有編碼HPV31 L1蛋白質或者HPV31 L1蛋白質的生物活性片段或者突變形式的核苷酸序列，還涉及含有為在酵母宿主中表達優(yōu)化的密碼子的多核苷酸序列。所述HPV31 L1蛋白質的突變形式包括，但不限于保守氨基酸替換、氨基酸末端截短、羧基末端截短、缺失、或者加入。任何這種生物活性片段和/或突變體將編碼至少基本上模擬SEQ ID NO4中提出的HPV31 L1蛋白質的免疫學性質的蛋白質或者蛋白質片段。本發(fā)明的合成多核苷酸編碼表達功能HPV31 L1蛋白質的mRNA分子從而可用于開發(fā)治療性或預防性HPV疫苗。
本發(fā)明的一方面是編碼SEQ ID NO4中提出的HPV31 L1蛋白質的經(jīng)密碼子優(yōu)化的核酸分子，所述核酸分子含有SEQ ID NO2中提出的核酸序列。
本發(fā)明的另一方面是編碼SEQ ID NO4中提出的HPV31 L1蛋白質的經(jīng)密碼子優(yōu)化的核酸分子，所述核酸分子含有SEQ ID NO3中提出的核苷酸序列。
本發(fā)明還涉及原核生物和真核生物的重組載體和重組宿主細胞，所述重組載體和重組宿主細胞含有該說明書全文中公開的核酸分子。
通過文中描述的方法構建的合成HPV31 DNA或者其片段可以通過將其分子克隆到含有適宜的啟動子和其他適宜的轉錄調(diào)節(jié)元件的表達載體中并用該表達載體轉化到原核或真核宿主細胞以產(chǎn)生重組HPV31 L1進行重組表達。這些操作的技術在文獻中公開(Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，(1989)；CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel等人，Green Pub.Associatesand Wiley-Interscience，New York(1988)；YeastGeneticsALaboratory Course Manual，Rose等人，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1990)，將這些文獻完整并入本文作為參考)。
從而，本發(fā)明還涉及在重組宿主細胞中表達HPV31 L1蛋白質的方法，該方法包括(a)將含有編碼HPV31 L1蛋白質的核酸的載體導入酵母宿主細胞；其中該核酸分子經(jīng)密碼子優(yōu)化以在酵母宿主細胞中最佳表達和；(b)在允許所述HPV31 L1蛋白質表達的條件下培養(yǎng)酵母宿主細胞。
本發(fā)明還涉及在重組宿主細胞中表達HPV31 L1蛋白質的方法，其包括(a)將含有編碼HPV31 L1蛋白質的核酸的載體導入酵母宿主細胞；其中該核酸分子沒有酵母識別的內(nèi)部轉錄終止信號和；(b)在允許所述HPV31 L1蛋白質表達的條件下培養(yǎng)酵母宿主細胞。
本發(fā)明還涉及在重組宿主細胞中表達HPV31 L1蛋白質的方法，其包括(a)將含有SEQ ID NO2或SEQID NO3中提出的核酸的載體導入酵母宿主細胞；和(b)在允許所述HPV31 L1蛋白質表達的條件下培養(yǎng)宿主細胞。
本發(fā)明的合成基因可以裝配到表達盒中，該表達盒含有經(jīng)設計以提供在宿主細胞中有效表達HPV58 L1蛋白質的序列。該盒優(yōu)選含有合成基因，其可操作地連接轉錄和翻譯控制序列，如啟動子和終止序列。在優(yōu)選實施方案中，啟動子為釀酒酵母GAL 1啟動子，然而本領域技術人員將認識到可以使用許多其他公知的酵母啟動子的任一種，如GAL10、GAL7、ADH1、TDH3或PGK啟動子，或者其他真核基因啟動子。優(yōu)選的轉錄終止子是酵母ADH1終止子，盡管也可以使用其他公知的轉錄終止子。尤其優(yōu)選GAL1啟動子-ADH1終止子的聯(lián)合。
本發(fā)明的另一方面是HPV31病毒類似顆粒(VLP)、產(chǎn)生HPV31VLP的方法，和使用HPV31 VLP的方法。當人和動物乳頭瘤病毒的主要殼體蛋白質L1在酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞或者細菌中表達時，VLPs可以自裝配(綜述見Schiller和Roden，PapillomavirusReviewsCurrent Researchon Papillomaviruses；Lacey，編者Leeds，UKLeeds Medical Information，101-12頁(1996))。通過L1和L2殼體蛋白質組合的表達可以產(chǎn)生形態(tài)上難以辨別的HPV VLPs。VLPs在T＝7二十面體結構中由L1的72個五聚體組成(Baker等人，Biophys.J.60(6)1445-56(1991))。
VLPs在形態(tài)上類似于真實的病毒體并且在施用于動物時能夠誘導高效價的中和抗體。證明用VLPs免疫兔(Breitburd等人，J.Virol.69(6)3959-63(1995))和狗(Suzich等人，Proc.Natl.Acad.Sci.MM 92(25)11553-57(1995))都誘導針對實驗乳頭瘤病毒感染的中和抗體和保護。然而，因為VLPs不含有潛在的致癌病毒基因組并且可以從一種基因自裝配，所以它們?yōu)镠PV疫苗開發(fā)中活病毒的使用提供了安全的備選方案(綜述見Schiller和Hidesheim，J.Clin.Virol.1967-74(2000))。
從而，本發(fā)明涉及由HPV31的重組L1蛋白質或者重組L1+L2蛋白質組成的病毒類似顆粒。
1.在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，在酵母中產(chǎn)生HPV31 VLPs。在進一步優(yōu)選的實施方案中，酵母選自釀酒酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤氏酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母和粟酒裂殖糖酵母。
本發(fā)明的另一方面是HPV31 VLP，其含有沒有酵母識別的內(nèi)部轉錄終止信號的HPV31 L1基因產(chǎn)生的HPV31 L1蛋白質。
本發(fā)明的另一方面是含有經(jīng)密碼子優(yōu)化的HPV31 L1基因產(chǎn)生的HPV31 L1蛋白質的HPV31 VLP。在本發(fā)明該方面的優(yōu)選實施方案中，經(jīng)密碼子優(yōu)化的HPV31 L1基因基本上由SEQ ID NO2或SEQID NO3中提出的核苷酸的序列組成。
本發(fā)明的再一個方面是產(chǎn)生HPV31 VLPs的方法，其包括(a)用編碼HPV31 L1蛋白質或者HPV31 L1+L2蛋白質的重組DNA分子轉化酵母；(b)在允許表達重組DNA分子產(chǎn)生重組HPV31蛋白質的條件下培養(yǎng)所轉化的酵母；和(c)分離重組HPV31蛋白質以產(chǎn)生HPV31 VLP。
在本發(fā)明該方面的優(yōu)選實施方案中，用沒有酵母識別的轉錄終止信號的HPV31 L1基因轉化酵母。在另一優(yōu)選實施方案中，用經(jīng)密碼子優(yōu)化的HPV31 L1基因轉化酵母以產(chǎn)生HPV31 VLPs。在尤其優(yōu)選的實施方案中，經(jīng)密碼子優(yōu)化的HPV31 L1基因基本上由SEQ ID NO2或SEQ ID NO3中提出的核苷酸的序列組成。
本發(fā)明還提供了在動物中誘導免疫應答的方法，該方法包括對該動物施用HPV31病毒類似顆粒。在優(yōu)選實施方案中，通過無酵母識別的內(nèi)部轉錄終止信號的基因產(chǎn)生HPV31 VLPs。在另一優(yōu)選實施方案中，通過經(jīng)密碼子優(yōu)化的基因產(chǎn)生HPV31 VLPs。
本發(fā)明的再一方面是預防或治療HPV相關的宮頸癌的方法，該方法包括對哺乳動物施用含有HPV31 VLPs的疫苗。在本發(fā)明該方面的優(yōu)選實施方案中，HPV31 VLPs在酵母中產(chǎn)生。
本發(fā)明還涉及含有HPV31病毒類似顆粒(VLPs)的疫苗。
在本發(fā)明該方面的備選實施方案中，所述疫苗還含有至少一種額外HPV類型的VLPs。在優(yōu)選實施方案中，所述至少一種額外HPV類型選自HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59、和HPV68。
在本發(fā)明該方面的優(yōu)選實施方案中，疫苗還含有HPV16 VLPs。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，疫苗還含有HPV16 VLPs和HPV18 VLPs。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，疫苗還含有HPV6 VLPs、HPV11 VLPs、HPV16 VLPs和HPV18 VLPs。
本發(fā)明還涉及含有HPV 31病毒類似顆粒的藥物組合物。此外，本發(fā)明涉及含有HPV31 VLPs和至少一種額外HPV類型的VLPs的藥物組合物。在優(yōu)選實施方案中，所述至少一種額外HPV類型選自HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59、和HPV68。
本發(fā)明的疫苗組合物可以以常規(guī)試驗界定的適宜劑量單獨使用以得到HPV31感染的最佳抑制而最小化任何潛在毒性。此外，其他試劑的共同施用或者順序施用是所希望的。
將導入疫苗接受者的病毒類似顆粒的量取決于所表達的基因產(chǎn)物的免疫原性。通常將約10μg到100μg，優(yōu)選約20μg到60μg VLPs的免疫或者預防有效劑量直接施用于肌肉組織。也可以預期皮下注射、皮內(nèi)導入、通過皮膚透入，和其他施用方式，如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、或者吸入遞送。還預期可以提供強化接種。本發(fā)明疫苗的腸胃外導入的同時或者隨后用佐劑進行腸胃外施用，如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或者其他施用方式也是有利的，所述佐劑如明礬或Merck明礬佐劑。
為了描述和公開與本發(fā)明有關的方法和材料，將文中提到的所有出版物并入本文作為參考。所有這些參考文獻都不應認為承認這些公開作為在先發(fā)明而本發(fā)明沒有資格先于這些公開。
已經(jīng)參考附圖描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，將理解本發(fā)明不限于那些精確實施方案，并且通過本領域技術人員可以實現(xiàn)多種改變和修飾而不背離所附權利要求書中限定的本發(fā)明的范圍和精神。
下面的實施例闡明但不限制本發(fā)明。
實施例1確定代表性HPV 31 L1序列已經(jīng)報導了HPV31 L1野生型序列(Goldsborough等人，Virology171(1)306-311(1989)；Genbank保藏號J04353)。但是在從臨床分離物所得的DNA之間發(fā)現(xiàn)小的序列差異并不罕見。為了分離代表性HPV31 L1野生型序列，從以前表明含有HPV31 L1 DNA的臨床樣品分離DNA。在聚合酶鏈式反應(PCR)中用Taq DNA聚合酶和下面的引物HPV 31 L1 F5′-CGT CGA CGT AAA CGT GTA TCA TAT TTTTTT ACA G-3′(SEQ ID NO5)和HPV 31 L1 B5′-CAG ACA CATGTA TTA CAT ACA CAA C-3′(SEQ ID NO6)擴增HPV 31 L1序列。在瓊脂糖凝膠上電泳擴增產(chǎn)物并通過溴化乙錠染色顯現(xiàn)。切除～1500bp L1帶并使用QIA quick PCR純化試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)純化DNA。將DNA連接到TA克隆載體pCR-II(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)，大腸桿菌轉化，并鋪在含有氨芐青霉素和IPTG和用于藍色/白色菌落選擇的X-gal的LB瓊脂平板上。將平板顛倒并在37℃孵育16小時。將白色菌落在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃搖動16小時，并進行小量制備以提取質粒DNA。
為了證明質粒中存在L1基因，進行限制性內(nèi)切酶消化并通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色觀看。對含有來自三個臨床分離物的每一個的克隆L1的質粒進行DNA測序。將DNA和翻譯的氨基酸序列相互比較和與Genbank HPV 31 L1序列比較。三個臨床分離物的序列分析揭示沒有序列與Genbank序列相同。選擇pCR-II-HPV31L1/81克隆為代表性31L1序列并在本文中稱作“31L1野生型序列”(SEQ IDNO1，見圖1)。選作31 L1野生型的序列在核苷酸1266處含有一個沉默替換和在核苷酸1295處C向G的改變，將編碼氨基酸從蘇氨酸改變成絲氨酸。31 L1部分和完全重建基因(分別為SEQ ID NO2和3)也編碼該位置上的絲氨酸(見圖1)。在所有情況中，氨基酸序列是相同的。在重建構建體中改變核苷酸以使用酵母優(yōu)選的密碼子序列編碼氨基酸和除去潛在的轉錄終止信號(見實施例2)。
將31 L1野生型序列用LS-1015′-CTC AGA TCT CAC AAA ACAAAA TGT CTC TGT GGC GGC CTA GC-3′(SEQ ID NO7)和LS-1025′-GAC AGA TCT TAC TTT TTA GTT TTT TTA CGT TTT GCTGG-3′(SEQ ID NO8)引物擴增以加入BglII延伸。用VentTMDNA聚合酶實施PCR。通過瓊脂糖凝膠的溴化乙錠染色顯現(xiàn)PCR產(chǎn)物。切除～1500bp條條并用QIAEX II凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化DNA。然后PCR產(chǎn)物經(jīng)BglII在37℃消化2小時并使用QIA quick PCR純化試劑盒純化。將BglII消化的31 L1 PCR產(chǎn)物與BamHI消化的pGAL110連接并轉化DH5大腸桿菌。通過PCR篩選具有正確方向上HPV31 L1插入片段的菌落。通過DNA測序證實序列和方向。所選克隆命名為pGAL110-HPV 31 L1#2。
然后制備Maxiprep DNA并制備感受態(tài)釀酒酵母并將其轉化。將酵母轉化株鋪在Lue-山梨醇板上的Leu-山梨醇頂層瓊脂中并在30℃顛倒孵育3-5天。挑選菌落并在Leu-山梨醇板上劃線分離。為了誘導L1轉錄和蛋白質表達，將所分離的菌落隨后生長在旋轉管中含有1.6％葡萄糖和4％半乳糖的5ml 5×Leu-Ade-山梨醇中30℃培養(yǎng)。
實施例2酵母密碼子優(yōu)化已經(jīng)描述了酵母優(yōu)選的密碼子(Sharp和Cowe，Yeast 7657-678(1991))。最初，用酵母優(yōu)選的密碼子重建HPV 31 L1的中間部分，其代表核苷酸697-1249。用于重建的策略是設計長的重疊的正義和反義寡聚體，其跨越所要重建的區(qū)域，用酵母優(yōu)選的密碼子序列代替原有核苷酸并保持相同的氨基酸序列。這些寡聚體用于替換PCR反應中的模板DNA。設計額外的擴增引物并用于用Pfu DNA聚合酶從模板寡聚體擴增重建序列(Stratagene，La Jolla，CA)。擴增的最優(yōu)條件是片段特異的；然而，多數(shù)使用類似下面的程序94℃1分鐘的最初變性步驟，然后是15-25輪95℃30秒變性，55℃30秒退火，72℃3.5分鐘延伸，然后是72℃10分鐘的最終延伸并保持在4℃。
通過瓊脂糖電泳檢查PCR產(chǎn)物。將適宜大小的條帶切除并用凝膠純化DNA。所擴增的片段用作模板以裝配552個核苷酸重建HPV 31中L1片段。用PCR擴增野生型核苷酸1-725(5’末端)和1221-1515(3’末端)。使用5’末端、3’末端和重建的中間部分進行最后PCR以產(chǎn)生全長31 L1部分重建，其在本文中稱作“31 L1部分重建”。
還用酵母優(yōu)選的密碼子重建了完整31 L1序列。該構建體在文中稱作“31 L1完全重建”。用9種長的重疊寡聚體產(chǎn)生從1-753的酵母優(yōu)選的密碼子核苷酸序列，并用四種長的重疊寡聚體產(chǎn)生從1207-1515的酵母優(yōu)選的密碼子核苷酸序列。擴增并凝膠純化后，這些片段，以及上述中間重建部分(核苷酸697-1249)一起用于PCR反應中以產(chǎn)生全長31 L1完全重建序列。用BamHI延伸產(chǎn)生該片段。將凝膠純化的重建31 L1 DNA用BamHI消化，連接到BamHI消化的pGAL110表達載體并轉化到大腸桿菌DH5細胞中。通過PCR篩選菌落以尋找正確方向的HPV 31 L1插入。通過DNA測序證實序列和方向。
制備質粒DNA。制備感受態(tài)釀酒酵母并將其轉化。將酵母鋪在Leu-山梨醇板上的Leu-山梨醇頂層瓊脂中并顛倒孵育3-5天。在Leu-山梨醇板上劃線分離菌落。將所分離的菌落隨后生長在旋轉管中含有1.6％葡萄糖和4％半乳糖的5ml 5×Leu-Ade-山梨醇中30℃培養(yǎng)以誘導L1轉錄和蛋白質表達。48-72小時后，沉淀OD600＝10的培養(yǎng)體積，除去上清液，凍干沉淀并在-70℃保存。
實施例3RNA制備將所轉化酵母的細胞沉淀在冰上解凍并懸浮在1ml冷DEPC處理的水中，其中所述經(jīng)轉化的酵母通過半乳糖誘導而表達HPV 31L1。離心沉淀細胞并除去所得上清液。然后將細胞沉淀重懸浮在400μl TES(10mM Tris pH7.0，10mM EDTA和0.5％SDS)中。加入等體積的AE緩沖液飽和的苯酚(50mM NaOAc和10mM EDTA)。將管渦旋10秒并在65℃加熱50分鐘，每10分鐘混合。將管置于冰上5分鐘，然后在4℃離心5分鐘。收集上清液并將其轉移到無菌管中。加入額外的400μl苯酚，管經(jīng)渦旋，置于冰上5分鐘并離心。將上清液轉移到無菌管中并加入400μl氯仿，混合并離心。再次收集上清液并轉移到無菌管中加入40μl 3M乙酸鈉(pH 5.2)和1ml 100％EtOH。將管置于干冰上1小時，之后將其高速離心以沉淀RNA。然后將RNA懸浮在100μl DEPC處理的水中并在65℃加熱5分鐘溶解。實施分光光度法以確定樣品中RNA濃度，使用如下假定當A260/280為1.7-2.0時A260讀數(shù)1＝40μg/ml RNA。
實施例4RNA印跡分析對表達31 L1野生型的酵母的初步分析表明HPV 31 L1蛋白質的表達產(chǎn)率顯著小于所預期的。為了確定是否由于轉錄水平和翻譯水平上的問題而發(fā)生低表達，進行HPV 31 L1轉錄物的RNA印跡分析。從凝膠進行RNA印跡，在所述凝膠中來自表達HPV16 L1的酵母的RNA和表達HPV31 L1的酵母的RNA在相同凝膠中運行以比較轉錄物大小。
澆鑄1.2％瓊脂糖甲醛凝膠。10微克RNA與變性緩沖液(終濃度6％甲醛、45％甲酰胺和0.9×MOPS)混合并在55℃加熱15分鐘。加入1/10體積凝膠上樣緩沖液并將樣品裝入凝膠。在65優(yōu)下1×MOPS緩沖液中進行電泳約5小時。在無菌水中洗滌凝膠15分鐘并在10×SSC中洗滌兩次，每次5分鐘。通過毛細管作用在10×SSC中16小時內(nèi)將RNA轉移到Hybond-N+尼龍膜(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)中。使用設定在700單位能量的Amersham交聯(lián)儀通過交聯(lián)將RNA固定到尼龍膜。固定后，允許尼龍膜風干。將膜置于30ml Zetaprobe緩沖液中55℃2小時，之后加入32P標記的探針并在53-65℃孵育16小時。將膜在5×SSC中室溫下洗滌3次20分鐘，然后在0.4×SSC中室溫下洗滌2次20分鐘，和60℃下洗滌一次10分鐘。通過PCR使用HPV31 L1序列特異的正義和反義引物產(chǎn)生探針DNA。通過用多核苷酸激酶(PNK)和γ-32P ATP在37℃處理1小時標記擴增的DNA。將印跡包在莎倫包裝膜中并暴露于x光片16小時。膠片顯影時，探針雜交的RNA檢測為放射自顯影上的黑色帶。
對上述RNA印跡的分析表明多數(shù)全長HPV 31 L1野生型轉錄物顯著小于全長(見圖4)。然而，31 L1部分重建經(jīng)設計不僅插入基因中間的酵母優(yōu)選的密碼子，而且除去類似酵母轉錄終止位點的任何可能的序列。RNA印跡分析清楚地表明重建時31 L1基因轉錄物的長度顯著增加到相應于全長HPV 16 L1轉錄物的大小(未顯示)。從而，未成熟的轉錄終止可能大部分解釋31 L1野生型構建體的低表達產(chǎn)率。
實施例5 HPV 31 L1蛋白質表達將相當于OD600＝10的半乳糖誘導的培養(yǎng)物的冰凍酵母細胞沉淀在冰上解凍并懸浮在含有2mM PMSF的300μl PC緩沖液(100mMNa2HPO4和0.5M NaCl，pH 7.0)中。加入酸洗滌的0.5mm玻璃珠，～0.5g/管。將管在4℃渦旋處理15分鐘。加入7.5μl 20％Triton100并在4℃再次渦旋處理5分鐘。將管置于冰上15分鐘，然后4℃下離心15分鐘。上清液轉移到無菌微量離心管中并在-70℃保存。
實施例6 RNA印跡分析通過蛋白質印跡分析從每種HPV 31 L1構建體的20到40個分離的酵母菌落提取總酵母蛋白質以證實半乳糖誘導后HPV 31 L1蛋白質的表達。
10微克總酵母蛋白質提取物與SDS-PAGE上樣緩沖液合并并在95℃加熱10分鐘。將蛋白質加到8％SDS-PAGE凝膠上并在Tris-甘氨酸緩沖液中電泳。蛋白質分離后，將蛋白質從凝膠Western轉移到硝酸纖維素并將印跡在TTBS(Tris緩沖鹽溶液與Tween20)中的10％無脂干奶溶液中封閉16小時。在TTBS中洗滌印跡三次。將與HPV31L1交叉反應的多克隆血清——山羊抗trpE-HPV 16 L1血清以TTBS中的1∶1000稀釋液在室溫下應用1小時。將印跡在TTBS中洗滌3次并將抗-山羊-HRP綴合的抗體以TTBS中的1∶2500稀釋液應用1小時。再次洗滌印跡3次并應用ECLTM檢測試劑(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)。進行放射自顯影。通過檢測試劑將抗血清識別的蛋白質檢測為放射自顯影照片上的黑色帶。
在所有情況中，HPV 31 L1蛋白質被檢測為放射自顯影照片上相應于約55kD的清晰條帶(數(shù)據(jù)未顯示)。凝膠上包括作為陽性對照的HPV 16 L1蛋白質。
實施例7放射免疫測定法(RIA)通過多種方法生長表達HPV 31 L1的酵母細胞，所述方法包括旋轉管培養(yǎng)、搖瓶和發(fā)酵罐。裂解酵母并提取蛋白質以確定每毫克總蛋白質產(chǎn)生的HPV 31 L1病毒類似顆粒(VLPs)的量。為了證明HPV31 L1 VLP表達，通過捕獲放射免疫測定法(RIA)分析每種總酵母蛋白質提取物的一部分。
用檢測單克隆抗體H31.A6進行RIA，所述單克隆抗體是HPV型31特異的和VLP構象特異的。H31.A6對HPV型31 L1特異，因為發(fā)現(xiàn)H31.A6結合完整HPV 31 L1 VLPs并且不識別變性的HPV 31VLPs。隨后通過I125標記的山羊抗小鼠抗體檢測該mAb。因此，每分鐘計數(shù)(cpm)值相當于HPV 31 L1 VLP表達的相對水平。
將聚苯乙烯珠用山羊抗-trpE-HPV31 L1多克隆血清在PBS中的1∶1000稀釋液過夜包被。然后用5體積無菌蒸餾水洗滌珠子并風干。然后將從分離的酵母菌落得到的總酵母蛋白質提取物抗原通過用含有1％BSA、0.1％Tween-20和0.1％疊氮化鈉的PBS稀釋后加入珠子上并旋轉下孵育1小時。洗滌后，珠子以每孔一個分布在20孔聚苯乙烯板中并用以1∶50,000稀釋的H31.A6 mAb在室溫下孵育17-24小時。洗滌珠子并加入活性范圍為23000-27000cpm/10μl的I125標記的山羊抗小鼠IgG。2小時后，洗滌珠子并以cpm/ml記錄放射性計數(shù)。從總cpm/ml扣除來自空白孔的背景值，得到RIA減背景值。
進行兩種實驗在實驗1中，比較來自31 L1野生型和31 L1部分重建的蛋白質提取物，在實驗2中，比較來自31 L1部分重建的和31 L1完全重建的蛋白質提取物(見圖5)。結果表明31 L1部分重建VLP表達比31 L1野生型高6.9倍。31 L1完全重建比31 L1部分重建表達增加1.7倍。因此，通過導入酵母優(yōu)選的密碼子序列和除去潛在的轉錄終止信號使31 L1表達水平增加了7倍以上。
實施例8透射電鏡術為了證明HPV 31 L1蛋白質實際上自裝配而形成五聚體L1殼體，其又自裝配成病毒類似顆粒，將部分純化的31 L1完全重建蛋白質提取物進行透射電鏡術(TEM)分析。酵母在小規(guī)模發(fā)酵條件下生長并沉淀。將沉淀進行純化處理。通過免疫印跡分析沉淀和澄清的酵母提取物以證明L1蛋白質表達并通過純化方法保留。將澄清的酵母提取物在45％蔗糖層上離心并將所得沉淀懸浮在緩沖液中以進行TEM分析(見圖6)。結果表明該粗制樣品中球形顆粒的直徑為30到60nm，某些顆粒顯示出殼體的規(guī)則排列。
序列表<110>Merck&Co.，Inc.
Jansen，Kathrin U.
Schultz，Loren D.
Neeper，Michael P.
Markuis，Henry Z.
<120>HPV 31 L1在酵母中的優(yōu)化表達<130>21188-PCT<150>60/457,172<151>2003-03-24<160>8<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1515<212>DNA<213>HPV31 L1野生型<400>1atgtctctgt ggcggcctag cgaggctact gtctacttac cacctgtccc agtgtctaaa 60gttgtaagca cggatgaata tgtaacacga accaacatat attatcacgc aggcagtgct 120aggctgctta cagtaggcca tccatattat tccataccta aatctgacaa tcctaaaaaa 180atagttgtac caaaggtgtc aggattacaa tatagggtat ttagggttcg tttaccagat 240ccaaacaaat ttggatttcc tgatacatct ttttataatc ctgaaactca acgcttagtt 300tgggcctgtg ttggtttaga ggtaggtcgc gggcagccat taggtgtagg tattagtggt 360catccattat taaataaatt tgatgacact gaaaactcta atagatatgc cggtggtcct 420ggcactgata atagggaatg tatatcaatg gattataaac aaacacaact gtgtttactt 480ggttgcaaac cacctattgg agagcattgg ggtaaaggta gtccttgtag taacaatgct 540attacccctg gtgattgtcc tccattagaa ttaaaaaatt cagttataca agatggggat 600atggttgata caggctttgg agctatggat tttactgctt tacaagacac taaaagtaat 660gttcctttgg acatttgtaa ttctatttgt aaatatccag attatcttaa aatggttgct 720gagccatatg gcgatacatt atttttttat ttacgtaggg aacaaatgtt tgtaaggcat 780ttttttaata gatcaggcac ggttggtgaa tcggtcccta ctgacttata tattaaaggc 840tccggttcaa cagctacttt agctaacagt acatactttc ctacacctag cggctccatg 900gttacttcag atgcacaaat ttttaataaa ccatattgga tgcaacgtgc tcagggacac 960aataatggta tttgttgggg caatcagtta tttgttactg tggtagatac cacacgtagt 1020accaatatgt ctgtttgtgc tgcaattgca aacagtgata ctacatttaa aagtagtaat 1080tttaaagagt atttaagaca tggtgaggaa tttgatttac aatttatatt tcagttatgc 1140aaaataacat tatctgcaga cataatgaca tatattcaca gtatgaatcc tgctattttg 1200gaagattgga attttggatt gaccacacct ccctcaggtt ctttggagga tacctatagg 1260tttgtaacct cacaggccat tacatgtcaa aaaagtgccc cccaaaagcc caaggaagat 1320ccatttaaag attatgtatt ttgggaggtt aatttaaaag aaaagttttc tgcagattta 1380gatcagtttc cactgggtcg caaattttta ttacaggcag gatatagggc acgtcctaaa 1440tttaaagcag gtaaacgtag tgcaccctca gcatctacca ctacaccagc aaaacgtaaa 1500aaaactaaaa agtaa 1515<210>2<211>1515<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>31部分重建
<400>2atgtctctgt ggcggcctag cgaggctact gtctacttac cacctgtccc agtgtctaaa 60gttgtaagca cggatgaata tgtaacacga accaacatat attatcacgc aggcagtgct 120aggctgctta cagtaggcca tccatattat tccataccta aatctgacaa tcctaaaaaa 180atagttgtac caaaggtgtc aggattacaa tatagggtat ttagggttcg tttaccagat 240ccaaacaaat ttggatttcc tgatacatct ttttataatc ctgaaactca acgcttagtt 300tgggcctgtg ttggtttaga ggtaggtcgc gggcagccat taggtgtagg tattagtggt 360catccattat taaataaatt tgatgacact gaaaactcta atagatatgc cggtggtcct 420ggcactgata atagggaatg tatatcaatg gattataaac aaacacaact gtgtttactt 480ggttgcaaac cacctattgg agagcattgg ggtaaaggta gtccttgtag taacaatgct 540attacccctg gtgattgtcc tccattagaa ttaaaaaatt cagttataca agatggggat 600atggttgata caggctttgg agctatggat tttactgctt tacaagacac taaaagtaat 660gttcctttgg acatttgtaa ttctatttgt aaatatccag attatcttaa aatggttgct 720gagccatacg gcgacacctt gttcttctat ttgcgtagag aacagatgtt cgtaaggcac 780ttcttcaaca gatccggcac cgtaggtgaa tctgtcccaa ccgacctgta catcaagggc 840tccggttcca ccgctaccct ggctaactcc acctacttcc caactccatc tggctccatg 900gtcacctccg acgctcagat cttcaacaag ccatactgga tgcagcgtgc acagggtcac 960aacaacggta tctgttgggg taaccagctg ttcgtgactg tggtcgatac cacgcgttct 1020accaacatgt ctgtctgtgc tgcaatcgct aactctgaca ctaccttcaa gtcctctaac 1080ttcaaggagt acctgagaca tggtgaggaa ttcgatctgc aattcatctt ccagttgtgc 1140aagatcaccc tgtctgctga catcatgacc tacatccaca gtatgaaccc tgccatcctg 1200gaggactgga acttcggtct gaccactcca ccttccggtt ctttggagga tacctatagg 1260tttgtaacct cacaggccat tacatgtcaa aaaagtgccc cccaaaagcc caaggaagat 1320ccatttaaag attatgtatt ttgggaggtt aatttaaaag aaaagttttc tgcagattta 1380gatcagtttc cactgggtcg caaattttta ttacaggcag gatatagggc acgtcctaaa 1440tttaaagcag gtaaacgtag tgcaccctca gcatctacca ctacaccagc aaaacgtaaa 1500aaaactaaaa agtaa 1515<210>3<211>1515<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>31完全重建<400>3atgtctttgt ggagaccatc tgaagctacc gtctacttgc caccagtccc agtctctaag 60gtcgtctcta ccgacgaata cgtcaccaga accaacatct actaccacgc tggttctgct 120agattgttga ccgtcggtca cccatactac tctatcccaa agtctgacaa cccaaagaag 180atcgtcgtcc caaaggtctc tggtttgcaa tacagagtct tcagagtcag attgccagac 240ccaaacaagt tcggtttccc agacacctct ttctacaacc cagaaaccca aagattggtc 300tgggcttgtg tcggtttgga agtcggtaga ggtcaaccat tgggtgtcgg tatctctggt 360cacccattgt tgaacaagtt cgacgacacc gaaaactcta acagatacgc tggtggtcca 420ggtaccgaca acagagaatg tatctctatg gactacaagc aaacccaatt gtgtttgttg 480ggttgtaagc caccaatcgg tgaacactgg ggtaagggtt ctccatgttc taacaacgct 540atcaccccag gtgactgtcc accattggaa ttgaagaact ctgtcatcca agacggtgac 600atggtcgaca ccggtttcgg tgctatggac ttcaccgctt tgcaagacac caagtctaac 660gtcccattgg acatctgtaa ctctatctgt aagtacccag actacttgaa gatggtcgct 720gaaccatacg gcgacacctt gttcttctac ttgcgtagag aacagatgtt cgtaaggcac 780ttcttcaaca gatccggcac cgtaggtgaa tctgtcccaa ccgacctgta catcaagggc 840tccggttcca ccgctaccct ggctaactcc acctacttcc caactccatc tggctccatg 900gtcacctccg acgctcagat cttcaacaag ccatactgga tgcagcgtgc acagggtcac 960aacaacggta tctgttgggg taaccagctg ttcgtgactg tggtcgatac cacgcgttct 1020accaacatgt ctgtctgtgc tgcaatcgct aactctgaca ctaccttcaa gtcctctaac 1080ttcaaggagt acctgagaca tggtgaggaa ttcgatctgc aattcatctt ccagttgtgc 1140aagatcaccc tgtctgctga catcatgacc tacatccaca gtatgaaccc tgccatcctg 1200gaggactgga acttcggtct gaccactcca ccttccggtt ctttggaaga cacctacaga 1260ttcgtcacct ctcaagctat cacctgtcaa aagtctgctc cacaaaagcc aaaggaagac 1320ccattcaagg actacgtctt ctgggaagtc aacttgaagg aaaagttctc tgctgacttg 1380gaccaattcc cattgggtag aaagttcttg ttgcaagctg gttacagagc tagaccaaag 1440ttcaaggctg gtaagagatc tgctccatct gcttctacca ccaccccagc taagagaaag 1500
aagaccaaga agtaa1515<210>4<211>504<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HPV 31 L1<400>4Met Ser Leu Trp Arg Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val1 5 10 15Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Thr Arg Thr Asn20 25 30Ile Tyr Tyr His Ala Gly Ser Ala Arg Leu Leu Thr Val Gly His Pro35 40 45Tyr Tyr Ser Ile Pro Lys Ser Asp Asn Pro Lys Lys Ile Val Val Pro50 55 60Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Arg Leu Pro Asp65 70 75 80Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Glu Thr85 90 95Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln100 105 110Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Phe Asp115 120 125Asp Thr Glu Asn Ser Asn Arg Tyr Ala Gly Gly Pro Gly Thr Asp Asn130 135 140Arg Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Leu145 150 155 160Gly Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys165 170 175Ser Asn Asn Ala Ile Thr Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys180 185 190Asn Ser Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala195 200 205Met Asp Phe Thr Ala Leu Gln Asp Thr Lys Ser Asn Val Pro Leu Asp210 215 220Ile Cys Asn Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Val Ala225 230 235 240Glu Pro Tyr Gly Asp Thr Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met245 250 255Phe Val Arg His Phe Phe Asn Arg Ser Gly Thr Val Gly Glu Ser Val260 265 270Pro Thr Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Thr Leu Ala275 280 285Asn Ser Thr Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp290 295 300Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Met Gln Arg Ala Gln Gly His305 310 315 320Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp325 330 335Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Val Cys Ala Ala Ile Ala Asn Ser340 345 350Asp Thr Thr Phe Lys Ser Ser Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly355 360 365Glu Glu Phe Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu370 375 380Ser Ala Asp Ile Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Pro Ala Ile Leu385 390 395 400Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Thr Thr Pro Pro Ser Gly Ser Leu Glu
405 410 415Asp Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Thr Cys Gln Lys Ser420 425 430Ala Pro Gln Lys Pro Lys Glu Asp Pro Phe Lys Asp Tyr Val Phe Trp435 440 445Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro450 455 460Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Tyr Arg Ala Arg Pro Lys465 470 475 480Phe Lys Ala Gly Lys Arg Ser Ala Pro Ser Ala Ser Thr Thr Thr Pro485 490 495Ala Lys Arg Lys Lys Thr Lys Lys500<210>5<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>5cgtcgacgta aacgtgtatc atattttttt acag 34<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>6cagacacatg tattacatac acaac 25<210>7<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>7ctcagatctc acaaaacaaa atgtctctgt ggcggcctag c 41<210>8<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>8gacagatctt actttttagt ttttttacgt tttgctgg 38
權利要求
1.核酸分子，其含有編碼SEQ ID NO4中提出的HPV31 L1蛋白質的核苷酸序列，所述核苷酸序列經(jīng)密碼子優(yōu)化以在酵母細胞中高水平表達。
2.載體，其含有權利要求1的核酸分子。
3.宿主細胞，其含有權利要求2的載體。
4.權利要求3的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自釀酒酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤氏酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母和粟酒裂殖糖酵母。
5.權利要求4的宿主細胞，其中宿主細胞為釀酒酵母。
6.權利要求1的核酸分子，其中核苷酸序列含有SEQ ID NO2中提出的核苷酸序列。
7.載體，其含有權利要求6的核酸分子。
8.宿主細胞，其含有權利要求7的載體。
9.權利要求1的核酸分子，其中核苷酸序列含有SEQ ID NO3中提出的核苷酸序列。
10.載體，其含有權利要求9的核酸分子。
11.宿主細胞，其含有權利要求10的載體。
12.病毒類似顆粒(VLPs)，其由HPV31的重組L1蛋白質或者重組L1+L2蛋白質組成。
13.權利要求12的VLPs，其中在酵母中產(chǎn)生所述重組L1蛋白質或者重組L1+L2蛋白質。
14.權利要求13的VLPs，其中所述重組L1蛋白質或者重組L1+L2蛋白質由經(jīng)密碼子優(yōu)化的HPV31L1核酸分子編碼。
15.權利要求14的VLPs，其中經(jīng)密碼子優(yōu)化的核酸分子基本上由SEQ ID NO2或SEQ ID NO3中提出的核苷酸序列組成。
16.產(chǎn)生權利要求14的VLPs的方法，該方法包括(a)用編碼HPV31 L1蛋白質或者HPV31 L1+L2蛋白質的經(jīng)密碼子優(yōu)化的DNA分子轉化酵母；(b)在允許經(jīng)密碼子優(yōu)化的DNA分子表達的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉化的酵母以產(chǎn)生重組乳頭瘤病毒蛋白質；和(c)分離重組乳頭瘤病毒蛋白質以產(chǎn)生權利要求14的VLPs。
17.疫苗，其含有權利要求14的VLPs。
18.藥物組合物，其含有權利要求14的VLPs。
19.預防HPV感染的方法，其包括將權利要求17的疫苗施用于哺乳動物。
20.在動物中誘導免疫應答的方法，其包括對動物施用權利要求14的VLPs。
21.權利要求14的病毒類似顆粒，其中酵母選自釀酒酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤氏酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母和粟酒裂殖糖酵母。
22.權利要求21的病毒類似顆粒，其中酵母為釀酒酵母。
23.權利要求17的疫苗，其還含有至少一種額外HPV類型的VLPs。
24.權利要求23的疫苗，其中至少一種額外HPV類型選自HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59、和HPV68。
25.權利要求24的疫苗，其中至少一種HPV類型包括HPV16。
26.權利要求25的疫苗，其還含有HPV18 VLPs。
27.權利要求26的疫苗，其還含有HPV6 VLPs和HPV11 VLPs。
28.核酸分子，其含有編碼HPV31 L1蛋白質的核苷酸序列，所述核酸分子沒有酵母識別的轉錄終止信號。
29.載體，其含有權利要求28的核酸分子。
30.宿主細胞，其含有權利要求29的載體。
31.權利要求30的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自釀酒酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤氏酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母和粟酒裂殖糖酵母。
32.權利要求31的宿主細胞，其中所述宿主細胞是釀酒酵母。
33.權利要求13的VLPs，其中重組L1蛋白質或者重組L1+L2蛋白質由沒有酵母識別的轉錄終止信號的HPV31 L1核酸分子編碼。
34.產(chǎn)生權利要求33的VLPs的方法，其包括(a)用編碼HPV31 L1蛋白質或者HPV31 L1+L2蛋白質的DNA分子轉化酵母，所述DNA分子沒有酵母識別的轉錄終止序列；(b)在允許所述DNA分子表達的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉化的酵母以產(chǎn)生重組乳頭瘤病毒蛋白質；和(c)分離重組乳頭瘤病毒蛋白質以產(chǎn)生權利要求33的VLPs。
35.疫苗，其含有權利要求33的VLPs。
36.藥物組合物，其含有權利要求33的VLPs。
37.預防HPV感染的方法，其包括對哺乳動物施用權利要求35的疫苗。
38.在動物中誘導免疫應答的方法，其包括對動物施用權利要求33的VLPs。
39.權利要求35的疫苗，其還含有至少一種額外HPV類型的VLPs。
40.權利要求39的疫苗，其中至少一種額外HPV類型選自HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59、和HPV68。
41.權利要求40的疫苗，其中至少一種HPV類型包括HPV16。
42.權利要求41的疫苗，其還包括HPV18 VLPs。
43.權利要求42的疫苗，其還包括HPV6 VLPs和HPV11 VLPs。
全文摘要
提供了編碼HPV31 L1蛋白質的合成DNA分子。具體地，本發(fā)明提供了編碼HPV31 L1蛋白質的多核苷酸，其中所述多核苷酸沒有酵母識別的內(nèi)部轉錄終止信號。還提供了編碼HPV31 L1的合成多核苷酸，其中該多核苷酸已經(jīng)經(jīng)密碼子優(yōu)化以在酵母細胞中高水平表達。該合成分子可用于產(chǎn)生HPV31病毒類似顆粒(VLPs)，和產(chǎn)生含有HPV31 VLPs的疫苗和藥物組合物。本發(fā)明的疫苗通過中和抗體和細胞介導的免疫提供了針對乳頭瘤病毒感染的有效免疫預防。
文檔編號A61KGK1761759SQ200480007725
公開日2006年4月19日 申請日期2004年3月19日 優(yōu)先權日2003年3月24日
發(fā)明者K·U·詹森, L·D·舒爾茨, M·P·尼佩, H·Z·馬庫斯 申請人:麥克公司