專利名稱：：耐高溫酒精酵母的優(yōu)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種耐高溫酒精酵母的優(yōu)化方法，及利用該方法獲得的耐高溫酒精酵母菌株。
背景技術(shù)：
：耐高溫酒精酵母的研究已經(jīng)成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外酒精行業(yè)的熱門課題，使用耐高溫酵母不僅能夠配合作用于纖維素原料的纖維素酶的最適作用溫度；降低生產(chǎn)水耗、電耗，充分利用現(xiàn)有設(shè)備，縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)率，而且能夠保證夏季的正常生產(chǎn)。自80年代后期，我國(guó)相繼有耐高溫酒精酵母問(wèn)世，并成功的在生產(chǎn)中應(yīng)用。1980年底至1985年，北京酒精廠從白酒出池的酒醅(出池溫度39—4rC)中初篩出5株發(fā)酵力強(qiáng)的菌株，然后從中復(fù)篩出在38—39'C發(fā)酵成績(jī)好的兩株酵母，再在40。C下定向馴化，經(jīng)4年1428次傳代、分離、培養(yǎng)，獲得了能在4(TC下正常繁殖和發(fā)酵的菌株。1987年中科院武漢病毒所報(bào)導(dǎo)了耐高溫酵母的選育。該所的WVHY8菌株適宜生長(zhǎng)溫度范圍廣(25-42°C)，一年四季均可使用，尤其保證夏季高溫正常發(fā)酵；生產(chǎn)快、發(fā)酵能力強(qiáng)，平均出酒率比其它生產(chǎn)菌株提高1.2%。1989年宜昌酵母基地從國(guó)內(nèi)收集到6株耐高溫酵母菌株，從中篩選出耐高溫，發(fā)酵性能良好的酒精酵母WT。它們?cè)?0'C下發(fā)酵成績(jī)與3(TC時(shí)的一樣優(yōu)良。目前，篩選耐高溫酵母大多采取長(zhǎng)期高溫馴化的方法，但普遍存在高溫馴化周期長(zhǎng)(幾年不等)，出酒率增幅小(1.2%)，耐受溫度低(40°C)等缺點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有優(yōu)化手段單一，周期長(zhǎng)，耐受溫度低的不足，提供一種新的優(yōu)化耐高溫酵母菌株的方法，同時(shí)還提供了利用該方法篩選獲得的耐高溫酒精酵母菌株。本發(fā)明提供了一種耐高溫酒精酵母的優(yōu)化方法，將高劑量率脈沖電子束對(duì)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)進(jìn)行輻照，輻照劑量為半致死劑量至臨界致死劑量，結(jié)合高溫馴化，最終獲得耐高溫4rc以上的釀酒酵母菌株。較佳的，高劑量率脈沖電子束對(duì)釀酒酵母輻照的劑量率范圍為109Gy/s-2.5X109Gy/s。較佳的，高溫馴化條件為在36。C的培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)三天，挑出生長(zhǎng)良好，形狀圓實(shí)飽滿的菌落，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)溫度提高0.5。C的培養(yǎng)條件下再培養(yǎng)三天，重復(fù)上述步驟，直至溫度提高到菌株無(wú)法生長(zhǎng)為止。由此獲得最高培養(yǎng)溫度。高劑量脈沖電子束是指由高能脈沖電子加速器產(chǎn)生的每2ns發(fā)射電流2A的電子束，即每秒能發(fā)射10v能量。本發(fā)明的方法，不僅可以對(duì)普通釀酒酵母進(jìn)行優(yōu)化，也可對(duì)用本方法或其它方法獲得的耐高溫釀酒酵母進(jìn)一步優(yōu)化。高溫馴化是指根據(jù)酵母在自然不同氣候條件下的適應(yīng)性原理，人為地創(chuàng)造熱刺激以馴化酵母的耐熱性，使之適應(yīng)高溫條件。本發(fā)明另一方面提供了一種耐高溫釀酒酵母菌株，經(jīng)由上述優(yōu)化方法獲得，在4FC下能正常繁殖和發(fā)酵。上述耐高溫酒精酵母菌株，產(chǎn)酒精量高于出發(fā)菌株。較佳的，上述菌株能在43.5'CYPD固體培養(yǎng)基正常生長(zhǎng)，36'C的發(fā)酵溫度下酒精產(chǎn)量較之出發(fā)菌株提高近一倍。本發(fā)明的有益效果在于利用本發(fā)明的優(yōu)化方法篩選耐高溫酒精酵母耐高溫在4rc以上，可重復(fù)性好。用該優(yōu)化方法獲得的耐高溫酒精酵母性能穩(wěn)定，活性較高，發(fā)酵力強(qiáng)，耐高溫酒精酵母可以配合作用于纖維素原料的纖維素酶的最適溫度，使纖維素酶的作用充分發(fā)揮；且能保證酒精工業(yè)的酵母菌株在夏季高溫正常生長(zhǎng)，降低水耗，電耗；并且高產(chǎn)酒精耐高溫的酵母能在相等原料的基礎(chǔ)上產(chǎn)出更多的酒精，顯著提高企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。圖1高能脈沖電子束不同劑量輻照酵母存活曲線圖2出發(fā)酵母菌株在36C和43.5'C的生長(zhǎng)情況左圖為36。C，右圖為43.5°C圖3優(yōu)化的酵母菌株在36。C和43.5'C的生長(zhǎng)情況左圖為36。C，右圖為43.5。C圖4出發(fā)酵母菌株乙醇產(chǎn)量HPGC分析圖5優(yōu)化的酵母菌株乙醇產(chǎn)量HPGC分析圖6高能脈沖電子束輻照選育的耐高溫酵母酯酶同工酶譜及模式圖比較左圖泳道2，4，6為出發(fā)菌株，點(diǎn)樣量為20，30，25ii1，泳道1，3，5為優(yōu)化的耐高溫釀酒酵母菌株，點(diǎn)樣量分別為20，30，25ul，右圖l為出發(fā)模式圖，右圖2為優(yōu)化的耐高溫釀酒酵母菌株模式圖具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1利用高劑量率脈沖電子束處理釀酒酵母菌株輻照樣品制備將出發(fā)菌株Saccharomycescerevisiaewo(購(gòu)自Sigma公司)接種于100ml液體YPD培養(yǎng)基，經(jīng)36i:培養(yǎng)溫度，活化18小時(shí)后，取0.5ml菌液加入EP(印pendorf)管中，離心5000r/min，重復(fù)三次。分別采用冷凍干燥，常溫真空干燥預(yù)處理樣品。分別設(shè)定不同的輻照劑量(0—200Gy)，測(cè)定酵母菌的生存曲線(圖1)，酵母輻照并稀釋涂平板后，24小時(shí)后記錄各平皿中的菌落數(shù)量。結(jié)果如圖l所示，從圖上可以看出，隨著輻照劑量的增大，酵母菌落存活數(shù)量有總體下降的趨勢(shì)，但在70Gy到100Gy存活曲線下降趨于平緩，100Gy之后菌落數(shù)迅速減少，從圖中可以看出，該酵母菌株的輻照半致死劑量為120Gy。(因?yàn)榭瞻准次唇?jīng)輻照的酵母菌株的存活數(shù)為720，所以半致死劑量的存活菌落數(shù)大約為360，所以120Gy也是估算的)臨界致死劑量為200Gy左右。采用由高能脈沖電子加速器產(chǎn)生的高劑量率脈沖電子束輻照酵母樣品，輻照時(shí)間分別為10s，15s,20s，25s，輻照劑量率分別為109Gy/s、1.5X109Gy/s、2X109Gy/s和2.5X109Gy/s的電子束輻照酵母樣品，對(duì)應(yīng)獲得四組輻照后的酵母樣品。實(shí)施例2輻照后樣品的高溫馴化將實(shí)施例l獲得的四組輻照后酵母樣品，分別在YPD液體培養(yǎng)基中36'C培養(yǎng)4h，然后分別接種到100mlYPD液體培養(yǎng)基中，4rC富集培養(yǎng)48h，稀釋后涂YPD平板，置41'C培養(yǎng)，以未經(jīng)輻照處理的酵母菌為對(duì)照，每天記錄菌落生長(zhǎng)情況。并經(jīng)多次高溫馴化篩選(即在36'C的培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)三天，挑出生長(zhǎng)良好，形狀圓實(shí)飽滿的菌落，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)溫度提高o.5t:的培養(yǎng)條件下再培養(yǎng)三天，重復(fù)上述步驟，直至溫度提高到菌株無(wú)法生長(zhǎng)為止。)最終，每組分別獲得耐高溫43.5°C、43°C、42.5°C、42'C的菌株，其中，輻照劑量率為109Gy/s的組獲得了耐高溫在43.5'C的耐高溫釀酒酵母菌株，該菌株在43.5'CYPD固體培養(yǎng)5基中仍能正常生長(zhǎng)，命名該菌株為YE2。(參見圖2和圖3)實(shí)施例3重復(fù)實(shí)驗(yàn)采用實(shí)施例1和2的方法，對(duì)出發(fā)菌株Saccharomycescerevisiae進(jìn)行輻照時(shí)間分別為10s、12s、15s、17s、20s、22s、25s，輻照劑量率分別為109Gy/s、1.2X109Gy/s、1.5X109Gy/s、1.7X109Gy/s、2X109Gy/s、2.2X109Gy/s和2.5X109Gy/s的輻照處理及高溫馴化篩選，每種劑量率各設(shè)兩組，結(jié)果每組在4rCYPD固體培養(yǎng)基平皿中能正常生長(zhǎng)的均超過(guò)20個(gè)單菌落，即均可獲得耐高溫4rc以上的菌株。這說(shuō)明本發(fā)明的方法優(yōu)化釀酒酵母耐高溫，可重復(fù)性好，且至少可獲得耐高溫4rc的釀酒酵母。實(shí)施例3出發(fā)菌株與優(yōu)化的耐高溫釀酒酵母菌株發(fā)酵乙醇含量分析將出發(fā)菌株和實(shí)施例2獲得的耐高溫釀酒酵母菌株以2X的接種量接種于100ml不同的葡萄糖濃度(葡萄糖濃度2%—8%)的YPD液體培養(yǎng)基置于36r發(fā)酵96h，取適量發(fā)酵醪液蒸餾后，供氣相色譜分析。乙醇含量分析采用高壓氣相色譜(HPGC)色譜儀汽化室溫度170。C，柱溫150。C。N220ml/ml，H260ml/min，02300ml/min.進(jìn)樣量lul，內(nèi)標(biāo)物為甲乙酮。結(jié)果表明，優(yōu)化的菌株與出發(fā)菌株相比，乙醇產(chǎn)量明顯提高，四組菌株平均提高85.9%。其中出發(fā)菌株接種于100mlYPD培養(yǎng)基36。C發(fā)酵96h酒精產(chǎn)量0.77%，菌株YE2接種于100mlYPD培養(yǎng)基36t:發(fā)酵96h酒精產(chǎn)量1.49%(參見圖4和圖5)，產(chǎn)量提高了近1倍。下表列出了出發(fā)菌株和誘變菌株YE2在不同葡萄糖濃度的YPD培養(yǎng)基36C發(fā)酵96h酒精產(chǎn)量<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例4酯酶同工酶分析出發(fā)菌株和菌株YE2在相同條件培養(yǎng)48h后，酯酶同工酶酶譜電泳照片和模式圖見圖6，點(diǎn)樣量為30ta時(shí)條帶較清晰，兩個(gè)菌株均可見6條典型酶帶，其Rf值分別為0.45，0.52，0.64，0.69，0.74，0.86，但突變株0.74和0.86兩條帶明顯增強(qiáng)，表明出發(fā)酵母菌株經(jīng)優(yōu)化所得的耐溫菌株有兩種小分子量的酯酶活性明顯增強(qiáng)。權(quán)利要求1.一種耐高溫酒精酵母的優(yōu)化方法，將高劑量率脈沖電子束對(duì)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)進(jìn)行輻照，輻照劑量為半致死劑量至臨界致死劑量，而后高溫馴化，最終獲得耐高溫41℃以上的釀酒酵母菌株。2.如權(quán)利要求1所述的耐高溫酒精酵母的優(yōu)化方法，其特征在于，所述高劑量率脈沖電子束對(duì)釀酒酵母輻照的劑量率范圍為109Gy/s-2.5X109Gy/s。3.如權(quán)利要求1所述的耐高溫酒精酵母的優(yōu)化方法，其特征在于，所述高溫馴化條件為在36。C的培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)三天，挑出生長(zhǎng)良好，形狀圓實(shí)飽滿的菌落，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)溫度提高0.5。C的培養(yǎng)條件下再培養(yǎng)三天，重復(fù)上述步驟，直至溫度提高到菌株無(wú)法生長(zhǎng)為止。4.如權(quán)利要求1所述的耐高溫酒精酵母的優(yōu)化方法，其特征在于，所述釀酒酵母為普通釀酒酵母或耐高溫釀酒酵母。5.—種耐高溫釀酒酵母菌株，由權(quán)利要求1—4中任一權(quán)利要求所述方法優(yōu)化獲得，在4rc下能正常繁殖和發(fā)酵。6.如權(quán)利要求5所述的耐高溫釀酒酵母菌株，其特征在于，所述耐高溫釀酒酵母菌株在43.5'C下能正常繁殖和發(fā)酵。7.如權(quán)利要求5所述的耐高溫釀酒酵母菌株，其特征在于，所述耐高溫酒精酵母菌株產(chǎn)酒精量高于出發(fā)菌株。8.如權(quán)利要求6所述的耐高溫釀酒酵母菌株，其特征在于，所述耐高溫酒精酵母菌株在36r的發(fā)酵溫度下酒精產(chǎn)量較之出發(fā)菌株提高近一倍。全文摘要本發(fā)明涉及一種耐高溫酒精酵母的優(yōu)化方法。將高劑量率脈沖電子束對(duì)酵母菌株進(jìn)行輻照，結(jié)合高溫馴化，篩選獲得耐高溫酒精酵母菌株。本發(fā)明還公開了用上述該方法篩選獲得的耐高溫酒精酵母菌株。利用本發(fā)明提供的方法優(yōu)化耐高溫酒精酵母，可重復(fù)性好。用該方法獲得的耐高溫酒精酵母性能穩(wěn)定，活性高，發(fā)酵力強(qiáng)，工業(yè)使用可保證酒精工業(yè)夏季高溫正常生長(zhǎng)，降低水耗，電耗，提高酒精產(chǎn)量，帶來(lái)顯著經(jīng)濟(jì)效益。文檔編號(hào)C12N13/00GK101328466SQ20071004222公開日2008年12月24日申請(qǐng)日期2007年6月19日優(yōu)先權(quán)日2007年6月19日發(fā)明者姚思德,孫曉宇,虹朱,朱融融,汪世龍,許競(jìng)早申請(qǐng)人:同濟(jì)大學(xué)