專(zhuān)利名稱(chēng)：微流化水包油乳劑及疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及疫苗領(lǐng)域，特別是增強(qiáng)獸醫(yī)動(dòng)物的免疫應(yīng)答的佐劑制劑。具體而言，本發(fā)明涉及亞微米(submicron)水包油乳劑作為增強(qiáng)抗原免疫原性的疫苗佐劑的用途。本發(fā)明提供亞微米水包油乳液制劑、包含摻入這種乳劑中的抗原的疫苗組合物及這種乳劑與疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)與支原體感染在獸醫(yī)動(dòng)物(如牛、豬及陪伴動(dòng)物)中廣泛地傳播。由這些感染因子造成的疾病經(jīng)常對(duì)抗微生物醫(yī)藥治療有抗性，使得無(wú)有效的治療方法。結(jié)果，逐漸使用疫苗方式控制獸醫(yī)動(dòng)物的感染性疾病。在化學(xué)滅活或適當(dāng)?shù)倪z傳操作后，全感染病原體可適用于疫苗制劑?；蛘?，病原體的蛋白質(zhì)亞單位可在重組表現(xiàn)體系中表達(dá)且純化而用于疫苗制劑。
佐劑通常指增加對(duì)抗原的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的任何材料。傳統(tǒng)疫苗由已被殺死的病原微生物粗制品組成，而且伴隨病原微生物培養(yǎng)的雜質(zhì)可作為佐劑以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。然而，在使用病原微生物或純化蛋白質(zhì)亞單位的均質(zhì)制品作為抗原進(jìn)行免疫接種時(shí)，這種抗原引發(fā)的免疫性差，加入特定外源材料作為佐劑因而變得必要。此外，合成及亞單位疫苗在制造上昂貴。因此，藉助于佐劑，僅需要較小劑量的抗原來(lái)刺激免疫應(yīng)答，從而節(jié)省疫苗的制造成本。
已知佐劑以多種不同方式作用以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。許多種佐劑修改與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)。即使在其不與抗原在一起時(shí)這些免疫調(diào)節(jié)性佐劑也可發(fā)揮其作用。免疫調(diào)節(jié)性佐劑通常造成特定細(xì)胞因子的總體上調(diào)，及導(dǎo)致細(xì)胞Th1和/或體液Th2應(yīng)答的其它細(xì)胞因子的伴隨下調(diào)。
一些佐劑具有保存抗原的構(gòu)象完整性的能力，使得抗原可有效呈遞給適當(dāng)?shù)拿庖咝?yīng)細(xì)胞。作為此種佐劑制劑保存抗原構(gòu)象的結(jié)果，疫苗可具有增加的儲(chǔ)存壽命，如免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)所示。Ozel M.等人Quarternary Structure of the ImmunestimmulatingComplex(Iscom)，J.of Ultrastruc.and Molec.Struc.Res.102，240-248(1989)。
一些佐劑具有在注射部位處保留抗原成為貯藏所(depot)的性質(zhì)。作為此貯藏所效應(yīng)的結(jié)果，抗原不因肝清除而快速地失去。鋁鹽及油包水乳劑經(jīng)此貯藏所效應(yīng)作用較短的持續(xù)時(shí)間。例如，通過(guò)使用為油包水乳劑的弗氏完全佐劑(FCA)可獲得長(zhǎng)期貯藏所。FCA通常保留在注射部位處，直到生物降解使得因抗原呈遞細(xì)胞能移除抗原。
基于其物理性質(zhì)，佐劑可分成兩大類(lèi)，即粒狀佐劑及非粒狀佐劑。粒狀佐劑作為微粒而存在。免疫原可摻入或結(jié)合此微粒。鋁鹽、油包水乳劑、水包油乳劑、免疫刺激復(fù)合物、脂質(zhì)體及毫微粒與微粒為粒狀佐劑的實(shí)例。非粒狀佐劑通常為免疫調(diào)節(jié)劑且其通常與粒狀佐劑聯(lián)合使用。胞壁酰二肽(自分枝桿菌(Mycobacteria)提取的肽聚糖的佐劑活性成分)、非離子性嵌段共聚物、皂苷(自皂樹(shù)(Quillajasaponaria)的樹(shù)皮提取的三萜類(lèi)的復(fù)雜混合物)、脂質(zhì)A(葡糖胺的二糖，其具有兩個(gè)磷酸基團(tuán)及五或六個(gè)長(zhǎng)度通常為C12至C16的脂肪酸鏈)、細(xì)胞因子、碳水化合物聚合物、衍生的多糖及細(xì)菌毒素(如霍亂毒素及大腸桿菌不穩(wěn)定毒素(LT))為非粒狀佐劑的實(shí)例。
一些最為熟知的佐劑為非粒狀免疫調(diào)節(jié)劑與可賦予佐劑制劑以儲(chǔ)藏所效應(yīng)的粒狀材料的組合。例如，F(xiàn)CA結(jié)合了結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)成分的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)與油乳劑的短期儲(chǔ)藏所效應(yīng)。
油乳劑已長(zhǎng)期用作為疫苗佐劑。Le Moignic與Pinoy在1916年發(fā)現(xiàn)，已被殺死的鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhimurium)于礦物油中的懸浮液增加免疫應(yīng)答。繼而在1925年，Ramon描述了淀粉油作為一種增加對(duì)白喉類(lèi)毒素的抗毒素反應(yīng)的物質(zhì)。然而油乳劑沒(méi)有流行起來(lái)，直到1937年Freund提出現(xiàn)在已知為弗氏完全佐劑(FCA)的佐劑制劑。FCA為一種由礦物(石蠟)油混合已被殺死的分枝桿菌與阿拉塞A(Arlacel A)組成的油包水乳劑。阿拉塞A主要為二縮甘露醇單油酸酯且用作為乳化劑。雖然FCA在誘發(fā)抗體應(yīng)答方面是優(yōu)異的，其造成嚴(yán)重的疼痛、膿腫形成、發(fā)燒及肉芽腫性炎癥。為了避免這些不希望的副反應(yīng)，開(kāi)發(fā)了不完全弗氏佐劑(IFA)。IFA的組成類(lèi)似FCA，除了無(wú)分枝桿菌成分。IFA通過(guò)注射部位處的貯藏所制劑起作用且緩慢地釋放抗原刺激抗體產(chǎn)生細(xì)胞。
另一種改進(jìn)FCA的方法是基于以生物相容性油替換礦物油會(huì)有助于消除在注射部位與FCA有關(guān)的反應(yīng)的觀點(diǎn)。亦據(jù)信乳劑應(yīng)為水包油而非油包水，因?yàn)楹笳咴谧⑸洳课惶幃a(chǎn)生持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間的貯藏所。Hilleman等人描述了一種油基佐劑“Adjuvant 65”，其由86％的花生油、10％的作為乳化劑的阿拉塞A及4％的作為穩(wěn)定劑的單硬脂酸鋁組成。Hilleman，1966，Prog.Med.Virol.8131-182；Hilleman與Beale，1983，于New Approaches to Vaccine Development(編者Bell，R.與Torrigiani，G.)，Schwabe，Basel。在人體中，Adjuvant 65安全且強(qiáng)效，但是呈現(xiàn)較IFA低的佐劑性。不過(guò)Adjuvant 65的應(yīng)用因與某些批次疫苗對(duì)人類(lèi)的致反應(yīng)性及在使用純化或合成乳化劑代替阿拉塞A時(shí)佐劑性降低而中斷。美國(guó)專(zhuān)利第5,718,904與5,690,942號(hào)教導(dǎo)，為了改善安全性的目的，水包油乳劑中的礦物油可以替換為可代謝性油。
除了佐劑性及安全性，乳劑的物理外觀亦為重要的商業(yè)考量。物理外觀取決于乳劑的穩(wěn)定性。乳狀液分層、沉積及聚結(jié)為乳劑不穩(wěn)定的指示。乳狀液分層是在乳劑的油相與水相具有不同的比重時(shí)發(fā)生。乳狀液分層亦在乳劑的起初小滴大且乳劑小滴不具有任何布朗運(yùn)動(dòng)時(shí)發(fā)生。在小滴大時(shí)有界面破裂的趨勢(shì)且小滴凝聚成大顆粒。乳劑穩(wěn)定性由許多因素決定，如所使用乳化劑的本性及量、乳劑中的小滴大小及油相與水相之間的密度差異。
乳化劑通過(guò)降低界面自由能且對(duì)小滴凝聚制造物理或靜電屏障而促進(jìn)分散小滴的穩(wěn)定化。已使用非離子型及離子型去污劑作為乳化劑。非離子型乳化劑在界面處定向且產(chǎn)生相當(dāng)大的結(jié)構(gòu)，其導(dǎo)致分散小滴的立體回避。陰離子型或陽(yáng)離子型乳化劑因吸引抗衡離子而誘發(fā)電雙層形成；此雙層斥力造成小滴在其接近時(shí)彼此互斥。
除了使用乳化劑，亦可經(jīng)由藉機(jī)械裝置降低乳劑的小滴大小而實(shí)現(xiàn)乳劑穩(wěn)定性。典型地，已使用推進(jìn)混合器、渦輪轉(zhuǎn)動(dòng)器、膠體研磨機(jī)、均化器及超聲波振蕩器制造乳劑。微流化為另一種增加乳劑中小滴大小均勻性的方式。微流化可產(chǎn)生具有亞微米范圍的一致粒度的精巧的、物理上穩(wěn)定的乳劑。除了增加乳劑的穩(wěn)定性，微流化的過(guò)程還允許終末過(guò)濾，其為確保最終產(chǎn)物無(wú)菌性的優(yōu)選方式。此外，亞微米油?？勺宰⑸洳课凰腿肓馨凸苋缓笾烈麈湹牧馨徒Y(jié)、血液及脾臟。如此降低在注射部位處建立油性貯藏所(其可產(chǎn)生局部炎癥及顯著的注射部位反應(yīng))的可能性。
微流化器現(xiàn)已市售。乳劑形成是在微流化器中因兩股流化流在相互作用室內(nèi)以高速相互作用而發(fā)生。微流化器為空氣或氮驅(qū)動(dòng)且可以超過(guò)20,000psi內(nèi)壓操作。美國(guó)專(zhuān)利第4,908,154號(hào)教導(dǎo)了微流化器用于得到基本上無(wú)任何乳化劑的乳劑的用途。
許多種亞微米水包油佐劑制劑已敘述于文獻(xiàn)中。美國(guó)專(zhuān)利第5,376,369號(hào)教導(dǎo)一種已知為Syntax佐劑制劑(SAF)的亞微米水包油乳劑佐劑制劑。SAF含鯊烯或鯊?fù)樽鳛橛统煞帧⑷閯┬纬闪康腜luronic L121(聚氧丙烯-聚氧乙烯)嵌段聚合物及免疫強(qiáng)化量的胞壁酰二肽。鯊烯為一種在許多組織中，特別是在鯊魚(yú)及其它魚(yú)類(lèi)的肝臟中發(fā)現(xiàn)的膽固醇的直鏈烴前體。鯊?fù)槭峭ㄟ^(guò)將鯊烯氫化而制備且完全飽和。鯊烯與鯊?fù)榫纱x且具有良好的毒理學(xué)研究記錄。鯊烯或鯊?fù)槿閯┮延糜谌祟?lèi)癌癥疫苗，其副作用溫和并具有期望的效力。例如，參見(jiàn)Anthony C.Allison，1999，Squalene and Squalane emulsions asadjuvants，Methods 1987-93。
美國(guó)專(zhuān)利第6,299,884號(hào)及國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)WO 90/14837號(hào)教導(dǎo)聚環(huán)氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物對(duì)于亞微米水包油乳劑的形成不是必需。此外，這些參考資料教導(dǎo)無(wú)毒的可代謝性油的用途，而且在其乳液制劑中明確地排除礦物油及毒性石油蒸餾油的應(yīng)用。
美國(guó)專(zhuān)利第5,961,970號(hào)教導(dǎo)另一種用作為疫苗佐劑的亞微米水包油乳劑。在此專(zhuān)利所述的乳劑中，疏水性成分選自中鏈甘油三酯油、植物油及其混合物。包括于此乳劑中的表面活性劑可為天然的生物相容性表面活性劑，如磷脂(例如，卵磷脂)，或醫(yī)藥可接受的非天然表面活性劑，如TWEEN-80。相對(duì)于在乳劑已獨(dú)立地及外部地形成后混合抗原與乳劑，此專(zhuān)利亦教導(dǎo)在乳劑形成時(shí)將抗原摻入乳劑中。
美國(guó)專(zhuān)利第5,084,269號(hào)教導(dǎo)含卵磷脂組合礦物油的佐劑制劑造成在宿主動(dòng)物內(nèi)的刺激性降低，同時(shí)誘發(fā)增加的系統(tǒng)免疫性。由美國(guó)專(zhuān)利第5,084,269號(hào)得到的佐劑制劑以商標(biāo)名AMPHIGEN市售用于獸醫(yī)疫苗。AMPHIGEN制劑是由微團(tuán)-被卵磷脂包圍的油小滴制成。這些微團(tuán)允許較傳統(tǒng)油基佐劑更多的全細(xì)胞抗原附著。此外，相較于其它含油佐劑的疫苗制劑，其一般含10％至20％的油，基于AMPHIGEN的疫苗制劑含2.5至5％礦物油的低油含量。其低油含量使基于此佐劑的疫苗制劑對(duì)注射部位的組織刺激性較小，造成較少的損害及在屠宰時(shí)較少的修整。此外，包圍油小滴的卵磷脂包層進(jìn)一步減輕注射部位反應(yīng)而得到安全且有效的疫苗。
AMPHIGEN制劑被用作為許多種獸醫(yī)疫苗中的佐劑，在短期及長(zhǎng)期儲(chǔ)存期間及重組時(shí)需要維持疫苗產(chǎn)品的物理外觀。此外，恰在注射前將凍干抗原與預(yù)制的佐劑制劑混合。此實(shí)踐操作并不總能確?？乖谒腿閯﹥?nèi)均勻分布，而且乳劑外觀可能未如所需。此外，靜置后，均化乳劑可顯示出相分離。因此，仍存在對(duì)長(zhǎng)期貯存不顯示相分離的穩(wěn)定佐劑制劑的需求。一種防止相分離的方式為降低乳劑的小滴大小及增加顆粒均勻性。雖然可代謝性油基乳液制劑的微流化過(guò)程已見(jiàn)于文獻(xiàn)中，如AMPHIGEN的水包油乳劑的微流化尚未進(jìn)行。
在本發(fā)明中，已使用微流化使卵磷脂包圍的礦物油小滴的大小為亞微米大小。出乎意料地，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，以包含卵磷脂與油的混合物的水包油乳劑為佐劑的疫苗制劑的微流化不僅改善制劑的物理外觀，而且還增強(qiáng)制劑的免疫效果。微流化制劑的特性亦具有改進(jìn)的安全性的特征。
發(fā)明概述本發(fā)明人已出乎意料地發(fā)現(xiàn)，基于不可代謝性油的水包油乳劑的佐劑活性及安全性可經(jīng)微流化而改進(jìn)。摻入微流化乳劑的抗原是穩(wěn)定的，即使抗原在微流化前內(nèi)部地?fù)饺肴閯┲袝r(shí)亦如此。
因此，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供可用作為疫苗佐劑的亞微米水包油乳液制劑。本發(fā)明的亞微米水包油乳劑是由不可代謝性油、至少一種表面活性劑及水性成分組成，其中油是以亞微米范圍的平均油小滴大小分散于水性成分中。優(yōu)選不可代謝性油為輕質(zhì)礦物油。優(yōu)選表面活性劑包括卵磷脂、Tween-80與SPAN-80。
本發(fā)明提供的優(yōu)選水包油乳劑是由AMPHIGEN制劑組成。
本發(fā)明的水包油乳劑可包括適當(dāng)及需要的另外的成分，包括防腐劑、滲透劑、生物粘著分子及免疫刺激分子。優(yōu)選的免疫刺激分子包括，例如，Quil A、膽固醇、GPI-0100、溴化二甲基二-十八烷基銨(DDA)。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備亞微米水包油乳劑的方法。依照本發(fā)明，將各種乳劑成分混合在一起，包括油、一種或多種表面活性劑、水性成分及任何適用于此乳劑的其它成分。使此混合物經(jīng)受初步乳化過(guò)程以形成水包油乳劑，然后將其送經(jīng)微流化器而得到具有直徑小于1微米，優(yōu)選平均小滴大小小于0.5微米的小滴的水包油乳劑。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供含抗原及上述亞微米水包油乳劑的疫苗組合物。抗原外部地或內(nèi)部地?fù)饺肴閯┲?，?yōu)選內(nèi)部地。
可包括于本發(fā)明的疫苗組合物中的抗原可為細(xì)菌、真菌或病毒抗原或其組合?？乖蔀闇缁畹娜?xì)胞或部分細(xì)胞或病毒制品的形式或藉常規(guī)蛋白質(zhì)純化、基因工程技術(shù)或化學(xué)合成而得到的抗原性分子的形式。
在進(jìn)一步具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備含一種或多種抗原組合亞微米水包油乳劑的疫苗組合物的方法。
在制備本發(fā)明的疫苗組合物時(shí)，抗原可內(nèi)部地(例如，在微流化前)或外部地(例如，在微流化后)與水包油乳劑的成分合并。優(yōu)選為，抗原內(nèi)部地組合水包油乳劑的成分。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供含微囊化抗原及上述亞微米水包油乳劑的疫苗組合物，其中微囊化抗原外部地組合乳劑。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1描繪非微流化疫苗組合物的分批制備過(guò)程。在此過(guò)程中，將各種疫苗成分加入左方的添加容器中且最后泵入摻合容器中，其中成分經(jīng)簡(jiǎn)單機(jī)械裝置混合在一起。
圖2描繪含內(nèi)部地?fù)饺氲目乖奈⒘骰呙缃M合物的制備過(guò)程。將各種疫苗成分加入添加容器中并轉(zhuǎn)移至乳劑前摻合單元以經(jīng)簡(jiǎn)單機(jī)械裝置混合。繼而使乳劑通過(guò)微流化器且在微流化后室中收集。
圖3描繪基于非微流化AMPHIGEN制劑的疫苗、基于微流化AMPHIGEN制劑的疫苗及實(shí)驗(yàn)臺(tái)摻合疫苗制品的小滴大小分布。
圖4顯示在微流化疫苗制品中無(wú)相分離。
圖5描繪內(nèi)部地?fù)饺牖谖⒘骰疉MPHIGEN制劑的疫苗制品(A907505)及三種基于對(duì)照、非微流化AMPHIGEN制劑的疫苗制品(A904369、A904370與A904371)中的抗原穩(wěn)定性的比較。將所有四種疫苗制品在4℃儲(chǔ)存2年。在儲(chǔ)存期間的不同時(shí)間點(diǎn)(0、6、12或24個(gè)月)，使用所有四種制劑對(duì)三個(gè)月大的乳牛接種。接種在第0及21天以2毫升疫苗劑量完成，并在第二次接種后2周采集血清。在各血清樣品中測(cè)定對(duì)BVD II型病毒的中和抗體滴度。此數(shù)據(jù)是以5只動(dòng)物的幾何平均值給出的。
圖6顯示在施用微流化及非微流化疫苗前后牛的最小二乘方平均直腸溫度。T01安慰劑組-單劑量；T02安慰劑組-雙劑量；T03非微流化制劑-單劑量；T04非微流化制劑-雙劑量；T05微流化制劑-單劑量；T06微流化制劑-雙劑量。
圖7描繪在施用非微流化及微流化疫苗制劑后在牛中觀察到的最小二乘方平均注射部位反應(yīng)體積。T03非微流化制劑-單劑量；T04非微流化制劑-雙劑量；T05微流化制劑-單劑量；T06微流化制劑-雙劑量。
圖8描繪在接種含重組PauA抗原與大腸桿菌全細(xì)胞抗原的各種疫苗制劑后，對(duì)得自乳房鏈球菌的重組PauA抗原的幾何平均IgG滴度。
圖9描繪在接種含重組PauA抗原與大腸桿菌全細(xì)胞抗原的各種疫苗制劑后，對(duì)得自乳房鏈球菌的大腸桿菌全細(xì)胞抗原的幾何平均IgG滴度。
圖10A及10B描繪微流化Amphigen制劑在初始制造(圖10A)及在制造后22個(gè)月(圖10B)的粒度分布。
發(fā)明詳述本發(fā)明人已出乎意料地發(fā)現(xiàn)，以水包油乳劑(包含卵磷脂與礦物油的混合物)為佐劑的疫苗制劑的微流化不僅改善疫苗制劑的物理外觀，亦增強(qiáng)疫苗制劑的免疫效果。微流化疫苗制劑的特征亦為改進(jìn)的安全性。
基于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供可在疫苗組合物中用作為佐劑的亞微米水包油乳劑。亦提供使用微流化器制造這些亞微米水包油乳劑的方法。此外，本發(fā)明提供其中抗原與亞微米水包油乳劑組合的亞微米疫苗組合物。亦提供制造此疫苗組合物的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供含微囊化抗原組合亞微米水包油乳劑的疫苗組合物，及制造此疫苗的方法。
為了公開(kāi)清楚，而且不為限制的方式，本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明分成以下小部分，描述或例示說(shuō)明本發(fā)明的某些特征、具體實(shí)施方案或應(yīng)用。亞微米水包油乳劑在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供可用作為疫苗佐劑的亞微米水包油乳液制劑。本發(fā)明的亞微米水包油乳劑增強(qiáng)疫苗組合物中抗原的免疫原性，對(duì)動(dòng)物施用安全且在儲(chǔ)存時(shí)穩(wěn)定。
本發(fā)明的亞微米水包油乳劑是由不可代謝性油、至少一種表面活性劑及水性成分組成，其中油以亞微米范圍的平均油小滴大小分散于水性成分中。
“亞微米”表示小滴為小于1μm(微米)的大小且平均(average)或均值(mean)油小滴大小小于1μm。優(yōu)選為，乳劑的平均小滴大小小于0.8微米；更優(yōu)選為小于0.5微米；而且甚至更優(yōu)選為小于0.4微米，或約0.1-0.3微米。
“平均小滴大小”定義為粒度的體積分布內(nèi)的體積平均直徑(VMD)粒度。VMD是由各粒徑乘以此大小的所有顆粒的體積并加總而計(jì)算。然后將其除以所有顆粒的總體積。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“不可代謝性油”指投以乳劑的動(dòng)物對(duì)象體無(wú)法代謝的油。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”及“動(dòng)物對(duì)象”指所有非人類(lèi)的動(dòng)物，例如，包括牛、羊及豬。
適宜用于本發(fā)明乳劑的不可代謝性油包括烷烴、烯烴、炔烴及其對(duì)應(yīng)酸與醇、其醚與酯及其混合物。優(yōu)選為，油的各個(gè)化合物為輕烴化合物，即，此類(lèi)成分具有6至30個(gè)碳原子。油可合成地制備或由石油產(chǎn)品純化。用于本發(fā)明乳劑的優(yōu)選不可代謝性油包括，例如，礦物油、石蠟油及環(huán)烷烴。
術(shù)語(yǔ)“礦物油”指經(jīng)蒸餾技術(shù)得自礦脂的液態(tài)烴的混合物。此術(shù)語(yǔ)與“液化石蠟”、“液體石蠟”及“白色礦物油”同義。此術(shù)語(yǔ)還意圖包括“輕質(zhì)礦物油”，即，藉礦脂蒸餾類(lèi)似地得到，但是具有比白色礦物油稍低的比重的油。例如，參見(jiàn)Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，(Easton，Pa.Mack Publishing Company，1990，第788與1323頁(yè))。礦物油可得自各種商業(yè)來(lái)源，例如，J.T.Baker(Phillipsburg，PA)、USB Corporation(Cleveland，OH)。優(yōu)選的礦物油為以商標(biāo)名DRAKEOL市售的輕質(zhì)礦物油。
一般而言，本發(fā)明亞微米乳劑的油成分是以1％至50％體積比的量；優(yōu)選為10％至45％的量；更優(yōu)選為20％至40％的量存在。
本發(fā)明的水包油乳劑一般包括至少一種(即，一種或多種)表面活性劑。表面活性劑與乳化劑(所述術(shù)語(yǔ)在此可互換使用)為穩(wěn)定油小滴表面且將油小滴維持在所需大小內(nèi)的試劑。
適宜用于本發(fā)明乳劑的表面活性劑包括天然生物相容性表面活性劑及非天然合成表面活性劑。生物相容性表面活性劑包括磷脂化合物或磷脂的混合物。優(yōu)選的磷脂為磷脂酰膽堿(卵磷脂)，如大豆或蛋卵磷脂。卵磷脂可通過(guò)水洗粗植物油及將所得水合膠分離且干燥，作為磷脂與甘油三酯的混合物而得。精制產(chǎn)物可通過(guò)在丙酮清洗而去除甘油三酯及植物油后，分餾殘留的丙酮不溶性磷脂與糖脂的混合物而得。或者，卵磷脂可得自各種商業(yè)來(lái)源。其它適當(dāng)?shù)牧字字８视?、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、心肌磷脂與磷脂酰乙醇胺。磷脂可分離自天然來(lái)源或常規(guī)合成。
適宜用于本發(fā)明亞微米乳劑的非天然合成表面活性劑包括基于脫水山梨糖醇的非離子型表面活性劑，例如，脂肪酸取代的脫水山梨糖醇表面活性劑(以名稱(chēng)SPAN或ARLACEL市售)、聚乙氧基化山梨糖醇的脂肪酸酯(TWEEN)、得自如蓖麻油來(lái)源的脂肪酸的聚乙二醇酯(EMULFOR)；聚乙氧基化脂肪酸(例如，名為SIMULSOLM-53的硬脂酸)、聚乙氧基化異辛酚/甲醛聚合物(TYLOXAPOL)、聚氧乙烯脂肪醇醚(BRIJ)；聚氧乙烯非苯基醚(TRITONN)、聚氧乙烯異辛基苯基醚(TRITONX)。優(yōu)選的合成表面活性劑為名為SPAN與TWEEN的表面活性劑。
用于本發(fā)明水包油乳劑的優(yōu)選表面活性劑包括卵磷脂、Tween-80與SPAN-80。
一般而言，表面活性劑或表面活性劑的組合(如果使用兩種或更多種表面活性劑)是以0.01％至10％，優(yōu)選為0.1％至6.0％，更優(yōu)選為0.2％至5.0％體積比的量存在于乳劑中。
水性成分組成乳劑的連續(xù)相且可為水、經(jīng)緩沖鹽水或任何其它適當(dāng)?shù)乃芤骸?br> 本發(fā)明的水包油乳劑可包括適當(dāng)且需要的另外的成分，包括防腐劑、滲透劑、生物粘著分子及免疫刺激分子。
據(jù)信生物粘著分子可增強(qiáng)抗原在目標(biāo)粘膜表面上或通過(guò)目標(biāo)粘膜表面的輸送及附著而產(chǎn)生粘膜免疫性。適當(dāng)生物粘著分子的實(shí)例包括酸性非天然存在聚合物，如聚丙烯酸與聚甲基丙烯酸(例如，CARBOPOL、CARBOMER)；酸性經(jīng)合成修飾天然聚合物，如羧甲基纖維素；中性經(jīng)合成修飾天然聚合物，如(羥丙基)甲基纖維素；堿性帶胺聚合物，如殼聚糖；可得自天然來(lái)源的酸性聚合物，如海藻酸、透明質(zhì)酸、果膠、黃蓍膠與梧桐膠；及中性非天然存在聚合物，如聚乙烯醇；或其組合。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“免疫刺激分子”指增強(qiáng)疫苗組合物中抗原性成分誘發(fā)的保護(hù)性免疫應(yīng)答的分子。適當(dāng)?shù)拿庖叽碳げ牧习?xì)菌細(xì)胞壁成分，例如，N-乙?；邗?L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺的衍生物，如壁肽丁酯、蘇氨?；?MDP與胞壁酰三肽；植物皂苷與其衍生物，例如，Quil A、QS 21與GPI-0100；膽固醇；及季銨化合物，例如，溴化二甲基二-十八烷基銨(DDA)與N，N-二-十八烷基-N，N-雙(2-羥乙基)丙二胺(“阿夫立定”)。
皂苷為廣泛種類(lèi)的植物物種中作為次級(jí)代謝產(chǎn)物而制造的糖苷化合物。皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)賦予廣泛范圍的藥理學(xué)及生物學(xué)活性，包括一些強(qiáng)效及有效的免疫學(xué)活性。
結(jié)構(gòu)上，皂苷由任何附著于一個(gè)或多個(gè)糖鏈的糖苷配基組成。皂苷可依照其糖苷配基組成分類(lèi)三萜糖苷、類(lèi)固醇糖苷與類(lèi)固醇生物堿糖苷。
皂苷可自皂樹(shù)的樹(shù)皮分離。皂苷長(zhǎng)期已知為免疫刺激劑。Dalsgaard，K.的“Evaluation of its adj uvant activity with a specialreference to the application in the vaccination of cattle againstfoot-and-mouth disease”，Acta.Vet.Scand.691-40 1978。含皂苷的植物粗提取物增強(qiáng)口蹄疫疫苗的效力。然而，此粗提取物在用于疫苗時(shí)伴有不良副作用。后來(lái)，Dalsgaard藉透析、離子交換與凝膠過(guò)濾層析術(shù)自皂苷部分地純化了佐劑活性成分。Dalsgaard，K.等人的“Saponin adjuvants III.Isolation of a substance from Quillajasaponaria Morina with adjuvant activity in foot-and-mouth diseasevaccines”，Arch.Gesamte.Virusforsch.44243-254 1974。以此方式純化的佐劑活性成分已知為“Quil A”。以重量計(jì)，Quil A相較于皂苷顯示增加的效力且呈現(xiàn)降低的局部反應(yīng)。Quil A廣泛地用于獸醫(yī)疫苗。
以高壓液相色譜(HPLC)進(jìn)一步分析Quil A顯示一種密切相關(guān)皂苷的異質(zhì)混合物且導(dǎo)致QS21的發(fā)現(xiàn)，其為具有降低或最小毒性的強(qiáng)效佐劑。Kensil C.R.等人的“Separation and characterization ofsaponins with adjuvant activity from Quillaja saponaria Molinacortex，”J.Immunol.146431-437，1991。不似大多數(shù)其它的免疫刺激劑，QS21為水溶性且可用于有或無(wú)乳劑型制劑的疫苗。QS21已顯示在小鼠中引出Th1型應(yīng)答，刺激IgG2a與IgG2b抗體產(chǎn)生，及應(yīng)答亞單位抗原而誘發(fā)抗原特異性CD8+CTL(MHC第I類(lèi))。對(duì)人類(lèi)的臨床研究已證明其佐劑性，并具有可接受的毒理學(xué)特征。Kensil，C.R.等人的“Structural and immunological characterization of the vaccineadjuvant QS-21.In Vaccine Designthe subunit and AdjuvantApproach，”編者Powell，M.F.與Newman，M.J.Plenum PublishingCorporation，紐約，1995，第525-541頁(yè)。
美國(guó)專(zhuān)利第6,080,725號(hào)教導(dǎo)制造及使用皂苷-親脂體綴合物的方法。在此皂苷-親脂體綴合物中，使親脂性部分(如脂質(zhì)、脂肪酸、聚乙二醇或萜烯)經(jīng)存在于三萜烯皂苷的3-O-葡萄糖醛酸上的羧基而共價(jià)地附著于非酰化或去?；葡┰碥?。親脂性部分對(duì)皂苷(如皂樹(shù)去酰皂苷、lucyoside P或得自絲石竹(Gypsophila)、肥皂草(saponaria)與針珊瑚屬(Acanthophyllum)的皂苷)的3-O-葡萄糖醛酸的附著增強(qiáng)其對(duì)體液及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性的佐劑效應(yīng)。此外，親脂性部分對(duì)非-或去酰基皂苷的3-O-葡萄糖醛酸殘基的附著產(chǎn)生比原始皂苷更易純化、更低毒性、化學(xué)上更穩(wěn)定而且具有相等或更好佐劑性質(zhì)的皂苷類(lèi)似物。
GPI-0100為美國(guó)專(zhuān)利第6,080,725號(hào)所述的皂苷-親脂體綴合物。GPI-0100是通過(guò)經(jīng)葡萄糖醛酸的羧基將脂族胺加入去?；碥斩圃?。
季銨化合物-已提出許多種脂族含氮堿可用作為免疫學(xué)佐劑，包括胺、季銨化合物、胍、芐脒與thiouroniums。特定的此類(lèi)化合物包括溴化二甲基二-十八烷基銨(DDA)與N，N-二-十八烷基-N，N-雙(2-羥乙基)丙二胺(“阿夫立定”)。
美國(guó)專(zhuān)利第5,951,988號(hào)教導(dǎo)含季銨鹽(如DDA)聯(lián)合油成分的佐劑制劑。此制劑可用于聯(lián)合已知的免疫物質(zhì)，例如，疫苗組合物中的病毒或細(xì)菌抗原，以增強(qiáng)免疫原性應(yīng)答。此組合物亦可不摻入抗原而作為非特異性免疫刺激性制劑而應(yīng)用。
美國(guó)專(zhuān)利第4,310,550號(hào)描述N，N-高碳烷基-N，N′-雙(2-羥乙基)-丙二胺與N，N-高碳烷基-二甲苯二胺與脂肪或脂質(zhì)乳劑調(diào)配成疫苗佐劑的用途。一種經(jīng)由將佐劑制劑經(jīng)腸胃外施用而誘發(fā)或增強(qiáng)人類(lèi)或動(dòng)物中抗原的免疫原性應(yīng)答的方法敘述于美國(guó)專(zhuān)利第4,310,550號(hào)。
在優(yōu)選具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種可用作為疫苗佐劑的亞微米水包油乳劑，其由AMPHIGEN制劑組成，小滴大小小于1微米且平均小滴大小為約0.25微米。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“AMPHIGEN制劑”指通過(guò)在TWEEN80與SPAN80存在下混合DRAKEOL卵磷脂油溶液(Hydronics，Lincoln，NE)與鹽水溶液而形成的溶液。典型AMPHIGEN制劑含40％體積比(v/v)的輕質(zhì)礦物油、約25％w/v的卵磷脂、約0.18％體積比(v/v)的TWEEN 80及約0.08％體積比(v/v)的Span 80。
制備亞微米水包油乳劑的方法在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備上述亞微米水包油乳劑的方法。
依照本發(fā)明，將乳劑的各種成分，包括油、一種或多種表面活性劑、水性成分及適宜用于乳劑的任何其它成分合并且混合在一起。
使形成的混合物經(jīng)受乳化過(guò)程，一般經(jīng)由通過(guò)一個(gè)或多個(gè)均化器或乳化器一次或多次以形成水包油乳劑，其具有均勻的外觀及約0.5微米的平均小滴大小。任何市售均化器或乳化器均可用于此目的，例如，Ross乳化器(Hauppauge，NY)、Gaulin均化器(Everett，MA)。
然后使如此形成的乳劑經(jīng)受微流化以使小滴大小落入亞微米范圍。微流化可使用市售微流化器完成，如得自Mass，Newton的Microfiuidics的型號(hào)11OY；Gaulin Model 30CD(Gaulin，Inc.，Everett，Mass.)；及Rainnie Minilab Type 8.30H(Miro Atomizer Food andDairy，Inc.，Hudson，Wis.)。這些微流化器是通過(guò)迫使液體在高壓下強(qiáng)制通過(guò)小穿孔，使得兩股液體流在相互作用室中以高速相互作用而形成具亞微米大小小滴的乳劑而操作。
小滴大小可使用市售定徑儀器通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法例如激光衍射來(lái)測(cè)定。取決于使用的表面活性劑類(lèi)型、表面活性劑對(duì)油的比例、操作壓力、溫度等，大小可以不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)即可確定這些參數(shù)的理想組合以得到具有所需小滴大小的乳劑。本發(fā)明乳劑的小滴直徑小于1微米，優(yōu)選平均小滴大小小于0.8微米，而且更優(yōu)選為平均小滴大小小于0.5微米，而且甚至更優(yōu)選為平均小滴大小小于0.3微米。
在本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方案中，將由Hydronics(Lincoln，NE)市售且在輕質(zhì)礦物油中含25％卵磷脂的DRAKEOL卵磷脂油溶液組與鹽水及表面活性劑TWEEN80與SPAN80合并及混合而形成“AMPHGEN溶液”或“AMPHIGEN制劑”。然后將AMPHGEN溶液以Ross(Hauppauge，NY 11788)乳化器于大約3400rpm乳化而形成水包油乳劑。繼而使此乳劑通過(guò)于大約4500±500psi操作的微流化器一次。此微流化水包油乳劑具有小于1微米大小的小滴，平均小滴大小為約0.25微米。
含摻入亞微米水包油乳劑中的抗原的疫苗組合物。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供含抗原和上述亞微米水包油乳劑的疫苗組合物。這些疫苗組合物的特征為具有增強(qiáng)的免疫原性效應(yīng)及改善的物理外觀(例如，在長(zhǎng)期儲(chǔ)存后未觀察到相分離)。此外，本發(fā)明的疫苗組合物對(duì)動(dòng)物施用安全。
依照本發(fā)明，抗原可外部地或優(yōu)選內(nèi)部地與乳劑組合合并。術(shù)語(yǔ)“內(nèi)部地(intrinsically)”指其中在微流化步驟前將抗原與乳劑成分合并組合的過(guò)程。術(shù)語(yǔ)“外部地(extrinsically)”指其中在乳劑已微流化后將抗原加入乳劑的過(guò)程。外部地加入的抗原可為游離抗原或其可包封于微粒中，如以下進(jìn)一步敘述。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“抗原”指在動(dòng)物中為免疫原性，而且包括于疫苗組合物中以在施打疫苗組合物的動(dòng)物中引出保護(hù)性免疫應(yīng)答的任何分子、化合物或組合物。
在此有關(guān)抗原使用的術(shù)語(yǔ)“免疫原性”指抗原在動(dòng)物中針對(duì)抗原引起免疫應(yīng)答的能力。此免疫應(yīng)答可為主要由細(xì)胞毒性T-細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，或主要由輔助T-細(xì)胞(其依次活化B-細(xì)胞，導(dǎo)致抗體產(chǎn)生)介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答。
“保護(hù)性免疫應(yīng)答”在此定義為在動(dòng)物中發(fā)生，對(duì)于因抗原或含抗原的病原體造成的障礙或疾病，預(yù)防或可檢測(cè)地降低其發(fā)生，或消除或可檢測(cè)地降低其嚴(yán)重性，或可檢測(cè)地減緩其進(jìn)展速率的任何免疫應(yīng)答(抗體或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答或兩者)。
可包括于本發(fā)明疫苗組合物中的抗原包括由以下物種制備的抗原致病性細(xì)菌，如豬關(guān)節(jié)支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)、嗜睡嗜血桿菌(Haemophilus somnus)、副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)、支氣管敗血性鮑特菌(Bordetella bronchiseptica)、胞膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumonie)、多殺巴斯德菌(Pasteurella multocida)、Manheimia hemolytica、牛支原體(Mycoplasma bovis)、Mycoplasma galanecium、牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)，副結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumparatuberculosis)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridial spp.)、乳房鏈球菌(Streptococcus uberis)、豬型鏈球菌(Streptococcus suis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrixrhusopathiae)、彎曲桿菌屬(Campylobacter spp.)、壞死梭形桿菌(Fusobacterium necrophorum)、大腸桿菌(Escherichia coli)、腸炎沙門(mén)菌(Salmonella enterica serovars)、鉤端螺旋體屬(Leptospiraspp.)；致病性真菌，如念珠菌屬(Candida)；原蟲(chóng)，如隱擔(dān)孢子蟲(chóng)(Cryptosporidium parvum)、Neospora canium、鼠弓形體(Toxoplasma gondii)、艾美球蟲(chóng)屬(Eimeria spp.)；蠕蟲(chóng)，如胃線蟲(chóng)屬(Ostertagia)、庫(kù)珀線蟲(chóng)屬(Cooperia)、血矛線蟲(chóng)屬(Haemonchus)、片吸蟲(chóng)屬(Fasciola)，為滅活的全細(xì)胞或部分細(xì)胞制品的形式，或?yàn)榻逵沙Ｒ?guī)蛋白質(zhì)純化、基因工程技術(shù)或化學(xué)合成而得到的抗原性分子的形式。另外的抗原包括致病性病毒，如牛皰疹病毒-1，3，6、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)1和2型、牛副流感病毒、牛呼吸道合胞病毒、牛白血病病毒、牛瘟病毒、口蹄疫病毒、狂犬病、豬瘟病毒、非洲豬熱病毒、豬小病毒、PRRS病毒、豬環(huán)狀病毒、流感病毒、豬水病病毒、泰琛(Techen)熱病毒、假狂犬病病毒，為滅活的全病毒或部分病毒制品的形式，或?yàn)榻逵沙Ｒ?guī)蛋白質(zhì)純化、基因工程技術(shù)或化學(xué)合成而得到的抗原性分子的形式。
抗原量應(yīng)使得抗原與水包油乳劑組合在動(dòng)物中有效誘發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答。有效的抗原精確量取決于抗原的性質(zhì)、活性及純度，而且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。
存在于疫苗組合物中的水包油乳劑的量應(yīng)足以增強(qiáng)疫苗組合物中抗原的免疫原性。在希望及適當(dāng)時(shí)，除了水包油乳劑提供的表面活性劑，額外量的表面活性劑或另外的表面活性劑可加入疫苗組合物中。一般而言，油成分以1.0％至20％體積比的量；優(yōu)選為1.0％至10％體積比的量；更優(yōu)選為2.0％至5.0％體積比的量，存在于疫苗組合物的終體積中。表面活性劑或表面活性劑的組合(如果使用兩種或更多種表面活性劑)是以0.1％至20％，優(yōu)選為0.15％至10％，更優(yōu)選為0.2％至6.0％體積比的量，存在于疫苗組合物的終體積中。
除了抗原及水包油乳劑，此疫苗組合物可包括適當(dāng)及希望的其它成分，如以上關(guān)于水包油乳劑所述的防腐劑、滲透劑、生物粘著分子及免疫刺激分子(如Quil A、膽固醇、GPI-0100、溴化二甲基二-十八烷基銨(DDA))。
本發(fā)明的疫苗組合物亦可包括獸醫(yī)可接受的載體。術(shù)語(yǔ)“獸醫(yī)可接受的載體”包括任何及所有溶劑、分散介質(zhì)、涂料、輔劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑、殺細(xì)菌劑與殺真菌劑、等滲壓劑、吸附延遲劑等。稀釋劑可包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等滲壓劑可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇與乳糖等。穩(wěn)定劑包括白蛋白等。
在優(yōu)選具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種疫苗組合物，其包括內(nèi)部地?fù)饺胨腿閯?其具有大小小于1微米的小滴，優(yōu)選為平均小滴大小小于0.8微米，更優(yōu)選為小于0.5微米，而且甚至更優(yōu)選為平均小滴大小為約0.5微米)中的BVDV I型或BVDV II型抗原至少之一。BVDV I型及/或II型抗原優(yōu)選為滅活病毒制品的形式。亞微米水包油乳劑優(yōu)選為由AMPHIGEN制劑(即，含輕質(zhì)礦物油、卵磷脂、TWEEN80與SPAN80的制劑)組成。此疫苗組合物優(yōu)選還包括Quil-A、膽固醇與乙基汞硫代水楊酸鈉。
在另一個(gè)優(yōu)選具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種疫苗組合物，其包括鉤端螺旋體抗原及BVDV I型或BVDV II型抗原至少之一于水包油乳劑中。所述抗原(優(yōu)選為滅活細(xì)胞或病毒制品的形式)是內(nèi)部地?fù)饺胨腿閯?其具有小于1微米大小的小滴，優(yōu)選為平均小滴大小小于0.8微米，更優(yōu)選為小于0.5微米，而且甚至更優(yōu)選為平均小滴大小為約0.5微米)中。此亞微米水包油乳劑優(yōu)選為由AMPHIGEN制劑(即，含輕質(zhì)礦物油、卵磷脂、TWEEN80與SPAN80的制劑)組成。此疫苗組合物優(yōu)選亦包括一種或多種選自Quil-A、膽固醇、DDA、GPI-100與氫氧化鋁(AlOH)的免疫刺激分子。
在另一個(gè)優(yōu)選具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種疫苗組合物，其包括至少一種細(xì)菌抗原，例如，重組乳房鏈球菌PauA蛋白質(zhì)或大腸桿菌的細(xì)胞制品或兩者的組合，于水包油乳劑中。所述抗原是內(nèi)部地與水包油乳劑(其具有小于1微米大小的小滴，優(yōu)選為平均小滴大小小于0.8微米，更優(yōu)選為小于0.5微米，而且甚至更優(yōu)選為平均小滴大小為約0.25微米)組合。此亞微米水包油乳劑優(yōu)選為由AMPHIGEN制劑(即，含輕質(zhì)礦物油、卵磷脂、TWEEN80與SPAN80的制劑)組成。此疫苗組合物優(yōu)選亦包括一種或多種選自Quil A、膽固醇、DDA與GPI-100的免疫刺激分子。
本發(fā)明的疫苗組合物可由已知途徑施用于動(dòng)物，包括口服、鼻內(nèi)、粘膜、局部、經(jīng)皮膚及腸胃外(例如，靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下或肌內(nèi))途徑。施用可使用途徑的組合完成，例如，首次施用采用腸胃外途徑，繼而使用粘膜途徑施用。
制備疫苗組合物的方法在進(jìn)一步具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備含一種或多種抗原及亞微米水包油乳劑的疫苗組合物的方法。
在制備本發(fā)明的疫苗組合物中，抗原可內(nèi)部地或外部地與水包油乳劑的成分組合。優(yōu)選為，抗原是內(nèi)部地與水包油乳劑的成分組合。
抗原可與乳劑的各種成分組合，包括油、一種或多種表面活性劑、水性成分及任何其它適當(dāng)成分，而形成混合物。此混合物經(jīng)受初步摻合過(guò)程，其一般為通過(guò)一或多個(gè)均化器或乳化器一次或多次，以形成含抗原的水包油乳劑。任何市售均化器或乳化器均可用于此目的，例如，Ross乳化器(Hauppauge，NY)、Gaulin均化器(Everett，MA)或Microfluidics(Newton，MA)?；蛘?，可首先使用均化器或乳化器合并乳劑佐劑的各種成分，包括油、一種或多種表面活性劑與水性成分，以形成水包油乳劑；然后將抗原加入該乳劑。初步摻合后的水包油乳劑的平均小滴大小為約1.0-1.2微米。
然后使含抗原的乳劑經(jīng)受微流化以使小滴大小處于亞微米范圍。微流化可使用市售微流化器完成，如得自Mass Newton的Mierofiuidies的型號(hào)11OY；Gaulin Model 30CD(Gaulin，Inc.，Everett，Mass.)；及Rainnie Minilab Type 8.30H(Miro Atomizer Food andDairy，Inc.，Hudson，Wis.)。
小滴大小可使用市售定徑儀器通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法例如激光衍射來(lái)測(cè)定。取決于使用的表面活性劑類(lèi)型、表面活性劑對(duì)油的比例、操作壓力、溫度等，大小可以不同?？纱_定這些參數(shù)的理想組合，以得到具所需小滴大小的乳劑。本發(fā)明乳劑的油小滴直徑小于1微米。優(yōu)選為平均小滴大小小于0.8微米。更優(yōu)選為平均小滴大小小于0.5微米。甚至更優(yōu)選為平均小滴大小為約0.1至0.3微米。
在本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方案中，將在輕質(zhì)礦物油中含25％卵磷脂的DRAKEOL卵磷脂油溶液與表面活性劑TWEEN80和SPAN80及鹽水溶液合并及混合，而形成含有40％的輕質(zhì)礦物油、卵磷脂、0.18％的TWEEN80與0.08％的SPAN80的混合物。然后將此混合物以Ross(Hauppauge，NY 11788)乳化器于3400rpm乳化而形成乳劑產(chǎn)物，其亦稱(chēng)為“AMPHIGEN制劑”或“AMPHIGEN溶液”。繼而藉助乳化器，例如，Ross均化器，將所需抗原與AMPHIGEN溶液及任何其它適當(dāng)成分(例如，免疫刺激分子)組合，而形成含抗原的水包油乳劑。使此乳劑通過(guò)以大約10000±500psi操作的微流化器一次。此微流化水包油乳劑具有小于1微米大小的小滴，及約0.25微米的平均小滴大小。
在亞微米水包油乳劑中含微囊化抗原的疫苗組合物及制法在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供含包封于微粒中的抗原(或“微囊化抗原”)的疫苗組合物，其中微囊化抗原是外部地?fù)饺肷鲜龅膩單⒚姿腿閯┲小?br> 吸收或捕捉抗原于粒狀載體中的方法在本領(lǐng)域?yàn)橐阎?。例如，參?jiàn)Pharmaceutical Particulate CarriersTherapeutic Applications(Justin Hanes，Masatoshi Chiba與Robert Langer.Polymermicrospheres for vaccine delivery.InVaccine design.The subunit andadjuvant approach。編者M(jìn)ichael F.Powell與Mark J.Newman，1995Plenum Press，紐約及倫敦)。粒狀載體可呈現(xiàn)多個(gè)拷貝的所選擇抗原給動(dòng)物對(duì)象的免疫系統(tǒng)，并促進(jìn)抗原在局部淋巴結(jié)的捕捉及保留。顆?？杀痪奘杉?xì)胞吞噬且可經(jīng)細(xì)胞因子釋放而增強(qiáng)抗原呈遞。粒狀載體亦已敘述于本領(lǐng)域中且包括，例如，衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的那些及衍生自聚(丙交酯)與聚(丙交酯-共-乙交酯)(其已知為PLG)的那些。聚甲基丙烯酸甲酯聚合物為不可生物降解的，而PLG顆粒因與沿正常代謝路徑分泌的乳酸及羥乙酸的酯鍵的隨機(jī)非酶水解而可生物降解。
可生物降解微球亦用于實(shí)現(xiàn)疫苗的控釋。例如，可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期的抗原連續(xù)釋放。視聚合物的分子量及聚合物中乳酸對(duì)羥乙酸的比例而定，PLGA聚合物可具有數(shù)日或數(shù)周至數(shù)個(gè)月或一年的水解速率。緩慢的控制釋放可造成類(lèi)似在多次注射后所觀察到的高水平抗體的形成?；蛘?，可通過(guò)選擇具有不同水解速率的聚合物而實(shí)現(xiàn)疫苗抗原的脈沖釋放。聚合物的水解速率一般視聚合物的分子量及聚合物中乳酸對(duì)羥乙酸的比例而定。由兩種或更多種具有不同抗原釋放速率的不同聚合物制造的微粒提供抗原的脈沖釋放且模擬多劑量方案的免疫接種。
依照本發(fā)明，抗原(包括任何上述抗原)可使用本領(lǐng)域已知的任何操作(如實(shí)施例7所例示的操作)而被吸收至粒狀聚合物載體，優(yōu)選為PLG聚合物，而形成微囊化抗原制品。然后將此微囊化抗原制品與亞微米水包油乳劑混合并分散于其中，此乳劑已敘述于上，而形成疫苗組合物。
在優(yōu)選具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供含包封于PLG聚合物中的抗原的疫苗組合物，其中微囊化抗原是外部地分散于微流化水包油乳劑中，所述乳劑是由輕質(zhì)礦物油、卵磷脂、TWEEN80、SPAN80與鹽水組成，而且具有小于1.0微米的平均小滴大小。
以下為實(shí)施本發(fā)明的特定具體實(shí)施方案的實(shí)施例。所述實(shí)施例僅為了描述性目的而提供，而絕不意圖限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1AMPHIGEN制劑的制備以二步驟過(guò)程制備AMPHIGEN制劑。在第一步驟中，將80升的Drakeol卵磷脂油溶液、116升的破傷風(fēng)類(lèi)毒素鹽水、1.2升的SPAN80及2.8升的Tween 80混合在一起且使用Ross乳化器乳化。Drakeol卵磷脂油溶液含25％的大豆卵磷脂及75％的礦物油。使乳化產(chǎn)物經(jīng)Ross乳化器再循環(huán)最少5倍體積或最少10分鐘。乳化產(chǎn)物在2-7℃儲(chǔ)存最多24小時(shí)以進(jìn)一步加工處理。將得自Ross乳化器槽的乳劑轉(zhuǎn)移至Gaulin均化器且在4500psi的壓力下均化20分鐘。然后將所得的40％Drakeol卵磷脂油溶液(以下稱(chēng)為“AMPHIGEN制劑”或“AMPHIGEN溶液”)分配至無(wú)菌聚丙烯羧基容器中。分配是在位于10,000級(jí)控制環(huán)境中的100級(jí)分配通風(fēng)櫥內(nèi)實(shí)行。將所述容器儲(chǔ)存在2-7℃。此AMPHIGEN制劑用于下述的實(shí)驗(yàn)，除非另有指示。
實(shí)施例2將BVD疫苗急速摻合均化的初步摻合用于此均化過(guò)程的裝置示于圖1。使用無(wú)菌技術(shù)或蒸氣轉(zhuǎn)換閥，將含BVD I型抗原(滅活BVD I型病毒制品)的瓶附著至摻合容器的底側(cè)口。在轉(zhuǎn)移所需體積的BVD I型抗原結(jié)束后，以含滅活BVD II型病毒制品(滅活BVD II型病毒制品)的瓶替換BVD I型抗原瓶。在所需量BVD II型抗原轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將Ross均化器附著至可攜式容器且以最大RPM(3300rpm)開(kāi)始再循環(huán)。容器攪拌維持在中速。
使用無(wú)菌技術(shù)或蒸氣轉(zhuǎn)換閥，將含50毫克/毫升濃度的Quil-A的瓶附著至摻合容器的均化器連線口。使所需量的Quil-A溶液經(jīng)線吸濾送至容器中。在Quil-A溶液轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將瓶移除。以相同的方式將所需量的膽固醇于乙醇溶液(18毫克/毫升)轉(zhuǎn)移至摻合容器。繼而將所需量的AMPHIGEN制劑、10％的乙基汞硫代水楊酸鈉溶液及基礎(chǔ)改良Eagles培養(yǎng)基(“BME”)增容(extender)溶液加入摻合容器。
一旦所有的添加結(jié)束，則混合繼續(xù)又15分鐘。將所得制劑等分成2毫升劑量且示為基于非微流化AMPHIGEN制劑的BVD疫苗。各劑疫苗含500微克的Quil-A、500微克的膽固醇、2.5％的AMPHIGEN制劑及0.009％的乙基汞硫代水楊酸鈉。以對(duì)gp53的ELISA滴度計(jì)，測(cè)定兩種不同BVD株的抗原濃度。
實(shí)施例3通過(guò)微流化進(jìn)行二次摻合圖2例示用于經(jīng)微流化二次摻合的過(guò)程。將微流化器蒸氣滅菌。首先將輔助處理模組室裝設(shè)于此單元中且將空室裝設(shè)于第二室位置。將含如實(shí)施例2所述而制備的完全佐劑化BVD疫苗的容器通過(guò)將來(lái)自供應(yīng)容器排放閥的轉(zhuǎn)移線附著至微流化器入口而連接至微流化器。
將氮?dú)膺B接至供應(yīng)容器濾氣入口且將容器壓力設(shè)定調(diào)整至20+/-5PSI。將收集容器排放閥連接至來(lái)自微流化器出口的轉(zhuǎn)移線。在完成所有必要的連接后，將閥打開(kāi)且以10,000+/-500PSI的操作壓力開(kāi)始微流化。使疫苗的全部?jī)?nèi)容物一次通過(guò)微流化器且在微流化后室中收集。將此制品等分成2毫升劑量且示為基于微流化AMPHIGEN制劑的BVD疫苗。
實(shí)施例4經(jīng)實(shí)驗(yàn)臺(tái)(bench)摻合制備疫苗組合物通過(guò)加入BVD抗原及增容劑將如實(shí)施例1所述而制備的AMPHIGEN制劑稀釋至2.5％。使用攪拌棒代替使用均化器在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上摻合所得溶液。最終制品含以下組成BVD I型與II型抗原，2.5％的AMPHIGEN制劑(其含油、卵磷脂、SPAN、與TWEEN，如實(shí)施例1所述)及鹽水。TWEEN 80與SPAN 80分別以0.18％及0.08％體積比存在于最終疫苗制品中。
實(shí)施例5基于非微流化與微流化AMPHIGEN制劑的BVD疫苗制品之間小滴大小分布的比較使用如實(shí)施例2所述而制備的基于非微流化AMPHIGEN制劑的疫苗、如實(shí)施例3所述而制備的基于微流化AMPHIGEN制劑的疫苗及如實(shí)施例4所述經(jīng)實(shí)驗(yàn)臺(tái)摻合而制造的制品，比較疫苗制品的小滴大小。將2毫升得自各制品的樣品加入Malvern 2000激光衍射計(jì)且測(cè)定小滴大小分布。如圖3所示，結(jié)果顯示基于微流化AMPHIGEN制劑的疫苗制品具有約0.1微米的最大顆粒體積，而基于非微流化AMPHIGEN制劑的疫苗制品具有約1微米的最大顆粒分布體積。
實(shí)施例6疫苗相分離的降低將三種不同的疫苗制品如實(shí)施例2所述而制備的基于非微流化AMPHIGEN制劑的疫苗、如實(shí)施例3所述而制備的基于微流化AMPHIGEN制劑的疫苗及如實(shí)施例4所述經(jīng)實(shí)驗(yàn)臺(tái)摻合而制備的制品，并列比較以測(cè)定其在長(zhǎng)期儲(chǔ)存時(shí)的相分離性質(zhì)。使所有這些制品在4℃靜置約1個(gè)月，而且就疫苗制品上方乳狀層出現(xiàn)而言監(jiān)測(cè)相分離。如圖4所示，基于微流化AMPHIGEN制劑的制品相較于其它兩種制品無(wú)相分離。
實(shí)施例7對(duì)抗牛病毒性腹瀉病毒的微流化及非微流化牛疫苗的制備將牛病毒性腹瀉病毒抗原經(jīng)微流化內(nèi)部地?fù)饺階MPHIGEN制劑中。術(shù)語(yǔ)“內(nèi)部地?fù)饺搿敝冈谖⒘骰皩⒖乖尤階MPHIGEN制劑的過(guò)程。使抗原與佐劑制劑的成分一起經(jīng)受微流化過(guò)程的物理力。在對(duì)照非微流化組中，抗原制品經(jīng)摻合分散于AMPHIGEN制劑中。
對(duì)照及微流化制品的最終組成如下對(duì)gp53具有2535RU/劑量的滅活后ELISA滴度的BVD I型、對(duì)gp53具有3290RU/劑量的滅活后ELISA滴度的BVD II型、1.25毫克/劑量的濃度的Quil-A、1.25毫克/劑量的濃度的膽固醇、2.5％終濃度的AMPHIGEN制劑及0.009％終濃度的乙基汞硫代水楊酸鈉。疫苗劑量為5毫升。
實(shí)施例8基于微流化AMPHIGEN制劑的疫苗制品中內(nèi)部地?fù)饺氲腂VD病毒抗原的長(zhǎng)期穩(wěn)定性進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)以測(cè)定內(nèi)部地?fù)饺氲目乖陂L(zhǎng)期儲(chǔ)存期間的穩(wěn)定性。在微流化過(guò)程期間將已被殺死的BVD II型病毒抗原內(nèi)部地?fù)饺階MPHIGEN制劑中，而得到微流化疫苗制品(A907505)。以三種含相同抗原于非微流化AMPHIGEN制劑中的其它疫苗制品(A904369、A904370與A904371)作為對(duì)照。在非微流化制品中，將抗原混合AMPHIGEN制劑且使用Ross均化器經(jīng)摻合混合。將所有四種疫苗制品在4℃儲(chǔ)存2年。在儲(chǔ)存期間的不同時(shí)間點(diǎn)(0、6、12或24個(gè)月)，使用所有四種制劑對(duì)三個(gè)月大的乳牛進(jìn)行免疫接種。
在第0及21天，以2毫升疫苗制劑經(jīng)皮下途徑對(duì)三個(gè)月大的乳牛進(jìn)行接種。在第35天采集得自接種動(dòng)物的血清，經(jīng)BVDV-E2 ELISA以抗體滴度計(jì)，測(cè)量對(duì)疫苗的血清學(xué)反應(yīng)。如圖5所示，微流化疫苗制品在所有測(cè)試的時(shí)間點(diǎn)(0、6、12和24個(gè)月)顯示較高的抗體滴度，提示在微流化過(guò)程中將抗原內(nèi)部摻入時(shí)不失去抗原制品的穩(wěn)定性。此外，亦令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，微流化疫苗制品在所有時(shí)間點(diǎn)誘發(fā)增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。
實(shí)施例9微流化后疫苗誘發(fā)直腸溫度增加的降低在第0天使用如實(shí)施例7所述而制造的微流化及非微流化疫苗制品對(duì)牛接種，及在接種前1天至接種后4天的時(shí)間段期間監(jiān)測(cè)直腸溫度。疫苗劑量為2毫升。以單或雙劑量的疫苗接種各組。在第1天至第4天(含)每日測(cè)量并記錄直腸溫度。第0天的直腸溫度是在施打測(cè)試物品前測(cè)量的。
如圖6所示，結(jié)果顯示以單或雙劑量的非微流化疫苗制劑接種的動(dòng)物的直腸溫度在接種后約24小時(shí)內(nèi)急劇上升。然而，在以微流化形式的疫苗接種的動(dòng)物中，接種后直腸溫度的上升僅極小且顯著地低于以非微流化制劑接種的動(dòng)物(圖6)。
實(shí)施例10在以微流化疫苗制劑接種時(shí)注射部位反應(yīng)體積較快地消退在第0天使用如實(shí)施例7所述而制造的微流化與非微流化疫苗制品對(duì)牛接種。包括于此研究的動(dòng)物為雜交肉牛。各安慰劑治療組(T01與T02)中有3只動(dòng)物。T03至T06組各有6只動(dòng)物。疫苗劑量為2毫升且各組在第0天以一或兩份劑量的疫苗進(jìn)行接種。在第0天，測(cè)試物是在右頸施打。接受雙倍劑量(4毫升)的測(cè)試物品的動(dòng)物(T02、T04與T06)是以一側(cè)的單次注射接受整個(gè)雙倍劑量。在第0天至第4天(含)及第6、9與14天，對(duì)頸的右側(cè)進(jìn)行注射部位觀察，包括注射部位反應(yīng)大小的估計(jì)。在第0天，在施打測(cè)試物品前觀察注射部位。接種單或雙劑量安慰劑的組未顯示注射部位反應(yīng)體積的任何顯著增加，因此此資料未示于圖7。在非微流化疫苗制劑的情形，單劑量與雙劑量接種之間有注射部位反應(yīng)體積的成比例增加。另一方面，在微流化疫苗制劑的情形，雖然單劑量誘發(fā)較大的注射部位反應(yīng)體積，以第二劑量注射未造成任何進(jìn)一步的增加。此外，在以微流化疫苗制劑注射的動(dòng)物中，與以非微流化疫苗制劑注射的動(dòng)物相比，注射部位反應(yīng)部位體積以更快的速率消退。這些結(jié)果示于圖7。
實(shí)施例11具有內(nèi)部摻入的BVD病毒和鉤端螺旋體抗原及免疫刺激分子如Quil A和DDA的基于微流化AMPHIGEN制劑的疫苗制品的制備將經(jīng)福爾馬林滅活的Leptospira hardjo-bovis CSL株以約1.4×109個(gè)生物體/5毫升劑量的直接計(jì)數(shù)調(diào)配于適當(dāng)佐劑中。將經(jīng)福爾馬林滅活的波摩那鉤端螺旋體(Leptospira Pomona)T262株調(diào)配為約2400比濁單位/5毫升劑量。比濁單位是基于處理前發(fā)酵液的比濁測(cè)量而計(jì)算的。BVD病毒I型是調(diào)配為約3000相對(duì)單位/5毫升劑量的E2 Elisa滴度。BVD病毒2型是調(diào)配為約3500相對(duì)單位/5毫升劑量的E2 Elisa滴度。相對(duì)單位是基于裝配前滅活后整體流體的E2 ELISA滴度計(jì)算的。Quil-A及膽固醇均以每劑0.5毫克的濃度使用。乙基汞硫代水楊酸鈉及AMPHIGEN制劑分別以0.009％及2.5％的終濃度使用。氫氧化鋁(Rehydragel LV)是以2.0％的終濃度使用。在使用DDA作為免疫調(diào)節(jié)劑時(shí)，DDA包括于AMPHIGEN制劑內(nèi)。AMPHIGEN制劑(即，40％Drakeol-卵磷脂儲(chǔ)備溶液)含1.6毫克/毫升的DDA，而且在適當(dāng)?shù)叵♂寱r(shí)，最終疫苗制品含2.5％的AMPHIGEN制劑與0.1毫克/毫升的DDA。
在不同疫苗制劑的制備中，將BVD部分、Leptos、Quil-A、膽固醇、乙基汞硫代水楊酸鈉、AMPHIGEN制劑及作為增容劑的鹽水加入Silverson均化器且以10,000±500RPM混合15分鐘。然后使成分于10,000psi經(jīng)200微米篩網(wǎng)微流化。
在疫苗制劑含氫氧化鋁時(shí)，微流化是無(wú)氫氧化鋁而進(jìn)行。在微流化結(jié)束后，加入氫氧化鋁且在4℃以攪拌棒混合過(guò)夜。
實(shí)施例12攻擊研究的BVD病毒疫苗的制備用于此實(shí)驗(yàn)的疫苗制品含得自BVD病毒1型與BVD病毒2型的抗原。使用對(duì)gp53為2535RU/劑量的滅活后ELISA滴度的BVD1-5960抗原。使用對(duì)gp53為3290RU/劑量的滅活后ELISA滴度的BVD2-890抗原。Quil-A及膽固醇是以0.5毫克/毫升的濃度使用。乙基汞硫代水楊酸鈉及AMPHIGEN制劑分別以0.009％及2.5％的終濃度使用。在使用DDA作為免疫調(diào)節(jié)劑時(shí)，DDA包括于AMPHIGEN制劑內(nèi)。AMPHIGEN儲(chǔ)備溶液(40％Drakeol-卵磷脂溶液)含不同量的DDA，而且在適當(dāng)?shù)叵♂寱r(shí)，最終疫苗制品含2.5％的AMPHIGEN制劑與濃度范圍從0.5毫克/劑量至2.0毫克/劑量的DDA。鋁膠(Rehydragel-LV)是以2％的終濃度使用。GPI-0100是以2、3與5毫克/劑量的范圍使用。
將所有成分加入Silverson均化器且以10,500rpm摻合15分鐘。然后以10,000psi通過(guò)200微米室而微流化。在疫苗制劑含氫氧化鋁時(shí)，微流化是無(wú)氫氧化鋁而進(jìn)行。在微流化結(jié)束后，加入氫氧化鋁且在4℃以攪拌棒混合過(guò)夜。
實(shí)施例13以具有鉤端螺旋體抗原的微流化Amphigen疫苗制劑接種后對(duì)抗鉤端螺旋體攻擊的保護(hù)作用表1-治療組
表1顯示在此研究中測(cè)試的疫苗制品中佐劑制劑的組成。疫苗制品是如實(shí)施例11所述而制備。每組有6只動(dòng)物。約七個(gè)月大的肉用雜交小母牛用于此研究。接種是以5毫升疫苗體積經(jīng)皮下途徑在第0天及第21天完成。攻擊是以得自NADC(國(guó)家農(nóng)業(yè)疾病中心)的L.hardjo-bovis 203株完成。攻擊是在第57-59天期間以1-毫升接種體完成。攻擊是經(jīng)眼結(jié)膜及陰道施打。攻擊材料含5.0×106個(gè)鉤端螺旋體/毫升。每周收集尿用于鉤端螺旋體培養(yǎng)、FA及PCR。在第112及113天時(shí)進(jìn)行腎采集。
表2-鉤端螺旋體攻擊研究的結(jié)果
表2顯示得自鉤端螺旋體攻擊研究的資料。在測(cè)定受攻擊動(dòng)物中鉤端螺旋體感染百分比時(shí)，使用以下的標(biāo)準(zhǔn)。如果僅一個(gè)樣品的腎培養(yǎng)呈陽(yáng)性，則此動(dòng)物視為對(duì)鉤端螺旋體呈陽(yáng)性。如果動(dòng)物對(duì)FA或PCR僅一個(gè)樣品呈陽(yáng)性，則此動(dòng)物視為陰性。如果僅一個(gè)樣品對(duì)FA與PCR兩者均呈陽(yáng)性，則其視為鉤端螺旋體陽(yáng)性。
表2的結(jié)果顯示，基于所有三種檢驗(yàn)，在所有疫苗組均有顯著較短的尿液脫落持續(xù)時(shí)間。就尿液與腎定殖而言，無(wú)AlOH的含QAC的制劑與含DDA的制劑的效力相當(dāng)。在此攻擊研究中，AlOH未改善且甚至降低含QAC的疫苗或含DDA的疫苗的效力。
表3-攻擊前峰幾何平均滴度日(第35天)的顯微凝集滴度范圍
在接種動(dòng)物中檢測(cè)對(duì)抗疫苗制劑中兩種鉤端螺旋體抗原的血清學(xué)反應(yīng)，在第35天記錄到峰反應(yīng)。血清學(xué)反應(yīng)與對(duì)抗攻擊的保護(hù)作用之間無(wú)關(guān)聯(lián)。疫苗制劑中鋁膠的存在降低保護(hù)水平，雖然血清學(xué)反應(yīng)因疫苗中鋁膠的存在而增強(qiáng)。
實(shí)施例14以含AMPHIGEN制劑和DDA的微流化疫苗制品免疫后引出對(duì)BVD病毒抗原的免疫應(yīng)答及對(duì)抗BVD 2型病毒攻擊的保護(hù)作用四至七個(gè)月大的血清陰性小牛用于此實(shí)驗(yàn)。有六個(gè)不同組且各組有十只動(dòng)物(表4)。在第0天及第21天，各動(dòng)物在大約肩胛骨與后頭之間中間位置的側(cè)頸部接受一劑2毫升皮下劑量的疫苗或安慰劑。
表4-治療組
在研究的第44天，將5毫升劑量的攻擊病毒制品(每個(gè)鼻孔約2.5毫升)鼻內(nèi)施打。非細(xì)胞致病性BVD病毒2型，分離物#24515(Ellis株)，批號(hào)#46325-70用于此研究作為攻擊株。在開(kāi)始攻擊時(shí)及結(jié)束時(shí)即刻滴定攻擊材料的保留樣品(每次滴定重復(fù)兩次)。每5毫升劑量的平均活病毒滴度為攻擊前5.3log10 FAID50/5毫升及攻擊后5.4log10FAID50/5毫升(FAID等同于TCID50)。
自第3天至第58天每日監(jiān)測(cè)動(dòng)物。在第42天至第58天，基于可歸因于BVD2感染的臨床征象，對(duì)各動(dòng)物作0、1、2或3的臨床疾病評(píng)分。第44天的評(píng)分在攻擊前記錄。在第0、21、35、44與58天自各動(dòng)物收集血樣(兩個(gè)13毫升血清分離管，SST)以測(cè)定BVD 1型與BVD 2型病毒中和抗體的血清滴度。
在第42天至第58天(含)自各動(dòng)物收集血樣且測(cè)定軟層細(xì)胞中BVD病毒的存在。在第44天，在攻擊前取得樣品。
為了測(cè)定白細(xì)胞計(jì)數(shù)，在第42天至第58天(含)自各動(dòng)物收集血樣(一個(gè)4毫升EDTA管)。在第44天，在攻擊前取得樣品。
白細(xì)胞減少定義為WBC計(jì)數(shù)自基線(自攻擊前2日至攻擊日的攻擊前WBC計(jì)數(shù)的平均值)減少40％或更大。
使用臨床疾病評(píng)分如下界定疾病狀態(tài)如果評(píng)分≤1，則疾?。椒瘢蝗绻u(píng)分＞2，則疾?。绞恰?br> 如表5與6所示，以含BVD病毒抗原與AMPHIGEN制劑，QuilA或DDA且微流化的疫苗接種的組，對(duì)BVD 1型及BVD 2型病毒均以顯著的血清病毒中和滴度發(fā)生血清轉(zhuǎn)化。在這些組中，攻擊后顯示病毒血癥的動(dòng)物百分比亦顯著減少，而對(duì)照組中100％的動(dòng)物為病毒血癥(表7)。此外，在接種組中，疾病頻率亦顯著地降低(表8)。類(lèi)似地，在接種組中，顯示白細(xì)胞減少的動(dòng)物百分比亦減少，而且白細(xì)胞減少的降低在含DDA組中比含Quil A組中更為顯著(表9)。在對(duì)照組中，相較于接種組，體重增加有顯著的下降(表10)。
血清學(xué)在第0天接種前，此研究的所有動(dòng)物對(duì)BVD病毒1與2型的抗體為血清陰性(SVN＜1∶2)(資料未示)。第二次接種后14天(第35天)，所有施打安慰劑的動(dòng)物(T01)對(duì)BVD病毒1與2型的抗體仍為血清陰性；而所有以ITA(調(diào)查性測(cè)試抗原)接種的動(dòng)物(T02、T03、T04、T05與T06)對(duì)BVD病毒1與2型的抗體均為血清陽(yáng)性(SVN≥1∶8)。一只施打以AMPHIGEN制劑及2毫克/劑量的DDA為佐劑的疫苗的動(dòng)物在第35天對(duì)BVD病毒2型的抗體的SVN滴度為3(表11與12)。
在第44天攻擊前，所有對(duì)照(T01)，除了一只以外，對(duì)BVD病毒1與2型的抗體均為血清陰性(SVN＜1∶2)(現(xiàn)在顯示資料)。一個(gè)對(duì)照(#2497)對(duì)BVD病毒1型的抗體為血清陽(yáng)性(SVN＝10)且對(duì)BVD病毒2型的抗體為血清陰性。攻擊后14天，此研究的所有動(dòng)物對(duì)BVD病毒1與2型的抗體均為血清陽(yáng)性。
表5. BVD病毒1型幾何平均血清病毒中和滴度
表6. BVD病毒2型幾何平均血清病毒中和滴度
表7.攻擊后的BVD病毒分離
表8.攻擊后的BVD疾病的臨床征象
表9.攻擊后的白細(xì)胞減少
表10.研究期間的體重及體重增加
病毒分離如表13的資料所示，在攻擊期間(第44至58天)，對(duì)照(T01)的所有十只動(dòng)物都為病毒血癥(在一天或更多天分離到BVD病毒)。在施打ITA的組中，各十只的組(分別為T(mén)02、T03、T04、T05與T06)中病毒血癥動(dòng)物的頻率為1、0、3、2及2只。對(duì)照與施打ITA的組之間的差異為統(tǒng)計(jì)上顯著(P≤0.05)。相較于施打ITA的組(0.0至0.5天)，對(duì)照的病毒血癥的最小二乘方平均天數(shù)量亦顯著更大(10.4天)。
臨床疾病具有2或3的臨床征象評(píng)分的動(dòng)物視為展現(xiàn)BVD疾病的跡象。如表14所示，具BVD病毒疾病臨床征象的動(dòng)物頻率在對(duì)照(T01)為10只中的9只，在施打ITA的各組(分別為T(mén)02、T03、T04、T05與T06)為10只中的1、2、0、0與0只。對(duì)照與施打ITA的組之間的差異為統(tǒng)計(jì)上顯著(P≤0.05)。
白細(xì)胞減少如表15所示，在攻擊期間(第44至58天)，對(duì)照(T01)的所有十只動(dòng)物為白血病(白細(xì)胞計(jì)數(shù)自攻擊前基線減少40％，第42-44天)?；及籽〉膭?dòng)物頻率在施打ITA的各組(分別為T(mén)02、T03、T04、T05與T06)為10只動(dòng)物中的6、2、4、3與2只。對(duì)照與施打以0.5毫克/劑量DDA及氫氧化鋁的AMPHIGEN制劑為佐劑的疫苗的組(T03)之間的差異為統(tǒng)計(jì)上顯著(P≤0.05)。相較于施打ITA的組(0.2至1.2天)，對(duì)照的最小二乘方平均白血病天數(shù)顯著地更大(7.8天)。
實(shí)施例15以含GPI-0100的微流化疫苗制劑免疫后誘出對(duì)BVD病毒抗原的免疫應(yīng)答及對(duì)抗BVD 2型病毒攻擊的保護(hù)作用依照如實(shí)施例14所述的一組實(shí)驗(yàn)條件且進(jìn)行Quil A與GPI-0100之間的直接比較。如表11與12所示，以含Quil A或GPI-0100的基于微流化AMPHIGEN制劑的制品中的BVD抗原接種的動(dòng)物對(duì)BVD1型與BVD 2型病毒均具有顯著的抗體滴度。對(duì)BVD 1型病毒的抗體滴度比對(duì)BVD 2型病毒的高得多。然而，BVD 2型病毒后續(xù)攻擊顯示強(qiáng)烈保護(hù)，而且在以含GPI-0100的基于微流化AMPHIGEN制劑的疫苗制品接種的小牛中疾病發(fā)病率顯著地減小。
表11. BVD病毒1型幾何平均血清病毒中和滴度
表12. BVD病毒2型幾何平均血清病毒中和滴度
表13.攻擊后的BVD病毒分離
表14.攻擊后BVD疾病的臨床征象
表15.攻擊后的白細(xì)胞減少
總之，接種動(dòng)物無(wú)不良反應(yīng)或死亡率證明各疫苗的安全性。在100％的接種動(dòng)物中的血清轉(zhuǎn)化(對(duì)BVD-1與BVD-2的SVN抗體滴度＞1∶8)證明各疫苗的效用。僅以2毫克GPI-0100為佐劑的疫苗展示令人滿意的攻擊抗性。
實(shí)施例16含微囊化抗原于微流化水包油乳劑中的疫苗制品將3克的海藻糖(Fluka)加入水中而得333毫克/毫升的海藻糖溶液的原液。將溶于0.8％SDS溶液的重組PauA抗原(SDS/rPauA)加入海藻糖溶液而得494微克rPauA/毫升的終濃度。在下一步驟中，將10克的聚丙交酯羥乙酸(polylactide glycolic acid，PLG-ResomerRE 503h，Boeringher Ingelheim)溶于200毫升的二氯甲烷(MeCl2)。將所得PLG/MeCl2溶液與在第一步驟中制備的SDS-rPauA/海藻糖溶液合并。使此合并溶液經(jīng)受微流化(使用得自Microfiuidics ModelM110EH的微流化器)且將微流化制品噴霧干燥(使用Temco SprayDryer Model SD-05)。使用500微米濾網(wǎng)收集噴霧干燥的材料。
使用Western印跡分析定量此噴霧干燥材料中的rPauA濃度。將1.04毫克的噴霧干燥材料溶于50微升的丙酮且在室溫以13,200rpm離心10分鐘。將上清液去除。使上清和沉淀部分在生物安全性通風(fēng)櫥中干燥2.5小時(shí)。將沉淀重懸于47.43微升的樣品溶液(25微升的樣品緩沖液+10微升的還原劑+65微升的水)。將干燥的上清部分以20微升的樣品溶液重懸。在Western分析中，使用純化PauA作為標(biāo)準(zhǔn)品定量噴霧干燥材料的rPauA含量。
通過(guò)將100克的甘露糖醇(Sigma)溶于500毫升的注射用水(WFI)中而制備20％甘露糖醇儲(chǔ)備溶液。以熱板/攪拌器將溶液加熱至40℃且冷卻至30℃。使溶液經(jīng)0.22微米無(wú)菌濾器(Millipore)過(guò)濾除菌。通過(guò)將12.5克的羧甲基纖維素(Sigma)溶于500毫升的WFI中，及在4℃混合過(guò)夜，而制備2.5％羧甲基纖維素溶液。使溶液在121℃高壓滅菌。
由噴霧干燥得到的粉末在含5％的甘露糖醇、0.3％的羧甲基纖維素與1∶5000的乙基汞硫代水楊酸鈉的溶液中重組。將最終溶液等分至3毫升小瓶中且使用凍干機(jī)(USIFROID)凍干。凍干粉末表示微囊化rPauA。將微囊化亞單位蛋白質(zhì)抗原重懸于2毫升含AMPHIGEN制劑的微流化水包油乳劑(如實(shí)施例20所述的微流化乳劑)且用作為疫苗。
實(shí)施例17含細(xì)菌全細(xì)胞抗原與重組蛋白質(zhì)抗原于水包油乳劑中的微流化疫苗制劑的制備制造兩種疫苗制品，其含重組乳房鏈球菌PauA蛋白質(zhì)與大腸桿菌細(xì)菌細(xì)胞兩者，內(nèi)部地加入如實(shí)施例2和3所述的水包油乳劑中。重組PauA抗原為每劑量100微克的濃度，而大腸桿菌細(xì)胞為每劑量4×109個(gè)的最終計(jì)數(shù)。兩種疫苗制劑的乳劑佐劑組成示于表16。
表16.含重組蛋白質(zhì)與全大腸桿菌細(xì)胞兩者的疫苗制劑
實(shí)施例18對(duì)含rPauA與全細(xì)胞細(xì)菌劑于水包油乳劑中的微流化疫苗的免疫應(yīng)答成年乳牛用于此實(shí)驗(yàn)。登記時(shí)動(dòng)物處在其第一或第二授奶期結(jié)束時(shí)。將2毫升的各疫苗制劑皮下地施打三次，在無(wú)奶時(shí)(D＝0)一次，28天后(D＝28)，及生小牛后4至10天(C+4-C+10)再一次。第一及第三劑是在頸的左側(cè)施打，第二劑是在頸的右側(cè)施打。在每次接種前及第三次接種后約14天和32天采集血液。對(duì)大腸桿菌及rPauA抗原的抗體滴度經(jīng)由ELISA測(cè)定。如圖8所示，結(jié)果顯示在以含GPI-0100作為免疫刺激劑的疫苗制劑接種的組中對(duì)rPauA的抗體滴度較高，而且在初始接種后第70天達(dá)到峰值。對(duì)大腸桿菌抗原的抗體滴度示于圖9。對(duì)大腸桿菌抗原的抗體滴度在兩種疫苗制劑中相似，雖然相較于以DDA作為免疫刺激的制劑，GPI-0100作為免疫劑激劑的存在誘發(fā)相對(duì)更高的抗體滴度。
實(shí)施例19基于微流化AMPHIGEN制劑的疫苗制品的殺病毒活性的分析為了測(cè)定微流化是否將病毒滅活，測(cè)定三種基于微流化AMPHIGEN制劑的疫苗制品的殺病毒活性。此三種制品含三種不同的牛感染性病毒，即，牛皰疹病毒(BHV)、副流感病毒3(PI3)及牛呼吸道合胞病毒(BRSV)。
三種疫苗制品中的殺病毒活性的檢測(cè)是依照USDA 9CFR.113.35要求進(jìn)行的。
表17所示的結(jié)果表明，基于AMPHIGEN制劑的疫苗制品的微流化不造成疫苗制品的任何顯著滅活。
表17.微流化疫苗的殺病毒活性的分析
A＝膽固醇以650毫升/分鐘加入B＝膽固醇以28毫升/分鐘加入C＝膽固醇以5毫升/分鐘加入M200＝以200微米篩網(wǎng)微流化M75＝以75微米篩網(wǎng)微流化M75@37C＝液體在微流化前加熱至37℃高于0.7的值為殺病毒效應(yīng)的指示。
實(shí)施例20微流化AMPHIGEN制劑的制備通過(guò)合并DRAKEOL卵磷脂油溶液(具有25％卵磷脂的輕質(zhì)礦物油)與TWEEN 80(終濃度為0.18％)與Span 80(終濃度為0.08％)且在36±1℃混合8-22小時(shí)而制備AMPHIGEN制劑。然后藉助Ross(Hauppauge，NY 11788)乳化器，以約3400rpm將油混合物加入鹽水。繼而使混合物于4500±500psi通過(guò)具200微米相互作用室的微流化器一次。圖10A與10B顯示微流化AMPHIGEN制劑的穩(wěn)定性。如激光衍射所測(cè)量，在開(kāi)始起初時(shí)間點(diǎn)的粒度分布(圖10A)與4℃儲(chǔ)存22個(gè)月后的粒度分布(圖10B)幾乎完全相同。
權(quán)利要求
1.一種可用作為疫苗佐劑的亞微米水包油乳劑，其包含輕烴不可代謝性油、表面活性劑及水性成分，其中所述油分散于所述水性成分中，且平均油小滴大小小于1微米。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的乳劑，其中所述油為輕質(zhì)礦物油且為1％至50％v/v的量，所述表面活性劑包含卵磷脂且為0.01％至10％v/v的量，且其中所述油分散于所述水性成分中且平均油小滴大小為0.1微米至0.5微米之間。
3.一種可用作為疫苗佐劑的亞微米水包油乳劑，其包含約40％v/v的礦物油、約10％w/v的卵磷脂、約.18％v/v的TWEEN-80、約0.08％v/v的SPAN-80及水相，其中所述油分散于所述水相中且平均油小滴大小為0.1微米至0.5微米之間。
4.一種制備亞微米水包油乳劑的方法，其包括(a)通過(guò)組合輕烴不可代謝性油、表面活性劑及水性成分而制備混合物；(b)使所述混合物經(jīng)受初步乳化過(guò)程而制造平均油小滴大小為1.0微米至1.1微米的水包油乳劑；及(c)使在(b)中制備的水包油乳劑經(jīng)受微流化而制造所述亞微米水包油乳劑，其中亞微米乳劑具有小于1微米的平均油小滴大小。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述油為輕質(zhì)礦物油且為1％至50％v/v的量，所述表面活性劑包含卵磷脂且為0.01％至10％v/v的量，且其中所述亞微米乳劑的平均油小滴大小為0.1微米至0.5微米之間。
6.一種疫苗組合物，其包含水包油乳劑與抗原，其中所述抗原分散于所述乳劑中，所述乳劑包含輕烴不可代謝性油、表面活性劑及水性成分，且其中所述乳劑的平均油小滴大小小于1微米。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的疫苗組合物，其中所述油為輕質(zhì)礦物油且以1％至20％v/v的量存在于所述疫苗組合物中，所述表面活性劑包含卵磷脂且以0.01％至10％v/v的量存在于所述疫苗組合物中，且其中所述平均油小滴大小為0.1微米至0.5微米之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的疫苗組合物，其中所述抗原為病毒抗原或細(xì)菌抗原。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的疫苗組合物，其中所述病毒抗原包含已被殺死的牛病毒性腹瀉病毒1型或2型，且其中所述細(xì)菌抗原包含滅活鉤端螺旋體菌苗、重組乳房鏈球菌PauA蛋白質(zhì)或大腸桿菌細(xì)胞制品中的至少一種。
10.一種制備疫苗組合物的方法，其包括(a)通過(guò)組合輕烴不可代謝性油、表面活性劑及水性成分而制備混合物；(b)將抗原加入在(a)中形成的混合物；(c)使在(b)中形成的含所述抗原的混合物經(jīng)受初步乳化過(guò)程而制造具有1.0微米至1.1微米的平均油小滴大小的水包油乳劑；及(d)使在(c)中形成的乳劑經(jīng)受微流化而制造所述疫苗組合物，其中此組合物具有小于1微米的平均油小滴大小。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述油為輕質(zhì)礦物油且以1％至20％v/v的量存在于疫苗組合物中，所述表面活性劑包含卵磷脂且以0.01％至10％v/v的量存在于所述疫苗組合物中，且其中所述平均油小滴大小為0.1微米至0.5微米之間。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述抗原為病毒抗原或細(xì)菌抗原。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述病毒抗原包含已被殺死的牛病毒性腹瀉病毒1型或2型，且其中所述細(xì)菌抗原包含滅活鉤端螺旋體菌苗、重組乳房鏈球菌PauA蛋白質(zhì)或大腸桿菌細(xì)胞制品中的至少一種。
14.一種疫苗組合，其包含微囊化抗原及水包油乳劑，其中所述微囊化抗原分散于所述乳劑中，且所述乳劑包含輕烴不可代謝性油、表面活性劑及水性成分，且其中所述乳劑的平均油小滴大小小于1微米。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的疫苗組合物，其中所述油為輕質(zhì)礦物油且以1.0％至20％v/v的量存在于所述疫苗組合物中，所述表面活性劑包含卵磷脂且以0.01％至10％v/v的量存在于所述疫苗組合物中，所述抗原為病毒抗原或細(xì)菌抗原且包封于粒狀載體中，且其中所述載體包含聚丙交酯羥乙酸。
全文摘要
本發(fā)明提供可用作為增強(qiáng)抗原免疫原性的疫苗佐劑的亞微米水包油乳劑。本發(fā)明亦提供包含與這種乳劑內(nèi)部或外部組合的抗原的疫苗組合物。本發(fā)明還提供制備所述乳劑及疫苗的方法。
文檔編號(hào)A61K39/12GK1767854SQ200480008618
公開(kāi)日2006年5月3日 申請(qǐng)日期2004年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月4日
發(fā)明者P·J·多米諾夫斯基, P·K·克魯斯, R·L·克雷布斯, R·M·曼南 申請(qǐng)人:輝瑞產(chǎn)品公司