專利名稱：具有延長(zhǎng)時(shí)間作用的胰島素類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療以糖尿病為特征的高血糖癥的胰島素類似物。
背景技術(shù)：
對(duì)胰島素的生理性需要可分為兩個(gè)階段a)營(yíng)養(yǎng)吸收階段，其需要脈沖量的胰島素以分解與進(jìn)餐相關(guān)的血液葡萄糖激增，b)吸收后的階段，其需要胰島素的持續(xù)釋放從而調(diào)節(jié)肝臟葡萄糖的輸出以維持最佳的空腹血液葡萄糖水平，這又稱為“基礎(chǔ)性”胰島素分泌。
對(duì)糖尿病人有效的胰島素治療通常包括聯(lián)合運(yùn)用兩種類型的外源性胰島素制劑一種為通過(guò)大丸劑注射而提供的進(jìn)餐時(shí)間速效胰島素，以及一種為每日1-2次注射施用以調(diào)節(jié)進(jìn)餐間隔期血液葡萄糖水平的長(zhǎng)效胰島素。
理想的外源基礎(chǔ)性胰島素可提供延長(zhǎng)而“平坦”的時(shí)間作用-即能控制血液葡萄糖水平至少12小時(shí)，并且優(yōu)選地為24小時(shí)而沒(méi)有明顯的低血糖風(fēng)險(xiǎn)。
所用的商業(yè)化長(zhǎng)效胰島素分子不能提供24小時(shí)的胰島素效應(yīng)。因此，仍需要提供胰島素效應(yīng)長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)的胰島素分子。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了胰島素類似物A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素。本發(fā)明也提供了包含胰島素類似物A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素的組合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該組合物為藥物組合物。
本發(fā)明也提供了胰島素類似物A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰島素。本發(fā)明也提供了包含胰島素類似物A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰島素的組合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該組合物為藥物組合物。
本發(fā)明也提供了治療高血糖癥的方法，該方法包括將本發(fā)明的胰島素類似物以足以調(diào)節(jié)血液葡萄糖濃度的量施與受試對(duì)象。
發(fā)明詳述本發(fā)明的A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素類似物可顯示為具有式I的A鏈和式II的B鏈。
“式I”為A0 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Gly(Seq.ID No.1).
式I中A0至A21位置的氨基酸分別對(duì)應(yīng)于Seq.ID No.1中1至22位的氨基酸。式I中A1至A20位置和Seq.ID No.1中2至21位的氨基酸對(duì)應(yīng)于人胰島素A鏈(Seq.ID No.3)1-20位的氨基酸。
“式II”為
B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-LeuB16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B23 B24 B25 B26 B27 B28 B29 B30Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-ThrB31 B32Arg-Arg(Seq.ID No.2).
式II中B1至B32位置的氨基酸分別對(duì)應(yīng)于Seq.ID No.2中1至32位的氨基酸。式II中B1至B30位置和Seq.ID No.2中1-30位置的氨基酸對(duì)應(yīng)于人胰島素B鏈(Seq.ID No.4)1-30位置的氨基酸。
來(lái)自眾多不同物種的胰島素分子的多核苷酸序列和氨基酸序列為本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員熟知。優(yōu)選地，″胰島素″指人胰島素?！叭艘葝u素”具有一條21個(gè)氨基酸的A鏈，其氨基酸序列為Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(Seq.ID No.3)；一條30個(gè)氨基酸的B鏈，其氨基酸序列為Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(Seq.ID No.4)。
人胰島素A鏈、B鏈和本發(fā)明A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素類似物的A鏈、B鏈通過(guò)二硫鍵交聯(lián)。一個(gè)鏈間二硫鍵在式I中A7位置的Cys殘基和式II中B7位置的Cys殘基之間，另一個(gè)鏈間二硫鍵在式I中A20位置的Cys殘基和式II中B19位置的Cys殘基之間。一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵在式I中A6和A11位置的Cys殘基之間。
如此處用一種簡(jiǎn)化符號(hào)表示胰島素分子和胰島素原分子。對(duì)于A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素，參照式I的A鏈(Seq.ID No.1)、式II的B鏈(Seq.ID No.2)、人胰島素A鏈(Seq.ID No.3)、人胰島素B鏈(Seq.ID No.4)設(shè)定符號(hào)。A0Arg意指精氨酸共價(jià)連接于Seq.ID No.3中A1位置的甘氨酸。A21Gly意指野生型人胰島素(Seq.ID No.3)中天冬酰胺替換為甘氨酸。B31Arg意思是精氨酸共價(jià)連接于Seq.ID No.4中B30位置的蘇氨酸。B32Arg意思是精氨酸共價(jià)連接于Seq.ID No.2中B31位置的精氨酸?？傊瑢?duì)野生型人胰島素A鏈和B鏈的這些改變提供了胰島素類似物“A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素”。符號(hào)“A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素”與符號(hào)“A0Arg，A21Gly，B31Arg，B32Arg-人胰島素”和符號(hào)“ArgA0，GlyA21，ArgB31，ArgB32-人胰島素”同義。
本發(fā)明的A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰島素類似物可表示為具有式I的A鏈和式III的B鏈。如上述討論，“式I”為A0 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Gly(Seq.ID No.1).
“式III”為B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-LeuB16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B23 B24 B25 B26 B27 B28 B29 B30Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Arg-ThrB31 B32Arg-Lys(Seq.ID No.5).
式III中B1至B32位置的氨基酸分別對(duì)應(yīng)于Seq.ID No.5第1-32位置的氨基酸。式III中B1至B28和B30位置的氨基酸以及Seq.ID No.5第1-28和第30位置的氨基酸對(duì)應(yīng)人胰島素B鏈(Seq.ID No.4)第1-28和第30位置的氨基酸。
一個(gè)鏈間二硫鍵位于式I中A7位置的Cys和式III中B7位置的Cys之間，另一個(gè)鏈間二硫鍵位于式I中A20位置的Cys和式III中B19位置的Cys之間。一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵位于式I中A6和A11位置的Cys之間。
使用前述簡(jiǎn)化符號(hào)，A0Arg意指精氨酸共價(jià)連接于Seq.ID No.3中A1位置的甘氨酸。A21Gly意指野生型人胰島素(Seq.ID No.3)中天冬酰胺替換為甘氨酸。B29Arg意指野生型人胰島素B29位置的賴氨酸替換為精氨酸。B31Arg意指精氨酸共價(jià)連接于Seq.ID No.4中B30位置的蘇氨酸。B32Lys意指賴氨酸共價(jià)連接于Seq.ID No.5中B31位置的精氨酸。概而言之，對(duì)野生型人胰島素A鏈和B鏈的這些改變提供了胰島素類似物“A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰島素”。符號(hào)“A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰島素”與符號(hào)“A0Arg，A21Gly，B29Arg，B31Arg，B32Lys-人胰島素”和符號(hào)“ArgA0，GlyA21，ArgB29，ArgB31，LysB32-人胰島素”同義。
本發(fā)明也提供了分子中一個(gè)或多個(gè)精氨酸(Arg)替換為高精氨酸(hArg)的胰島素類似物和胰島素原類似物。因此本發(fā)明提供了例如A0hArgA21GlyB31hArgB32hArg-人胰島素，A0hArgA21GlyB29hArgB31hArgB32Lys-人胰島素，A0hArgA21GlyB31hArgB32hArg-人胰島素原，A0hArgA21GlyB29hArgB31hArgB32Lys-人胰島素原。
術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”和“該宿主細(xì)胞”指單個(gè)宿主細(xì)胞和多于一個(gè)宿主細(xì)胞。
如此處所用的“胰島素分子”包括野生型胰島素和胰島素類似物。
如此處所用的“胰島素原分子”包括野生型胰島素原和胰島素原類似物。
“胰島素類似物”是指經(jīng)修飾而不同于野生型胰島素的胰島素分子。因此，胰島素類似物可具有與人胰島素A鏈和B鏈氨基酸序列基本相同的A鏈和/或B鏈，但是通過(guò)在人胰島素A鏈和B鏈中具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、和/或在人胰島素A鏈和B鏈中具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、和/或?qū)⒁粋€(gè)或多個(gè)氨基酸共價(jià)連接至A鏈和/或B鏈的氨基端和/或羧基端而不同于人胰島素A鏈和B鏈。
“胰島素原類似物”是經(jīng)修飾后不同于野生型胰島素原的胰島素原分子。因此，胰島素原類似物可分別具有與人胰島素原A-鏈、B-鏈和C-肽的氨基酸序列基本相同的A-鏈、B-鏈和C-肽，但通過(guò)胰島素原類似物A鏈、B鏈或C肽內(nèi)具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失和/或一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換而不同于人胰島素原A-鏈、B-鏈和C-肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰島素原類似物為A21Gly-人胰島素原，其去除連接肽后，產(chǎn)生A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰島素原類似物為A21GlyB29ArgB32Lys-人胰島素原，其去除連接肽后，產(chǎn)生A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰島素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，胰島素原類似物為A21GlyB0LysB29ArgB32Lys-人胰島素原，其去除連接肽后，產(chǎn)生A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰島素。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰島素原類似物得以純化。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰島素原類似物得以分離。
“胰島素模板”意為經(jīng)化學(xué)修飾以形成本發(fā)明的胰島素類似物的胰島素分子?？山?jīng)一系列化學(xué)修飾的用作模板的胰島素分子包括但不限于任何一種天然存在的胰島素并優(yōu)選地為人胰島素。胰島素模板優(yōu)選地為重組胰島素。胰島素模板更為優(yōu)選地為重組人胰島素或其類似物。胰島素模板最優(yōu)選地為重組人胰島素。
“重組蛋白質(zhì)”意為在真核或原核細(xì)胞內(nèi)從含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸序列的表達(dá)載體表達(dá)的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，重組蛋白質(zhì)為重組胰島素分子。
“重組胰島素分子”是在真核或原核細(xì)胞內(nèi)從含有編碼胰島素分子A-鏈和/或B-鏈的多核苷酸序列的表達(dá)載體表達(dá)的胰島素分子。
“重組胰島素原分子”是在真核或原核細(xì)胞內(nèi)從含有編碼胰島素原分子A-鏈、B-鏈和連接肽的多核苷酸序列的表達(dá)載體表達(dá)的胰島素原分子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組胰島素原分子是A21Gly-人胰島素原。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組胰島素原分子是A21GlyB29ArgB32Lys-人胰島素原。
“重組人胰島素”意為具有野生型(即天然的)人胰島素A鏈(Seq.IDNo.3)和B鏈(Seq.ID No.4)氨基酸序列的重組胰島素。
“足以調(diào)節(jié)受試者血葡萄糖”意為胰島素分子的施用導(dǎo)致臨床上正常的空腹血漿葡萄糖水平。臨床上正常的空腹血漿葡萄糖水平為70-110mg/dl。臨床上正常的餐后血漿葡萄糖水平小于140mg/dl。為本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員熟知，胰島素效應(yīng)可由“葡萄糖鉗夾”技術(shù)定量，即以維持一段時(shí)間預(yù)設(shè)血漿葡萄糖水平的外源葡萄糖需要量而衡量胰島素分子引起的胰島素效應(yīng)持續(xù)時(shí)間和強(qiáng)度。例見“Burke等，Diabetes Research，4163-167(1987)”。一般地，在葡萄糖鉗夾研究中，葡萄糖由靜脈內(nèi)輸入。若胰島素分子導(dǎo)致血漿葡萄糖水平下降，則增加葡萄糖輸入速率，從而預(yù)設(shè)血漿葡萄糖水平得以維持。當(dāng)胰島素分子效應(yīng)減弱，則降低葡萄糖輸入速率，從而預(yù)設(shè)血漿葡萄糖水平得以維持。
“胰島素效應(yīng)”意為在葡萄糖鉗夾研究中，胰島素分子的施用需要靜脈內(nèi)血葡萄糖施與速率的增加以維持葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)中受試者預(yù)設(shè)的血漿葡萄糖水平。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，預(yù)設(shè)的葡萄糖水平為正常空腹血漿葡萄糖水平。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，預(yù)設(shè)的葡萄糖水平為正常餐后血漿葡萄糖水平。
若一種胰島素分子對(duì)高血糖癥如糖尿病患者提供的胰島素效應(yīng)持續(xù)時(shí)間超過(guò)人胰島素，則該胰島素分子具有“延長(zhǎng)的作用持續(xù)時(shí)間”。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，單次施與胰島素分子后，胰島素分子提供約8小時(shí)至約24小時(shí)的胰島素效應(yīng)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰島素效應(yīng)持續(xù)約10小時(shí)至約24小時(shí)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰島素效應(yīng)持續(xù)約12小時(shí)至約24小時(shí)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰島素效應(yīng)持續(xù)約16小時(shí)至大約24小時(shí)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰島素效應(yīng)持續(xù)約20小時(shí)至大約24小時(shí)。
若一種胰島素分子單次施與可使受試者葡萄糖降低效應(yīng)持續(xù)約24小時(shí)，則該胰島素分子具有“基礎(chǔ)的胰島素效應(yīng)”。在一個(gè)優(yōu)選的方案中，胰島素分子單次施用后在約24小時(shí)的期間可提供接近穩(wěn)定量(也即無(wú)峰值)的葡萄糖降低效應(yīng)。
本發(fā)明的胰島素類似物或組合物的“有效量”是在施與需要胰島素治療的受試者時(shí)產(chǎn)生所需的胰島素效應(yīng)而沒(méi)有不可接受副作用的量。施與受試者本發(fā)明的胰島素類似物的“有效量”也取決于疾病類型和嚴(yán)重程度和受試者特征如總體健康狀況、年齡、性別、體重和對(duì)藥物的耐受等。熟練的技術(shù)人員根據(jù)這些及其它因素將能夠決定適當(dāng)?shù)膭┝?。一般地，本發(fā)明的胰島素類似物的治療有效量對(duì)成年人可為大約0.01mg每日至大約1000mg每日之間。劑量?jī)?yōu)選地為大約0.1mg每日至大約100mg每日，更優(yōu)選地為大約1.0毫克/日至大約10毫克/日。
劑量、施與途徑和每日施與次數(shù)由內(nèi)科醫(yī)生考慮下列因素如治療目標(biāo)、病人的疾病性質(zhì)和原因、病人的性別和體重、運(yùn)動(dòng)水平、飲食習(xí)慣、施與方法和其它內(nèi)科醫(yī)生熟知的因素后決定。在較寬范圍內(nèi)，每日劑量將在大約1nmol/Kg體重至大約6nmol/Kg體重(認(rèn)為6nmol等同于約1單位胰島素活性)。大約2至大約3nmol/Kg之間的劑量是一般的當(dāng)前胰島素療法。
本發(fā)明提供包含本發(fā)明的胰島素類似物的容器。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，容器為小瓶。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，小瓶含有包含本發(fā)明的胰島素類似物的藥學(xué)制劑。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，容器為用于遞送裝置如胰島素筆式注射系統(tǒng)中的藥筒。本發(fā)明也提供了包括藥筒的胰島素筆式注射系統(tǒng)，其中所述藥筒含有包含本發(fā)明胰島素類似物的藥學(xué)制劑。本發(fā)明也提供了含有包含本發(fā)明胰島素類似物的藥學(xué)制劑的單位劑量系統(tǒng)。
“所需的治療效應(yīng)”包括下列一種或多種情況1)糖尿病相關(guān)(諸)癥狀的改善、2)與糖尿病關(guān)聯(lián)的諸癥發(fā)生的延遲、3)與未治療相比增加的壽命和4)與未治療相比更好的生活質(zhì)量。例如本發(fā)明的胰島素類似物對(duì)糖尿病治療的“有效量”是與不治療相比導(dǎo)致更好的血葡萄糖濃度的調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥如視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變或腎病等發(fā)生延遲的量。
本發(fā)明提供治療高血糖癥的方法，該方法包括以足以調(diào)節(jié)受試者血葡萄糖濃度的量對(duì)受試者施與本發(fā)明的胰島素類似物、組合物和藥物組合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，受試者因糖尿病接受治療。
本發(fā)明提供本發(fā)明的胰島素類似物的用途，用于制備治療高血糖癥的藥物。本發(fā)明也提供了本發(fā)明胰島素類似物的用途，用于制備治療糖尿病的藥物。
本發(fā)明的胰島素類似物及其組合物可以腸胃外施與。腸胃外施與包括例如全身施與例如肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)注射。腸胃外施與途徑優(yōu)選地為皮下。
“受試者”意為哺乳動(dòng)物，優(yōu)選地為人，但也可為動(dòng)物如陪伴動(dòng)物(如狗、貓等)、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物(如奶牛、綿羊、豬、馬等)和實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物(如大鼠、小鼠、豚鼠等)。
此處所用“分離的蛋白質(zhì)”是指蛋白質(zhì)從其產(chǎn)生的環(huán)境中移出。當(dāng)天然存在的蛋白質(zhì)從該蛋白質(zhì)存在的細(xì)胞環(huán)境中移出時(shí)，則所述天然存在的蛋白質(zhì)得以分離。當(dāng)重組蛋白質(zhì)從表達(dá)其的細(xì)胞環(huán)境中移出時(shí)，則所述重組蛋白質(zhì)得以分離。當(dāng)經(jīng)化學(xué)修飾的天然存在蛋白質(zhì)或經(jīng)化學(xué)修飾的重組蛋白質(zhì)從所述蛋白發(fā)生化學(xué)修飾的反應(yīng)混合物中移出時(shí)，則所述經(jīng)化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)得以分離。分離的蛋白質(zhì)優(yōu)選地從其它蛋白質(zhì)、多肽、肽中被移出。分離蛋白質(zhì)的方法包括離心、層析、凍干或電泳。這些蛋白質(zhì)分離方法和其它方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知。本發(fā)明中的胰島素類似物和胰島素原類似物優(yōu)選地為被分離。
用以產(chǎn)生本發(fā)明的胰島素類似物或胰島素原類似物的氨基酸可為D-或L-型，可為天然存在的氨基酸或人造氨基酸。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類似物未與脂肪酸共價(jià)結(jié)合。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素類似物未與脂肪酸?；?。
“可藥用”意為臨床上適合施與人。可藥用制劑不含毒性成分、不合需要的污染物或其它等，并且不干擾其中活性化合物的活性。
“藥物組合物”意為臨床上可接受的施與人類受試者的組合物。本發(fā)明的胰島素類似物可在藥物組合物中制劑，這樣蛋白質(zhì)與一種或多種無(wú)機(jī)堿和無(wú)機(jī)或有機(jī)酸形成鹽。因此本發(fā)明的組合物和藥物組合物可包含本發(fā)明的胰島素類似物的鹽。
通常使用的形成酸加成鹽的酸為無(wú)機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、磷酸等和有機(jī)酸如對(duì)甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、對(duì)溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、檸檬酸、苯甲酸、乙酸、三氟乙酸等。此類鹽的實(shí)例包括硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫、磷酸鹽、磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、己酸鹽、庚酸鹽、丙炔酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、癸二酸鹽、延胡索二酸鹽、順丁烯二酸鹽、丁炔-1，4二酸鹽、己炔-1，6二酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸、鄰苯二甲酸鹽、磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽、苯乙酸鹽、苯丙酸鹽、苯丁酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、γ-羥基丁酸鹽、羥基乙酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、丙磺酸鹽、1-萘磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、苯乙醇酸鹽等。
堿加成鹽包括那些從無(wú)機(jī)堿如氨、堿金屬、堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽、重碳酸鹽等衍生的鹽。在制備本發(fā)明的鹽中有用的堿因此包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、碳酸鉀等。
本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選地為酸性水溶液。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酸性水溶液pH為從大約3至大約5，這里“大約”意為加或減0.1pH單位。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，pH為從大約3.5至大約4.5。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，pH為從大約3.75至大約4.25。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酸性水溶液pH為大約4。酸性水溶液pH最優(yōu)選地為4。
本發(fā)明的胰島素類似物和其組合物可與作為高血糖癥治療的藥物組合物的部分的一種或多種藥學(xué)可接受賦形劑、載體和稀釋劑一起施與受試者。于此提供的組合物包含本發(fā)明的胰島素類似物和選自等張劑、二價(jià)陽(yáng)離子、六聚體穩(wěn)定化合物、防腐劑和緩沖劑中的至少一種成分。
合適的藥學(xué)載體可含有不與本發(fā)明的胰島素類似物相互作用的惰性成分。可使用如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCompany，Easton，PA中描述那些標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)制劑技術(shù)。適于腸胃外施與的藥學(xué)載體包括如滅菌水、生理鹽水、抑菌鹽水(鹽水中包含約0.9％mg/ml苯酚)、磷酸鹽緩沖鹽水、Hank′s溶液、Ringer′s-乳酸和其它等。一些合適的賦形劑實(shí)例包括甘油、乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇和甘露醇。
“等張劑”意為生理上可耐受并賦予制劑合適的張力以阻止水跨越與所使用制劑接觸的細(xì)胞膜的凈流動(dòng)的化合物。甘油(又名丙三醇)和甘露醇是通常使用的等張劑。其它等張劑包括鹽如氯化鈉和單糖如葡萄糖和乳糖。甘油是優(yōu)選的等張劑。本發(fā)明的組合物和藥物組合物可包含等張劑。
“六聚體穩(wěn)定化合物”意為以六聚體方式存在且使本發(fā)明的胰島素類似物穩(wěn)定的非蛋白質(zhì)的小分子量化合物。酚類化合物尤其是酚類防腐劑是眾知的使胰島素分子穩(wěn)定的化合物。六聚體穩(wěn)定化合物優(yōu)選地為苯酚、間甲酚、鄰甲酚、對(duì)甲酚、氯甲酚、對(duì)羥基苯甲酸甲酯中一種或上述化合物中兩種或多種的混合劑。六聚體穩(wěn)定化合物更優(yōu)選地為苯酚、間甲酚、或其混合劑。本發(fā)明的組合物和藥物組合物可包含六聚體穩(wěn)定化合物。
“防腐劑”指添加到藥學(xué)制劑中作為抗微生物劑而發(fā)揮作用的化合物。本發(fā)明制劑中使用的防腐劑可為酚類防腐劑并且與六聚體穩(wěn)定化合物可相同或不同。腸胃外制劑必須符合防腐劑效力規(guī)范成為商業(yè)上可行的多用途產(chǎn)品。氯化苯甲烷銨、苯乙銨、氯乙醇、苯酚、間甲酚、苯甲醇、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、氯丁醇、鄰甲酚、對(duì)甲酚、氯甲酚、硝酸苯汞、硫汞柳酸鈉、苯甲酸、苯甲酸丁酯、苯甲酸乙酯、苯氧基乙醇、苯乙醇、苯甲酸丙酯、苯基氯甲酚、氯甲酚及其多種的混合劑是本領(lǐng)域內(nèi)眾知有效且為腸胃外制劑可接受的防腐劑。本發(fā)明的組合物和藥物組合物可包含防腐劑。
“酚類防腐劑”包括化合物苯酚、間甲酚、鄰甲酚、對(duì)甲酚、氯甲酚、苯甲酸甲酯及其混合劑。某些酚類防腐劑如苯酚和間甲酚已知結(jié)合胰島素樣分子從而誘導(dǎo)提高物理、化學(xué)穩(wěn)定性或兩者穩(wěn)定性的構(gòu)象的變化。酚類防腐劑優(yōu)選地為間甲酚或苯酚。本發(fā)明的組合物和藥物組合物可包含酚類防腐劑。
“緩沖劑”或“可藥用緩沖劑”意為在胰島素制劑中可安全使用并具有調(diào)節(jié)制劑的pH至制劑所需pH的化合物。本發(fā)明的組合物和藥物組合物可包含可藥用緩沖劑?？伤幱谜{(diào)節(jié)pH至中等酸性pH到中等堿性pH的緩沖劑包括下列化合物如乳酸鹽、酒石酸鹽、磷酸鹽尤其磷酸鈉、乙酸鹽尤其乙酸鈉、檸檬酸鹽尤其檸檬酸鈉、精氨酸、TRIS和組氨酸?！癟RIS”是指2-氨基-2-羥甲基-1，3，-丙二醇及其任何可藥用鹽。游離堿和鹽酸形式是TRIS的兩種常見形式。本領(lǐng)域內(nèi)TRIS又稱為三羥甲基氨基甲烷、緩血酸胺、3(羥基-甲基)氨基甲烷。其它合適的調(diào)節(jié)pH至所需水平的可藥用緩沖劑為普通藥劑師熟知。
本發(fā)明的胰島素類似物可為也使用進(jìn)餐時(shí)間胰島素分子的受試者使用。一種優(yōu)選的進(jìn)餐時(shí)間胰島素分子是B28LysB29Pro-胰島素(所謂“賴脯”胰島素)，該分子中野生型胰島素B鏈(Seq.ID No.4)28位置的Pro和野生型胰島素B鏈(Seq.ID No.4)29位置的Lys被轉(zhuǎn)換。例見美國(guó)專利號(hào)5,514,646、5,474,978和5,700,662。另一種進(jìn)餐時(shí)間胰島素分子是B28Asp-胰島素，該分子中B鏈28位置的野生型Pro已為Asp替換。見美國(guó)專利號(hào)5,547,930。另一種進(jìn)餐時(shí)間胰島素分子為B3LysB29Glu-胰島素。見美國(guó)專利號(hào)6,221,633。
本發(fā)明的胰島素類似物可復(fù)合合適的二價(jià)金屬陽(yáng)離子?！岸r(jià)金屬陽(yáng)離子”意為參與同多個(gè)蛋白分子形成復(fù)合物的離子。過(guò)渡金屬、堿金屬和堿土金屬是已知與胰島素形成復(fù)合物的金屬離子的例子。過(guò)渡金屬是優(yōu)選的。二價(jià)金屬陽(yáng)離子優(yōu)選地為一種或多種選自鋅離子、銅離子、鈷離子、鎂離子、鈣離子、鎘離子、鎳離子和鐵離子的陽(yáng)離子。鋅更為優(yōu)選地為二價(jià)金屬陽(yáng)離子。鋅優(yōu)選地以鹽提供，如硫酸鋅、氯化鋅、氧化鋅或乙酸鋅。
為得到本發(fā)明的胰島素類似物與二價(jià)金屬陽(yáng)離子的復(fù)合物，將蛋白質(zhì)溶解于同時(shí)存在金屬鹽的適合的緩沖液內(nèi)。使混合物在環(huán)境溫度下孵育而使復(fù)合物沉淀。適合的緩沖劑為那些可維持混合物pH至大約3.0到9.0而不干擾復(fù)合反應(yīng)的緩沖液。實(shí)例包括磷酸鹽緩沖液、乙酸緩沖液、檸檬酸緩沖液和Good′s緩沖液如HEPES、Tris和Tris乙酸鹽。合適的金屬鹽是那些其中的金屬為復(fù)合反應(yīng)可得的鹽。合適的鋅鹽實(shí)例包括氯化鋅、乙酸鋅、氧化鋅、硫酸鋅。
本發(fā)明的胰島素類似物可利用重組方法獲得。例如可利用重組的胰島素原類似物。另外，重組胰島素A-和B-鏈可在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)然后重新組合?；蛘呃靡葝u素前體分子。這些方法中的每一種均為本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員熟知。例見美國(guó)專利號(hào)4,421,685、美國(guó)專利號(hào)4,569,791、美國(guó)專利號(hào)4,569,792、美國(guó)專利號(hào)4,581,165、美國(guó)專利號(hào)4,654,324、美國(guó)專利號(hào)5,304,473、美國(guó)專利號(hào)5,457,066號(hào)、美國(guó)專利號(hào)5,559,094、歐洲專利申請(qǐng)EP 741188A1。也見Chance等，Diabetes Care 16(Suppl 3)133-142(1993)、Chance等，Proceedings of the 7thAmerican Peptide Symposium中“肽合成-結(jié)構(gòu)-功能”、Rich，D.H.等編Pierce Chemical Company，Rockford，IL，pp.721-738(1981)和Frank等Munch med Wsch 125(Suppl.1)S14-20(1983)。
胰島素原類似物可經(jīng)羧肽酶B和胰蛋白酶的切割而酶法加工形成胰島素類似物。此外，胰島素原類似物也可以賴氨酰內(nèi)蛋白酶如LysC內(nèi)蛋白酶和胰蛋白酶切割。調(diào)節(jié)酶切反應(yīng)條件以便賴氨酰內(nèi)蛋白酶不切割B29Lys。
用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可為任何常規(guī)的適合生長(zhǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基如基本培養(yǎng)基或含有適當(dāng)補(bǔ)充成分的復(fù)合培養(yǎng)基。適合的培養(yǎng)基可自供應(yīng)商獲得或自公開發(fā)表(如在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American TypeCulture Collection)目錄中)的配方制備。然后細(xì)胞生產(chǎn)的肽可用常規(guī)步驟包括通過(guò)離心或過(guò)濾將宿主細(xì)胞從培養(yǎng)基中分離、通過(guò)鹽如硫酸銨等沉淀上清和過(guò)濾物中的蛋白質(zhì)成分、通過(guò)多種層析步驟進(jìn)行純化如離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、親和層析以及其它取決于目的肽類型的步驟等從培養(yǎng)基中回收。
本發(fā)明也提供了包含編碼本發(fā)明的胰島素原類似物的核酸序列的核酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰島素原類似物為A21Gly-人胰島素原。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰島素原為A21GlyB29ArgB32Lys-人胰島素原。
本發(fā)明也提供了包含編碼本發(fā)明胰島素原類似物的核酸序列的載體。本發(fā)明也提供了包含該載體的宿主細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞。真核細(xì)胞優(yōu)選地為真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或永生化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系細(xì)胞。真核細(xì)胞更為優(yōu)選地為酵母細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。原核細(xì)胞優(yōu)選地為細(xì)菌細(xì)胞，更為優(yōu)選地為大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞。
本發(fā)明也提供了包含本發(fā)明的胰島素原類似物的組合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，也提供了包含本發(fā)明的胰島素原類似物的細(xì)胞培養(yǎng)基。
也提供了表達(dá)本發(fā)明的胰島素原類似物的方法，包括在適合宿主細(xì)胞的增殖和胰島素原類似物的表達(dá)的條件下培養(yǎng)含有編碼本發(fā)明的胰島素原類似物的核酸序列的宿主細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括從宿主細(xì)胞中純化胰島素原類似物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括從培養(yǎng)基中純化胰島素原類似物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括從宿主細(xì)胞和培養(yǎng)基中純化胰島素原類似物。
也提供了表達(dá)本發(fā)明的類似物的重組方法，包括a)在適合宿主細(xì)胞的增殖和胰島素原類似物表達(dá)的條件下培養(yǎng)含有編碼具有連接肽序列的胰島素原類似物的核酸序列的宿主細(xì)胞，b)純化胰島素原類似物并除去連接肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用一種或多種酶如胰蛋白酶和/或羧肽酶B除去連接肽。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，前導(dǎo)肽存在于胰島素原類似物內(nèi)并且前導(dǎo)肽被除去。
本發(fā)明也提供了包含編碼本發(fā)明的胰島素類似物A-和/或B-鏈的核酸序列的核酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰島素類似物為A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰島素類似物為A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰島素。在表達(dá)和純化后，使胰島素類似物A-和B-鏈組合形成本發(fā)明的胰島素類似物。
本發(fā)明也提供了包含編碼本發(fā)明的胰島素類似物A-和/或B-鏈的核酸序列的載體。本發(fā)明也提供了包含該載體的宿主細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞。真核細(xì)胞優(yōu)選地為真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或永生化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系細(xì)胞。宿主細(xì)胞更為優(yōu)選地為酵母細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。原核細(xì)胞優(yōu)選地為細(xì)菌細(xì)胞，更為優(yōu)選地為大腸桿菌細(xì)胞。
也提供了表達(dá)本發(fā)明的胰島素類似物的方法，包含在適合宿主細(xì)胞的增殖和A-和/或B-鏈的表達(dá)的條件下培養(yǎng)含有編碼本發(fā)明的胰島素類似物A-和/或B-鏈的核酸序列的宿主細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包含從宿主細(xì)胞中純化A-和/或B-鏈。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括從培養(yǎng)基中純化A-和/或B-鏈。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包含從宿主細(xì)胞和培養(yǎng)基中純化A-和/或B-鏈。
編碼胰島素原類似物或A-和/或B-鏈的核酸序列可插入任何便于進(jìn)行重組DNA步驟的載體內(nèi)，且載體的選擇常常取決于載體將要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。因此載體可為自主復(fù)制的載體，即作為染色體外的實(shí)體而存在，其復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制的載體如質(zhì)粒。此外，載體也可為一種導(dǎo)入宿主細(xì)胞后整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組而與被整合(諸)染色體共同復(fù)制的載體。
載體優(yōu)選地為編碼肽的DNA序列有效地連接至DNA轉(zhuǎn)錄所需額外的核酸序列如啟動(dòng)子的表達(dá)載體。啟動(dòng)子可為在所選擇的宿主細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列并且可來(lái)源于編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)基因。在多種宿主細(xì)胞內(nèi)指導(dǎo)編碼本發(fā)明肽的DNA序列轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子實(shí)例為本領(lǐng)域公知。
編碼肽的DNA序列根據(jù)需要可有效地連接合適的終止子、多聚腺苷酸化信號(hào)、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列和翻譯增強(qiáng)子序列。本發(fā)明的重組載體可進(jìn)一步包含使該載體所在討論的宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。
載體也可包含可選擇的標(biāo)記，如其基因產(chǎn)物互補(bǔ)宿主細(xì)胞內(nèi)的缺陷或其產(chǎn)物提供對(duì)藥物如氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、新霉素、潮霉素或甲氨蝶呤抗性的基因。
為指導(dǎo)本發(fā)明的親本肽進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑，在重組載體中提供分泌性信號(hào)序列(又稱為前導(dǎo)序列、前原序列或前序列)。分泌性信號(hào)序列按正確閱讀框連接編碼肽的DNA序列。分泌性信號(hào)序列一般位于編碼肽的DNA序列5’端。分泌性信號(hào)序列可為通常與該肽聯(lián)合的序列或源于編碼另一個(gè)分泌性蛋白質(zhì)的基因。
本發(fā)明也提供了包含本發(fā)明的胰島素原類似物的細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明也提供了包含本發(fā)明的胰島素類似物A-和/或B-鏈的細(xì)胞培養(yǎng)基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該培養(yǎng)基也含有宿主細(xì)胞物質(zhì)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基內(nèi)基本無(wú)宿主細(xì)胞物質(zhì)。
本發(fā)明的胰島素類似物也可由固相肽合成技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法制備。肽合成儀可從如Applied Biosystems in Foster City CA商業(yè)地獲得。固相合成使用的試劑可從如Midwest Biotech(Fishers，IN)商業(yè)地獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，自動(dòng)固相肽合成儀根據(jù)制造商用法說(shuō)明用于封閉干擾基團(tuán)、保護(hù)欲反應(yīng)的氨基酸、偶聯(lián)、脫偶聯(lián)和對(duì)未反應(yīng)的氨基酸加帽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，自動(dòng)固相肽合成儀根據(jù)制造商用法說(shuō)明通過(guò)氨基酸偶聯(lián)、對(duì)未反應(yīng)α-氨基酸加帽、去保護(hù)的連續(xù)循環(huán)用于合成肽。
使用標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)化固相合成程序以叔丁氧基羰基或芴基甲氧羰基-α氨基酸和適當(dāng)?shù)膫?cè)鏈保護(hù)反應(yīng)合成肽。合成完成后，以標(biāo)準(zhǔn)氫氟酸法或TFA法將肽從固相支持物上切下及同時(shí)的側(cè)鏈去保護(hù)。然后粗肽得以純化，例如利用在Vydac C18柱上以所有溶劑均含0.1％TFA的水-乙腈線性梯度的反相層析法純化。將肽從含0.1％TFA、乙腈和水的溶液中凍干以去除乙腈和水。分析性反相層析驗(yàn)證肽純度。質(zhì)譜法驗(yàn)證肽身份。肽可以溶解于中性pH的水緩沖劑中。
實(shí)施例1以Boc-Arg(Pbf)-NHS酯?；疉21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素產(chǎn)生A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素Boc-Arg(Pbf)-OH、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)各0.4mml在二氯甲烷中混合30分鐘制備Boc-Arg(Pbf)-NHS酯(0.4mmol)。反應(yīng)混合物過(guò)濾后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮至干燥，溶解于4mlMeOH中。將180mg A21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素(0.030mmol)溶解于20ml含有50mmol Na2HPO4的50∶50水/CH3CN內(nèi)，以5M KOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.7。向胰島素溶液內(nèi)加入1.2ml Boc-Arg(Pbf)-NHS酯溶液(0.12mmol)。反應(yīng)物室溫?cái)嚢?0分鐘，然后加入另外1.2mlBoc-Arg(Pbf)-NHS酯溶液(0.12mmol)，使其反應(yīng)另外30分鐘，隨后以100μl TFA酸化。樣品在Zorbax Eclipse XDB-C84.6mm i.d.×15cm柱上以10％-100％B經(jīng)15分鐘的線性AB梯度而在線性梯度中A＝0.05％TFA/H2O同時(shí)B＝在60∶40 CH3CN∶H2O中0.05％TFA且流速為1ml/分鐘的反相HPLC和質(zhì)譜檢測(cè)(LC-MS)分析?；旌衔飪?nèi)含一些未衍生的蛋白質(zhì)，三個(gè)單?；宓南鄬?duì)比率為7.5∶1.5∶1而三個(gè)二酰化峰的相對(duì)比率為2∶5∶3。
基于以前的實(shí)驗(yàn)，主要的單酰化產(chǎn)物預(yù)期為源于A鏈N末端?；漠a(chǎn)物。這是進(jìn)行分離和表征的化合物。反應(yīng)混合物在流速8ml/分鐘的Kromasil C181.2cm i.d.×25cm制備柱(10μm顆粒大小)上純化。樣品用0-20％B經(jīng)15分鐘后接20％-70％B經(jīng)100分鐘的二階線性AB梯度洗脫，其中A＝0.05％TFA/H2O而B＝0.05％TFA/CH3CN。合并且純化的物質(zhì)經(jīng)凍干后產(chǎn)生28mg主要的單衍生化化合物。凍干的蛋白質(zhì)溶解于20ml的94∶2∶2∶2 TFA∶苯甲醚∶三異丁基硅烷∶MeOH中并置室溫1.5小時(shí)。樣品在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)至＜2mL，以25ml 10∶90乙腈∶水稀釋并經(jīng)乙醚抽提3次。最后的純化過(guò)程如上述進(jìn)行但使用0-15％B經(jīng)15分鐘后接15％-55％B經(jīng)100分鐘的二階線性AB梯度。合并的純化級(jí)分凍干且產(chǎn)量為21mg(大約12％產(chǎn)率)。觀測(cè)的分子量為6218.3(計(jì)算分子量＝6210.1)。產(chǎn)物的身份通過(guò)0.1mg蛋白質(zhì)以5μg內(nèi)蛋白酶Glu-C(來(lái)自金黃色葡萄球菌V8，SigmaP6181)在pH8緩沖液，37℃下2小時(shí)的消化而確認(rèn)。得到的混合物的LC-SM分析顯示存在可辨認(rèn)的片段A(1-4)+Arg、A(1-17)-B(1-13)+Arg和A(5-17)-B(1-13)，因此證實(shí)加入的Arg殘基定位在A鏈N末端。
實(shí)施例2體外的受體親和力胰島素類似物對(duì)人胰島素受體(IR)的親和力在使用放射性標(biāo)記配體[125I]胰島素的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)中測(cè)定。人胰島素受體膜通過(guò)過(guò)量表達(dá)受體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的293EBNA細(xì)胞P1膜制備而得。分析方法在獲得可比結(jié)果的過(guò)濾和SPA(閃爍迫近分析)模式下進(jìn)行和驗(yàn)證，但在使用AmershamPharmacia Biotech.公司經(jīng)PVT PEI處理的小麥凝集素偶聯(lián)SPA珠，A型(WGA PVT PEI SPA)珠的SPA模式下進(jìn)行。
放射標(biāo)記的配體([125I]重組人胰島素)可自制或購(gòu)自AmershamPharmacia Biotech.公司，參考日期的比放射活性為2000Ci/mmol。SPA分析緩沖液為50mM Tris-HCL，pH 7.8、150mM NaCl、0.1％BSA。分析以在96-孔微量培養(yǎng)板(Costar，#3632)中高通量設(shè)置并通過(guò)Titertec/Plus(ICN Pharmaceuticals)加入放射性配體、膜和SPA珠而自動(dòng)化。
諸試劑按如下順序加入培養(yǎng)板孔
培養(yǎng)板以粘性培養(yǎng)板蓋密封并在LabLine Instruments層板振蕩器上振蕩1分鐘。培養(yǎng)板通過(guò)放入Wallac Microbeta閃爍計(jì)數(shù)器并設(shè)置計(jì)時(shí)器12小時(shí)在室溫(22℃)下孵育12小時(shí)。通過(guò)[125I]已標(biāo)準(zhǔn)化的方法每孔1分鐘計(jì)數(shù)。每種胰島素分子的IC50由4-參數(shù)對(duì)數(shù)非線性回歸分析測(cè)定。數(shù)據(jù)報(bào)告為平均值±SEM。相對(duì)親和力通過(guò)將胰島素類似物與每個(gè)試驗(yàn)中的重組人胰島素對(duì)照對(duì)比并按所進(jìn)行試驗(yàn)次數(shù)平均化相對(duì)親和力而測(cè)定。因此胰島素類似物的平均IC50與胰島素的平均IC50的比較不能生成相同值。
胰島素類似物和重組人胰島素對(duì)胰島素生長(zhǎng)因子受體(IGF1-R)的親和力在使用[125I]IGF-1放射標(biāo)記配體的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析中測(cè)定。人IGF-1受體膜通過(guò)過(guò)量表達(dá)受體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的293EBNA細(xì)胞P1膜制備而得。分析方法在獲得可比結(jié)果的過(guò)濾和SPA(閃爍迫近分析)模式下進(jìn)行和驗(yàn)證，但在使用Amersham Pharmacia Biotech.公司經(jīng)PVT PEI處理的小麥凝集素偶聯(lián)SPA珠，A型(WGA PVT PEI SPA)珠的SPA模式下進(jìn)行。IGF-1放射標(biāo)記配體可自制或購(gòu)自Amersham Pharmacia Biotech.公司，參考日期的比放射活性為2000Ci/mmol。SPA分析緩沖液為50mMTris-HCL、pH 7.8、150mM NaCl、0.1％BSA。分析以在96-孔微量培養(yǎng)板(Costar，#3632)中高通量設(shè)置并通過(guò)Titertec/Plus(ICNPharmaceuticals)加入放射性配體、膜和SPA珠而自動(dòng)化。
諸試劑按如下順序加入培養(yǎng)板孔
培養(yǎng)板以粘性培養(yǎng)板改密封并在LabLine Instruments層板振蕩器上振蕩1分鐘。培養(yǎng)板通過(guò)放入Wallac Microbeta閃爍計(jì)數(shù)器并設(shè)置計(jì)時(shí)器12小時(shí)在室溫(22℃)下孵育12小時(shí)。通過(guò)[125I]已標(biāo)準(zhǔn)化的方法每孔1分鐘計(jì)數(shù)。
每種胰島素分子的IC50由4-參數(shù)對(duì)數(shù)非線性回歸分析測(cè)定。數(shù)據(jù)報(bào)告為平均值+SEM。相對(duì)親和力通過(guò)將胰島素類似物與每個(gè)試驗(yàn)中的重組胰島素對(duì)照對(duì)比并按所進(jìn)行試驗(yàn)次數(shù)平均化相對(duì)親和力而測(cè)定。因此胰島素類似物的平均IC50與胰島素的平均IC50的比較不能生成相同值。
將選擇指數(shù)計(jì)算為IR相對(duì)親和力與IGF-1 R相對(duì)親和力的比值。選擇指數(shù)＞1表示對(duì)IR更強(qiáng)的相對(duì)選擇性。選擇指數(shù)＜1表示對(duì)IGF-1R更強(qiáng)的相對(duì)選擇性。
表1描述胰島素類似物和重組人胰島素的胰島素受體(IR)親和力、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1R)受體親和力及受體選擇指數(shù)(IR/IGF1-R)。
實(shí)施例3體外的代謝能力A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素和重組人胰島素的代謝能力(葡萄糖攝入)在使用已分化的小鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝入分析中測(cè)定。在100μl生長(zhǎng)培養(yǎng)基(高葡萄糖且不含L-谷氨酰胺的DMEM、10％小牛血清、2mM L-谷氨酰胺、1％抗生素/抗真菌溶液)中以密度為25,000個(gè)細(xì)胞/孔的未分化的小鼠3T3細(xì)胞鋪板。
鋪板后3天通過(guò)加入分化培養(yǎng)基高葡萄糖且不含L-谷氨酰胺的DMEM、10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1％抗生素/抗真菌溶液、10mMHEPES、0.25mM地塞米松、0.5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、5mg/ml胰島素而啟動(dòng)分化。48小時(shí)后(第3天)，原分化培養(yǎng)基換成一種含有胰島素但沒(méi)有IBMX或地塞米松的分化培養(yǎng)基而至第6天細(xì)胞轉(zhuǎn)換以不含胰島素、IBMX或地塞米松的分化培養(yǎng)基。細(xì)胞在FBS培養(yǎng)基中維持并隔日換液。
葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)分析使用Cytostar T 96孔板進(jìn)行。在分析前24小時(shí)。細(xì)胞轉(zhuǎn)換以100μl含有0.1％BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基。在分析當(dāng)日，移去培養(yǎng)基并加入50μl分析緩沖液含有HEPES，pH 7.4(118mM NaCl、4.8mMKCl、1.2mM MgSO4×7H2O、1.3mM CaCl2H2O、1.2mM KH2PO4、15mM HEPES)的稱為KRBH或Krebs-Ringer緩沖液。用含有0.1％BSA的相同緩沖液配制胰島素稀釋物并以2×加入。空白含有KRBH、0.1％BSA和20mM 2×2-脫氧-D-葡萄糖、0.2μCi/孔的2-脫氧-D-(U-14C)葡萄糖和2×10-7胰島素。細(xì)胞37℃孵育1小時(shí)。此后在KRBH液中加入10μl松胞菌素B至終濃度200μM并在Microbeta培養(yǎng)板讀數(shù)儀上對(duì)培養(yǎng)板讀數(shù)。相對(duì)親和力通過(guò)將A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素與每個(gè)試驗(yàn)中的重組人胰島素對(duì)照對(duì)比并按所進(jìn)行的試驗(yàn)次數(shù)平均化相對(duì)親和力而測(cè)定。因此，A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素的平均EC50與胰島素平均EC50的比較不能生成相同值。
表2描述A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素和重組人胰島素的體外代謝能力。
實(shí)施例4體外促有絲分裂性A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素的促有絲分裂能力經(jīng)測(cè)定培養(yǎng)的人乳腺上皮細(xì)胞(HMEC)增殖而測(cè)定。HMEC由Clonetics Corporation(San Diego，CA)獲得為第7代并擴(kuò)增至第8代凍存。每次使用一支新鮮安瓿因而所有試驗(yàn)均使用相同的第10代HMEC進(jìn)行。細(xì)胞按照BioWhittaker使用說(shuō)明書維持培養(yǎng)。生長(zhǎng)培養(yǎng)基隔日更換以維持細(xì)胞培養(yǎng)并且每日檢查培養(yǎng)物。
以BioWhittaker的兩種產(chǎn)品作為生長(zhǎng)培養(yǎng)基1.完全補(bǔ)充的MEGM(CC-3051)包括(數(shù)字表示終濃度，除BPE外)10ng/ml hEGF(人重組表皮生長(zhǎng)因子)5μg/ml胰島素0.5μg/ml氫化可的松50μg/ml慶大霉素，50ng/ml兩性霉素-B13mg/mlBPE(牛垂體抽提物)2ml(附加的)；及2.含所有下列補(bǔ)充物(SingleQuots，CC-3150)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEBM，CC-3151)
13mg/ml BPE(牛垂體抽提物(CC-4009)2ml10μg/ml hEGF(CC-4017)0.5ml5μg/ml胰島素(CC-4031)0.5ml0.5mg/ml氫化可的松(CC-4031)0.5ml50mg/ml慶大霉素，50mg/ml兩性霉素-B(CC-4081)0.5ml。
對(duì)生長(zhǎng)試驗(yàn)而言，分析培養(yǎng)基是無(wú)5μg/ml胰島素、含0.1％BSA的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。分析在96孔Cytostart閃爍微量培養(yǎng)板(AmershamPharmacia Biotech，RPNQ0162)上進(jìn)行。重組人胰島素和IGF-1作為每輪分析的對(duì)照使用且在每個(gè)分析培養(yǎng)板上有重組人胰島素。
分析按如下程序進(jìn)行。第一天，在100μl分析培養(yǎng)基內(nèi)按4000個(gè)細(xì)胞/孔密度鋪種HMEC。生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的胰島素以0-1000nM終濃度的梯度劑量的重組人胰島素或另一種胰島素分子替代。孵育4小時(shí)后，每孔加入10μl含0.1μCi14C-胸苷的分析培養(yǎng)基并在Trilux上第48小時(shí)和/或72小時(shí)對(duì)培養(yǎng)板讀數(shù)。
一般地，最大生長(zhǎng)反應(yīng)在基礎(chǔ)之上3-4倍刺激量之間。反應(yīng)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化至0-100％反應(yīng)之間，等同于100X(在X濃度的反應(yīng)-在0濃度的反應(yīng))除以(在最大濃度的反應(yīng)-在0濃度的反應(yīng))。濃度-反應(yīng)數(shù)據(jù)用JMP軟件非線性回歸擬合。
相對(duì)促有絲分裂能力通過(guò)A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素與每次試驗(yàn)中胰島素對(duì)照的對(duì)比并按所做試驗(yàn)次數(shù)平均化相對(duì)能力而測(cè)定。因此A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素的平均EC50與胰島素的平均EC50的比較不能生成相同值。
表3描述以細(xì)胞增殖測(cè)量的A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素和重組人胰島素的體外促有絲分裂性。表3數(shù)據(jù)表明A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素的促有絲分裂性低于重組人胰島素。
實(shí)施例5磷酸鹽緩沖鹽水中的溶解性如下開展了指示體內(nèi)延長(zhǎng)時(shí)間作用傾向的體外沉淀分析法。將含有藥學(xué)劑量(100個(gè)國(guó)際單位)胰島素分子和30μg/ml Zn2+、2.7mg/ml間甲酚和17mg/ml甘油％同時(shí)pH調(diào)節(jié)至4的水溶液用磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)中和至2個(gè)國(guó)際單位并以14,000轉(zhuǎn)每分鐘室溫離心5分鐘。轉(zhuǎn)移上清并將約十分之一上清注入分析性Symmetry Shield RP8 RP-HPLC系統(tǒng)(Waters，Inc.)。洗脫峰下的面積合并后與參考標(biāo)準(zhǔn)物峰下的面積比較，參考標(biāo)準(zhǔn)物或?yàn)?.1N HCl中的重組人胰島素。面積比乘以100而得在PBS中的溶解性％。
重組人胰島素制劑和胰島素類似物的PBS溶解性見表4
實(shí)施例6等電點(diǎn)等電聚焦是基于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)分離蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。pI是蛋白質(zhì)不具有凈電荷同時(shí)在電場(chǎng)中不移動(dòng)時(shí)所在的pH。IEF凝膠可有效產(chǎn)生pH梯度因而蛋白質(zhì)按它們獨(dú)特的PI特性分離。蛋白質(zhì)條帶的檢測(cè)可用靈敏染料染色如Novex Collodial Coomassie Staining Kit完成?；蛘邔⒛z印跡至聚偏二乙烯二氟化物(PVDF)膜同時(shí)麗春紅染色而完成檢測(cè)。蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測(cè)定可與已知標(biāo)準(zhǔn)物的等電點(diǎn)比較而得。IEF蛋白標(biāo)準(zhǔn)物是pI值充分表征的并混合以提供均一染色的諸蛋白質(zhì)的合并物。另一pI測(cè)定方法是毛細(xì)管電泳(cIEF)。pI通過(guò)與已知標(biāo)記物對(duì)比測(cè)定。
重組人胰島素和A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素的等電點(diǎn)(pI)使用可產(chǎn)生pI性能范圍3.5-8.5的pH 3-10的Novex IEF凝膠通過(guò)等電聚焦凝膠電泳測(cè)定。等電點(diǎn)示于表5
實(shí)施例7A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰島素的生物合成用含有編碼A21GlyB0LysB29ArgB32Lys-人胰島素原序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化商業(yè)購(gòu)買的大腸桿菌表達(dá)菌株以生產(chǎn)胰島素原分子。前導(dǎo)序列以起始子Met密碼子開始，后接Lys殘基以在胰島素原分子內(nèi)形成B0Lys。過(guò)度表達(dá)的蛋白質(zhì)聚集在包涵體內(nèi)，包涵體在4000轉(zhuǎn)每分鐘的細(xì)胞裂解物終末離心后收集。前導(dǎo)序列-A21GlyB0LysB29ArgB32Ly-人胰島素原蛋白質(zhì)溶于50mMTrispH 9.0、7M尿素中并且使蛋白質(zhì)混合物經(jīng)1小時(shí)pH梯度至pH 11.0同時(shí)室溫?cái)嚢柽M(jìn)一步增溶。室溫下以亞硫酸鈉(100mM終濃度)和連四硫酸鈉(4.9mM終濃度)繼續(xù)亞硫酸鹽解4小時(shí)同時(shí)溫和攪拌。亞硫酸化的蛋白質(zhì)通過(guò)在50mM Tris pH 9.0、7M尿素中以0至400mM NaCl梯度洗脫進(jìn)行Pharmacia Fast Flow Q Sepharose層析純化。然后以pH 10.5 20mM甘氨酸稀釋已純化的蛋白質(zhì)溶液至約150μg/ml。加半胱氨酸至終濃度2mM啟動(dòng)折疊過(guò)程并在4℃經(jīng)60-72小時(shí)溫和攪拌完成。折疊的蛋白質(zhì)通過(guò)在100mM乙酸鈉、pH 4.0、30％乙腈中以線性NaCl梯度洗脫進(jìn)行Pharmacia Fast Flow SP Sepharose層析法純化。凍干合并的含有已純化蛋白質(zhì)的級(jí)分，在水中重溶解并裝載到C18反相柱上然后以乙腈梯度洗脫。凍干收集的含胰島素原的洗脫液而獲得210mg蛋白質(zhì)。
在B0、B32、C64處3個(gè)賴氨酸殘基C-末端側(cè)的切割預(yù)期導(dǎo)致所需的胰島素類似物的直接產(chǎn)生。22mg胰島素原(MW 9990.4；0.0022mmol)溶于2ml 25mM tris，pH 8.2緩沖液中，然后向該蛋白質(zhì)溶液加25μg內(nèi)蛋白酶Lys-C(Sigma目錄編號(hào)P-3428；獲自Lysobacter enzymogenes)，在37℃孵育5小時(shí)然后在室溫下孵育額外15小時(shí)。此時(shí)顯著量的白色沉淀物出現(xiàn)在樣品中。樣品在3000轉(zhuǎn)每分鐘離心5分鐘并移去上清。沉淀重溶在3mlpH2的30∶70乙腈∶水中。
上清的分析性反相HPLC記錄顯示在10.77分鐘(上清的主要成份)時(shí)的一個(gè)峰，分子量為3148.5Da，正好是在B32Lys/B33Glu和C64Lys/C65Arg處切割后得到的C-肽片段的預(yù)期分子量。
沉淀物的分析性反相HPLC記錄表明顯示在11.25分鐘(沉淀的主要成份)時(shí)的一個(gè)峰，分子量為6219.8Da，與目的產(chǎn)物的計(jì)算分子量(6219.1Da)很好吻合。因此，在沉淀中獲得目的產(chǎn)物。分析顯示小比例的目的產(chǎn)物同時(shí)滯留在上清中。
產(chǎn)物在流速6mL/分鐘、線性0.5％乙腈/分鐘梯度的Vydac C18反相HPLC柱(10mm i.d.×25cm)上再純化。凍干的終產(chǎn)物產(chǎn)量為9mg，從胰島素原形式的回收率約為66％(由于前導(dǎo)肽和C肽質(zhì)量損失，100％效率將產(chǎn)出62％的初始質(zhì)量)。
這里提及的全部專利、專利申請(qǐng)、論文、書和其他出版物此處完整引用作為參考。
序列表<110>伊萊利利公司<120>具有延長(zhǎng)時(shí)間作用的胰島素類似物<130>X-16270M<150>US 60/466,501<151>2003-04-29<150>US 60/466,500<151>2003-04-29<150>US 60/470,118<151>2003-05-13<160>5<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>22<212>PRT<213>人(HOMO SAPIENS)<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(22)<223>A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素和A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰島素的A鏈氨基酸序列<400>1Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln1 5 10 15Leu Glu Asn Tyr Cys Gly20
<210>2<211>32<212>PRT<213>人<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(32)<223>A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素的B鏈氨基酸序列<400>2Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg20 25 30<210>3<211>21<212>PRT<213>人<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(21)<223>野生型人胰島素的A鏈氨基酸序列<400>3Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu1 5 10 15Glu Asn Tyr Cys Asn20<210>4<211>30
<212>PRT<213>人<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(30)<223>野生型人胰島素的B鏈氨基酸序列<400>4Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr20 25 30<210>5<211>32<212>PRT<213>人<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(32)<223>A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰島素的B鏈氨基酸序列<400>5Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Arg Thr Arg Lys20 25 30
權(quán)利要求
1.胰島素類似物A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰島素。
2.包含權(quán)利要求1的胰島素類似物的組合物。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中該組合物為藥物組合物。
4.權(quán)利要求3的組合物，其進(jìn)一步包含一種或多種可藥用賦形劑。
5.權(quán)利要求2-4中任意一項(xiàng)所述的組合物，其進(jìn)一步包含二價(jià)金屬陽(yáng)離子。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中二價(jià)金屬陽(yáng)離子為鋅。
7.權(quán)利要求2-6中任意一項(xiàng)所述的組合物，其進(jìn)一步包含酚類防腐劑。
8.權(quán)利要求2-6中任意一項(xiàng)所述的組合物，其進(jìn)一步包含等張劑。
9.治療高血糖癥的方法，該方法包括對(duì)受試者以足以調(diào)節(jié)受試者血葡萄糖濃度的量施與權(quán)利要求1的胰島素類似物。
10.治療高血糖癥的方法，該方法包括對(duì)受試者以足以調(diào)節(jié)受試者血葡萄糖濃度的量施與權(quán)利要求2-8中任意一項(xiàng)所述的組合物。
11.權(quán)利要求9或10的方法，其中受試者因糖尿病而治療。
12.胰島素類似物A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰島素。
13.包含權(quán)利要求12的胰島素類似物的組合物。
14.權(quán)利要求13的組合物，其進(jìn)一步包含一種或多種可藥用賦形劑。
15.權(quán)利要求12-14中任意一項(xiàng)所述的組合物，其進(jìn)一步包含二價(jià)金屬陽(yáng)離子。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中二價(jià)金屬陽(yáng)離子為鋅。
17.治療高血糖癥的方法，該方法包括對(duì)受試者以足以調(diào)節(jié)受試者血葡萄糖濃度的量施與權(quán)利要求12-16中任意一項(xiàng)所述的組合物。
18.胰島素原類似物A21GlyB0LysB29ArgB32Lys-人胰島素原。
19.包含權(quán)利要求18的胰島素原類似物的組合物。
20.胰島素原類似物A21GlyB29ArgB32Lys-人胰島素原。
21.包含權(quán)利要求20的胰島素原類似物的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了胰島素類似物A0
文檔編號(hào)A61K38/28GK1780854SQ200480011107
公開日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2004年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月29日
發(fā)明者R·D·迪馬其, W·D·科恩, 張連山 申請(qǐng)人:伊萊利利公司