專利名稱：內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供的方法和組合物通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，遷移，和/或小管形成，因此用于治療脊椎動(dòng)物血管發(fā)生相關(guān)失調(diào)和疾病，包括癌癥。更具體地，所述方法涉及施用抑制血管發(fā)生或腫瘤生長(zhǎng)的偶聯(lián)或未偶聯(lián)形式的對(duì)腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物(TEM)特異性的抗體，和這些方法中使用的組合物。
背景技術(shù)：
血管發(fā)生包括組織或器官中新血管的產(chǎn)生。正常生理?xiàng)l件下，在非常特定的情形下發(fā)生血管發(fā)生，例如傷口愈合，胎兒發(fā)育，及黃體，子宮內(nèi)膜和胎盤(pán)的形成。血管發(fā)生的過(guò)程通過(guò)天然存在的刺激物而被高度調(diào)節(jié)，例如，血管發(fā)生素-1，IL-8，血小板來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PD-ECGF)，和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，和抑制劑，例如，血小板反應(yīng)蛋白，干擾素，和金屬蛋白酶抑制劑。
血管發(fā)生也能作為多種疾病狀態(tài)中的重要因素而存在。事實(shí)上，不受控制的血管發(fā)生直接導(dǎo)致與很多疾病相關(guān)的病理?yè)p害。這種不受控制的或過(guò)度的血管發(fā)生在血管發(fā)生因子失衡并且存在血管發(fā)生抑制劑時(shí)發(fā)生，例如，當(dāng)產(chǎn)生過(guò)量血管發(fā)生因子時(shí)。不充足的血管發(fā)生也是某些疾病狀態(tài)的原因。例如，不適當(dāng)?shù)难苌L(zhǎng)導(dǎo)致與冠狀動(dòng)脈疾病、中風(fēng)、和延遲的傷口愈合有關(guān)的病理。
象糖尿病患者視網(wǎng)膜病、與年齡有關(guān)的黃斑變性、動(dòng)脈粥樣硬化、和炎癥狀況，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牛皮癬這樣的疾病中存在過(guò)度的血管發(fā)生。例如，在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，關(guān)節(jié)滑膜中的血管經(jīng)歷不適當(dāng)?shù)难馨l(fā)生。除了形成新血管網(wǎng)外，內(nèi)皮細(xì)胞釋放因子和活性氧物質(zhì)，它們導(dǎo)致血管翳生長(zhǎng)和軟骨破壞，從而可以活躍地引起和幫助保持類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的慢性炎癥狀態(tài)。參見(jiàn)，例如，Bodolay，E.，等，J.CellMol.Med.6357-76(2002)。類(lèi)似地，在骨關(guān)節(jié)炎中，血管發(fā)生相關(guān)因子對(duì)軟骨細(xì)胞的激活可以引起關(guān)節(jié)的破壞。參見(jiàn)，例如，Walsh，D.A.，等，Arthritis Res.3147-53(2001)。
血管發(fā)生在癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中起著決定性作用。參見(jiàn)，例如，B.R.Zetter，Ann.Rev.Med.49407-24(1998)，J.Follcman，Sem.Oncol.2215-18(2002)。首先，血管發(fā)生導(dǎo)致原發(fā)腫瘤血管發(fā)生，對(duì)生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞供應(yīng)必需的營(yíng)養(yǎng)。其次，腫瘤的增加的血管發(fā)生提供進(jìn)入血流的通路，從而增強(qiáng)腫瘤轉(zhuǎn)移可能性。最后，轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞離開(kāi)原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)位點(diǎn)之后，必須發(fā)生血管發(fā)生來(lái)支持轉(zhuǎn)移細(xì)胞在第二位點(diǎn)生長(zhǎng)和擴(kuò)展。
正常和與疾病相關(guān)的血管發(fā)生似乎是以類(lèi)似方式進(jìn)行?；啄ぐ鼑膬?nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞形成毛細(xì)血管。疾病或損傷誘導(dǎo)產(chǎn)生促血管發(fā)生因子。最初，這些因子激活內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞，釋放侵蝕或溶解存在的血管的基底膜的酶。覆蓋血管腔的激活的內(nèi)皮細(xì)胞然后突起通過(guò)基底膜。促血管發(fā)生刺激物然后誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移通過(guò)受損的基底膜。遷移細(xì)胞形成離開(kāi)母體血管的“芽狀物”，在那里內(nèi)皮細(xì)胞開(kāi)始增殖。內(nèi)皮芽狀物彼此匯合，利用粘附因子形成毛細(xì)管回路，產(chǎn)生新的血管。另外的酶，例如基質(zhì)金屬蛋白酶，然后消化出芽血管尖端的組織，允許活性組織在新血管周?chē)厮堋Ｖ芗?xì)胞(即，特化的平滑肌細(xì)胞)穩(wěn)定新形成的血管。一旦穩(wěn)定，新血管就支持血流。
已經(jīng)鑒定出很多化合物是血管發(fā)生抑制劑。舉例的化合物包括魚(yú)精蛋白(Taylor等，Nature 297307(1982))，肝素，甾族化合物(Folkman等，Science 221719(1983)和美國(guó)專利Nos.5,001,116和4,994,443)，沙利度胺(R.J.D′Amato，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.914082-85(1994))，TNP-470(Ingmer，等，Nature 348555-57(1990))，和羧基酰氨基三唑(CAI)(Kohn，等，Cancer Res.56569-73(1996)。內(nèi)源產(chǎn)生的抑制劑包括干擾素α(IFN-α)(White等，New England J.Med.3201197-1200(1989)，Sidky等，Cancer Res.475155-61(1987)，制管張素(O′Reilly，等，Cell 79315-28(1994))，和內(nèi)皮抑素(O′Reilly，等，Cell 881-20(1997))。
很多這樣的化合物的局限性是它們的抗血管發(fā)生活性的普遍性質(zhì)。換句話說(shuō)，大多數(shù)化合物沒(méi)有區(qū)別正常血管發(fā)生和與疾病相關(guān)的血管發(fā)生的能力。作為結(jié)果，顯著的毒性限制很多已經(jīng)鑒定的抗血管發(fā)生物質(zhì)的臨床應(yīng)用，因?yàn)檎５暮团c疾病相關(guān)的血管發(fā)生都被抑制。因此，選擇性導(dǎo)向于與疾病相關(guān)的血管發(fā)生的血管發(fā)生抑制劑在降低毒性和有效增強(qiáng)長(zhǎng)期效力方面提供顯著的優(yōu)勢(shì)。
發(fā)明概述這里提供抑制細(xì)胞增殖的方法，包括施用有效量的與選自腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物(TEM)1和TEM17的抗原特異性結(jié)合的抗體，或者其生物活性片段，從而抗體抑制細(xì)胞增殖。
這里還提供了一種抑制細(xì)胞遷移的方法，包括施用有效量的與選自腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物TEM1，TEM9，和TEM17的抗原特異性結(jié)合的抗體，或者其生物活性片段，從而抗體抑制細(xì)胞遷移。
這里提供一種抑制內(nèi)皮管形成的方法，包括施用有效量的與選自腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物TEM1和TEM17的抗原特異性結(jié)合的抗體，或者其生物活性片段，從而抗體抑制內(nèi)皮管形成。
這里提供的方法的抗體可以是人抗體或人源化抗體。本發(fā)明方法中能使用完整抗體分子，單鏈可變區(qū)，F(xiàn)ab片段，或F(ab′)2片段。抗體可以是單克隆抗體，嵌合抗體，或多克隆抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠中能產(chǎn)生抗體。與生物活性劑偶聯(lián)的抗體在本發(fā)明中也是有用的。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體對(duì)于抗原的胞外結(jié)構(gòu)域是特異性的。本發(fā)明方法的抗體介導(dǎo)的抑制作用能在體外細(xì)胞中，在組織中，或者在受試者中發(fā)生。
這里還提供了一種抑制血管發(fā)生的方法，包括對(duì)需要的受試者施用有效量的與選自TEM1，TEM9，和TEM17的抗原特異性結(jié)合的抗體，或者其生物活性片段，從而抗體抑制血管發(fā)生。接受本發(fā)明方法治療的受試者表達(dá)感興趣的TEM。血管發(fā)生可以是新血管發(fā)生。本發(fā)明方法中使用的抗體包括與抗血管發(fā)生劑或抗腫瘤劑偶聯(lián)的抗體。本發(fā)明方法治療的受試者包括具有但不限于下面疾病的患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，星形細(xì)胞瘤，少突膠質(zhì)瘤，室管膜和脈絡(luò)叢腫瘤，松果體腫瘤，神經(jīng)元腫瘤，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，神經(jīng)鞘瘤，腦膜瘤，腦膜肉瘤；眼部腫瘤基底細(xì)胞癌，鱗狀細(xì)胞癌，黑素瘤，橫紋肌肉瘤，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤；內(nèi)分泌腺腫瘤垂體瘤，甲狀腺瘤，腎上腺皮質(zhì)腫瘤，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，胃腸胰腺內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，生殖腺腫瘤；頭頸腫瘤頭頸癌，口腔，咽，喉，牙原性腫瘤胸部腫瘤大細(xì)胞肺癌，小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌，胸部腫瘤，惡性間皮瘤，胸腺瘤，胸部原發(fā)生殖細(xì)胞腫瘤；消化道腫瘤食管腫瘤，胃腫瘤，肝腫瘤，膽囊腫瘤，外分泌胰腺腫瘤，小腸腫瘤，蠕蟲(chóng)樣闌尾和腹膜，結(jié)腸和直腸腺癌，肛門(mén)腫瘤；泌尿生殖道腫瘤腎細(xì)胞癌，腎盂和輸尿管腫瘤，膀胱腫瘤，尿道腫瘤，前列腺腫瘤，陰莖腫瘤，睪丸腫瘤；女性生殖器官腫瘤外陰和陰道腫瘤，子宮頸腫瘤，子宮體腺癌，卵巢癌，婦科肉瘤；乳腺腫瘤；皮膚腫瘤基底細(xì)胞癌，鱗癌，皮膚纖維肉瘤，Merkel細(xì)胞腫瘤；惡性黑素瘤；骨和軟組織腫瘤成骨肉瘤，惡性纖維性組織細(xì)胞瘤，軟骨肉瘤，尤因氏肉瘤，原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤，血管肉瘤；造血系統(tǒng)腫瘤骨髓發(fā)育不良綜合征，急性髓細(xì)胞白血病，慢性髓細(xì)胞白血病，急性淋巴細(xì)胞白血病，HTLV-1，和T-細(xì)胞白血病/淋巴瘤，慢性淋巴細(xì)胞白血病，毛細(xì)胞白血病，何杰金氏病，非何杰金氏淋巴瘤，肥大細(xì)胞白血??；兒童腫瘤急性成淋巴細(xì)胞白血病，急性髓細(xì)胞白血病，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，骨腫瘤，橫紋肌肉瘤，淋巴瘤，腎和肝腫瘤。其他疾病包括多囊性腎病；糖尿病視網(wǎng)膜病；類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；牛皮癬；骨關(guān)節(jié)炎；聽(tīng)神經(jīng)瘤，神經(jīng)纖維瘤，沙眼和生膿性肉芽腫；黃斑變性；早發(fā)視網(wǎng)膜?。唤悄ひ浦才女?；新血管青光眼和晶狀體后纖維組織增生。與血管發(fā)生相關(guān)的其他疾病包括但不限于，流行性角膜結(jié)膜炎，維生素A缺乏，特應(yīng)性角膜炎，上緣角膜炎，翼狀胬肉干燥性角膜炎，干燥綜合征，phylectenulosis，梅毒，分支桿菌感染，脂變性，化學(xué)損傷，細(xì)菌性潰瘍，真菌性潰瘍，單純皰疹感染，帶狀皰疹感染，原蟲(chóng)感染，卡波西肉瘤，角膜侵蝕性潰瘍，Terrien′s邊緣變性，邊緣角質(zhì)層分離，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，多動(dòng)脈炎，創(chuàng)傷，Wegeners肉樣瘤病，鞏膜炎，斯約二氏病，類(lèi)天皰瘡放射狀角膜切開(kāi)術(shù)，角膜圖形排斥，和慢性炎癥。
這里提供抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法，包括對(duì)需要的受試者施用有效量的與選自TEM1，TEM17和TEM9的抗原特異性結(jié)合的抗體，或者其生物活性片段，從而抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)。本發(fā)明方法處理過(guò)的受試者表達(dá)感興趣的TEM。本發(fā)明方法中有用的抗體包括與抗血管發(fā)生劑或抗腫瘤劑偶聯(lián)的抗體。本發(fā)明的方法治療的受試者包括患有腺癌，白血病，淋巴瘤，黑素瘤，肉瘤或tetratocarcinoma的患者。腫瘤可以是腎上腺，膀胱，骨，骨髓，腦，乳腺，子宮頸，膽囊，神經(jīng)節(jié)，胃腸道，心臟，腎，肝，肺，肌肉，卵巢，胰腺，甲狀旁腺，陰莖，前列腺，唾液腺，皮膚，脾，睪丸，胸腺，甲狀腺，和子宮的癌。這樣的腫瘤包括但不限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，星形細(xì)胞瘤，少突膠質(zhì)瘤，室管膜和脈絡(luò)叢腫瘤，松果體腫瘤，神經(jīng)元腫瘤，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，神經(jīng)鞘瘤，腦膜瘤，腦膜肉瘤；眼部腫瘤基底細(xì)胞癌，鱗狀細(xì)胞癌，黑素瘤，橫紋肌肉瘤，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤；內(nèi)分泌腺腫瘤垂體瘤，甲狀腺瘤，腎上腺皮質(zhì)腫瘤，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，胃腸胰腺內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，生殖腺腫瘤；頭頸腫瘤頭頸癌，口腔，咽，喉，牙原性腫瘤胸部腫瘤大細(xì)胞肺癌，小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌，胸部腫瘤，惡性間皮瘤，胸腺瘤，胸部原發(fā)生殖細(xì)胞腫瘤；消化道腫瘤食管腫瘤，胃腫瘤，肝腫瘤，膽囊腫瘤，外分泌胰腺腫瘤，小腸腫瘤，蠕蟲(chóng)樣闌尾和腹膜，結(jié)腸和直腸腺癌，肛門(mén)腫瘤；泌尿生殖道腫瘤腎細(xì)胞癌，腎盂和輸尿管腫瘤，膀胱腫瘤，尿道腫瘤，前列腺腫瘤，陰莖腫瘤，睪丸腫瘤；女性生殖器官腫瘤外陰和陰道腫瘤，子宮頸腫瘤，子宮體腺癌，卵巢癌，婦科肉瘤；乳腺腫瘤；皮膚腫瘤基底細(xì)胞癌，鱗癌，皮膚纖維肉瘤，Merkel細(xì)胞腫瘤；惡性黑素瘤；骨和軟組織腫瘤成骨肉瘤，惡性纖維性組織細(xì)胞瘤，軟骨肉瘤，尤因氏肉瘤，原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤，血管肉瘤；造血系統(tǒng)腫瘤骨髓發(fā)育不良綜合征，急性髓細(xì)胞白血病，慢性髓細(xì)胞白血病，急性淋巴細(xì)胞白血病，HTLV-1，和T-細(xì)胞白血病/淋巴瘤，慢性淋巴細(xì)胞白血病，毛細(xì)胞白血病，何杰金氏病，非何杰金氏淋巴瘤，肥大細(xì)胞白血??；兒童腫瘤急性成淋巴細(xì)胞白血病，急性髓細(xì)胞白血病，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，骨腫瘤，橫紋肌肉瘤，淋巴瘤，腎和肝腫瘤。
這里還提供了在本發(fā)明方法中有用的與包括抗血管發(fā)生劑或抗腫瘤劑的生物活性劑偶聯(lián)的抗體的組合物。
這里還提供了一種鑒定調(diào)節(jié)TEM1的血管發(fā)生抑制劑分子的方法，包括使攜帶腫瘤的TEM1轉(zhuǎn)基因小鼠接觸試驗(yàn)分子；并且檢測(cè)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，從而，當(dāng)相對(duì)于沒(méi)有接觸試驗(yàn)分子的小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)，接觸了試驗(yàn)分子的小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)減少時(shí)，將試驗(yàn)分子鑒定為調(diào)節(jié)TEM1的血管發(fā)生抑制劑分子。
這里提供一種鑒定調(diào)節(jié)TEM9的血管發(fā)生抑制劑分子的方法，包括使攜帶腫瘤的TEM9轉(zhuǎn)基因小鼠接觸試驗(yàn)分子；并且檢測(cè)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，從而，當(dāng)相對(duì)于沒(méi)有接觸試驗(yàn)分子的小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)，接觸了試驗(yàn)分子的小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)減少時(shí)，將試驗(yàn)分子鑒定為調(diào)節(jié)TEM9的血管發(fā)生抑制劑分子。
這里提供一種鑒定調(diào)節(jié)TEM17的血管發(fā)生抑制劑分子的方法，包括使攜帶腫瘤的TEM17轉(zhuǎn)基因小鼠接觸試驗(yàn)分子；并且檢測(cè)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，從而，當(dāng)相對(duì)于沒(méi)有接觸試驗(yàn)分子的小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)，接觸了試驗(yàn)分子的小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)減少時(shí)，將試驗(yàn)分子鑒定為調(diào)節(jié)TEM17的血管發(fā)生抑制劑分子。
這里還提供了特異性結(jié)合TEM1的單克隆抗體，或者其生物活性片段，其中抗體由雜交瘤產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，雜交瘤是TEM1-70。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交瘤是TEM1-7。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交瘤是TEM1-38。這里還提供了單克隆抗體，或者其生物活性片段，其中所述抗體包括對(duì)TEM1特異性的抗體的可變區(qū)的相同的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是IgG抗體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，IgG抗體選自由IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4組成的Ig亞類(lèi)中的成員。使用與原氨基酸不同的氨基酸通過(guò)缺失、添加、或取代，能改變抗體重鏈的至少一個(gè)氨基酸。此外，抗體能與抗腫瘤劑或抗血管發(fā)生劑偶聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體抑制血管發(fā)生。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，血管發(fā)生促進(jìn)或引起癌癥。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，血管發(fā)生促進(jìn)或引起多囊性腎病。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，血管發(fā)生促進(jìn)或引起糖尿病視網(wǎng)膜病。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，血管發(fā)生促進(jìn)或引起類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，血管發(fā)生促進(jìn)或引起牛皮癬。在一個(gè)實(shí)施方案中，TEM1-特異性抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)。腫瘤可以是腺癌，白血病，淋巴瘤，黑素瘤，肉瘤，或tetracarcinoma。腫瘤可以是腎上腺，膀胱，骨，骨髓，腦，乳腺，子宮頸，膽囊，神經(jīng)節(jié)，胃腸道，心臟，腎，肝，肺，肌肉，卵巢，胰腺，甲狀旁腺，陰莖，前列腺，唾液腺，皮膚，脾，睪丸，胸腺，甲狀腺，或子宮的癌。
這里提供含有一定量的對(duì)TEM1特異性的單克隆抗體，或者其生物活性片段，和合適的賦形劑的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是TEM1-70。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是TEM1-38。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是TEM1-7。
這里提供雜交瘤株TEM1-70，雜交瘤株TEM1-7，和雜交瘤株TEM1-38。
附圖簡(jiǎn)述

圖1說(shuō)明對(duì)TEM1特異性的人抗體抑制EPC增殖。
本發(fā)明的詳細(xì)描述這里公開(kāi)的方法和組合物涉及內(nèi)皮細(xì)胞體外和體內(nèi)生長(zhǎng)和功能。具體地說(shuō)，這些方法和組合物使用對(duì)于優(yōu)先在腫瘤中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)并且已知是腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物或TEM的內(nèi)皮細(xì)胞上的一亞組表面分子特異性的抗體。因此，這些抗體優(yōu)先導(dǎo)向于與疾病相關(guān)的血管發(fā)生。導(dǎo)向于TEM的抗體分子能通過(guò)至少四種不同的機(jī)理用作內(nèi)皮細(xì)胞活性調(diào)節(jié)劑(例如，作為治療藥物)。首先，抗體通過(guò)調(diào)節(jié)或抑制關(guān)鍵大分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑能直接作用于它的靶細(xì)胞。例如，抗體能結(jié)合關(guān)鍵配體或者其受體并且抑制必需的陽(yáng)性刺激物，或者，誘導(dǎo)陰性信號(hào)(例如，引發(fā)凋亡的陰性信號(hào))。其次，通過(guò)簡(jiǎn)單地結(jié)合其靶或者送遞作為具有治療益處的其偶聯(lián)物，例如放射性核素或有效毒素的生物活性劑，抗體能間接作用于其靶細(xì)胞。第三，抗體能使得免疫系統(tǒng)的其他成分作用于靶細(xì)胞。例如，能使用抗體來(lái)觸發(fā)抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞溶解(CDC)。第四，抗體能具有內(nèi)在的細(xì)胞毒性。
導(dǎo)向于腫瘤血管內(nèi)皮具有幾個(gè)獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。首先，血管內(nèi)皮的腔表面和靜脈內(nèi)施用的藥劑之間有最小的屏障，增強(qiáng)送遞給靶細(xì)胞的效率。其次，少數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞的局部損傷能導(dǎo)致作為內(nèi)皮反應(yīng)性腫脹結(jié)果的血管阻塞并且危害周?chē)膬?nèi)皮細(xì)胞，使得局部損傷實(shí)現(xiàn)更總體的效果。第三，內(nèi)皮細(xì)胞不會(huì)對(duì)抗體產(chǎn)生抗性，允許反復(fù)施用抗體而不降低它的效力。
任何腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物能在這里提供的方法和組合物中用作靶。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)″腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物(TEM)″指優(yōu)先在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的分子。TEMs表達(dá)在正常(非腫瘤)血管上不存在或顯著更低。參見(jiàn)，例如，St.Croix，等，Science 2891197-1202(2000)，美國(guó)系列No.09/918715(公開(kāi)號(hào)No.20030017157)。TEM包括在其半壽期的至少一部分在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的任何類(lèi)型的分子。這樣的分子包括但不限于TEM1，TEM2，TEM3，TEM4，TEM5，TEM6，TEM7，TEM8，TEM9，TEM10，TEM11，TEM12，TEM13，TEM14，TEM15，TEM16，TEM17，TEM18，TEM19，TEM20，TEM21，TEM22，TEM23，TEM24，TEM25，TEM26，TEM27，TEM28，TEM29，TEM30，TEM31，TEM32，TEM33，TEM34，TEM35，TEM36，TEM37，TEM38，TEM39，TEM40，TEM41，TEM42，TEM43，TEM44，TEM45和TEM46。
在一個(gè)實(shí)施方案中，靶分子是TEM1。內(nèi)皮唾液酸蛋白是165kDa的糖蛋白。Rettig，等，Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.8910832-36(1992)，Christian，等，J.Biol.Chem.2767408-14(2001)。St.Croix和colleagues在Science 2891197-1202(2001)中將TEM1的序列鑒定為是內(nèi)皮唾液酸蛋白的序列。TEM1是C-型凝集素樣I型膜蛋白，具有信號(hào)前導(dǎo)肽，五個(gè)球形胞外結(jié)構(gòu)域，接著是粘蛋白樣區(qū)，跨膜片段和短胞質(zhì)尾。N-末端顯示與凝血調(diào)節(jié)蛋白和補(bǔ)體受體ClqRp的同源性，凝血調(diào)節(jié)蛋白是調(diào)節(jié)血液凝固中涉及的受體。Webster，等，J.Leuk.Biol.67109-16(2000)。鼠類(lèi)和人TEM1有77.5％氨基酸同一性，在跨膜區(qū)是100％同一性。Opavsky，等，J.Biol.Chem.27638795-807(2001)。TEM1的信號(hào)序列是氨基酸1-17并且其跨膜結(jié)構(gòu)域是氨基酸686-708。其胞外結(jié)構(gòu)域是殘基1-685。TEM1表達(dá)隨著細(xì)胞密度(或細(xì)胞周期)而變化。Opavsky等，上文(2001)。TEM1在匯合(G0)細(xì)胞中最大表達(dá)，這是體內(nèi)細(xì)胞周期最適合期。美國(guó)系列No.09/918715(公開(kāi)號(hào)No.20030017157)中公開(kāi)TEM1的DNA序列是SEQ ID NO.196。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶分子是TEM17。TEM17是I型膜蛋白，具有位于殘基1-18的信號(hào)序列，與巢蛋白的G1結(jié)構(gòu)域相似的N-末端區(qū)，與plexin同源的100個(gè)氨基酸的區(qū)域，位于427-445殘基的跨膜結(jié)構(gòu)域，和短的胞質(zhì)尾。其胞外區(qū)包括殘基1-426。plexin家族介導(dǎo)細(xì)胞指導(dǎo)指令，提示TEM17可以在該能力中發(fā)揮功能。鼠TEM17與人TEM17具有81％的序列同一性。美國(guó)系列號(hào)No.09/918715(公開(kāi)號(hào)No.20030017157)中公開(kāi)了TEM17的DNA序列是SEQID NO230。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶分子是TEM9。TEM9是分泌素家族七跨膜G-蛋白偶聯(lián)的受體。這種G-蛋白偶聯(lián)受體的同源物既有殘基1-26的信號(hào)序列又有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。N-末端胞外結(jié)構(gòu)域由富亮氨酸重復(fù)(LRR)區(qū)，接著是免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，肽激素受體結(jié)構(gòu)域，和GPCR蛋白水解位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域組成。其胞外區(qū)殘基位于氨基酸1-769，其跨膜結(jié)構(gòu)域是殘基817-829(TM2和TM3)，殘基899-929(TM4和TM5)，和殘基1034-1040(TM6和TM7)?？缒^(qū)與其他分泌素家族蛇根雙堿受體的跨膜區(qū)同源。胞質(zhì)區(qū)的起點(diǎn)包含對(duì)于GPCR-棕櫚?；饔玫湫偷膬蓚€(gè)相鄰的胱氨酸。因此，TEM9是具有作為細(xì)胞粘附蛋白的特征的胞外結(jié)構(gòu)域的G-蛋白偶聯(lián)的受體。小鼠直向同源物在殘基1-29有預(yù)知的信號(hào)肽并且與人TEM9具有87％同源性。美國(guó)系列No.09/918715(公開(kāi)號(hào)No.20030017157)中公開(kāi)了TEM9的DNA序列是SEQ ID NO.212。
在這里提供的方法和組合物中能使用任何特異性抗體。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)″抗體″指包括來(lái)自輕鏈免疫球蛋白分子的至少一個(gè)可變區(qū)和來(lái)自重鏈分子的至少一個(gè)可變區(qū)組合形成靶抗原特異性結(jié)合位點(diǎn)的分子?？贵w能以Fab片段，F(xiàn)(ab′)2片段，單鏈可變區(qū)，或完整抗體分子的形式使用。應(yīng)用本領(lǐng)域公知的方法能產(chǎn)生完整分子的片段，包括酶促消化和重組方法。本發(fā)明方法中有用的片段是生物活性片段。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)″生物活性″指能結(jié)合預(yù)期的抗原表位并且直接或間接發(fā)揮生物作用的抗體或抗體片段。直接作用包括但不限于生長(zhǎng)信號(hào)的抑制，抗凋亡信號(hào)的抑制，激發(fā)凋亡或壞死信號(hào)，啟動(dòng)ADCC級(jí)聯(lián)，和啟動(dòng)CDC級(jí)聯(lián)。間接作用包括但不限于由于偶聯(lián)物送遞導(dǎo)致的毒性(例如，放射性核素，毒素，藥物，或其他生物活性劑)或者對(duì)于第二藥劑的敏化(例如，送遞的藥劑在暴露于另外的物質(zhì)例如射線之后變得有毒性)。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)″特異性″指抗體與靶抗原位點(diǎn)的選擇性結(jié)合。通過(guò)在一組給定條件下比較與適當(dāng)抗原的結(jié)合和與不相關(guān)抗原或抗原混合物的結(jié)合，能對(duì)抗體測(cè)定結(jié)合特異性。與不相關(guān)抗原或抗原混合物相比，如果抗體與適當(dāng)抗原多結(jié)合多至少2，5，7，優(yōu)選10被，則認(rèn)為它是特異性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，特異性抗體是結(jié)合人TEM抗原但是不結(jié)合非人TEM抗原，例如鼠TEM抗原的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，特異性抗體是結(jié)合人TEM抗原但是不結(jié)合與人TEM抗原有70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％或更大氨基酸同源性的非人TEM抗原的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是IgG抗體。例如，抗體是IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4抗體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是對(duì)TEM1有特異性的并且由雜交瘤TEM1-7產(chǎn)生的克隆7。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是對(duì)TEM1有特異性的并且由雜交瘤TEM1-70產(chǎn)生的克隆70。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是對(duì)TEM1有特異性的并且由雜交瘤TEM1-38產(chǎn)生的克隆38。根據(jù)布達(dá)佩斯條約，在2003年5月15日，在國(guó)際專利申請(qǐng)微生物保藏單位國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(AIST Tsukuba Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki，305-8566，日本)保藏了產(chǎn)生克隆7(TEM1-7)，克隆38(TEM1-38)，和克隆70(TEM1-70)的雜交瘤，保藏號(hào)是FERM BP-8380(TEM1-7)，F(xiàn)ERM BP-8381(TEM1-38)，和FERM BP-8382(TEM1-70)。
在本發(fā)明方法和組合物中有用的抗體可以在細(xì)胞培養(yǎng)物中，在噬菌體中，或者在各種動(dòng)物中制備，所述動(dòng)物包括但不限于牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠、羊、狗、貓、猴、黑猩猩、猿。因此本發(fā)明中有用的抗體是哺乳動(dòng)物抗體。能利用噬菌體技術(shù)來(lái)分離最初的抗體或者產(chǎn)生有改變的特異性或親和力特征的變體。這樣的技術(shù)是常規(guī)的本領(lǐng)域公知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)本領(lǐng)域公知的重組方法制備抗體。例如，通過(guò)用包含編碼抗體的序列的載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞能產(chǎn)生重組抗體。能使用一個(gè)或多個(gè)載體來(lái)轉(zhuǎn)染在宿主細(xì)胞中表達(dá)至少一種VL和一種VH區(qū)的DNA序列。舉例描述的抗體產(chǎn)生和制備的重組方法包括Delves，ANTIBODY PRODUCTIONESSENTIAL TECHNIQUES(Wiley，1997)；Shephard，等，MONOCLONAL ANTIBODIES(OxfordUniversity Press，2000)；和Goding，MONOCLONAL ANTIBODIESPRINCIPLES AND PRACTICE(Academic Press，1993)。本發(fā)明方法中使用的抗體能通過(guò)重組方法修飾，來(lái)增強(qiáng)抗體在介導(dǎo)期望的功能中的更大效力。還考慮利用重組方法通過(guò)取代作用來(lái)修飾抗體。典型地，取代作用是保守取代。例如，抗體的恒定區(qū)中至少一個(gè)氨基酸能用不同的殘基置換。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.5,624,821，美國(guó)專利No.6,194,551，申請(qǐng)?zhí)朜o.WO9958572；和Angal，等，Mol.Immunol.30105-08(1993)。氨基酸修飾包括氨基酸的缺失，添加，取代。在某些情況下，進(jìn)行這樣的變化來(lái)減小不期望的活性，例如補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性。
抗體可以是人源化抗體。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)″人源化抗體″指其中改變非抗原結(jié)合區(qū)中的氨基酸序列使得抗體更類(lèi)似于人抗體同時(shí)仍然保留它原來(lái)的抗原特異性的抗體。典型地，可變區(qū)是一種物種例如小鼠的，恒定區(qū)來(lái)源是人?？贵w可以是嵌合抗體。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)″嵌合抗體″指其中改變氨基酸序列使得抗體包含來(lái)自一種以上哺乳動(dòng)物的序列而同時(shí)保留它原來(lái)的抗原特異性的抗體。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)″單鏈可變片段(ScFv)″指由柔性肽接頭連接在一起的免疫球蛋白的可變重鏈(VH)和輕鏈(VL)構(gòu)成的基因工程抗體。
能使用任何形式的抗原產(chǎn)生足以產(chǎn)生生物活性抗體的抗體。因此，激發(fā)抗原可以是單表位，多個(gè)表位，或者單獨(dú)的完整抗原或與本領(lǐng)域公知的一種或多種增強(qiáng)免疫原性的試劑組合。激發(fā)抗原可以是分離的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)，細(xì)胞表面蛋白質(zhì)(例如，使用用抗原的至少一部分轉(zhuǎn)染的細(xì)胞免疫)，或可溶性蛋白質(zhì)(例如，只是用蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域部分免疫)?？梢栽谶z傳修飾的細(xì)胞中產(chǎn)生抗原。編碼抗原的DNA可以是基因組或非基因組的(例如，cDNA)并且編碼胞外結(jié)構(gòu)域的至少一部分。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)″部分″指構(gòu)建感興趣的抗原的免疫原性表位合適的氨基酸或核酸的最小數(shù)目?？梢允褂眠m合用于感興趣的細(xì)胞轉(zhuǎn)化的任何基因載體，包括但不限于腺病毒載體，質(zhì)粒，和非病毒載體，例如陽(yáng)離子脂質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，這里的方法和組合物的抗體特異性結(jié)合感興趣的TEM胞外結(jié)構(gòu)域的至少一部分。
本發(fā)明方法和組合物的抗體可以是單克隆或多克隆的。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)″單克隆抗體″指單一B細(xì)胞產(chǎn)生的單一抗體。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)″多克隆抗體″指具有相同的抗原特異性但是由一種以上B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的單克隆抗體的混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，多克隆抗體包含在包含多個(gè)抗原表位的單一抗原中具有不同的表位特異性、親和性、或親合力的單克隆抗體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，這里提供的抗體是人抗體。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)″人抗體″指其中基本上輕鏈和重鏈序列的完整序列，包括互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)來(lái)自人基因的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)trioma技術(shù)，人B-細(xì)胞技術(shù)(參見(jiàn)，例如，Kozbor，等，Immunol.Today 4；72(1983)，EBV轉(zhuǎn)化技術(shù)(參見(jiàn)，例如，Cole等，MONOCLONAL ANTIBODIES ANDCANCER THERAPY 77-96(1985))，或者利用噬菌體展示(參見(jiàn)，例如，Marks等，J.Mol.Biol.222581(1991))制備單克隆抗體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生人抗體。制備這樣的部分至全部人抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，并且能使用任何這樣的技術(shù)。根據(jù)一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，在經(jīng)基因工程化而表達(dá)人重鏈和輕鏈抗體基因的轉(zhuǎn)基因小鼠中制備全人抗體序列。制備產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠的舉例描述見(jiàn)PCT公開(kāi)No.WO 02/43478。來(lái)自產(chǎn)生期望抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠的B細(xì)胞然后能融合，來(lái)制備雜交瘤細(xì)胞系，用于連續(xù)制備抗體。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.5569825；5625126；5633425；5661016；和5545806；和Jakobovits，Adv.Drug Del.Rev.3133-42(1998)；Green，等，J.Exp.Med.188483-495(1998)。
雙特異性抗體在本發(fā)明方法和組合物中也是有用的。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)“雙特異性抗體”指對(duì)于至少兩種不同的抗原表位有結(jié)合特異性的抗體，一般是單克隆抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，表位來(lái)自相同的抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表位來(lái)自兩種不同的抗原。制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，利用兩種免疫球蛋白重鏈/輕鏈對(duì)的共同表達(dá)能重組制備雙特異性抗體。參見(jiàn)，例如，Milstein等，Nature 305537-39(1983)?；蛘?，利用化學(xué)鍵能制備雙特異性抗體。參見(jiàn)，例如，Hollinger，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.906444-48(1993)，Gruber，等，J.Immunol.1525368(1994)。
雜偶聯(lián)物在本發(fā)明方法和組合物中是有用的。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)“雜偶聯(lián)物抗體”指兩個(gè)共價(jià)連接的抗體。利用合成蛋白質(zhì)化學(xué)，包括利用交聯(lián)劑，能制備這樣的抗體。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.4676980。
這里提供的抗體可以與生物活性劑偶聯(lián)。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)“生物活性劑”指增強(qiáng)或介導(dǎo)期望的生物作用的任何合成的或天然存在的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，期望的生物作用是停滯或細(xì)胞死亡(例如凋亡)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，期望的生物作用來(lái)自使靶細(xì)胞對(duì)誘導(dǎo)停滯或細(xì)胞死亡的第二種試劑敏感的抗體。生物活性劑包括，例如，藥物，例如化療藥物或毒素。它們可以包括細(xì)胞因子，配體，或另一種抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種試劑是抗腫瘤劑。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)″抗腫瘤劑″指通過(guò)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，停滯，細(xì)胞死亡，或壞死而抑制腫瘤生長(zhǎng)的試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種藥物是抗血管發(fā)生劑。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)″抗血管發(fā)生劑″指通過(guò)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，停滯，細(xì)胞死亡，或壞死而抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，遷移，管生成，或者它們的一些組合的試劑。用于與抗體偶聯(lián)的合適的試劑包括細(xì)胞因子，例如白細(xì)胞介素2(IL-2)，干擾素(IFN)，腫瘤壞死因子(TNF)；光敏劑(用于光動(dòng)力學(xué)療法)，包括酞菁四磺酸鋁(III)，血卟啉，和酞菁；放射性核素，例如碘-131(131I)，釔-90(90Y)，鉍-212(212Bi)，鉍-213(213Bi)，锝-99m(99mTc)，錸-186(186Re)，和錸-188(188Re)；抗生素，例如阿霉素，亞德里亞霉素，柔紅霉素，氨甲喋呤，柔毛霉素，新制癌菌素，和卡鉑；細(xì)菌，植物，和其他毒素，如白喉毒素，假單胞菌外毒素A，葡萄球菌腸毒素A，紅豆毒素-A毒素，蓖麻毒素A(去糖基化蓖麻毒素A和天然蓖麻毒素A)，TGF-α毒素，來(lái)自中國(guó)眼鏡蛇(naja naja atra)的細(xì)胞毒素，和gelonin(一種植物毒素)；來(lái)自植物、細(xì)菌和真菌的核糖體滅活蛋白，例如局限曲菌素(局限曲菌Aspergillus restrictus產(chǎn)生的核糖體滅活蛋白)，皂草素(Saponaria officinalis產(chǎn)生的核糖體滅活蛋白)，和RNase；酪氨酸激酶抑制劑；1y207702(二氟化嘌呤核苷)；包含抗腫瘤劑的脂質(zhì)體(例如，反義寡核苷酸，編碼毒素的質(zhì)粒，氨甲喋呤等)；和其他抗體或抗體片段，例如F(ab)。
這里提供的抗體在鑒定本發(fā)明方法的TEMS的存在或表達(dá)的方法中是有用的。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了檢測(cè)TEM多肽的方法，包括使樣品與TEM-特異性抗體接觸足以形成復(fù)合體的時(shí)間，并且檢測(cè)復(fù)合體，如果檢測(cè)到復(fù)合體，則樣品中存在TEM。這樣的分析的例子包括放射免疫分析，ELISAs，免疫化學(xué)，免疫沉淀，和其他公知的免疫分析，參見(jiàn)，例如，USING ANTIBODIESA LABORATORY MANUAL(Harlow，等，編著，1999)。樣品包括但不限于細(xì)胞，蛋白質(zhì)或細(xì)胞的膜提取物，生物流體，例如唾液，血液，血清，血漿，或尿，或者生物學(xué)樣品，例如福爾馬林固定的或冷凍的組織切片。制備這樣的用于分析的樣品的方法是本領(lǐng)域公知的。利用這里公開(kāi)的抗體分析的樣品根據(jù)分析形式，檢測(cè)方法的性質(zhì)，和要分析的組織、細(xì)胞、或細(xì)胞提取物而不同。這樣的制備和變化是本領(lǐng)域公知的。可以利用任何合適的檢測(cè)系統(tǒng)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，能利用這里公開(kāi)的檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)診斷，分階段，或監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展或監(jiān)測(cè)對(duì)治療干預(yù)的反應(yīng)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含進(jìn)行這里提供的方法的分析的必需試劑的試劑盒。具體地說(shuō)，這里提供了包括一個(gè)或多個(gè)容器的具有隔室的試劑盒，其中第一容器包括一種或多種TEM特異性抗體，包括下面一種或多種物質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)其他容器洗滌試劑，能檢測(cè)被結(jié)合抗體的存在的試劑。容器可以是玻璃，塑料，或者塑料或紙條。檢測(cè)試劑類(lèi)型包括標(biāo)記的第二抗體，其他標(biāo)記的第二結(jié)合試劑，或者，如果第一抗體是標(biāo)記的，這是能與被標(biāo)記抗體反應(yīng)的酶促或抗體結(jié)合試劑。
這里提供了抑制細(xì)胞增殖的方法，包括施用有效量的特異性結(jié)合選自腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物(TEM)1和TEM17的人抗體，或者其生物活性片段，從而抗體抑制細(xì)胞增殖?？梢允褂糜糜跍y(cè)定細(xì)胞增殖的所有合適的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制細(xì)胞增殖的方法包括使內(nèi)皮細(xì)胞接觸上述TEM特異性抗體或者其生物活性片段一定時(shí)間，然后測(cè)定相對(duì)于沒(méi)有用抗體處理的細(xì)胞的增殖。
如果相對(duì)于不存在抗體或者存在非結(jié)合抗體的細(xì)胞增殖，抗體抑制了細(xì)胞增殖，則該抗體是增殖抑制性的。利用任何合適的方法可以定量測(cè)定增殖。典型地，通過(guò)評(píng)定摻入到DNA中放射性標(biāo)記的核苷酸(例如，3H-胸苷)來(lái)測(cè)定增殖。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)ATP發(fā)光測(cè)定增殖。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，利用Promega生產(chǎn)的CellTiter-GloTM發(fā)光細(xì)胞存活力測(cè)定法來(lái)確定增殖。如下所述通過(guò)對(duì)組織或?qū)κ茉囌呤┯每贵w也可以抑制細(xì)胞增殖。
阻斷TEM與增強(qiáng)的腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖相關(guān)的功能的抗體對(duì)于惡性疾病產(chǎn)生低水平或不產(chǎn)生循環(huán)內(nèi)皮前體細(xì)胞的受試者是最有利的，因此表明疾病來(lái)源的腫瘤血管很大一部分來(lái)自共同選擇存在的血管上的內(nèi)皮細(xì)胞增殖。阻斷TEM與增強(qiáng)的腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖相關(guān)的功能還能使受試者受到腫瘤負(fù)荷相對(duì)低的益處，因?yàn)槟[瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制導(dǎo)致對(duì)治療的動(dòng)力學(xué)慢反應(yīng)。
這里提供了抑制細(xì)胞遷移的方法，包括施用有效量的與選自TEM1，TEM17，和TEM9的抗原特異性結(jié)合的人抗體，或者其生物活性片段，從而抗體抑制細(xì)胞遷移?？梢耘c本發(fā)明方法一起使用所有合適的評(píng)定細(xì)胞遷移的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制細(xì)胞遷移的方法包括以下步驟在沒(méi)有化學(xué)引誘劑的一個(gè)腔室中讓內(nèi)皮細(xì)胞與如上所述的TEM特異性抗體或者其生物活性片段接觸，在通過(guò)多孔膜與第二個(gè)腔室分開(kāi)的腔室內(nèi)用化學(xué)引誘劑溫育內(nèi)皮細(xì)胞和抗體，測(cè)定存在或不存在抗體時(shí)進(jìn)入有化學(xué)引誘劑腔室的細(xì)胞數(shù)，當(dāng)不存在抗體時(shí)遷移的細(xì)胞的數(shù)目大于存在抗體時(shí)遷移的細(xì)胞數(shù)時(shí)，抗體對(duì)于遷移是抑制性的。
如果存在抗體時(shí)的遷移細(xì)胞數(shù)相對(duì)于不存在抗體或存在非結(jié)合抗體或其他不相關(guān)抗體時(shí)的細(xì)胞遷移更少，則抗體對(duì)于遷移是抑制性的。利用任何合適的方法可以定量測(cè)定遷移。典型地，通過(guò)評(píng)估有化學(xué)引誘劑的腔室中的細(xì)胞數(shù)對(duì)保留在原腔室中的細(xì)胞數(shù)來(lái)測(cè)定遷移。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)廠商說(shuō)明，用PKH67綠染料預(yù)先標(biāo)記細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用鈣黃綠素AM標(biāo)記細(xì)胞。溫育之后，用熒光反相顯微鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞。如下所述對(duì)組織或?qū)κ茉囌呤┯每贵w也可以抑制遷移。
阻斷TEM與增強(qiáng)的腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞遷移相關(guān)的功能的抗體對(duì)于惡性疾病生長(zhǎng)相對(duì)緩慢或無(wú)痛和/或有已知的轉(zhuǎn)移病灶的受試者是最有利的，因?yàn)檫@些患者的病灶中血管形成最可能是由于來(lái)自骨髓的內(nèi)皮前體細(xì)胞以及來(lái)自疾病的正常組織部位的內(nèi)皮細(xì)胞，這樣需要內(nèi)皮細(xì)胞遷移作為主要功能。
這里還提供了抑制內(nèi)皮管形成的方法，包括施用有效量的與選自TEM1和TEM17的抗原特異性結(jié)合的人抗體，或者其生物活性片段，從而抗體抑制內(nèi)皮管形成。評(píng)價(jià)管形成的所有合適的方法可以用于這里的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制細(xì)胞內(nèi)皮管形成的方法包括在合適基質(zhì)存在下，使內(nèi)皮細(xì)胞接觸如上所述的TEM特異性抗體或其生物活性片段，在基質(zhì)中溫育內(nèi)皮細(xì)胞和抗體，評(píng)價(jià)小管形成的步驟，其中當(dāng)不存在抗體時(shí)形成的小管的數(shù)目或小管的特征相對(duì)于存在抗體下小管數(shù)目或小管的特征更大或者顯著改變，則抗體對(duì)于小管形成是抑制性的。
如果相對(duì)于不存在抗體或者存在非結(jié)合抗體形成的小管的數(shù)目，存在抗體時(shí)形成的小管的數(shù)目更少，則抗體對(duì)于小管形成是抑制性的。如果相對(duì)于不存在抗體或者存在非結(jié)合抗體形成的小管的特征，存在抗體時(shí)形成的小管的特征改變，則抗體對(duì)于小管形成是抑制性的。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)″小管的特征″指基質(zhì)中形成的小管網(wǎng)絡(luò)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。利用任何合適的方法可以定量測(cè)定小管形成。典型地，通過(guò)顯微鏡評(píng)價(jià)管形成。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)廠商說(shuō)明，用PKH67綠染料預(yù)先標(biāo)記細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用鈣黃綠素AM標(biāo)記細(xì)胞。在基質(zhì)中有或沒(méi)有抗體存在下溫育之后，用熒光反相顯微鏡檢查小管。如下所述通過(guò)對(duì)組織或受試者施用抗體也可以抑制細(xì)胞小管形成。
阻斷TEMs與腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增強(qiáng)的管形成相關(guān)的功能對(duì)于其惡性疾病產(chǎn)生高循環(huán)水平內(nèi)皮前體細(xì)胞的患者是最有利的，因此表明他們疾病的腫瘤血管大部分源自循環(huán)內(nèi)皮前體細(xì)胞建立的血管發(fā)育。阻斷TEMs與腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增強(qiáng)的管形成相關(guān)的功能也有利于相對(duì)快速生長(zhǎng)腫瘤的患者，其中血管發(fā)生的破壞或抑制阻斷腫塊的繼續(xù)擴(kuò)大。
在抑制血管發(fā)生、增殖、遷移和/或內(nèi)皮小管形成的方法中，表達(dá)感興趣的TEM的任何細(xì)胞能被誘導(dǎo)表達(dá)感興趣的TEM，或者表達(dá)非人TEM同源物(例如，鼠，牛等等)。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞是內(nèi)源表達(dá)感興趣的TEM的細(xì)胞系。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，細(xì)胞系是鼠2H11內(nèi)皮細(xì)胞系(ATCC)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)感興趣的TEM。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，細(xì)胞是在堿性FGF(bFGF)，VEGF，和肝素存在下培養(yǎng)產(chǎn)生內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPC′s)的AC133+/CD34+人骨髓細(xì)胞，如實(shí)施例1所述。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用感興趣的TEM轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，用編碼感興趣的TEM的腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)或者人微血管內(nèi)皮細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用編碼感興趣的TEM的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS或293細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，TEM-表達(dá)細(xì)胞可以接觸生長(zhǎng)因子或其他細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。例如，使用在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)三天的人HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞或人HT29結(jié)腸癌細(xì)胞的匯合培養(yǎng)物制備結(jié)腸癌條件培養(yǎng)基。用于補(bǔ)充培養(yǎng)基的因子包括VEGF和bFGF。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞來(lái)自或者是人或獸醫(yī)受試者。
TEM-表達(dá)細(xì)胞能以任何合適的方式接觸抗體任何合適長(zhǎng)短的時(shí)間。在溫育或處理期間細(xì)胞可以接觸抗體一次以上。典型地，要求劑量在大約1微克/毫升至1000微克/毫升范圍內(nèi)，更典型地在100微克/毫升至800微克/毫升范圍內(nèi)。由細(xì)胞的體外培養(yǎng)物和使細(xì)胞暴露于不同劑量的抗體能容易地確定精確劑量。典型地，細(xì)胞接觸抗體的時(shí)間是1小時(shí)至三天，更典型地24小時(shí)?？梢允褂萌魏魏线m的培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基是重配的基底膜MatrigelTM基質(zhì)(BDSciences)。
這里提供了抑制血管發(fā)生的方法，包括對(duì)需要的受試者施用有效量的與選自TEM1，TEM17，和TEM9的抗原特異性結(jié)合的人抗體或其生物活性片段，從而抗體抑制血管發(fā)生。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)″血管發(fā)生″指血管發(fā)育。血管可以是已經(jīng)存在的血管或新血管。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)″新血管發(fā)生″指發(fā)育新血管。
此外，這里提供了抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法，包括對(duì)需要的受試者施用有效量的與選自TEM1，TEM17，和TEM9的抗原特異性結(jié)合的人抗體或其生物活性片段，從而抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)。
接受這些方法治療的受試者表達(dá)感興趣的TEM抗原。在開(kāi)始用TEM-特異性治療處理之前對(duì)患者樣品進(jìn)行篩選或診斷分析。使用任何樣品可以進(jìn)行這樣的使用本發(fā)明抗體的診斷分析，包括但不限于細(xì)胞，蛋白質(zhì)，或細(xì)胞的膜提取物，生物流體，例如痰、血液、血清、血漿、或尿，或生物樣品，例如福爾馬林固定的或冷凍組織切片。可以利用檢測(cè)和分析TEM表達(dá)的任何合適的方法。
用這里提供的方法和組合物能治療任何受試者。這樣的受試者是患有與血管發(fā)生相關(guān)的疾病或癥狀的哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，受試者患有癌癥。也包括公開(kāi)的方法和組合物的獸醫(yī)應(yīng)用。這樣的應(yīng)用包括對(duì)馴養(yǎng)動(dòng)物、牲畜和純種馬的血管發(fā)生相關(guān)疾病和癌癥的治療。
如這里使用的，″抑制″或″治療″或″處理″包括延遲產(chǎn)生與不受控制的血管發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)的癥狀和/或減小將要產(chǎn)生或預(yù)期產(chǎn)生的所述癥狀的嚴(yán)重程度。這些術(shù)語(yǔ)進(jìn)一步包括減輕存在的不受控制的或不期望的血管發(fā)生-相關(guān)或腫瘤生長(zhǎng)-相關(guān)癥狀，預(yù)防其它癥狀，和減輕或防止癥狀的潛在代謝原因。因此，這些術(shù)語(yǔ)指明有益結(jié)果已經(jīng)賦予給有血管發(fā)生-相關(guān)疾病或癥狀特別是癌癥，或者有可能產(chǎn)生這樣的疾病或癥狀的脊椎動(dòng)物受試者。
如這里使用的，術(shù)語(yǔ)″治療有效量″或″有效量″指當(dāng)單獨(dú)或與另外的治療劑聯(lián)合對(duì)細(xì)胞、組織或受試者施用時(shí)有效防止或減輕血管發(fā)生-和/或腫瘤-相關(guān)疾病狀況或疾病進(jìn)展的抗-TEM抗體的量。治療有效量進(jìn)一步指足以導(dǎo)致癥狀減輕，例如相關(guān)醫(yī)學(xué)狀況的治療、治愈、防止或減輕，或者足以導(dǎo)致這樣的病癥的治療、治愈、防止或減輕的比例增大的化合物的量。當(dāng)指施用給個(gè)體單獨(dú)的活性成分時(shí)，治療有效劑量指單獨(dú)的該成分。當(dāng)指聯(lián)合給藥的情況時(shí)，治療有效劑量指產(chǎn)生治療作用的活性成分的合并量，不管是聯(lián)合，順序或同時(shí)給藥。
可以以治療或減輕各種病癥的劑量，以其本身，或者以混合有合適的載體或賦形劑的藥物組合物對(duì)需要的受試者施用本發(fā)明方法中使用的抗體(不管產(chǎn)生的來(lái)源是什么，包括但不限于重組和非重組來(lái)源)。這樣的組合物還可以含有(除了蛋白質(zhì)和載體之外)稀釋劑，填料，鹽，緩沖劑，穩(wěn)定劑，增溶劑，和本領(lǐng)域公知的其他材料。術(shù)語(yǔ)″藥學(xué)可接受的″意思是不干擾活性成分生活活性效力的無(wú)毒材料。載體的特征取決于給藥途徑。本發(fā)明的藥物組合物還可以含有其他抗-血管發(fā)生和抗-腫瘤藥物，例如細(xì)胞因子或化療劑。
在實(shí)施這里提供的治療方法或應(yīng)用時(shí)，對(duì)具有要治療的狀況的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的這里提供的抗體。根據(jù)本發(fā)明方法，可以單獨(dú)地或與其他治療方法聯(lián)合施用抗體，所述其他治療方法例如使用其他造血因子(例如細(xì)胞因子)，化療劑，抗-血管發(fā)生劑等的治療。當(dāng)與一種或多種生物活性劑共同給藥時(shí)，這里提供的抗體可以與生物活性劑同時(shí)或順序給藥。如果順序給藥，主治醫(yī)師會(huì)決定與生物活性劑聯(lián)合施用本發(fā)明蛋白質(zhì)的合適的順序。通過(guò)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序，例如用于測(cè)定LD50(使50％人群致死的劑量)和ED50(在50％人群中治療有效的劑量)，能確定這樣的化合物的毒性和治療功效。毒性和治療效果之間的劑量比例是治療指數(shù)，并且它可以表示為L(zhǎng)D50和ED50之間的比值。具有高治療指數(shù)的抗體是優(yōu)選的。在配制對(duì)人使用的劑量范圍中可以使用從這些細(xì)胞培養(yǎng)分析和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)。這樣的化合物的劑量?jī)?yōu)選在循環(huán)濃度范圍之內(nèi)，包括幾乎沒(méi)有或沒(méi)有毒性的ED50。根據(jù)使用的劑型和利用的給藥途徑，劑量可以在這個(gè)范圍內(nèi)變化。各醫(yī)生根據(jù)患者的狀況能選擇制劑，給藥途徑和劑量。參見(jiàn)，例如，F(xiàn)ingl等，THE PHARMACOLOGICAL BASIS OFTHERAPEUTICS 1(1975)?？梢苑謩e判斷劑量和間隔，提供足以保持期望的治療效果或者最小的有效濃度(MEC)的活性部分的血漿濃度。MEC對(duì)于各種化合物是不同的但是能從體外數(shù)據(jù)估計(jì)；例如，利用這里描述的分析實(shí)現(xiàn)遷移活性50-90％抑制必需的濃度。
給藥方式不是特別重要的。在一個(gè)實(shí)施方案中，給藥方式是靜脈內(nèi)快速濃注。處方醫(yī)師會(huì)正常地確定這里提供的抗體的劑量。預(yù)期給藥劑量將根據(jù)各患者的年齡、體重和反應(yīng)而不同。
本發(fā)明方法的抗體的配制和給藥技術(shù)參見(jiàn)REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，最新版。合適的給藥途徑例如包括口服、直腸、經(jīng)粘膜、或腸內(nèi)給藥；腸胃外送遞，包括肌內(nèi)、皮下、髓內(nèi)注射，以及鞘內(nèi)，直接腦室內(nèi)，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，鼻內(nèi)，或眼內(nèi)注射。能以各種常規(guī)途徑實(shí)現(xiàn)藥物組合物中使用的抗體的給藥或者實(shí)施本發(fā)明方法，例如口服攝取，吸入，局部施用或皮膚施用、皮下、腹膜內(nèi)、腸胃外、動(dòng)脈內(nèi)或靜脈內(nèi)注射。對(duì)患者靜脈內(nèi)給藥是優(yōu)選的。
或者，可以以局部而不是全身方式施用抗體，例如，通過(guò)對(duì)關(guān)節(jié)、纖維變性組織、或腫瘤中直接注射抗體，經(jīng)常是以貯存或持續(xù)釋放制劑形式。此外，可以在定向藥物送遞系統(tǒng)中施用抗體，例如，在組織-特異性抗體包被的脂質(zhì)體中，定向于，例如，關(guān)節(jié)或纖維變性組織或腫瘤。脂質(zhì)體定向于受損組織并且被受損組織選擇性攝取。
因此，利用一種或多種生理學(xué)可接受載體，包括有利于將活性化合物加工成能藥學(xué)使用的制劑的賦形劑和輔助物質(zhì)，用常規(guī)方法可以配制根據(jù)本發(fā)明方法使用的藥物組合物。這些藥物組合物可以以本身已知的方法制備，例如，利用常規(guī)混合，溶解，造粒，制成糖衣丸，磨細(xì)，乳化，制成膠囊，捕獲或凍干方法。合適的制劑取決于選擇的給藥途徑。當(dāng)以液體形式給藥時(shí)，可以加入液體載體，例如水、石油、動(dòng)物或植物來(lái)源的油，例如花生油，礦物油，大豆油，或芝麻油，或者合成油。液體形式的藥物組合物可以進(jìn)一步含有生理鹽水溶液，葡萄糖或其他糖溶液，或者二醇類(lèi)，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。當(dāng)以液體形式給藥時(shí)，藥物組合物含有大約0.5至90重量％的本發(fā)明蛋白質(zhì)，優(yōu)選大約1至50重量％的本發(fā)明蛋白質(zhì)。
當(dāng)通過(guò)靜脈內(nèi)，皮膚或皮下注射施用此處的方法中的治療有效量的抗體時(shí)，本發(fā)明的蛋白質(zhì)是無(wú)熱源的腸胃外可接受的水溶液形式。這樣的腸胃外可接受的蛋白質(zhì)溶液的制備，有關(guān)pH，等滲性，穩(wěn)定性等等，在本領(lǐng)域技術(shù)人員知識(shí)內(nèi)。用于靜脈內(nèi)，皮膚或皮下注射的優(yōu)選的藥物組合物除了本發(fā)明的蛋白質(zhì)之外，還應(yīng)該含有等滲賦形劑，例如氯化鈉注射液，林格氏注射液，葡萄糖注射液，葡萄糖和氯化鈉注射液，乳酸林格氏注射液，或者本領(lǐng)域公知的其他賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物還可以含有穩(wěn)定劑，防腐劑，緩沖液，抗氧化劑，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他添加劑。對(duì)于注射，可以在水溶液中，優(yōu)選在生理相容性緩沖液中，例如Hanks′溶液，林格氏溶液，或生理鹽水緩沖液中配制本發(fā)明的試劑。對(duì)于經(jīng)粘膜給藥，制劑中使用適合要滲透的屏障的滲透劑。這樣的滲透劑在本領(lǐng)域一般是公知的。
對(duì)于吸入給藥，一般以氣溶膠噴霧劑形式從加壓包或霧化器方便地送遞根據(jù)本發(fā)明方法使用的抗體，其中使用合適的推進(jìn)劑，例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或者其他合適的氣體。在加壓氣溶膠情況下，通過(guò)提供閥門(mén)以送遞經(jīng)計(jì)量的量，可以確定劑量單位?？梢耘渲坪谢衔锖秃线m的粉末基質(zhì)例如乳糖或淀粉的粉末混合物的在吸入器或吹入器中使用的例如明膠的膠囊和藥筒?？梢詫⒒衔锱渲瞥赏ㄟ^(guò)注射給藥的腸胃外給藥劑型，例如，通過(guò)快速濃注或連續(xù)輸注。用于注射的制劑可以以單位劑型存在，例如以安瓿或多劑量容器存在，加有防腐劑。組合物可以是下面的形式如油性或含水賦形劑中的懸浮液，溶液或乳狀液，并且可以含有配制試劑，例如懸浮劑，穩(wěn)定劑和/或分散劑。
用于腸胃外給藥的藥物制劑包括水溶形式的活性化合物的水溶液。另外，可以將活性化合物懸浮液制備成合適的油性注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或賦形劑包括脂肪油，例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂質(zhì)體。含水注射懸浮液可以含有提高懸浮液粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉，山梨糖醇，或葡聚糖。任選地，懸浮液還可以含有合適的穩(wěn)定劑或提高化合物的溶解度使得可制備高濃縮溶液的試劑?；蛘撸钚猿煞挚梢允怯糜谠谑褂们坝煤线m的賦形劑例如無(wú)菌無(wú)熱源水配制的粉末形式。
本發(fā)明公開(kāi)的方法中用于藥物組合物中的抗體的量取決于要治療的狀況的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，和取決于患者接受治療之前的狀況。總之，主治醫(yī)師決定用來(lái)治療各個(gè)患者的本發(fā)明蛋白質(zhì)的量。開(kāi)始時(shí)，主治醫(yī)師施用低劑量的本發(fā)明方法的抗體并且觀察患者反應(yīng)?？梢允┯酶髣┝康谋景l(fā)明的抗體直到獲得對(duì)患者的最佳治療效果，在這一點(diǎn)劑量不再增加?？紤]用來(lái)實(shí)施本發(fā)明方法的各種藥物組合物應(yīng)該含有大約0.01微克至大約100毫克(優(yōu)選大約0.1微克至大約10毫克，更優(yōu)選大約0.1微克至大約1毫克)本發(fā)明抗體/千克體重。當(dāng)給藥時(shí)，本發(fā)明中使用的治療組合物當(dāng)然是無(wú)熱源的生理可接受形式。上述組合物中還可以任選地包括本發(fā)明方法的抗體之外的治療上有用的試劑，可以兩者選其一地或另外地，同時(shí)或順序地和本發(fā)明方法中的組合物一起給藥。
這里提供的抗體可以單獨(dú)地給藥或者與其他治療方式聯(lián)合給藥。例如，治療方法可以進(jìn)一步包括對(duì)接觸抗體的細(xì)胞送遞電離輻射的步驟。根據(jù)測(cè)定存活?lèi)盒约?xì)胞的分析判斷，以足以誘導(dǎo)相當(dāng)大程度的惡性增殖細(xì)胞中細(xì)胞殺傷的量給與電離輻射。誘導(dǎo)的細(xì)胞殺傷程度顯著大于單獨(dú)的抗體或單獨(dú)的電離輻射誘導(dǎo)的程度。電離輻射的典型形式包括β射線，γ射線，α粒子，和X-射線。這些可以從外部源，例如X-射線機(jī)器或γ照相機(jī)給與，或者從對(duì)患者施用的放射性核素送遞給惡性組織。放射性核素的使用是本領(lǐng)域公知的，不需要進(jìn)一步詳述。例如，S.Hellman，Principles of Radiation Therapy，CANCERPRINCIPLES&PRACTICE OF ONCOLOGY 248(V.T.DeVita，Jr.，等，編著，第四版，1993)中描述了電離輻射在惡性腫瘤的治療中的應(yīng)用?？梢允褂玫膭┝糠秶诖蠹s1和500cGy之間(即，大約1至大約500rads)。
利用這里公開(kāi)的方法，這里提供的抗體可以單獨(dú)使用或者與鑒定為內(nèi)皮細(xì)胞增殖，遷移，和/或小管形成的抑制劑的其他抗體聯(lián)合施用。共同施用的抗體對(duì)于相同的TEM的不同表位，不同的TEM，或者TEM和另一種血管發(fā)生-抑制或抗腫瘤靶是特異性的。
利用本發(fā)明方法能治療涉及血管發(fā)生的任何疾病。這樣的疾病包括但不限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，星形細(xì)胞瘤，少突膠質(zhì)瘤，室管膜和脈絡(luò)叢腫瘤，松果體腫瘤，神經(jīng)元腫瘤，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，神經(jīng)鞘瘤，腦膜瘤，腦膜肉瘤；眼部腫瘤基底細(xì)胞癌，鱗狀細(xì)胞癌，黑素瘤，橫紋肌肉瘤，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤；內(nèi)分泌腺腫瘤垂體瘤，甲狀腺瘤，腎上腺皮質(zhì)腫瘤，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，胃腸胰腺內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，生殖腺腫瘤；頭頸腫瘤頭頸癌，口腔，咽，喉，牙原性腫瘤胸部腫瘤大細(xì)胞肺癌，小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌，胸部腫瘤，惡性間皮瘤，胸腺瘤，胸部原發(fā)生殖細(xì)胞腫瘤；消化道腫瘤食管腫瘤，胃腫瘤，肝腫瘤，膽囊腫瘤，外分泌胰腺腫瘤，小腸腫瘤，蠕蟲(chóng)樣闌尾和腹膜，結(jié)腸和直腸腺癌，肛門(mén)腫瘤；泌尿生殖道腫瘤腎細(xì)胞癌，腎盂和輸尿管腫瘤，膀胱腫瘤，尿道腫瘤，前列腺腫瘤，陰莖腫瘤，睪丸腫瘤；女性生殖器官腫瘤外陰和陰道腫瘤，子宮頸腫瘤，子宮體腺癌，卵巢癌，婦科肉瘤；乳腺腫瘤；皮膚腫瘤基底細(xì)胞癌，鱗癌，皮膚纖維肉瘤，Merkel細(xì)胞腫瘤；惡性黑素瘤；骨和軟組織腫瘤成骨肉瘤，惡性纖維性組織細(xì)胞瘤，軟骨肉瘤，尤因氏肉瘤，原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤，血管肉瘤；造血系統(tǒng)腫瘤骨髓發(fā)育不良綜合征，急性髓細(xì)胞白血病，慢性髓細(xì)胞白血病，急性淋巴細(xì)胞白血病，HTLV-1，和T-細(xì)胞白血病/淋巴瘤，慢性淋巴細(xì)胞白血病，毛細(xì)胞白血病，何杰金氏病，非何杰金氏淋巴瘤，肥大細(xì)胞白血??；兒童腫瘤急性成淋巴細(xì)胞白血病，急性髓細(xì)胞白血病，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，骨腫瘤，橫紋肌肉瘤，淋巴瘤，腎和肝腫瘤。其他疾病包括多囊性腎??；糖尿病視網(wǎng)膜??；類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；牛皮癬；骨關(guān)節(jié)炎；聽(tīng)神經(jīng)瘤，神經(jīng)纖維瘤，沙眼和生膿性肉芽腫；黃斑變性；早發(fā)視網(wǎng)膜??；角膜移植排異；新血管青光眼和晶狀體后纖維組織增生。與血管發(fā)生相關(guān)的其他疾病包括但不限于，流行性角膜結(jié)膜炎，維生素A缺乏，特應(yīng)性角膜炎，上緣角膜炎，翼狀胬肉干燥性角膜炎，干燥綜合征，phylectenulosis，梅毒，分支桿菌感染，脂變性，化學(xué)損傷，細(xì)菌性潰瘍，真菌性潰瘍，單純皰疹感染，帶狀皰疹感染，原蟲(chóng)感染，卡波西肉瘤，角膜侵蝕性潰瘍，Terrien′s邊緣變性，邊緣角質(zhì)層分離，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，多動(dòng)脈炎，創(chuàng)傷，Wegeners肉樣瘤病，鞏膜炎，斯約二氏病，類(lèi)天皰瘡放射狀角膜切開(kāi)術(shù)，角膜圖形排斥，和慢性炎癥。
這里提供的方法作為血管抑制和血管發(fā)生的生物測(cè)定也具有重要的非臨床應(yīng)用。通過(guò)在血管發(fā)生測(cè)定中提供陽(yáng)性和陰性對(duì)照物，可以利用該方法檢查和表征候選抗-血管發(fā)生分子的功效，同時(shí)評(píng)價(jià)對(duì)正常血管發(fā)生的可能的毒性作用。
抗-血管發(fā)生分子是減少或消除血管發(fā)生的那些分子。這樣的抑制作用通過(guò)導(dǎo)致抗-血管發(fā)生信號(hào)，空間位阻，減少的細(xì)胞表面表達(dá)等的TEM蛋白質(zhì)的一種或多種關(guān)鍵結(jié)合殘基的直接結(jié)合能產(chǎn)生。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)″抗-血管發(fā)生分子″包括蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑是小分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑是蛋白質(zhì)。
這里提供了鑒定調(diào)節(jié)TEM蛋白質(zhì)的血管發(fā)生抑制劑分子的方法，包括使攜帶腫瘤的TEM-轉(zhuǎn)基因小鼠接觸試驗(yàn)分子；并且測(cè)定腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，當(dāng)接觸試驗(yàn)分子的小鼠的腫瘤生長(zhǎng)相對(duì)于沒(méi)有接觸試驗(yàn)分子的小鼠的腫瘤生長(zhǎng)被減少時(shí)，鑒定該試驗(yàn)分子是調(diào)節(jié)TEM蛋白質(zhì)或活性的血管發(fā)生抑制劑分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，TEM是TEM1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，TEM是TEM9。在另一個(gè)實(shí)施方案中，TEM是TEM17。
利用常規(guī)轉(zhuǎn)基因方法產(chǎn)生TEM轉(zhuǎn)基因小鼠。在一個(gè)實(shí)施方案中，RPCI11-867G23 BAC克隆(GenBank登記號(hào)No.AP001107 InvitrogenCorp.)中的人TEM1cDNA是轉(zhuǎn)基因。通過(guò)YS New Technology Institute，Inc.實(shí)施對(duì)C57B1/6小鼠胚胎的注射。得到的TEM1轉(zhuǎn)基因小鼠然后與C57B1/6小鼠(Japan SLC，Inc.)雜交，得到另外的轉(zhuǎn)基因后代。
可以以任何合適的方式對(duì)任何合適的腫瘤注射，提供分析抗-血管發(fā)生分子的模型。腫瘤的鼠受者可以是任何合適的株。腫瘤可以是對(duì)腫瘤同基因，同種異基因，或異種的。受者可以是在一個(gè)或多個(gè)免疫相關(guān)功能中是有免疫能力的或者免疫受損的，包括但不限于nu/nu，scid，和beige小鼠。在一個(gè)實(shí)施方案中，受者是轉(zhuǎn)基因小鼠。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因小鼠是帶有人TEM1轉(zhuǎn)基因的C57B1/6小鼠。人TEM1轉(zhuǎn)基因包括RPCI11-867G23 BAC克隆(GenBank登記No.AP001107，Invitrogen Corp.)中TEM1的DNA序列。然后利用本領(lǐng)域常規(guī)方法將TEM1轉(zhuǎn)基因注射到C57BL/6小鼠胚胎中。TEM1轉(zhuǎn)基因小鼠然后與非轉(zhuǎn)基因的相同株的小鼠雜交，增加轉(zhuǎn)基因后代的數(shù)目。用同基因腫瘤細(xì)胞例如B16黑素瘤(ATCC)對(duì)TEM1轉(zhuǎn)基因小鼠接種。利用常規(guī)方法通過(guò)定量測(cè)定原發(fā)或轉(zhuǎn)移腫瘤生長(zhǎng)能確定施用抗體對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的效果。至少一次給藥中，抗體劑量的范圍是1微克/小鼠至1毫克/小鼠?？贵w可以通過(guò)任何合適的途徑給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體的劑量是100微克/小鼠，每周兩次。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，在第0天，對(duì)C57B1/6人TEM1轉(zhuǎn)基因小鼠皮下注射B16黑素瘤腫瘤，并且在指定的時(shí)間點(diǎn)通過(guò)使用卡鉗測(cè)量原發(fā)腫瘤體積?？梢允褂萌魏魏线m的對(duì)照抗體。在一個(gè)例子中，對(duì)照抗體是產(chǎn)生抗半抗原二硝基苯的純化的IgG1同位型對(duì)照抗體。
利用這里提供的方法可以鑒定各種不同的試驗(yàn)抗-血管發(fā)生分子。抗-血管發(fā)生分子涉及多種化學(xué)種類(lèi)。在一些實(shí)施方案中，它們是有機(jī)分子，優(yōu)選具有大于50小于大約2500道爾頓分子量的小有機(jī)化合物?？?血管發(fā)生分子可以帶有與蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)相互作用所必需的官能團(tuán)，特別是氫鍵，并且可以包括至少一個(gè)胺基，羰基，羥基或羧基，優(yōu)選至少兩個(gè)化學(xué)官能團(tuán)?？?血管發(fā)生分子可以帶有被一個(gè)或多個(gè)上述官能團(tuán)取代的環(huán)狀碳或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳香或多芳香結(jié)構(gòu)?？?血管發(fā)生分子還包括生物分子，如肽，糖，脂肪酸，甾族化合物，嘌呤，嘧啶，衍生物，結(jié)構(gòu)類(lèi)似物或者其組合。感興趣的試驗(yàn)抗-血管發(fā)生分子還包括肽和蛋白質(zhì)試劑，例如抗體或者其結(jié)合片段或模擬物，例如，F(xiàn)v，F(xiàn)(ab′)2和Fab。
試驗(yàn)抗-血管發(fā)生分子還可以從各種各樣的來(lái)源獲得，包括合成的或天然化合物文庫(kù)。例如，對(duì)于各種各樣的有機(jī)化合物和生物分子的隨機(jī)和直接合成有多種方法，包括隨機(jī)化寡核苷酸和寡肽的表達(dá)?；蛘撸?xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式的天然化合物文庫(kù)是可獲得的或者容易制備。另外，天然或合成制備的文庫(kù)容易通過(guò)常規(guī)化學(xué)、物理和生物化學(xué)方法修飾，并且可以用來(lái)制備組合庫(kù)。可以對(duì)已知的試劑進(jìn)行直接或隨機(jī)化學(xué)修飾，例如?；饔?，烷基化作用，酯化作用，酰胺化作用等，來(lái)制備結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。
當(dāng)能特異性抑制腫瘤生長(zhǎng)至少20％，經(jīng)常30，40，50，60，70，80或90％，有時(shí)100％時(shí)，試驗(yàn)抗-血管發(fā)生分子被鑒定為是一種抑制劑。利用常規(guī)測(cè)定方法能定量測(cè)定生長(zhǎng)抑制作用。例如，對(duì)于原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)，對(duì)腫塊垂直測(cè)量來(lái)計(jì)算腫瘤體積。根據(jù)需要，通過(guò)顯微鏡或肉眼觀察能確定轉(zhuǎn)移灶生長(zhǎng)。對(duì)于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來(lái)說(shuō)，腫瘤可以是同基因、同種異基因，或異種的?？梢栽谀[瘤接種的時(shí)候，原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)確立之后，或者局部和/或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移確立之后施用試驗(yàn)抗-血管發(fā)生分子。利用任何常規(guī)給藥方式能一次或多次施用試驗(yàn)分子，包括但不限于靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，瘤內(nèi)，皮下和真皮內(nèi)給藥。
下面的實(shí)施例是為了詳細(xì)說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPC′s)在纖連蛋白或膠原單層培養(yǎng)物中，用VEGF，bFGF和肝素刺激表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞系標(biāo)記物AC133和CD34的骨髓細(xì)胞分化成描述為內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPCs)的表型。簡(jiǎn)要地說(shuō)，為了將骨髓細(xì)胞分化成EPC′s，利用常規(guī)方法分離AC133+/CD34+骨髓細(xì)胞群。在懸浮培養(yǎng)物中，在補(bǔ)充有15％FBS的IMDM培養(yǎng)基中用50ng/ml VEGF165，10-50ng/ml bFGF，和50ng/ml肝素刺激AC133+/CD34+細(xì)胞。細(xì)胞發(fā)生快速增殖和分化。然后在檢查T(mén)EM功能的體外分析中使用得到的粘附細(xì)胞群。這些EPCs可以在培養(yǎng)物中擴(kuò)增超過(guò)十二代并且表現(xiàn)出是來(lái)自骨髓的干細(xì)胞和完全分化的內(nèi)皮細(xì)胞之間的中間群體。這些EPCs的表征表明它們具有很多與成熟內(nèi)皮細(xì)胞例如HMVECs和HUVECs相同的性質(zhì)。在體外，EPCs在Matrigel上能形成管，遷移和侵入，這是腫瘤微環(huán)境中新血管發(fā)生的重要性質(zhì)。進(jìn)行EPCs的SAGE分析，比較刺激(+VEGF)和非刺激(-VEGF)條件下的基因表達(dá)，觀察顯著差異。在體內(nèi)，在免疫缺陷小鼠的Matrigel塞中植入人EPCs從而允許建立小鼠內(nèi)人內(nèi)皮血管發(fā)生模型時(shí)，人EPCs能形成管。根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)EPCs以類(lèi)似于HUVEC和HMVEC的水平表達(dá)很多內(nèi)皮表面標(biāo)記物，包括CD31，P1H12，和CD105。另外，EPCs表達(dá)結(jié)腸腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物(TEMs)，與正常結(jié)腸粘膜內(nèi)皮相比較，鑒定為來(lái)自結(jié)腸腫瘤新手術(shù)標(biāo)本的內(nèi)皮細(xì)胞中高水平表達(dá)的mRNAs。在人EPC中表達(dá)TEM mRNA的水平比在MHVECs和HUVECs中觀察到的水平顯著高。事實(shí)上，很多TEMs在MHVECs和HUVECs中檢測(cè)不到。
實(shí)施例2TEM1抗體為了產(chǎn)生TEM1的小鼠多克隆抗體，用包含全長(zhǎng)TEM1人基因的pcDNA 3.1人TEM1(hTEM1)質(zhì)粒對(duì)C57B1/6小鼠肌內(nèi)接種。使用3′和5′TEM1特異引物通過(guò)RT-PCR從人胎兒腦RNA克隆人TEM1編碼序列。對(duì)5′端引物修飾使其包含CCACC 5′至ATG起始密碼子的共有Kozak序列。測(cè)序證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物，2273堿基對(duì)(bp)片段，相應(yīng)于美國(guó)系列No.09/918715(公開(kāi)號(hào)No.20030017157)的SEQ ID NO.195(GenBank#；NM-020404)的核苷酸(nt)6-nt 2279，并且亞克隆到pCDNA3.1載體(Invitrogen)中。這種載體pcDNA3.1 hTEM1編碼757個(gè)氨基酸的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)。
為了產(chǎn)生對(duì)于TEM1胞外結(jié)構(gòu)域的多克隆特異性，將TEM1的全長(zhǎng)人基因的nt102至nt1963亞克隆到VV-1載體(Genovac AG，F(xiàn)reiburg，德國(guó))，與位于5′端的5′信號(hào)序列和myc-TAG和位于3′端的GPI跨膜錨定基序位于同一讀框中，產(chǎn)生VV-1TEM1。載體中包括的胞外部分編碼美國(guó)系列No.09/918715(公開(kāi)號(hào)No.20030017157)的SEQ ID NO.196(GenBank#NM-020404)的氨基酸33至684的TEM1。用VV-1TEM1載體對(duì)兔免疫接種。然后利用常規(guī)方法純化兔多克隆的IgG成分。
細(xì)胞表面表達(dá)為了測(cè)定細(xì)胞表面上是否存在TEM1，用質(zhì)粒載體pCFA-TEM1對(duì)COS細(xì)胞(ATCC)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。將全長(zhǎng)人TEM1克隆到pCFA載體主鏈中(Yew等，Hum.Gene Ther.10223-34(1999)。然后用兔抗-TEM1多克隆對(duì)(沒(méi)有透化的)細(xì)胞染色，接著用CY3-標(biāo)記的抗-兔Ig抗體染色。然后用核染料(DAPI)對(duì)細(xì)胞復(fù)染并且通過(guò)熒光顯微鏡檢查。熒光染色限于COS細(xì)胞的細(xì)胞表面，因此證明在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表面上表達(dá)TEM1。
利用流式細(xì)胞儀分析，在2H11內(nèi)皮細(xì)胞(2H11細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)鼠TEM1)上用鼠多克隆抗TEM1抗體和使用VV-TEM1轉(zhuǎn)染并且用兔多克隆抗人TEM1處理的Hek-293細(xì)胞證實(shí)TEM1的細(xì)胞表面表達(dá)。兩種細(xì)胞都用抗-TEM1抗體陽(yáng)性染色。這些實(shí)驗(yàn)第一次證明，TEM1是胞外和膜局部蛋白質(zhì)。
增殖測(cè)定使用根據(jù)實(shí)施例1所述制備的人內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPC′s)，通過(guò)Crouch等，J.Immunol.Meth.16081(1993)和Kangas等，Med.Biol.62338(1984)中描述的方法，檢測(cè)增殖。在補(bǔ)充有2％胎牛血清的培養(yǎng)基中在使用2×103細(xì)胞/孔的96孔板系統(tǒng)中評(píng)價(jià)增殖。ATP發(fā)光測(cè)定(CellTiter GloTMLuminescent Cell Viability試劑盒，Promega)用作接觸兔多克隆抗-人TEM1的人EPC的生長(zhǎng)抑制終點(diǎn)。細(xì)胞與從100-800微克/毫升漸增濃度的抗體一起溫育48-小時(shí)。對(duì)照IgG抗體是Sigma購(gòu)買(mǎi)的兔血清IgG成分。不存在抗體時(shí)，檢測(cè)3,662±354EPC′s?？贵w是200，400和800微克/毫升時(shí)，對(duì)照IgG存在下觀察到的細(xì)胞數(shù)目分別是4,185±117，4,418±38，和4,611±165。相反，200，400和800微克/毫升抗-TEM1抗體存在下觀察到的細(xì)胞數(shù)目分別是3,756±92，3,881±97，和3,773±127，證明抗-TEM1抗體的抗-增殖作用。在用兔抗-TEM1多克隆抗體處理的鼠2H11內(nèi)皮細(xì)胞中也觀察到這種抗-增殖作用。不存在抗體時(shí)，2H11細(xì)胞產(chǎn)生9,216±102個(gè)細(xì)胞。與200，400或800微克/毫升對(duì)照IgG一起溫育的2H11細(xì)胞分別產(chǎn)生10,672±292個(gè)細(xì)胞，10,846±475個(gè)細(xì)胞，和11,977±267個(gè)細(xì)胞。但是存在抗-TEM1抗體，以200，400和800微克/毫升存在時(shí)，細(xì)胞數(shù)目分別減小至10,205±113個(gè)細(xì)胞，10,269±114個(gè)細(xì)胞，和8,725±97個(gè)細(xì)胞。
遷移測(cè)定根據(jù)Glaser等，Nature 288483-84(1983)和Alessandri等，Cancer Res.431790-97(1983)所述，使用在8微米孔膜頂部上室中以每室5×104在無(wú)血清培養(yǎng)基中平板培養(yǎng)的人EPC′s(根據(jù)實(shí)施例1所述制備)分析遷移。在下室中將補(bǔ)充有0.5％胎牛血清的培養(yǎng)基換為化學(xué)-誘引劑。在存在和不存在800微克/毫升抗-人TEM1兔多克隆抗血清或?qū)φ胀肐gG成分下，讓細(xì)胞通過(guò)膜下側(cè)遷移48小時(shí)。抗體置于實(shí)驗(yàn)孔的上室和下室中。然后用鈣黃綠素對(duì)通過(guò)膜遷移的細(xì)胞染色并且通過(guò)熒光強(qiáng)度定量測(cè)定。48小時(shí)之后，當(dāng)沒(méi)有抗體或者在對(duì)照IgG存在下溫育時(shí)，遷移細(xì)胞分別產(chǎn)生7000和7750RFUs。然而，在抗-TEM1抗體存在下，RFUs減小至4200，表明遷移細(xì)胞數(shù)目顯著減小。
內(nèi)皮管形成測(cè)定根據(jù)Souza，等，Biotechniques，26502-08(1999)所述，使用pAD(vantage)系統(tǒng)構(gòu)建包含編碼全長(zhǎng)人TEM1的基因的腺病毒載體(Ad2CMV-TEM1)。使用Ad2CMV-TEM1感染人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMVEC)，MOI是300。病毒感染之后72小時(shí)，用胰蛋白酶消化HMVEC并且鋪于Matrigel板，用于管形成測(cè)定。測(cè)定在24孔板上進(jìn)行24小時(shí)。然后在37℃下用鈣黃綠素AM(分子探針)對(duì)細(xì)胞染色30-60分鐘，并且進(jìn)行管熒光成像。利用MetaMorph成像分析定量測(cè)定管占據(jù)的區(qū)域。使用250微升MatrigelTM以3×104細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞鋪板。沒(méi)有抗體存在下，沒(méi)有感染的，空載體(EV)-感染的，和TEM1-感染的細(xì)胞的管面積分別是90000，61000，和110000像素。存在對(duì)照抗體下，沒(méi)有感染的，空載體(EV)-感染的，和TEM1-感染的細(xì)胞的管面積分別是38000，62000，和61000像素。存在800微克/毫升抗-TEM1兔多克隆抗血清下，相對(duì)于接觸預(yù)先免疫兔血清的細(xì)胞來(lái)說(shuō)，發(fā)現(xiàn)腺病毒-TEM1-感染的HMVEC中管形成減少。沒(méi)有感染的，空載體(EV)-感染的，和TEM1-感染的細(xì)胞的管面積分別是38000，80000，和42000。抗-TEM1抗體處理過(guò)的細(xì)胞相對(duì)于沒(méi)有暴露于抗-TEM1抗體的細(xì)胞中管面積來(lái)說(shuō)管面積減小63％。
實(shí)施例3TEM17抗體為了產(chǎn)生TEM17胞外結(jié)構(gòu)特異性多克隆抗體，將TEM17全長(zhǎng)人基因的nt 152至nt 1318亞克隆到VV-1載體(Genovac AGG，F(xiàn)reiburg，德國(guó))，與位于5′端的5′信號(hào)序列和myc-TAGG和位于3′端的GPI跨膜錨定基序位于同一讀框中，產(chǎn)生VV-1TEM17。載體中包括的胞外部分編碼美國(guó)系列號(hào)No.09/918715(公開(kāi)號(hào)No.20030017157)的SEQ IDNO.230的氨基酸24至412的TEM17。用VV-1TEM17載體對(duì)兔免疫接種。
為了生產(chǎn)TEM17的鼠多克隆抗體，用包含全長(zhǎng)TEM17人基因的pcDNA 3.1 hTEM17質(zhì)粒對(duì)C57B1/6小鼠肌內(nèi)免疫。使用3′和5′TEM17特異引物通過(guò)RT-PCR從人胎兒腦RNA克隆人TEM17編碼序列。對(duì)5′端引物修飾使其包含CCACC 5′至ATG起始密碼子的共有Kozak序列。測(cè)序證實(shí)1503bpd的擴(kuò)增產(chǎn)物相應(yīng)于美國(guó)系列No.09/918715(公開(kāi)號(hào)No.20030017157)的SEQ ID NO.229(GenBank#；AF-279144)的nt83-nt1585，并且亞克隆到pCDNA3.1載體(Invitrogen)中。這種載體pcDNA3.1 hTEM17編碼500個(gè)氨基酸的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)。應(yīng)用常規(guī)方法純化兔和鼠多克隆的IgG成分。
細(xì)胞表面表達(dá)為了測(cè)定細(xì)胞表面上是否存在TEM17，用質(zhì)粒載體pCFA-TEM17對(duì)COS細(xì)胞(ATCC)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。將全長(zhǎng)人TEM17克隆到pCFA載體主鏈中。pCFA載體主鏈在Yew等，Hum.GGene Ther.10223-34(1999)中有描述。然后用兔抗-TEM17多克隆對(duì)(沒(méi)有透化的)細(xì)胞染色，接著用CY3-標(biāo)記的抗-兔Ig抗體染色。然后用核染料(DAPI)對(duì)細(xì)胞復(fù)染并且通過(guò)熒光顯微鏡檢查。熒光染色限于COS細(xì)胞的細(xì)胞表面，因此證明在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表面上表達(dá)TEM17。
利用流式細(xì)胞儀分析，在2H11內(nèi)皮細(xì)胞(2H11細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)鼠TEM17)上用鼠多克隆抗人TEM17抗體和使用VV-TEM17轉(zhuǎn)染并且用兔多克隆抗人TEM17處理的Hek-293細(xì)胞證實(shí)TEM17的細(xì)胞表面表達(dá)。兩種細(xì)胞都用抗-TEM17抗體陽(yáng)性染色。這些實(shí)驗(yàn)第一次證明，TEM17是胞外和膜局部蛋白質(zhì)。
增殖測(cè)定使用根據(jù)實(shí)施例1所述制備的人內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPC′s)，通過(guò)Crouch等，J.Immunol.Meth.16081(1993)和Kangas等，Med.Biol.62338(1984)中描述的方法，檢測(cè)增殖。在補(bǔ)充有2％胎牛血清的培養(yǎng)基中在使用2×103細(xì)胞/孔的96孔板系統(tǒng)中評(píng)價(jià)增殖。ATP發(fā)光測(cè)定(CellTiter GloTMLuminescent Cell Viability試劑盒，Promega)用作接觸兔多克隆抗-人TEM17的人EPC的生長(zhǎng)抑制終點(diǎn)。細(xì)胞與從100-800微克/毫升漸增濃度的抗體一起溫育48-小時(shí)。對(duì)照IgG抗體是從Sigma購(gòu)買(mǎi)的兔血清IgG成分。不存在抗體時(shí)，檢測(cè)到3,662±354EPC′s。抗體是200，400和800微克/毫升時(shí)，對(duì)照IgG存在下觀察到的細(xì)胞數(shù)目分別是4,185±117，4,418±38，和4,611±165。相反，200，400和800微克/毫升抗-TEM17抗體存在下觀察到的細(xì)胞數(shù)目分別是3,480±190，3,472±35，和3,536±166，證明抗-TEM17抗體的抗-增殖作用。在用兔抗-TEM17多克隆抗體處理的鼠2H11內(nèi)皮細(xì)胞中沒(méi)有觀察到這種抗-增殖作用。
遷移測(cè)定根據(jù)Glaser等，Nature 288483-84(1983)和Alessandri等，Cancer Res.431790-97(1983)所述，使用在8微米孔膜頂部上室中以每室5×104在無(wú)血清培養(yǎng)基中鋪板的EPC′s(根據(jù)實(shí)施例1所述制備)分析遷移。在下室中將補(bǔ)充有0.5％胎牛血清的培養(yǎng)基換為化學(xué)-誘引劑。在存在和不存在800微克/毫升抗-人TEM17兔多克隆抗血清或?qū)φ胀肐gG成分下，讓細(xì)胞通過(guò)膜下側(cè)遷移48小時(shí)?？贵w置于實(shí)驗(yàn)孔的上室和下室中。然后用鈣黃綠素對(duì)通過(guò)膜遷移的細(xì)胞染色并且通過(guò)熒光強(qiáng)度定量測(cè)定。48小時(shí)之后，當(dāng)沒(méi)有抗體或者在對(duì)照IgG存在下溫育時(shí)，遷移細(xì)胞分別產(chǎn)生4500和10000RFUs。然而，在抗-TEM17抗體存在下，RFUs減小至3500，表明遷移細(xì)胞數(shù)目相對(duì)于對(duì)照抗體處理的細(xì)胞顯著減小。
內(nèi)皮管形成測(cè)定為了檢查抗-TEM17抗體對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞管形成的作用，在兔抗-TEM17多克隆抗體的存在下將人EPC(根據(jù)實(shí)施例1所述制備的)預(yù)先溫育過(guò)夜。然后在用MatrigelTM預(yù)先包被的48孔板上以2×104細(xì)胞/孔在補(bǔ)充有0.5％和2％胎牛血清(FBS)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中鋪板。24小時(shí)之后，在37℃下用鈣黃綠素AM(分子探針)對(duì)細(xì)胞染色30-60分鐘，并且進(jìn)行管熒光成像。利用MetaMorph圖像分析定量測(cè)定管占據(jù)的區(qū)域。存在對(duì)照抗體下，0.5％和2％FBS分別存在下，EPC管面積分別是3000和2800像素。存在800微克/毫升抗-TEM17兔多克隆抗血清時(shí)，0.5％和2％FBS分別存在下，EPC的管面積分別是2200和600象素，證明抗-TEM17抗體的有效抑制作用。類(lèi)似地，在兔多克隆抗-TEM17存在下2H11內(nèi)皮細(xì)胞的管形成被抑制。2H11細(xì)胞與800mg/ml抗體預(yù)先溫育，然后在Matrigel中形成網(wǎng)絡(luò)/管5小時(shí)。在對(duì)照IgG存在下，管面積是6000象素，而在抗-TEM17抗體存在下，面積是2300象素，表明抗-TEM17抗體對(duì)人EPCs和2H11內(nèi)皮細(xì)胞的管形成提供抑制作用。
實(shí)施例4TEM9抗體為了生產(chǎn)TEM9的鼠多克隆抗體，用包含全長(zhǎng)TEM9人基因的pcDNA3.1 hTEM9質(zhì)粒對(duì)C57B1/6小鼠肌內(nèi)免疫接種。通過(guò)人胎兒腎cDNA文庫(kù)在pCMV Sport2中的集落雜交克隆人TEM9 cDNA。使用編碼TEM9序列的1100bp PCR片段對(duì)cDNA篩選并且對(duì)陽(yáng)性克隆完全測(cè)序。通過(guò)在cDNA的3′和5′端加入Notl和Sall位點(diǎn)產(chǎn)生cDNA文庫(kù)。選擇包含與美國(guó)系列號(hào)No.09/918715(公開(kāi)號(hào)No.20030017157)的SEQ ID NO.211(AF-378755)的nt35-nt4030相同的3996bp全長(zhǎng)TEM9 ORF的克隆pCMV Sport-2 TEM9(克隆9-1)中的一個(gè)。并且將pCMV Sport-2 TEM9的全長(zhǎng)序列亞克隆到pCDNA3.1載體(Invitrogen)中，產(chǎn)生pcDNA3.1 hTEM9，在對(duì)小鼠的免疫中使用它。
為了產(chǎn)生TEM9胞外結(jié)構(gòu)特異性多克隆抗體，將TEM9全長(zhǎng)人基因的nt 127至nt 2290亞克隆到VV-1載體(Genovac AG，F(xiàn)reiburg，德國(guó))，與位于5′端的5′信號(hào)序列和myc-TAG和位于3′端的GPI跨膜錨定基序位于同一讀框中，產(chǎn)生VV-1TEM9載體。載體中包括的胞外部分編碼美國(guó)系列No.09/918715(公開(kāi)號(hào)No.20030017157)的SEQ IDNO.212的氨基酸32至752的TEM9。用VV1-TEM9載體對(duì)兔免疫接種。然后應(yīng)用常規(guī)方法純化兔和鼠多克隆的IgG成分。
細(xì)胞表面表達(dá)為了測(cè)定細(xì)胞表面上是否存在TEM9，用質(zhì)粒載體pCFA-TEM9對(duì)COS細(xì)胞(ATCC)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。將全長(zhǎng)人TEM9克隆到pCFA載體主鏈中。pCFA載體主鏈在Yew等，Hum.Gene Ther.10223-34(1999)中有描述。然后用兔抗-TEM9多克隆對(duì)(沒(méi)有透化的)細(xì)胞染色，接著用CY3-標(biāo)記的抗-兔Ig抗體染色。然后用核染料(DAPI)對(duì)細(xì)胞復(fù)染并且通過(guò)熒光顯微鏡檢查。熒光染色限于COS細(xì)胞的細(xì)胞表面，因此證明在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表面上表達(dá)TEM9。
利用流式細(xì)胞儀分析，在2H11內(nèi)皮細(xì)胞(2H11細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)鼠TEM9)上用鼠多克隆抗TEM9抗體和使用VV-TEM9轉(zhuǎn)染并且用兔多克隆抗人TEM9處理的Hek-293細(xì)胞證實(shí)TEM9的細(xì)胞表面表達(dá)。兩種細(xì)胞類(lèi)型都用抗-TEM9抗體陽(yáng)性染色。這些實(shí)驗(yàn)第一次證明，TEM9是胞外和膜局部蛋白質(zhì)。
增殖檢測(cè)使用根據(jù)實(shí)施例1所述制備的人內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPC′s)，通過(guò)Crouch等，J.Immunol.Meth.16081(1993)和Kangas等，Med.Biol.62338(1984)中描述的方法，檢測(cè)增殖。在補(bǔ)充有2％胎牛血清的培養(yǎng)基中在使用2×103細(xì)胞/孔的96孔板系統(tǒng)中評(píng)價(jià)增殖。ATP發(fā)光測(cè)定(CellTiter GloTMLuminescent Cell Viability試劑盒，Promega)用作接觸兔多克隆抗-人TEM9的人EPC的生長(zhǎng)抑制終點(diǎn)。細(xì)胞與從100-800微克/毫升漸增濃度的抗體一起溫育48-小時(shí)。對(duì)照IgG抗體是Sigma購(gòu)買(mǎi)的兔血清IgG成分。對(duì)于EPC或鼠2H11細(xì)胞沒(méi)有觀察到增殖的抑制作用。
遷移測(cè)定根據(jù)Glaser等，Nature 288483-84(1983)和Alessandri等，Cancer Res.431790-97(1983)所述，使用在8微米孔膜頂部上室中以每室5×104在無(wú)血清培養(yǎng)基中平板培養(yǎng)的人EPC′s(根據(jù)實(shí)施例1所述制備)分析遷移。鋪板之前2H11細(xì)胞與抗體預(yù)先溫育30分鐘。在下室中將補(bǔ)充有0.5％胎牛血清的培養(yǎng)基換為化學(xué)-誘引劑。在存在和不存在800微克/毫升抗-人TEM9兔多克隆抗血清或?qū)φ胀肐gG成分下，讓EPC和2H11細(xì)胞分別通過(guò)膜下側(cè)遷移48小時(shí)和4小時(shí)?？贵w置于實(shí)驗(yàn)孔的上室和下室中。然后用鈣黃綠素對(duì)通過(guò)膜遷移的細(xì)胞染色并且通過(guò)熒光強(qiáng)度定量測(cè)定。單獨(dú)與對(duì)照血清溫育導(dǎo)致遷移2H11細(xì)胞產(chǎn)生1000RFU，而抗-TEM9抗體將相對(duì)熒光減小至820RFUs，表明TEM抗體對(duì)遷移有抑制作用。在抗-TEM9抗體存在下對(duì)EPC觀察到類(lèi)似的抑制作用。使用如下所述制備的腺病毒-TEM9感染的(Ad2CMV-TEM9)HMVECs進(jìn)一步證實(shí)抗-TEM9抗體對(duì)遷移的抑制作用。在對(duì)照IgG存在下，遷移的腺病毒-TEM9-感染的EPCs熒光強(qiáng)度是1899?？?TEM9抗體的存在將熒光強(qiáng)度減小至1254。
內(nèi)皮管形成測(cè)定根據(jù)Souza，等，Biotechniques，26502-08(1999)所述，使用pAD(vantage)系統(tǒng)構(gòu)建包含編碼全長(zhǎng)人TEM9的基因的腺病毒載體(Ad2CMV-TEM9)。使用Ad2CMV-TEM9轉(zhuǎn)染人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMVEC)，MOI是300。病毒感染之后72小時(shí)，用胰蛋白酶消化HMVEC并且鋪板于MatrigelTM，用于管形成測(cè)定。測(cè)定在24孔板上進(jìn)行24小時(shí)。然后在37℃下用鈣黃綠素AM(分子探針)對(duì)細(xì)胞染色30-60分鐘，并且進(jìn)行管熒光成像。利用MetaMorph圖像分析定量測(cè)定管占據(jù)的區(qū)域。使用250微升MatrigelTM以3×104細(xì)胞/孔的密度對(duì)細(xì)胞鋪板。與沒(méi)有暴露于抗-TEM9抗體的細(xì)胞相比，抗-TEM9處理過(guò)的細(xì)胞的管面積沒(méi)有減小。
實(shí)施例5人抗-TEM1抗體通過(guò)免疫接種表達(dá)TEM1的FM3A細(xì)胞(FM3A/TEM1)或表達(dá)TEM1的L929細(xì)胞(L929/TEM1)，使KM小鼠TM(WO02/043478)產(chǎn)生抗TEM1人抗體，根據(jù)使用抗人TEM1的兔多克隆抗體試劑的流式細(xì)胞術(shù)分析(FACS)所測(cè)定的，這兩種細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)高水平人TEM1。為了建立FM3A/TEM1，通過(guò)電穿孔用包含人TEM1cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠FM3A乳腺癌細(xì)胞(ATCC)。通過(guò)使用BstXI位點(diǎn)將來(lái)自pcDNA3.1人TEM1的TEM1cDNA亞克隆到pTracerEF-Bsd(Invitrogen)中來(lái)構(gòu)建質(zhì)粒。為了建立L929/TEM1，使用IT-LT1(MirUs)通過(guò)脂轉(zhuǎn)染法用相同的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠L929成纖維細(xì)胞(ATCC)。然后使用細(xì)胞分選器，F(xiàn)ACSVantage(BDBiosciences)，從用兔多克隆抗體試劑染色的轉(zhuǎn)染子收集表達(dá)TEM1的細(xì)胞。FM3A/TEM1保持在補(bǔ)充有10％胎牛血清(FBS)和10微克/毫升殺稻瘟素S的改進(jìn)的Eagle′s培養(yǎng)基中，而L929/TEM1保持在補(bǔ)充有10％FBS和10微克/毫升殺稻瘟素S的Dulbecco′s改進(jìn)的Eagle′s培養(yǎng)基中。5×106FM3A/TEM1細(xì)胞或1×106L929/TEM1細(xì)胞以兩周間隔對(duì)小鼠腹膜內(nèi)免疫接種三次。最后一次免疫接種時(shí)，細(xì)胞融合之前3天，對(duì)免疫的小鼠腹膜內(nèi)注射5微克人白細(xì)胞介素-6。使用SP2/0-Ag14骨髓瘤細(xì)胞(ATCC)作為融合配偶體，從免疫動(dòng)物的脾制備雜交瘤。通過(guò)使用表達(dá)TEM1的FM3A細(xì)胞對(duì)上清液進(jìn)行的FACS分析篩選產(chǎn)生抗人TEM1的抗體的雜交瘤。簡(jiǎn)要地說(shuō)，表達(dá)TEM1的FM3A細(xì)胞與上清液在0℃下溫育1小時(shí)。清洗之后，0℃下，細(xì)胞與RPE-偶聯(lián)的抗-人κ鏈特異性抗體或RPE-偶聯(lián)的抗-人γ鏈特異性抗體溫育1小時(shí)。清洗之后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行FACS分析。通過(guò)有限稀釋方法克隆選擇的雜交瘤。
抗體的純化為了純化抗體，使雜交瘤適應(yīng)補(bǔ)充有1％低IgG FBS(HyClone)，5微克/毫升的胰島素，5微克/毫升的轉(zhuǎn)鐵蛋白，10μM的乙醇胺，和25nM的亞硒酸鈉的eRDF培養(yǎng)基(Kyokuto Pharmacy)。利用對(duì)于抗體生產(chǎn)常用的常規(guī)技術(shù)的組合從發(fā)酵肉湯中純化IgG。澄清培養(yǎng)收集物，去除細(xì)胞和細(xì)胞碎屑，然后開(kāi)始純化程序。將收集物過(guò)濾實(shí)現(xiàn)純化。澄清之后，捕獲抗體并且利用在蛋白質(zhì)A基質(zhì)(MabSelect；Amersham Biosciences)上的親和層析顯著純化?？贵w與蛋白質(zhì)A基質(zhì)結(jié)合，將基質(zhì)清洗之后，通過(guò)減小pH來(lái)洗脫。然后通過(guò)陰離子交換色譜(Q Sepharose Fast Flow；Amersham Biosciences)和陽(yáng)離子交換色譜(SP Sepharose Fast Flow；Amersham Biosciences)實(shí)現(xiàn)抗體的進(jìn)一步純化。并且去除雜質(zhì)，這個(gè)步驟也用來(lái)將緩沖液交換成PBS。
增殖測(cè)定在補(bǔ)充有2％胎牛血清的培養(yǎng)基中在使用2×103細(xì)胞/孔的96孔板系統(tǒng)中評(píng)價(jià)人內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPC)增殖。ATP發(fā)光測(cè)定(CellTiter GloTMLuminescent Cell Viability試劑盒，Promega)用作與人抗體溫育的人EPC的生長(zhǎng)抑制終點(diǎn)。細(xì)胞與1微克/毫升的人抗-TEM1上清液一起溫育48-小時(shí)。如圖1所示，一定數(shù)量的抗體上清液對(duì)于EPC增殖是抑制性的。
人TEM1抗體對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用為了體外評(píng)價(jià)抗人TEM1的人TEM1抗體，使用RPCI11-867G23 BAC克隆(InvitrogenCorporation)作為轉(zhuǎn)基因建立人TEM1轉(zhuǎn)基因小鼠。由YS NewTechnology Institute，Inc.進(jìn)行對(duì)C57B1/6胚胎的轉(zhuǎn)基因注射。然后TEM1轉(zhuǎn)基因小鼠與非轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠(Japan SLC，Inc.)雜交，擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因后代。第0天，對(duì)成年TEM1轉(zhuǎn)基因小鼠皮下接種1×106個(gè)B16黑素瘤細(xì)胞(ATCC)，在指定的時(shí)間點(diǎn)使用卡鉗測(cè)量各個(gè)實(shí)驗(yàn)組各個(gè)小鼠的腫瘤體積。以100微克/小鼠的劑量從第一天起始，一周兩次施用來(lái)自克隆7，克隆38，和克隆70的純化的TEM1抗體，和純化的對(duì)于半抗原(即二硝基苯)特異性的IgG1同種型對(duì)照抗體。第6天，接受對(duì)照IgG1抗體(n＝6)，克隆TEM1-7抗體(n＝6)，克隆TEM1-70(n＝4)，和克隆TEM1-38(n＝6)的小鼠的腫瘤體積分別是4.88±3.629，6.12±6.12，3.56±3.56，36.83±15.15mm3(值代表平均值±SEM)。第9天，接受IgG對(duì)照抗體的小鼠的腫瘤體積是378.02±112.90mm3，而接受克隆TEM1-7，克隆TEM1-70，和克隆TEM1-38抗-TEM1抗體的小鼠分別是221.8±54.12，130.08±25.14，和467.41±185.19mm3。第13天，抗-TEM1抗體更顯著地抑制B 16腫瘤生長(zhǎng)。只接受對(duì)照抗體的小鼠的腫瘤體積增大到944.04±402.19mm3，而對(duì)于接受克隆TEM1-7，克隆TEM1-70，和克隆TEM1-38抗-TEM1抗體的小鼠腫瘤體積分別減小至204.88±31.56，128.67±62.46，和513.92±174.40mm3。
不脫離本發(fā)明的基礎(chǔ)方面可以對(duì)上述內(nèi)容進(jìn)行修飾。雖然參照一個(gè)或多個(gè)具體實(shí)施方案實(shí)質(zhì)上詳細(xì)描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員理解可以對(duì)本申請(qǐng)公開(kāi)的具體實(shí)施方案進(jìn)行改變，但是這些修飾和改進(jìn)屬于如下面權(quán)利要求書(shū)中闡述的本發(fā)明的范圍和精神之內(nèi)。
上面引用的公開(kāi)物或文獻(xiàn)不是為了承認(rèn)前面所述是相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)，也不是承認(rèn)這些公開(kāi)物或文獻(xiàn)的內(nèi)容或日期。這里參考的美國(guó)專利或其他公開(kāi)物引作參考。
權(quán)利要求
1.一種抑制細(xì)胞增殖的方法，包括施用有效量的與選自腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物(TEM)1和TEM17的抗原特異性結(jié)合的抗體，或者其生物活性片段，從而抗體抑制細(xì)胞增殖。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體，或者其生物活性片段特異性結(jié)合抗原的胞外結(jié)構(gòu)域。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗原是TEM1。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗原是TEM17。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體是人抗體。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體是人源化抗體或嵌合抗體。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體是完整抗體分子，單鏈可變區(qū)，F(xiàn)ab片段，或F(ab′)2片段。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體在轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生。
10.權(quán)利要求1的方法，其中體外抑制細(xì)胞增殖。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體與生物活性劑偶聯(lián)。
12.一種抑制細(xì)胞遷移的方法，包括施用有效量的與選自TEM1，TEM17，和TEM9的抗原特異性結(jié)合的抗體，或者其生物活性片段，從而抗體抑制細(xì)胞遷移。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗體，或者其生物活性片段特異性結(jié)合抗原的胞外結(jié)構(gòu)域。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗原是TEM1。
15.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗原是TEM17。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗原是TEM9。
17.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗體是人抗體。
18.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗體是人源化抗體或嵌合抗體。
19.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗體是完整抗體分子，單鏈可變區(qū)，F(xiàn)ab片段，或F(ab′)2片段。
20.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
21.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗體在轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生。
22.權(quán)利要求12的方法，其中體外抑制細(xì)胞遷移。
23.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗體與生物活性劑偶聯(lián)。
24.一種抑制內(nèi)皮管形成的方法，包括施用有效量的與選自TEM1和TEM17的抗原特異性結(jié)合的抗體，或者其生物活性片段，從而抗體抑制內(nèi)皮管形成。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述抗體，或者其生物活性片段，特異性結(jié)合抗原的胞外結(jié)構(gòu)域。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述抗原是TEM1。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述抗原是TEM17。
28.權(quán)利要求24的方法，其中所述抗體是人抗體。
29.權(quán)利要求24的方法，其中所述抗體是人源化抗體或嵌合抗體。
30.權(quán)利要求24的方法，其中所述抗體是完整抗體分子，單鏈可變區(qū)，F(xiàn)ab片段，或F(ab′)2片段。
31.權(quán)利要求24的方法，其中所述抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
32.權(quán)利要求24的方法，其中所述抗體在轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生。
33.權(quán)利要求24的方法，其中抗體在體外抑制內(nèi)皮管形成。
34.權(quán)利要求24的方法，其中所述抗體與生物活性劑偶聯(lián)。
35.鑒定調(diào)節(jié)TEM1的血管發(fā)生抑制劑分子的方法，包括使攜帶腫瘤的TEM1轉(zhuǎn)基因小鼠接觸試驗(yàn)分子；并且檢測(cè)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，從而，當(dāng)相對(duì)于沒(méi)有接觸試驗(yàn)分子的小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)，接觸了試驗(yàn)分子的小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)減少時(shí)，將試驗(yàn)分子鑒定為調(diào)節(jié)TEM1的血管發(fā)生抑制劑分子。
36.鑒定調(diào)節(jié)TEM9的血管發(fā)生抑制劑分子的方法，包括使攜帶腫瘤的TEM9轉(zhuǎn)基因小鼠接觸試驗(yàn)分子；并且檢測(cè)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，從而，當(dāng)相對(duì)于沒(méi)有接觸試驗(yàn)分子的小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)，接觸了試驗(yàn)分子的小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)減少時(shí)，將試驗(yàn)分子鑒定為調(diào)節(jié)TEM9的血管發(fā)生抑制劑分子。
37.鑒定調(diào)節(jié)TEM17的血管發(fā)生抑制劑分子的方法，包括使攜帶腫瘤的TEM17轉(zhuǎn)基因小鼠接觸試驗(yàn)分子；并且檢測(cè)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，從而，當(dāng)相對(duì)于沒(méi)有接觸試驗(yàn)分子的小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)，接觸了試驗(yàn)分子的小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)減少時(shí)，將試驗(yàn)分子鑒定為調(diào)節(jié)TEM17的血管發(fā)生抑制劑分子。
38.一種抑制血管發(fā)生的方法，包括對(duì)需要的受試者施用有效量的與選自TEM1，TEM17，和TEM9的抗原特異性結(jié)合的抗體，或者其生物活性片段，從而抗體抑制血管發(fā)生。
39.權(quán)利要求38的方法，其中受試者表達(dá)抗體結(jié)合的抗原。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述血管發(fā)生是新血管發(fā)生。
41.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗原是TEM1。
42.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗原是TEM17。
43.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗原是TEM9。
44.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗體是人抗體或嵌合抗體。
45.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗體是人源化抗體。
46.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗體是完整抗體分子，單鏈可變區(qū)，F(xiàn)ab片段，或F(ab′)2片段。
47.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
48.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗體是IgG抗體。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述抗體是IgG1抗體。
50.權(quán)利要求48的方法，其中所述抗體是IgG2抗體。
51.權(quán)利要求48的方法，其中所述抗體是IgG3抗體。
52.權(quán)利要求48的方法，其中所述抗體是IgG4抗體。
53.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗體偶聯(lián)于抗血管發(fā)生劑或抗腫瘤劑。
54.權(quán)利要求38的方法，其中所述受試者患有癌癥。
55.權(quán)利要求38的方法，其中所述受試者患有多囊性腎病。
56.權(quán)利要求38的方法，其中所述受試者患有糖尿病視網(wǎng)膜病。
57.權(quán)利要求38的方法，其中所述受試者患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
58.權(quán)利要求38的方法，其中所述受試者患有牛皮癬。
59.一種抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法，包括對(duì)需要的受試者施用有效量的與選自TEM1，TEM17，和TEM9的抗原特異性結(jié)合的抗體，或者其生物活性片段，從而抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)。
60.權(quán)利要求59的方法，其中受試者表達(dá)抗體結(jié)合的抗原。
61.權(quán)利要求59的方法，其中所述抗原是TEM1。
62.權(quán)利要求59的方法，其中所述抗原是TEM17。
63.權(quán)利要求59的方法，其中所述抗原是TEM9。
64.權(quán)利要求59的方法，其中所述抗體是人抗體。
65.權(quán)利要求59的方法，其中所述抗體是人源化抗體或嵌合抗體。
66.權(quán)利要求59的方法，其中所述抗體是完整抗體分子，單鏈可變區(qū)，F(xiàn)ab片段，或F(ab′)2片段。
67.權(quán)利要求59的方法，其中所述抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
68.權(quán)利要求59的方法，其中所述抗體是IgG抗體。
69.權(quán)利要求68的方法，其中所述抗體是IgG1抗體。
70.權(quán)利要求68的方法，其中所述抗體是IgG2抗體。
71.權(quán)利要求68的方法，其中所述抗體是IgG3抗體。
72.權(quán)利要求68的方法，其中所述抗體是IgG4抗體。
73.權(quán)利要求59的方法，其中所述抗體偶聯(lián)于抗血管發(fā)生劑或抗腫瘤劑。
74.權(quán)利要求59的方法，其中所述腫瘤是腺癌，白血病，淋巴瘤，黑素瘤，肉瘤，或tetratocarcinoma。
75.權(quán)利要求59的方法，其中所述腫瘤是腎上腺，膀胱，骨，骨髓，腦，乳腺，子宮頸，膽囊，神經(jīng)節(jié)，胃腸道，心臟，腎，肝，肺，肌肉，卵巢，胰腺，甲狀旁腺，陰莖，前列腺，唾液腺，皮膚，脾，睪丸，胸腺，甲狀腺，或子宮的癌。
76.特異性結(jié)合TEM1的單克隆抗體，或者其生物活性片段，其中所述抗體由雜交瘤TEM1-70產(chǎn)生。
77.單克隆抗體，或者其生物活性片段，其中抗體包括與權(quán)利要求76的抗體的可變區(qū)相同的氨基酸序列。
78.權(quán)利要求77的方法，其中所述抗體是IgG抗體。
79.權(quán)利要求78的方法，其中所述IgG抗體選自由IgG1，IgG2，IgG3和IgG4組成的IgG亞類(lèi)的成員。
80.權(quán)利要求79的方法，其中所述抗體是IgG1抗體。
81.權(quán)利要求79的方法，其中所述抗體是IgG2抗體。
82.權(quán)利要求79的方法，其中所述抗體是IgG3抗體。
83.權(quán)利要求79的方法，其中所述抗體是IgG4抗體。
84.權(quán)利要求79的抗體，其中重鏈的至少一個(gè)氨基酸被缺失，添加，或者被不同于原來(lái)氨基酸的氨基酸取代。
85.權(quán)利要求76的抗體，其中所述抗體偶聯(lián)于抗血管發(fā)生劑或抗腫瘤劑。
86.權(quán)利要求76的抗體，其中所述抗體抑制血管發(fā)生。
87.權(quán)利要求86的抗體，其中血管發(fā)生促進(jìn)或引起癌癥。
88.權(quán)利要求86的抗體，其中血管發(fā)生促進(jìn)或引起多囊性腎病。
89.權(quán)利要求86的抗體，其中血管發(fā)生促進(jìn)或引起糖尿病視網(wǎng)膜病。
90.權(quán)利要求86的抗體，其中血管發(fā)生促進(jìn)或引起類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
91.權(quán)利要求86的抗體，其中血管發(fā)生促進(jìn)或引起牛皮癬。
92.權(quán)利要求76的抗體，其中抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)
93.權(quán)利要求92的抗體，其中所述腫瘤是腺癌，白血病，淋巴瘤，黑素瘤，肉瘤，或tetratocarcinoma。
94.權(quán)利要求92的抗體，其中所述腫瘤是腎上腺，膀胱，骨，骨髓，腦，乳腺，子宮頸，膽囊，神經(jīng)節(jié)，胃腸道，心臟，腎，肝，肺，肌肉，卵巢，胰腺，甲狀旁腺，陰莖，前列腺，唾液腺，皮膚，脾，睪丸，胸腺，甲狀腺，或子宮的癌。
95.含有一定量的權(quán)利要求76的單克隆抗體，或者其生物活性片段和合適的賦形劑的藥物組合物。
96.雜交瘤株TEM1-70。
97.特異性結(jié)合TEM1的單克隆抗體，或者其生物活性片段，其中所述抗體由雜交瘤TEM1-7產(chǎn)生。
98.單克隆抗體，或者其生物活性片段，其中抗體包括與權(quán)利要求97的抗體的可變區(qū)相同的氨基酸序列。
99.權(quán)利要求98的抗體，其中所述抗體是IgG抗體。
100.權(quán)利要求99的抗體，其中所述IgG抗體選自由IgG1，IgG2，IgG3和IgG4組成的IgG亞類(lèi)的成員。
101.權(quán)利要求100的方法，其中所述抗體是IgG1抗體。
102.權(quán)利要求100的方法，其中所述抗體是IgG2抗體。
103.權(quán)利要求100的方法，其中所述抗體是IgG3抗體。
104.權(quán)利要求100的方法，其中所述抗體是IgG4抗體。
105.權(quán)利要求97的抗體，其中重鏈的至少一個(gè)氨基酸被缺失，添加，或者被不同于原來(lái)氨基酸的氨基酸取代。
106.權(quán)利要求97的抗體，其中所述抗體偶聯(lián)于抗血管發(fā)生劑或抗腫瘤劑。權(quán)利要求76的抗體，其中所述抗體抑制血管發(fā)生。
107.權(quán)利要求97的抗體，其中所述抗體抑制血管發(fā)生。
108.權(quán)利要求107的抗體，其中血管發(fā)生促進(jìn)或引起癌癥。
109.權(quán)利要求107的抗體，其中血管發(fā)生促進(jìn)或引起多囊性腎病。
110.權(quán)利要求107的抗體，其中血管發(fā)生促進(jìn)或引起糖尿病視網(wǎng)膜病。
111.權(quán)利要求107的抗體，其中血管發(fā)生促進(jìn)或引起類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
112.權(quán)利要求107的抗體，其中血管發(fā)生促進(jìn)或引起牛皮癬。
113.權(quán)利要求97的抗體，其中抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)
114.權(quán)利要求113的抗體，其中所述腫瘤是腺癌，白血病，淋巴瘤，黑素瘤，肉瘤，或tetratocarcinoma。
115.權(quán)利要求113的抗體，其中所述腫瘤是腎上腺，膀胱，骨，骨髓，腦，乳腺，子宮頸，膽囊，神經(jīng)節(jié)，胃腸道，心臟，腎，肝，肺，肌肉，卵巢，胰腺，甲狀旁腺，陰莖，前列腺，唾液腺，皮膚，脾，睪丸，胸腺，甲狀腺，或子宮的癌。
116.含有一定量的權(quán)利要求97的單克隆抗體，或者其生物活性片段和合適的賦形劑的藥物組合物。
117.雜交瘤株TEM1-7。
118.特異性結(jié)合TEM1的單克隆抗體，或者其生物活性片段，其中所述抗體由雜交瘤TEM1-38產(chǎn)生。
119.單克隆抗體，或者其生物活性片段，其中抗體包括與權(quán)利要求118的抗體的可變區(qū)相同的氨基酸序列。
120.權(quán)利要求119的抗體，其中所述抗體是IgG抗體。
121.權(quán)利要求120的抗體，其中所述IgG抗體選自由IgG1，IgG2，IgG3和IgG4組成的IgG亞類(lèi)的成員。
122.權(quán)利要求121的方法，其中所述抗體是IgG1抗體。
123.權(quán)利要求121的方法，其中所述抗體是IgG2抗體。
124.權(quán)利要求121的方法，其中所述抗體是IgG3抗體。
125.權(quán)利要求121的方法，其中所述抗體是IgG4抗體。
126.權(quán)利要求118的抗體，其中重鏈的至少一個(gè)氨基酸被缺失，添加，或者被不同于原來(lái)氨基酸的氨基酸取代。
127.權(quán)利要求118的抗體，其中所述抗體偶聯(lián)于抗血管發(fā)生劑或抗腫瘤劑。
128.權(quán)利要求118的抗體，其中所述抗體抑制血管發(fā)生。
129.權(quán)利要求128的抗體，其中血管發(fā)生促進(jìn)或引起癌癥。
130.權(quán)利要求128的抗體，其中血管發(fā)生促進(jìn)或引起多囊性腎病。
131.權(quán)利要求128的抗體，其中血管發(fā)生促進(jìn)或引起糖尿病視網(wǎng)膜病。
132.權(quán)利要求128的抗體，其中血管發(fā)生促進(jìn)或引起類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
133.權(quán)利要求128的抗體，其中血管發(fā)生促進(jìn)或引起牛皮癬。
134.權(quán)利要求118的抗體，其中抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)。
135.權(quán)利要求134的抗體，其中所述腫瘤是腺癌，白血病，淋巴瘤，黑素瘤，肉瘤，或tetratocarcinoma。
136.權(quán)利要求113的抗體，其中所述腫瘤是腎上腺，膀胱，骨，骨髓，腦，乳腺，子宮頸，膽囊，神經(jīng)節(jié)，胃腸道，心臟，腎，肝，肺，肌肉，卵巢，胰腺，甲狀旁腺，陰莖，前列腺，唾液腺，皮膚，脾，睪丸，胸腺，甲狀腺，或子宮的癌。
137.含有一定量的權(quán)利要求118的單克隆抗體，或者其生物活性片段和合適的賦形劑的藥物組合物。
138.雜交瘤株TEM1-38。
全文摘要
本發(fā)明提供的方法和組合物涉及內(nèi)皮細(xì)胞增殖，遷移，和小管形成的抑制，因此用于治療血管發(fā)生相關(guān)疾病，包括癌癥，多囊性腎病，糖尿病視網(wǎng)膜病，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，和牛皮癬。公開(kāi)了通過(guò)施用對(duì)于腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物(TEMs)特異性的抗體來(lái)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，遷移，和小管形成的方法。還公開(kāi)了通過(guò)施用在這樣的方法中有用的TEM－特異性抗體和抗體組合物來(lái)抑制血管發(fā)生和腫瘤生長(zhǎng)的方法。
文檔編號(hào)A61P9/00GK1832965SQ200480012126
公開(kāi)日2006年9月13日 申請(qǐng)日期2004年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月4日
發(fā)明者B·泰徹爾, B·羅伯茨, 片岡之郎, 田原知幸, 本間央之 申請(qǐng)人:麒麟麥酒株式會(huì)社, 金齊姆公司