專利名稱：回折擬態(tài)及其相關(guān)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及回折擬態(tài)(reverse-turn mimetic)結(jié)構(gòu)和與其相關(guān)的化合物庫。本發(fā)明還涉及在例如癌癥疾病之類的醫(yī)學(xué)疾病治療中的用途，并且涉及含有該擬態(tài)的藥學(xué)組合物。
背景技術(shù)：
為確定分子作為治療劑的可能活性，對其進(jìn)行隨機(jī)篩選已經(jīng)存在了多年，并且導(dǎo)致大量重要藥物的發(fā)現(xiàn)。當(dāng)分子生物學(xué)和計算化學(xué)的進(jìn)展已經(jīng)導(dǎo)致對被稱為“合理化藥物設(shè)計(rational drug design)”的興趣日益增長的時候，這種技術(shù)并未證實如最初所預(yù)期的那樣快捷或可靠。因此，近幾年來人們的興趣重新轉(zhuǎn)向隨機(jī)藥物篩選。因此，基于組合化合物庫的發(fā)展和在生物活性成員檢索中對這種庫的篩選的新技術(shù)，邁出了特殊的一步。
通常，組合化合物庫僅僅是分子的收集。這種庫隨該庫中化學(xué)物種，以及用來產(chǎn)生庫成員并且分辨哪些成員與所關(guān)心的生物靶互相作用的方法而改變。雖然這一領(lǐng)域尚屬初期，用于生成并篩選庫的方法已經(jīng)變得非常多樣和成熟。例如，最近的關(guān)于各種組合化合物庫的綜述已經(jīng)識別了一定數(shù)目的這種技術(shù)(Dolle，J.Com.Chem.，2(3)383-433，2000)，包括標(biāo)記的和未標(biāo)記的庫成員的使用(Janda，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9110779-10785，1994)。
最初，組合化合物庫通常限于肽源或核苷酸源的成員。因此，Houghten等人的技術(shù)說明了被稱為“雙重定義迭代(dual-definediterative)”法的例子，其通過裂分合成(split synthesis)技術(shù)匯集可溶性組合肽庫(Nature(London)35484-86，1991；Biotechniques 13412-421，1992；Bioorg.Med.Chem.Lett.3405-412，1993)。通過這種技術(shù)，可以獲得含有數(shù)千萬成員的可溶性肽庫。這種庫已經(jīng)在例如甲硫氨酸-腦啡肽和亮氨酸-腦啡肽的阿片樣肽的識別中顯示出效果(Dooley和Houghten，Life Sci.52，1509-1517，1993)，而N-?；膸煲呀?jīng)用于識別acetalins，其是有效的阿片樣物質(zhì)拮抗劑(Dooley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9010811-10815，1993)。近來，已經(jīng)構(gòu)建了全D-氨基酸阿片樣肽庫，并且對其對mu(“μ”)阿片樣物質(zhì)受體的鎮(zhèn)痛活性進(jìn)行了篩選(Dooley等，Science 2662019-2022，1994)。
雖然含有肽源和核苷酸源成員的組合庫具有重要價值，該領(lǐng)域中仍然需要含有不同源成員的庫。例如，傳統(tǒng)的肽庫很大程度上僅僅改變氨基酸序列而產(chǎn)生庫成員。雖然確實要承認(rèn)肽的二級結(jié)構(gòu)對生物活性至關(guān)重要，這種肽庫無法賦予其庫成員受限的二級結(jié)構(gòu)。
因此，一些研究人員用二硫橋使肽環(huán)化，試圖提供更受限的二級結(jié)構(gòu)(Tumelty等，J.Chem.Soc.1067-68，1994；Eichler等，Peptide Res.7300-306，1994)。然而，這種環(huán)化的肽通常仍然非常容易變形，很難進(jìn)行生物應(yīng)用，因此僅僅獲得了有限的成功。
最近，發(fā)展了非肽化合物，其非常接近地模仿了在生物活性蛋白質(zhì)或肽中發(fā)現(xiàn)的回折的二級結(jié)構(gòu)。例如，Kahn的美國專利第5,440,013號和Kahn公開的PCT申請第WO94/03494、WO01/00210A1和WO01/16135A2分別公開了結(jié)構(gòu)受限的非肽化合物，其模仿了回折的三維結(jié)構(gòu)。此外，均屬于Kahn的美國專利第5,929,237號及其部分繼續(xù)申請美國專利第6,013,458號公開了結(jié)構(gòu)受限的化合物，其模仿了生物活性肽和蛋白質(zhì)的回折區(qū)的二級結(jié)構(gòu)。Obrecht對結(jié)構(gòu)受限的回折擬態(tài)的合成和識別，及其對疾病的應(yīng)用進(jìn)行了詳細(xì)地綜述(Advances inMed.Chem.，4，1-68，1999)。
雖然在結(jié)構(gòu)受限的回折擬態(tài)的合成和識別上已經(jīng)取得顯著的進(jìn)展，該領(lǐng)域中仍然需要模擬肽二級結(jié)構(gòu)的小分子。該領(lǐng)域還需要含有這種成員的庫，以及合成和篩選所關(guān)注的靶，特別是生物靶的庫成員的技術(shù)，以識別生物活性庫成員。
本發(fā)明也滿足了這些需要，并且通過提供模仿生物活性肽和蛋白質(zhì)回折區(qū)二級結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)受限化合物，而進(jìn)一步提供了相關(guān)的優(yōu)勢。
Wnt信號通道(Wnt signaling pathway)調(diào)節(jié)多種過程，包括細(xì)胞生長、腫瘤發(fā)生和發(fā)展(Moon等，1997，Trends Genet.13，157-162；Miller等，1999，Oncogene 18，7860-7872；Nusse和Varmus，1992，Cell 69，1073-1087；Cadigan和Nusse，1997，Genes Dev.11，3286-3305；Peifer和Polakis，2000 Science 287，1606-1609；Polakis 2000，Genes Dev.14，1837-1851)。已經(jīng)在各種生物體內(nèi)對Wnt信號通道進(jìn)行了深入的研究。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Wnt signal transduction)激活的TCF4/β-連蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，在其生物功能中扮演關(guān)鍵角色(Molenaar等，1996，Cell 86391-399；Gat等，1998 Cell 95605-614；Orford等，1999J.Cell.Biol.146855-868；Bienz和Clevers，2000，Cell 103311-20)。
在缺少Wnt信號的情況下，腫瘤抑制基因結(jié)腸腺瘤樣息肉(APC)同時與絲氨酸激酶糖原合成酶激酶(GSK)-3β和β-連環(huán)蛋白相互作用(Su等，1993，Science 262，1734-1737；Yost等，1996Genes Dev.10，1443-1454；Hayashi等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，242-247；Sakanaka等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，3020-3023；Sakanaka和William，1999，J.Biol.Chem 274，14090-14093)。通過GSK-3β進(jìn)行的APC磷酸化作用，對APC與β-連環(huán)蛋白之間的相互作用加以調(diào)節(jié)，其可以反過來調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白的信號功能(B.Rubinfeld等，Science 272，1023，1996)。Wnt信號穩(wěn)定了β-連環(huán)蛋白，允許其易位到其與轉(zhuǎn)錄因子的淋巴增強(qiáng)因子(LEF1)/T-細(xì)胞因子(TCF4)家族中的成員相互作用的核處(Behrens等，1996Nature 382，638-642；Hsu等，1998，Mol.Cell.Biol.18，4807-4818；Roose等，1999Science 285，1923-1926)。
近來顯示，公知的腫瘤基因c-myc作為β-連環(huán)蛋白/TCF4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的靶基因(He等，1998Science 281，1509-1512；Kolligs等，1999 Mol.Cell.Biol.19，5696-5706)。已經(jīng)識別出許多其它重要基因，包括細(xì)胞周期蛋白D1和金屬蛋白酶，其也涉及腫瘤形成，這些基因是受TCF4/β-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)錄通道所調(diào)節(jié)的(Crawford等，1999，Oncogene 18，2883-2891；Shtutman等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，11，5522-5527；Tetsu和McCormick，1999Nature，398，422-426)。
此外，發(fā)現(xiàn)Wnt信號的幾種下游介質(zhì)的超量表達(dá)調(diào)節(jié)了編程性細(xì)胞死亡(Moris等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，7950-7954；He等，1999，Cell 99，335-345；Orford等，1999J.Cell.Biol.，146，855-868；Strovel和Sussman，1999，Exp.Cell.Res.，253，637-648)。人類結(jié)腸癌細(xì)胞中APC的超量表達(dá)，誘導(dǎo)了編程性細(xì)菌死亡(Moris等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，93，7950-7954)，β-連環(huán)蛋白的異位表達(dá)抑制了與胞外基質(zhì)附著物缺失有關(guān)的編程性細(xì)胞死亡(Orford等，1999，J.CellBiol.146，855-868)。通過TCF4的顯性負(fù)突變體的表達(dá)對TCF4/β-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)錄的抑制，阻斷了Wnt-1-介導(dǎo)的細(xì)胞存活，并且使細(xì)胞對例如抗癌劑之類的編程性細(xì)胞死亡刺激物敏感(Shaoqiong Chen等，2001，J.Cell.Biol.，152，1，87-96)，并且APC突變通過允許一種公知的抗編程性細(xì)胞死亡的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)性存活蛋白基因表達(dá)，來抑制編程性細(xì)胞死亡(Tao Zhang等，2001，Cancer Research，62，8664-8667)。
盡管在人類癌癥中尚未發(fā)現(xiàn)Wnt基因的突變，APC或β-連環(huán)蛋白中的突變，如在大多數(shù)結(jié)腸腫瘤的案例中那樣，導(dǎo)致了TCF4的不適當(dāng)?shù)募せ?、c-myc的超量表達(dá)和腫瘤生長的產(chǎn)生(Bubinfeld等，1997，Science，275，1790-1792；Morin等，1997，Science，275，1787-1790；Casa等，1999，Cell.Growth.Differ.10，369-376)。在85％的結(jié)腸癌以及各種其它癌中，腫瘤抑制基因(APC)缺失或未激活(Kinzler和Vogelstein，1996，Cell 87，159-170)。APC的主要作用是Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(Wntsignal transduction cascade)的負(fù)調(diào)節(jié)物。該通道的中心特征包括，通過與含有APC的大Axin基復(fù)合體的相互作用，而對β-連環(huán)蛋白的胞質(zhì)池的穩(wěn)定性和定位進(jìn)行調(diào)節(jié)。這種相互作用導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白的磷酸化，從而將其定為目標(biāo)而降解。
最初，CREB結(jié)合蛋白質(zhì)(CBP)/p300是在蛋白質(zhì)相互作用分析中識別的，其首先通過其與轉(zhuǎn)錄因子CREB的關(guān)聯(lián)(Chrivia等，1993，Nature，365，855-859)，然后通過其與腺病毒轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)E1A的相互作用(Stein等，1990，J.Viol.，64，4421-4427；Eckner等，1994，Genes.Dev.，8，869-884)。CBP具有參與包括轉(zhuǎn)錄共激活功能在內(nèi)的各種細(xì)胞功能的潛力(Shikama等，1997，Trends.Cell.Biol.，7，230-236；Janknecht和Hunter，1996，Nature，383，22-23)。CBP/p300加強(qiáng)了作為公知的Wnt靶的siamois啟動子的β-連環(huán)蛋白介導(dǎo)激活(Hecht等，2000，EMBO J.19，8，1839-1850)。β-連環(huán)蛋白直接與CBP的CREB結(jié)合區(qū)相互作用，并且β-連環(huán)蛋白與CBP一起協(xié)同增效以刺激TCF4/β-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄激活(Ken-Ichi Takemaru和Randall T.Moon，2000J.Cell.Biol.，149，2，249-254)。

發(fā)明內(nèi)容
由背景技術(shù)可看到，TCF4/β-連環(huán)蛋白和Wnt通道的CBP復(fù)合體可以用作調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、腫瘤形成和細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡等的靶分子。因此，本發(fā)明涉及通過抑制CBP來阻斷TCF4/β-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)錄通道的化合物，因此該化合物可用于治療癌癥，尤其是結(jié)腸癌。
簡要的說，本發(fā)明涉及一種新型的結(jié)構(gòu)受限的化合物，其模仿生物活性肽和蛋白質(zhì)回折區(qū)的二級結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還公開了含有這些化合物的庫，以及對其的合成與篩選。
本發(fā)明的化合物具有以下通式(I) 其中A是-(CHR3)-或-(C＝O)-，B是-(CHR4)-或-(C＝O)-，D是-(CHR5)-或-(C＝O)-，E是-(ZR6)-或-(C＝O)-，G是-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-或-(C＝O)-，W是-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y是氧、硫或-NH-，X和Z獨立地是氮或CH，n＝0或1；而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9可以相同或不同，并且獨立地選自氨基酸側(cè)鏈部分或其衍生物、分子殘余部分、連接基或固體載體、及其立體異構(gòu)體。
在一個實施方式中，其中A是-(CHR3)-，B是-(C＝O)-，D是-(CHR5)-，E是-(C＝O)-，并且G是-(XR7)n-，本發(fā)明的化合物具有下式(II) 其中W、X、Y和n如上定義，并且R1、R2、R3、R5和R7如下面的詳細(xì)說明所定義。
在一個實施方式中，其中A是-(C＝O)-，B是-(CHR4)-，D是-(C＝O)-，E是-(ZR6)-，并且G是-(C＝O)-(XR9)-，本發(fā)明的化合物具有下式(III)
其中W、X和Y如上定義，Z是氮或CH(限定當(dāng)Z是CH時，那么X是氮)，并且R1、R2、R4、R6和R9如下面的詳細(xì)說明所定義。
在一個實施方式中，其中A是-(C＝O)-，B是-(CHR4)-，D是-(C＝O)-，E是-(ZR6)-，并且G是-(XR7)n-，本發(fā)明的化合物具有以下通式(IV) 其中W、Y和n如上所述，Z是氮或CH(當(dāng)Z為氮時，則n為0，而當(dāng)Z為CH時，則X為氮并且n不為0)，并且R1、R2、R4、R6和R7如下面的詳細(xì)說明所定義。
本發(fā)明還涉及含有一種或多種上式(I)的化合物，以及用于合成這種庫的方法和用于對這種庫進(jìn)行篩選從而識別生物活性化合物的方法。還公開了含有本發(fā)明的化合物與藥學(xué)上可接受載體或稀釋劑相組合的組合物。
本發(fā)明還涉及使用含有一種或多種式(I)的化合物的庫，識別生物活性化合物的方法。在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了一種用于進(jìn)行結(jié)合分析(binding assay)的方法，包括(a)提供含有第一共激活劑(firstco-activator)和相互作用蛋白(interacting protein)的組合物，所述第一共激活劑含有LXXLL、LXXLI或者FXXFF的結(jié)合基序，其中X是任何氨基酸；(b)將第一共激活劑和相互作用蛋白與檢測化合物相結(jié)合；以及(c)在具有通式(I)的化合物的存在下，檢測第一共激活劑和相互作用蛋白之間的結(jié)合的改變。
本發(fā)明還提供了用于預(yù)防或治療與Wnt信號通道有關(guān)的病癥。可以用本發(fā)明的化合物或組合物治療或預(yù)防的病癥包括腫瘤或癌癥(例如，與KSHV相關(guān)的腫瘤)、與血管成形術(shù)有關(guān)的再狹窄、多囊腎病、異常血管生成病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)節(jié)性硬化綜合癥、脫發(fā)和阿爾茨海默氏病。這種方法包括根據(jù)需要對受體施用可達(dá)到預(yù)期結(jié)果的有效量的本發(fā)明的化合物或組合物。
在相關(guān)的方面，本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于促進(jìn)神經(jīng)突生成、神經(jīng)干細(xì)胞分化和癌細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的方法。這種方法包括對合適的細(xì)胞施予可達(dá)到預(yù)期結(jié)果的有效量的本發(fā)明的化合物或組合物。
參考附圖和下面的詳細(xì)說明，本發(fā)明的這些方面和其它方面將會是顯而易見的。因此，本文中列出了多種更詳細(xì)地說明了某些程序、化合物和/或組合物的參考文件，它們整體引入作為參考。


圖1提供了制備本發(fā)明的回折擬態(tài)的一般合成方案。
圖2提供了制備本發(fā)明的回折擬態(tài)的一般合成方案。
圖3顯示了使用SW480細(xì)胞測量的本發(fā)明化合物A的IC50的曲線圖，其中在實施例4所制備的化合物A的各種濃度下測量對SW480細(xì)胞的細(xì)胞生長抑制，以得到IC50值。具體地說，測定了化合物A對螢火蟲和海腎(renilla)熒光素酶活性的抑制度。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)化合物A對SW480細(xì)胞生長的IC50如表4所示。詳細(xì)程序如實施例6所公開。
圖4.PC-12細(xì)胞在有被平皿(coated dish)上培養(yǎng)，并且在50ng/ml的神經(jīng)生長因子(NGF)中分化10天(如實施例7所述)。(A、B)載體轉(zhuǎn)染的PC-12細(xì)胞(A)和PC-12細(xì)胞超量表達(dá)wt PS-1(B)在NGF中10天后表現(xiàn)出廣泛的神經(jīng)突生成。(C)PC-12細(xì)胞表達(dá)突變體PS-1/L286V在相同的培養(yǎng)條件下未顯示明顯的神經(jīng)突。(D、E)神經(jīng)突生成的分子標(biāo)記GAP-43的免疫熒光分析(如實施例7所述)，證明了在PC-12細(xì)胞(E)中載體轉(zhuǎn)染的和超量表達(dá)的PS-1/WT的神經(jīng)突(D)中對GAP-43的強(qiáng)染色。(F)神經(jīng)突生成的缺乏對應(yīng)于突變體細(xì)胞中的弱GAP-43免疫染色。數(shù)據(jù)代表至少兩個獨立實驗。(G)用Topflash轉(zhuǎn)染分化細(xì)胞，Topflash是一種TCF/β-連環(huán)蛋白報道構(gòu)造(reporter construct)。使細(xì)胞溶解，并且在轉(zhuǎn)染后6小時測量其熒光素活性(如實施例7所述)。數(shù)據(jù)代表三個獨立實驗的平均(±SD)。星號表示P＜0.05。
圖5.化合物D表型地矯正了PC-12超量表達(dá)的突變體PS-1/L286V細(xì)胞中的不完全神經(jīng)元分化。在分化期間，除NGF之外，突變體細(xì)胞暴露在10μM化合物D中(Misner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，11714(2001))。(A)在用化合物D處理過的PC-12細(xì)胞超量表達(dá)的PS-1/L286V中觀察到神經(jīng)突的延伸和伸展。(B)GAP-43(綠)在突變體細(xì)胞中明顯的提高了，并且可以在神經(jīng)突中看到。(C)PC-12細(xì)胞中神經(jīng)突生成的量化。神經(jīng)突長度大于兩個細(xì)胞直徑的突變體細(xì)胞的數(shù)目，少于PC-12細(xì)胞中載體轉(zhuǎn)染的和超量表達(dá)的PS-1/WT數(shù)目的10％。具有所定義的神經(jīng)突長度的突變體PS-1/L286V細(xì)胞的數(shù)目，在用10μM化合物D處理過后明顯提高。結(jié)果是三次獨立測定的平均(±SD)。星號表示P＜0.05。
圖6.Ephrin B2(EphB2)受體表達(dá)。進(jìn)行免疫熒光分析和RT-PCR以檢測EphB2受體表達(dá)(如實施例7所述)。(A、B)EphB2受體在載體轉(zhuǎn)染的和超量表達(dá)的PS-1/WT細(xì)胞的神經(jīng)突中清楚地展示。染色的強(qiáng)度與高表達(dá)水平有關(guān)。(C)相反，PS-1/L286V PC-12細(xì)胞具有顯著降低的EphB2受體表達(dá)。(D)用化合物D治療突變體細(xì)胞，從而導(dǎo)致EphB2受體表達(dá)升高，其聚焦于神經(jīng)突生長點。(E)EphB2受體的表達(dá)先前顯示為轉(zhuǎn)錄地調(diào)節(jié)(Guo等，J.Neurosci.17，4212(1997))。線道1，載體轉(zhuǎn)染的PC-12細(xì)胞，線道2，超量表達(dá)的PS-1/WT細(xì)胞，線道3，超量表達(dá)的突變體PS-1/L286V細(xì)胞，線道4，用化合物D處理過的突變體細(xì)胞。RT-PCR分析顯示，細(xì)胞超量表達(dá)的突變體PS-1/L285V中的EphB2受體的信息，與載體轉(zhuǎn)染的和超量表達(dá)的wtPS-1 PC-12細(xì)胞相比均有所下降。用10μM化合物D處理上調(diào)了EphB2信息。
圖7.A，化合物D在G1中抑制了細(xì)胞。在SW480(下部的一系列)上進(jìn)行FACS分析，并且用化合物D(25μM)(右)或者對照(0.5％0DMSO(左)將HCT116(上部的一系列)細(xì)胞處理24小時。5.5×106個細(xì)胞用碘化丙錠(PI)進(jìn)行固定和染色。B，化合物D選擇性地激活了結(jié)腸癌細(xì)胞系中的胱天蛋白酶(caspase)。SW480和HCT116(左圖)細(xì)胞(105)連同正常的colonocyte CCD18Co(右圖)一起用對照(0.5％DMSO)或者化合物D(25μM)進(jìn)行處理。經(jīng)過處理后24小時，使細(xì)胞溶解并且測量胱天蛋白酶-3/7的酶活性。通過從處理過的樣品(化合物D或?qū)φ?減去空白(對照，沒有細(xì)胞)來計算相對熒光單位(RFU)，并且繪圖。
圖8.化合物D減少了菌落在軟瓊脂中劑量依賴形式的生長。向三個孔的SW480(5000個細(xì)胞/孔)中加入提高濃度的5-氟尿嘧啶(5-FU)(0.5-32μM)和化合物D(0.25-5μM)。洗滌細(xì)胞并使其懸浮在軟瓊脂菌種生長培養(yǎng)基中。計算8天后菌落的數(shù)目(直徑超過60μM的菌落)并且用其對化合物濃度作圖。顯示了三個測定結(jié)果的平均±SE。不存在該化合物的對照的菌落數(shù)目為1,637±71。
圖9.A，化合物C降低了裸鼠模型的腫瘤生長。B，化合物C稍微降低了裸鼠模型的體重。
圖10.存活蛋白的轉(zhuǎn)錄活性被Wnt1向上調(diào)節(jié)，但是被化合物D壓下。在野生型CBP+/-和p300+/-3T3細(xì)胞中，在不存在Wnt1和化合物D的情況下，或者在存在Wnt1或化合物D的情況下或者二者均存在的情況下，測量熒光素酶活性百分比。
圖11.化合物A(右圖)和化合物D(左圖)抑制了SW480細(xì)胞中存活蛋白熒光素酶報道基因的活性。在用各種濃度的化合物A或者化合物D處理過的SW480細(xì)胞中，測量在存活蛋白啟動子(survivinpromoter)的控制下的熒光素酶活性。
圖12.RT-PCR分析表明，化合物D處理降低了存活蛋白基因的表達(dá)水平。
圖13.化合物D降低了各種蛋白與存活蛋白啟動子的關(guān)聯(lián)。在用化合物D(25μM)或?qū)φ?0.5％DMSO)處理了18個小時的SW480細(xì)胞上進(jìn)行ChIP化驗。
圖14.化合物D在翻譯水平上降低了存活蛋白的表達(dá)。A，使用存活蛋白6E4單克隆抗體(Cell Signaling Technolgy)對用單獨的載體(0.5％DMSO)、10μM或25μM化合物D、或者5μM 5-FU處理過的細(xì)胞提取物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。B，存活蛋白免疫熒光顯微鏡檢查。用抗存活蛋白綠對培養(yǎng)的癌細(xì)胞進(jìn)行固定和染色。C，存活蛋白免疫熒光顯微鏡檢查。用抗存活蛋白綠對用化合物D處理過的SW480細(xì)胞進(jìn)行固定和染色。
圖15.化合物D經(jīng)過對存活蛋白表達(dá)的抑制而激活了胱天蛋白酶3的活性(但是不是胱天蛋白酶2的活性)。用星形孢菌素(stausporine)(0.5μM)、化合物D(2.5μM或5.0μM)或者這二者，對用或未用含有存活蛋白基因的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染過的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行處理。測量這些細(xì)胞中胱天蛋白酶2和胱天蛋白酶3的活性。
圖16.化合物D通過對存活蛋白表達(dá)的抑制促進(jìn)了細(xì)胞的死亡。用星形孢菌素(0.5μM)、化合物D(5.0μM)或者這二者，對用或未用含有存活蛋白基因的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染過的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行處理。測量這些細(xì)胞的細(xì)胞死亡。
圖17.化合物D提高了G0中細(xì)胞的數(shù)目。用星形孢菌素(0.5μM)、化合物D(5μM)或者這二者，對用或未用含有存活蛋白基因的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染過的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行處理。對這些細(xì)胞進(jìn)行FACS分析并且顯示了G0中細(xì)胞的百分比。
具體實施例方式
本發(fā)明涉及模仿了生物肽和蛋白質(zhì)回折區(qū)的二級結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)受限的化合物(本文中也稱為“回折擬態(tài)“)，并且還涉及與其相關(guān)的化合物庫。
本發(fā)明的回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)可用作生物活性劑，包括(但是不限于)用作診斷劑、預(yù)防劑和/或治療劑。本發(fā)明的回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)庫可用于識別具有這種用途的生物活性劑。在本發(fā)明的實際用途中，庫可以含有數(shù)十至數(shù)百至數(shù)千(或者更多)種獨立的回折結(jié)構(gòu)(本文中也被稱為“成員”)。
在本發(fā)明的一個方面，公開了具有下式(I)的回折擬態(tài)結(jié)構(gòu) 其中A是-(CHR3)-或-(C＝O)-，B是-(CHR4)-或-(C＝O)-，D是-(CHR5)-或-(C＝O)-，E是-(ZR6)-或-(C＝O)-，G是-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-或-(C＝O)-，W是-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y是氧、硫或-NH-，X和Z獨立地是氮或CH，n＝0或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9可以相同或不同，并且獨立地選自氨基酸側(cè)鏈部分或其衍生物、分子殘余部分、連接基團(tuán)或固體載體、及其立體異構(gòu)體。
在一個實施方式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9獨立地選自氨基C2-5烷基、胍C2-5烷基、C1-4烷基胍基C2-5烷基、二C1-4烷基胍基-C2-5烷基、脒基C2-5烷基、C1-4烷基脒基C2-5烷基、二C1-4烷基脒基C2-5烷基、C1-3烷氧基、苯基、取代苯基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、芐基、取代芐基(其中芐基上的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、萘基、取代萘基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、雙苯基甲基、取代雙苯基甲基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、吡啶基、取代吡啶基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、吡啶基C1-4烷基、取代吡啶基C1-4烷基(其中吡啶的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、嘧啶基C1-4烷基、取代嘧啶基C1-4烷基(其中嘧啶的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、三嗪-2-基-C1-4烷基、取代三嗪-2-基-C1-4烷基(其中三嗪的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、咪唑并C1-4烷基、取代咪唑并C1-4烷基(其中咪唑的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、咪唑啉基C1-4烷基、N-脒基哌嗪基-N-C0-4烷基、羥基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、羥基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、C1-5二烷基氨基C2-5烷基、N-脒基哌啶基C1-4烷基和4-氨基環(huán)己基C0-2烷基。
在一個實施方式中，E的R1、R2、R6和G的R7、R8和R9可以相同或不同，并且表示化合物的殘余部分，而A的R3、B的R4或D的R5選自氨基酸側(cè)鏈部分或其衍生物。這里所使用的術(shù)語“化合物的殘余部分”表示共價結(jié)合到回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)的R1、R2、R5、R6、R7、R8和/或R9位置的任何分子部分、試劑、化合物、載體(support)、分子、連接基團(tuán)、氨基酸、肽或蛋白質(zhì)。該術(shù)語也包括氨基酸側(cè)鏈部分及其衍生物。
在另一個實施方式中，A的R3、D的R5、E的R6和G的R7、R8和R9可以相同或不同，并且表示化合物的殘余部分，而在B的R1、R2和R4中的一個或多個，并且在一個方面其全部表示氨基酸側(cè)鏈。在這種情況下，術(shù)語“化合物的殘余部分”表示共價結(jié)合到回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)的R3、R5、R6、R7、R8和/或R9位置的任何分子部分、試劑、化合物、載體、分子、連接基團(tuán)、氨基酸、肽或蛋白質(zhì)。該術(shù)語也包括氨基酸側(cè)鏈部分及其衍生物。
這里所使用的術(shù)語“化合物的殘余部分”表示共價結(jié)合到回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)的任何分子部分、試劑、化合物、載體、分子、原子、連接基團(tuán)、氨基酸、肽或蛋白質(zhì)。該術(shù)語也包括氨基酸側(cè)鏈部分及其衍生物。在本發(fā)明的一個方面，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和/或R9中的任意一個或多個位置可以表示化合物的殘余部分。在本發(fā)明的一個方面，R1、R2和R4中的一個或多個表示氨基酸側(cè)鏈部分或其衍生物。
這里所使用的術(shù)語“氨基酸側(cè)鏈部分”表示任何天然蛋白質(zhì)中所存在的氨基酸側(cè)鏈部分，包括(但是不限于)表1中載明的天然氨基酸的側(cè)鏈部分。本發(fā)明的其它天然氨基酸側(cè)鏈部分包括(但是不限于)3，5-二溴酪氨酸、3，5-二碘酪氨酸、羥賴氨酸、γ-羧基谷氨酸鹽、磷酸酪氨酸和磷酸絲氨酸。此外，在本發(fā)明的實際應(yīng)用中也可以使用糖基化的氨基酸側(cè)鏈，包括(但是不限于)糖基化的蘇氨酸、絲氨酸和天門冬酰胺。
表1氨基酸側(cè)鏈部分氨基酸-H甘氨酸-CH3丙氨酸-CH(CH3)2纈氨酸-CH2CH(CH3)2亮氨酸-CH(CH3)CH2CH3異亮氨酸-(CH2)4NH3+賴氨酸-(CH2)3NHC(NH2)NH2+精氨酸 組氨酸-CH2COO-天門冬氨酸-CH2CH2COO-谷氨酸-CH2CONH2天門冬酰胺-CH2CH2CONH2谷酰胺 苯丙氨酸 酪氨酸 色氨酸-CH2SH 半胱氨酸-CH2CH2SCH3甲硫氨酸-CH2OH 絲氨酸-CH(OH)CH3蘇氨酸 脯氨酸 羥基脯氨酸除天然氨基酸側(cè)鏈部分外，本發(fā)明的氨基酸側(cè)鏈部分還包括它們的各種衍生物。這里所使用的氨基酸側(cè)鏈部分的“衍生物”包括天然氨基酸側(cè)鏈部分的變體和/或變異。例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸的氨基酸側(cè)鏈部分通?？梢员粴w類為低鏈烷基、低鏈芳基或低鏈芳烷基部分。氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物包括其它直鏈或支鏈的、環(huán)狀或非環(huán)狀的、取代或非取代的、飽和的或非飽和的低鏈烷基、低鏈芳基或低鏈芳烷基部分。
這里所使用的“低鏈烷基部分”含有1-12個碳原子，“低鏈芳基部分”含有6-12個碳原子，而“低鏈芳烷基部分”含有7-12個碳原子。因此，在一個實施方式中，氨基酸側(cè)鏈衍生物選自C1-12烷基、C6-12芳基和C7-12芳烷基，并且在一個更優(yōu)選的實施方式中，其選自C1-7烷基、C6-10芳基和C7-11芳烷基。
本發(fā)明的氨基酸側(cè)鏈衍生物進(jìn)一步包括低鏈烷基、低鏈芳基和低鏈芳烷基部分的取代衍生物，其中取代基選自(但是不限于)以下化學(xué)部分的一個或多個-OH、-OR、-COOH、-COOR、-CONH2、-NH2、-NHR、-NRR、-SH、-SR、-SO2R、-SO2H、-SOR和鹵素(包括F、Cl、Br和I)，其中各個R的存在獨立地選自直鏈或支鏈的、環(huán)狀或非環(huán)狀的、取代或非取代的、飽和或不飽和的低鏈烷基、低鏈芳基和低鏈芳烷基部分。此外，本發(fā)明的環(huán)狀低鏈烷基、低鏈芳基和低鏈芳烷基部分包括萘，以及雜環(huán)化合物，例如噻吩、吡咯、呋喃、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、3-吡咯啉、吡咯烷、吡啶、嘧啶、嘌呤、喹啉、異喹啉和咔唑。氨基酸側(cè)鏈衍生物進(jìn)一步包括低鏈烷基和低鏈芳烷基部分的烷基部分的雜烷基衍生物，包括(但是不限于)烷基和芳烷基的磷酸酯和硅烷。
代表性的R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9部分具體包括(但是不限于)-OH、-OR、-COR、-COOR、-CONH2、-CONR、-CONRR、-NH2、-NHR、-NRR、-SO2R和-COSR，其中各個R的存在如上所述。
在另一個實施方式中，除了可以是氨基酸側(cè)鏈部分或其衍生物(或者R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是化合物的殘余部分)，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8或R9可以是促進(jìn)化合物與另一個部分或化合物連接的連接基團(tuán)。例如，本發(fā)明的化合物可以連接到一種或多種用于診斷或篩選化驗的公知化合物上，例如生物素。此外，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8或R9可以是將化合物連接到固體載體(例如在固相肽合成中所使用的載體)上的連接基團(tuán)，或者也可以是載體本身。在此實施方式中，連接到另一個部分或化合物上、或者到固體載體上，優(yōu)選在R1、R2、R7或R8、或者R9位置上，更優(yōu)選在R1或R2位置上。
在A是-(CHR3)-、B是-(C＝O)-、D是-(CHR5)-、E是-(C＝O)-并且G是-(XR7)n-的實施方式中，本發(fā)明的回折擬態(tài)化合物具有下式(II) 其中R1、R2、R3、R5、R7、W、X和n如上所述。在優(yōu)選實施方式中，R1、R2和R7表示化合物的殘余部分，并且R3或R5選自氨基酸側(cè)鏈部分。
在A是-(C＝O)-、B是-(CHR4)-、D是-(C＝O)-、E是-(ZR6)-、G是-(C＝O)-(XR9)-的實施方式中，本發(fā)明的回折擬態(tài)化合物具有下式(III) 其中R1、R2、R4、R6、R9、W和X如上所述，Z是氮或CH(當(dāng)Z是CH時，則X是氮)。在優(yōu)選實施方式中，R1、R2、R6和R9代表化合物的殘余部分，并且R4選自氨基酸側(cè)鏈部分。
在更具體的實施方式中，其中A是-(C＝O)-、B是-(CHR4)-、D是-(C＝O)-、E是-(ZR6)-并且G是(XR7)n-，本發(fā)明的回折化合物具有下式(IV)
其中R1、R2、R4、R6、R7、W、X和n如上所述，并且Z是氮或CH(當(dāng)Z是氮時，則n是0，當(dāng)Z是CH時，則X是氮并且n不是0)。在優(yōu)選實施方式中，R1、R2、R6和R7代表化合物的殘余部分，并且R4選自氨基酸側(cè)鏈部分。在一個方面，當(dāng)Z和X都是CH時，R6或R7選自氨基酸側(cè)鏈部分。
這些化合物可以通過使用合適的起始組分分子(下文中稱為“組分片段”)而制備。簡單的說，在具有式(I)的回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)的合成中，使第一和第二組分片段偶聯(lián)以形成結(jié)合的第一-第二中間體，如果必要，使第三和/或第四組分片段偶聯(lián)以形成結(jié)合的第三-第四中間體(或者，如果商品化，可以使用單獨的第三中間體)，然后使結(jié)合的第一-第二中間體與第三-第四中間體偶聯(lián)以提供第一-第二-第三-第四中間體(或者第一-第二-第三中間體)，將該中間體環(huán)化從而生成本發(fā)明的回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)?；蛘撸?I)的回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)可以通過單獨的組分片段在溶液中逐步地，或者如固相肽合成中所常用的一樣通過固相合成，進(jìn)行連續(xù)偶聯(lián)而制備。
制備本發(fā)明的化合物的具體組分片段及其組裝如圖1所示。例如，“第一組分片段”可以具有下式S1 其中R2如上所述，并且R是適用于肽合成的保護(hù)基，其中該保護(hù)基可以連接到聚合載體上以使固相合成能夠進(jìn)行。合適的R基團(tuán)包括烷基，并且在優(yōu)選實施方式中，R是甲基。在圖1中，R基團(tuán)之一是聚合(固體)載體，在該圖中顯示為“Pol”。這種第一組分片段可以通過H2N-R2和CH(OR)2-CHO的還原性胺化作用，或者通過H2N-R2與CH(OR)x-CH2-LG(其中LG代表離去基團(tuán)，例如鹵素(Hal)基團(tuán))之間的取代反應(yīng)而容易地合成。
“第二組分片段”可以具有下式S2 其中P是適用于肽合成的氨基保護(hù)基團(tuán)，L1是羥基或羧基-活化基團(tuán)，并且R4如上所述。優(yōu)選的保護(hù)基團(tuán)包括叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)，叔丁氧基羰基(BOC)、甲氧基羰基(MOC)、9H-芴甲氧羰基(FMOC)，和丙烯氧基羰基(Alloc)。N-保護(hù)的氨基酸是商品化的；例如可從各種來源得到FMOC氨基酸。為使第二組分片段與第一組分片段反應(yīng)，L1是羧基-活化基團(tuán)，并且通過本領(lǐng)域中公知的羧基活化方法可以容易地完成羧基到活化羧基的轉(zhuǎn)換。合適的活化羧酸基團(tuán)包括酸鹵，其中L1是例如氯或溴的鹵素；酸酐，其中L1是例如乙?；孽；?；活性酯，例如N-羥基琥珀酰亞胺酯和五氟苯基酯；以及其它活性中間體，例如使用例如二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的碳二亞胺在偶聯(lián)反應(yīng)中形成的活性中間體。因此，市售的N-保護(hù)氨基酸可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的手段轉(zhuǎn)化為羧酸活性形式。
在氨基酸的疊氮衍生物充當(dāng)?shù)诙M分片段的情況下，這種化合物可以通過Zaloom等人所公開的反應(yīng)(J.Org.Chem.465173-76，1981)，由相應(yīng)的氨基酸制備。
或者，本發(fā)明的第一組分片段可以具有下式S1’ 其中R如上所定義，并且L2是離去基團(tuán)，例如鹵原子或甲苯磺?；⑶冶景l(fā)明的第二組分片段可以具有下式S2’ 其中R2、R4和P如上所定義。
本發(fā)明的“第三組分片段”可以具有下式S3 其中G、E、L1和L2如上所定義。合適的第三組分片段可以是各種來源的市售產(chǎn)品，或者可以通過有機(jī)化學(xué)中公知的方法制備。
在圖1中，式(1)的化合物的A是-(C＝O)-、B是-(CHR4)-、D是-(C＝O)-并且E是-(CR6)-。如圖2所示，其中的羧基在B位并且R基團(tuán)在B位的式(1)的化合物，即，其中A是-(CHR3)-并且B是-(C＝O)-的化合物，可以用與圖1所示方法類似的方法制備。圖2也說明了向第一-第二-第三組分中間體中加入第四組分片段，而不是在與第一-第二中間體片段反應(yīng)之前將第四組分片段附在第三組分片段上。此外，圖2說明了其中D是-(CHR5)-(而不是圖1所示的-(C＝O)-)并且E是-(C＝O)-(而不是圖1所示的-(CHR6)-)的本發(fā)明的化合物的制備過程。最后，圖2說明了其中G是NR7的化合物的制備過程。
因此，如上所述，式(I)的回折擬態(tài)化合物可以通過以下方法合成，使第一組分片段與第二組分片段反應(yīng)從而生成結(jié)合的第一-第二中間體，然后繼續(xù)使結(jié)合的第一-第二中間體與第三組分片段反應(yīng)以提供結(jié)合的第一-第二-第三-第四中間體，然后使該中間體環(huán)化以生成回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明代表性的組分片段的合成如制備實施例和工作實施例所述。
式(III)和(IV)的回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)可以通過與以上公開的模塊化組分合成相類似的技術(shù)而制備，但是對組分片段進(jìn)行適當(dāng)?shù)母摹?br> 本發(fā)明的回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)可用作生物活性劑，例如診斷劑、預(yù)防劑和治療劑。例如，本發(fā)明的回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)可以通過包括對動物施予有效量的式(I)化合物的方法，用于調(diào)節(jié)恒溫動物中的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的肽。
此外，本發(fā)明的回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)還可以有效地用于抑制結(jié)合到恒溫動物的PTB結(jié)構(gòu)域的肽、調(diào)節(jié)恒溫動物的G蛋白偶合受體(GPCR)和離子通道、調(diào)節(jié)恒溫動物的細(xì)胞因子。
同時，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)式(I)的化合物，尤其是式(VI)的化合物有效地抑制或治療受Wnt-信號通道調(diào)節(jié)的病癥，例如癌癥、尤其是結(jié)腸癌。
其中Ra是苯基；帶有一個或多個取代基的取代苯基，其中的一個或多個取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；土u基；芐基；帶有一個或多個取代基的取代芐基，其中的一個或多個取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；土u基；或者具有8至11個環(huán)原子的二環(huán)芳基，其具有1至3個選自氮、氧或硫的雜原子；Rb是具有5至7個環(huán)原子的單環(huán)芳基，其具有1至2個選自氮、氧或硫的雜原子，并且該化合物的芳環(huán)可以具有一個或多個選自鹵素、羥基、氰基、低級烷基和低級烷氧基的取代基；Rc是飽和或不飽和的C1-6烷基、C1-6烷氧基、全氟C1-6烷基基團(tuán)；并且X1、X2和X3可以相同或不同，并且獨立地選自氫、羥基和鹵素。
在另一方面，本發(fā)明的一個目的是提供一種含有安全和有效量的具有通式(VI)的化合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥學(xué)組合物，其可以用于治療受Wnt信號通道調(diào)節(jié)，尤其是受TCF4-β-連環(huán)蛋白-CBP復(fù)合體調(diào)節(jié)的病癥。
此外，本發(fā)明提供了一種使用上述本發(fā)明的化合物抑制腫瘤細(xì)胞生長的方法；一種使用上述本發(fā)明的組合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡的方法；一種使用上述本發(fā)明的組合物治療受TCF4-β連環(huán)蛋白-CBP復(fù)合體調(diào)節(jié)的病癥的方法；以及一種通過將本發(fā)明的組合物與其它抗癌劑一起進(jìn)行給藥來治療例如結(jié)腸癌的癌癥的方法，其它抗癌劑例如5-氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇(taxol)、順鉑、絲裂霉素C、喃氟啶、雷替曲塞(raltitrexed)、卡培他濱(capecitabine)和伊立替康(irinotecan)等。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的化合物具有如下(6S，10R)-構(gòu)型
其中Ra和Rb與前述具有相同的含義。
在本發(fā)明的另一方面，公開了含有本發(fā)明的回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)的庫。一旦組裝完成，可以對本發(fā)明的庫進(jìn)行篩選以識別具有生物活性的單個成員。這種對于庫生物活性成員的篩選可以涉及，例如，評價庫成員的結(jié)合活性或者評價庫成員在功能分析中的效果。篩選通常是通過將庫成員(或者庫成員的亞型)與所關(guān)注的靶，例如抗體、酶、受體或細(xì)胞系，相接觸而完成的。能夠與所關(guān)注的靶相互作用的庫成員，在本文稱為“生物活性庫成員”或者“生物活性擬態(tài)”。例如，生物活性擬態(tài)可以是能夠結(jié)合到抗體或者受體上的庫成員，或者是能夠抑制酶的庫成員，或者是能夠引起或者對抗例如與細(xì)胞系有關(guān)的功能反應(yīng)的庫成員。換句話說，本發(fā)明的庫的篩選確定了哪些庫成員能夠與一種或多種所關(guān)注的生物靶相互作用。此外，當(dāng)相互作用確實發(fā)生時，則可以由庫成員識別生物活性擬態(tài)(或多種擬態(tài))。由庫識別單個(或有限數(shù)量)的生物活性擬態(tài)產(chǎn)生了本身具有生物活性的回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)，因此可用作診斷劑、預(yù)防劑或者治療劑，還可以進(jìn)一步用于極大地發(fā)展這些領(lǐng)域中先導(dǎo)化合物的識別。
合成本發(fā)明的庫的肽擬態(tài)，可以使用已知的肽合成技術(shù)進(jìn)行，使本發(fā)明的第一、第二和第三組分片段結(jié)合。更具體地說，可以向結(jié)構(gòu)受限的回折擬態(tài)的N-末端和/或C-末端添加任意的氨基酸序列。因此，擬態(tài)可以通過已知技術(shù)在固體載體上(例如PAM樹脂)合成(參見，例如，John M.Stewart和Janis D.Young，Solid Phase Peptide Synthesis，1984，Pierce Chemical Comp.，Rockford，III.)，或者通過醇連接(alcoholattachment)在甲硅烷基鍵連的樹脂上合成(參見Randolph等，J.AmChem.Soc.1175712-14，1995)。
此外，可以組合使用溶液合成技術(shù)和固相合成技術(shù)以合成本發(fā)明的肽擬態(tài)。例如，可以利用固體載體合成鏈狀肽序列，直到結(jié)構(gòu)受限的回折加入該序列中。然后可以將通過溶液合成技術(shù)預(yù)先合成的合適的結(jié)構(gòu)受限的回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)，作為下一個“氨基酸”加入到固相合成中(即，可以使用既具有N-末端又具有C-末端的結(jié)構(gòu)受限的回折擬態(tài)作為將要加入到鏈狀肽中的下一個氨基酸)。通過將結(jié)構(gòu)受限的回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)結(jié)合到序列中，然后可以加入另外的氨基酸以使結(jié)合到固體載體上的肽完成?；蛘?，可以在固體載體上合成鏈狀的N-末端和C-末端受保護(hù)的肽序列，將其從載體上移開，然后在溶液中使用公知的溶液偶聯(lián)技術(shù)偶聯(lián)到結(jié)構(gòu)受限的回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)上。
在本發(fā)明的另一方面，公開了構(gòu)造庫的方法。傳統(tǒng)的組合化學(xué)技術(shù)(參見，例如，Gallop等，J.Med.Chem.371233-1251，1994)允許通過試劑在基本分子框架的順序組合而迅速制備大量化合物。組合技術(shù)已經(jīng)用于構(gòu)造由天然氨基酸衍生的肽庫。例如，通過取20種適當(dāng)保護(hù)的不同氨基酸的20種混合物，并且每一種均與20種氨基酸之一進(jìn)行偶聯(lián)，從而建立了400種(即，202)二肽的庫。重復(fù)該程序7次，結(jié)果制成了由大約260億(即，208)種八肽組成的肽庫。
具體地說，合成本發(fā)明的庫的肽擬態(tài)，可以使用公知肽合成技術(shù)來進(jìn)行，例如如下的[4，4，0]回折擬態(tài)庫的一般方案 合成本發(fā)明的庫的肽擬態(tài)，可以使用具有96孔板的FlexChem反應(yīng)堆艙通過公知技術(shù)進(jìn)行。在以上方案中，“Pol”表示溴乙縮醛樹脂(Advanced ChemTech)，詳細(xì)程序如下所述。
步驟1將溴乙縮醛樹脂(37mg，0.98mmol/g)和R2-胺的DMSO溶液(1.4mL)放置在帶有96孔板的Robbins艙(FlexChem)中。在60℃下使用轉(zhuǎn)爐[Robbins Scientific]將反應(yīng)混合物振蕩12小時。用DMF、MeOH，然后用DCM清洗該樹脂。
步驟2將市售的Fmoc氨基酸(4當(dāng)量)、PyBob(4當(dāng)量)、HOAt(4當(dāng)量)和DIEA(12當(dāng)量)的DMF溶液加入到樹脂中。將反應(yīng)混合物在室溫下振蕩12小時后，用DMF、MeOH，然后用DCM清洗該樹脂。
步驟3向在反應(yīng)前被DMF溶漲的樹脂中加入在DMF中的25％的哌啶，并且在室溫下將該反應(yīng)混合物振蕩30分鐘。再次重復(fù)該去保護(hù)步驟，并且用DMF、甲醇，然后用DCM清洗該樹脂。向該樹脂中加入肼酸(4當(dāng)量)、HOBt(4當(dāng)量)和DIC(4當(dāng)量)的DMF溶液，并且在室溫下將該反應(yīng)混合物振蕩12小時。用DMF、MeOH，然后用DCM清洗該樹脂。
步驟4a(當(dāng)肼酸是MOC氨基甲酸鹽時)在室溫下用甲酸(每個孔1.2mL)將步驟3中獲得的樹脂處理18小時。過濾除去樹脂后，在減壓下使用SpeedVac[SAVANT]濃縮濾液以給出油狀產(chǎn)品。用50％的水/乙腈稀釋該產(chǎn)品，然后在冷凍后進(jìn)行冷凍干燥。
步驟4b(當(dāng)使用Fmoc肼酸通過異氰酸酯制備脲時)向在反應(yīng)前被DMF溶漲的樹脂中加入在DMF中的25％的哌啶，并且在室溫下將該反應(yīng)混合物振蕩30分鐘。再次重復(fù)該去保護(hù)步驟，并且用DMF、甲醇，然后用DCM清洗該樹脂。向在反應(yīng)前被DCM溶漲的樹脂中加入在DCM中的異氰酸酯(5當(dāng)量)。在室溫下將該反應(yīng)混合物振蕩12小時后，用DMF、MeOH，然后用DCM清洗該樹脂。在室溫下用甲酸(每個孔1.2mL)將該樹脂處理18小時。過濾除去樹脂后，在減壓下使用SpeedVac[SAVANT]濃縮濾液以給出油狀產(chǎn)品。用50％的水/乙腈稀釋該產(chǎn)品，然后在冷凍后進(jìn)行冷凍干燥。
步驟4c(當(dāng)使用Fmoc-肼酸通過活性氨基甲酸酯制備脲時)向在反應(yīng)前被DMF溶漲的樹脂中加入在DMF中的25％的哌啶，并且在室溫下將將該反應(yīng)混合物振蕩30分鐘。再次重復(fù)該去保護(hù)步驟，并且用DMF、MeOH，然后用DCM清洗該樹脂。向在反應(yīng)前被DCM溶漲的樹脂中加入在DCM中的對硝基苯基氯甲酸酯(5當(dāng)量)和二異丙基乙胺(5當(dāng)量)。在室溫下將該反應(yīng)混合物振蕩12小時后，用DMF、MeOH，然后用DCM清洗該樹脂。在室溫下向該樹脂中加入在DCM中的伯胺并保持12小時，并且用DMF、MeOH，然后用DCM清洗該樹脂。反應(yīng)后，在室溫下用甲酸(每個孔1.2mL)將該樹脂處理18小時。過濾除去樹脂后，在減壓下使用SpeedVac[SAVANT]濃縮濾液以給出油狀產(chǎn)品。用50％的水/乙腈稀釋該產(chǎn)品，并且在冷凍后進(jìn)行冷凍干燥。
為生成這些嵌段庫，根據(jù)制備實施例中說明的程序，合成了關(guān)鍵中間體肼酸。
表2A和2B顯示了可以通過本發(fā)明制備的[4，4，0]回折擬態(tài)庫，其代表性的制備過程在實施例4中給出。
表2A[4，4，0]回折擬態(tài)庫
























表2B[4，4，0]回折擬態(tài)庫















































































































此外，合成本發(fā)明的庫的肽擬態(tài)，可以使用如下的[4，3，0]回折擬態(tài)庫的一般方案來進(jìn)行 合成本發(fā)明的二環(huán)模板庫的肽擬態(tài)，可以使用具有96孔板的FlexChem反應(yīng)堆艙通過公知技術(shù)進(jìn)行。在上述方案中，“Pol”表示溴乙縮醛樹脂(Advanced ChemTech)，并且其具體程序如下所述。
步驟1將溴乙縮醛樹脂(1.6mmol/g)和R1胺的DMSO溶液(2M溶液)置于96孔Robbins艙(FlexChem)中。在60℃下使用轉(zhuǎn)爐[RobbinsScientific]將反應(yīng)混合物振蕩12小時。用DMF、MeOH，然后用DCM清洗該樹脂。
步驟2將市售的Fmoc-氨基酸(4當(dāng)量)、PyBob(4當(dāng)量)、HOAt(4當(dāng)量)和DIEA(12當(dāng)量)的DMF溶液加入到該樹脂中。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩12小時后，用DMF、MeOH，然后用DCM清洗該樹脂。
步驟3向在反應(yīng)前被DMF溶漲的樹脂中加入在DMF中的25％的哌啶。之后在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩30分鐘。再次重復(fù)該去保護(hù)步驟，然后用DMF、甲醇，然后用DCM進(jìn)行清洗。將氨基甲酰氯(4當(dāng)量)、HOBt(4當(dāng)量)和DIC(4當(dāng)量)的DMF溶液加入該樹脂。在室溫下將該反應(yīng)混合物振蕩12小時后，用DMF、MeOH，然后用DCM清洗該樹脂。
步驟4向在反應(yīng)前被DMF溶漲的樹脂中加入在DMF中的25％的哌啶。之后在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩30分鐘。再次重復(fù)該去保護(hù)步驟，然后用DMF、甲醇，然后用DCM進(jìn)行清洗。向在反應(yīng)前被DCM溶漲的樹脂中加入在DCM中的R1-異氰酸酯(5當(dāng)量)。在室溫下將該反應(yīng)混合物振蕩12小時后，用DMF、MeOH，然后用DCM清洗該樹脂。
步驟5在室溫下將樹脂用甲酸(每個孔1.2mL)處理18小時。過濾除去樹脂后，在減壓下使用SpeedVac[SAVANT]濃縮該濾液，以給出油狀產(chǎn)品。用50％的水/乙腈稀釋這些產(chǎn)品，然后在冷凍后進(jìn)行冷凍干燥。
表3顯示了可以根據(jù)本發(fā)明制備的[4，3，0]回折擬態(tài)庫，其代表性的制備過程在實施例5中給出。
表3[4，3，0]回折擬態(tài)庫





在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了用于篩選庫生物活性的方法和分離具有生物活性的庫成員的方法。
在本發(fā)明的又一個方面，本發(fā)明提供了一種用于進(jìn)行結(jié)合分析的方法。該方法包括提供一種含有第一共激活劑、相互作用蛋白質(zhì)和測試化合物的組合物。第一共激活劑的氨基酸結(jié)構(gòu)包括LXXLL、LXXLI或FxxFF的結(jié)合基序，其中X是任意氨基酸。該方法進(jìn)一步包括，由于該化合物的存在，檢測第一共激活劑與相互作用蛋白質(zhì)之間的結(jié)合的改變，然后根據(jù)其結(jié)合效果表征該測試化合物。
該分析法可以通過任何能夠測量測試化合物對兩種蛋白質(zhì)之間結(jié)合的影響的方法來進(jìn)行。很多這種分析法在本領(lǐng)域中是公知的，并且可以在本發(fā)明的方法中應(yīng)用，包括所謂的雙雜交系統(tǒng)和分裂雜交系統(tǒng)。
雙雜交系統(tǒng)，以及使用這種系統(tǒng)進(jìn)行測定的各種方法，例如，美國專利6,410,245所述。分裂雜交系統(tǒng)，例如，Hsiu-Ming Shiu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9313896-13901，November 1996和John D.Crispino等，Molecular Cell，31-20，F(xiàn)ebruary 1999所述。在分裂雜交系統(tǒng)中，使用融合蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)X融合到lexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(plexA)并且蛋白質(zhì)Y融合到轉(zhuǎn)錄激活劑VP16(pSHM.1-LacZ)。lexA-X與VP16-Y之間的相互作用導(dǎo)致四環(huán)素阻抑蛋白(TetR)的表達(dá)。TetR防止了HIS3報道基因的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞不能在缺少組氨酸的介質(zhì)上生長。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的破壞，將通過切斷四環(huán)素阻遏劑的表達(dá)而使細(xì)胞在這種介質(zhì)上的生長能力恢復(fù)。因此，可以將本發(fā)明的化合物加入到生長細(xì)胞中，并且如果該化合物的加入使細(xì)胞在介質(zhì)上生長的能力恢復(fù)，則該化合物可以被視為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的有效破壞劑。
使分裂雜交系統(tǒng)工作所需的酵母菌株可以與雙雜交lexA/VP16構(gòu)造一起使用，例如Stanley M.Hollenberg等，Molecular and CellularBiology 15(7)3813-3822，July 1995所述的那些。Takemaru，K.I.和Moon，R.T.，J.Cell Biol.149249-254使用了分裂雜交系統(tǒng)的有用的變化。
其它分析形式也適用。例如，AP-1、ELISA的報道基因分析法，例如，通過用CD3和CD28刺激后的T-細(xì)胞系阻斷了IL-2的生產(chǎn)，以尋找IL-2轉(zhuǎn)錄的抑制劑。直接結(jié)合分析法(在共激活劑與其伙伴之間)可以通過表面等離子體共振譜儀(Biacore，Sweden制造合適的儀器)或ELISA來進(jìn)行。
示例性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑包括但不限于VP16、VP64、p300、CBP、PCAF、SRC1PvALF、AtHD2A和ERF-2。參見，例如，Robyr等(2000)Mol.Endocrinol.14329-347；Collingwood等(1999)J.Mol.Endocrinol.23255-275；Leo等(2000)Gene 2451-11；Manteuffel-Cymborowska(1999)Acta Biochim.Pol.4677-89；McKenna等(1999)J.SteroidBiochem.Mol.Biol.693-12；Malik等(2000)Trends Biochem.Sci.25277-283；以及Lemon等(1999)Curr.Opin.Genet.Dev.9499-504。其它示例性的轉(zhuǎn)錄因子包括但不限于，OsGAI、HALF-1、C1、AP1、ARF-5、-6、-7和-8、CPRF1、CPRF4、MYC-RP/GP和TRAB1。參見，例如，Ogawa等(2000)Gene 24521-29；Okanami等(1996)Genes Cells 187-99；Goff等(1991)Genes Dev.5298-309；Cho等(1999)Plant Mol.Biol.40419-429；Ulmason等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 965844-5849；Sprenger-Haussels等(2000)Plant J.221-8；Gong等(1999)Plant Mol.Biol.4133-44；以及Hobo等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9615,348-15,353。
在一個優(yōu)選實施方式中，轉(zhuǎn)錄共激活劑是人類轉(zhuǎn)錄共激活劑。在另一個優(yōu)選實施方式中，轉(zhuǎn)錄共激活劑是具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的p300/CBP族共激活劑的成員。p300，例如，Eckner等，1994所述，并且CBP如Bannister和Kouzarides，1996所述。對本發(fā)明來說，p300/CBP指的是p300的人類等位基因變體和合成變體，和p300的其它哺乳動物的變體和等位基因變體和合成變體，以及所述p300的人類和哺乳動物形式的片段。在該測定法的一個方面，相互作用蛋白質(zhì)是轉(zhuǎn)錄因子或第二共激活劑。
在該測定法的一個方面，相互作用蛋白質(zhì)是RIP140、SRC-1(NCoA-1)、TIF2(GRIP-1、SRC-2)、p(CIP、RAC3、ACTR、AIB-1、TRAM-1、SRC-3)、CBP(p300)、TRAPs(DRIPs)、PGC-1、CARM-1、PRIP(ASC-2、AIB3、RAP250、NRC)、GT-198和SHARP(CoAA、p68、p72)中的任何一個。在該測定法的另一方面，相互作用蛋白質(zhì)是TAL 1、p73、MDm2、TBP、HIF-1、Ets-1、RXR、p65、AP-1、Pit-1、HNF-4、Stat2、HPV E2、BRCA1、p45(NF-E2)、c-Jun、c-myb、Tax、Sap 1、YY1、SREBP、ATF-1、ATF-4、Cubitus、Interuptus、Gli3、MRF、AFT-2、JMY、dMad、PyLT、HPV E6、CITTA、Tat、SF-1、E2F、junB、RNA解旋酶A、C/EBPβ、GATA-1、Neuro D、Microphthalimia、E1A、TFIIB、p53、P/CAF、Twist、Myo D、pp9ORSK、c-Fos和SV40Large T中任意一種。在該測定法的另一方面，相互作用蛋白質(zhì)是ERAP140、RIP140、RIP160、Trip1、SWI1(SNF)、ARA70、RAP46、TIF1、TIF2、GRIP1和TRAP中的任意一種。在本發(fā)明的另一方面，相互作用蛋白質(zhì)是VP16、VP64、p300、CBP、PCAF、SRC1 PvALF、AtHD2A、ERF-2、OsGAI、HALF-1、C1、AP-1、ARF-5、ARF-6、ARF-7、ARF-8、CPRF1、CPRF4、MYC-RP/GP和TRAB1中的任意一種。在本發(fā)明的另一方面，第一共激活劑是CBP或者p300。
測試化合物選自如本文所述的化合物。例如，具有通式(I)、(II)、(III)、(IV)、(VI)和(VIa)的化合物。通常，測試化合物以幾種不同的濃度進(jìn)行評價，其中這些濃度部分地基于測定條件進(jìn)行選擇，例如第一共激活劑和相互作用蛋白質(zhì)的濃度。濃度通常在大約0.1至10μM的范圍內(nèi)。在一個方面，該測定法評價了兩種化合物影響兩種蛋白質(zhì)之間的結(jié)合相互作用的相對效力，其中那兩種化合物中至少一種是本發(fā)明的化合物。在對化合物結(jié)構(gòu)和化合物活性之間關(guān)系的研究中，更有效的化合物可以充當(dāng)參比化合物。
通過各種技術(shù)和方法對本發(fā)明的庫的生物活性進(jìn)行篩選。通常，篩選測定法可以通過以下方式進(jìn)行(1)使庫的擬態(tài)與例如受體的所關(guān)注的生物靶相接觸，以使庫的擬態(tài)與靶之間的結(jié)合得以發(fā)生，以及(2)通過合適的測定法對結(jié)合結(jié)果進(jìn)行檢測，例如Lam等(Nature 35482-84，1991)或Griminski等(Biotechnology 121008-1011，1994)所公開的量熱測定法(二者均引入本文作為參考)。在優(yōu)選實施方式中，庫成員在溶液中并且靶被固定在固相上?；蛘邘炜梢怨潭ㄔ诠滔嗌?，并且可以通過使其與溶液中的靶相接觸而探測。
下表4顯示了選自本發(fā)明的庫、用于生物活性測試的化合物及其IC50值，其是通過如實施例6所述的報道基因測定法所測量的。
表4所選擇的庫化合物的IC50(μM)



































根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通式(I)的化合物，尤其是通式(VI)的化合物，由于其對CBP的特定結(jié)合，能夠抑制癌細(xì)胞中的CBP-介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的激活。這個結(jié)論是由SW480細(xì)胞的CBP與本發(fā)明的化合物的免疫沉淀法所支持的。
本發(fā)明的化合物還能夠抑制SW480細(xì)胞中存活蛋白的表達(dá)，因此抑制了癌細(xì)胞中的致癌活性。本發(fā)明的化合物可以用于抑制癌細(xì)胞，因此可用于調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長。支持這個結(jié)果，本發(fā)明的化合物進(jìn)一步顯示了其可以誘導(dǎo)SW480細(xì)胞中胱天蛋白酶-3的激活，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡活性。本發(fā)明的化合物還可以有利地用于誘導(dǎo)細(xì)胞中的編程性細(xì)胞死亡。
為了在生物體外確定癌細(xì)胞中的致癌活性，通過以下方法測試了MTS的細(xì)胞毒性分析。
(1)細(xì)胞毒性測試將SW480或者HCT116細(xì)胞放置在96孔微量培養(yǎng)板上(104個細(xì)胞/孔)并且在37℃下培育24小時。用各種濃度的TCF4化合物處理該細(xì)胞24小時。向每一個孔中加入20μl的MTS溶液(Promega)，并且在37℃下培育24小時。通過使用微量培養(yǎng)板讀數(shù)器(Molecular Device)在490nm下讀取吸光度來測量細(xì)胞生存力，并且計算化合物在各濃度下的細(xì)胞毒性。
(2)生長抑制分析將SW480或者PCT116細(xì)胞放置到96孔微量培養(yǎng)板中(104個細(xì)胞/孔)并且在37℃下培育24小時。將20μl的[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓內(nèi)鹽](MTS)溶液(Promega)加入到每個孔中，并且在37℃(負(fù)控制)下培育2小時后讀取吸光度。然后，用各種濃度的TCF4化合物處理該細(xì)胞48小時。向每個孔中加入20μl的MTS溶液(Promega)，并且在37℃下培育2小時。使用微量培養(yǎng)板讀數(shù)器(Molecular Device)在490nm下讀取吸光度以測量細(xì)胞生存力，并且計算化合物在各濃度下的細(xì)胞毒性。
所選擇的庫化合物的致癌活性結(jié)果如表5所示。表5中化合物的編號與表4中化合物的編號無關(guān)。
表5所選擇的庫化合物通過MTS或者磺酰羅丹明B(sulforhodamine B)分析的致癌活性






























在其它方面，本發(fā)明提供了含有具有通式(I)、或者通式(II)、或者通式(III)、或者通式(IV)、或者通式(VI)的化合物的藥學(xué)組合物。這些組合物可以用于如以下詳細(xì)描述的本發(fā)明的各種方法中(例如治療癌癥或者阿爾茨海默式癥)。
本發(fā)明的藥學(xué)組合物配制為使其與其預(yù)計給藥路徑相容。給藥路徑的例子包括胃腸外給藥，例如靜脈給藥、皮內(nèi)給藥、皮下給藥、口服給藥(例如，吸入法給藥)、經(jīng)皮給藥(局部給藥)、經(jīng)粘膜給藥和直腸給藥。用于胃腸外、皮內(nèi)或者皮下應(yīng)用的溶液或者懸浮液可以包括以下組分無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑，例如芐醇或者羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或者亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸；緩沖劑，例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用于調(diào)節(jié)張力的試劑，例如氯化鈉或者葡萄糖。此外，pH可以用酸或者堿來調(diào)節(jié)，例如鹽酸或氫氧化鈉。胃腸外制劑可以封裝在由玻璃或者塑料制成的安瓿、一次性注射器或多次劑量小瓶中。
適用于注射用途的藥學(xué)組合物包括無菌水溶液(其中是水溶性的)或懸浮液，以及用于臨時配制無菌可注射溶液或懸浮液的無菌粉末。對于靜脈給藥，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或者磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物必須是無菌的，并且其流動性應(yīng)當(dāng)達(dá)到易于注射的程度。其必須在生產(chǎn)和存儲條件下穩(wěn)定，并且必須保存而不受例如細(xì)菌和真菌的微生物的污染作用影響。載體可以是含有例如水、乙醇、多醇(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其適當(dāng)?shù)幕旌衔锏娜軇┗蚍稚⒔橘|(zhì)。例如，通過使用例如卵磷脂的涂層，在分散液的情況下通過保持所需的粒徑，以及通過使用表面活性劑，可以保持合適的流動性。對微生物作用的預(yù)防可以通過各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑獲得，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包括等滲劑，例如糖，例如甘露醇(manitol)、山梨糖醇的多醇，氯化鈉?？梢酝ㄟ^在組合物中包括延遲吸收的藥劑，例如，單硬脂酸鋁和凝膠，而達(dá)到可注射組合物的延長吸收。
無菌可注射溶液可以通過如下制備將所需量的活性化合物(例如，具有通式(I)、(II)、(III)、(IV)或者(VI)的化合物)結(jié)合到含有以上所列成分中的一種或組合的適當(dāng)溶液中，接著根據(jù)需要進(jìn)行過濾除菌。通常，懸浮液通過將活性化合物結(jié)合到無菌載體中來制備，該無菌載體含有分散介質(zhì)和所需的以上列舉的其它成分。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，其由預(yù)先的無菌過濾溶液獲得活性成分加任意其它所需成分的粉末。
口服組合物通常含有惰性稀釋劑或者可食用的載體。其可以被封裝在凝膠膠囊中或者被壓制成片劑。為了口服治療給藥，活性化合物可以與賦形劑相結(jié)合并且以片劑、錠劑或者膠囊的形式使用?？诜M合物也可以使用流體載體制備以用作漱口水，其中流體載體中的化合物在口中應(yīng)用和漱動(swished)，然后吐出或吞咽。可以包括藥學(xué)相容的結(jié)合劑，和/或輔藥物質(zhì)作為該組合物的部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可以含有任意以下成分或者性質(zhì)相近的化合物結(jié)合劑，例如微晶纖維素、面黃蓍膠或凝膠；賦形劑，例如淀粉或乳糖；崩解劑，例如褐藻酸、Primogel或者玉米淀粉；潤滑劑，例如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑，例如膠體二氧化硅；甜味劑，例如蔗糖或糖精；或者矯臭劑，例如薄荷、水楊酸甲酯或者橙味香料。
對于吸入法給藥，化合物以氣溶膠噴霧的形式由含有合適推進(jìn)物的加壓容器或噴霧器來輸送，該合適推進(jìn)物例如氣體，如二氧化碳。
也可以通過經(jīng)粘膜或者經(jīng)皮方式進(jìn)行系統(tǒng)的給藥。對于經(jīng)粘膜或者經(jīng)皮給藥，在配方中使用適合滲透障礙物的滲透劑。這種滲透劑在本領(lǐng)域中是公知的，并且包括，例如，用于經(jīng)粘膜給藥的除垢劑、膽汁鹽和羧鏈孢酸衍生物。經(jīng)粘膜給藥可以通過使用鼻噴霧或者栓劑來進(jìn)行。對于經(jīng)皮給藥，如本領(lǐng)域所公知的那樣，將活性化合物配制為軟膏、油膏、凝膠或者乳膏。
該化合物也可以被制備為栓劑的形式(例如，用例如可可豆油和其它甘油酯的常規(guī)栓劑基)或者用于直腸輸送的保留灌腸形式。
在一個實施方式中，活性化合物與將會保護(hù)該化合物免于從體內(nèi)被迅速排出的載體一起制備，該載體例如長效制劑，包括植入片和微膠囊輸送系統(tǒng)。可以使用生物降解、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯、聚酐、聚羥基乙酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這種制劑的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。這些物質(zhì)也可以由Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.商業(yè)獲得。脂質(zhì)體懸浮液(包括用病毒抗原的單克隆抗體定向到受感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)也可以用作藥學(xué)可接受的載體。這些可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備，例如，如美國專利第4,522,811號所述。
為了給藥的便利性和劑量的均勻性，配制成劑量單位形式的口服或胃腸外組合物尤其具有優(yōu)勢。這里所使用的劑量單位形式指的是對被治療個體來說，適合作為單劑使用的物理離散單位；每個單位含有預(yù)定數(shù)量的活性化合物和所需藥學(xué)載體，該活性化合物的數(shù)量經(jīng)計算可產(chǎn)生預(yù)期治療效果。對本發(fā)明劑量單位形式的說明是由該活性化合物的獨特特性以及要達(dá)到的特定治療效果、以及合成這種用于治療個體的活性化合物的領(lǐng)域的內(nèi)在限制所規(guī)定的，并且與其直接相關(guān)。
這種化合物的毒性和療效可以通過細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游锏臉?biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序來測定，例如測定LD50(對50％種群致死的劑量)和ED50(對50％種群有療效的劑量)。毒性和療效之間的劑量比是治療指數(shù)，其可以表達(dá)為LD50/ED50比。優(yōu)選表現(xiàn)出大的治療指數(shù)的化合物。雖然可以使用表現(xiàn)出毒性副作用的化合物，應(yīng)當(dāng)小心地設(shè)計輸送系統(tǒng)，其將這種化合物定向到受患組織的位置，以便使對未感染細(xì)胞的潛在危害最小化，從而減少副作用。
由細(xì)胞培養(yǎng)實驗和動物研究得到的數(shù)據(jù)可以用于調(diào)制人類所使用的劑量范圍。優(yōu)選這種化合物的劑量處于包括很少或沒有毒性的ED50的循環(huán)濃度的范圍內(nèi)。劑量在此范圍內(nèi)可以隨所采用的劑型和所使用的給藥路徑而改變。對于本發(fā)明的方法中所使用的任何化合物，均可以從細(xì)胞培養(yǎng)實驗初步估算治療有效劑量?？梢栽趧游锬Ｐ蜕险{(diào)制劑量以達(dá)到包括如細(xì)胞培養(yǎng)中所測定的IC50(即，對癥狀的抑制達(dá)到最大的一半時的測試化合物的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。這種信息可以用于更準(zhǔn)確地測定人類的可用劑量?？梢酝ㄟ^，例如，高效液相色譜測量血漿中的水平。
例如，在某些實施方式中，本發(fā)明的藥學(xué)組合物是一種適于口服給藥的單位劑量形式的組合物，例如含有大約1mg至大約1g本發(fā)明的化合物的片劑或膠囊。在另一些實施方式中，本發(fā)明的藥學(xué)組合物是一種適用于靜脈注射、皮下注射或者肌肉注射的組合物?；颊呖梢越邮?，例如，含大約1μg/kg至大約1g/kg本發(fā)明化合物的靜脈、皮下或肌肉劑量。靜脈、皮下或肌肉劑量可以通過彈丸式注射的方式或者通過經(jīng)過一段時間的連續(xù)灌輸來給予?；蛘呋颊邔⒔邮艽蠹s等于一日胃腸外劑量的一日口服劑量，每天施用該化合物1至4次。
下表說明了含有用于人類治療或預(yù)防的化合物或其藥學(xué)可接受鹽的示例性的藥學(xué)劑量形式





含有通式(I)或(II)或(III)或(IV)或(VI)的化合物的藥學(xué)組合物可以用于治療受Wnt信號通道調(diào)節(jié)的病癥，尤其是癌癥，特別是結(jié)腸癌。
在一個方面，本發(fā)明提供了抑制放射性同位素標(biāo)記的腦啡肽衍生物與δ和μ鴉片受體結(jié)合的化合物。因此，本發(fā)明的回折擬態(tài)可以用作受體激動劑和潛在的止痛劑。
在另一個方面，本發(fā)明提供了用于抑制腫瘤生長的方法。這種方法包括對帶有腫瘤的個體(例如哺乳動物個體)施予抑制腫瘤生長有效量的通式(I)的化合物的步驟，尤其是通式(VI)的化合物。如果接受化合物或組合物治療的個體與未接受治療的個體相比，腫瘤尺寸在統(tǒng)計上顯著較小，則該化合物或組合物抑制了腫瘤的生長。
本發(fā)明的特定化合物或組合物對腫瘤生長的抑制效果可以用本領(lǐng)域公知的任何合適方法來特征。例如，可以測量該化合物或組合物在存活蛋白表達(dá)上的效果?；衔锘蚪M合物向下調(diào)節(jié)了存活蛋白表達(dá)，可能對腫瘤生長具有抑制效果。此外，也可以如實施例中所詳細(xì)說明地使用利用腫瘤細(xì)胞系的分析(例如，使用SW480細(xì)胞的軟瓊脂分析)和用于腫瘤生長的動物模型(例如移植了腫瘤細(xì)胞的裸鼠和小鼠(minmouse)模型)，以評價給定化合物或組合物對腫瘤生長的抑制效果。其它示例性的用于腫瘤生長的動物模型或者異種移植物包括那些用于乳癌(Guo等，Cancer Res.624678-84，2002；Lu等，Breast Cancer Res.Treat.57183-92，1999)、胰腺癌(Bouvet等，Cancer Res.621534-40，2002)、卵巢腫瘤(Nilsson等，Cancer Chemother.Pharmacol.4993-100，2002；Bao等，Gynecol.Oncol.78373-9，2000)、黑素瘤(Demidem等，Cancer Res.612294-300，2001)、結(jié)腸癌(Brown等，Dig.Dis.Sci.451578-84，2000；Tsunoda等，Anticancer Res.191149-52，1999；Cao等，Clin.Cancer Res.5267-74，1999；Shawler等，J.Immunother.EmphasisTumor Immunol.17201-8，1995；McGregor等，Dis.Colon.Rectum.36834-9，1993；Verstijnen等，Anticancer Res.81193-200，1988)、肝細(xì)胞癌(Labonte等，Hepatol.Res.1872-85，2000)、以及胃癌(Takahashi等，Int.J.Cancer 85243-7，2000)的。
抑制腫瘤生長的化合物或組合物可以根據(jù)，例如，其中腫瘤所處的組織，經(jīng)由適當(dāng)?shù)穆窂浇o藥至帶有腫瘤的個體。合適的劑量可以使用如上所述的本領(lǐng)域公知的知識和技術(shù)來確定?；衔锘蚪M合物對腫瘤生長的療效也可以使用本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行監(jiān)控。例如，可以使用各種方法來監(jiān)控結(jié)腸癌的進(jìn)展和/或生長，包括結(jié)腸鏡檢查、乙狀結(jié)腸鏡檢查、活體檢查、計算機(jī)斷層成像、超聲、磁共振成像和正電子發(fā)射斷層成像。用于監(jiān)控卵巢癌的發(fā)展和/或生長的方法包括，例如，超聲、計算機(jī)斷層成像、磁共振成像、胸部X射線、腹腔鏡檢查和組織取樣。
在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了一種用于治療或預(yù)防癌癥的方法。這種方法包括根據(jù)需要對個體施予治療或預(yù)防個體癌癥有效量的具有通式(I)的化合物或組合物的步驟，尤其是通式(VI)的化合物。要理解治療癌癥包括減少或消除癌癥的發(fā)展(例如，癌癥的生長和轉(zhuǎn)移)。要理解預(yù)防癌癥包括防止或延緩癌癥的發(fā)病。通過本發(fā)明可以治療或預(yù)防各種類型的癌癥。其包括，但不限于，肺癌、乳癌、結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、子宮癌、卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑素瘤、淋巴瘤和白血病。
需要治療的個體可以是患有各種類型癌癥的人類或非人類靈長類動物或其它動物。需要預(yù)防的個體可以是具有發(fā)展癌癥的風(fēng)險的人類或非人類靈長類動物或其它動物。用于診斷癌癥和對具有高癌癥風(fēng)險的個體進(jìn)行篩選的方法在本領(lǐng)域中是公知的，并且可以在本發(fā)明中使用。例如，結(jié)腸癌可以通過糞便潛血檢驗、乙狀結(jié)腸鏡檢查、結(jié)腸鏡檢查、用空氣做對照的鋇劑灌腸和模擬結(jié)腸鏡檢查來診斷。具有高結(jié)腸癌風(fēng)險的個體可以具有一種或多種結(jié)腸癌風(fēng)險因素，例如結(jié)腸癌或息肉的強(qiáng)家族史、遺傳性結(jié)腸癌綜合癥的已知家族史、腺瘤性息肉的個人史、和慢性發(fā)炎性腸道疾病的個人史。
可用于癌癥治療或預(yù)防的具有通式(I)的化合物，可以通過本領(lǐng)域公知的方法來識別。也可以使用如上所述的可以用來選擇對腫瘤生長有抑制效果的化合物的方法?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的知識和技術(shù)來確定給藥的路徑、特定化合物的劑量和治療的有效性。進(jìn)行這種確定可能需考慮的因素包括，例如，要治療的癌癥的類型和階段。
用于癌癥的治療和預(yù)防的具有通式(I)的化合物，可以與抗腫瘤劑聯(lián)合給藥?？鼓[瘤劑指的是抑制腫瘤生長的化合物。示例性的抗腫瘤機(jī)包括氟尿嘧啶、5-氟-2，4(1H，3H)-尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇、順鉑、絲裂霉素C、喃氟啶、雷替曲塞、卡培他濱和伊立替康(Arango等，Cancer Research 61，20014910-4915)。與抗腫瘤劑聯(lián)合給藥的具有通式(I)的化合物不需要將該化合物與抗腫瘤劑同時給藥。該化合物和抗腫瘤劑可以單獨給藥，只要在某時間點，它們在相同的癌癥細(xì)胞上均有效果。
在另一個相關(guān)方面，本發(fā)明提供了用于促進(jìn)癌癥細(xì)胞中編程性細(xì)胞死亡的方法。這種方法包括使癌癥細(xì)胞與促進(jìn)這些細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的有效量的具有通式(I)的化合物相接觸的步驟，尤其是具有通式(VI)的化合物。如果在該化合物的存在下經(jīng)受了編程性細(xì)胞死亡的癌癥細(xì)胞的數(shù)量，在統(tǒng)計上明顯大于不存在該化合物時的數(shù)量，則該化合物促進(jìn)了編程性細(xì)胞死亡。這種化合物可以使用培養(yǎng)的癌癥細(xì)胞系、異種移植物或者動物癌癥模型，通過本領(lǐng)域公知的方法(例如，測量胱天蛋白酶的活性和/或細(xì)胞死亡)來識別。在促進(jìn)編程性細(xì)胞死亡上，優(yōu)選該化合物在癌癥細(xì)胞中比在正常細(xì)胞中具有更大的活性。用本發(fā)明的方法可以治療的癌癥細(xì)胞可以來自各種組織源。
在本發(fā)明的另一個方面，公開了一種用于治療受Wnt信號通道調(diào)節(jié)的病癥的方法，其中該方法包括對患者施予安全和有效量的具有通式(I)的化合物，尤其是具有通式(VI)的化合物。含有本發(fā)明化合物的藥學(xué)組合物也可以用于此目的。關(guān)于這一點，在本發(fā)明中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有通式(I)的化合物，尤其是具有通式(VI)的化合物或者含有它們的藥學(xué)組合物，可以用于治療受TCF4-β連環(huán)蛋白-CBP復(fù)合體調(diào)節(jié)的病癥，該復(fù)合體被認(rèn)為對與Wnt信號通道相關(guān)的癌細(xì)胞超量表達(dá)的引發(fā)有責(zé)任。因此，本發(fā)明的另一個方面是提供一種使用具有通式(I)的化合物，尤其是具有通式(VI)的化合物，治療受TCF4-β連環(huán)蛋白-CBP復(fù)合體調(diào)節(jié)的病癥的方法。
本發(fā)明還提供了用于抑制存活蛋白表達(dá)的化合物和方法。存活蛋白是TCF/β-連環(huán)蛋白通道的靶基因，更具體的說是TCF/β-連環(huán)蛋白/CBP通道的靶基因。其是IAP(編程性細(xì)胞死亡蛋白質(zhì)的抑制劑)族蛋白質(zhì)的一員。與存活蛋白有關(guān)的生物活性包括G2/M的高度表達(dá)，其調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)入和脫離；根據(jù)細(xì)胞周期的階段，與微管、中心體、著絲粒和中間體有關(guān)；以及經(jīng)由與胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶3、7和9)的直接或間接的相互作用的抗-編程性細(xì)胞死亡。與癌癥相關(guān)，存活蛋白在腫瘤細(xì)胞中廣泛地和高度地表達(dá)，但是很少或不會在正常組織細(xì)胞中表達(dá)。同樣，已經(jīng)觀察到腫瘤表達(dá)了存活蛋白的癌癥患者具有降低的整體生存率。此外，存活表達(dá)的程度已經(jīng)與其它癌癥標(biāo)志關(guān)聯(lián)起來，例如，Ki67、PNCA、p53、APC等。
本發(fā)明的特定化合物對于存活蛋白表達(dá)的效果，可以通過本領(lǐng)域公知的方法表征。這些方法包括用于在轉(zhuǎn)錄或翻譯層次上表征存活蛋白表達(dá)的方法。用于在轉(zhuǎn)錄層次上表征存活蛋白表達(dá)的示范性方法是cDNA微陣列、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、染色質(zhì)免疫沉淀法(ChIP)、和通過存活蛋白啟動子驅(qū)動的報道基因活性檢驗。用于在翻譯層次上表征存活蛋白表達(dá)的示范性方法是蛋白質(zhì)印跡分析、免疫化學(xué)和胱天蛋白酶活性。以上示范性方法的詳細(xì)說明可以在以下實施例中找到。
如上所述，本發(fā)明提供了用于抑制存活蛋白表達(dá)的方法。這些方法包括使存活蛋白表達(dá)的細(xì)胞與抑制存活蛋白表達(dá)有效量的本發(fā)明的化合物相接觸的步驟。如果在該化合物的存在下細(xì)胞中存活蛋白的表達(dá)比不存在該化合物時存活蛋白的表達(dá)減少了，則該化合物抑制了存活蛋白的表達(dá)。存活蛋白表達(dá)的細(xì)胞包括以下腫瘤細(xì)胞，其表達(dá)例如在肺癌、乳癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、子宮癌、卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑素瘤、結(jié)腸癌、淋巴瘤和白血病中的或者來自其中的細(xì)胞。使存活蛋白表達(dá)的細(xì)胞與該化合物接觸的步驟可以在體外、先體外后體內(nèi)、或在體內(nèi)進(jìn)行?？梢酝ㄟ^如上所詳細(xì)說明的本領(lǐng)域公知的方法，來識別可用于抑制存活蛋白表達(dá)的化合物，以及來表征本發(fā)明的特定化合物的效果。
本發(fā)明的化合物已經(jīng)顯示出對存活蛋白的表達(dá)的抑制。Blanc-Brude等，Nat.Medicine 8987(2002)，已經(jīng)顯示了存活蛋白是平滑肌細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，其在病理性血管壁重塑中至關(guān)重要。因此，本發(fā)明的另一方面提供了一種治療或預(yù)防與血管成形術(shù)有關(guān)的再狹窄的方法，包括根據(jù)需要對個體施予安全和有效量的本發(fā)明的回折擬態(tài)。在一個實施方式中，本發(fā)明治療了再狹窄，即，對患有再狹窄的個體施予本發(fā)明的回折擬態(tài)，使得再狹窄的嚴(yán)重程度、范圍或等級等有所降低。在另一個實施方式中，本發(fā)明預(yù)防了再狹窄，即，對預(yù)期將發(fā)展新的或額外的再狹窄的個體施予本發(fā)明的回折擬態(tài)，使得再狹窄預(yù)期的嚴(yán)重程度、范圍或等級等有所降低。任選地，該個體是哺乳動物個體。
本發(fā)明的化合物已經(jīng)顯示出抑制TCF/B-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)錄。Rodova等，J.Biol.Chem.27729577(2002)，已經(jīng)顯示了PKD-1啟動子是B-連環(huán)蛋白/TCF通道的靶。因此，本發(fā)明的另一方面提供了一種治療或預(yù)防多囊腎疾病的方法，包括根據(jù)需要對個體施予安全和有效量的本發(fā)明的回折擬態(tài)。在一個實施方式中，本發(fā)明治療了多囊腎疾病，即，對患有多囊腎疾病的個體施予本發(fā)明的回折擬態(tài)，使得多囊腎疾病的嚴(yán)重程度、范圍或等級等有所降低。在另一個實施方式中，本發(fā)明預(yù)防了多囊腎疾病，即，對預(yù)期將發(fā)展新的或額外的多囊腎疾病的個體施予本發(fā)明的回折擬態(tài)，使得多囊腎疾病預(yù)期的嚴(yán)重程度、范圍或等級等有所降低。任選地，該個體是哺乳動物個體。
本發(fā)明的化合物已經(jīng)顯示出抑制Wnt信號的表達(dá)。Hanai等，J.CellBio.158529(2002)，已經(jīng)顯示了內(nèi)皮抑制素，一種公知的抗血管生成因子，抑制Wnt信號。因此，本發(fā)明的另一方面提供了一種治療或預(yù)防異常血管生成病的方法，包括根據(jù)需要對個體施予安全和有效量的本發(fā)明的回折擬態(tài)。在一個實施方式中，本發(fā)明治療了異常血管生成病，即，對患有異常血管生成病的個體施予本發(fā)明的回折擬態(tài)，使得異常血管生成病的嚴(yán)重程度、范圍或等級等有所降低。在另一個實施方式中，本發(fā)明預(yù)防了異常血管生成病，即，對預(yù)期將發(fā)展新的或額外的異常血管生成病的個體施予本發(fā)明的回折擬態(tài)，使得異常血管生成病預(yù)期的嚴(yán)重程度、范圍或等級等有所降低。任選地，該個體是哺乳動物個體。
本發(fā)明的化合物已經(jīng)顯示出抑制Wnt信號的表達(dá)。Sen等，P.N.A.S.(USA)972791(2000)，已經(jīng)顯示了患有風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的哺乳動物在RA滑液組織中顯示了升高的Wnt和Fz表達(dá)。因此，本發(fā)明的另一方面提供了一種用于治療或預(yù)防風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病的方法，包括根據(jù)需要對個體施予安全和有效量的本發(fā)明的回折擬態(tài)。在一個實施方式中，本發(fā)明治療了風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病，即，對患有風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病的個體施予本發(fā)明的回折擬態(tài)，使得風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病的嚴(yán)重程度、范圍或等級等有所降低。在另一個實施方式中，本發(fā)明預(yù)防了風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病，即，對預(yù)期將發(fā)展新的或額外的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病的個體施予本發(fā)明的回折擬態(tài)，使得風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病預(yù)期的嚴(yán)重程度、范圍或等級等有所降低。任選地，該個體是哺乳動物個體。
本發(fā)明的化合物已經(jīng)顯示出抑制Wnt信號的表達(dá)。Uthoff等，Int.J.Oncol.19803(2001)，已經(jīng)顯示了在潰瘍性結(jié)腸炎中發(fā)生了凌亂的和fz(Wnt通道分子)的分化上調(diào)(differential upregulation)(與Chron氏病患者相比)。因此，本發(fā)明的另一方面提供了一種治療或預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎的方法，包括根據(jù)需要對個體施予安全和有效量的本發(fā)明的回折擬態(tài)。在一個實施方式中，本發(fā)明治療了潰瘍性結(jié)腸炎，即，對患有潰瘍性結(jié)腸炎的個體施予本發(fā)明的回折擬態(tài)，使得潰瘍性結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度、范圍或等級等有所降低。在另一個實施方式中，本發(fā)明預(yù)防了潰瘍性結(jié)腸炎，即，對預(yù)期將發(fā)展新的或額外的潰瘍性結(jié)腸炎的個體施予本發(fā)明的回折擬態(tài)，使得潰瘍性結(jié)腸炎預(yù)期的嚴(yán)重程度、范圍或等級等有所降低。任選地，該個體是哺乳動物個體。
本發(fā)明的化合物已經(jīng)顯示出抑制Wnt TCF/連環(huán)蛋白信號。因此，本發(fā)明的另一方面提供了一種治療或預(yù)防結(jié)節(jié)性硬化綜合癥(TSC)的方法，包括根據(jù)需要對個體施予安全和有效量的本發(fā)明的回折擬態(tài)?；加蠺SC的個體通常在大腦、心臟、腎臟和其它組織中發(fā)展多重局灶性病變(參見，例如，Gomez，M.R.Brain Dev.17(suppl)55-57(1995))。哺乳動物細(xì)胞中的研究已經(jīng)顯示TSC1(其表達(dá)錯構(gòu)瘤蛋白)和TSC2(其表達(dá)馬鈴薯球蛋白)的超量表達(dá)負(fù)面調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖，并且誘導(dǎo)G1/S敗育(參見，例如，Miloloza，A等，Hum.Mol.Genet.91721-1727(2000))。其它研究已經(jīng)顯示錯構(gòu)瘤蛋白和馬鈴薯球蛋白在β-連環(huán)蛋白降解復(fù)合體的層次上起作用，更具體地說，這些蛋白質(zhì)通過參與β-連環(huán)蛋白降解復(fù)合體而對β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定性和活性有負(fù)調(diào)節(jié)(參見，例如，Mak，B.C.等，J.Biol.Chem.278(8)5947-5951，(2003))。β-連環(huán)蛋白是95-kDa蛋白質(zhì)，其通過其與膜結(jié)合鈣粘著蛋白族的成員的聯(lián)合參與細(xì)胞粘附，并且作為Wnt/Wingless通道的關(guān)鍵組分參與細(xì)胞增殖和分化(參見，例如，Daniels，D.L.等，Trends Biochem.Sci.26672-678(2001))。已經(jīng)顯示該通道的誤調(diào)節(jié)在人類和嚙齒動物中是致癌的。本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白的活性，具體地說是調(diào)節(jié)其與其它蛋白質(zhì)的相互作用，因此可以用于TSC治療的化合物。因此，在一個實施方式中，本發(fā)明治療了TSC，即，對患有TSC的個體施予本發(fā)明的回折擬態(tài)，使得TSC的嚴(yán)重程度、范圍或等級等方面有所降低。在另一個實施方式中，本發(fā)明預(yù)防了TSC，即，對預(yù)期將發(fā)展新的或額外的TSC的個體施予本發(fā)明的回折擬態(tài)，使得TSC預(yù)期的嚴(yán)重程度、范圍或等級等有所降低。任選地，該個體是哺乳動物個體。
本發(fā)明的化合物已經(jīng)顯示出抑制Wnt信號的表達(dá)。與卡波濟(jì)氏肉瘤有關(guān)的皰疹病毒(KSHV)潛伏期相關(guān)的核抗原(LANA)在所有KSHV相關(guān)的腫瘤中均有表達(dá)，包括卡波濟(jì)氏肉瘤(KS)和β-細(xì)胞惡性疾病，例如原發(fā)滲出性淋巴瘤(PEL)和多中心性卡斯特萊曼病。Fujimuro，M.等，Nature Medicine 9(3)300-306(2003)，已經(jīng)顯示出LANA明顯地通過負(fù)性調(diào)節(jié)劑GSK-3β的重新分布而起到穩(wěn)定β-連環(huán)蛋白的效果。本發(fā)明提供了用于抑制β-連環(huán)蛋白的蛋白質(zhì)相互作用的化合物和方法，例如，抑制β-連環(huán)蛋白/TCF復(fù)合體的形成。因此，本發(fā)明的化合物阻斷了LANA誘導(dǎo)的β-連環(huán)蛋白/TCF復(fù)合體的積累，并且至少部分地阻斷了KSHV感染的后果。因此，本發(fā)明的另一個方面是提供一種治療或防止由與卡波濟(jì)氏肉瘤有關(guān)的皰疹病毒(KSHV)感染所引起的疾病的方法。這種疾病包括KSHV相關(guān)的腫瘤，包括卡波濟(jì)氏肉瘤(KS)和原發(fā)滲出性淋巴瘤(PEL)。該方法包括根據(jù)需要對個體施予安全和有效量的本發(fā)明的回折擬態(tài)。在一個實施方式中，本發(fā)明治療了KSHV相關(guān)的腫瘤，即，對患有KSHV相關(guān)的腫瘤的個體施予本發(fā)明的回折擬態(tài)，使得腫瘤的嚴(yán)重程度、范圍或等級等有所降低。在另一個實施方式中，本發(fā)明預(yù)防了KSHV相關(guān)的腫瘤，即，對預(yù)期將發(fā)展新的或額外的KSHV相關(guān)的腫瘤的個體施予本發(fā)明的回折擬態(tài)，使得腫瘤預(yù)期的嚴(yán)重程度、范圍或等級等有所降低。任選地，該個體是哺乳動物個體。
LEF/TCF DNA-結(jié)合蛋白與活化的β-連環(huán)蛋白(Wnt信號的產(chǎn)物)合作起到了反向激活下游靶基因的效果。DasGupta，R.和Fuchs，E.Development 126(20)4557-68(1999)，證明了當(dāng)在細(xì)胞命運(yùn)和分化責(zé)任中發(fā)生變化時，活化的LEF/TCF復(fù)合體于不同的時間在毛發(fā)發(fā)展和循環(huán)中的重要性。此外，在皮膚形態(tài)發(fā)生中，β-連環(huán)蛋白已經(jīng)顯示出對于毛囊形成是必需的，其超量表達(dá)引起小鼠的“毛皮的”顯型(Gat，U.等，Cell 95605-614(1998)和Fuchs，E.Harvey Lect.9447-48(1999)。還參見Xia，X.等，Proc.Natl.Aad.Sci.USA 9810863-10868(2001))。本發(fā)明的化合物已經(jīng)顯示出抑制Wnt信號的表達(dá)，并且顯示出阻斷β-連環(huán)蛋白復(fù)合體的形成。因此，本發(fā)明的化合物提供了一種用于調(diào)節(jié)頭發(fā)生長的方法，包括根據(jù)需要對個體施予安全和有效量的本發(fā)明的回折擬態(tài)，其中該量有效地調(diào)節(jié)了個體的頭發(fā)生長。任選地，該個體是哺乳動物個體。
本發(fā)明提供了可用于治療或預(yù)防阿爾茨海默式癥的化合物。阿爾茨海默式癥(AD)是一種伴有進(jìn)行性癡呆的神經(jīng)變性疾病。該病伴有大腦中三處主要結(jié)構(gòu)的變化，即，i)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)沉積(也稱為神經(jīng)元纖維纏結(jié)，或者NFT)，ii)細(xì)胞外蛋白質(zhì)沉積，術(shù)語稱為淀粉樣蛋白斑塊，其被營養(yǎng)不良的神經(jīng)炎圍繞，和iii)神經(jīng)元的彌漫性流失。
本發(fā)明的化合物或組合物拯救了由早老蛋白-1突變引起的神經(jīng)元分化缺陷，并且可以降低阿爾次海默氏病患者大腦中神經(jīng)元前體群分化為神經(jīng)元的數(shù)量或比率。早老蛋白是透膜蛋白質(zhì)，其功能與Notch和淀粉樣前體蛋白的運(yùn)輸、更新和解理有關(guān)。早老蛋白1(PS-1)中的錯義突變與早發(fā)家族性阿爾茨海默式癥有關(guān)(Fraser等，Biochem.Soc.Symp.67，89(2001))。本發(fā)明的化合物不僅可用于帶有PS-1家族性阿爾茨海默式突變的個體，還適用于一般的阿爾茨海默式癥患者。
此外，本發(fā)明提供了一種用于治療或預(yù)防阿爾茨海默式癥的方法，包括根據(jù)需要對個體施予安全和有效量的本發(fā)明的回折擬態(tài)，其中該量有效地治療或預(yù)防個體的阿爾茨海默式癥。要理解治療阿爾茨海默式癥包括減少或消除阿爾茨海默式癥病癥特性的表現(xiàn)，或者延緩該疾病的發(fā)展。要理解預(yù)防阿爾茨海默式癥包括預(yù)防或延緩該病的發(fā)作。
需要治療的個體可以是處于阿爾茨海默式癥的各種階段的人類或非人靈長類動物或其它動物。用于診斷阿爾茨海默式癥的方法在本領(lǐng)域是公知的(參見，例如，Dinsmore，J.Am.Osteopath.Assoc.99(9 Suppl.)S1-6，1999；Kurz等，J.Neural Transm.Suppl.62127-33，2002；Storey等，F(xiàn)ront Viosci.7e155-84，2002；Marin等，Geriatrics 5736-40，2002；Kril和Halliday，Int.Rev.Neurobiol.48167-217，2001；Gurwitz，TrendsNeurosci.23386，2000；Muller-Spahn和Hock，Eur.Arch.Psychiatry Clin.Neurosci.249Suppl.337-42；Fox和Rossor，Rev.Neuro.(Paris)155Suppl.4S33-7，1999)，包括神經(jīng)心理學(xué)方法、功能影像方法、生物標(biāo)記和腦組織尸體解剖的應(yīng)用。需要進(jìn)行預(yù)防的個體可以是具有發(fā)展阿爾茨海默式癥風(fēng)險的人類或非人靈長類動物或其它動物，例如帶有作為該病肇因的某些基因(例如，編碼了淀粉樣前體蛋白、早老蛋白1和早老蛋白2的基因)、和/或涉及該病發(fā)病機(jī)理的基因(例如，載脂蛋白E基因)的突變的個體(Rocchi等，Brain Res.Bull 611-24，2003)。
具有如式(I)所列出的結(jié)構(gòu)的化合物，可以通過本領(lǐng)域公知的任何合適方法對其在治療或預(yù)防阿爾茨海默式癥中的活性進(jìn)行篩選。這種篩選最初可以使用在體外培養(yǎng)的細(xì)胞(例如，實施例8所述的PC-12細(xì)胞)來進(jìn)行?？梢允褂酶鞣N阿爾茨海默式癥的動物模型，來對能夠拯救由早老蛋白1突變引起的神經(jīng)元分化缺陷的化合物進(jìn)行進(jìn)一步的篩選?；蛘撸哂惺?I)所列出的結(jié)構(gòu)的化合物可以在阿爾茨海默式癥的動物模型中直接進(jìn)行測試。許多模型系統(tǒng)在本領(lǐng)域中是公知的，并且可以在本發(fā)明中使用(參見，例如，Rowan等，Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.358821-8，2003；Lemere等，Neurochem.Res.281017-27，2003；Sant’Angelo等，Neurochem.Res.281009-15，2003；Weiner，Harv.Rev.Psychiatry4306-16，1997)。所選擇的化合物在治療或預(yù)防阿爾茨海默式癥上的效果，可以用本領(lǐng)域公知的用于評價阿爾茨海默式癥發(fā)展的方法來表征或監(jiān)控，包括如上所述的那些用于診斷該病的方法。
本發(fā)明還提供了用于促進(jìn)神經(jīng)突生長的方法。這種方法包括使神經(jīng)元與促進(jìn)神經(jīng)突生長有效量的根據(jù)式(I)的化合物接觸的步驟。這些方法可用于治療神經(jīng)變性疾病(例如，青光眼、黃斑部變性、帕金森氏病和阿爾茨海默式癥)和神經(jīng)系統(tǒng)損傷。如果在該化合物的存在下神經(jīng)元的神經(jīng)突長度在統(tǒng)計學(xué)上明顯長于不存在該化合物時的神經(jīng)元的神經(jīng)突長度，則該化合物促進(jìn)了神經(jīng)突生長。這種化合物可以使用在體外培養(yǎng)的細(xì)胞(例如，PC-12細(xì)胞，成神經(jīng)細(xì)胞瘤B104細(xì)胞)進(jìn)行識別(Bitar等，Cell Tissue Res.298233-42，1999；Pellitteri等，Eur.J.Histochem.45367-76，2001；Satoh等，Biochem.Biophys.Res.Commun.25850-3，1999；Hirata和Fujisawa，J.Neurobiol.32415-25，1997；Chauvet等，Glia 18211-23，1996；Vetter和Bishop，Curr.Biol.5168-78，1994；Koo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 904748-52，1993；Skubitz等，J.Cell Biol.1151137-48，1991；O’Shea等，Neuron 7231-7，1991；Rydel和Greene，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 851257-61，1988)，或者使用外植物來進(jìn)行識別(Kato等，Brain Res.31143-7，1983；Vanhems等，Eur.J.Neurosci.2776-82，1990；Carri等，Int.J.Dev.Neurosci.12567-78，1994)。使神經(jīng)元與根據(jù)本發(fā)明的化合物相接觸可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行。所得到的治療過的神經(jīng)元，如果是在體外生成的，可以被移植到需要的組織中去(Lacza等，Brain Res.Brain Res.Protoc.11145-54，2003；Chu等，Neurosci.Lett 343129-33，2003；Fukunaga等，Cell Transplant 8435-41，1999)。
本發(fā)明還提供了用于促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法，包括使神經(jīng)干細(xì)胞與促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化有效量的根據(jù)式(I)的化合物相接觸。這種方法也可用于治療神經(jīng)變性疾病(例如，青光眼、黃斑部變性、帕金森氏病和阿爾茨海默式癥)和神經(jīng)系統(tǒng)損傷?！吧窠?jīng)干細(xì)胞”指的是在適當(dāng)?shù)臈l件下能夠分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)克隆的、未分化的、多潛能細(xì)胞。如果在該化合物的存在下神經(jīng)干細(xì)胞表現(xiàn)出的分化程度明顯高于不存在該化合物時神經(jīng)干細(xì)胞的分化程度，則該化合物促進(jìn)了神經(jīng)干細(xì)胞的分化。這種化合物可以使用涉及體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞或者動物模型的分析來進(jìn)行識別(Albranches等，Biotechnol.Lett.25725-30，2003；Deng等，Exp.Neurol.182373-82，2003；Munoz-Elias等，Stem Cells 21437-48，2003；Kudo等，Biochem.Pharmacol.66289-95，2003；Wan等，Chin.Med.J.116428-31，2003；Kawamorita等，Hum.Cell 15178-82，2002；Stavridis和Smith，Biochem.Soc.Trans.3145-9，2003；Pachernik等，Reprod.Nutr.Dev.42317-26，2002；Fukunaga等，如上)。神經(jīng)干細(xì)胞可以是培養(yǎng)的干細(xì)胞、由其源組織剛剛分離出來的干細(xì)胞、或者其源生物體內(nèi)的干細(xì)胞。因此，使該神經(jīng)干細(xì)胞與根據(jù)本發(fā)明的化合物相接觸可以在體外(對于培養(yǎng)干細(xì)胞或者剛剛分離的干細(xì)胞來說)或者在體內(nèi)(對于在其源生物體內(nèi)的干細(xì)胞來說)進(jìn)行。所得的分化的神經(jīng)細(xì)胞，如果是在體外生成的，可以被移植到需要的組織中去(Lacza等，如上；Chu等，如上；Fukunaga等，如上)。這種組織包括遭受外傷或神經(jīng)變性疾病的腦組織或其它神經(jīng)組織。
以下非限定性實施例說明了本發(fā)明使用的化合物、組合物和方法。
實施例制備實施例1(N-Fmoc-N’-R3-肼基)-乙酸的制備(1)N-Fmoc-N’-甲基肼的制備
為2L的雙頸圓底燒瓶配上玻璃塞和鈣管。加入硫酸甲基肼(20g，139mmol，其中R3是甲基)的THF(300mL)溶液，并且加入DiBoc(33g，153mmol)的THF溶液。經(jīng)2小時，用加料漏斗滴加入飽和碳酸氫鈉水溶液(500mL)，同時劇烈攪拌。6小時后，緩慢加入Fmoc-Cl(39g，153mmol)的THF溶液。所得到的懸浮液在0℃下攪拌6小時。用乙酸乙酯(EA，500mL)萃取該混合物，并且保留有機(jī)層。用硫酸鈉干燥該溶液并且真空蒸發(fā)。無需純化進(jìn)行下一步。
為1L的雙頸圓底燒瓶配上玻璃塞和鈣管。加入由前步得到的產(chǎn)物在MeOH(300mL)中的溶液，并且用加料漏斗緩慢加入濃鹽酸(30mL，12N)，同時在冰水浴中用磁力進(jìn)行攪拌，并且攪拌過夜。用EA(1000mL)萃取該混合物并且保留有機(jī)層。用硫酸鈉干燥該溶液并且真空蒸發(fā)。通過用正己烷和EA重結(jié)晶來對殘余物進(jìn)行純化，從而得到N-Fmoc-N’-甲基肼(32.2g，83％)。1HNMR(DMSO-D6)δ7.90～7.88(d，J＝6Hz，2H)，δ7.73～7.70(d，J＝9Hz，2H)，7.44～7.31(m，4H)，4.52～4.50(d，J＝6Hz，2H)，4.31～4.26(t，J＝6Hz，1H)，2.69(s，1H)。
(2)(N-Fmoc-N’-甲基-肼基)-乙酸叔丁基酯的制備 為1L的雙頸圓底燒瓶配上玻璃塞和連接到鈣管的回流冷凝器。加入N-Fmoc-N’-甲基肼(20g，75mmol)的甲苯(300mL)溶液。緩慢加入溴乙酸叔丁酯(t-butylbromo acetate，22g，111mmol)的甲苯(50mL)溶液。緩慢加入Cs2CO3(49g，149mmol)。緩慢加入NaI(11g，74mmol)同時劇烈攪拌。在回流溫度下將反應(yīng)混合物攪拌1天。過濾產(chǎn)品混合物并且用EA(500mL)萃取。用硫酸鈉干燥該溶液并且真空蒸發(fā)。用己烷∶EA＝2∶1的溶液通過色譜對產(chǎn)品進(jìn)行純化以得到(N-Fmoc-N’-甲基-肼基)-乙酸叔丁酯(19.8g，70％)。
1H-NMR(CDCl3-d)δ7.78～7.75(d，J＝9Hz，2H)，δ7.61～7.59(d，J＝6Hz，2H)，7.43～7.26(m，4H)，4.42～4.40(d，J＝6Hz，2H)，4.23(b，1H)，3.57(s，2H)，2.78(s，3H)，1.50(s，9H)。
(3)(N-Fmoc-N’-甲基-肼基)-乙酸的制備 為1L的雙頸圓底燒瓶配上玻璃塞和連接到鈣管的回流冷凝管。加入(N-Fmoc-N’-甲基-肼基)-乙酸叔丁酯(20g，52mmol)。緩慢加入鹽酸溶液(150mL，在二氧己環(huán)中的4M溶液)，同時在冰水浴中劇烈攪拌。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1天。在減壓下于40℃下將該溶液完全濃縮。加入飽和NaHCO3水溶液(100mL)，并且用乙醚(100mL)洗滌水層。在0℃下緩慢滴加濃鹽酸(pH2-3)。萃取該混合物并且保留有機(jī)層(500mL，MC)。用硫酸鈉干燥該溶液并且真空蒸發(fā)。用正己烷和乙酸乙酯通過重結(jié)晶對殘余物進(jìn)行純化，從而得到(N-Fmoc-N’-甲基-肼基)乙酸(12g，72％)。1H-NMR(DMSO-d6)δ12.38(s，1H)，8.56(b，1H)，7.89～7.86(d，J＝9Hz，2H)，7.70～7.67(d，J＝9Hz，2H)，7.43～7.29(m，4H)，4.29～4.27(d，J＝6Hz，2H)，4.25～4.20(t，J＝6Hz，1H)，3.47(s，2H)，2.56(s，3H)。
制備實施例2(N-Moc-N’-R7-肼基)-乙酸的制備(1)(N’-甲氧基羰基-肼基)乙酸乙基酯的制備 將MOC-NH-NH2(50g，0.55mol)溶解在DMF(300ml)中，然后向反應(yīng)容器中加入溴乙酸乙酯(68ml，0.555mol)和碳酸鉀(77g，0.555mol)。將該混合物加熱到50℃并保持5小時。反應(yīng)完成后，將該混合物過濾，并且用EtOAc稀釋，然后用鹽水洗滌(3次)。粗產(chǎn)品用柱純化(洗脫液Hex/EtOAc＝4/1)，從而得到72克無色的油。
(2)[N-R7-N’-甲氧基羰基-肼基]-乙酸乙基酯 將乙基酯(10g，0.05mol)、碳酸鉀(6.9g，0.05mol)和R7-溴(14.1g，0.06mol)溶解在DMF(200ml)中，并且將該混合物加熱到50℃并保持5小時。反應(yīng)完成后，將該混合物過濾，并且用EA稀釋，然后用鹽水洗滌(3次)。用色譜純化粗產(chǎn)品(洗脫液Hex/EtOAc＝4/1)。
(3)[N-R7-N’-甲氧基羰基-肼基]-乙酸 將烷基化的乙基酯(9.5g，0.03mol)溶解在THF/水(1/1，ml)中，并且在0℃下加入2N的NaOH(28.3ml)溶液。在室溫將該混合物攪拌2小時。當(dāng)在紫外下檢測不到起始的酯時，用EA稀釋該溶液，然后分離。用1N的鹽酸將水層酸化到pH3～4，并且用DCM萃取化合物(3次)。合并的有機(jī)層經(jīng)MgSO4干燥后進(jìn)行蒸發(fā)，得到黃色固體。
實施例1 (1)Nβ-Moc-Nα-芐基-肼基甘氨酸的制備 該化合物是根據(jù)文獻(xiàn)的程序而制備的。(Cheguillaume等，Synlett2000，3，331)。
(2)1-甲氧基羰基-2，8-二芐基-6-甲基-4，7-二氧-六氫-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪的制備將溴乙縮醛樹脂(60mg，0.98mmol/g)和芐胺的DMSO溶液(2.5ml，2M)放置在配有螺帽的管形瓶中。在60℃下使用轉(zhuǎn)爐[RobbinsScientific]將該反應(yīng)混合物振蕩12小時。過濾收集樹脂，并且用DMF，然后用DCM清洗該樹脂，從而得到第一組分片段。
將Fmoc-丙氨酸(4當(dāng)量，市售，第二組分片段)，HATU(PerSeptiveBiosystems，4當(dāng)量)和DIEA(4當(dāng)量)的NMP(Advanced ChemTech)溶液加入到樹脂中。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩4小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
向該樹脂中加入在DMF中的20％的哌啶。在室溫下將該反應(yīng)混合物振蕩8分鐘后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
將Nβ-Moc-Nα-芐基-肼基甘氨酸(4當(dāng)量，制備實施例2中的化合物(3)，其中R7是芐基，第三組分片段)、HOBT[Advanved ChemTech](4當(dāng)量)和DIC(4當(dāng)量)的DMF溶液加入到以上制備的樹脂中。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩3小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用MeOH清洗該樹脂。在室溫下真空干燥該樹脂。
在室溫下用甲酸(2.5ml)將該樹脂處理18小時。過濾除去樹脂后，在減壓下濃縮濾液，從而得到作為油的產(chǎn)品。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；1.51(d，3H)，2.99(m，1H)，3.39(d，1H)，3.69(m，1H)，3.75(m，1H)，3.82(s，3H)，4.02(d，1H)，4.24(d，1H)，4.39(d，1H)，4.75(d，1H)，5.14(q，1H)，5.58(dd，1H)，7.10-7.38(m，10H)。
實施例2 (1)N’-Fmoc-N-甲基-肼基碳酰氯的制備 迅速地攪拌在15ml的CH2Cl2中的N-甲基肼羧酸9H-芴-9-基甲基酯(107mg，0.4mmol)和15ml的飽和NaHCO3水溶液的冰冷卻的兩相混合物，同時加入在甲苯中的1.93M光氣(1.03ml，2mmol)作為單獨的部分。將反應(yīng)混合物攪拌30分鐘，收集有機(jī)相，并且用CH2Cl2萃取水相。合并的有機(jī)相經(jīng)MgSO4干燥后，過濾，真空濃縮以得到作為泡沫狀固體的128mg(97％)氨基甲酰氯。[警告光氣蒸汽劇毒。在通風(fēng)櫥中使用]。該產(chǎn)品無需進(jìn)一步純化即用于以下的固相合成。
(2)2，5-二甲基-7-芐基-3，6-二氧-六氫-[1，2，4]三嗪并[4，5-a]吡嗪-1-羧酸芐酰胺的制備將溴乙縮醛樹脂(30mg，0.98mmol/g)和芐胺的DMSO溶液(1.5ml，2M)放置在帶有螺帽的管形瓶中。在60℃下使用轉(zhuǎn)爐[RobbinsScientific]將反應(yīng)混合物振蕩12小時。過濾收集樹脂，并且用DMF，然后用DCM清洗該樹脂，以得到第一組分片段。
將Fmoc-丙氨酸(3當(dāng)量，第二組分片段，市售)、HATU(PerSeptiveBiosystems，3當(dāng)量)和DIEA(3當(dāng)量)的NMP(Advanced ChemTech)溶液加入到樹脂中。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩4小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂，從而將第二組分片段加入到第一組分片段上。
向該樹脂中加入在DMF中的20％的哌啶。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩8分鐘后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
將上述步驟(1)中所獲的N’-Fmoc-N-甲基-肼基碳酰氯(結(jié)合的第三和第四組分片段，5當(dāng)量)、DIEA(5當(dāng)量)的DCM溶液加入到上述制備的樹脂中。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩4小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
向該樹脂中加入在DMF中的20％的哌啶(1g樹脂加入10ml)。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩8分鐘后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
在室溫下用異氰酸芐酯(4當(dāng)量)和DIEA(4當(dāng)量)在DCM中的混合物對該樹脂進(jìn)行4小時的處理。然后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用MeOH清洗該樹脂。在室溫下真空干燥該樹脂。
在室溫下用甲酸將該樹脂處理14小時。過濾除去樹脂后，在減壓下濃縮濾液，從而得到作為油的產(chǎn)品。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；1.48(d，3H)，2.98(s，3H)，3.18(m，1H)，3.46(m，1H)，4.37-4.74(m，5H)，5.66(dd，1H)，6.18(m，1H)，7.10-7.40(m，10H)。
實施例32，5，7-三甲基-3，6-二氧-六氫-[1，2，4]三嗪并[4，5-a]吡嗪-1-羧酸芐酰胺的制備根據(jù)實施例2所述的相同程序制備題述化合物，但是使溴乙縮醛樹脂與甲基胺溶液進(jìn)行反應(yīng)而非芐胺。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；1.48(d，3H)，2.99(s，3H)，3.03(s，3H)，3.38(m，1H)，3.53(dd，1H)，4.36(dd，1H)，4.52(q，1H)，4.59(dd，1H)，5.72(dd，1H)，6.19(br.t，1H)，7.10-7.38(m，5H)。
實施例42-甲基-5-(對羥基苯甲基)-7-萘甲基-3，6-二氧-六氫-[1，2，4]三嗪并[4，5-a]吡嗪-1-羧酸芐酰胺的制備將溴乙縮醛樹脂(30mg，0.98mmol/g)和萘甲胺的DMSO溶液(1.5ml，2M)放置在帶有螺帽的管形瓶中。使用轉(zhuǎn)爐[RobbinsScientific]將反應(yīng)混合物在60℃下振蕩12小時。過濾收集樹脂，并且用DMF、然后用DCM清洗該樹脂，從而得到第一組分片段。
向該樹脂中加入Fmoc-Tyr(OBut)-OH(3當(dāng)量)、HATU(PerSeptiveBiosystems，3當(dāng)量)和DIEA(3當(dāng)量)的NMP(Advanced ChemTech)溶液。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩4小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂，從而將第二組分片段加入到第一組分片段上。
向該樹脂中加入在DMF中的20％的哌啶。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩8分鐘后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
向以上制備的樹脂中加入N’-Fmoc-N-肼基碳酰氯(5當(dāng)量)、DIEA(5當(dāng)量)的DCM溶液。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩4小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM、和DMF清洗該樹脂。
向該樹脂中加入在DMF中的20％的哌啶(1g樹脂中加入10ml)。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩8分鐘后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
在室溫下用異氰酸芐酯(4當(dāng)量)和DIEA(4當(dāng)量)在DCM中的混合物將該樹脂處理4小時。然后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用MeOH清洗該樹脂。在室溫下真空干燥該樹脂。
在室溫下用甲酸將該樹脂處理14小時。過濾除去樹脂后，在減壓下濃縮濾液，從而得到作為油的產(chǎn)品。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；2.80-2.98(m，5H)，3.21-3.37(m，2H)，4.22-4.52(m，2H)，4.59(t，1H)，4.71(d，1H)，5.02(dd，1H)，5.35(d，1H)，5.51(d，1H)，6.66(t，2H)，6.94(dd，2H)，7.21-8.21(m，12H)。
實施例52-甲基-6-(對羥基苯甲基)-8-萘基-4，7-二氧-六氫-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1-羧酸芐酰胺的制備將溴乙縮醛樹脂(60mg，0.98mmol/g)和萘胺的DMSO溶液(2.5ml，2M)放置在帶有螺帽的管形瓶中。使用轉(zhuǎn)爐[Robbins Scientific]將反應(yīng)混合物在60℃下振蕩12小時。過濾收集樹脂，并且用DMF，然后用DCM清洗該樹脂。
將Fmoc-Tyr(OBut)-OH(4當(dāng)量)、HATU[PerSeptive Biosystems](4當(dāng)量)和DIEA(4當(dāng)量)的NMP(Advanced ChemTech)溶液加入到該樹脂中。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩4小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
向該樹脂中加入在DMF中的20％的哌啶。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩8分鐘后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
將Nβ-Fmoc-Nα-芐基-肼基甘氨酸(4當(dāng)量)、HOBT[AdvancedChemTech](4當(dāng)量)和DIC(4當(dāng)量)的DMF溶液加入到以上制備的樹脂中。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩3小時后，過濾收集樹脂，并且用DMF，然后用DCM清洗該樹脂。向該樹脂中加入在DMF中的20％的哌啶(1g樹脂中10ml)。在室溫下將反應(yīng)混合物振蕩8分鐘后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用DMF清洗該樹脂。
在室溫下用異氰酸芐酯(4當(dāng)量)和DIEA(4當(dāng)量)在DCM中的混合物將該樹脂處理4小時。然后，過濾收集樹脂，并且用DMF、DCM，然后用MeOH清洗該樹脂。在室溫下真空干燥該樹脂后，在室溫下用甲酸(2.5ml)將該樹脂處理18小時。過濾除去樹脂后，在減壓下濃縮濾液，從而得到作為油的產(chǎn)品。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm；2.73(s，3H)，3.13(d，1H)，3.21-3.38(m，3H)，3.55(d，1H)，3.75(t，1H)，4.22(dd，1H)，4.36(dd，1H)，4.79(d，1H)，5.22(t，1H)，5.47(m，2H)，6.68(d，2H)，6.99(d，2H)，7.21-8.21(m，12H)；
MS(m/z，ESI)564.1(MH+)586.3(MNa+)。
實施例6對SW480細(xì)胞的IC50進(jìn)行測量的生物分析和對該細(xì)胞系的細(xì)胞毒性測試本實施例中所使用的測試化合物(化合物A)是在實施例4中制備的。
a.報道基因分析使用SuperfectTM轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen，301307)對SW480細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染前，細(xì)胞用胰蛋白酶消化短暫的1天時間，并且放置在6孔板上(5×105細(xì)胞/孔)，以便使其在轉(zhuǎn)染當(dāng)天有50-80％的融合。
在150μl的無血清培養(yǎng)基中稀釋DNA的4微克(TOPFlash)和1微克(pRL-null)，并且加入30μl的SuperfectTM轉(zhuǎn)染試劑。在室溫下將DNA-Superfect混合物培育15分鐘，然后，向該復(fù)合體中加入1ml10％的FBS DMEM并且繼續(xù)培育3小時。當(dāng)復(fù)合體形成時，用不含抗菌素的PBS將細(xì)胞洗滌兩次。
將DNA-SuperfectTM轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合體施加到細(xì)胞上，然后在37℃下在5％的CO2中培育3小時。培育后，加入含有10％FBS的回收培養(yǎng)基以使最終體積達(dá)到1.18ml。在3小時的培育后，收獲細(xì)胞，并且將其補(bǔ)種到96孔板上(3×104個細(xì)胞/孔)。于37℃下在5％的CO2中培育過夜后，用化合物A將該細(xì)胞處理24小時。最后，通過熒光素酶分析(Promega，E1960)的方式檢查活性。
圖3說明了化合物A對SW480細(xì)胞的IC50的測量結(jié)果。
b.磺酰羅丹明B(SRB)分析化合物A對下列細(xì)胞的生長抑制效果通過磺酰羅丹明B分析進(jìn)行測量。將在100μl培養(yǎng)基中的SW480細(xì)胞放置在96-孔板的每一個孔中，并且使其附著24小時。將化合物A加入孔中以便產(chǎn)生預(yù)期的最終濃度，并且將該板在37℃下培育48小時。然后通過向每一個孔中平緩加入100μl冷(4℃)的10％的三氯乙酸而使細(xì)胞固定，隨后在4℃下培育1小時。板用去離子水清洗五次，并且使其風(fēng)干。然后通過向孔中加入100μl SRB溶液(在1％的乙酸(v/v)中的0.4％SRB(w/v))而將細(xì)胞染色15分鐘。染色后，該板用1％的乙酸迅速清洗5次以除去任何未結(jié)合的染料，并且使其風(fēng)干。在讀取該板前，用10mmol/L的三羥甲基氨基甲烷(tris base)(pH10.5)使結(jié)合染料溶解。光學(xué)密度(OD)用Molecular Device在515nm的波長下在板讀數(shù)器上讀取。生長抑制表達(dá)為相對生存力(對照的％)，并且GI50由對數(shù)/概率值轉(zhuǎn)換后的濃度-響應(yīng)曲線來計算。
表6顯示了實施例4中所獲得的化合物A的體外細(xì)胞毒性(SRB)檢驗數(shù)據(jù)。表6中數(shù)值的單位是μg/ml。
表6

實施例7小鼠模型在小鼠模型中對所選擇的本發(fā)明的化合物(化合物B和化合物C)進(jìn)行評價，從而對其作為抗癌劑的效力進(jìn)行評價。

化合物B

化合物C小鼠模型是一種廣泛用于測試這種類型效力的模型。在各種處理后，對這些小鼠的小腸和結(jié)腸中形成的息肉數(shù)量進(jìn)行測量(表7)。數(shù)據(jù)顯示，與那些僅僅用載體處理的對照小鼠中的息肉數(shù)量相比，當(dāng)這兩種化合物的給藥量為大約300mpk時，減少了小鼠中息肉的數(shù)量。
表7小鼠模型數(shù)據(jù)

實施例8對CBP/β-連環(huán)蛋白相互作用的化學(xué)基因組的抑制，補(bǔ)救在由早老蛋白-1突變所引起的神經(jīng)元分化中的缺陷以下化合物(化合物D)在本實施例中使用 材料和方法質(zhì)粒。TOPFLASH和FOPFLASH報道基因構(gòu)造根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程轉(zhuǎn)化為DH5α感受態(tài)細(xì)胞。使用EndoFree Maxi kit(Oiagen，Valencia，CA)對用于轉(zhuǎn)染檢驗的質(zhì)粒進(jìn)行分離和純化。
PC-12細(xì)胞培養(yǎng)。PC-12細(xì)胞被保存在補(bǔ)充了10％馬血清、5％胎牛血清、4.5g/L葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、1.0mM丙酮酸鈉和10μg/ml青霉素-鏈霉素的RPMI 1640中。
細(xì)胞分化。細(xì)胞培養(yǎng)盤用0.25mg/ml骨膠原(Cohesion，CA)、10μg/ml聚-L-賴氨酸(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和12μg/ml聚乙烯亞胺(ICN，La Mesa，CA)預(yù)涂覆過夜。在涂覆過的盤上以15,000個細(xì)胞/cm2來培養(yǎng)細(xì)胞，并且通過在含有50ng/ml神經(jīng)生長因子(NGF)(Sigma-Aldrich)的減少血清的培養(yǎng)基(1％胎牛血清)中培育10天，而使這些細(xì)胞分化為類神經(jīng)元顯型。含NGF的培養(yǎng)基每隔2-3天更換。
用化合物D處理?；衔顳，β-連環(huán)蛋白/CBP相互作用的小分子抑制劑，以100mM的原料濃度溶解在DMSO中。分化的PC-12/L286V細(xì)胞用濃度不斷升高的這種化合物處理4小時。然后在該處理期后開始轉(zhuǎn)染。對于細(xì)胞分化實驗，化合物D在整個分化期間以10μM的濃度與NGF一起加入。
轉(zhuǎn)染。PC-12細(xì)胞在60毫米的盤上進(jìn)行培養(yǎng)和分化。在10天的分化期的結(jié)尾，細(xì)胞用每60毫米盤上2μg報道基因構(gòu)造，TOPFLASH和FOPFLASH，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染是使用Superfect(Qiagen)根據(jù)廠商的用法說明來進(jìn)行的。
熒光素酶分析。在轉(zhuǎn)染后6小時，在100μl的細(xì)胞培養(yǎng)溶解劑(Promega，Madison，WI)中將細(xì)胞溶解，并且將其刮到微量離心管中。然后將該管以12000rpm短暫離心(大約10秒)以使細(xì)胞碎片結(jié)成小球。對20μl細(xì)胞溶解產(chǎn)物和來自熒光素酶檢驗系統(tǒng)(Promega)的100μl基質(zhì)測量熒光素酶的活性。熒光素酶活性使用PackardLumiCount(Hewlett Packard)來測量。熒光素酶的量化進(jìn)行三次，并且至少在三個獨立的實驗中重復(fù)。
免疫熒光。將細(xì)胞以10,000個細(xì)胞/cm2的密度涂在6孔培養(yǎng)板中無菌涂覆的22×22毫米蓋玻片上。如前所述，開始10天的分化。然后在-20℃下于甲醇中將分化細(xì)胞固定15分鐘。然后用PBS+0.1％Triton X-100進(jìn)行15分鐘的培育。在37℃下，將蓋玻片與針對Ephrin B2受體(Santa Cruz Biotechnology)和Gap-43(Novus Biologicals)產(chǎn)生的抗體培育40分鐘。在用PBS-Triton X-100進(jìn)行一系列的清洗之后，施用與FITC(Jackson Immuno Resarch，Westgrove，PA)結(jié)合的第二抗體。使用固定在Nikon Eclipse E600直立型顯微鏡(Nikon，Melville，NY)上的Nikon PCM2000激光掃描共焦顯微鏡獲取所有的玻片影像。
神經(jīng)突生長的量化。由六個隨機(jī)選取的顯微視野(10×)中獲取細(xì)胞計數(shù)。在每一個視野中，測定細(xì)胞總數(shù)，以及顯示出神經(jīng)突大于細(xì)胞體長度兩倍的細(xì)胞的總數(shù)。然后將具有這種生長的細(xì)胞的數(shù)目表達(dá)為細(xì)胞總數(shù)的百分比。所獲的值來自雙重的三個獨立實驗。
RT-PCR。為分析Ephrin B2(EphB2)受體的mRNA水平，使用Trizol(Invitrogen-GIBCO-BRL，Baltimore，MD)將總的RNA由分化細(xì)胞中分離出來。在含有隨機(jī)六聚物(50ng)的20μl總體積中，使用Superscirpt II逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(Invitrogen-GIBCO-BRL)，根據(jù)廠商的指南對2μg的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR是在含有5μl cDNA、100pmol引物、100μM dNTPs、1×Taq緩沖液和1.5mM MgCl2的50μl體積中進(jìn)行的。將反應(yīng)混合物加熱到80℃并保持10分鐘，然后加入Taq。使cDNA放大25(EphB2受體)或15(GAPDH)個周期。一圈的放大由在94℃下1分鐘、在60℃下2分鐘和在72℃下2分鐘，同時在72℃下最后延展10分鐘而組成。PCR產(chǎn)物被重新溶解，并且在用溴化乙錠染色的2％凝膠中進(jìn)行電泳以進(jìn)行顯現(xiàn)。所使用的EphB2受體PCR引物為，5’-CACTACTGGACCGCACGATAC-3’和5’-TCTACCGACTGGATCTGGTTCA-3’。用于GAPDH的引物對是5’-GGTGCTGAGTATGTCGTGGA-3’和5’-ACAGTGTTCTGGGTGGCAGT-3’。
結(jié)果大鼠PC-12細(xì)胞衍生自神經(jīng)嵴系譜，并且經(jīng)過神經(jīng)生長因子(NGF)處理，經(jīng)歷了分化變?yōu)樯窠?jīng)突軸類交感神經(jīng)的神經(jīng)元(neurite-bearingsympathetic-like neuron)(Greene和Tischler，Proc Natl Acad Sci U S A73，2424(1976))。利用PC-12細(xì)胞基模型，表征了與PS-1突變，PS-1/L286V，相關(guān)的早發(fā)性FAD，對TCF/β-連環(huán)蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和神經(jīng)元分化的效果。說明了特異地阻斷TCF/β-連環(huán)蛋白/CBP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，減輕了神經(jīng)元分化中PS-1誘導(dǎo)的缺陷。
PC-12細(xì)胞穩(wěn)定地超量表達(dá)了野生型PS-1(PS-1/WT)或突變體PS-1(PS-1/L286V)，并且載體轉(zhuǎn)染對照細(xì)胞系(Guo等，Neuroreport，8，379(1996))被放置在涂覆有骨膠原、聚-L-賴氨酸和聚乙烯亞胺的盤上。用50ng/ml的NGF處理10天以誘導(dǎo)分化。超量表達(dá)的PS-1/WT細(xì)胞或者載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞廣泛形成了神經(jīng)突(與來自ATCC的PC-12細(xì)胞克隆相似)，然而PS-1/L286V突變細(xì)胞僅僅形成了斷株樣的神經(jīng)突(圖4A-C)。此外，載體轉(zhuǎn)染的PC-12對照和PS-1/WT細(xì)胞顯示了神經(jīng)原分化標(biāo)記GAP-43的廣泛表達(dá)(Gorgels等，Neurosic Lett.83，59(2987))(圖4D、E)，然而PS-1/L286V細(xì)胞基本上沒有這種標(biāo)記(圖4F)。
為評定PS-1/L286V突變對典型的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號的效果，我們用Topflash，一種Wnt/β-連環(huán)蛋白信號報道基因構(gòu)造，臨時轉(zhuǎn)染了NGF處理過的PC-12細(xì)胞(Morin等，Science 275，1787(1997))。如圖4F中可見，超量表達(dá)的PS-1/WT細(xì)胞具有與載體對照細(xì)胞相似的TCF/β-連環(huán)蛋白信號水平。然而，PS-l/L286V突變細(xì)胞顯示了明顯提高的Topflash表達(dá)(10倍)。相反，負(fù)控制報道基因構(gòu)造Fopflash未顯示任何明顯的不同。
假設(shè)PS-1/L286V突變細(xì)胞中調(diào)節(jié)異常的TCF/β-連環(huán)蛋白信號是有缺陷的分化和神經(jīng)突生長的原因。為檢驗這一假定，使用了特定的TCF/β-連環(huán)蛋白信號的小分子抑制劑，化合物D(Emami等，CancerCell，in press)。該小分子選擇性地阻斷了β-連環(huán)蛋白/CBP的相互作用，而不是β-連環(huán)蛋白/p300的相互作用，從而中斷了TCF/β-連環(huán)蛋白亞型的轉(zhuǎn)錄。與未處理的細(xì)胞相比(圖4C)，類似于在超量表達(dá)的PS-1/WT細(xì)胞中所見的情況(圖5A、B)，用10μM的化合物D加NGF處理PS-1/L286V突變細(xì)胞減少了TCF/β-連環(huán)蛋白報道基因轉(zhuǎn)錄，并且導(dǎo)致基本上正常的神經(jīng)突生長和分化(圖5A)。此外，用化合物D處理的PS-1/L286V突變體顯示了與PS-1/WT和載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(圖4B)相似的強(qiáng)GAP-43染色。為了說明化合物D處理過的突變細(xì)胞發(fā)展了與載體對照或PS-1/WT細(xì)胞相似的神經(jīng)突，計算了具有大于細(xì)胞體長度兩倍的神經(jīng)突的細(xì)胞。用化合物D進(jìn)行處理基本上將細(xì)胞軸神經(jīng)突的百分比提高到與載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞和超量表達(dá)的PS-1/WT細(xì)胞(圖5C)相似的水平。得到的結(jié)論是，阻斷由TCF/β-連環(huán)蛋白/CBP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，修正了許多由于PS-1/L286V突變引起的神經(jīng)突生長和神經(jīng)元分化中的顯型缺陷。
Ephrin B2受體(EphB2)與突觸形成有關(guān)(Wilkinson，Nat.Rev.Neurosci.2，155(2001))，并且近來顯示Ephrin A族在海馬樹突棘形態(tài)學(xué)中扮演角色(Murai等，Nat.Neurosci.6，153(2003))。觀察了焦點EphB2表達(dá)，其在載體和PS-1/WT轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(圖6A、B)中使得神經(jīng)元過程局部化了，然而PS-1/L286V突變細(xì)胞顯示了非常弱和分散的EphB2信號(圖6C)。PS-1/L286V突變細(xì)胞中增大的TCF/β-連環(huán)蛋白信號，表明了其自身降低了的EphB2表達(dá)，如RT-PCR所判斷的一樣(圖6E，線道3)。此外，加入10μM化合物D導(dǎo)致這些細(xì)胞中提高的EphB2信息(圖6E，線道4)以及提高的EphB2表達(dá)(圖6D)。這些結(jié)果與Batlle和同事的數(shù)據(jù)吻合(Batlle等，Cell 111，251(2002))，他們近來表示EphB2/EphB3受體及其配合基ephrin-B1的表達(dá)經(jīng)由TCF/β-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄在結(jié)腸隱窩中反向控制，并且合理的調(diào)節(jié)對于適當(dāng)?shù)募?xì)胞增殖、分化和分類來說是重要的。我們提出了PS-1/L286V突變的證據(jù)，經(jīng)由提高的TCF/β-連環(huán)蛋白信號、降低的EphB2受體的表達(dá)，并且其由化合物D所介導(dǎo)的β-連環(huán)蛋白/CBP相互作用的抑制所修正。
實施例9化合物D引起G1/S-階段敗育并且激活胱天蛋白酶的活性流式細(xì)胞儀分析(FACS)為進(jìn)行FACS分析，將大約5×106個用化合物D處理過的或者用載體處理過的細(xì)胞用70％的冷乙醇固定，并且在-20℃下存貯至少30分鐘。這些細(xì)胞用1×PBS清洗一次，并且用碘化丙錠(PI)溶液(85μg/ml碘化丙錠，0.1％乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P-40)，10mg/mlRNAse)在室溫下培育30分鐘。使用Beckman Coulter EPICS XL-MCL流式細(xì)胞儀為每一個樣品獲取10,000個染色細(xì)胞，并且通過Expo32ADC軟件(Coulter Corporation，Miami，F(xiàn)lorida，33195)測定細(xì)胞周期的不同階段中細(xì)胞的百分比。。
胱天蛋白酶-3活性檢驗在處理前24小時將SW480，HCT116和CCD18Co細(xì)胞以每孔105個細(xì)胞(96-孔板)涂覆。向每個孔中加入25μM的化合物D或者對照(0.5％DMSO)。處理后24小時，將細(xì)胞溶解，并且使用胱天蛋白酶-3/7活性試劑盒(Apo-One均相胱天蛋白酶-3/7檢驗，#G77905，Promega)。通過由實驗測量值減去空白(對照，無細(xì)胞)的單位值獲得相對熒光單位(RFU)。
化合物D引起G1/S-階段敗育并且激活胱天蛋白酶的活性已經(jīng)顯示了對細(xì)胞周期蛋白D1基因表達(dá)的抑制，在細(xì)胞周期的G1/S-階段引起敗育(Shintani等，“Infrequent alternations of RB Pathway(Rb-p 161INK4A-cyclin D1)in adenoid cystic carcinoma of salivaryglands”，Anticancer Res.202169-75(2000))。HCT116(圖7A，上部的一系列)和SW 480(圖7A，下部的一系列)細(xì)胞用化合物D(25μM)(圖7A，右)或?qū)φ?0.5％DMSO)(圖7A，左)處理24小時。隨后用碘化丙錠(PI)將細(xì)胞染色，并且通過FACS細(xì)胞熒光光度術(shù)分析DNA含量。如所預(yù)期的，對照細(xì)胞，(圖7A，左)具有正常的周期，然而用化合物D處理過的細(xì)胞(圖7A，右)在細(xì)胞周期的G1/S-階段顯示出提高的積累。因此，可以看出化合物D在G1階段引起了細(xì)胞的敗育。
胱天蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶類，其通常在通過編程性細(xì)胞死亡刺激觸發(fā)的細(xì)胞的給定種群中被激活。為評價SW480，HCT116和野生型colonocyte(CCD18Co細(xì)胞)，將細(xì)胞用化合物D(25μM)或者對照(0.5％DMSO)處理24小時，隨后檢驗胱天蛋白酶-3/7的活性。如圖7B所示，與CCD18Co細(xì)胞相比，在SW480和HCT116細(xì)胞中，化合物D特異地并且顯著地激活了胱天蛋白酶-3/7通道。
實施例10化合物D減少了轉(zhuǎn)化的結(jié)腸細(xì)胞的增殖軟瓊脂檢驗軟瓊脂菌落形成檢驗是用SW480細(xì)胞通過具有某些修改的前述程序而進(jìn)行的(Moody等，“A vasoactive intestinal peptide antagonistinhibits non-small cell lung cancer growth”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.904345-49(1993))。
6-孔板(Nalge Nunc International，Roskide，Denmark)的每一個孔(35mm)用1ml在含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中的0.8％的底部瓊脂(bottom agar)涂覆。在其固化后，將含有0.4％頂部瓊脂(top agar)、10％胎牛血清、濃縮兩倍的化合物和5,000個單個的活細(xì)胞的1ml DMEM培養(yǎng)基加入到每個孔中。在37℃下在加濕的5％CO2培養(yǎng)箱中對菌種進(jìn)行培育。每天監(jiān)控軟瓊脂中的菌落，并且在培育8天后拍照。計算出直徑大于60μM的菌落數(shù)。
化合物D減少了轉(zhuǎn)化的結(jié)腸細(xì)胞的增殖軟瓊脂菌落形成檢驗是使用經(jīng)化合物D(0.25-5μM)和5-氟尿嘧啶(5-FU)(0.5-32μM)處理過的SW480細(xì)胞來進(jìn)行的。如圖8A所示，化合物D顯示出在菌落形成的數(shù)目中劑量相關(guān)的減少。化合物D和5-FU的IC50值分別為0.87±0.11μM和1.98±0.17μM。因此，化合物D提高了胱天蛋白酶的活性，并且減少了結(jié)腸細(xì)胞在體外的生長，該細(xì)胞是由激活了β-連環(huán)蛋白信號的突變所轉(zhuǎn)化的。
實施例11化合物C降低了裸鼠模型中腫瘤的生長在第0天的時候，將SW620細(xì)胞(9×106個細(xì)胞/鼠)皮下移植到裸鼠上。從第1天開始，小鼠每隔1天接受300mg/kg化合物C的腹腔內(nèi)注射，4次后，每隔1天接受200mg/kg化合物C的腹腔內(nèi)注射，直到第21天。與載體對照小鼠(圖9A)相比，化合物C減少了治療過的小鼠中腫瘤的生長，并且與那些載體對照小鼠(圖9B)相比，輕微地降低了受治療的小鼠的體重。
實施例12化合物D抑制了存活蛋白的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個層次上研究了化合物D對存活蛋白表達(dá)的效果。在轉(zhuǎn)錄層次上使用的方法包括cDNA微陣列分析、RT-PCR、存活蛋白報道基因檢驗和染色質(zhì)免疫沉淀法(ChIP)。翻譯層次上所使用的方法包括蛋白質(zhì)印跡分析法和免疫化學(xué)。
在存活蛋白啟動子控制下的含熒光素酶的質(zhì)粒，被構(gòu)造并且轉(zhuǎn)染為野生型、CBP+/-或者p300+/-3T3細(xì)胞。結(jié)果(圖10)顯示W(wǎng)nt1在三種類型的細(xì)胞中均激發(fā)了存活蛋白基因的表達(dá)，然而化合物D減少了存活蛋白基因的表達(dá)，并且減少了在那些細(xì)胞中Wnt1對存活蛋白基因表達(dá)的激發(fā)。類似地，化合物D及其類似物(化合物A)顯示出抑制SW480細(xì)胞中存活蛋白的表達(dá)(圖11)。
實時逆轉(zhuǎn)錄-PCR分析是根據(jù)由SYBR Green PCR Master Mix Kit(Perkin Elmer Biosystems，Shelton，ST)所提供的規(guī)約來進(jìn)行的。用RNeasy Midi Kit(Qiagen)從用化合物D(25μM)或?qū)φ?0.5％DMSO)處理過24小時的細(xì)胞中，提取RT-PCR反應(yīng)的總RNA樣板。RT-PCR反應(yīng)所使用的引物是5’-AGCCCTTTCTCAAGGACCAC-3’和5’-GCACTTTCTTCGCAGTTTCC-3’。表8顯示了分析的結(jié)果。小于0.5的比率表明，由于化合物D的處理，基因表達(dá)有了顯著的降低，而大于1.5的比率表明，基因表達(dá)有了顯著的提高。如表8和圖12所示，與對照相比，在化合物D的存在下，存活蛋白基因的表達(dá)有了顯著地降低。
表8有和無化合物D時的基因表達(dá)

對用化合物D(25μM)或?qū)φ?0.5％DMSO)處理過的SW 480細(xì)胞進(jìn)行ChIP檢驗。如圖13所示，存活蛋白啟動子是通過對照處理細(xì)胞中的CBP、β-連環(huán)蛋白、Tcf4和乙?；M蛋白而發(fā)生的。用化合物D進(jìn)行處理降低了所有這些蛋白質(zhì)與存活蛋白啟動子的關(guān)聯(lián)。
為了表征化合物D在翻譯層次上對存活蛋白表達(dá)的效果，使用存活蛋白6E4單克隆抗體(Cell Signaling Technolgy)對單獨用載體(0.5％DMSO)、10μM或25μM的化合物D或者5μM 5-FU處理過的細(xì)胞的提取物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。結(jié)果(圖14A)顯示，用兩種濃度的化合物D進(jìn)行處理和用5-FU進(jìn)行處理減少了存活蛋白的量。用兩種濃度的化合物D進(jìn)行處理在降低存活蛋白表達(dá)方面比用5-FU進(jìn)行處理更有效，并且用濃度較高(即，25μM)的化合物D進(jìn)行處理最有效。
使用免疫熒光顯微鏡檢查來進(jìn)一步表征化合物D在翻譯層次上對存活蛋白表達(dá)的效果。在不存在化合物D的情況下，存活蛋白局限于有絲分裂紡錘體，與染色體分離涉及存活蛋白的觀念相符(圖14B)。在用化合物D處理后在SW480細(xì)胞中未觀察到該表達(dá)模式，而幾乎沒有或無存活蛋白被檢測到(圖14C)。
實施例13各種化合物對存活蛋白和TCF4表達(dá)的效果表征了具有通式(I)的各種化合物對存活蛋白和TCF4表達(dá)的效果。結(jié)果如表9所示。
表9.化合物對存活蛋白和TCF4表達(dá)的效果






實施例14化合物D經(jīng)由對存活蛋白表達(dá)的抑制促進(jìn)了編程性細(xì)胞死亡為確定化合物D對編程性細(xì)胞死亡的效果以及存活蛋白在這種效果中的作用，測量了胱天蛋白酶2和3在用化合物D或?qū)φ仗幚磉^的培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中的活性。結(jié)果(圖15)顯示，(1)化合物D(2.5μM或5.0μM)激活了胱天蛋白酶3的活性，但是未激活胱天蛋白酶2的活性；(2)星形孢菌素(0.5μM)同時提高了胱天蛋白酶2和胱天蛋白酶3的活性；(3)用星形孢菌素和化合物D的共同處理產(chǎn)生了胱天蛋白酶3活性的協(xié)同刺激，但是未產(chǎn)生胱天蛋白酶2活性的協(xié)同刺激；以及(4)存活蛋白基因的轉(zhuǎn)染降低了由星形孢菌素或化合物D的處理所誘導(dǎo)的胱天蛋白酶3活性的激活，和由星形孢菌素和化合物D的共同處理所誘導(dǎo)的胱天蛋白酶3活性的協(xié)同刺激。以上結(jié)果顯示，化合物D經(jīng)由對存活蛋白基因表達(dá)的抑制刺激了胱天蛋白酶3的活性。
通過測量用星形孢菌素(0.5μM)、化合物D(5.0μM)或這二者處理過的培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞死亡，來進(jìn)一步表特化合物D對編程性細(xì)胞死亡的效果和存活蛋白在這種效果中的作用。結(jié)果(圖16)顯示，化合物D和星形孢菌素二者均促進(jìn)了細(xì)胞死亡，并且存活蛋白基因的轉(zhuǎn)染降低了用星形孢菌素、化合物D、或這二者進(jìn)行處理所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的上升。以上結(jié)果顯示，化合物D經(jīng)由對存活蛋白基因表達(dá)的抑制促進(jìn)了編程性細(xì)胞死亡。
為確定化合物D在細(xì)胞周期中的效果和存活蛋白在這種效果中的作用，對經(jīng)過或未經(jīng)過含有存活蛋白基因的構(gòu)造的轉(zhuǎn)染并且用星形孢菌素(0.5μM)、化合物D(5μM)、或者這二者進(jìn)一步處理的培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行FACS分析。結(jié)果(圖17)顯示，星形孢菌素和化合物D二者均在G0中提高了細(xì)胞的數(shù)目，并且細(xì)胞中存活蛋白的超量表達(dá)降低了用星形孢菌素、化合物D、或這二者進(jìn)行處理的效果。這些結(jié)果顯示，化合物D在細(xì)胞周期中的效果可能至少部分經(jīng)由對存活蛋白基因表達(dá)的抑制。
將意識到，盡管為說明的目的在本文中對本發(fā)明的具體實施方式
進(jìn)行了說明，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出各種修改。因此，本發(fā)明除受所附權(quán)利要求限制外，不受其它限制。
本說明書所引用的和/或本申請數(shù)據(jù)表所列出的所有以上美國專利、美國專利申請公開、美國專利申請、外國專利、外國專利申請和非專利文獻(xiàn)，包括2002年3月1日提交的美國專利申請序列號第10/087,443號，和2001年10月12日提交的美國專利申請序列號第09/976,470號，均并入本文作為參考。
由前述內(nèi)容可以意識到，盡管為說明的目的在本文中對本發(fā)明的具體實施方式
進(jìn)行了說明，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出各種修改。因此，本發(fā)明除受所附權(quán)利要求限制外，不受其它限制。
權(quán)利要求
1.一種具有以下通式(I)的化合物 其中A是-(CHR3)-或-(C＝O)-，B是-(CHR4)-、-(C＝O)-，D是-(CHR5)-或-(C＝O)-，E是-(ZR6)-、-(C＝O)-，G是-(XR7)n-、-(CHR7)-(NR8)-、-(C＝O)-(XR9)-或-(C＝O)-，W是-Y(C＝O)-、-(C＝O)NH-、-(SO2)-或空缺，Y是氧、硫或-NH-，X和Z獨立地是氮或CH，n＝0或1；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9是相同或不同的，并且獨立地選自氨基酸側(cè)鏈部分或其衍生物、分子殘余部分、連接基和固體載體、及其立體異構(gòu)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9獨立地選自氨基C2-5烷基、胍基C2-5烷基、C1-4烷基胍基C2-5烷基、二C1-4烷基胍基-C2-5烷基、脒基C2-5烷基、C1-4烷基脒基C2-5烷基、二C1-4烷基脒基C2-5烷基、C1-3烷氧基、苯基、取代苯基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、芐基、取代芐基(其中芐基上的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、萘基、取代萘基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、雙苯基甲基、取代雙苯基甲基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、吡啶基、取代吡啶基(其中取代基獨立地選自一個或多個氨基脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基或羥基)、吡啶基C1-4烷基、取代吡啶基C1-4烷基(其中吡啶的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、嘧啶基C1-4烷基、取代嘧啶基C1-4烷基(其中嘧啶的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基或硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、三嗪-2-基-C1-4烷基、取代三嗪-2-基-C1-4烷基(其中三嗪的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、咪唑并C1-4烷基、取代咪唑并C1-4烷基(其中咪唑的取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；蛄u基)、咪唑啉基C1-4烷基、N-脒基哌嗪基-N-C0-4烷基、羥基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、羥基C2-5烷基、C1-5烷基氨基C2-5烷基、C1-5二烷基氨基C2-5烷基、N-脒基哌啶基C1-4烷基和4-氨基環(huán)己基C0-2烷基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中A是-(CHR3)-，B是-(C＝O)-，D是-(CHR5)-，E是-(C＝O)-，G是-(XR7)n-，并且所述化合物具有以下通式(II) 其中R1、R2、R3、R5、R7、W、X和n如權(quán)利要求1所定義。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中A是-(C＝O)-，B是-(CHR4)-，D是-(C＝O)-，E是-(ZR6)-，G是-(C＝O)-(XR9)-，并且所述化合物具有以下通式(III) 其中R1、R2、R6、R6、R9、W和X如權(quán)利要求1所定義，Z是氮或CH(當(dāng)Z是CH時，則X是氮)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中A是-(C＝O)-，B是-(CHR4)-，D是-(C＝O)-，E是-(ZR6)-，G是(XR7)n-，并且所述化合物具有以下通式(IV) 其中R1、R2、R6、R6、R7、W、X和n如權(quán)利要求1所定義，并且Z是氮或CH，條件是當(dāng)Z為氮時，則n為0，并且當(dāng)Z為CH時，則X為氮并且n不為0。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物，其中所述化合物具有以下通式(VI) 其中Ra是苯基；帶有一個或多個取代基的取代苯基，其中所述的一個或多個取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；土u基；芐基；帶有一個或多個取代基的取代芐基，其中所述的一個或多個取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；土u基；或者具有8至11個環(huán)原子的二環(huán)芳基，其可以具有1至3個選自氮、氧或硫的雜原子；Rb是具有5至7個環(huán)原子的單環(huán)芳基，其具有1至2個選自氮、氧或硫的雜原子，并且所述化合物的芳環(huán)可以具有一個或多個選自鹵素、羥基、氰基、低級烷基和低級烷氧基的取代基；Rc是飽和或不飽和的C1-6烷基、C1-6烷氧基、全氟C1-6烷基基團(tuán)；并且X1、X2和X3可以相同或不同，并且獨立地選自氫、羥基和鹵素。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的化合物，其中Ra是苯基；帶有一個或多個取代基的取代苯基，其中所述的一個或多個取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺酰基和羥基；芐基；帶有一個或多個取代基的取代芐基，其中所述的一個或多個取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；土u基；萘基；喹啉基；或者異喹啉基；并且Rb是苯基、吡啶基或哌啶基，其均可以被一個或多個選自鹵素、羥基、氰基、低級烷基和低級烷氧基的取代基所取代。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的化合物，其中Ra是苯基；帶有一個或多個取代基的取代苯基，其中所述的一個或多個取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；土u基；芐基；帶有一個或多個取代基的取代芐基，其中所述的一個或多個取代基獨立地選自一個或多個氨基、脒基、胍基、肼基、amidazonyl、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-3烷氧基、硝基、羧基、氰基、磺?；土u基；或萘基；并且Rb是苯基，其可以被一個或多個選自鹵素、羥基、氰基、低級烷基和低級烷氧基的取代基所取代。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8或R9連接到固體載體或固體載體衍生物上。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8或R9連接到固體載體或固體載體衍生物上。
11.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8或R9連接到固體載體或固體載體衍生物上。
12.一種藥學(xué)組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項所述的化合物和藥學(xué)可接受的載體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥學(xué)組合物，所述組合物含有安全和有效量的所述化合物。
14.一種化合物庫，其包括至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項所述的化合物。
15.一種識別生物活性化合物的方法，其包括使權(quán)利要求14所述的庫與靶相接觸，以檢測或篩選所述的生物活性化合物。
16.一種用于進(jìn)行結(jié)合檢驗的方法，包括a)提供含有第一共激活劑和相互作用蛋白的組合物，所述第一共激活劑含有結(jié)合基序LXXLL、LXXLI或FXXFF，其中X是任意氨基酸；b)使所述第一共激活劑和所述相互作用蛋白與測試化合物結(jié)合；以及c)在所述化合物的存在下，檢測第一共激活劑與相互作用蛋白之間的結(jié)合的改變；其中所述測試化合物選自權(quán)利要求1至8中任意一項所述的化合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述相互作用蛋白是轉(zhuǎn)錄因子或第二共激活劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述相互作用蛋白選自RIP140；SRC-1(NCoA-1)；TIF2(GRIP-1；SRC-2)；p(CIP；RAC3；ACTR；AIB-1；TRAM-1；SRC-3)；CBP(p300)；TRAPs(DRIPs)；PGC-1；CARM-1；PRIP(ASC-2；AIB3；RAP250；NRC)；GT-198；和SHARP(CoAA；p68；p72)。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述相互作用蛋白選自TAL1；p73；MDm2；TBP；HIF-1；Ets-1；RXR；p65；AP-1；Pit-1；HNF-4；Stat2；HPV E2；BRCA1；p45(NF-E2)；c-Jun；c-myb；Tax；Sap 1；YY1；SREBP；ATF-1；ATF-4；Cubitus；Interruptus；Gli3；MRF；AFT-2；JMY；dMad；PyLT；HPV E6；CITTA；Tat；SF-1；E2F；junB；RNA解旋酶A；C/EBPβ；GATA-1；Neuro D；Microphthalimia；E1A；TFIIB；p53；P/CAF；Twist；Myo D；pp9O RSK；c-Fos；和SV40Large T。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述相互作用蛋白選自ERAP140；RIP140；RIP160；Trip1；SWI1(SNF)；ARA70；RAP46；TIF1；TIF2；GRIP1和TRAP。
21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述相互作用蛋白選自VP16；VP64；p300；CBP；PCAF；SRC1 PVALF；AtHD2A；ERF-2；OsGAI；HALF-1；C1；AP-1；ARF-5；ARF-6；ARF-7；ARF-8；CPRF1；CPRF4；MYC-RP/GP和TRAB1。
22.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述第一共激活劑是CBP或p300。
23.一種用于抑制腫瘤生長的方法，包括對帶有腫瘤的哺乳動物個體施予抑制所述哺乳動物個體中所述腫瘤生長有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項所述的化合物，或根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的組合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的腫瘤是癌性的。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的腫瘤是結(jié)腸癌。
26.一種治療或預(yù)防癌癥的方法，包括根據(jù)需要對個體施予治療或預(yù)防所述癌癥有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項所述的化合物，或者根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的組合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的癌癥是結(jié)腸癌。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的化合物或組合物與抗腫瘤劑結(jié)合給藥。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述的抗腫瘤劑選自5-FU、紫杉醇、順鉑、絲裂霉素C、喃氟啶、雷替曲塞、卡培他濱、和伊立替康。
30.一種治療或預(yù)防與血管成形術(shù)有關(guān)的再狹窄的方法，包括根據(jù)需要對個體施予一定量的根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項所述的化合物，或者根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述的量對預(yù)防所述再狹窄是有效的。
31.一種治療或預(yù)防多囊腎疾病的方法，包括根據(jù)需要對個體施予一定量的根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項所述的化合物，或者根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述的量對治療所述多囊腎疾病是有效的。
32.一種治療或預(yù)防異常血管生成病的方法，包括根據(jù)需要對個體施予一定量的根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項所述的化合物，或者根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述的量對治療所述異常血管生成病是有效的。
33.一種治療或預(yù)防風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病的方法，包括根據(jù)需要對個體施予一定量的根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項所述的化合物，或者根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述的量對治療所述風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病是有效的。
34.一種治療或預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎的方法，包括根據(jù)需要對個體施予一定量的根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項所述的化合物，或者根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述的量對治療所述潰瘍性結(jié)腸炎是有效的。
35.一種治療或預(yù)防結(jié)節(jié)性硬化癥(TSC)的方法，包括根據(jù)需要對個體施予一定量的根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項所述的化合物，或者根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述的量對治療或預(yù)防TSC是有效的。
36.一種治療或預(yù)防與KSHV相關(guān)的腫瘤的方法，包括根據(jù)需要對個體施予一定量的根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項所述的化合物，或者根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述的量對治療或預(yù)防所述與KSHV相關(guān)的腫瘤是有效的。
37.一種用于調(diào)節(jié)毛發(fā)生長的方法，包括根據(jù)需要對個體施予一定量的根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項所述的化合物，或者根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述的量對調(diào)節(jié)所述個體的毛發(fā)生長是有效的。
38.一種治療或預(yù)防阿爾茨海默式癥的方法，包括根據(jù)需要對個體施予一定量的根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項所述的化合物，或者根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述的量對治療或預(yù)防阿爾茨海默式癥是有效的。
39.一種用于促進(jìn)神經(jīng)突生長的方法，包括使神經(jīng)元與促進(jìn)神經(jīng)突生長有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項所述的化合物，或者根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的組合物相接觸。
40.一種用于促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法，包括使神經(jīng)干細(xì)胞與一定量的根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項所述的化合物，或者根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的組合物相接觸，其中所述的量對促進(jìn)所述神經(jīng)干細(xì)胞分化是有效的。
41.一種用于促進(jìn)癌細(xì)胞中編程性細(xì)胞死亡的方法，包括使癌細(xì)胞與促進(jìn)所述癌細(xì)胞中編程性細(xì)胞死亡有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項所述的化合物，或者根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的組合物相接觸。
42.一種用于抑制細(xì)胞中存活蛋白表達(dá)的方法，包括使存活蛋白表達(dá)的細(xì)胞與抑制存活蛋白表達(dá)有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項所述的化合物，或者根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的組合物相接觸。
全文摘要
本發(fā)明公開了結(jié)構(gòu)受限制的化合物，其模仿生物活性肽和蛋白質(zhì)回折區(qū)的二級結(jié)構(gòu)。這種回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)可用于寬范圍的領(lǐng)域，包括用作診斷劑和治療劑。本發(fā)明還公開了含有本發(fā)明的回折擬態(tài)結(jié)構(gòu)的庫，以及用于對該庫進(jìn)行篩選以便識別生物活性成員的方法。本發(fā)明還涉及使用這些化合物來抑制或治療受Wnt－信號通道調(diào)節(jié)的病癥，例如癌癥，尤其是結(jié)腸癌；與血管成形術(shù)有關(guān)的再狹窄；多囊腎疾??；異常血管生成?。伙L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎??；結(jié)節(jié)性硬化癥；阿爾茨海默式癥；毛發(fā)生長過?；蛎摪l(fā)；或者潰瘍性結(jié)腸炎。
文檔編號A61P9/08GK1798746SQ200480015057
公開日2006年7月5日 申請日期2004年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月9日
發(fā)明者文圣煥, 鄭宰旭, 李承燦, M·埃奇, M·卡恩, 鄭光遠(yuǎn), C·恩因 申請人:(株)中外制藥