專利名稱：含NF－κB誘餌的用于治療和預防呼吸疾病的藥物組合物及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及組合物及其使用方法，所述組合物包含與轉錄調節(jié)因子尤其是NF-κB的染色體結合位點特異性結合的化合物(如核酸及其同源物)。更具體的，本發(fā)明涉及含NF-κB誘餌(decoy)化合物的組合物及其使用方法。
具體而言，本發(fā)明提供治療、改善和預防氣道炎性疾病、氣道狹窄或鼻腔炎性疾病的組合物及其具有顯著效果的使用方法，具體的，例如，根本性治療、改善和預防哮喘或鼻炎的組合物。
背景技術：
1993年3月，WHO(世界衛(wèi)生組織)報告了“事實上全球哮喘發(fā)病率正在增加”，并公布了他們的發(fā)現(xiàn)在世界55億人口中間哮喘患者超過1億(“Internationalguidance towards asthma control-global strategy for asthma control and prevention，NHLBI/WHO Workshop Report”ed.Sohei MAKINO，Kokusai Igaku Shuppan(International Medical Publishers，Inc.)1995)。特別是哮喘在小兒中的發(fā)病率正在增加。
在日本，小兒哮喘增加的趨勢明顯，根據(jù)文部省(Ministry of Education)的學校保健調查，小兒哮喘發(fā)病率最高是在1994年，與1975-1984年期間相比已經增加2-4倍。
厚生省(Ministry of Health and Welfare)于1993年10月公布日本總計有1,066,000人患哮喘(男性586,000；女性480,000)，據(jù)此統(tǒng)計數(shù)字計算人口中0.9％患有哮喘。
而且根據(jù)調查方法在日本有2-3百萬哮喘患者(人口的約2-3％)，并且每年因哮喘死亡的人數(shù)估計是約6,000-7,000。
如此，日本和其它地方的當前趨勢是與哮喘相關的發(fā)病率增加。而且，與哮喘相關的死亡率也微降低；哮喘導致死亡的風險高，尤其是對于難治的哮喘。
氣道粘膜炎癥在支氣管哮喘病理中起重要作用。
也就是說，一旦氣道粘膜接受變應原刺激，炎癥細胞如肥大細胞或嗜酸性粒細胞就產生各種細胞因子、組織毒性蛋白等。由此，細胞的炎性刺激引起受炎性刺激而激活的轉錄因子如NF-κB和AP-1激活，從而增強各種基因的表達，如各種細胞因子的表達。
炎性因子如細胞因子負責介導免疫系統(tǒng)細胞之間的相互作用，并在對變應原或微生物的免疫應答中起重要作用。
然而，由這些因子介導的過度的變態(tài)反應或炎癥導致支氣管哮喘、氣道狹窄等患者的不利現(xiàn)象，如哮喘發(fā)作。
肥大細胞和嗜酸性粒細胞的表面膜上攜帶細胞因子受體。一旦其它細胞或其自身產生的細胞因子與這些受體結合，信號就經細胞內信號傳遞傳入細胞核而促進各種基因轉錄，從而基于轉錄產生新細胞因子、趨化因子和細胞粘附分子。
在此情況下，轉錄因子在調節(jié)核中遺傳信息的轉錄活性方面起重要作用。氣道炎癥中重要的轉錄因子包括NF-κB、AP-1、NF-AT(活化T細胞的核因子)，尤其是NF-κB起關鍵作用。
對NF-κB促進轉錄反應而產生的因子包括各種因子如炎性細胞因子、趨化因子、細胞毒性蛋白、細胞粘附分子、免疫系統(tǒng)相關的細胞膜受體等。
迄今為止，已經報道在人肥大細胞(MC)中，IgE依賴的NF-κB被炎性抗體刺激激活，TNF-α(腫瘤壞死因子α)被認為促進NF-κB活化。而且，已知在嗜酸性粒細胞中GM-CSF(粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)對NF-κB活化重要(J.Immunol.，169(9)，5287-93，2002)。
氣道中的TNF-α有與IL-1相似的生物學作用，并與氣道炎癥和氣道中過度反應相關。此外，受IL-1或IL-4激活在氣道上皮和內皮中表達的粘附分子尤其是VCAM-1導致嗜酸性粒細胞浸潤入氣道，并參與氣道中的過度反應。動物試驗中施用抗ICAM-1抗體抑制嗜酸性粒細胞浸潤和氣道反應性。
傳統(tǒng)哮喘治療主要是針對炎癥控制，并可按以下分類連續(xù)使用用于長期控制的長期控制劑(控制劑)，和用于短期治療哮喘發(fā)作的發(fā)作治療劑(緩解劑)。
具體的，吸入性類固醇、抗變態(tài)反應劑、持續(xù)釋放性茶堿等已經被用作控制劑，而吸入性β2受體激動劑、氨茶堿、口服或靜脈注射的類固醇等已經被用作緩解劑。
然而，盡管緩解劑的發(fā)作緩解作用，使用傳統(tǒng)控制劑治療不能達到足夠效果，因為如上所述，哮喘發(fā)病率增加，哮喘死亡率仍沒有降低。
因此，對哮喘治療的研究最近已經從這些傳統(tǒng)癥狀治療轉向抑制氣道炎癥。
代表性轉錄因子NF-κB是由p65和p50異二聚體組成的轉錄調節(jié)因子。NF-κB典型位于細胞漿中，在此與其抑制因子IκB結合從而使NF-κB的核轉位受阻。然而，當施加刺激如細胞因子、缺血、再灌注等時，IκB因磷酸化而被降解。結果導致NF-κB被活化并轉位進入核。在核中，NF-κB結合到染色體上的NF-κB結合位點，并促進其下游基因轉錄。位于NF-κB結合位點下游的很多基因是已知的，如炎性細胞因子(如IL-1、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子α(TNFα)等)和粘附分子(例如(如VCAM-1、ICAM-1等)。
盡管有許多患者，支氣管哮喘、變應性哮喘、小兒哮喘等是難于根治的疾病，而長期以來一直期待這種根治。現(xiàn)在的治療主要基于癥狀治療，并且主要是施用支氣管擴張劑如茶堿等。然而，這些癥狀治療僅能在發(fā)作后開始，因此完全抑制患者癥狀是不可能的，并且根治也是不可能的。因此，提供根本性治療的療法已經被長期期待。
除了感冒中常見的癥狀如鼻塞、鼻涕、噴嚏等以外，鼻炎有多種癥狀，各種癥狀如鼻出血、嗅覺和味覺減退、頭痛、注意力缺乏等。
根據(jù)誘因/誘發(fā)性物質或臨床癥狀，將鼻炎分成以下幾類變應性鼻炎、花粉病、急性鼻炎、慢性鼻炎、肥大性鼻炎、慢性竇炎(積膿癥)和鼻中隔偏移等。
作為代表性鼻炎，變應性鼻炎由吸入吸入性抗原如塵、塵螨、花粉等引起，導致鼻部癥狀如噴嚏、鼻涕和鼻塞等。剛吸入抗原性物質時沒有癥狀。然而在開始吸入這種抗原以后，體內的抗體量逐漸增加，當抗體效價超過某一水平并且這種抗原性物質被吸入時，就出現(xiàn)癥狀。
基本上認為其病理是變應性炎癥(Rhinology，41(2)，80-6，2003)。
日本柳杉(Cryptomeria japonica)所致花粉病的患者數(shù)在日本一直在增加，現(xiàn)在認為已經達到一千五百萬人。特別是日本大都市地區(qū)，據(jù)說有五分之一的人有花粉病。這里的原因被認為是(1)日本柳杉花粉分散量增加；(2)柴油機尾氣對空氣的污染促進IgE抗體產生。
(3)壓力增加促進變態(tài)反應。
(4)由于西方化飲食習慣促進IgE抗體產生。
(5)寄生蟲感染降低。
如本文所用，術語“變應性鼻炎”表示引起鼻腔粘膜抗特異性物質反應的鼻炎，可能與噴嚏、鼻涕和鼻塞這三種主要癥狀相關，可能還與其它癥狀如眼部搔癢、眼部充血和系統(tǒng)性癥狀如缺乏食欲和疲勞相關。
引起變態(tài)反應的物質(變應原)包括花粉(日本柳杉、日本扁柏(Chamaecyparisobtusa)等)、豚草、塵螨、居室塵、寵物毛等，這些可以分成季節(jié)性變應原(如春季的日本柳杉花粉)和全年性變應原。
已經提出治療鼻炎的各種方法。然而迄今，只有去除變應原或癥狀治療可用，并且很多這些癥狀治療有副作用。
此外，慢性阻塞性肺病(COPD)為全球死因的第四大原因。然而，有很多患者在變嚴重之前沒有意識到它，因此它已成為21世紀最嚴重的健康問題之一。在美國，COPD死亡率隨年齡增加，并且根據(jù)年齡層劃分，在45歲或更高年齡中是排在第四或五位的死亡原因。在1965-1998年期間，盡管其它疾病死亡率降低，COPD死亡率已顯著增加，因此強烈需要根本性解決方案。
近年COPD患者數(shù)一直在增加，因而預期在未來將進一步增加。如今沒有COPD的根本性治療，并且社會保險對與COPD相關的醫(yī)療支出也大。COPD是氣流不可逆限制的發(fā)病狀態(tài)。氣流限制通常是進行性的，并且根據(jù)吸入有毒氣體的量或類型而程度不同。氣流限制是由肺實質破壞引起，而所述肺實質破壞是由對吸入氣體的反應而由周圍氣道中炎癥反應引起。WHO和世界銀行(World Bank)于1990年進行了一項調查，其中報告其全球死亡率是9.34/千人(男性)和7.33/千人(女性)。如今COPD正在增加，并且是1990年排到第六位的死亡誘因，預期到2020年將上升到第三位。在日本如今有約50,000名患者由于該疾病而在家接受氧療。根據(jù)厚生省1996年公布的統(tǒng)計數(shù)字，患者數(shù)是220,000。然而，根據(jù)肺病流行病學調查協(xié)會(haishikkanekigaku chosa kenkyukai)公布的統(tǒng)計數(shù)字，日本COPD患者數(shù)估計是5,300,000。此外，40歲或更高年齡中COPD發(fā)病率是8.5％，這與全球發(fā)病率相當。迄今為止，認為日本有少數(shù)患者，然而，有很多仍未被診斷的患者，因此以實際患者數(shù)來看對于COPD的根本性治療有日益增加的需要。
COPD是呼吸過程中作為空氣通路的“氣道”受到破壞并因而呼吸功能逐漸降低的一種疾病。以前稱“肺氣腫”和“慢性支氣管炎”的疾病現(xiàn)在統(tǒng)稱為COPD。
COPD從正常癥狀開始，并逐漸發(fā)展，并因而被認為是“與生活方式相關的肺病”，其中當患者接受診斷時，他/她已經處于嚴重狀態(tài)。COPD是這樣一種疾病，其中由于嚴重狀態(tài)的呼吸困難而導致患者運動受限制，并將發(fā)生系統(tǒng)性障礙，這是極其嚴重的疾病。因此，從改善癥狀的角度講，非常需要對其的治療。
當前COPD治療僅包括癥狀治療和改善生活方式，它們是被動方法，因而沒有積極方法或根本性治療。例如，建議放棄有高COPD風險的生活習慣，如吸煙。此外，也在使用促進呼吸的藥物治療、康復、氧療等，它們都是對癥治療。預防支氣管感染的接種和并發(fā)癥治療等也在使用。對于最嚴重患者，當所有條件都被滿足時也可考慮手術治療。然而不能說這種手術治療令人滿意得改善癥狀。
如此，現(xiàn)如今沒有有效的CIPD治療，并且如今沒有方法延緩疾病進程。如上所述，迄今為止，現(xiàn)在使用的療法只是對癥治療，如吸氧、外部主動換氣等。如上所述，必要時手術切除病變的肺組織。然而有很多報告說明上述治療不提供COPD的長期預后改善。而且，施用藥劑如支氣管擴張劑、祛痰劑等的作用是有限的。
專利文獻1(WO 03/105780)和專利文獻2(US 6303582)公開了生產核酸微顆粒的技術。然而，所述文獻沒有描述小核酸如誘餌是否能被生產為微顆粒而仍然具有對抗炎性疾病的功能。
本發(fā)明的目的是提供組合物及其用途，適用于治療由受NF-κB調節(jié)的基因表達引起的呼吸系統(tǒng)疾病，如包括氣道炎性疾病、氣道狹窄或鼻腔炎性疾病的疾病、障礙和/或病癥。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供含NF-κB誘餌作為主要成分的組合物，用于治療和/或預防由受NF-κB調節(jié)的基因表達引起的呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥，以及使用所述組合物治療和/或預防所述疾病的方法。
發(fā)明人已經發(fā)現(xiàn)，施用NF-κB誘餌可以有效治療和/或預防由受NF-κB調節(jié)的基因表達或由嗜酸性粒細胞和/或嗜中性粒細胞異常引起的呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥，從而實現(xiàn)了本發(fā)明。
本發(fā)明涉及用于治療和預防由受NF-κB調節(jié)的基因表達引起的疾病、障礙和/或病癥的藥物組合物。所述組合物包含NF-κB誘餌、其衍生物、變體或片段以及藥學上可接受的載體，并且其衍生物、變體或片段是具有生物活性的誘餌。
本發(fā)明也涉及用于治療和/或預防與嗜酸性粒細胞異常相關的呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥的藥物組合物，包含誘餌和藥學上可接受的載體。
優(yōu)選的，所述疾病是COPD、哮喘或鼻炎。
優(yōu)選的，所述疾病是與嗜酸性粒細胞異常相關的疾病。這種與嗜酸性粒細胞異常相關的疾病例如包括哮喘，如支氣管哮喘、小兒哮喘、變應性哮喘、特應性哮喘、類固醇抵抗型哮喘(SRA)、非變應性哮喘(內因性哮喘、外因性哮喘如阿司匹林哮喘、心臟性哮喘和感染性哮喘)；和其它嗜酸性粒細胞異常，如鼻炎、變應性疾病等。
優(yōu)選的，所述藥學上可接受的載體是親水聚合物、不溶性脂質體、碳水化合物或不溶性添加劑。
優(yōu)選的，所述藥學上可接受的載體是選自脂質體、乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇和木糖醇的一種或多種。
優(yōu)選的，所述NF-κB誘餌是SEQ ID NO1中列出的誘餌。
優(yōu)選的，所述呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥是氣道炎性疾病、氣道狹窄或鼻腔炎性疾病。
優(yōu)選的，所述呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥是COPD、哮喘或鼻炎。
優(yōu)選的，所述呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥是COPD。
優(yōu)選的，所述呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥是哮喘。
優(yōu)選的，所述呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥是鼻炎。
優(yōu)選的，所述呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥是選自哮喘或鼻炎，所述哮喘選自支氣管哮喘、小兒哮喘、變應性哮喘、特應性哮喘、類固醇抵抗型哮喘、非變應性哮喘、內因性哮喘、外因性哮喘、阿司匹林哮喘、心臟性哮喘和感染性哮喘；所述鼻炎選自變應性鼻炎、花粉病、急性鼻炎、慢性鼻炎、肥大性鼻炎、慢性竇炎(積膿癥)和鼻中隔偏移。
另一方面，本發(fā)明涉及NF-κB誘餌用于制造藥劑或藥物組合物的用途，所述藥劑或藥物組合物用于治療和/或預防由受NF-κB調節(jié)的基因表達引起的呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥，或由嗜酸性粒細胞異常引起的呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥。
另一方面，本發(fā)明包含本發(fā)明的上述組合物，其適用于施用于呼吸系統(tǒng)。
優(yōu)選的，施用于呼吸系統(tǒng)包含施用于氣道內或經氣道吸收。
優(yōu)選的，施用于呼吸系統(tǒng)特征是經霧化或吸入施用于氣道。
優(yōu)選的，施用于呼吸系統(tǒng)特征包含經定量噴霧式吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)或噴霧器施用。
優(yōu)選的，所述組合物以干粉提供。
優(yōu)選的，所述干粉是經選自下組之一的方式生產的微粒球磨、珠磨、噴射磨、ultimaizer、研缽、石磨、噴霧干燥和超臨界流體。
優(yōu)選的，所述干粉的氣體動力學平均粒徑為約0.01至約50微米。
優(yōu)選的，所述干粉的氣體動力學平均粒徑為約0.05至約30微米。
優(yōu)選的，所述干粉的氣體動力學平均粒徑為約0.1至約10微米。
優(yōu)選的，本制劑(formulation)中提供的每輪劑量是10μg-100mg。
優(yōu)選的，本制劑中提供的每輪劑量是50μg-50mg。
優(yōu)選的，本制劑中提供的每輪劑量是10mg或更少。
優(yōu)選的，施用于呼吸系統(tǒng)包含經鼻吸收。
優(yōu)選的，所述制劑是選自滴鼻劑、噴鼻劑、噴霧劑、呼吸器用劑和粉末給藥制劑的制劑。
優(yōu)選的，所述制劑是用于鼻炎的滴鼻劑。
優(yōu)選的，本發(fā)明特征在于NF-κB誘餌包封在HVJ-E囊膜載體(envelope vector)中。
優(yōu)選的，施用于呼吸系統(tǒng)包含施用于肺。
另一方面，本發(fā)明提供治療呼吸系統(tǒng)的裝置，其包含根據(jù)本發(fā)明的組合物以及將所述組合物施用于呼吸系統(tǒng)的器具。
優(yōu)選的，所述施用于呼吸系統(tǒng)的器具包含選自下組的器具用于向肺給藥的器具、用于經氣道給藥的器具、用于經氣道吸收的器具和用于經鼻吸收的器具。
優(yōu)選的，所述用于向氣道中給藥的器具包含定量噴霧式吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)或噴霧器。
另一方面，本發(fā)明提供制造含NF-κB誘餌的顆粒的方法，包括以下步驟A)提供所述誘餌和藥學上可接受的載體；B)將所述誘餌和載體干燥并加熱到足以造粒(particulization)的溫度；和C)獲得具有預期顆粒大小的顆粒。
優(yōu)選的，所述溫度是50攝氏度或更低。
優(yōu)選的，所述溫度是100攝氏度或更低。
優(yōu)選的，所述干粉氣體動力學平均粒徑為約0.01至約50微米。
優(yōu)選的，所述干粉的氣體動力學平均粒徑為約0.05至約30微米。
優(yōu)選的，所述干粉的氣體動力學平均粒徑為約0.1至約10微米。
另一方面，本發(fā)明提供治療和/或預防由受NF-κB調節(jié)的基因表達引起的呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥的方法，包括以下步驟A)向對象的呼吸系統(tǒng)施用含NF-κB誘餌和藥學上可接受載體的組合物。
優(yōu)選的，所述呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥是氣道炎性疾病、氣道狹窄或鼻腔炎性疾病。
優(yōu)選的，所述呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥是COPD、哮喘或鼻炎。
優(yōu)選的，施用于呼吸系統(tǒng)包含施用于氣道內或經氣道吸收。
優(yōu)選的，施用于呼吸系統(tǒng)特征是經霧化或吸入施用于氣道。
優(yōu)選的，施用于氣道包含經定量噴霧式吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)或噴霧器施用。
優(yōu)選的，所述施用經選自滴鼻劑、噴鼻劑、噴霧器、呼吸器和粉末給藥的方式實現(xiàn)。
另一方面，本發(fā)明提供治療和/或預防由嗜酸性粒細胞異常引起的呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥的方法，包括以下步驟A)向對象的呼吸系統(tǒng)施用含NF-κB誘餌和藥學上可接受載體的組合物。
另一方面，本發(fā)明涉及NF-κB誘餌在制造用于治療和/或預防由受NF-κB調節(jié)的基因表達引起的呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥的藥物方面的用途。
另一方面，本發(fā)明涉及NF-κB誘餌在制造用于治療和/或預防由嗜酸性粒細胞異常引起的呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥的藥物方面的用途。
發(fā)明效果本發(fā)明允許處理如治療或預防呼吸疾病如氣道炎性疾病、氣道狹窄或鼻腔炎性疾病等。


圖1是顯示根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物在哮喘模型中效果的試驗方案的實例(圖1A)。圖1B和1C顯示吸入誘餌的效果。
圖2的結果顯示來自卵清蛋白激發(fā)的動物的支氣管肺泡灌洗液中根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的效果。圖2A和2B所示為用于計算嗜酸性粒細胞數(shù)目的原始數(shù)據(jù)。圖2C顯示本發(fā)明的效果，其中從左邊開始分別表示對照、卵清蛋白激發(fā)、氣溶膠處理(2mg×2)和液體處理(0.5mg×1)。
圖3的結果顯示來自卵清蛋白激發(fā)的動物的支氣管肺泡灌洗液中根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的效果。圖3A(嗜酸性粒細胞數(shù))和圖3B(嗜酸性粒細胞百分率)顯示本發(fā)明的效果。從左邊開始，每個圖分別表示對照、卵清蛋白激發(fā)、裸誘餌(500微克)、HVJ(200；含HVJ-E 10000HAU和誘餌200μg)、HVJ(500；含HVJ-E 25000HAU和誘餌500μg)和載體(只有HVJ-E 25000HAU，無誘餌)。#表示對照相對于卵清蛋白激發(fā)的統(tǒng)計顯著性。
圖4表示嗜酸性粒細胞行為的實例。
圖5表示本發(fā)明NF-κB誘餌的粉末吸入藥劑的結果。
圖6表示用作對照的含乳糖的粉末吸入藥劑的結果。
圖7表示NF-κB誘餌在大鼠哮喘模型(AHR)中的結果。圖例如下##p＜0.01vs鹽水組(學生t-檢驗)；*，**分別表示p＜0.05，0.01vs對照組(Dunnett’s多重比較檢驗)。
圖8表示NF-κB誘餌在大鼠哮喘模型(BALF)中的結果。圖例如下##p＜0.01vs鹽水組(學生t-檢驗)；*，**分別表示p＜0.05，0.01vs對照組(Dunnett’s多重比較檢驗)。
圖9表示NF-κB誘餌在大鼠鼻炎模型中的效果。圖例如下##p＜0.01vs鹽水組(學生t-檢驗)；*，**分別表示p＜0.05，0.01vs對照組(Dunnett’s多重比較檢驗)。序列表說明SEQ ID NO1是NF-κB誘餌。
SEQ ID NO2是打亂的(scrambled)NF-κB誘餌。
SEQ ID NO3是NF-κB誘餌的變體。
以下，本發(fā)明將用優(yōu)選實施方案的方式描述。本領域技術人員將會理解，基于本說明書的描述和本領域公知的常用技術，本發(fā)明的實施方案可以適當實施或實現(xiàn)。本發(fā)明的功能和效果容易被本領域技術人員識別。
實施發(fā)明的最佳方式以下將描述本發(fā)明。應該理解，在本說明書中除非文中明確的另外指出，單數(shù)形式的冠詞(如英語中的“a”、“an”、“the”等；德語中的“ein”、“der”、“das”、“die”、等及其變化；法語中的“un”、“une”、“l(fā)e”、“l(fā)a”等；西班牙語中的“un”、“una”、“el”、“l(fā)a”等，和其它語言中的冠詞、形容詞等)包括其復數(shù)指示物。也應該理解，除非另外說明，此處所用的術語具有本領域通常使用的定義。因此，除非另外定義，此處使用的所有術語和技術名詞與本發(fā)明所屬領域的技術人員一般理解具有相同含義。如果有沖突，以本說明書(包括定義)為準。
此處下面提供的實施方案為更好理解本發(fā)明的目的而提供，因而應該理解本發(fā)明范圍不受以下描述的限制。因此，根據(jù)本說明書的描述，進行在本發(fā)明范圍內的任何修飾對于本領域技術人員是顯而易見的。
術語“誘餌”或“誘餌化合物”表示這樣一種化合物，它結合到NF-κB的染色體結合位點或受NF-κB控制的基因的另一個轉錄調節(jié)因子的染色體結合位點(以下稱為靶結合位點)，并拮抗NF-κB與其靶結合位點的結合。代表性的，所述誘餌或誘餌化合物包括核酸及其類似物。
當誘餌存在于核中時，誘餌與轉錄調節(jié)因子沖突，競爭所述轉錄調節(jié)因子的靶結合位點。結果，通過轉錄調節(jié)因子與靶結合位點的結合而產生的生物功能被抑制。所述誘餌含有至少一種能結合靶結合序列的核酸序列。只要誘餌能結合靶結合序列，所述誘餌就能用于制備本發(fā)明的藥物組合物。
誘餌的優(yōu)選實施例包括但不限于含5’-CCT-TGA-AGG-GAT-TTC-CCT-CC-3’(SEQ ID NO1)(NF-κB誘餌)的寡核苷酸、或其互補序列、其變體或包括一種或多種這些分子的化合物等。所述寡核苷酸可以是DNA或RNA，并且其中也可以包括修飾核酸和/或假核酸。此外，這些寡核苷酸可以是其突變體或其中有它們的化合物。所述寡核苷酸可以是單鏈或雙鏈，或可以是線性或環(huán)狀，或可以帶分支或線性。突變體指具有在上述序列之一中含突變、替換、插入或缺失的序列的核酸，并且它能特異性拮抗NF-κB或受NF-κB控制基因的另一種轉錄調節(jié)因子與其結合位點的結合。更優(yōu)選的誘餌包括含一種或多種上述核酸序列的雙鏈寡核苷酸或其突變體。NF-κB誘餌的代表性變體包括但不限于具有SEQ ID NO3核酸序列的那些。
用于本發(fā)明的寡核苷酸包括經修飾以抵抗體內降解的寡核苷酸等，如具有硫代磷酸二酯鍵(其中磷酸二酯鍵中的氧原子被硫原子替換)的寡核苷酸(S-oligo)、磷酸二酯鍵被不帶電荷的甲基磷酸基團替換的寡核苷酸等。
此處所用的分子生物學技術、生化技術和微生物學技術是公知其常用的，例如描述于Ausubel F.A.et al ed.(1988)，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，New York，NY；Sambrook J.et al.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，2ndEd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，SupplementExperimental Medicine“Gene introduction and expression analysis methods”，Yodosha，1997等。
除非另外注明，此處所用的術語“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”具有相同含義，指由一系列核苷酸組成的聚合物。核苷酸指形成磷酸酯的核苷?；静糠职ň哂朽奏A基或嘌呤堿基的核苷酸(嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸)。組成多核苷酸的核苷酸包括DNA或RNA等。如上所述，誘餌通常使用這些形式的核酸。
基于本發(fā)明的誘餌序列通過用軟件如BLAST、FASTA等對基因組數(shù)據(jù)如人類基因組計劃(the Human Genome Project)中包括的那些或基因信息數(shù)據(jù)庫如GenBank進行同源性搜索而獲得的序列也在本發(fā)明范圍內。生物學篩選基于這種數(shù)據(jù)庫制備的文庫而獲得的序列(例如，在嚴謹條件下獲得的序列)也包括在本發(fā)明范圍內。
此處使用FASTA(序列分析工具)比較堿基序列的相似性、一致性和同源性時使用默認參數(shù)，除非另外注明。
如此處所用，術語“對應”的基因或序列(如誘餌或啟動子序列等)指給定物種中具有或預期具有與供比較的參考物種中的預定基因相似的功能的基因。當有多個具有這種功能的基因時，該術語指具有相同進化起源的基因。因此，與給定基因對應的基因可以是所述給定基因的直向同源基因。因此，與那些如小鼠NF-κB或序列對應的基因可以在其它動物如人、大鼠、豬、牛等中發(fā)現(xiàn)?？赏ㄟ^本領域公知的技術鑒定這種對應的基因。因此，例如，給定動物中的對應基因可用序列如作為參考基因的小鼠NF-κB作為查詢序列通過搜索所述動物(如人、大鼠)的序列數(shù)據(jù)庫而被發(fā)現(xiàn)。這些對應基因可由本領域技術人員用序列數(shù)據(jù)庫或文庫容易的獲得。本發(fā)明中，與本發(fā)明的特定序列對應的序列因此也將被包括。
“寡核苷酸衍生物”或“多核苷酸衍生物”包括核苷酸衍生物，或表示核苷酸之間具有與典型連接不同的連接的寡核苷酸或多核苷酸，可互換使用。這種寡核苷酸的實例具體包括寡核苷酸中的磷酸二酯鍵轉變成硫代磷酸二酯鍵的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中的磷酸二酯鍵轉變成N3’-P5’氨基磷酸酯鍵的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中的核糖和磷酸二酯鍵轉變成肽核酸鍵的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中的尿嘧啶被替換成C-5丙炔基尿嘧啶的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中的尿嘧啶被替換成C-5噻唑尿嘧啶的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中的胞嘧啶被替換成C-5丙炔基胞嘧啶的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中的胞嘧啶被替換成吩噁嗪修飾胞嘧啶的寡核苷酸衍生物、DNA中的核糖被替換成2’-O-丙基核糖的寡核苷酸衍生物，以及寡核苷酸中的核糖被替換成2’-甲氧乙氧基核糖的寡核苷酸衍生物。
如此處所用，術語“生物活性”指某種因子在生物體內所具有的活性，包括表現(xiàn)各種功能的活性。例如，當某種因子是轉錄因子時，其生物活性包括調節(jié)轉錄活性的活性。當某種因子是酶時，其生物活性包括酶活性。作為另一個例子，當某種因子是配體時，其生物活性包括與所述配體對應的受體的結合。在本發(fā)明的實施方案中，這種生物活性包含與至少一種轉錄因子的結合活性。通過混合轉錄因子和轉錄因子的結合序列、并測定由這種結合所得的復合體(如經電泳觀察)可以實現(xiàn)測定這種轉錄因子結合活性的方法。這種方法在本領域公知并常規(guī)使用。
如此處所用，術語“核苷酸”可以是天然存在的或非天然存在的?！昂塑账嵫苌铩敝概c天然存在核苷酸不同但具有與這種核苷酸相似功能的衍生物。這種核苷酸衍生物與核苷酸類似物在本領域公知。這種核苷酸衍生物的實例例如包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。
如此處所用，術語“變體”指起始物質如多核苷酸的一部分被改變的物質。這種變體包括具有替換、添加或缺失的變體、截短型變體、等位基因變體等。等位基因指與另一個位于相同遺傳座位并可以互相有區(qū)別的遺傳變體。
本發(fā)明的誘餌可用本領域已知的化學或生化合成方法制備。例如，當用核酸作為誘餌化合物時，可以采用遺傳工程中常用的核酸合成方法。例如，DNA合成儀可直接用于合成預定的誘餌核酸。此外，可以合成這些核酸、含所述核酸的核酸或其部分，隨后用PCR方法、克隆載體等擴增。而且，將由這些方法獲得的核酸用限制酶等切割，并用DNA連接酶等連接，等等，以制備預定核酸。為獲得在細胞中更穩(wěn)定的誘餌核酸，所述核酸中的堿基、糖和磷酸酯部分可以被化學修飾，如烷基化、?；取?br> 本發(fā)明提供含單獨或與穩(wěn)定化合物、稀釋劑、載體或其它成分或藥劑組合的上述誘餌化合物的藥物組合物。
如此處所用，術語“患者”或“對象”指被施加本發(fā)明的治療或組合物的生物體。患者可以是任何動物，如靈長類、嚙齒類等。只要可以施加本發(fā)明的治療或組合物即可。優(yōu)選的，所述患者可以是人，如此處所用，術語“由受NF-κB調節(jié)的基因表達引起的疾病、障礙和/或病癥”指原因是轉錄因子NF-κB調節(jié)(例如增加、減少、延遲等)表達(例如翻譯或轉錄)的疾病或障礙。這種疾病、障礙或病癥包括但不限于哮喘、鼻炎、COPD等。
如此處所用，術語“與嗜酸性粒細胞異常相關的疾病、障礙和/或病癥”指體內(如血液中)嗜酸性粒細胞水平位于正常水平以外作為原因或結果的任何疾病、障礙和/或病癥。嗜酸性粒細胞表面有IgE受體，并在變應性疾病中起重要作用。
這些與嗜酸性粒細胞異常相關的疾病包括但不限于哮喘(支氣管哮喘、小兒哮喘、變應性哮喘、特應性哮喘、類固醇抵抗型哮喘(SRA)、非變應性哮喘(內因性哮喘、外因性哮喘如阿司匹林哮喘、心臟性哮喘和感染性哮喘)；和其它嗜酸性粒細胞異常如鼻炎、變應性疾病等。
如此處所用，術語“與呼吸系統(tǒng)相關的疾病、障礙和/或病癥”指與呼吸系統(tǒng)相關的任何疾病、障礙和/或病癥。這種與呼吸系統(tǒng)相關的疾病包括但不限于氣道炎性疾病、氣道狹窄或鼻腔炎性疾病。
如此處所用，與呼吸系統(tǒng)相關的疾病包括COPD、哮喘、鼻炎等。
如此處所用，術語“COPD”(Chronic Obstructive Pulmonary Disease的縮寫)總起來說表示空氣進出肺慢性變差并因而逐漸變得有病的疾病。它基本包括如今已被稱為“慢性支氣管炎”和“肺氣腫”的任何疾病。舉例來說，COPD病情包括每天連續(xù)咳嗽并有痰、甚至患者沒有感冒時也是如此的情況，和當移動他/她的身體如上下樓梯等時患者感到呼吸困難的情況。一些患者在當他們以與沒有咳嗽和痰的同齡人相同步伐行走而感到疲勞時將只識別出呼吸困難。這些是常見病情，并因而被誤認為是由于衰老導致。然而，COPD的特征是連續(xù)表現(xiàn)咳嗽、有痰和呼吸困難等。
COPD主要分成傳統(tǒng)稱謂的“慢性支氣管炎”和“肺氣腫”，其中慢性支氣管炎有支氣管和細支氣管疾病，肺氣腫特征是肺泡疾病。多數(shù)患者同時看到兩種類型疾病。即使患者有慢性支氣管炎，也有不總是伴隨咳嗽和有痰的病例，因此最近將它稱為“氣道疾病類型”，應該理解所有這些都被本發(fā)明目標包括。
多數(shù)氣道疾病類型被識別為氣道表面發(fā)炎并分泌大量粘液的情況。此外，氣道壁變厚，氣道變狹窄，因而通氣被破壞。
肺氣腫表示那些疾病，其中慢性炎癥引起肺泡破壞和融合，因而肺含空氣導致起泡或膨脹的肺組織擠壓氣道，從而破壞氣道并且通氣被破壞。
與上述兩種疾病類型無關，肺中的細胞都已經被破壞，因而沒有根本性治療，除非假定肺中的細胞可以再生。應該注意本發(fā)明有史以來第一次提供COPD的根本性治療。
如下診斷COPD可以用稱為“肺量計”的裝置經簡單的呼吸功能測試(肺量測試)進行COPD診斷。肺量測試是肺容量和呼氣時氣道通暢程度的測試。
“用力肺活量(forced vital capacity)(FVC)”表示當對象盡可能吸氣隨后徹底呼出時的呼吸體積，而“一秒內體積(FEV1.0)”是吸氣后第一秒內呼出的體積，在肺量測試中測量這兩個數(shù)據(jù)。然后，如果FEV1.0值除以FVC值所得的值(以下稱為一秒比率“FEV1.0％”)小于70％，則認為有COPD的可能。調查確認病情、癥狀、吸煙史或狀態(tài)、生活環(huán)境和疾病史等，如果必要也將進行其它測試，例如，包括胸部X-射線檢查、CT掃描等的成像診斷、研究是否身體缺氧的血氣分析等。這使用動脈血或使用脈沖式量氧計(pulse oxymeter)測量氧，以進行COPD診斷，其中所述脈沖式量氧計是一種裝備在指尖等的小型測定裝置。
如果一秒比率(FEV1.0％)＝一秒體積/用力肺活量×100＜70％，則所述對象診斷有COPD。
(COPD嚴重程度)優(yōu)選根據(jù)疾病的嚴重程度進行COPD治療。因此，根據(jù)需要確定COPD的嚴重程度?；诳捎煞瘟繙y試測量的％預期一秒體積(％FEV1.0)對COPD的嚴重程度分類。
表1

FEV1.0一秒體積；FVC用力肺活量GOLDCOPD global strategy for diagnosis，control and prevention(2003，revision)如此處所用，術語“哮喘”指呼吸系統(tǒng)(例如，氣道(鼻腔、咽、喉、氣管、支氣管)和肺)對粘膜相關浮腫、粘稠分泌物和任意其它刺激具有更強反應、導致氣道狹窄引起呼氣困難的病癥。哮喘包括但不限于，例如，支氣管哮喘、小兒哮喘、變應性哮喘、特應性哮喘、類固醇抵抗性哮喘、非變應性哮喘、內因性哮喘、外因性哮喘、阿司匹林哮喘、心臟性哮喘和感染性哮喘等。
如此處所用，術語“鼻炎”指鼻腔粘膜的任何炎性疾病。鼻炎包括但不限于，例如變應性鼻炎、花粉病、急性鼻炎、慢性鼻炎、肥大性鼻炎、慢性竇炎(積膿癥)和鼻中隔偏移等。變應性鼻炎是與作為主要癥狀的頻繁打噴嚏、大量鼻液溢和因鼻粘膜水腫性增生而致的鼻塞相關的鼻炎，因此變應原(抗原)包括居室塵、塵螨、雪松或其它的花粉等，據(jù)說日本有一千五百萬患者。
實施本發(fā)明的藥物組合物和方法中，在患者是人的情況下，優(yōu)選在人體試驗之前，進行體外、隨后體內和最終的動物試驗以確定對預期治療或預防適當?shù)膭┝?。作為預備試驗，組合物抗細胞系和/或動物模型的效果可以用本領域已知技術測定。根據(jù)本發(fā)明，可用于確定是否可施用特定化合物的體外測試包括觀察轉錄因子與轉錄因子結合序列之間的結合等。在動物水平試驗中，可以象對人一樣向動物施用所述組合物并確認治療效果的水平例如觀察嗜酸性粒細胞變化，從而進行測定。本領域中應該理解，一旦在動物模型中測定到治療和/或預防效果，通常在人中將獲得相似效果。
本發(fā)明的藥物組合物可以這種形式使用，其中誘餌可被攝入目標組織中的受影響部分或細胞中。
本發(fā)明藥物組合物可以在任何無菌生物相容性藥物載體(包括但不限于生理鹽水、緩沖生理鹽水、右旋糖和水)中被施用。上述誘餌化合物在藥物組合物中與適當賦形劑、佐劑和/或藥學上可接受的載體混合而使用。這種組合物可以單獨或與藥物組合物中的另一種藥物成分組合施用于患者。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述藥學上可接受的載體沒有藥物活性。
可通過口腔或非胃腸道途徑施用本發(fā)明藥物組合物。非胃腸道遞送方法包括局部、動脈內(如直接入腫瘤、動脈瘤等)、肌肉內、皮下、骨髓內、入蛛網(wǎng)膜下腔、心室內、靜脈內、腹膜內或鼻內施用。除了誘餌化合物以外，本發(fā)明藥物組合物還包含藥學上可接受的載體，如賦形劑和加速處理所述誘餌化合物的其它化合物，從而制備藥學上可接受的制劑。處方和給藥的進一步技術細節(jié)例如描述于最新版“REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES”(Maack Publishing Co.，Easton，PA)。
用于給藥的藥物組合物可以用本領域公知的藥學上可接受的載體制備成適于給藥的形式。這種載體可以制備成片劑、丸劑、糖衣劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑(slurry)、懸液等，它們適于患者使用所述藥物組合物。藥學上可接受的載體包括但不限于脂質體、乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇、木糖醇、結晶纖維素、脫乙酰殼多糖、碳酸鈣、滑石、氧化鈦或硅膠(氧化硅)等。
所用藥物組合物可以例如如下方式獲得將活性化合物與固體賦形劑組合，必要時將所得混合物研磨成粉，如果必要再加入適當化合物而獲得片或糖衣劑的芯，并加工顆粒混合物。適當賦形劑可以是碳水化合物或蛋白質填充劑，包括但不限于以下糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；來源于玉米(玉米淀粉)、小麥、稻米、馬鈴薯或其它植物的淀粉；纖維素如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或羧甲基纖維素鈉；和膠，包括阿拉伯膠和黃芪膠；和蛋白質，如明膠和膠原。如果必要可以使用崩解劑或助溶劑，如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、海藻酸或其鹽(如海藻酸鈉)。
糖衣劑芯與適當?shù)陌氯鐫饪s糖溶液一起提供。糖衣劑芯也可以含有阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、carbopolygel、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液以及適當有機溶劑或溶劑混合液。為識別產品或表征活性化合物的量(即劑量)，染料或顏料可以加入片劑或糖衣劑中。
可使用的藥物組合物例如可以含有由明膠膠囊、明膠和包衣(如甘油或山梨醇)組成的密封軟膠囊。明膠膠囊可以含有活性成分，其中混合填充劑或粘合劑如乳糖或淀粉、潤滑劑如滑石或硬脂酸鎂，和任選的穩(wěn)定劑。在軟膠囊中，所述誘餌化合物可以溶于或懸于適當液體如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇中，其中有或無穩(wěn)定劑。
用于非胃腸道給藥的藥物組合物含有活性化合物的水溶液。對于注射目的，本發(fā)明的藥物組合物在水性溶液中制備，優(yōu)選Hank’s溶液、Ringer’s溶液或生理適合的緩沖液如緩沖生理鹽水。注射用水懸液可以含有增加懸液粘度的物質(如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖)。此外，活性化合物的懸液可以制備為適當?shù)挠托詰乙?。適當?shù)挠H脂性溶劑或介質包括脂肪酸如麻油、合成脂肪酸酯如油酸乙酯或三甘油酯，或脂質體。如果必要，懸液可以含有允許制備高濃度溶液的穩(wěn)定劑，或用于增加所述化合物溶解性的適當藥物成分或試劑。
對于局部給藥，如肺部給藥、經氣道給藥或鼻內給藥，制劑中可使用透過特定屏障的適當通透劑。這種通透劑在本領域公知。
本發(fā)明藥物組合物可以用與本領域已知方法相似的方法制備(如常規(guī)混合、溶解、造粒、制備糖衣劑、淘析、乳化、膠囊化、包合或凍干)。
因此，應該理解，根據(jù)本領域已知技術，可以容易的實施適用于向呼吸系統(tǒng)給藥的方法。例如，應該理解氣道內給藥或經氣道吸收優(yōu)選的可適于用噴霧或吸入的形式包括微粒如干粉。如此處所用，例如，本發(fā)明適于經定量噴霧式吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)或噴霧器施用。對于鼻腔給藥，應該理解水溶液也適合。對于肺部給藥，應該理解優(yōu)選使用與氣道給藥相似的劑量或甚至更細的微粒。干粉制造可通過選自以下之一的方式球磨、珠磨、噴射磨、ultimaizer、研缽、石磨、噴霧干燥和超臨界流體。對于氣道給藥，理想的干粉的氣體動力學平均粒徑典型是約0.01至約50μm，優(yōu)選約0.1至約30μm，更優(yōu)選約0.1至約10μm。對于肺部給藥，考慮到遞送入肺泡，優(yōu)選制造具有氣體動力學平均粒徑約3μm或更小的顆粒，但本發(fā)明不限于此。術語“氣體動力學平均粒徑”指沉降速率與所研究顆粒相同、其密度為1(g/cm3)并具有球形的粒徑?？苫陬w粒沉降距離的差異或顆粒加速時慣性差異進行這種粒徑的測定。例如，階式碰撞取樣器等通過分級這些顆粒而捕集顆粒。本發(fā)明使用這種氣體動力學平均粒徑的原因是基于一種理論，其中經呼吸而吸入身體的沉積到每個位點上的顆粒的比例可以用氣體動力學平均粒徑確定。典型的，動態(tài)光散射(例如，用可從HORIBA獲得的LB-550)或激光衍射(例如用可從HORIBA獲得的LB-500)、離心沉降(例如可從HORIBA獲得的CPA-500)等可用于測定。如此處所用，術語“動態(tài)光散射”指用激光照射溶液中顆粒并從輸出散射光的隨時間波動獲得布朗運動速率(分散效率)而測量粒徑的方法。激光衍射法是用光散射現(xiàn)象(Fraunhofer現(xiàn)象)和米氏散射現(xiàn)象的方式獲得粒徑的方法。離心沉降滲透方法是通過在介質中沉降的顆粒直徑與沉降速度之間關系而測量粒徑的方法。
優(yōu)選的，在非胃腸道給藥的情況下，如向受影響部位的細胞或預定組織的細胞局部給藥，本發(fā)明藥物組合物可以含有合成或天然存在的親水聚合物作為載體。這種親水聚合物的實例包括羥丙基纖維素和聚乙二醇。本發(fā)明的誘餌化合物可與上述親水聚合物在適當溶劑中混合?？捎美缈諝飧稍锏姆椒ㄈコ軇Ｋ没衔锟沙尚螢轭A期形式如片，然后可給予靶位點。這種含親水聚合物的制劑具有低含水量、優(yōu)異的儲存期限，并具有優(yōu)異的保持所述誘餌化合物的能力，因為使用時所述制劑吸水并變成凝膠。
這種片可以包括親水片，通過混合多元醇與上述組合物成分相似的化合物如纖維素或淀粉、或其衍生物、合成聚合化合物等、并調節(jié)片的硬度而獲得。
這種片可以在腹腔鏡下放置在靶位點內。當前，腹腔鏡手術已經顯著的發(fā)展為一項非侵入性技術。通過組合本發(fā)明的藥物組合物以及腹腔鏡技術，可以提供可重復使用的治療疾病的方法。
作為替代方案，當核酸或其修飾物用作誘餌時，本發(fā)明藥物組合物有利地使用通常在基因導入方法中使用的形式，如用仙臺病毒(HVJ)等的膜融合脂質體制劑、用細胞內吞等的脂質體制劑、含陽離子脂的脂質體制劑如Lipofectamine(LifetechOriental)等，或用逆病毒載體、腺病毒載體等的病毒制劑。具體而言，優(yōu)選膜融合脂質體制劑。
所述脂質體制劑是以下脂質體構造物的任一種大單層囊泡(LUV)、多層囊泡(MLV)和小單層囊泡(SUV)。LUV具有200-1000nm的顆粒系統(tǒng)。MLV具有400-3500nm的顆粒系統(tǒng)。SUV具有20-50nm的顆粒系統(tǒng)。用仙臺病毒等的膜融合脂質體制劑優(yōu)選使用具有200nm-1000nm顆粒體系的MLV。
對制備脂質體的方法沒有特別限制，只要脂質體能保留誘餌即可。脂質體可用常用方法制備，例如，反相蒸發(fā)法(Szoka，F(xiàn) et al.，Biochim.Biophys.Acta，Vol.601559(1980))、醚注入法(Deamer，D.W.Ann.N.Y.Acad.Sci.，Vol.308 250(1978))、表面活性劑法(Brunner，J et al.Biochim.Biophys.Acta，Vol.455 322(1976))等。
用于形成脂質體的脂的實例包括磷脂、膽固醇、氮脂(nitrogen lipids)等。一般來說，優(yōu)選磷脂，包括天然存在的磷脂，如磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、心磷脂、鞘磷脂、卵黃卵磷脂、大豆卵磷脂、溶血卵磷脂等，或用常用方法氫化的對應磷脂，還有合成磷脂，如聯(lián)十六烷基磷酸酯(dicetylphosphate)、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸、桐酰磷脂酰膽堿(eleostearoylphosphatidylcholine)、桐酰磷脂酰乙醇胺、桐酰磷脂酰絲氨酸等。
包括這些磷脂的脂類可以單獨使用，或至少兩種組合使用。在此情況下，分子內含具陽離子基團的原子團如乙醇胺、膽堿等的脂類可用于增加帶負電誘餌核酸的結合速率。除了用于形成脂質體的主要磷脂以外，可以使用添加劑如膽固醇、硬脂胺、α-生育酚等，它們已被公認為形成脂質體的添加劑。
由此獲得的脂質體還可含有促進膜融合的物質，如從仙臺病毒純化的膜融合促進蛋白、滅活仙臺病毒等，以加速吸收入受影響部位的細胞或預定組織的細胞。
制備脂質體制劑的示例性方法將在下面具體描述。例如，上述用于形成脂質體的物質與膽固醇一起溶于有機溶劑如四氫呋喃、氯仿、乙醇等中。所得溶液放入適當容器，隨后減壓去除溶劑，從而在容器內壁形成可形成脂質體物質的膜。將含誘餌的緩沖溶液加入容器中，隨后攪拌。如果必要將上述促進膜融合的物質加入所得脂質體中，隨后分離脂質體。由此獲得的含誘餌脂質體可懸于適當溶劑中，或可加以凍干并在以后分散于適當溶劑中。所得懸液可用于治療?？稍诜蛛x脂質體之后和使用之前的中間時期加入促進膜融合的物質。
如此處所用，術語或“治療(treatment或therapy)”指當患者感染疾病或障礙時防止這種疾病或障礙的惡化，優(yōu)選至少維持現(xiàn)狀，更優(yōu)選緩解，更優(yōu)選消退。
如此處所用，術語“預防(prophylaxis或prevention)”當針對疾病或障礙時指在這種狀態(tài)出現(xiàn)之前進行一種處理從而使這種狀態(tài)不會發(fā)生。因此，對于疾病或障礙而言，它包括這種狀態(tài)的防止、延遲等，以及惡化的防止。
如此處所用，對于疾病、障礙或病癥而言，術語“處理(treatment)”的最廣義含義指對疾病、障礙或病癥的任何醫(yī)學行為，包括診斷、治療、預防、預后等的任何行為。
通常，用于藥物治療呼吸系統(tǒng)疾病如哮喘的藥物分為緩解劑和控制劑，其中所述緩解劑是用于減輕發(fā)作的發(fā)作處理藥物，所述控制劑是用于預防發(fā)作的長期控制藥物。應該理解，NF-κB可用于預防和治療。這具體是因為防止發(fā)作基本是哮喘的根本性治療，更重要的是具有根本性治療效果，而緩解發(fā)作劑則沒有這種效果。一旦明白本發(fā)明可用于其它疾病如鼻炎、COPD等，它也可用于治療。另一方面，一旦明白本發(fā)明可用于治療，那么它也可用于預防。因此，應該明白在本發(fā)明中當已知預防或治療的適當劑量時，本領域技術人員將能從已知劑量計算用于治療或預防的適當劑量。
本發(fā)明藥物組合物包括含可達到誘餌化合物預定目的的有效量誘餌化合物的組合物?！邦A防有效量”、“治療有效量”和“藥理有效量”是本領域技術人員公知的術語，指產生預定藥理效果如預防或治療效果的藥劑有效量。因此，預防有效量是足以避免發(fā)生癥狀的量，治療有效量是足以降低待治療疾病表現(xiàn)的量。確認對預定應用的有效量(如治療有效量)的有用測試是測量從目標疾病的恢復程度。實際給藥量取決于待治療個體。優(yōu)選優(yōu)化該量以獲得預期效果，而沒有顯著副作用。確定治療有效量在本領域技術人員的能力范圍內。
可用細胞培養(yǎng)測試或任何適當動物模型初步估計任何化合物的預防或治療有效量。動物模型用于獲得預期濃度范圍和給藥途徑。之后，這些信息可用于確定用于向人給藥時的劑量和途徑。
預防和治療有效量分別指足以預防疾病發(fā)生的量，和導致疾病的癥狀或狀態(tài)改善的誘餌化合物的量。這種化合物的治療效果和毒性可用標準藥學方法在細胞培養(yǎng)物或試驗動物中確定(如ED50，對群體中50％治療有效的劑量；LD50，導致群體中50％死亡的劑量)。治療和毒性作用的劑量比是治療指數(shù)，它可以表示為ED50/LD50的比。優(yōu)選表現(xiàn)高治療指數(shù)的藥物組合物。從細胞培養(yǎng)測試和動物研究中獲得的數(shù)據(jù)可用于配制用于人的劑量范圍。這些化合物的劑量優(yōu)選位于包括ED50同時很少或沒有毒性的循環(huán)濃度范圍內。這種劑量可根據(jù)所用劑型、患者易感性和給藥途徑而在此范圍內變化。作為實例，可根據(jù)患者年齡和其它情況、疾病類型、所用誘餌類型等適當選擇誘餌劑量。例如，在血管內給藥、肌肉內給藥、關節(jié)內給藥或涂敷于皮膚的情況下，一般可以每天一次到幾次施用1μg到100mg。
確切劑量由各醫(yī)生根據(jù)待治療患者的狀況選擇。調節(jié)劑量和給藥以提供足夠水平的活性部分或達到預期效果。待考慮的其它因素包括疾病狀態(tài)的嚴重程度(如腫瘤大小和位置)；患者的年齡、重量和性別；飲食限制時間和給藥頻率、潛在藥物相互作用、反應易感性和對治療的抗性/反應)。根據(jù)具體制劑的半衰期和清除速率，持續(xù)作用的藥物組合物可以每3-4天、每周或每兩周施用一次。具體劑量和遞送方法的指導在本領域已知的出版物中提供。
根據(jù)疾病類型、待使用誘餌類型等，含誘餌作為主要成分而制備的藥物產品可以經多種方式施用。例如，對于哮喘、COPD等，霧化器型吸入器如MDI、BDI或噴霧器等可用于吸入。例如對于鼻炎，可使用吸收和吸入進行給藥。
常規(guī)用作經鼻腔、氣道和鼻通路給藥方法等的吸入方法將在下面描述。在氣道內給藥劑型、經氣道吸收劑型或經鼻吸收劑型中，通常優(yōu)選制備合劑(mist)形式的藥物溶液或作為細粉末(干粉)。通常，所形成藥物溶液可經噴霧器的方式吸入，加工成粉末的那些可用加有藥物的氣霧化類型的器具MDI(定量噴霧式吸入器)或呼出吸入系統(tǒng)DPI(干粉吸入器)吸入。
對于粉末吸入器，現(xiàn)有兩種類型用于快速和深度吸入，“干粉吸入器(DPI)”和延遲吸入類型“定量噴霧式吸入器(MDI)”。
DPI又分成三類多劑量儲器(產品名稱；Turbuhaler，得自AstraZeneca)、多單位劑量(產品名稱；Accuhaler/Diskus，得自GSK)、單位劑量(很多制造商)。
吸入器指由口端(mouth piece)和藥筒(管)組成的藥盒，通常管兩端經鋁箔密封使用。使用之前，將管裝上口端以刺破鋁箔，從而允許吸入內部的粉狀藥物。
另一方面，可經噴霧器或呼吸器、人工呼吸器的器具吸收藥物溶液。噴霧器產生的藥物氣溶膠速度緩慢并在空氣中流動，從而使任何人容易吸收藥物，這是其優(yōu)點。
珠磨是用于研磨和分散的裝置，經向容器中加入珠子、旋轉中心轉軸以移動珠子、遞送物質到珠子并研磨珠子而提供。
噴射磨是經高壓氣流而研磨顆粒的裝置，將顆粒加速到約聲速在氣流中引起碰撞從而研磨顆粒。
ultimaizer是用于微?；难b置，其中是經過使用經氣體如空氣、氮氣等而加壓霧化或加壓的漿狀物質在極端速度下互相碰撞粉體。
超臨界流體微?；墙涍^噴霧干燥溶于溶劑中藥物的方式而制造微粒的方法，其中通過從連接于加壓容器內的噴嘴并溶于超臨界CO2而快速膨脹。
用于本發(fā)明的干粉的平均粒徑不限制，但通常在約0.01-約50μm，優(yōu)選約0.05μm-約30μm，更優(yōu)選約0.1μm-約1μm。
當以位點選擇性方式給藥時，為作用于氣管，通常要求氣體動力學平均粒徑約10-約30微米；為作用于支氣管，通常要求氣體動力學平均粒徑約3-約10微米；為作用于肺泡，通常要求氣體動力學平均粒徑約3微米或更小，優(yōu)選氣體動力學平均粒徑約2微米或更小，并優(yōu)選要求均勻粒徑。
本發(fā)明的NF-κB劑量不限制于特定值，但當以干粉用于氣道內給藥或經氣道吸入時，劑量通常是每個成年個體10μg-100mg/輪，優(yōu)選50μg-50mg/輪，更優(yōu)選10mg或更少/輪。當作為經鼻吸入劑給藥時，特別是作為鼻炎滴鼻劑給藥時，劑量通常是每個成年個體10μg-100mg/輪，優(yōu)選50μg-50mg/輪，更優(yōu)選10mg或更少/輪。根據(jù)目標疾病、狀況(程度)、年齡和是否有并發(fā)癥，劑量可以適當變化。
此外，本發(fā)明NF-κB誘餌可以裸形式施用，或可以在各種載體如HVJ-囊膜載體中將誘餌包括在其中施用。
制造本發(fā)明干粉時，通常使用賦形劑。
可用的賦形劑是對NF-κB無活性的，并且只要被認為作為藥物添加劑使用，對這種賦形劑沒有限制，例如優(yōu)選包括單糖如半乳糖、甘露糖、山梨糖；二糖如乳糖、蔗糖和海藻糖等；多糖如淀粉、棉子糖、葡聚糖等；糖醇(包括甘油、赤蘚糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇、甘露醇)、二元醇(包括乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇)、纖維素樣聚合物(包括羥基纖維素、羥丙基纖維素)、不溶性添加劑(結晶纖維素、脫乙酰殼多糖、碳酸鈣、滑石、氧化鈦或硅膠(氧化硅))或其混合物。
噴劑形式的氣溶膠系統(tǒng)例如包括內含推進劑的容器，也在開發(fā)無推進劑的氣溶膠系統(tǒng)。此外，氣溶膠系統(tǒng)中推進劑包含與常規(guī)添加劑如乳糖一起的活性成分。由這些成分組成的組合物決定氣溶膠吸入劑的特性，也即，例如顆粒分布、遞送速率、粘度等。
氣溶膠可以作為兩相氣溶膠(即氣體和液體)或三相氣溶膠(氣體、液體和固體或液體)獲得。兩相氣溶膠由溶于液化推進劑和噴霧推進劑中的活性物質溶液組成。溶劑例如包括推進劑或推進劑和醇或丙二醇等的混合物。聚乙二醇用于改善活性物質的溶解度。
三相系統(tǒng)包括懸劑或乳劑，每種包括與混合推進劑一起的一種或多種活性成分。懸劑包括經常規(guī)添加劑如潤濕劑和/或固體載體如滑石或膠體二氧化硅的方式分散于推進劑系統(tǒng)中的活性成分。如果可能，使用已知推進劑如烴以防止破壞臭氧層。
只有如果吸入溶液霧化成1-10μm大小范圍的極小顆粒，吸入才有可能。優(yōu)選吸入其中微細分布的氣溶膠。在除上述以外的常規(guī)氣溶膠情況下，優(yōu)選不吸入。為獲得關于氣溶膠吸入劑的詳細信息，例如可參考藥典如日本藥典、美國藥典等，它們的全部內容引入此處作為參考。
根據(jù)本發(fā)明使用的脂質體優(yōu)選是0.1μm-2μm的大小，特別優(yōu)選0.4μm。具體而言，優(yōu)選使用單層脂質體。用擠出加工裝置或高壓過濾可以實現(xiàn)脂質體制備。例如通過將干脂膜重構于期望液體中可以制備脂質體(例如，Parthasarathy et al.，CancerChemother.and Pharmacol.1999，43(4)，277-283)。由此而制備所謂的多層脂質體(即在水性核心周圍有多個脂層的脂質體)。這種脂質體的大小極其均勻。
另一方面，本發(fā)明提供預防或治療肺組織的系統(tǒng)，其含有向肺給藥的器具和適于肺給藥形式的NF-κB誘餌。應該明白，只要系統(tǒng)利于向肺施用藥劑，這種系統(tǒng)可以是任何形式。實現(xiàn)肺給藥的這種器具例如包括但不限于吸入裝置、支氣管鏡等。
在優(yōu)選實施方案中，所用的NF-κB誘餌可以是任何形式，如干粉、脂質體、微粒等。
在一個實施方案中，用于本發(fā)明組合物中的NF-κB為有效濃度。這種濃度可以在簡單的體外試驗中確定。這種試驗包括但不限于例如，經閃爍曲線等方式確定放射性同位素(如I125)標記的NF-κB誘餌的方法。優(yōu)選的，有利地使用適于臨床使用的閃爍曲線。這是因為它能用大型動物如狗進行確認。
在優(yōu)選實施方案中，所用NF-κB誘餌可施用于期望組織如肺組織。這種選擇性給藥可通過描述為本發(fā)明系統(tǒng)中優(yōu)選給藥器具如吸入器或支氣管鏡的優(yōu)選器具實現(xiàn)。因此，更優(yōu)選的，NF-κB誘餌基本上不施用于除期望組織如肺以外的其它組織。如果NF-κB誘餌施用于除期望組織以外的其它組織，它可能引起意料之外的事件，導致出現(xiàn)副作用。
可使用的肺給藥系統(tǒng)是能將本發(fā)明的NF-κB誘餌遞送到肺的任何系統(tǒng)。這種肺給藥系統(tǒng)包括吸入器或支氣管鏡，并包括Olympus Inc.商業(yè)供應的支氣管鏡系統(tǒng)。
下面將以實施例方式描述本發(fā)明。這些實施例只用于說明目的。本發(fā)明不限于這些實施例或本發(fā)明以上的詳細描述，而只受所附權利要求的限制。
實施例下面將以實施例方式描述本發(fā)明，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非要限制本發(fā)明。
(實施例1制備誘餌)以下誘餌寡聚脫氧核苷酸已被制備。
所用誘餌序列如下此處所用誘餌NF-κB誘餌(SEQ ID NO1)5′-CCT-TGA-AGG-GAT-TTC-CCT-CC-3′3′-GGA-GGG-AAA-TCC-CTT-CAA-GG-5′打亂的NF-κB誘餌(SEQ ID NO2)5′-TTG-CCG-TAC-CTG-ACT-TAG-CC-3′3′-GGC-TAA-GTC-AGG-TAC-GGC-AA-5′NF-κB誘餌變體(SEQ ID NO3)5′-GGG(A/G)(C/A/T)T(T/C)(T/C)(C/A/T)C-3′(SEQ ID NO3)3′-CCC(T/C)(G/T/A)A(A/G)(A/G)(G/T/A)G-5′這些誘餌溶液以100mg/管保存于-20℃直至使用。
(實施例2使用大鼠哮喘模型的NF-κB誘餌治療)接著，建立哮喘模型以證明根據(jù)本發(fā)明的誘餌的效果?；净诿枋鲇贓ur JPharmacol.1995 Dec 7；293(4)401-12中的方法建立哮喘模型。
(動物和致敏方法)從Charles River，Japan獲得Brown Norway大鼠(8-10周齡；重200-300g)?；诖筅娲髮W在動物福利精神下制定的規(guī)定繁殖并維持大鼠。經頸部皮下注射向這些大鼠施用溶于1ml無熱源鹽水中的4mg氫氧化鋁和1mg卵清蛋白(OVA；Sigma，grade V)進行致敏。含3×109熱滅活細菌的百日咳博代氏菌(Bordetella pertussis)疫苗作為佐劑用于腹膜內注射。與上述相同但缺少卵清蛋白的溶液作為對照用于腹膜內注射，從而提供陰性對照。
(制備仙臺病毒囊膜載體)如下制備仙臺病毒(HVJ)囊膜載體(HVJ-E)。簡單的說，經紫外照射(99mJ/cm2)滅活病毒懸液(1.0×104血凝單位(HAU))，并與誘餌寡核苷酸(200μg)和0.3％Triton-X混合。離心后用1ml平衡鹽溶液(BSS；10mM Tris-Cl，pH7.5，137mM NaCl，和5.4mM KCl)洗滌滅活病毒懸液，以去除表面活性劑和未摻入的寡核苷酸。離心后將囊膜載體懸于適量磷酸鹽緩沖液(PBS)中。載體在4℃保存直至使用。
(實驗方案)致敏后12天，如下處置大鼠。使用口腔氣管(orotracheal)滴注，分別施用(1)0.5ml生理鹽水(對照)；(2)500μg裸誘餌/0.5ml；(3)200μg用HVJ-E 1.0×104HAU處理的誘餌/0.5ml；(4)500μg用HVJ-E 2.5×104HAU處理的誘餌/0.5ml HVJ-E；(5)HVJ-E 2.5×104HAU/0.5ml。在第14天，用5％氣溶膠化的卵清蛋白利用噴霧器(PARIturbo)激發(fā)5分鐘。氣流速率是7-8升/分鐘。結果誘導產生了氣道過敏。實驗方案的流程圖示于圖1。
(導入誘餌)經鼻吸入(用氣溶膠)或插管(液體、氣溶膠、呼吸器)向大鼠施用誘餌。
第一個實驗中，如下施用誘餌2mg×1次、1mg×2次或2mg×2次(氣溶膠)或0.5mg×1次(液體給藥)。
第二個實驗中，如上述用HVJ-E制備誘餌并施用。
(支氣管肺泡灌洗(BAL))卵清蛋白激發(fā)后24小時收集BAL液。腹膜內注射超劑量戊巴比妥鈉對大鼠實施安樂死。用5ml磷酸鹽緩沖液(PBS；137mM NaCl，10mM磷酸鈉緩沖液pH7.4，2.7mM KCl)實施BAL 4次。用血細胞計數(shù)器確定BAL液中的細胞總數(shù)。通過用Diff-Quick染料(IBMC Inc.，Chicago，ILCatalog# K7124)計數(shù)300余個細胞來實施差異細胞計數(shù)。
(結果)圖2顯示第一次實驗中BAL中嗜酸性粒細胞百分比的表現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)卵清蛋白激發(fā)引起嗜酸性粒細胞數(shù)的統(tǒng)計學顯著增加(p＜0.01)。激發(fā)以后進行氣溶膠處理或液體處理。作為結果，在每種情況下，嗜酸性粒細胞增加被統(tǒng)計學顯著的抑制(每組p＝0.08)。因此，證明了本發(fā)明誘餌對引起嗜酸性粒細胞異常的疾病如哮喘等是有效的，與給藥方法無關。
圖3顯示使用仙臺病毒作為另一種給藥方法時本發(fā)明誘餌的效果。卵清蛋白激發(fā)后用上述HVJ-E誘餌藥方進行處理。結果，HVJ-E誘餌具有比裸誘餌顯著更高的效果(見圖4)。具有2.5倍量的HVJ-E制劑具有統(tǒng)計學顯著更高的治療效果。證明這種HVJ-E效果不是由于載體自身。因而本發(fā)明中證明HVJ-E制劑有更高治療效果。
(實施例3用變體治療)接下來，代替上述實施例中使用的誘餌，在哮喘模型大鼠中使用誘餌變體。確認是否能用誘餌變體獲得相同效果。此處，使用NF-κB的共有序列5′-GGG(A/G)(C/A/T)T(T/C)(T/C)(C/A/T)C-3′(SEQ ID NO3)作為變體。因此證明任何被NF-κB識別的序列都可用于治療和預防受NF-κB調節(jié)的基因表達引起的疾病、障礙和/或病癥，和嗜酸性粒細胞異常引起的疾病、障礙和/或病癥。
除了使用不同誘餌，按上述實施例進行相同實驗。對于主動脈瘤或哮喘，已經證明表現(xiàn)出治療和預防效果。因此，本發(fā)明不限于特定NF-κB誘餌。已經證明，只要保持生物活性(即結合轉錄因子序列的活性)，任何變體NF-κB誘餌都具有相同治療和預防效果。
(實施例4NF-κB誘餌對大鼠哮喘模型的效果)接下來，闡明NF-κB對大鼠哮喘模型的效果。在本實施例中，施用裸NF-κB誘餌的粉末吸入劑。
(制備NF-κB誘餌粉末吸入劑)NF-κB(100mg)與18g氧化鋯珠(直徑3.0mm)一起位于透明玻璃容器中(大小25.5mm，高48.5mm)，并以200rpm在球磨旋轉搖床(Asahi Rika)上研磨10小時。
將乳糖(50g，產品名Pharmatose 450M，得自DMV)在噴射磨(產品名A-O噴射磨，得自Seishin Enterprise)中研磨。
為確定由此獲得的NF-κB誘餌和乳糖的大小，使用掃描電子顯微鏡(S-570，得自HITACHI)觀察。結果示于圖5(NF-κB誘餌)和圖6(乳糖)。照片放大倍數(shù)是×1000，每個顆粒的大小小于10μm。
通常認為使用10μm或更小施用于氣管是理想的，但本發(fā)明不限于此。此外，已知使用3μm或更小的那些允許施用到肺泡中。
研磨后NF-κB誘餌(100mg)、研磨后乳糖(3700mg)和輕無水硅酸(Aerosil 200，得自Japan Aerosil Inc.；200mg)在小研磨器(Shibata Kagaku Inc.制造)中混合1分鐘，得到NF-κB誘餌混合物粉末(25μg/mg)。
NF-κB誘餌混合物粉末(25μg/mg；1000mg)、研磨后乳糖(2850mg)和輕無水硅酸(150mg)在小研磨器中混合1分鐘，得到NF-κB誘餌混合物粉末(6.25μg/mg)。
NF-κB誘餌混合物粉末(6.25μg/mg；800mg)、研磨后乳糖(3040mg)和輕無水硅酸(160mg)在小研磨器中混合1分鐘，得到NF-κB誘餌混合物粉末(1.25μg/mg)。
NF-κB誘餌混合物粉末(25μg/mg；400mg)、研磨后乳糖(3420mg)和輕無水硅酸(180mg)在小研磨器中混合1分鐘，得到NF-κB誘餌混合物粉末(2.5μg/mg)。
NF-κB誘餌混合物粉末(2.5μg/mg；400mg)、研磨后乳糖(3420mg)和輕無水硅酸(180mg)在小研磨器中混合1分鐘，得到NF-κB誘餌混合物粉末(0.25μg/mg)。
NF-κB誘餌混合物粉末(0.25μg/mg；800mg)、研磨后乳糖(3040mg)和輕無水硅酸(160mg)在小研磨器中混合1分鐘，得到NF-κB誘餌混合物粉末(0.05μg/mg)。
(實驗步驟)向雄性BN大鼠股肌施用抗原卵清蛋白OA(1mg/大鼠)，并向腹腔施用百日咳博代氏菌(Bordetella pertussis)(1.25×1010/大鼠)并主動致敏。致敏后12或13天，麻醉下吸入鹽水中的0.5％抗原，并產生變態(tài)反應。吸入抗原3天后，研究氣道對乙酰膽堿(ACh)的反應性。用兩分鐘間隔吸入評價氣道對ACh的反應性。每次吸入進行10秒，而濃度從0.1mg/nl每次依次加倍。從吸入ACh開始氣道壓力增加5cmH2O時的ACh濃度計算為激發(fā)濃度(Provocation Concentration)5cmH2O(PC5cmH2OACh)ACh(mg/mL)。確定氣道反應性以后，進行氣道洗滌，并計算浸潤到氣道中的細胞數(shù)。作為陰性對照，準備致敏大鼠吸入鹽水的組和致敏大鼠吸入抗原與溶劑的對照組。
此外，在吸入抗原之前3天，4克由前述方法制備的NF-κB誘餌混合物粉末(0.05、0.25、1.25和6.25μg/mg)在麻醉下被大鼠吸入。本實施例中所用BN大鼠的平均體重是200g，因而NF-κB誘餌的劑量分別是1μg/kg、5μg/kg、25μg/kg和125μg/kg。
(實驗結果)如圖7和8所示，(圖7和8NF-κB誘餌在大鼠哮喘模型中的效果。圖例如下##p＜0.01vs鹽水組(學生t-檢驗)；*，**分別表示p＜0.05，0.01vs對照組(Dunnett’s多重比較檢驗))，與鹽水對照組比較，觀察到在對照組中氣道反應性(氣道超敏性)和主要由嗜酸性粒細胞組成的炎癥細胞的浸潤明顯增強。NF-κB誘餌以劑量依賴的方式從5μg/kg開始抑制這些變化，在25和125μg/kg達到最大抑制。這闡明了NF-κB誘餌粉末吸入劑在大鼠哮喘模型中的療效。
表2大鼠哮喘模型附表



(實施例5NF-κB誘餌對變應性鼻炎模型的效果)本實施例證明NF-κB誘餌對大鼠鼻炎模型的效果。
(實驗方法)抗原2，4-二硝基苯基卵清蛋白(DNP-OA)(1mg/大鼠)和百日咳博代氏菌(1.25×1010)皮給予雄性SD大鼠四肢的足墊上，進行主動致敏。致敏后9天，施用抗原到兩側鼻中(10％DNP-OA×0.02mL/位點×2位點)，由此引起變態(tài)反應。發(fā)生鼻炎后6小時，靜脈注射施用染料(Pontamin Sky-Blue)，處理后9小時當觀察到峰值時解剖所述對象。取出鼻中隔周圍的組織并測定染料泄漏水平。準備向致敏大鼠鼻中給予鹽水的陰性對照組和向致敏大鼠鼻中給予抗原與溶劑的對照組。以5和125μg/mL濃度將NF-κB誘餌溶解于鹽水，之前3天每側鼻孔中滴入20μL，使得劑量分別是0.2μg和5μg。本實施例使用的SD大鼠的平均體重是200g，因而NF-κB誘餌的劑量分別是1μg/kg和25μg/kg。
(實驗結果)圖9的圖例如下##p＜0.01vs鹽水組(學生t-檢驗)；*，**分別表示p＜0.05，0.01vs對照組(Dunnett’s多重比較檢驗)。如圖9所示，其中顯示NF-κB誘餌在大鼠鼻炎模型中的效果，與陰性對照(鹽水)組比較，觀察到陽性對照組的血液滲透性明顯增強，因此可以確認出現(xiàn)鼻炎癥狀。另一方面，NF-κB以體積依賴的方式從1μg/kg開始抑制血液滲透性增強，并在25μg/kg顯示基本完全抑制血液滲透性增強。由此證明了NF-κB誘餌在大鼠鼻炎模型中的療效。
表3鼻炎附表NF-kB

(實施例6制備比格犬COPD模型)皮下注射動物麻醉劑(Selactal，Bayer)麻醉比格犬(體重9-14kg)。以氣管內管的方式將支氣管鏡插入氣管中。豬胰彈性蛋白酶(50mg；3750單位，得自NacalaiTesque)溶于5ml鹽水，并將霧化導管(得自Olympus等)插入周圍氣管并分散到整個右肺5到10次。分散后約1個月過去后用作COPD模型肺。左肺用作正常肺進行比較。
(實施例7向比格犬模型施用NF-κB誘餌)根據(jù)實施例4的方法研磨NF-κB誘餌來制備粒徑為3μm或更小的微粒粉末。
作為NF-κB誘餌混合粉末以擴散方式用支氣管鏡進入整個右肺中5到10次，從而將NF-κB(200μg)分散入COPD模型肺中。為觀察NF-κB誘餌治療前后之間的變化，用MRI測量血流并比較。
(比較MRI結果)MRI用于準備全身麻醉后比格犬的仰臥位照片。在右頸內動脈中確認靜脈途徑并注射常用造影劑，約3秒后對肺內血管進行造影。由于造影作用，MRI信號強度已被增強。MRI信號強度依賴于血流，因而血流越多，信號越強。由于肺動脈血液體積之間的個體差異，為消除這些個體差異，接受給藥的右肺的MRI信號值除以正常左肺的值，用于左側和石側之間的比較。注射3ml常規(guī)造影劑后開始成像。對于注射造影劑后約120秒，拍照100個圓截面并連續(xù)測量和分析限于肺實質的截面的信號值。還計算MRI肺內血流體積的左右比值。基于這些結果，測量左右信號值的比值，觀察到正常犬中左右肺沒有區(qū)別，而在COPD模型中右肺血流降低，NF-κB誘餌治療模型中血流被改善，并接近正常狀態(tài)。也就是說，認識到施用NF-κB誘餌提供顯著的血流改善。
盡管此處已經描述某些優(yōu)選實施方案，除了所附權利要求列出的以外，不應理解為這些實施方案是對本發(fā)明范圍的限制。在閱讀用具體和優(yōu)選的實施方案在此處的說明以后，根據(jù)本領域的普通知識，本發(fā)明的各種其它修飾和等價物對于本領域技術人員將是顯而易見的，并可由他們容易的實現(xiàn)。本文引用的所有專利、公開的專利申請和出版物通過引用并入，就像全文在本文中列出一樣。
工業(yè)實用性藥物組合物或載體用于治療疾病，所述疾病與受NF-κB調節(jié)的基因表達或嗜酸性粒細胞異常引起的疾病相關。局部施用本發(fā)明的藥物組合物是非侵入性的，并可以重復提供。
序列表<110>安琪士多摩奇株式會社森下龍一青木元邦荻原俊男川崎富夫牧野寬史肉倉孝小柳晶裕<120>含NF-KB誘餌的用于治療和預防呼吸疾病的藥物組合物及其使用方法<130>AN011-1PCT<150>PCT/JP03/08740<151>2003-07-09<160>3<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>誘餌<400>1ccttgaaggg atttccctcc 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>誘餌<400>2ttgccgtacc tgacttagcc 20<210>3<211>10<212>DNA<213>人工的<220>
<223>誘餌<400>3gggrhtyyhc10
權利要求
1.一種藥物組合物，其用于治療和/或預防由受NF-κB調節(jié)的基因表達引起的呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥，包含NF-κB誘餌和藥學上可接受的載體。
2.根據(jù)權利要求1的組合物，其中所述NF-κB誘餌是NF-κB誘餌或其衍生物、變體或片段，并且所述衍生物、變體或片段具有生物活性。
3.根據(jù)權利要求1的組合物，其中所述NF-κB誘餌是SEQ ID NO1列出的誘餌。
4.根據(jù)權利要求1的組合物，其中所述呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥是氣道炎性疾病、氣道狹窄或鼻腔炎性疾病。
5.根據(jù)權利要求1的組合物，其中所述呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥是COPD、哮喘或鼻炎。
6.根據(jù)權利要求1的組合物，其中所述呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥是COPD。
7.根據(jù)權利要求1的組合物，其中所述呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥是哮喘。
8.根據(jù)權利要求1的組合物，其中所述呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥是鼻炎。
9.根據(jù)權利要求1的組合物，其中所述藥學上可接受的載體是親水聚合物、碳水化合物或不溶性添加劑。
10.根據(jù)權利要求1的組合物，其中所述藥學上可接受的載體是選自脂質體、乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇和木糖醇的至少一種類型。
11.一種組合物，其用于治療和/或預防與嗜酸性粒細胞異常相關的呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥，包含NF-κB誘餌和藥學上可接受的載體。
12.根據(jù)權利要求11的組合物，其中所述NF-κB誘餌是NF-κB誘餌或其衍生物、變體或片段，并且所述衍生物、變體或片段具有生物活性。
13.根據(jù)權利要求11的組合物，其中所述NF-κB誘餌是SEQ ID NO1列出的誘餌。
14.根據(jù)權利要求11的組合物，其中所述呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥是氣道炎性、氣道狹窄性或鼻腔炎性疾病、障礙和/或病癥。
15.根據(jù)權利要求11的組合物，其中所述呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥是COPD、哮喘或鼻炎。
16.根據(jù)權利要求11的組合物，其中所述呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥是哮喘或鼻炎，所述哮喘選自支氣管哮喘、小兒哮喘、變應性哮喘、特應性哮喘、類固醇抵抗型哮喘、非變應性哮喘、內因性哮喘、外因性哮喘、阿司匹林哮喘、心臟性哮喘和感染性哮喘；所述鼻炎選自變應性鼻炎、花粉病、急性鼻炎、慢性鼻炎、肥大性鼻炎、慢性竇炎(積膿癥)和鼻中隔偏移。
17.根據(jù)權利要求11的組合物，其中所述藥學上可接受的載體是親水聚合物或碳水化合物。
18.根據(jù)權利要求11的組合物，其中所述藥學上可接受的載體是選自脂質體、乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇和木糖醇的一種或多種。
19.一種適于施用于呼吸系統(tǒng)的呼吸系統(tǒng)制劑，包含根據(jù)權利要求1-18中任意一項的組合物。
20.根據(jù)權利要求19的制劑，其中所述施用于呼吸系統(tǒng)包含施用于氣道內或經氣道吸收。
21.根據(jù)權利要求19的制劑，其中所述施用于氣道是經霧化或吸入施用于氣道。
22.根據(jù)權利要求19的制劑，其中所述施用于氣道包含經定量噴霧式吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)或噴霧器施用。
23.根據(jù)權利要求19的制劑，其中所述組合物以干粉提供。
24.根據(jù)權利要求23的制劑，其中所述干粉是經選自下組之一的方式生產的微粒球磨、珠磨、噴射磨、ultimaizer、研缽、石磨、噴霧干燥和超臨界流體。
25.根據(jù)權利要求23的制劑，其中所述干粉的氣體動力學平均粒徑為約0.01值至約50微米。
26.根據(jù)權利要求23的制劑，其中所述干粉的氣體動力學平均粒徑為約0.05至約30微米。
27.根據(jù)權利要求23的制劑，其中所述干粉的氣體動力學平均粒徑為約0.1至約10微米。
28.根據(jù)權利要求19的制劑，其中提供的每輪劑量是10μg-100mg。
29.根據(jù)權利要求19的制劑，其中提供的每輪劑量是50μg-50mg。
30.根據(jù)權利要求19的制劑，其中提供的每輪劑量是10mg或更少。
31.根據(jù)權利要求19的制劑，其中所述施用于呼吸系統(tǒng)包含經鼻吸收。
32.根據(jù)權利要求31的制劑，它是選自滴鼻劑、噴鼻劑、噴霧劑、呼吸器用劑和粉末給藥制劑的制劑。
33.根據(jù)權利要求31的制劑，它是用于鼻炎的滴鼻劑。
34.根據(jù)權利要求19的制劑，其中NF-κB誘餌包封在HVJ-E囊膜載體中。
35.根據(jù)權利要求19的制劑，其中所述施用于呼吸系統(tǒng)包含施用于肺。
36.治療呼吸系統(tǒng)的裝置，包含根據(jù)權利要求1-18中任意一項的組合物，以及將所述組合物施用于呼吸系統(tǒng)的器具。
37.根據(jù)權利要求36的裝置，其中所述施用于呼吸系統(tǒng)的器具包含選自下組的器具用于向肺給藥的器具、用于經氣道給藥的器具、用于經氣道吸收的器具和用于經鼻吸收的器具。
38.根據(jù)權利要求36的裝置，其中用于向氣道給藥的器具包含定量噴霧式吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)或噴霧器。
39.制造包含NF-κB誘餌的顆粒的方法，包括以下步驟A)提供所述誘餌和藥學上可接受的載體；B)將所述誘餌和載體干燥并加熱到足以造粒的溫度；和C)獲得具有預期顆粒大小的顆粒。
40.根據(jù)權利要求39的方法，其中所述溫度是50攝氏度或更低。
41.根據(jù)權利要求39的方法，其中所述溫度是100攝氏度或更低。
42.根據(jù)權利要求39的方法，其中所述干粉的氣體動力學平均粒徑為約0.01至約50微米。
43.根據(jù)權利要求39的方法，其中所述干粉的氣體動力學平均粒徑為約0.05至約30微米。
44.根據(jù)權利要求39的方法，其中所述干粉的氣體動力學平均粒徑為約0.1至約10微米。
45.治療和/或預防由受NF-κB調節(jié)的基因表達引起的呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥的方法，包括以下步驟A)向對象的呼吸系統(tǒng)施用含NF-κB誘餌和藥學上可接受載體的組合物。
46.根據(jù)權利要求45的方法，其中所述呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥是氣道炎性疾病、氣道狹窄或鼻腔炎性疾病。
47.根據(jù)權利要求45的方法，其中所述呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥是COPD、哮喘或鼻炎。
48.根據(jù)權利要求45的方法，其中所述施用于呼吸系統(tǒng)包含施用于氣道內或經氣道吸收。
49.根據(jù)權利要求45的方法，其中所述施用于呼吸系統(tǒng)是經霧化或吸入施用于氣道。
50.根據(jù)權利要求45的方法，其中所述施用于氣道包含經定量噴霧式吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)或噴霧器施用。
51.根據(jù)權利要求45的方法，其中所述施用經選自滴鼻劑、噴鼻劑、噴霧器、呼吸器和粉末給藥的方式實現(xiàn)。
52.治療和/或預防由嗜酸性粒細胞異常引起的呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥的方法，包括以下步驟A)向對象的呼吸系統(tǒng)施用含NF-κB誘餌和藥學上可接受載體的組合物。
53.NF-κB誘餌在制造用于治療和/或預防由受NF-κB調節(jié)的基因表達引起的呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥的藥物方面的用途。
54.NF-κB誘餌在制造用于治療和/或預防由嗜酸性粒細胞異常引起的呼吸系統(tǒng)疾病、障礙和/或病癥的藥物方面的用途。
全文摘要
藥用組合物，用于治療和預防由受NF－κB調節(jié)的基因表達引起的氣道炎性、氣道狹窄性或鼻腔炎性疾病、障礙和/或病癥，該組合物含有NF－κB誘餌和藥學上可接受的載體。以上疾病可以是哮喘、COPD或鼻炎。而且以上疾病可以是由嗜酸性粒細胞異常引起的疾病(例如，哮喘、鼻炎和COPD)。所述藥學上可接受的載體可以是親水聚合物、脂質體等。
文檔編號A61K47/10GK1819845SQ200480019698
公開日2006年8月16日 申請日期2004年7月9日 優(yōu)先權日2003年7月9日
發(fā)明者森下龍一, 青木元邦, 荻原俊男, 川崎富夫, 牧野寬史, 肉倉孝, 小柳晶裕 申請人:安琪士摩奇株式會社