專利名稱：編碼纖維母細胞生長因子的質粒用于治療與高膽固醇血癥或糖尿病相關的血管生成缺陷的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及編碼纖維母細胞生長因子質粒的應用，其作為預防和治療與高膽固醇血癥(hyperchelesterolemia)或糖尿病(diabetes)相關的心肌或骨骼血管生成缺陷的治療藥物。本發(fā)明也涉及用于患有高膽固醇血癥或糖尿病的哺乳動物受試者，增強其心肌和骨骼的缺血組織的側支血管和小動脈生成的方法。本發(fā)明進一步涉及促進缺血心肌或骨骼組織中的側支血管生成的方法，該方法不誘導VEGF-A因子表達，也不引起被治療肌肉的水腫。
背景技術：
血管形成一個起于并止于心臟的閉合的供血系統(tǒng)，包括三類主要的血管種類，即動脈、毛細血管和靜脈。隨著心臟搏動，血液由心室被壓入大動脈。大動脈分支成為中等大小的動脈，這些動脈分支成為更小的動脈，將血液輸送到身體各部分。動脈一次又一次分支，直至達到最小的分支，即小動脈。當小動脈進入組織中，它們分支成為微觀的血管，稱為毛細血管，其位置在組織細胞附近。毛細血管壁很薄。氧氣和營養(yǎng)物質離開毛細血管里的血液，進入組織細胞，二氧化碳和其他廢物離開細胞，進入毛細血管中的血液。毛細血管在離開組織之前匯聚形成較小的靜脈，稱為小靜脈。小靜脈匯聚逐漸形成更大的靜脈，最后回流入將血液返回心臟的大靜脈。
除毛細血管外，所有血管的管壁都由3層組成，其環(huán)繞著管腔。內襯管腔的最內側的一層稱為內膜，主要由內皮細胞組成。中間的一層，即中膜，主要由環(huán)形排列的平滑肌細胞組成。血管壁最外側的一層，即外膜主要由彈性纖維和膠原纖維構成，它們保護血管并使血管錨著于周圍結構。外膜有神經(jīng)纖維穿過，而且較大的動脈和靜脈中還有微小的血管系統(tǒng)穿過。
小動脈是最小的動脈，其管腔直徑小于50um。小動脈的管壁由內膜和環(huán)繞內膜的含有散在的平滑肌纖維的中膜組成。小動脈調節(jié)由動脈到毛細血管的血液流量。在小動脈壁進行血管收縮過程中，流入毛細血管的血流受限，由該小動脈供血的組織可能暫時被繞過。小動脈壁進行血管舒張時，流入毛細血管的血流顯著增加。
相反，毛細血管管壁極薄，只包含一層內皮細胞，只具有內膜。它們形成了廣泛的網(wǎng)絡，遍及全身幾乎所有的組織，幾乎靠近幾乎全身每一個細胞。毛細血管的平均管腔直徑是0.01mm(10μm)，大小僅夠紅細胞以單列滑過。極薄的血管壁對于毛細血管的作用非常適合，即與身體細胞交換營養(yǎng)物質，氧氣以及廢物。
側支血管對于器官的供氧起著重要作用，特別是在脈管系統(tǒng)正常是，疾病導致氧氣供應不足時。側支血管可以作為預存的血管，正常情況下血流很少或沒有。正常血管的急性閉塞(如，大動脈血栓)可以引起血管床內壓力重新分配，因而使側支血管中產(chǎn)生血流。側支血管在冠脈和骨骼肌(如，人類腿部)的循環(huán)中尤其重要。在心臟中，側支血管可以協(xié)助給心外膜動脈狹窄或閉塞導致的缺血區(qū)域提供血流。側支血流是限制梗死面積的重要機制。側支血管的形成是治療性的血管生成中觸發(fā)的。
血管生成是復雜的過程，涉及內皮細胞增生、基底膜分解、遷移通過周圍基質，以及排列、分化為管狀結構以形成血管壁，從而形成新的毛細血管網(wǎng)。
動脈生成是指長出側支小動脈，這也被認為是恢復血流灌注的最有效過程，因為與毛細血管網(wǎng)相比這些血管容量更高(Carmeliet et al.，Nat.Med.，2000；6389-395；Van Royen et al.，Cardiovasc.Res.，2001；49543-553)。在作用效果方面，可以認為小動脈是成熟的健全的功能性血管，因為它具有內膜和中膜，即由一層平滑肌細胞支撐一層內皮細胞。小動脈形成是長期有效的新生血管化的優(yōu)選形式。
與血管內皮功能異常有關的病理狀態(tài)包括高膽固醇血癥，該疾病的特征有異常血管形成、組織灌注調節(jié)受損、血流空間分配異常以及微血管功能異常。而且，血管生長的動力學以及由此產(chǎn)生的血管的性質也與正常組織中不同。這些改變可能是血管內皮受損的結果，表現(xiàn)為信號轉導的減少；L精氨酸可利用性減少；eNOS表達減少；來源于吞噬細胞其他炎癥細胞的superoxyde陰離子使得NO滅活增加；某些血管收縮因子如內皮縮血管肽的釋放；以及平滑肌血管反應。在患有高膽固醇血癥的受試者中，動脈壁的毛細血管密度及分布發(fā)生了明顯的變化。最后，它們表現(xiàn)為密集的外膜微血管叢，具有顯著的不規(guī)則性。據(jù)信這是由于可以引起血管生成反應增強或減弱的不同刺激所導致的。人類的高膽固醇血癥引起血管內皮功能異常，最終導致主要動脈的進行性狹窄。在靜息時和應激時的冠狀動脈血流不平衡產(chǎn)生隱匿的肌肉功能不良，導致疼痛和收縮力低。通常在靜息時血供正常，但當發(fā)生應激時，需求增加而由于動脈阻塞性病變導致血供不能增加。因此為了達到模仿該人類的病理過程的目的，不僅要在例如主要冠狀動脈中建立狹窄，而且使用應激試驗來顯示應激時由此狹窄產(chǎn)生的不平衡。也已知I型和II型糖尿病患者中血管功能的特征是內皮依賴的舒張功能受損。糖尿病的特征是提早發(fā)生微血管和大血管疾病(Kannel et al.，Diabetes Care，1979，2412035-2038)。因此，患有外周動脈疾病(PAD)，外周動脈阻塞性疾病(PAOD)或冠心病(CAD)的患者中，高膽固醇血癥、糖尿病和高血壓所致的如此嚴重的內皮損傷和異常是否能使用治療性的血管生成來挽救尚無定論。
已有提議使用給予某些血管生成因子，如VEGF，aFGF及bFGF，HIF-1α/VP16和TGF-3來促進側支血管，即治療性的血管生成來治療缺血性心血管疾病和外周缺血性疾病。但是，對多種細胞類型的潛在多向效應可能使其中某些化合物的治療可用性受到限制。例如，VEGF-A是最強的備選血管生成因子之一。但是VEGF-A曾有引起水腫和產(chǎn)生無序、曲折而易滲漏的血管，這種血管與腫瘤中發(fā)現(xiàn)的血管很類似(Lee et al.，Circulation2000，102898-901；Springer et al.，Mol Cell，1998，2549-559).。
治療性的血管生成有兩種不同策略。蛋白治療是一種可能的選擇，涉及將生長因子直接遞送到缺血組織。血管生成基因治療是另外一種可能的選擇，目的是通過將核酸轉移到體細胞，促進側支血管生成并糾正灌注缺損以及相關的缺血(8-10)。
動物試驗顯示，許多生長因子都有局部的血管生成效果，包括例如，重組人VEGF，重組PDGF或重組FGF。但是，重組的蛋白遞送以及全身給予大劑量的重組蛋白會導致多種其他不良副反應。而且，所需的重組蛋白的量很重要。如果使用了過多的蛋白，會導致形成無序的血管床和雜亂的血管生成(promiscuous angiogenesis)。
已研究通過給予核酸的治療性血管生成，所述核酸可以以裸露形式和經(jīng)由脂質體和病毒載體表達血管生成蛋白。用病毒載體傳遞編碼血管生成的序列允許高效遞送，但具有許多與使用病毒載體相關的缺點，如免疫反應的產(chǎn)生以及整合和播散的可能性。例如，1999年9月，賓夕法尼亞大學的Jesse Gelsinger接受了表達正確形式的人的烏氨酸轉氨甲酰酶的、E1和E4缺失的重組腺病毒的肝內動脈輸注后死亡，此后腺病毒基因治療方法遭到置疑。病理分析顯示死亡的正式原因是由于全身應用腺病毒引發(fā)的全身性炎癥反應，導致了成人呼吸窘迫綜合癥，繼發(fā)出現(xiàn)多器官功能衰竭。最近，一項意在治療患有嚴重聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)的兒童的試驗報道了兩例由于使用逆轉錄病毒作為載體而導致白血病的病例。
包含編碼血管生成多肽的DNA的脂質體和裸露DNA也有一個主要缺點，即轉移效率較病毒低，難以達到要取得治療效果所必需的蛋白水平。
關于裸DNA策略，有結果出出人意料地顯示給患有終末期外周動脈阻塞性疾病(PAOD)的患者肌內注射NV1FGF，即編碼酸性纖維母細胞生長因子或1型纖維母細胞生長因子(FGF-1)的質粒，可以滿足安全方面的要求。Camerota等人(J Vasc.Surg.，2002，35，5930-936)描述了51名不可重建的終末期PAD患者，他們都伴有靜息時疼痛或組織壞死，對缺血的前腿或后腿經(jīng)肌內注射單次或重復給予劑量漸增的NV1FGF。隨后評價各種參數(shù)，如經(jīng)皮氧分壓、踝及趾的肱指數(shù)、疼痛評分和潰瘍的愈合情況。觀察發(fā)現(xiàn)給予NV1FGF后，肱指數(shù)顯著增加，疼痛減輕，潰瘍面積縮小而且灌注改善。
也證實了下肢缺血患者中的VEGF基因轉移誘導的血管生成。在患不可治愈的缺血性潰瘍和/或由于外周動脈疾病導致靜息時疼痛的患者中，編碼VEGF-165同種型的裸露質粒DNA被給予缺血的肌肉。治療8周后血管造影可以觀察到有新生成的側支血管和灌注改善，也可觀察到毛細血管。但是，在治療后5至6周時也可以觀察到血清VEGF水平有顯著的提高(Isner etal.，Lancet，1996；348370-4)。這種血清VEGF水平的提高可以引起紊亂的有害血管生成，產(chǎn)生嚴重不良副反應如水腫(26)。
Vincent等人(Circulation，2000；102(18)2225-61)報道編碼低氧誘導的因子Ia(HIF-1a)轉錄因子的裸露DNA質粒的給藥與后腿血壓比值、血管生成評分、局部血流和毛細血管密度的顯著增加有關。但是，也有報道HIF-1a活化了內源性VEFG基因的表達，提示VEGF途徑依賴的血管生成的增強以及體內的數(shù)個靶點。
Taniyama等人(Gene Therapy，2001，8181-189)進一步報告了在大鼠和兔的缺血性后肢模型中使用肌內注射編碼了人肝細胞生長因子(HGF)的DNA質粒的方式的治療性血管生成。用血管造影鑒定側支血管的增加，用堿性磷酸酶做內皮細胞的標記物顯示毛細血管密度。HGF最初曾作為肝細胞的促細胞分裂劑，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)它是某一類細胞的促細胞分裂劑，包括黑色素細胞、腎小管細胞、角化細胞以及某些內皮細胞和上皮起源的細胞(Matsumoto et al.，BBRC，1991，17645-51)。HGF也能激活內皮細胞的生長而不伴隨血管平滑肌細胞的復制(Nakamura et al.，Hypertension，1996；28409-413；Hayashi et al.，BBRC，1996；220539-545)。最后，還發(fā)現(xiàn)HGF也可以起到“分散因子(scatter factor)”的作用，具有促進上皮細胞和血管內皮細胞分離的活性(Giordano et al.，PNAS，1993，90649-653)。因此，公知HGF參與了腫瘤的形成。
相反，經(jīng)過證實，給予編碼酸性纖維母細胞生長因子(aFGF或FGF-1)的質粒不會增加FGF-1的血清水平，因此顯示出在安全性方面，使用這種表達人FGF-1的質粒具有顯著的優(yōu)勢，因為沒有無序血管生成或不良副反應。沒有循環(huán)的FGF-1，是優(yōu)于其他血管生成因子例如，VEGF或FGF-2的一個顯著優(yōu)勢，據(jù)稱后者都有滲漏入循環(huán)中導致遠端水腫(Baumgartner etal.，Circulation，1998，971114-23)。
纖維母細胞生長因子(FGF)家族包括至少23種結構上相關的蛋白(FGF1-23)，其中最為人所熟悉的是FGF-1，F(xiàn)GF-2，F(xiàn)GF-4，F(xiàn)GF-7和FGF-9。該家族的成員可以刺激來源于中胚層和神經(jīng)外胚層的大多數(shù)細胞進行晚期有絲分裂，并影響其他生物學過程，包括血管生成、神經(jīng)軸突延伸、成骨細胞生長、神經(jīng)元存活以及成肌細胞分化。一般而言，F(xiàn)GF對肝素具有高親和性。在它們的術語命名尚未確定之前，某些FGF被稱為肝素結合性生長因子-1，-2等等，而且有許多是纖維母細胞的促細胞分裂劑，但并非全部如此。FGF家族的成員在核心序列中有約25-55％的氨基酸序列同一性，而某些FGF之外有明顯延伸，可能在C端、N端或兩者均有。這種結構同源性提示，編碼已知FGF的不同基因可能都來源于相同的祖基因。
除FGF家族的已知的23種成員之外，因為同一基因產(chǎn)生幾種FGF分子形式而導致了另外的復雜性。例如，aFGF(FGF-1)的初級翻譯產(chǎn)物包含155個殘基。但是，天然來源(如牛腦)的FGF-1最長的形式包含154個殘基。這一154個殘基形式的FGF-1較155個殘基的形式缺失了NH2端蛋氨酸，而具有乙?；被┒?。體內或純化過程中的蛋白水解過程會產(chǎn)生FGF-1的較小活性形式，其中缺失了氨基末端的15個(des 1-15)或21個(des 1-21)氨基酸。按照本文定義，F(xiàn)GF-1是指154個殘基的FGF-1及它的稍短的生物學活性形式，如上文所述缺失氨基末端的15個(des 1-15)或21個(des 1-21)氨基酸的形式。過去FGF-1的154個殘基的形式稱為β內皮細胞生長因子(3-ECGF)，des 1-15的形式稱為aFGF或FGF-1，des 1-21的形式稱為alpha-ECGF。在這一組生長因子的術語尚未標準化之前，曾將這些蛋白冠以某些其他命名，包括眼源性生長因子和肝素結合性生長因子1。bFGF(FGF-2)的類似形式也有描述。除裂解的形式之外，還描述了bFGF的擴展形式，這是由于在ATG翻譯起始密碼子上游的幾個不同的GTG密碼子開始翻譯，產(chǎn)生了155個殘基的bFGF形式。所有這些FGF的不同形式都包含結構同源的核心區(qū)，這是FGF家族的特征。各種FGF分子中有許多已被分離出來，用于各種心肌缺血的動物模型，產(chǎn)生了不同的而且通常相反的結果。
體內試驗提示了FGF-1的血管生成活性(Comerota et al.，J.Vasc.Surg.，2002，35，5930-936)。肌內注射表達FGF-1的質粒，顯示灌注改善，依據(jù)為踝的肱指數(shù)升高、疼痛緩解和經(jīng)皮氧分壓升高。
申請者吃驚地發(fā)現(xiàn)，肌內注射表達FGF-1的質粒不會在血管內皮細胞中誘導VEGF，因此可以作為非常安全的血管生成療法，而與其他血管生成因子包括其他FGF因子、VEGF、HIF-1a/VP16和HGF不同。
大多數(shù)治療性血管生成研究都在肢體缺血的動物模型中進行確證，用正常的健康動物進行試驗，而很少研究它們對于高膽固醇血癥或糖尿病背景中的血管生成缺陷的逆轉能力，在前述情況下內皮功能顯著受損。
在這一點上，在接受了股動脈切除的高膽固醇血癥的兔模型進行試驗時，已知的治療性血管生成還未被令人信服地證實，因為給予VEGF后觀察到側支血管形成受損和毛細血管密度被部分逆轉(26)。此外，在糖尿病模型中檢測時，治療性血管生成也未被令人信服地證實，如Roguin A.等人(Cardiovascular Diabetology 2003，218)發(fā)現(xiàn)，在糖尿病性缺血的小鼠中，使用表達VEGF的質粒，不能提高血流，也不能促進側支生成。
相反，申請者驚訝地發(fā)現(xiàn)，在患有高膽固醇血癥或糖尿病的哺乳動物受試者中，將表達人類FGF-1的質粒經(jīng)肌內注入缺血的心肌或骨骼肌肌內，能夠有效逆轉高膽固醇血癥或糖尿病相關的側支血管缺陷，并促進成熟的血管如小動脈的形成。
此外，申請者發(fā)現(xiàn)與類似的血管生成因子不同的是，表達FGF-1的質粒肌內注射不會引起所治療的骨骼肌或心肌中的水腫，因此在惡化的情況如高膽固醇血癥或糖尿病的背景中可以使用足以挽救缺血肌肉的血管生成缺陷的劑量。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及治療與高膽固醇血癥或糖尿病相關的心肌或骨骼血管生成缺陷的方法，包括將藥物組合物給予受試者，所述藥物組合物中含有載有編碼某種纖維母細胞生長因子的基因的質粒，其劑量可以促進內皮功能異常和血管生成缺陷的逆轉。
本發(fā)明也涉及治療與高膽固醇血癥或糖尿病相關的心肌或骨骼血管生成異?；蛉毕莸姆椒?，包括使用有效量的編碼纖維母細胞生長因子的質粒，其中不會在心肌或骨骼肌中誘導VEGF-A因子表達。
本發(fā)明進一步涉及治療與高膽固醇血癥或糖尿病相關的血管內皮功能不良的方法，其通過將一定量編碼纖維母細胞生長因子的質粒給予骨骼肌或心肌內來進行，其中所述的量足以有效逆轉心肌或骨骼肌的血管生成缺陷，其中不會在這些肌肉中誘導VEGF-A因子表達，也不會發(fā)生水腫。
本發(fā)明還有一個目的，即提供刺激和/或促進在高膽固醇血癥或糖尿病的背景中缺血肌肉中的缺血心肌或骨骼肌組織中成熟側支血管形成的方法，包括在上述受試者的上述組織中注射有效量的編碼纖維母細胞生長因子的質粒，其中不會誘導VEGF-A因子表達，并且/或者不會發(fā)生水腫。
本發(fā)明的另一個目的是提供治療患有高膽固醇血癥或糖尿病的哺乳動物受試者中的缺血疾病諸如PAD，PAOD或CAD的方法，其中不會誘導VEGF因子的表達，也不會引起水腫的形成。
本發(fā)明另一個目的是提供一種方法，用于促進缺血組織中側支血管和小動脈的形成，其中內皮功能受損。
本發(fā)明另一個目的是一種逆轉高膽固醇血癥或糖尿病引發(fā)的血管生成缺陷的方法，其用于需要此類治療的患有高膽固醇血癥或糖尿病的哺乳動物受試者中，且不會誘導VEGF因子的表達。
本發(fā)明另一個目的是提供一種方法，用于促進血管生成的VEGF非依賴途徑。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種促進血管生成的方法，前提是VEGF在所治療細胞中不會被上調。
對于逆轉高膽固醇血癥或糖尿病相關的心肌或骨骼肌的血管生成缺陷，心肌內或肌肉內注射FGF表達的質粒是優(yōu)選的方式。本發(fā)明的實踐中優(yōu)選的纖維母細胞生長因子是FGF-1，而最優(yōu)選的是人類全長FGF-1。
通過結合以下附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行詳細描述以便達到公開的目的，本發(fā)明的其他及進一步目的、特性及優(yōu)點將變得更加清楚。
附圖的簡單描述

圖1為本試驗的設計示意圖。
圖2(A)-(C)代表經(jīng)HES染色后，倉鼠肌肉(股薄肌和內收肌)的橫切面(放大X100倍)；圖2(A)為非缺血(對側)肌肉的橫切面；圖2(B)和(C)是缺血肌肉的橫切面；圖2(B)中的虛線表示輕度壞死的存在；圖2(C)中的箭頭指示中央成核現(xiàn)象(centronucleation)。
圖3(A)-(C)列出典型的血管造影片，其是在LC(A)；HC/21(B)；和HC/28(C)倉鼠的非缺血(左)和缺血(右)后肢中記錄的。
圖3(D)顯示后肢缺血后對側支形成量化得出相應的血管造影評分圖4(A)-(D)顯示用平滑肌α肌動蛋白(SMA)免疫化學法標記的成熟血管的典型橫切面(放大X100倍)，所述血管來自誘導缺血后21天(A和B)或28天(C和D)取下的非缺血(A和C)及缺血(B和D)肌肉(股薄肌和內收肌)。
圖4(E)和(F)圖示肌肉面積和＜50μm的SMA陽性小動脈的定量。空白區(qū)非缺血的后肢；陰影線區(qū)缺血后肢。NS不顯著；**相對于任何組p＜0.01。
圖5(A)和(B)顯示用鹽水(A)或NV1FGF(B)處理的倉鼠的非缺血和缺血下肢的典型的血管造影片。
圖5(C)定量顯示下肢缺血后的側支形成，其通過血管造影評分觀察。
圖6(A)和(B)顯示用鹽水(A)或NV1FGF(B)處理的倉鼠的缺血肌肉(股薄肌和內收肌)的典型的橫切面(放大X100倍)，顯示用平滑肌α肌動蛋白(SMA)免疫化學法標記的成熟血管。
圖6(C)和(D)圖示肌肉區(qū)域和＜50μm的SMA陽性小動脈的定量?？瞻讞l非缺血的下肢；陰影線條缺血下肢。NS不顯著；*p＜0.01；**鹽水組相對于NV1FGF組p＜0.01。
圖7為股后部肌肉(股薄肌和內收肌)的典型照片(放大X100倍)，其中用抗-FGF-1多克隆抗體進行免疫化學染色，所述肌肉取自非缺血(對側)經(jīng)注射的下肢和注射了鹽水(B)或NV1FGF(C)的缺血下肢。箭頭指示免疫反應性纖維，其根據(jù)免疫復合物被染為褐色可以識別。
圖8(A)-(C)為脛前肌(Tibialis Cranialis muscles)的組織學切片，用鼠VEGF抗體染色。(A)注射NaCl的肌肉的切片，肌纖維陽性為馬賽克(mosaic)表現(xiàn)。(B)注射pCOR-CMV-空白的肌肉切片，表現(xiàn)相似。(C)用mVEGF-A多肽吸收抗mVEGF-A抗體后，注射NaCl的肌肉切片。
圖8(D)和(E)為注射pCOR-CMV.大鼠-spFGF-1的脛前肌的連續(xù)組織切片，用mVEGF-A(D)或FGF-1(E)的抗體染色。
圖9A顯示模板，表示患高膽固醇血癥的兔心臟中的13處注射點的位置圖9B為用HES染色的取自患高膽固醇血癥的Watanabe兔的左旋冠狀動脈切片的顯微照片，放大倍數(shù)為X100倍。A外膜；M中膜；箭頭尖端指內膜；箭頭指動脈粥樣硬化斑塊；圖10顯示人類靜息時的心電圖，其根據(jù)人類應激試驗中ST段改變命名(出自Braurwald et al.心臟病學，第5版，p159)。圖10的左側顯示人類靜息時的ECG，右側由上到下為程度逐漸加重的ST段改變，根據(jù)該段的傾斜程度分別為上斜型、水平型和下斜型。最下方顯示的抬高為最嚴重的情況。
圖11A顯示兔在多巴酚丁胺應激試驗中的ECG。
圖11B顯示I導聯(lián)的放大圖。QRS復合波為一個大的垂直的峰，其后清晰可見ST段水平型壓低。
圖12顯示高劑量的多巴酚丁胺時的ECG評分。
圖13A顯示兔靜息時的典型12導聯(lián)ECG。
圖13B顯示同一只兔在最大的應激下的嚴重缺血狀態(tài)。
圖142D超聲心動描計術的命名法示意圖。
圖15顯示在注射NV1FGF后3天，健康兔心的心肌顯微鏡下病灶以及相關的FGF-1表達。HES染色顯示心肌變性和壞死以及活動的慢性炎性反應(A)和相關FGF-1表達(箭頭，B)。背景(*)對應于二級抗體(抗兔)與內源IgG偶聯(lián)。放大倍數(shù)x100。
圖16顯示應激試驗中，將兔用空質粒(灰色區(qū))或NV1-FGF質粒(陰影區(qū))處理，最大ECG評分的變化情況。
圖17顯示16個正常部分(灰色)和14個異常部分(黑色)的定量。正常/異常的判定為通過肉眼觀察評價。
圖18顯示ECG最大評分與Echo最大評分比較圖?；貧w曲線用黑色表示，兩個主要區(qū)域(異常ECG和異常echo，正常ECG和正常echo)用灰色覆蓋。
圖19顯示治療后超聲心動圖評分隨時間的演變。NV1-FGF處理的動物用陰影表示，空質粒處理的動物用灰色表示。*表示組間有顯著性差異(p＜0.05)圖20表示制備心臟橫切面樣本的標準步驟，該樣本用于按照3個短軸切片(axis slice)例如心尖部、中部和心底部節(jié)段，對心臟的不同區(qū)段進行組織學分析。
圖21顯示對疤痕及遠離疤痕的存活心肌中的血管密度的定量分析。
發(fā)明的詳細描述本發(fā)明提供了一種方法，其用于治療或修復高膽固醇血癥或糖尿病背景相關的心肌或骨骼的血管缺陷，其中內皮功能受損或不良。
在直接肌內給藥以促進心肌或骨骼肌中血管網(wǎng)形成增加后，本方法和化合物對于逆轉高膽固醇血癥或糖尿病相關的內皮功能異常特別有用。本發(fā)明包括使用編碼具有生物活性的纖維母細胞生長因子的質粒及其可藥用的鹽類和衍生物。
本發(fā)明也提供一種方法，其用于促進需要此類治療的哺乳動物受試者中缺血的心肌或骨骼肌組織中成熟側支血管的生成，包括在所述受試者的所述組織中注射有效量的編碼纖維母細胞生長因子的質粒，其中不會在所述受試者中誘導VEGF-A產(chǎn)生。具體地說，使用表達FGF的質?？梢哉T導缺血心肌和骨骼肌組織中的側支血管形成以及小動脈形成，而不會誘導VEGF-A因子的表達。根據(jù)本發(fā)明，表達FGF的質粒不會引起諸如水腫之類的副作用。
本發(fā)明也提供了一種方法，其可以逆轉高膽固醇血癥或糖尿病引起的血管生成缺陷，而不會誘導VEGF-A因子表達和/或引起水腫形成，包括在上述患者在心肌或骨骼肌組織中注射有效量的編碼纖維母細胞生長因子的質粒，以促進側支血管和小動脈的形成。
本發(fā)明也提供了一種方法，其用來增強再血管化，該方法通過促進高膽固醇血癥或糖尿病背景中的哺乳動物受試者的缺血組織中的側支血管和小動脈來進行，包括再上述受試者的上述組織中注射有效量的表達FGF的質粒，以逆轉血管生成缺陷。上述質粒的遞送和表達意外地導致了整個缺血肌肉的血液灌注的顯著的提高。
術語“受試者”包括哺乳動物，如狗、貓、馬、牛、豬、大鼠、小鼠、猿和人類，但不止于此。
術語“生物學活性序列”指一種核苷酸序列，其編碼天然存在的多肽或它的任何有生物學活性的類似物或片段。自然界中存在不同的形式，編碼具有相同生物學功能的多肽的結構基因序列有各種變異。生物學活性序列類似物包括天然或非天然存在的類似物，其具有一個或多個氨基酸取代、刪除、增加或置換。所有這些等位基因變體的修飾及其類似物使得保持了一種或幾種天然的活性特征的衍生物包含在本發(fā)明范圍內。
因此編碼FGF的質粒包括編碼所需FGF蛋白的核苷酸序列。這些分子可以是cDNA、染色體組DNA、合成DNA或它們的雜和體或RNA分子，如mRNA。優(yōu)選，所述質粒包含編碼FGF-1的核苷酸序列，因此包括編碼154個殘基的FGF-1酸性生長因子的核苷酸序列，如US專利4,686,113所述。
DNA分子基因表達所必須的調節(jié)元件可以包含啟動子、起始密碼子、終止密碼子和多聚腺苷酸信號。此外，基因表達還經(jīng)常需要增強子。這些元件都必須與編碼目的蛋白的序列相連接，而且調節(jié)元件在用藥的受試者的心肌中必須能夠可操作。
一般認為起始密碼子和終止密碼子是編碼目標蛋白的序列的一部分。但是，這些元件必須在接受基因構建體的受試者中能夠行使功能。起始密碼子和終止密碼子必須與編碼序列一起在框內。
所用的啟動子和多聚腺苷酸信號必須在受試者的心肌細胞中能夠行使功能。
本發(fā)明實踐中可用的啟動子的示例包括來自猿病毒40(Simian Virus40)(SV40)的啟動子、鼠乳腺病毒(Mouse Mammary Tumor Virus)(MMTV)啟動子、人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus)(HIV)如HIV長末端重復序列(LTR)啟動子、莫洛尼氏病毒(Moloney virus)(ALV)、巨細胞病毒(Cytomegalovirus)(CMV)如CMV立即早啟動子、Epstein Barr病毒(EBV)、魯斯氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)(RSV)以及來自人類基因的啟動子，如人alpha肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸和人金屬硫蛋白，但不止于此。
另一優(yōu)選的實施方案是，F(xiàn)GF基因的表達由肌肉特異性啟動子來驅動，如鼠或人的CARP基因上游序列，在US公開2003/0039984中有描述，或是心α肌動蛋白啟動子序列，在國際公開WO 01/11064中有描述。
本發(fā)明實踐中特別是在人類基因疫苗生產(chǎn)中可用的多聚腺苷酸的實例，包括SV40多聚腺苷酸信號、?；蛉松L激素多聚腺苷酸信號和LTR多聚核苷酸信號，但不止于此。特別地，使用了pCEP4質粒(Invitrogen，SanDiego Calif.)中的SV40多聚腺苷酸信號(稱為SV40多聚腺苷酸信號)。
除DNA表達所需的調節(jié)元件之外，DNA分子中還需要包含其他元件。這些附加的元件包括增強子。增強子可以從包括但不止于人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸和病毒增強子例如來自CMV、RSV和EBV組成的組選擇。
基因構建體可具有哺乳動物復制起點，以便保持該構建體位于染色體外，并在細胞中生產(chǎn)該構型的多個拷貝。來自Invitrogen(San Diego，Calif.)的質粒pCEP4和pREP4包含Epstein Barr病毒復制起點和編碼核抗原EBNA-1的區(qū)，其導致大量的附加型復制(episomal replication)而不會發(fā)生整合。其他適用的質粒均為本領域方法人員所熟知，如質粒pBR322，其具有復制子pMB1，或質粒pMK16，其攜帶復制子ColEl(ubel，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，New York(1988)111.5.2.)。
在一項優(yōu)選的實施方案中，編碼FGF的質粒顯示條件復制起點pCOR(conditional origin of replication)，如國際申請WO 97/10343及Soubrier等人(GeneTher.1999；61482-1488)所述。pCOR質粒含有優(yōu)化的表達單元盒，它編碼插入原始主鏈中的人類FGF-1(sphFGF-1)的分泌形式。產(chǎn)生的質粒具有尺寸小的優(yōu)點，為2.4kb。編碼sphFGF-1的序列是序列融合體，所述序列分別編碼來自人成纖維母細胞干擾素的編碼分泌信號肽(sp)和天然存在的人FGF-1的氨基酸21到154的截短形式(US 4,686,113；US 5,849,538)。sphFGF-1的表達由人巨細胞病毒(CMV)立即即早增強子/啟動子(核苷酸-522到+72)驅動。來自猿病毒40的晚期多聚腺苷酸化信號(SV40基因組的核苷酸2538到2759，GenBank基因座SV4CG；US5,168,062)插在sphFGF-1融合體的下游，以保證轉錄終止和隨后的sphFGF-1轉錄物的多聚腺苷酸化正確而有效。優(yōu)選的質粒命名為NV1FGF，且沒有任何抗生素抗藥基因。質粒的選擇依賴于自養(yǎng)受體株中的抑制子轉移RNA基因(suppressor transfer RNA gene)。維持較高的拷貝數(shù)和嚴格限制的質粒的宿主范圍是利用R6Ky復制起點獲得的。編碼該蛋白的序列在細菌不常見，而是人工插入所選的宿主株的基因組中。因此，質粒的潛在的傳播受到極大限制。
根據(jù)本發(fā)明的質?？赏ㄟ^任何將可注射藥物遞送到心肌細胞的方法來給予脊椎動物。優(yōu)選地，所給予的質粒是裸DNA質粒，因為這種質粒不含有任何用于幫助進入細胞的轉移載體，例如，所述多聚核苷酸序列不含有病毒序列，特別是任何可能攜帶基因信息的病毒顆粒。類似地，它們也不合有促進轉染的物質，例如脂質體配制劑，帶電荷的脂質如LipofectinTM或沉淀劑如CaPO4。另外質粒也可以用可藥用的液體載體遞送給動物。在優(yōu)選的申請中，液體載體是水性或部分是水性，包括經(jīng)消毒的無致熱源的水。制劑的PH值經(jīng)適宜地調整并緩沖?；蛘?，質粒也可以應用脂質體，如陽離子或帶正電荷的脂質體來注射。
以下例子清楚地顯示質粒NV1FGF使得所編碼的FGF-1蛋白緩慢釋放，達到的濃度足以促進持續(xù)的血管生成反應，該反應是通過毛細血管和成熟血管如小動脈的生成實現(xiàn)的。另外，NV1FGF顯示特別有效，因為證明它在不可測量的濃度下可以有效促進所治療的肌肉中的仍血管生成。因此NV1FGF使用的濃度可以在一定治療窗內，這樣就避免了由于分布到周圍組織或器官或雜亂的血管生成所引起的副反應。
另外，有證據(jù)顯示由于在安全性及有效性方面的優(yōu)越的特性，在高膽固醇血癥或糖尿病引起的惡化的疾病中，NV1FGF對于治療性血管生成特別有用。
因此預期本發(fā)明可以逆轉任何原因導致的血供減少引起的血管生成缺陷，所述缺陷在諸如高膽固醇血癥或糖尿病的疾病中加重。
在本發(fā)明的內容下，靶組織包括已出現(xiàn)或可能出現(xiàn)缺血損害的肌肉組織，產(chǎn)生這種損害的原因是這些組織缺乏足夠的氧合血供應，在高膽固醇血癥或糖尿病背景中會進一步惡化。如實施例所顯示的，肌內注射NV1FGF質粒在與基因治療必須的安全性相一致的治療窗內可以有效使用，其也能夠在進一步誘導顯示內皮功能受損的缺血組織中的血管生成。
關于本發(fā)明的一個實施方案，NV1FGF質粒以局部方式用于靶肌肉組織。但是，在本發(fā)明的上下文中，可以利用任何將NV1FGF質粒用于靶組織的適宜的用藥方法，優(yōu)選地，這種局部注射入靶肌肉組織的方式通過使用針將NV1FGF直接注射入肌肉來完成。
使用術語“注射”，意指NV1FGF被加壓導入靶組織。按照本發(fā)明，任何適宜的注射裝置均可使用。
雖然給予一個劑量NV1FGF質?？梢酝ㄟ^一次注射入靶組織來完成，但優(yōu)選的劑量給藥方式是通過NV1FGF多次注射。多次注射可以是2，3，4，5或更多次重復注射，優(yōu)選為5次或更多次注射入患有高膽固醇血癥或糖尿病的哺乳動物受試者的缺血肌肉。多次注射相對與單次注射的優(yōu)點在于其可以通過參數(shù)來控制，所述參數(shù)如在靶組織中每次注射的位置所決定的特定幾何學(specific geometry)。通過多次注射來注射單個劑量的NV1FGF可以更好地控制，給予的每任何劑量的效力可以最大化。
多次注射的特定幾何學也可以在兩維空間中確定，每個位置均給予NV1FGF(where the each application of the NV1FGF is administered)。多次注射可以在缺血組織內或其周圍進行，優(yōu)選諸如注射點間相隔2或3cm。
按照本發(fā)明的另一實施方案，多次注射進行的每次注射之間相隔約5到10分鐘。
將NV1FGF用于受血管生成缺陷影響而且其中內皮功能嚴重受損的靶組織時，要求給藥的方式保證NV1FGF能夠接觸到的這樣的區(qū)域，其合理地接近側支血管形成的起點和終點，以及兩者之間的區(qū)域。
給藥按照本發(fā)明的組合物以達到治療的目標可以通過經(jīng)局部、肌內、胃腸外、靜脈、心肌內、心包、心外膜的方式或經(jīng)冠狀動脈內對目標心肌組織給藥。優(yōu)選地，經(jīng)心肌內、心外膜、心包或冠狀動脈內給藥時使用針或導管進行。
優(yōu)選地，肌內注射NV1FGF可以在大腿遠端肌肉或小腿(leg)遠端肌肉進行，也可以在靠近缺血區(qū)域或缺血區(qū)域周圍進行。
而且，用直接心肌內注射的方式用藥時，所述給藥可以在開胸外科手術時進行或通過導管的輔助進行。心臟給藥的導管在本方法領域為人熟知，包括例如US專利5,045,565或4,661,133所描述的針式導管；帶有位置感受裝置的如US專利6,254,573和6,309,370所描述的；或者US專利6,346,099和6,358,247所描述的帶有螺旋形針的導管。
本發(fā)明的一個有利的方面是，給予有效治療劑量的NV1FGF來逆轉高膽固醇血癥或糖尿病背景中的血管生成缺陷。雖然有效量根據(jù)患有除高膽固醇血癥或糖尿病受試者外的血管生成缺陷的給定受試者的體重和疾病而不同，但本領域技術人員能確定對于給定受試者和疾病的適當劑量。
按照這方面的一項優(yōu)選實施方案，治療使用的質粒劑量為約8000μg到約16000μg，在嚴重的血管生成缺陷疾病中，所述質粒通過多次注射給予，優(yōu)選在約1到2周或更長的時間間隔里重復給予2到4次NV1FGF的肌內注射，以促進側支血管和小動脈的持續(xù)形成，從而使得患高膽固醇血癥或糖尿病的哺乳動物受試者中的缺血所致的血管生成缺陷得以逆轉。
所需的NV1FGF以藥劑組合物的形式用于目標缺血肌肉，該組合物包括可藥用的載體和NV1FGF質粒。
在本發(fā)明上下文中，任何可藥用的載體都可以使用，這些載體在本領域已知。載體的選擇部分地由該組合物用藥的具體位置和該組合物用藥的具體方法決定。適用于注射的配方包括水性和非水性溶液或等張滅菌注射溶液，其中可能包含抗氧化劑，緩沖劑，抑菌劑和使得配方與目的受者血液達到等張的溶劑，以及含水和非含水滅菌懸液，包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。所述配制劑可以以單一劑量或多個劑量存在于密封容器如安瓿和小瓶中，可以以冰凍干燥(凍干)狀態(tài)儲存，只需用藥前另加滅菌液體載體，例如水。可以用上述藥物的滅菌藥粉、顆粒和藥片制備臨時的注射溶液和懸液。優(yōu)選地，可藥用的載體是緩沖鹽溶液。最優(yōu)選地，藥用組合物含氯化鈉溶液(0.9％)。
一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物通與低分子肝素(LMWH)聯(lián)合使用。LMWH分子和制備方法在本領域熟知，具體地在以下文獻描述US5,389,618；US 4,692,435，和US 4,303,651，歐洲專利EP 0 040 144，而且Nenci GG也曾討論(Vasc.Med，2000；5251-258)，此處引文中包含此文獻。
第二個實施方案中，在對所治療的骨骼肌給予電刺激之前或之后將表達FGF的質粒注射于高膽固醇血癥或糖尿病的患者的骨骼肌中。本實施方案中使用的電刺激在US2002/0031827中描述，而且所采用的電壓和頻率不會引起骨骼肌收縮，也不會引起患者疼痛，因為其低于肌肉收縮的閾值。例如，采用的頻率為約50HZ，電壓為約0.1伏。在與表達FGF的質粒聯(lián)合使用時，電刺激在增加血流方面產(chǎn)生協(xié)同增強作用。
在第三個實施方案中，表達FGF-1的質粒是BB，其與一種或多種促血管生成的因子聯(lián)合給予。血管生成因子不做限制，包括PDGF-AA，M-CSF，GMCSF，VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C.VEGF-D，VEGF-E，neuropilin，F(xiàn)GF2(bFGF)，F(xiàn)GF-3，F(xiàn)GF-4，F(xiàn)GF-5，F(xiàn)GF-6，血管生成素1，血管生成素2，15促紅細胞生成素，BMP-2，BMP-4，BMP-7，TGF-β，IGF-I，骨橋蛋白(Osteopotin)，多效蛋白(Pleiotropin)，Activin，內皮素-1以及它們的組合。
優(yōu)選地，NV1FGF與表達PDGFBB的質粒聯(lián)合注入骨骼肌或心肌，導致在高膽固醇血癥或糖尿病背景中，側支血管和小動脈的形成更好。因此這一實施方案涉及促進側支血管和小動脈的方法，包含NV1FGF和表達PDGF-BB的質粒給予組織的局部區(qū)域，其劑量可以有效地在組織區(qū)域中誘導血管生成。促進血管生成的因子的遞送在將編碼該因子的分離的DNA遞送到組織局部區(qū)域后，通過自該DNA表達而進行的。
本發(fā)明還涉及治療還患有高膽固醇血癥和糖尿病的患者中的PAD和PAOD，CAD或CHF的病理學的方法。
PAD的病因是一條或多條大血管的堵塞導致的下肢灌注受損。在早期階段，這會導致步行時腿部肌肉不適感，到晚期就發(fā)展為潰瘍和壞疽(1)。在已經(jīng)患有缺血疾病如PAD的患者中，慢性心血管疾病是使其惡化的因素，作用的機制包括內皮功能不良(2，3)。為開發(fā)PAD的試驗模型，將高膽固醇血癥、高血壓和糖尿病等病理改變作為可能的靶點進行研究(4-7)。然而，在這種下肢缺血的模型中，重要的一點是要抑制自發(fā)的血管生成反應，使任何再血管化治療起效，以便模擬下肢缺血的臨床狀態(tài)。
高膽固醇血癥的遺傳模型也用于評價高膽固醇血癥或糖尿病疾病中的血管生成特性，但是在這種遺傳模型中，產(chǎn)生了單個受體(Watanabe遺傳性高脂血癥兔的LDL受體缺陷)或蛋白(ApoE-/-小鼠中糖蛋白ApoE缺陷導致VLDL和IDL水平升高)發(fā)生單個改變，實際上不能再現(xiàn)該病理學情況。
相反，在與患者的病理學情況相當類似的動物模型中，經(jīng)證明NV1FGF質粒逆轉高膽固醇血癥引起的缺陷的效果尤其有效。實際上，由于富含膽固醇的飲食所造成的整體脂質超負荷的病理與患有高膽固醇血癥的PAD患者的情況類似。
按照本發(fā)明，經(jīng)證明NV1FGF通過促進側支血管和小動脈的生長，對于挽救患PAD的患者的膽固醇引起的血管生成損害特別有效。
本發(fā)明還有另外一個目的是提供一種方法，其用于促進缺血組織中側支血管和小動脈的形成，其中內皮功能受損。
如以下舉例所示，NV1FGF能夠有效誘導股后部的缺血損傷的肌肉中的成熟大傳導血管(＞150μm側支血管)以及小阻力動脈(＜50μm小動脈)的形成，這些血管對于傳輸和轉運血液到組織都是必需的。誘導產(chǎn)生這種成熟血管在多數(shù)嚴重病例中都代表非常有效的治療，這類病例中不良血管生成缺陷是由高膽固醇血癥或糖尿病引發(fā)的。
在治療性血管生成中，側支和小動脈的生長是特別感興趣的。實際上，側支是在小動脈網(wǎng)之間形成的橋血管，而小動脈是成熟的血管，由一層內皮細胞和保護其穩(wěn)定性的壁層細胞(外膜細胞或平滑肌細胞)組成，給組織提供大量的血供。因此毛細血管網(wǎng)依賴于它們的存在才能保證血流分布。(Carmeliet等.，Nat.Med.，2000；6389-395；Van Royen等.，Cardiovasc.Res.，2001；49543-553)。
本方面進一步的目的是提供一種促進血管生成的方法，前提是VEGF在所治療細胞中不會被上調。
以下例子證明肌內注射NV1FGF不會導致注射的肌肉中局部鼠VEGF-A的誘導，也不會導致接受注射的小鼠的循環(huán)血液中鼠VEGF-A的分泌。這是本發(fā)明的一個重要方面，即其涉及在VEGF非依賴性途徑中，促進側支血管和小動脈生成，而不會誘導VEGF-A因子的新方法。實際上，已經(jīng)知道VEGF-A會引起嚴重的不良副反應如雜亂的有害血管生成、水腫和潛在的致腫瘤性。
本申請自始至終參考了各種出版物、專利和專利申請。因此這些出版物、專利和專利申請的全文的教導和公布以參考文獻的形式包含在本申請中，以便更完整地描述本申請所屬技術領域的情況。
可以理解和預料，本發(fā)明在此處的范例實施方案中公布的規(guī)律可以由本領域方法人員進行改變，意圖將這種修飾、變化和代替包含于本申請的范圍中。
實施例實施例1動物及其飲食本試驗使用11-12周的敘利亞金倉鼠(n＝50)(CERJ，Le Genest St Isle，F(xiàn)rance)。試驗方案開始前至少7天，允許動物在標準環(huán)境中達到平衡。在整個試驗過程中所有動物可以自由接觸到水。所有動物操作經(jīng)AventisPharma動物使用委員會(Animal Use ommittee of Aventis Pharma)認可，按照美國國立衛(wèi)生研究院出版的指南進行操作。(NIH 出版物No.85-23，1985修訂)。
試驗1中，倉鼠(n＝37)隨機分為3組(圖1)。低膽固醇組(LC)倉鼠(n＝13)用標準食物隨意飼養(yǎng)(參見A04-C，UAR，Epinay-sur-Orge，F(xiàn)rance)。對于兩個高膽固醇(HC)組中的倉鼠，分別在治療21天(HC/21)和28后(HC/28)(HC/21n＝12；HC/28n＝12)每天給予每只動物20g富含膽固醇的食物，這種食物是在標準食物中添加3％的膽固醇和15％的可可黃油制備的(參見1414C，UAR，Epinay-sur-Orge，F(xiàn)rance)。試驗2中，倉鼠(n＝13)隨機分配到2組中(圖1)，鹽水組(n＝5)和NV1FGF組(n＝8)的倉鼠用富含膽固醇的食物飼養(yǎng)，如試驗1所述。
實施例2誘導下肢缺血LC或HC飼養(yǎng)35天后，按照下述進行外科操作，動物易于發(fā)生下肢缺血。誘導下肢缺血是在用N2O(0.81.min-1)，O2(0.41.min-1)和異氟烷(2％)的氣體麻醉下，按照其他動物物種使用的程序進行操作的。在無菌外科手術的環(huán)境中，在右下肢的股內側做一條縱行切口，從腹股溝韌帶到髕骨近端的點。通過該切口，使用外科繩結(surgical loops)，分離股動脈并電凝(coagulate)其主要分支。將股動脈完全切斷，其近端為自外髂動脈分出的起點，其遠端為其分成隱動脈和腘動脈兩個分支處(20)。用4.0號絲線單層縫合切口。
實施例3下肢骨骼肌的基因轉移試驗2中，在誘導缺血后14天對鹽水組(n＝5)或編碼NV1FGF的質粒組(180gag DNA，n＝8)盲性給予3次注射，每次50μL，注射位點分別在缺血下肢的脛前肌(Tibialis cranialis)、內收肌和四頭肌。
實施例4血漿總膽固醇和甘油三酯水平的測定在相對于手術日的第-35，-7，和+21或+28天，在N2O(0.81.min-1)，)O2(0.41.min-1)和異氟烷(2％)的氣體麻醉下，用眶后穿刺的方式從HC/21，HC/28，鹽水組和NV1FGF組的倉鼠取血。利用市售試劑盒(OlympusDiagnostica GmbH，Hamburg，Germany)用酶學方法測定血漿總膽固醇和甘油三酯水平。
實施例5用血管造影定量側支血管形成在誘導缺血后的第21天(HC/21group)或第28天(LC，HC/28，鹽水組和NV1FGF組)，進行血管造影如下。
經(jīng)插入腹主動脈的導管注射～300μL的對比介質(0.5g.ml-1硫酸鋇水溶液)后即刻，用過量的戊巴比妥鈉處死倉鼠。將倉鼠置于仰臥位，進入造像裝置(MX-20型，F(xiàn)axitron X光公司，惠靈，IL，USA)，搜集雙下肢的脈管系統(tǒng)尸檢(post-mortem)圖像并進行數(shù)字化(軟件示范，DALSAMedOptics，圖森，AZ，USA)。該X光照像系統(tǒng)可以顯示直徑大于150μm的血管。由對治療不知情的研究者離線分析圖像，使用如前所述的專用軟件(22)。
簡單地說，對于缺血和非缺血肢體，用分析區(qū)域的百分數(shù)來評價股后部的側支血管程度。血管程序作為缺血/非缺血百分數(shù)的比值來評分。為檢驗該方法的可信度，在6只分別按年齡配對的非下肢缺血的倉鼠中，進行血管造影評分。與預期那樣，用右肢/左肢百分數(shù)比值計算的血管造影評分為1.04±0.18，反映雙側肢體的血管形成相似。
實施例6用免疫組化法定量小動脈的形成以及通過切除高膽固醇血癥的倉鼠的股動脈產(chǎn)生的下肢缺血所致的典型肌肉損傷在誘導缺血后的第21天(HC/21group)或第28天(LC，HC/28，鹽水組和NV1FGF組)，由缺血下肢獲取骨骼肌，用PBS-3.7％福爾馬林溶液固定。非缺血下肢的肌肉也同樣采樣，作為對照肌肉。由每個大腿的后部處理得到不同肌肉(股薄肌、半膜肌、內收肌、半腱肌、股二頭肌)的兩張橫斷切片。切片經(jīng)脫水，包埋于石蠟中，制備成5μm厚的切片以便免疫組化分析。用直接抗平滑肌α肌動蛋白的小鼠單克隆抗體(SMA；克隆1A4，1∶200倍稀釋，Dako，Carpinteria，CA，USA)作為血管平滑肌細胞(VSMCs)的標記物，因為其在成熟血管中持續(xù)表達。采用抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶方法，用市售試劑盒(EnvisionTM+System/Horse RadishPeroxidase，Dako，Carpinteria，CA，USA)檢測SMA抗體。SMA陽性(SMA+)的血管按其大小(外直徑)分級，計數(shù)內收肌和股薄肌中直徑＜50μm的小動脈。
選用這些肌肉是因為它們與股后部的其他肌肉(半膜肌、半腱肌和股二頭肌)相反，容易受到我們的下肢缺血的倉鼠模型中的組織病理學損傷。
股動脈切除引起的典型損傷在圖2中顯示。誘導缺血28天后獲取股后部的肌肉，即股薄肌和內收肌，然后將肌肉的5μm的切片用HES染色后觀察。圖2B和2C分別顯示缺血肌肉中存在輕度壞死(虛線)和中央成核現(xiàn)象(箭頭)。圖2A顯示沒有病灶的非缺血對側肌肉的放大X100倍的橫切面，其作為對照。確定內收肌和股薄肌的總面積以便觀察缺血對肌容量的影響。確定總肌肉區(qū)域內SMA+小動脈的數(shù)目。對這兩個參數(shù)，計算缺血/非缺血數(shù)值的比值。所有操作由對治療不知情的研究人員完成。
實施例7缺血肌肉中NV1FGF基因轉移后FGF-1的表達在試驗2中，注射鹽水或NV1FGF基因轉移后14天(即誘導缺血后28天)，對取自缺血和非缺血肢體股后部的肌肉(股薄肌和內收肌)做如下處理。用檢測FGF-1表達經(jīng)典的鏈霉抗生物素-生物素分析來進行FGF-1免疫組化分析。用一級多克隆抗-FGF-1兔抗體(參見AB-32-NA，1∶30倍稀釋，R&D Systems，Abingdon，UK)保溫，再用生物素?；捏H抗兔免疫球蛋白(1∶200倍稀釋，Amersham，白金漢郡，UK)保溫。在加入偶聯(lián)于鏈霉抗生物素的過氧化物酶后，用產(chǎn)色的二氨基聯(lián)苯為底物來定位免疫復合物。5μm厚的切片用蘇木精復染，脫水及用永久包埋介質包埋。免疫反應的纖維(染為褐色)在顯微鏡下可以鑒別(Axioplan 2，Zeiss，Hallbergmoos，Germany)。
統(tǒng)計分析結果用平均值SD表示。統(tǒng)計學顯著性公知為P＜0.05。
在試驗1中，在各個時間點比較HC/21和HC/28兩組的血漿脂質水平，任意2數(shù)值間的比較先用ANOVA方法再采用Tukey-Kramer post-test來進行。LC、HC/21和HC/28三組間的血管造影評分用ANOVA方法再采用Tukey-Kramer post-test來比較。HC/21和HC/28兩組的非缺血及缺血的肌肉面積和SMA陽性小動脈的數(shù)值，以及相應的比值，用非配對t檢驗比較。
在試驗2中，在各個時間點比較鹽水組和NV1FGF組兩組的血漿脂質水平，任意2數(shù)值間的比較先用ANOVA方法再采用Tukey-Kramer post-test來進行。鹽水組和NV1FGF組兩組的血管造影評分、非缺血及缺血的肌肉面積和SMA陽性小動脈的數(shù)值，以及相應的比值，用非配對t檢驗比較。
實施例8測量低膽固醇和富含膽固醇食物組的血漿脂質表1和表2分別總結了試驗1和試驗2中的血漿脂質水平，在給予富含膽固醇的食物前(第-35日)以及食物改變后的各個時間點(第-7日和+21或+28日)。富含膽固醇的食物引起了血漿總膽固醇和甘油三酯水平隨時間依賴性的升高。
表1.試驗1中的血漿脂質水平

N.A.不可應用***P＜0.001相對于飲食前表2.試驗2中的血漿脂質水平

N.A.不可應用**P＜0.01相對于飲食前***P＜0.001相對于飲食前實施例9富含膽固醇的食物對下肢缺血后側支發(fā)育和小動脈密度的影響(試驗1)如圖3所示，LC組(圖3A)下肢缺血28天后側支形成較多，因此血管造影評分為0.93±0.45(圖3D)。
相反，下肢缺血后21或28天，兩個HC組的側支形成顯著受損，血管造影評分分別下降至0.35±0.38和0.37±0.21(見圖3B和3C)。兩個HC組與LC組相比血管造影評分均顯著下降(P＜0.01)。然而，在HC/21和HC/28兩組之間，血管造影評分沒有顯著差別(P＞0.05)，如圖3D所示。
圖4A-4D顯示放大X100倍的橫切面，描繪用平滑肌α肌動蛋白(SMA)免疫化學法標記的成熟血管，所述血管來自誘導缺血后21天(A和B)或28天(C和D)獲取的非缺血(A和C)及缺血(B和D)肌肉(股薄肌和內收肌)，以及肌肉面積和＜50μm的SMA陽性小動脈的定量。
如圖4E-F所示，缺血21天后，缺血下肢與非缺血下肢相比，前者內收肌和股薄肌的面積下降(P＜0.01)。下肢缺血28天后也觀察到同樣的趨勢，盡管其沒能達到統(tǒng)計學顯著性(P＝0.0538)。另外，缺血后21天和28天缺血下肢均與非缺血下肢相比，前者中＜50μm的小動脈數(shù)量顯著降低(P＜0.01)。在開始改變食物后21天和28天，盡管在計算小動脈密度的中間步驟中有這些統(tǒng)計學水平具有顯著性，但是小動脈密度本身卻沒有顯著差異。在21天和28天時，用缺血/非缺血下肢比值表示的肌肉面積、SMA+小動脈和小動脈密度也沒有顯著差異。
這些結果清楚顯示，下肢缺血后21天和28天，高膽固醇血癥對側支血管發(fā)育的抑制，大小血管水平的慢性血管生成疾病(如血管造影定量所示)，和由組織學方法定量的＜50μm的小動脈的誘導程度相同(圖2B和2C)。
此外，本研究所使用的高膽固醇血癥倉鼠提供了一個特別嚴重的模型，因為用于我們的模型的脂質超負荷增加，明顯導致了下肢缺血后的內皮功能損害和血管生成反應的缺陷。另外開始富含膽固醇的飲食4周后取自倉鼠的動脈的組織病理學分析顯示存在泡沫細胞。而且，總膽固醇和甘油三酯水平連續(xù)升高，并在下肢缺血恢復的期間持續(xù)存在，因此在內皮損害和血管生成缺血的嚴重程度方面該模型為最嚴重的病例情況。
實施例10肌內用藥14天后(即下肢缺血28天后)NV1FGF基因轉移對于高膽固醇血癥倉鼠中側支發(fā)育和小動脈密度的影響(試驗2)如圖5B所示，誘導下肢缺血14天以后肌內給予NV1FGF基因轉移，與用鹽水處理的倉鼠相比，顯著改善了缺血肢體的側支形成(圖5A)。實際上NV1FGF基因轉移后的血管造影評分(0.75±0.47)也顯著高于(P＜0.01)鹽水處理的倉鼠(0.22±0.05)。
圖6A和6B是用鹽水和NV1FGF處理的倉鼠的缺血肌肉的典型的橫切面(放大X100倍)，顯示用平滑肌α肌動蛋白(SMA)免疫化學法標記的成熟血管，并定量表示肌肉區(qū)域和＜50μm的SMA陽性小動脈。
鹽水組和NV1FGF組的缺血下肢中均可觀察到內收肌和股薄肌面積減少(分別為P＝0.2404和P＝0.0846)。如圖6C和6D所示，用缺血/非缺血肢體比值表示的肌肉面積在鹽水組和NV1FGF組中相似(P＝0.4584)。鹽水處理的動物中，＜50μm的小動脈的數(shù)目在缺血下肢中較非缺血下肢中顯著減少(P＝0.0333)，然而在NV1FGF組差異不顯著(P＝0.1347)。計算缺血/非缺血下肢的比值顯示，NV1FGF處理的肌肉中的所述值與鹽水處理的肌肉中的所述值相比在統(tǒng)計學上更高(P＝0.0187)。但是，任一組的非缺血與缺血下肢的肌肉中小動脈密度沒有差異(鹽水組和NV1FGF組分別為P＝0.9320和P＝0.1586)。用缺血/非缺血比值表示的小動脈密度在鹽水組和NV1FGF組間沒有差異(P＝0.2724)。
實施例11NV1FGF基因轉移后缺血肌肉的FGF-1表達與涉及其他血管生成因子如VEGF或FGF-2的基因治療不同的是，發(fā)明者已經(jīng)證明，F(xiàn)GF-1的表達有利地局限于用NV1FGF處理的動物的缺血肌肉。
而且，如非缺血(對側)未經(jīng)注射的下肢(圖7A)和注射鹽水的缺血下肢(圖7B)或注射NV1FGF的缺血下肢(圖7C)的股后部肌肉(股薄肌和內收肌)中，如用抗-FGF-1多克隆抗體免疫化學染色的代表照片(放大×100倍)所示，令人吃驚的是，在鹽水處理的動物的缺血肌肉和鹽水及NV1FGF處理的動物的非缺血(對側)肌肉中都沒有FGF-1的表達。這清楚表明NV1FGF質粒的優(yōu)越特性，即使得所編碼的FGF-1蛋白在治療窗內緩慢釋放，其足以通過成熟血管的形成產(chǎn)生持續(xù)的血管生成反應，而該濃度不允許出現(xiàn)傳播和雜亂血管生成或不良副反應。由此可證明NV1FGF非常有效，因為它可以在不可檢出的濃度下，促進所治療肌肉內的血管生成，因此在特征性表現(xiàn)為內皮功能不良惡化的疾病中，允許使用包含在治療窗內的NV1FGF濃度。由于在安全性和有效性方面的這一優(yōu)越特性，NV1FGF可以有效地用于高膽固醇血癥或糖尿病引起的加重的疾病中的血管生成治療。
這些結果清楚地顯示NV1FGF基因治療能夠通過側支血管和小動脈的增加來挽救受損的肌肉。事實上，在股后部的肌肉中，血管造影已經(jīng)證實有＞150μm的側支血管的生長，免疫組化證實了＜50μm的小動脈的生長，這些肌肉包括股二頭肌、內收肌、股薄肌、半膜肌和半腱肌。出乎意料的是，申請人還證實，在NV1FGF基因轉移后14天，在該區(qū)域內側支血管明顯受到刺激而形成，這正如血管造影評分所強調的(圖5C)。
盡管沒有進行組織氧合的原位測量來評價股動脈切除后該區(qū)域發(fā)生的缺血，但發(fā)現(xiàn)存在組織病理學損傷如中央成核現(xiàn)象、萎縮、壞死和炎癥(圖2)。更精確地說，這些損傷局限在內收肌和股薄肌，而股二頭肌、半膜肌和半腱肌不易受損。因此專門在內收肌和股薄肌進行＜50μm的小動脈的定量，位置正在內收肌管的上方。如圖6D所顯示，NV1FGF基因轉移增加了進入缺血下肢中這些肌肉的小動脈的絕對數(shù)量。
因此這些數(shù)據(jù)明確顯示了NV1FGF在股后部缺血損傷的肌肉中具有誘導成熟的大傳導血管(＞150μm的側支血管)和小阻力動脈(＜50μm的小動脈)的形成的能力，它們是給組織運送和提供血液所需要的。
實施例12在NV1FGF治療的肌肉中沒有VEGF-A的誘導本試驗的目的是評價經(jīng)肌內(IM)給予編碼鼠FGF-1的裸DNA后，小鼠體內的VEGF-A誘導。研究小鼠VEGF-A(mVEGF-A)的循環(huán)水平和基因表達。循環(huán)中的水平用ELISA法，在IM給藥后3天和7天時測量，局部mVEGF-A基因的表達在第7天使用兩種分析方法測定針對這種蛋白的免疫組化法(IHC)以及通過實時逆轉錄聚合酶鏈反應法(RT-PCR)檢測mRNA。
本研究中使用40只雌小鼠。1到3組(每組n＝8)分別接受pCOR-CMV.大鼠-spFGF-1、pCOR-CMV空白(無FGF-1基因)或NaCl 0.9％的IM用藥，所述注射在左右脛前肌都進行。pCOR-CMV.大鼠-spFGF-1對應NV1FGF質粒，其中人FGF-1用相應的大鼠來源的編碼序列替換。用藥后第7天獲取被注射的肌肉，并對其進行mVEGF-A和FGF-1免疫組化(右側肌肉)或mVEGF-A實時RT-PCR(左側肌肉)。在1至3組中，用藥后第3天(D3)和第7天(D7)取血進行ELISA檢測，檢測在新鮮制備的血漿樣品中的mVEGF-A。
如圖8所示，在注射了pCOR-CMV空白I(圖8B)和注射了鹽水(圖8C)的肌肉中都沒有檢測到FGF-1陽性的肌肉纖維。在注射pCOR-CMV.大鼠-spFGF-1的肌肉(圖8E)中，確認每張切片平均有25條表達FGF-1的肌纖維。
利用免疫組化法，在兩組對照組肌肉中(NaCl和pCOR-CMV.空白)均觀察到類似且微弱的mVEGF-A的標記，提示內源性的mVEGF-A表達，免疫染色定位在肌纖維內，顯示馬賽克的圖案，因為某些纖維的標記較另外一些的密度更大。注射后第7天時，與注射NaCl或pCOR-CMV.空白的肌肉相比，在注射pCOR-CMV.大鼠-spFGF-1的肌肉中，沒有觀察到mVEGF-A免疫標記增多。觀察到的免疫染色的馬賽克圖案相同。
使用實時RT-PCR方法，證明用NaCl和pCOR-CMV.空白處理的肌肉的mVEGF-A mRNA水平表達相同(每2ng總RNA中有6.84×103和4.31×103個cDNA拷貝)，提示內源性mVEGF-A表達。用藥后第7天，在注射了pCOR-CMV.大鼠-spFGF-1的肌肉中，與注射了NaCl或pCOR-CMV.空白的肌肉相比，沒有發(fā)現(xiàn)mVEGF-A的mRNA的水平升高。
這些結果清楚地提示肌內注射pCOR-CMV.大鼠-spFGF-1不會導致被注射肌肉中局部的VEGF-A誘導，也不會導致被注射的小鼠循環(huán)血液中的mVEGF-A分泌。
實施例13高膽固醇血癥Watanabe兔冠狀動脈疾病的動物模型基因治療產(chǎn)品作為有效療法的合法性部分依賴于其生物學活性。為了評價這一問題，所選的動物模型應該顧及解剖和功能，盡可能接近其所模擬的人類疾病。
解剖學相關性基于所用的物種，在冠狀動脈網(wǎng)絡方面，其應該盡可能接近人類的心臟。而且，動物種類越大就越合適，因為這使得各種方法步驟易于進行。另一方面，也要注意其他因素，如成本，操作設備，動物狀況的偶然性(contingency)，動物設備的依從性等。本研究找到的最佳的折衷方案是兔，它足夠小，可以易于處理和穩(wěn)定(stabulated)，也足夠大，可以保證較好地對具體動脈進行定位，進行精確的冠狀動脈造影，各種解剖和功能問題也類似人類。
當然，在此功能的相關性基于動物發(fā)生病理學改變的能力，這種病理學改變應盡可能與所對應的人類疾病即高膽固醇血癥相關的血管生成缺陷類似。
人類高膽固醇血癥導致血管內皮功能不良，而且最終進展為主要冠狀動脈的狹窄。冠脈血流在靜息和應激情況下的不平衡產(chǎn)生隱匿的心肌功能不良，導致疼痛和伸縮性降低。通常在靜息時血供適宜，但發(fā)生應激時，由于冠脈阻塞性病變，需求增加而血供不能增加。所以為了達到模擬這種人類的病理的目的，既要在主要冠狀動脈建立狹窄又要使用應激試驗來顯示由該狹窄應激導致的不平衡。
Watanabe可遺傳性高脂血癥兔(WHHR)缺乏LDL受體，因此它可以出現(xiàn)自發(fā)的動脈粥樣硬化癥，引起冠脈動脈粥樣化(coronary atheroma)，因此用來評價缺血和評估開胸手術過程中心肌內注射NV1FGF對其缺血狀態(tài)的影響。
所有試驗均依照由動物管理及使用委員會批準的草案的進行，而且遵守NIH關于試驗動物的使用和管理指南。
由Covance獲得體重在3000到3500g之間的一年齡的WHH兔(PO Box7200，Denver，PA，17517，USA)。
依照優(yōu)良的動物管理慣例，在使用之前將所有動物在我們的動物房中保持至少8天。在此期間，每籠圈養(yǎng)一只動物，它們可以自由獲得食物(來自UAR的112C型)和適宜的經(jīng)過濾飲用水。動物居所保持12小時的晝/夜節(jié)律(6a.m.起照明)，環(huán)境溫度保持在20-24℃，濕度設定在35-75％。
Watanabe兔的膽固醇水平較野生型動物高7到10倍，而其甘油三酯水平較正常高4到5倍。
處死后，其中的4只進行油紅O染色，這種染色顯示主動脈內存在的脂質斑塊，冠狀動脈開口和二尖瓣。
而且，它們中有一只送交組織學分析。對回旋冠狀動脈HES染色的切片進行顯微鏡檢查，確定所研究的兩只兔中有一只的動脈粥樣硬化斑塊占據(jù)了管腔近15％(兔#CAD98R2，參見圖9B)Watanabe可遺傳性高脂血癥兔有兩點有趣的特性其心臟的大小變得很適于進行多點心肌內注射，而且它的冠狀動脈網(wǎng)布滿了動脈粥樣硬化斑。后者可以解釋冠脈血流在靜息時正常(通過ECG正常和收縮正常而如此評價)而麻醉下的多巴酚丁胺應激試驗會導致缺血的顯著表現(xiàn)。
實際上，兩種分析方法，如心電圖和超聲心動圖，都顯示了可與其人類相應情況相比較的應激征象，例如ST段壓低或運動低下。
實施例14手術使用手術來用直接注射的方式將基因治療產(chǎn)品遞送入心肌內。手術過程在消毒環(huán)境下進行。動物通過肌內注射氯胺酮(ketamine)(70mg/Kg)+甲苯噻嗪(Xylazine)(7mg/Kg)混合物(1ml/Kg)的方式麻醉。動物備皮后，對于咽部噴以氣化的5％利多卡因，以便易于進行氣管內插管，整個試驗過程中用機械通氣維持麻醉(西門子，Servo呼吸機900D)，條件如下 通氣量1，4L/分 呼吸頻率40/分 氟烷0.4到0.6％ 氧30-35％
進行耳緣動脈插管，以便給動物連續(xù)輸注5％葡萄糖。使用ECG監(jiān)護來保證整個手術中心率穩(wěn)定。在第4肋間隙施行左側胸廓切開術。打開心外膜后，心臟顯露，可以進行質粒注射。
在左室游離壁的13個不同位置進行注射，使用自制的針250μl漢密爾頓注射器連接一根Stériflex G19導管(參見167.10)，用短斜針BD(26G3/8)固定。我們在每個位置注射1mg/ml的質粒溶液25μl。圖1A顯示每次注射的位置。
注射后，在胸腔置引流管，并將肋骨用兩根Mersurtures(1.0)絲線并排固定。停用氟烷，維持氧氣至動物蘇醒。關閉胸腔期間引流設置在約200-400毫巴。兩層肌肉用Vicrylg(4.0)絲線縫合，皮膚用Suturamide(2/0)絲線縫合。最后一針縫合完成后，拔除引流管之前，用機械通氣提高肺的呼氣末正壓，以便在引流管剛拔除時，肺在胸腔里充分膨脹。
在傷口使用聚維酮碘膠并用繃帶包扎。動物蘇醒后，停止機械通氣。
實施例15手術后治療動物蘇醒后立即注射以下化合物-抗聚集藥物和抗凝藥物，以避免手術中和手術后可能出現(xiàn)的冠脈血栓形成Vetalgine 0.375ml(手術前一天，以及此后5天)肌內肝素0.1ml(自手術次日起用4天)皮下-廣譜抗生素以預防感染2％Baytril 0.2ml(5天)皮下-強鎮(zhèn)痛劑以便動物可以耐受大手術操作嗎啡0.5ml(2天)皮下實施例16心電圖盡可能按相應的人類的情況進行心電圖檢查。四個電極安置在四肢，6個電極(VI到V6)安置在心前區(qū)。用HP Pagewriter II 4565A記錄常規(guī)典的12導聯(lián)心電圖。使用ECG以便監(jiān)測(1)手術中心律(2)多巴酚丁胺應激試驗中的心律(3)檢測心肌梗死以及(4)檢測缺血征象。
4.1手術中監(jiān)測心律全麻下的開胸手術可能引起各種手術相關per-operatory問題，可以通過ECG監(jiān)測發(fā)現(xiàn)。處理心動過緩通過注射阿托品治療，心律失常通過注射0.5％利多卡因(0.5到1ml)治療，心跳驟停通過電(energic)心肺復蘇，包括異丙腎上腺素治療。
4.2多巴酚丁胺應激試驗中監(jiān)測心律盡管多巴酚丁胺的主要藥理學影響是變力性的作用，該產(chǎn)品也有變時性，因此心律增快似乎是監(jiān)測應激試驗的最簡便方法。
4.3檢測心肌梗死心肌電活動記錄為一系列心搏，每搏是順序出現(xiàn)的幾個波主要部分為p，q，r，s和t。p波用來代表心房活動，qrs綜合波為心室活動，t波用來作為復極化的標志。
人類心肌梗死最典型的ECG征象是深大的q波。用兔也可以得到類似結果，因為對一批用于探察的兔分析顯示，經(jīng)歷冠狀動脈的機械性關閉后，其中大部分出現(xiàn)這種q波。
4.4檢測缺血征象這種隱匿的現(xiàn)象通常在靜息時不能發(fā)現(xiàn)。在應激試驗中則描述了各種改變。我們假定兔心臟在受到機械/化學應激時顯示的電模式是相同的。事實上，人類中真正的缺血會導致ST段抬高或壓低，或/和T波倒置(圖10)。人類應激試驗中，兩個主要的征象是ST段壓低和負相的深T波，如圖10所示為。其相應的兔的示例在圖11中表示。
圖12顯示對缺血征象的評分方法。給圖12所示每個導聯(lián)評分為0(正常ECG)到3分(顯著缺血)，并記予記錄。任何導聯(lián)出現(xiàn)顯著的變異與出現(xiàn)變異的導聯(lián)數(shù)目同樣重要。因此最初記錄所有得分之和，以后只記錄具體ECG的最高得分并用于缺血動物的納入。唯一的排除標準是出現(xiàn)q波(寬超過1格，深超過3格)，它提示出現(xiàn)了透壁的壞死。
圖13A顯示靜息時典型的正常12導聯(lián)ECG，而同一只動物在應激最強時(見圖13B)，顯示I，II，aVF，VI，V2，V3，V4導聯(lián)出現(xiàn)明顯的下斜型壓低，以及III，V5和V6導聯(lián)出現(xiàn)不明顯壓低。這一ECG顯示相當嚴重的缺血。
總之，ECG是發(fā)現(xiàn)排除標準(即壞死)或納入標準(對多巴酚丁胺的缺血反應)的最佳一線方法。
實施例17超聲心動圖使用Acuson Sequoia 256和線性8L58MHz探頭來評價心肌收縮力，這是因為兔胸腔區(qū)域小，在這一項特定的分析中可以使用這種表面的探頭。
對每只動物，在手術前進行一次超聲心動描計，然后每周在應激試驗前和當中進行一次。每一病例中，檢查心臟的總體動力表現(xiàn)，盡可能沿長軸和短軸兩個方向逐一測量多個段。然后標記(spotted)長軸中的最大直徑，調整儀器到M型，確認左室運動正常。
應激試驗的每一步均進行類似的2D分析。記錄所發(fā)現(xiàn)的任何異常并進一步評價用以下(圖14)術語記錄出現(xiàn)的位置，并且給運動缺陷的類型分級1為正常，2為運動低下(hypokinesy)，3為無運動，4為運動障礙。如果缺陷的存在不明確，用M型計算增厚分數(shù)。如下順序評分如果所有節(jié)段增厚分數(shù)均正常(30％以上)為1，如果有運動低下(一個或更多節(jié)段低于30％)為2，如果無運功(至少一個節(jié)段沒有增厚)為3，如果運動障礙(一個節(jié)段增厚分數(shù)為負，即收縮期心肌舒張)為4。
在最后的分析中只保留最高的缺陷得分。
實施例18多巴酚丁胺應激試驗本試驗利用多巴酚丁胺的變力性和變時性，來模擬心臟對應激的反應。由于缺血是隱匿的現(xiàn)象，通常在應激過程中發(fā)生，其揭示要通過由ECG上的電征象和其對心肌收縮力的影響來檢測，如超聲心動描計所顯示的那樣。該試驗的方法步驟如下-麻醉不使用異氟烷，因為它引起靜息時心率快。不使用氟烷，因為其與阿托品聯(lián)用時導致心室異位(ectopies)的表現(xiàn)。因此選用甲苯噻嗪-氯胺酮Xylazine-Ketamine，因為其心率升高的動力學好。
-阿托品在耳導管內注射阿托品甲基硝酸鹽0.5mg/Kg，作為預備步驟。不使用阿托品硫酸鹽，因為它引起一定程度的心率升高。
-劑量增加首次劑量為2μg/Kg/min，每3分鐘增加劑量至5、10、20、30和40μg/kg/min。如果沒有達到最大心率，最高劑量為80μg/kg/min。
每一步驟均記錄ECG和超聲心動圖。麻醉的兔靜息時心率為203±22(試驗n＝61)，劑量為40μg/kg/min時心率為280±31(n＝59)，而劑量為80μg/kg/min時心率為299±19(n＝29)。僅當劑量為40μg/kg/min、心率在300bpm以下時，才決定由40增至80。
總之，本試驗用來顯示化學應激過程中心肌的活動，從而揭示心臟的缺血部分。
實施例19組織學分析-檢出動脈粥樣硬化斑塊，耐受性和FGF-1表達。
在試驗最后檢查兩只兔的回旋冠狀動脈是否存在粥樣硬化斑塊。移除心臟，切取左室樣本，其中包含回旋冠狀動脈的上部分，浸于PBS緩沖的3.7％福爾馬林以便進一步分析。每個樣本用石蠟包埋。每隔30μm切5μm切片，用蘇木精-伊紅-番紅花(saffron)(HES)染色以便進行顯微鏡檢查。
另外兩只兔用來評價在左室壁內注射編碼FGF-1的質粒的有效性和安全性。最后的一只在第3天施以安樂死，移除心臟并清洗，觀察其前壁，在福爾馬林中保存1小時。然后它被分為5份樣本，每份樣本在石蠟包埋前置于PBS緩沖的3.7％福爾馬林中固定過夜。
對每個心臟，有肉眼可見的病灶的或可能包括注射位點的5個樣本被收集起來，在石蠟包埋前置于PBS緩沖的3.7％福爾馬林中固定過夜。
使用標準步驟制備切片。對于每塊切取2張5μm連續(xù)切片。一張切片用蘇木精-伊紅-番紅花(HES)染色進行組織病理學檢查，另一切片進行FGF-1免疫組化處理(IHC)。通過與針和載體注射的組織學變化，可以在HES染色的切片上確認注射位置。
用經(jīng)典的鏈霉抗生物素-生物素分析來進行IHC處理。用一級多克隆抗-FGF-1兔抗體(R&D Systems，#AB-32-NA，1∶30倍稀釋)保溫，再用生物素?；捏H抗兔免疫球蛋白(Amersham，1∶200倍稀釋)保溫。在加入與鏈霉抗生物素偶聯(lián)的過氧化物酶后，用產(chǎn)色的二氨基聯(lián)苯為底物來定位免疫復合物。切片用蘇木精復染，脫水及用永久包埋介質包埋。用這種方法，免疫反應的纖維表現(xiàn)為褐色，核為藍色。先前在兔肌肉中的FGF-1 IHC分析的有效性顯示了檢測肌纖維中的FGF-1轉基因的能力。使用陰性對照(去除初級抗體，但使用次級抗體)來區(qū)別非特異性染色(主要在細胞外)與特異性免疫反應。而且，在整個分析過程中，使用事先表現(xiàn)有高水平FGF-1表達的大鼠肌肉的陽性切片(切片P1056GNR2，研究PAD31.2001)，對FGF-1IHC的性能進行控制。在顯微鏡(Zeiss，Axioplan 2)下確認和計數(shù)免疫反應性纖維。免疫反應性細胞的數(shù)目是在每個注射位置周圍觀察到的免疫反應性心肌纖維的數(shù)目。
實施例20在高膽固醇血癥背景中證實治療性血管生成共用16只一年齡的雄性Watanabe兔來評估NV1FGF對于逆轉高膽固醇血癥相關的心肌缺血的有效性。另外兩只新西蘭兔進行了同樣的外科手術，在表達分析后3天處死。
20.1/FGF-1表達的評價和組織病理學模式兩只健康新西蘭兔在接受外科手術并注射NV1FGF三天后處死。與注射載體相關的組織病理學變化的評價成功地完成，因為在每個心臟的5個樣本中，定位了5個和7個注射位點。某些樣本中見到多達3個不同的注射位點，相隔6到10mm，與2次注射間隔的距離相對應。心肌的病變或多或少呈線性，其變性與壞死與活動性慢性炎癥反應相一致(見圖15A)。某些樣本顯示心包膜下彌漫的淋巴細胞浸潤，提示局限性心包炎。每個結果在表3中列出。
心肌內注射NV1FGF后3天，在所有顯示注射位點的樣本中均可發(fā)現(xiàn)FGF-1免疫反應性肌纖維。局限于組織學病灶外圍的表達為每個注射位點陽性3到36個心肌纖維不等(見圖15B)。每個結果在表3中說明。
*表3心肌內注射NV1FGF后3天，健康兔心肌中的組織學觀察和FGF-1表達



總之，在健康兔的心肌內直接注射NV1FGF后3天，觀察到了肌纖維變性和此后的炎性反應。在這樣早的時間點，認為組織學損傷是非NV1FGF特異性的，因為病變的嚴重程度和類型都與在豬心肌內注射不編碼任何轉基因的裸DNA質粒后的病變類似。
在心肌內注射NV1FGF對兔心的轉基因表達的有效性得到了證實，因為在顯示注射位點的所有樣本中都發(fā)現(xiàn)了FGF-1的表達。考慮到每個注射位點的免疫反應性肌纖維的數(shù)目，表達的水平與在大鼠心臟的心肌內注射同等量的NV1FGF后觀察到的相似，前提是兔中的一個注射位點與大鼠心臟中的一次注射對等。
20.2/接受注射的Watanabe兔的心電圖模式本研究包含了16只兔。每只動物在手術前經(jīng)歷應激試驗，然后每周一次，持續(xù)四周。對兩組觀察到的最高得分作圖(藍色為注射空質粒的動物，粉色為注射NV1FGF的動物)。第7天時，NV1FGF組的大部分動物得分均較低，提示治療后缺血趨于消失。另一方面，空白治療組的大部分動物仍有深度缺血(最大缺血得分為3)。
如圖16所示的結果顯示應激試驗中最大的ECG得分的演變，所述應激試驗對空質粒治療的兔(藍色點代表個體值，藍色柱代表平均值)或NV1FGF質粒治療的兔(紅色點代表個體值，粉色柱代表平均值)進行。NV1FGF質粒的質粒清楚地顯示其相當有效地減少了缺血面積。
從第7天開始，統(tǒng)計分析(非配對t檢驗)顯示在兩組之間有顯著差異(p＜0.05為*，p＜0.01為**)，提示FGF-1的存在可以影響應激時缺血性心電圖模式的恢復。
20.3/接受注射的Watanabe兔的超聲心動圖模式第一步是要證實定性評價(分類為正常、運動低下、無運動)和定量評價(壁增厚分數(shù))之間相符合的精確程度，分析了30個節(jié)段，16個視為正常，14個為異常。之后計算它們的壁增厚分數(shù)，其一致性在圖17中表示。
正如所見，兩個系列之間的重疊相當狹窄，提示肉眼評價很適當。異常的節(jié)段包括一個運動障礙節(jié)段(增厚分數(shù)好但運動異常)和3個無運動節(jié)段，其中有一個甚至出現(xiàn)收縮期變薄。接下來可以認為我們對正常和運動低下/無運動的定性是正確的，因此能夠進行第二步和心肌動力的更廣泛的評價。
第二步是將每次應激試驗中的ECG結果與超聲心動評價建立相關性。結果作圖見圖18?；貧w曲線用紅色顯示，提示異常的ECG與異常的回聲大致相關。兩個陰影區(qū)域代表兩套主要數(shù)據(jù)第一個是運動正常的回聲與正常/輕微缺血的ECG，第二個是異常的回聲(運動低下和無運動)與嚴重缺血的ECG(得分為3)。
其中缺血ECG對應正常回聲的6個點是由于方法上的困難，不可能每個試驗都獲得滿意的數(shù)據(jù)(getting a good clip for every test)，提示可能回聲缺陷被遺漏。另一方面，只有3個試驗顯示具有回聲缺陷的輕微缺血ECG。沒有正常ECG與異常回聲相關，提示ECG的敏感性好。
第三步，隨訪兩組、每組4只待治療的動物的超聲心動的演變。得分分級為1(正常)，2(運動地下)或3(無運動)。在這一批動物中沒有運動障礙的節(jié)段。原始數(shù)據(jù)標在表4中。如這一附件中可見，基線值不同(平均分為2.25對1.5)。因此，對整批動物用各自的基線值作為100％進行標準化。然后以下代表每只動物的點就用基線值的百分數(shù)來表示。最終數(shù)字在圖19中顯示。
表4超聲心動評分的原始數(shù)據(jù)

NV1FGF治療的動物評分顯著低于空白質粒處理的動物的評分(用非配對t檢驗分析)，提示FGF-1的存在對于心肌收縮力的影響，而空白質粒處理的動物評分增加。
重要的是，由于最終處死步驟包括了其他方法分析，未在此詳述，所以這些動物在第28天沒有回聲記錄。
圖19所示結果清楚地顯示用多點NV1FGF心肌內注射處理的動物在應激時都有缺血模式的減輕，表現(xiàn)在ECG和超聲心動上，而注射空白質粒的動物沒有。這些結果也清楚地顯示，在高膽固醇血癥的背景中，NV1FGF的作用對心臟對應激狀態(tài)的適應有幫助。
實施例21NV1FGF治療的心肌中小動脈的誘導的證實21.1/動物本試驗使用成年雄性小型豬(30kg)。共使用34只動物(預計最后每個治療組和對照組為n＝8，共4組)。動物飼養(yǎng)于標準環(huán)境，給予規(guī)律飲食。Duke大學動物管理及使用委員會批準了所有程序和草案。動物所受的人類的管理，遵從由國立醫(yī)學研究院(the National Society for MedicalResearch)編寫的“試驗動物管理原則”和由試驗動物資源研究所準備，由國立衛(wèi)生研究院出版的“管理及使用試驗動物的指南”(NIH出版85-23，1985修訂)。
動物被麻醉并經(jīng)口氣管插管。在整個過程中使用持續(xù)心電圖和脈搏血氧(pulse-oximetric)監(jiān)護，以保證心律和氧合穩(wěn)定。在無菌環(huán)境下，通過第4肋間隙進行左側前外側胸廓切開術。心包膜被縱行分離，收縮左心耳以便暴露左旋(LCx)動脈。LCx近端被分離，以便在血管周圍放置液體閉合器(hydraulic occluder)和2mm的超聲血流探頭(Transonic Systems，Inc.，Ithaca，NY)。血流探頭放置于閉合器的遠端，以便記錄經(jīng)過LCx的下游血流。通過一個單獨的針刺切口(separate stab incision)取出閉合器和血流探頭。放置20號French胸管，逐層縫合傷口。在操作結束時拔除胸管。術后3天，閉合器膨脹，使LCx的靜息時血流減少到基線值的近10％，其利用植入的血流探頭評價得出。動物維持該低血流狀態(tài)2周，每周記錄3次血流，來保證進行生理學評價前血管阻塞的程度相同。
21. 2/正電子發(fā)射成像，多巴酚丁胺應激心電圖和彩色微球低血流狀態(tài)32±11天后，對動物進行正電子發(fā)射成像(PET)和多巴酚丁胺應激心電圖(DSE)來描述心臟的血流、代謝和功能狀態(tài)，證明在LCx供血區(qū)存在缺血的存活心肌。如果LCx供血的左室側壁和下后壁發(fā)現(xiàn)血流缺損，同時該區(qū)域的葡萄糖利用率正常或升高(均為與非缺血的心間隔區(qū)相比)，則PET掃描解釋為冬眠的心肌。使用DSE，左室側壁和后下壁的存活力定義為在靜息時收縮力嚴重低下的心肌區(qū)域中，低劑量多巴酚丁胺使收縮時室壁的增厚程度的改善。如果收縮性室壁運動在應激時減弱，則認為存活區(qū)段缺血(雙向性反應)。
PET和DSE確認存在缺血的心肌后進行給藥，所述確認利用開胸的方式(LCx閉塞后52±16天)，通過直接心肌內注射表達FGF的質粒如NV1FGF進行。載體在10個位置用藥(每個質粒載體的注射位置100μg/100ul)，分散于左室游離壁。對照組注射10次100μl的鹽水。進行治療的操作者和試驗者對治療不知情。所有的有效參數(shù)以盲法賦值，在試驗結束時才公開代碼。
21. 3/試驗設計
21 3/實驗設計 治療后109±13天，切除心臟進行組織學分析和灌注化驗。用圖20所示的標準步驟制備樣本。更精確地，將心臟沿3個短軸(心尖部、中部和心底部節(jié)段)切片。每個節(jié)段分為6個(中部和心底部節(jié)段)或4個(心尖部節(jié)段)朝向的區(qū)段，每個心臟總共分為16區(qū)段。然后每個區(qū)段分為3個跨漿膜的樣本，一個樣本被存儲以備微球灌注分析，另一個在液氮制冷的異戊烷中迅速冷凍，最后一個樣本在3.7％福爾馬林中固定。由右心室取一個樣本作為對照。
21.41組織學分析用標準步驟制備切片。每個福爾馬林固定的樣本用石蠟包埋，每塊連續(xù)切取3張5μm的切片。每個切片用蘇木精-伊紅-番紅花(HES)染色，用于組織病理檢查評價壞死后纖維化，連續(xù)切片用抗α平滑肌肌動蛋白(SMA)抗體染色，以便識別動脈和小動脈。在成熟血管中的內皮細胞相關的外膜細胞以及平滑肌細胞均實際表達α-SMA(Benjamin et al.，Development，125，1591-1598.1998)。眾所周知，某些大靜脈可以被這種抗體染色，但是根據(jù)形態(tài)學標準可以很容易識別。
21.4. 1/α-SMA染色取自所有豬的所有區(qū)段均用α-SMA進行免疫組化。本步驟使用DakoEnVisionTM+/HRP(馬蘿卜過氧化物酶)(Horse Radish Peroxidase)檢測系統(tǒng)(Dako，Sabattini et al.，J.Clin Pathol，51506-511，1998)。切片用抗α-SMA單克隆抗體(Dako，克隆1A4，1∶100倍稀釋)保溫。第二步為使用與HRP標記的聚合體偶聯(lián)的山羊抗兔抗體保溫。用發(fā)色二氨基聯(lián)苯底物定位免疫復合物。切片用蘇木精復染，脫水并用永久包埋介質進行包埋。用這種方法，免疫反應細胞顯褐色，核為藍色。
21.4.2/形態(tài)計量學分析由唯一的一個觀察者進行測量，他對治療方案不知情。對每個區(qū)段，先分析HES染色的切片，以便確定瘢痕區(qū)域(壞死后纖維化)。在低倍放大(×25)下對樣本中纖維化的量進行評分，按如下分級+最小(被纖維化影向的樣本表面少于5％)；++輕度(～5-15％的樣本表面)+++顯著(～15-25％的樣本表面)++++嚴重(超過樣本的25％)評價α-SMA染色的連續(xù)切片中的血管密度。在9個高倍顯微鏡視野(均為0.37mm2)中計數(shù)α-SMA染色的血管數(shù)目，所述視野位于i)瘢痕中央(3個視野)，ii)瘢痕邊界(3個視野)，以及iii)遠離瘢痕處，即在存活的心肌中(3個視野)。對每一個視野均記錄3類血管小的單層血管，直徑＜100μm的多層血管，直徑＞100μm的小動脈和動脈(見圖2)。根據(jù)它們的形態(tài)學特點，分析時排除被α-SMA染色的大靜脈。重要的是，形態(tài)學分析中排除了大量的含有α-SMA纖維的成肌纖維細胞。
然后通過將將被注射的5個部分(BA，BAL，MA，MAL和AA區(qū)段)的數(shù)據(jù)合并來計算每個區(qū)域(瘢痕區(qū)、瘢痕邊界、存活心肌)的血管密度(即每mm2內每類血管的數(shù)目)。作為附加的對照，也計算非注射區(qū)(BIL，BI，BIS，BAS，MIL，MI，MIS，MAS，AL，AI，AS區(qū)段)中的血管密度。
21.4.3/轉基因表達將NV1FGF治療的豬的BA，BAL，MA，MAL及AA區(qū)段進行FGF-1免疫組化。用經(jīng)典的鏈霉抗生物素-生物素分析來評價FGF-1的表達。用一級多克隆抗-FGF-1兔抗體(R&D Systems，#AB-32-NA，1∶30倍稀釋)保溫，再用生物素酰化的驢抗兔免疫球蛋白(Amersham，1∶200倍稀釋)保溫。在加入與鏈霉抗生物素偶聯(lián)的過氧化物酶后，用產(chǎn)色的二氨基聯(lián)苯為底物來定位免疫復合物。切片用蘇木精復染，脫水及用永久包埋介質進行包埋。用這種方法，免疫反應細胞顯褐色，核為藍色。在整個分析過程中，使用事先表現(xiàn)有高水平pCOR-CMV鼠FGF-1質粒基因轉移的大鼠肌肉的陽性切片，對FGF-1 IHC的性能進行控制。
21.4.4/統(tǒng)計分析在不同區(qū)域中(瘢痕區(qū)、瘢痕邊界、存活心肌)證明鹽水組與質粒治療組相比較，脈管系統(tǒng)中的數(shù)量變化，計算每類血管的算術平均數(shù)和標準差(Sd)。用單因素方差分析(ANOVA，SigmaStat，Jandel Scientific).比較組間數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)顯著差異后，采用Dunnett′s方法相對于對照組進行多重比較。所有在p＜0.05水平的差異均被認為是顯著的。
21.5/評價血管密度將用NV1FFGF處理的動物中的注射區(qū)與對照動物中的NaCl注射區(qū)的平均值進行比較(圖21)。
在存活心肌中，分別對每類血管(小、中、大)進行分析。無論在何種治療組中，均在纖維化瘢痕中觀察到大量的直徑＜100μm的動脈結構。僅根據(jù)形態(tài)學標準，這些血管與自然的心肌血管不能區(qū)別。它們大部分為小血管，顯示單層平滑肌細胞。
與注射鹽水的區(qū)域比較，給予心臟NV1FGF可在注射區(qū)域內的心肌可存活部分中誘導小的單層血管密度增加22％和20％(p＝0.017)。對于較大血管則沒有顯示這種影響。
這些結果清楚地顯示，直接心肌內注射編碼任何一種spFGF-1轉基因的pCOR質粒，在缺血豬心臟中誘導了明顯的單層動脈的密度增加，即具有單層平滑肌細胞的小動脈。這些結果也顯示了直接心肌內注射NV1FGF后長期持續(xù)的FGF-1表達。事實上，通常位于注射位點周圍的某些心肌纖維，在用藥后104到132天表達可檢測量的FGF-1。長期持續(xù)的表達可能有益于動脈生成和維持誘導的新血管所需的前體細胞的補充和分裂。在獲取的時候，認為這些血管處于動脈生成的早期階段。
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權利要求
1.一種方法，其用于治療高膽固醇血癥或糖尿病患者中與高膽固醇血癥或糖尿病相關的心肌或骨骼肌的血管生成疾病或缺陷，所述方法包括給予所述患者有效量的編碼纖維母細胞生長因子的質粒，其中VEGF-A因子表達不會在心肌或骨骼肌中誘導。
2.一種方法，其用于治療高膽固醇血癥或糖尿病患者中與高膽固醇血癥或糖尿病相關的血管內皮功能不良，包括在上述患者的骨骼肌或心肌中給予一定量編碼纖維母細胞生長因子的質粒，所述的量足以逆轉心肌或骨骼肌的血管生成缺陷，其中VEGF-A因子表達不會在所述肌肉中誘導。
3.一種方法，其用于治療高膽固醇血癥或糖尿病患者中與高膽固醇血癥或糖尿病相關的心肌或骨骼肌的血管生成疾病，包括將一定量編碼纖維母細胞生長因子的質粒給予上述患者，所述的量足以促進所述患者的心肌或骨骼肌中的血管形成，其中VEGF-A因子表達不會在所述肌肉中誘導。
4.一種方法，其用于治療高膽固醇血癥或糖尿病患者中與高膽固醇血癥或糖尿病相關的心肌或骨骼肌的血管生成疾病，包括給予所述患者一定量編碼纖維母細胞生長因子的質粒，所述的量足以促進所述患者的心肌或骨骼肌中的成熟側支血管和小動脈的生成。
5.一種方法，其用于促進需要所述治療的哺乳動物受試者中的缺血心肌或骨骼肌組織中的成熟側支血管形成，包括向所述受試者的所述組織中注射有效量的編碼纖維母細胞生長因子的質粒，其中VEGF-A因子表達不會在所述受試者中誘導。
6.一種方法，其用于促進需要所述治療的哺乳動物受試者中的缺血心肌或骨骼肌組織中側支血管和小動脈的形成，所述方法包括向所述受試者的所述組織中注射有效量的編碼纖維母細胞生長因子的質粒。
7.如權利要求6所述的方法，其中VEGF-A因子表達不在所述受試者的心肌或骨骼肌中誘導。
8.一種方法，其用于逆轉高膽固醇血癥或糖尿病患者中因高膽固醇血癥或糖尿病而引起的血管生成缺陷而不誘導VEGF-A因子表達，所述方法包括向所述受試者的心肌或骨骼肌組織中注射有效量的表達纖維母細胞生長因子的質粒，以促進側支血管和小動脈的形成。
9.一種方法，其用于促進高膽固醇血癥或糖尿病的患者的心肌或骨骼肌中成熟大傳導血管(＞150um的側支血管)和小阻力動脈(＜50pm的小動脈)的形成，包括向上述肌肉中注射有效量的表達纖維母細胞生長因子的質粒。
10.如權利要求9所述的方法，其中不誘導VEGF-A因子。
11.如權利要求1至10中的任意一項權利要求所述的方法，其中質粒的注射在大腿和小腿的后部和/或前部中的骨骼肌中重復進行。
12.如權利要求11所述的方法，其中所述質粒通過在所述肌肉的缺血部位周圍以多次注射的方式給藥。
13.如權利要求1至10中的任意一項權利要求所述的方法，其中所述質粒經(jīng)冠脈內、經(jīng)心肌內、經(jīng)胸廓、經(jīng)心包或心外膜注射給予所述患者的心肌。
14.如權利要求13所述的方法，其中對心肌的給藥通過在所述心肌的缺血部位周圍進行多次注射或通過單次注射(one single injection)來進行。
15.如權利要求13或14所述的方法，其中所述注射通過導管進行。
16.如權利要求15的方法，其中所述的導管是針式導管。
17.如權利要求1至16中的任意一項權利要求所述的方法，其中的纖維母細胞生長因子是FGF-1或酸性纖維母細胞生長因子。
18.如權利要求1至18中的任意一項權利要求所述的方法，其中的質粒進一步包括調節(jié)序列，編碼位于FGF-1基因上游的信號肽的序列，終止信號以及位于FGF-1基因下游的多聚腺苷酸信號。
19.如權利要求1至19中的任意一項權利要求所述的方法，其中所述調節(jié)序列是CMV啟動子，所述信號肽序列來源于干擾素的肽序列，多聚腺苷酸信號來源于SV40的多聚腺苷酸信號，而編碼FGF-1的質粒稱為NV1FGF。
20.如權利要求1至17中的任意一項權利要求所述的方法，其中將所述質粒與低分子量肝素聯(lián)合用藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼纖維母細胞生長因子質粒的應用，其作為預防和治療與高膽固醇血癥或糖尿病相關的心肌或骨骼血管生成缺陷的治療藥物。本發(fā)明也涉及用于增強患有高膽固醇血癥或糖尿病的哺乳動物受試者中心肌和骨骼的缺血組織中的側支血管和小動脈生成的方法。本發(fā)明進一步涉及促進缺血心肌或骨骼組織中側支血管生成的方法，該方法不誘導VEGF－A因子表達，也不引起所治療肌肉的水腫。
文檔編號A61K31/727GK1832763SQ200480022288
公開日2006年9月13日 申請日期2004年6月4日 優(yōu)先權日2003年6月5日
發(fā)明者亞歷克西斯·卡倫, 弗洛倫斯·伊曼紐爾, 安妮·卡倫, 弗朗科伊斯·菲尼爾斯, 桑德林·米歇萊特, 伯特蘭德·施瓦茨, 迪迪爾·勞伊, 迪迪爾·布拉尼利克 申請人:森特利昂公司