專利名稱：注射骨髓源細胞和培養(yǎng)基用于血管生成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及注射自體骨髓和骨髓細胞的方法。更具體地，本發(fā)明涉及心肌內(nèi)注射自體骨髓和轉(zhuǎn)染的骨髓細胞，和/或來源于這些細胞培養(yǎng)生長時(其不是必需從自體細胞得到)的培養(yǎng)基，以增強側(cè)支血管形成(血管生成(angiogenesis))和組織灌注。
背景技術(shù)：
應(yīng)用重組基因或生長因子增強心肌側(cè)支血管(collateral bloodvessel)功能，代表了治療心血管疾病的一種新方法。Komowski，R.等人，“Delivery strategies for therapeutic myocardial angiogenesis，”Circulation 2000；101454-458。此觀點的證據(jù)顯示于心肌缺血動物模型中，臨床試驗正在進行中。Unger，E.F.等人，“Basic fibroblast growthfactor enhances myocardial collateral flow in a canine model，”Am JPhysiol 1994；266H1588-1595；Banai，S.等人，“Angiogenic-inducedenhancement of collateral blood flow to ischemic myocardium by vascularendothelial growth factor in dogs，”Circulation 1994；83-2189；Lazarous，D.F.等人，“Effect of chronic systemic administration of basic fibroblastgrowth factor on collateral development in the canine heart，”Circulation1995；91145-153；Lazarous，D.F.等人，“Comparative effects of basicdevelopment and the arterial response to injury，”Circulation 1996；941074-1082；Giordano，F(xiàn).J.等人，“Intracoronary gene transfer of fibroblastgrowth factor-5 increases blood flow and contractile function in anischemic region of the heart，”Nature Med 1996；2534-9。Guzman，R.J.等人，“Efficient gene transfer into myocardium by direct injection ofadenovirus vectors，”Circ Res 1993；731202-7；Mack，C.A.等人，“Biologic bypass with the use of adenovirus-mediated gene transfer of thecomplementary deoxyribonucleic acid for VEGF-121，improvesmyocardial perfusion and function in the ischemic porcine heart，”J ThoracCardiovasc Surg 1998；115168-77。
在心肌缺血動物模型中，已經(jīng)研究了直接術(shù)中心肌內(nèi)注射(direct intra-operative intramyocardial injection)血管生成因子(angiogenicfactor)對側(cè)支功能(collateral function)的效應(yīng)。開胸、經(jīng)心外膜給予腺病毒載體，導(dǎo)致側(cè)支功能增強，所述腺病毒載體含有編碼血管生成肽的轉(zhuǎn)基因(transgene)(Mack等人，見上)。也報道，在患者的開心臟手術(shù)期間直接心肌內(nèi)注射血管生成肽或質(zhì)粒載體時，發(fā)生血管生成。Schumacher，B.等人，“Induction of neoangiogenesis in ischemicmyocardium by human growth factors.First clinical results of a newtreatment of coronary heart disease，”Circulation 1998；97645-650；Losordo，D.W.等人，“Gene therapy for myocardial angiogenesisinitialclinical results with direct myocardial injection of phVEGF 165 as soletherapy for myocardial ischemia，”Circulation 1998；982800。我們不希望將本專利限制為心肌內(nèi)注射，—我們應(yīng)該省略本段嗎？ 盡管治療性血管生成(therapeutic angiogenesis)作為一種新形式，對治療患有冠狀動脈疾病的患者是大有希望的，但是在關(guān)于哪種具體策略將最佳促進臨床上相關(guān)的治療性血管生成反應(yīng)上，仍然存在著巨大差距。而且，不清楚多種血管生成生長因子(angiogenic growthfactor)中的哪一個(或更多個)可能和有益的血管生成反應(yīng)相關(guān)。此外，應(yīng)用不同的組織輸送平臺，例如，蛋白質(zhì)、腺病毒或“裸”DNA(nakedDNA)促進最佳的血管生成反應(yīng)，仍然是懸而未決的問題。
發(fā)明概述 本發(fā)明基于這樣的前提多種復(fù)雜的過程涉及幾十個基因的差異表達，如果不是數(shù)百個基因的話，而所述過程對于最適的側(cè)支發(fā)育是必要的?；诖烁拍?，隨之是，側(cè)支血管的最適發(fā)育和組織灌注不能通過給予單一的基因而得到，已知所述基因的編碼產(chǎn)物和血管生成相關(guān)；或者由于血管生成過程的復(fù)雜性，也不能通過給予血管生成相關(guān)基因的一個組合而得到。本發(fā)明依賴于骨髓細胞分泌參與血管生成的生長因子和細胞因子的能力，所述分泌是時問和濃度依賴性的協(xié)調(diào)的和合適的順序進行的。
絕大多數(shù)當(dāng)前處于試驗中的治療方法集中于，將單一的血管生成生長因子(例如，VEGF、FGF、血管生成素-1(angiopoietin-1))輸送至缺血組織。這可以通過輸送終產(chǎn)物(例如，蛋白質(zhì))或應(yīng)用不同載體通過基因轉(zhuǎn)移來完成。然而，認為在幾種生長因子體系中的復(fù)雜相互作用，對于起始和維持新血管形成可能是必需的。更具體地，認為用各種血管生成細胞因子(angiogenic cytokines)誘導(dǎo)特異定位的血管生成環(huán)境(specific localized angiogenic milieu)是重要的，所述細胞因子以協(xié)調(diào)一致的和時間適當(dāng)?shù)姆绞?in concert and in a time-appropriate manner)相互作用，從而起始和維持新血管的形成和功能。
因此，在一種實施方案中，本發(fā)明提供了方法，用于在需要的患者中增強受損骨髓細胞促進側(cè)支血管發(fā)育的能力。受損骨髓細胞(impaired bone marrow cells)是從患者得到的，并且在合適的培養(yǎng)條件下在合適的培養(yǎng)基中生長一段時間，所述時間足以促進由骨髓細胞產(chǎn)生的早期附著細胞(early attaching cells)。至少一部分早期附著細胞被載體轉(zhuǎn)染，所述載體包括編碼一種或多種因子(agents)的多核苷酸，所述因子選自血管生成細胞因子、生長因子和哺乳動物血管生成促進因子(angiogenic-promoting factors)，轉(zhuǎn)染的骨髓細胞被進一步培養(yǎng)一段時間，所述時間足以使一種或多種因子產(chǎn)生。通過此方法，培養(yǎng)的骨髓細胞和/或來自這些細胞培養(yǎng)生長中的培養(yǎng)基促進患者側(cè)支血管發(fā)育的能力被增強，所述細胞和/或培養(yǎng)基被輸送入了所述患者，這是與非轉(zhuǎn)染的細胞或來自由培養(yǎng)生長的非轉(zhuǎn)染細胞得到的培養(yǎng)基的能力相比而言的。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了增強所需患者中側(cè)支血管形成的方法，如下實施使骨髓在合適的培養(yǎng)條件下生長一段時間，所述時間足以促進由骨髓產(chǎn)生早期附著細胞；用載體轉(zhuǎn)染至少一部分早期附著細胞，所述載體包括編碼一種或多種因子的多核苷酸，所述因子選白血管生成細胞因子、生長因子和哺乳動物血管生成促進因子，用于由早期附著細胞表達，和在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的早期附著細胞和培養(yǎng)一段時間，所述時間適于使細胞表達一種或多種因子，從而產(chǎn)生條件培養(yǎng)基(conditioned medium)。隨后，將有效量的轉(zhuǎn)染的早期附著細胞和/或條件培養(yǎng)基直接給予患者的所需部位，從而增強患者中該部位的側(cè)支血管形成(collateral blood vessel formation)。
在又一種實施方案中，本發(fā)明提供了治療組合物，包括來自骨髓的早期附著細胞，所述細胞已經(jīng)被載體轉(zhuǎn)染，所述載體包括編碼一種或多種因子的多核苷酸，所述因子選自血管生成細胞因子、生長因子和血管生成促進因子。治療組合物可以進一步包括條件培養(yǎng)基，在條件培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染的細胞已經(jīng)培養(yǎng)生長一段時間，所述時間足以使一種或多種轉(zhuǎn)基因因子以及其它因子表達，所述因子通常由這些培養(yǎng)細胞產(chǎn)生。
附圖簡述

圖1是PAEC’s的增殖對條件培養(yǎng)基量的圖； 圖2是內(nèi)皮細胞增殖對條件培養(yǎng)基量的圖； 圖3是經(jīng)四周時間期間，條件培養(yǎng)基中VEGF濃度的圖；和 圖4是經(jīng)四周時間期間，條件培養(yǎng)基中MCP-1濃度的圖。
圖5是顯示來自小鼠的CD34+細胞和骨髓源基質(zhì)細胞(bonemarrow-derived stromal cells)的VEGF、MCP-1和bFGF體外產(chǎn)量的圖。
圖6是曲線圖，顯示了當(dāng)被注射入小鼠缺血后肢的內(nèi)收肌(adductor muscles)時，骨髓源基質(zhì)細胞對側(cè)支血流(collateral flow)發(fā)育的影響，如激光/多普勒灌注成像所確定。血流(flow)被表示為缺血肢體的血流和正常后肢血流的比值。MSC＝骨髓源基質(zhì)細胞(marrow-derived stromal cell)；培養(yǎng)基(Media)＝非條件培養(yǎng)基(non-conditioned media)；MAEC＝小鼠主動脈內(nèi)皮細胞(mouse aorticendothelial cells)。
圖7是顯示對體外釋放VEGF和bFGF的影響的圖，所述VEGF和bFGF來自用腺病毒轉(zhuǎn)染的骨髓源基質(zhì)細胞(MSCs)，所述腺病毒編碼HIF-1α-VP16。(MSC＝單獨的MSCs；缺氧＝單獨的缺氧條件；HIP＝用編碼融合蛋白HIF-1α-VP16的DNA轉(zhuǎn)染的MSCs。數(shù)據(jù)代表了對至少3個不同的MSC群的分析。
圖8是曲線圖，顯示了與接受1×105非轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSCs相比，在接受注射入后肢的1×105HIF-1α/VP16轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSCs的小鼠中，改進的體內(nèi)血流恢復(fù)(趨勢比較p＝0.05，經(jīng)ANOVA比較)。細胞在第一天被注射。
發(fā)明詳述 骨髓(bone marrow)(BM)是參與調(diào)控血管生成過程的廣譜的細胞因子(例如，生長因子)和細胞的天然來源。因此認為，輸送自體BM((autologous)(A)BM)或從其而來的骨髓細胞，或當(dāng)這些細胞培養(yǎng)生長時、來自這些細胞的培養(yǎng)基，通過利用這些細胞以時間適當(dāng)?shù)姆绞椒置谠S多血管生成因子的天然能力，提供了在缺血心肌中獲得治療性側(cè)支發(fā)育的最適干預(yù)手段。
根據(jù)本發(fā)明的多種多樣的實施方案，注射自體骨髓或來自自體骨髓的細胞，或當(dāng)這些細胞培養(yǎng)生長時、來自這些細胞的培養(yǎng)基，或是以“單獨”(stand alone)治療劑或是和任意的藥理學(xué)藥物、蛋白質(zhì)或基因或任何其它化合物或干預(yù)手段相結(jié)合，所述藥理學(xué)藥物、蛋白質(zhì)或基因或任何其它化合物可以增強骨髓產(chǎn)生血管生成生長因子和/或促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管管道形成?？梢詫ⅰ敖M合的”(combined)血管生成因子直接注射入患者或靶組織，或在將骨髓或骨髓細胞注射入患者之前，在體外和骨髓溫育。如此處所應(yīng)用，術(shù)語“骨髓細胞”(bonemarrow cell)意味著，通過在細胞生長條件下培養(yǎng)抽吸的骨髓(aspiratedbone marrow)而產(chǎn)生的任何細胞。
這些“組合的”血管生成因子的非限制性例子是，粒細胞-單核細胞集落刺激因子(Granulocyte-Monocyte Colony Stimulatory Factor(GM-CSF))、單核細胞趨化蛋白1(Monocyte Chemoattractant Protein 1(MCP-1))和缺氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia Inducible Factor-1(HIF-1))。
骨髓也是參與血管生成調(diào)控和炎癥過程的廣譜的細胞因子、生長因子和血管生成促進因子(angiogenesis-promoting factors)的天然來源。表達的細胞因子、生長因子和血管生成促進因子包括已知參與維持早期和晚期血細胞生成的介質(zhì)(IL-1α和IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11和IL-13；集落刺激因子、血小板生成素、紅細胞生成素、干細胞因子、fit 3-配體、肝細胞生長因子、腫瘤壞死因子α、白血病抑制因子、轉(zhuǎn)化生長因子β1和β3；和巨噬細胞炎性蛋白1α(macrophageinflammatory protein 1 alpha)，血管生成因子(成纖維細胞生長因子1和2、血管內(nèi)皮生長因子)和其通常的靶(和來源)是結(jié)締組織形成細胞的介質(zhì)(血小板源性生長因子A、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子α和β2、制瘤素M和胰島素樣生長因子-1)，或神經(jīng)元細胞的介質(zhì)(神經(jīng)生長因子)。Sensebe，L.等人，Stem Cells 1997；15133-43。而且，已經(jīng)顯示，VEGF多肽存在于血小板和巨核細胞中，和β-血小板球蛋白的釋放一起從活化的血小板釋放。Wartiovaara，U.等人，Thromb Haemost 1998；80171-5；Mohle，R.，Proc Natl Acad Sci USA 1997；94663-8。
也有指示物支持下述概念需要血管生成以支持骨髓功能和造血細胞的發(fā)育，包括干細胞和祖細胞，其可以進入循環(huán)并靶向于創(chuàng)傷愈合和/或缺血組織，最終有助于新血管形成。已經(jīng)顯示，特異地識別從成人骨髓分離出的未分化間充質(zhì)祖細胞的單克隆抗體，識別發(fā)育中的微血管的細胞表面標(biāo)志物，證據(jù)證明，這種細胞可以在胚胎血管生成中起作用。Fleming，J.E.，Jr.，Dev Dyn 1998；212119-32。
在病理狀態(tài)下，骨髓血管生成可以變得過度，在所述病理狀態(tài)中，骨髓被惡性細胞所活化(如在多發(fā)性骨髓瘤中)，其處已經(jīng)顯示，骨髓血管生成和人多發(fā)性骨髓瘤細胞的進展同時增加。Ribatti，D.等人，Br J Cancer 1999；79451-5。而且，已經(jīng)顯示，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在造血腫瘤(hematopoietic neoplasms)如多發(fā)性骨髓瘤的生長中通過或是旁分泌或是自分泌機制起作用。Bellamy，W.T.，Cancer Res 1999；59728-33；Fiedler，W.，Blood 1997；891870-5)。認為具有其獨特的天然體液性質(zhì)和細胞性質(zhì)的自體骨髓，是多種血管生成化合物的潛在來源。此“混合的”血管生成細胞因子的天然來源可以驚人地被用作有效的相互作用的生長因子(interactive growth factors)的混合物，以產(chǎn)生治療性血管生成和/或肌生成(myogenesis)；應(yīng)用細胞本身可以提供這些天然血管生成因子的更加持續(xù)的來源。
此外，現(xiàn)在驚人地發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)這種骨髓細胞的培養(yǎng)基含有這種相互作用的生長因子蛋白的混合物，所述蛋白產(chǎn)生治療性血管生成和/或肌生成。而且，治療效應(yīng)可以通過培養(yǎng)非自體骨髓細胞一段時間而產(chǎn)生，所述時間適于使相互作用的生長因子蛋白從骨髓細胞產(chǎn)生和向缺血組織區(qū)輸送“條件”培養(yǎng)基，以產(chǎn)生治療性血管生成和/或肌生成。事實上，這是“預(yù)料不到的結(jié)果”當(dāng)轉(zhuǎn)染早期附著骨髓細胞時，將這種骨髓細胞和通過使轉(zhuǎn)染的骨髓細胞培養(yǎng)生長而得到的條件培養(yǎng)基，或單獨的條件培養(yǎng)基注射入缺血相關(guān)組織或經(jīng)注射輸送入血流，如供應(yīng)缺血組織的動脈，或任何其它動脈或靜脈，導(dǎo)致的血管生成大于單獨注射轉(zhuǎn)染的骨髓干細胞導(dǎo)致的血管生成。
最可能參與響應(yīng)于缺血而起始血管生成的血管生成促進因子之一是HIF-1，其為一種有效的轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合并刺激參與缺氧反應(yīng)的幾個基因的啟動子。HIF-1的誘導(dǎo)和活化由組織pO2緊密調(diào)控；HIF-1表達隨pO2降低而呈指數(shù)增加，從而提供了正反饋環(huán)，通過正反饋環(huán)，pO2降低引起基因產(chǎn)物表達增加，所述產(chǎn)物對低氧環(huán)境起適應(yīng)性反應(yīng)的作用。HIF-1活化導(dǎo)致，例如，參與糖酵解的基因紅細胞生成素的誘導(dǎo)，和VEGF的表達。它可能也調(diào)節(jié)許多其它基因的表達，所述基因參與對低pO2水平的適應(yīng)性反應(yīng)。HIF-1調(diào)節(jié)參與對低氧反應(yīng)的蛋白質(zhì)的水平的機制是通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)響應(yīng)于低pO2的基因而實現(xiàn)的。因此，這種基因在啟動子或增強子區(qū)內(nèi)有短的DNA序列，其含有HIF-1結(jié)合位點，被稱為缺氧反應(yīng)元件(hypoxia responsive element)(HRE)。HIF-1是異二聚體，帶有基本的螺旋-環(huán)-螺旋基序，由亞基HIF-1α和HIF-1β構(gòu)成。其水平是通過pO2調(diào)節(jié)的，既在轉(zhuǎn)錄水平也在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)—HIF-1誘導(dǎo)通過缺氧而增加，并且其半衰期隨pO2水平增加而顯著降低。
相關(guān)的是，盡管HIF-1的表達(如在Hela細胞中所確定)與pO2指數(shù)相關(guān)和負相關(guān)，曲線的拐點(inflection point)在氧飽和度為5％時發(fā)生，最大活性在0.5％處，1/2最大活性在1.5-2.0％處。這些相對缺氧的低水平，并且不清楚這種水平是否發(fā)生于存在中度水平的心肌缺血或下肢缺血時-即，不存在組織壞死時(分別是心肌梗塞，和腿部潰瘍)的水平。因此，骨髓細胞可以具有分泌血管生成因子，從而增強側(cè)支發(fā)育的能力。然而，可能的是，如果一些附加的刺激不存在，這種活性在被治療的具體組織環(huán)境中可以不變得顯著。因此，如果需要，給予骨髓或者骨髓細胞，和HIF-1共同植入，是本發(fā)明的一個優(yōu)選方面。預(yù)期的是，HIF-1將為骨髓移植物中存在的許多缺氧誘導(dǎo)的血管生成基因提供最佳的表達。HIF-1可以作為蛋白質(zhì)或是作為基因被注射。如果是作為后者，其可以在質(zhì)粒載體或者病毒載體中被注射，或者以任意其它方式被注射，所述方式導(dǎo)致出現(xiàn)功能上相關(guān)的蛋白質(zhì)水平。
HIF-1是轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄激活作用中起關(guān)鍵作用。它以異二聚體起作用，異二聚體由HIF-1α和HIF-1β亞基組成。HIF-1活性由HIF-1α亞基的穩(wěn)定性所控制。因此，HIF-1α在常氧環(huán)境下被泛素化，其靶向于該分子的蛋白酶體降解(proteasomaldegradation)。缺氧導(dǎo)致泛素化降低，從而增強蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。這增強了異二聚體形成，從而增加HIF-1活性。HIF-1的功能活性緊密地和負性地與氧水平相偶聯(lián)的事實提示了其作為氧的分子感受器，和從而在細胞對缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)中的關(guān)鍵作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性來源于異二聚體結(jié)合于特異的DNA缺氧-反應(yīng)識別元件(HRE)的能力，如所述，異二聚體僅在缺氧條件下形成，缺氧-反應(yīng)識別元件存在于參與細胞對缺氧的反應(yīng)的許多基因的啟動子中，包括VEGF、VEGFR1、VEGFR2、Ang-2、Tie-1和一氧化氮合酶。因此，HIF-1在協(xié)調(diào)組織對缺氧的反應(yīng)中起重要作用。
由于HIF-1α在不存在缺氧時的不穩(wěn)定性，為了確認其甚至在常氧條件下的組成性活性(constitutive activity)，構(gòu)建了HIF-1α基因的嵌合(chimeric)構(gòu)建體，由來自HIF-1α的DNA-結(jié)合和二聚化結(jié)構(gòu)域和來自單純皰疹病毒VP16蛋白的轉(zhuǎn)錄激活域構(gòu)成，如下面的實施例8中所描述。VP16結(jié)構(gòu)域廢除了HIF-1α中的泛素化位點，從而消除了蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶體介導(dǎo)的降解。因此，得到的穩(wěn)定水平的HIF-1α導(dǎo)致由HIF-1靶向的基因的組成性轉(zhuǎn)錄激活。
然而，著重的是，HIF-1被用作干預(yù)的例子，所述干預(yù)能夠增強血管生成物質(zhì)從骨髓產(chǎn)生。本發(fā)明也涵蓋了其它血管生成因子的用途，這是通過增強HIF-1活性(即，延長其半衰期)或者通過產(chǎn)生和HIF-1相似的效應(yīng)，以刺激骨髓增加血管生成因子的表達。相似的方法涉及將自體骨髓暴露于內(nèi)皮PAS域蛋白(endothelial PAS domain protein 1(EPAS1))。EPAS1和HIF-1共享高度結(jié)構(gòu)同源性和功能同源性，也被稱為HIF-2。
在根據(jù)本發(fā)明的另一種實施方案中，為了通過HIF-1增強VEGF啟動子的活性，可以將骨髓細胞在體外培養(yǎng)中暴露于缺氧或者其它能量形式如，例如，超聲、RF、或電磁能。本干預(yù)增加VEGF和其它基因的表達。通過此效應(yīng)，其可以提高骨髓刺激血管生成的能力。因此，在本實施方案中，本發(fā)明涉及用HIF-1體外刺激抽吸的自體骨髓(或者增強HIF-1效應(yīng)或產(chǎn)生HIF-1對骨髓的相似效應(yīng)的產(chǎn)物)或者直接將骨髓暴露于缺氧環(huán)境，隨后將活化的骨髓細胞或當(dāng)細胞培養(yǎng)生長時，來自這些細胞的培養(yǎng)基輸送至缺血心肌或外周器官(例如，缺血肢體)，以增強心臟和/或外周缺血組織中的側(cè)支依賴性灌注(collateral-dependent perfusion)。
目前的數(shù)據(jù)提示了單核細胞來源的細胞因子對于增強側(cè)支功能的重要性。單核細胞在側(cè)支生長期間在體內(nèi)被激活，單核細胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)在體外通過剪切應(yīng)力被上調(diào)。已經(jīng)顯示，在側(cè)支血管生長(動脈血管形成(arteriogenesis))和毛細血管芽生(血管生成)期間，單核細胞粘附于血管壁。也已經(jīng)顯示，在家兔慢性后肢缺血模型中，在股動脈閉塞之后，MCP-1增強側(cè)支生長(Ito等人，Circ Res 1997；80829-3)。在側(cè)支生長以及毛細血管芽生(sprouting)中，單核細胞活化似乎起了重要作用。在試驗性動脈閉塞7天之后，單核細胞經(jīng)LPS的募集增加和毛細血管密度增加以及側(cè)支和外周傳導(dǎo)性增加相關(guān)聯(lián)(Arms M.等人，J Clin Invest 1998；10140-50.)。
本發(fā)明的又一方面涉及由MCP-1體外刺激抽吸的自體骨髓，隨后通過將活化的骨髓細胞或當(dāng)細胞培養(yǎng)生長時，將來自這些細胞的培養(yǎng)基直接輸送至缺血心肌或外周器官(例如，缺血肢體)，以增強心臟和/或外周缺血組織中的側(cè)支依賴性灌注和肌肉功能。對骨髓的刺激可以通過將骨髓直接暴露于蛋白質(zhì)形式的MCP-1，或者可以用帶有MCP-1基因的載體轉(zhuǎn)染骨髓細胞。例如，可以用攜帶MCP-1轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒載體或腺病毒載體轉(zhuǎn)染骨髓或者來自骨髓的早期附著細胞。
粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒細胞-集落刺激因子(G-CSF)是單核細胞成熟的刺激性細胞因子并且是多能造血生長因子，它被應(yīng)用在臨床實踐上，用于多種造血病理學(xué)中，如白細胞數(shù)目減少(即，白細胞減少，粒細胞減少或者單核細胞減少)，其通常響應(yīng)于免疫抑制或癌癥患者的化學(xué)療法而發(fā)生。GM-CSF也被描述為多譜系生長因子，在體外誘導(dǎo)集落形成，所述集落形成是從紅系爆式集落形成單位(erythroid burst-forming units)、嗜伊紅集落形成單位(colony-forming units(CSF))和多能(CSF)以及從粒細胞-巨噬細胞CSF和粒細胞CFU形成的(Bot F.J.，Exp Hetizato 1989，17292-5)。已經(jīng)顯示，體外暴露于GM-CSF誘導(dǎo)CD-34+祖細胞的快速增殖。(Egeland T.等人，Blood 1991；783192-g.)這些細胞具有分化為血管內(nèi)皮細胞的潛能，并且可以天然地參與出生后血管生成。此外，GM-CSF在巨噬細胞/單核細胞增殖、分化、運動和存活(凋亡速度降低)中行使多重刺激效應(yīng)。與對骨髓源的內(nèi)皮祖細胞和單核細胞的聯(lián)合的已知效應(yīng)一致，本發(fā)明的又一方面是，應(yīng)用GM-CSF作為自體骨髓注射的附加治療，目的是誘導(dǎo)新血管在缺血心血管器官中的形成和分化。而且，GM-CSF可以進一步增強骨髓引起的治療性心肌血管生成，這是通過增強骨髓的效應(yīng)，或者通過進一步刺激骨髓實施的，GM-CSF是在體內(nèi)或以外給予的，骨髓也受因子如HIF-1、EPAS1、缺氧或MCP-1刺激。
然而，當(dāng)一些“危險”(at risk)情況占優(yōu)勢時，骨髓細胞可以不產(chǎn)生最佳的血管生成效應(yīng)，所述骨髓細胞是為了增強血液輸送至缺血區(qū)而被注射入需要側(cè)支血管發(fā)育的區(qū)域的。例如，有證據(jù)證明，在高膽固醇血癥存在時，血管生成受到損害，在衰老(aging)時其也受到損害。此外，存在許多遺傳性疾病和其它疾病，損害天然發(fā)生的血管生成過程，這是和發(fā)現(xiàn)于正常青年健康個體中的血管生成過程相比而言的。目前也發(fā)現(xiàn)，在伴有衰老的高膽固醇血癥存在下，和通過這種遺傳性疾病和其它疾病，骨髓細胞的功能也受損，所述遺傳性疾病和其它疾病損害天然發(fā)生的血管生成過程，這是和發(fā)現(xiàn)于正常青年健康個體中的血管生成過程相比而言的。
高膽固醇血癥是顯型遺傳的遺傳性病理狀態(tài)，其導(dǎo)致顯著增加的低密度脂蛋白膽固醇水平，這起始于出生時，并且導(dǎo)致較早年齡的心肌梗塞。“衰老”(aging)作為術(shù)語用于此處，它不一定用年齡來評定，而是根據(jù)機體在健康狀況下維持血管系統(tǒng)能力的退化狀態(tài)來評定。然而，機體維持血管健康的能力也趨向于隨時間(即，隨年齡)而退化。
試驗證據(jù)提示，老年人脈管系統(tǒng)的側(cè)支發(fā)育受損，老年人代表了受晚期動脈硬化影響的最大的患者群體。骨髓祖細胞(BMPCs)的功能和HIF-1活性均隨衰老而降低。因此，損害側(cè)支發(fā)育的所有的衰老相關(guān)因子(age-related factors)也將影響骨髓源細胞，如從老年患者重新得到并輸送至他們的缺血組織的骨髓源基質(zhì)細胞(MSCs)。隨后是，老年患者的側(cè)支形成受損，這部分是由于HIF-相關(guān)機制受損，和將發(fā)育中的側(cè)支暴露于增加濃度的HIF-1-誘導(dǎo)細胞因子將增強側(cè)支形成。
在另一方面，本發(fā)明認識到這些和其它“危險因子”(risk factors)的混合效應(yīng)，和貫穿本申請方法進行描述，所述方法被設(shè)計為，增強這些功能上受損的骨髓細胞的血管生成潛能，這是通過用編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)這些細胞實施的，所述蛋白質(zhì)將增強這些受損骨髓細胞促進側(cè)支血管發(fā)育的能力。存在幾個另外的基因，其蛋白表達產(chǎn)物重要地增強受損骨髓細胞增強側(cè)支血管形成的能力。例如，在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了方法，用編碼一種或幾種一氧化氮合酶(NOS)的基因轉(zhuǎn)化骨髓細胞?！癗OS基因”作為術(shù)語用于此處，意味著任何已知的NOS異構(gòu)體，包括誘導(dǎo)型NOS(iNOS)和內(nèi)皮型NOS(eNOS)，以及已經(jīng)被突變以致于其表達量被改變的NOS基因，或編碼改變的蛋白的NOS基因，這兩者中的任一導(dǎo)致更有效的血管生成效應(yīng)。
用編碼NOS的多核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的原理基于下列事實被鑒定為更有效的血管生成因子之一VEGF，是通過NOS信號通路起作用的。例如，已經(jīng)顯示，在NOS基因被敲除的小鼠中，VEGF不能誘導(dǎo)血管生成。而且，NOS的蛋白產(chǎn)物一氧化氮(NO)有多重作用，所述作用是誘導(dǎo)血管生成和此外，誘導(dǎo)許多不同基因表達，所述血管基因中的許多參與血管生成。因此，用NOS轉(zhuǎn)染骨髓細胞，增加了骨髓細胞分泌多種血管生成細胞因子和生長因子的內(nèi)在能力，并且也刺激多種血管生成-相關(guān)基因的表達。本發(fā)明也提供了這種NOS-轉(zhuǎn)染的骨髓細胞，特別是ABM細胞，或當(dāng)這些細胞培養(yǎng)生長時、來源于這些細胞的培養(yǎng)基。
本發(fā)明描述的另一基因家族是成纖維細胞生長因子(FGF)家族，其被描述為具有增強骨髓細胞增加側(cè)支血管發(fā)育潛能的能力。此基因家族涉及超過十四個密切相關(guān)的基因，包括但不限于FGF1、FGF2、FGF4和FGF5。用FGF家族中的一個基因轉(zhuǎn)導(dǎo)骨髓細胞的原理是，已知FGF是相關(guān)生成的有效刺激物，也能夠刺激多種基因的表達，所述多種基因的蛋白表達產(chǎn)物中的許多也能夠誘導(dǎo)血管生成。
因此，在又一種實施方案中，本發(fā)明提供了方法，用編碼FGF肽家族之一的多核苷酸轉(zhuǎn)染的骨髓細胞，增強骨髓細胞增加側(cè)支血管發(fā)育的能力，如由于不同危險因子造成的增強血管生成能力受損的骨髓細胞，危險因子包括但不限于高膽固醇血癥和衰老。本發(fā)明也提供了這種FGF-轉(zhuǎn)染的骨髓細胞，特別是ABM細胞，或當(dāng)這些細胞培養(yǎng)生長時、來源于這些細胞的培養(yǎng)基。
單核細胞/巨噬細胞表達的另一種基因PR39，是本發(fā)明描述的另一種基因，其被描述為能夠增強骨髓細胞血管生成潛能以促進側(cè)支形成。用編碼此蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)骨髓細胞的原理來源于下列事實PR39抑制HIF-α的蛋白酶體降解，導(dǎo)致小鼠體外血管結(jié)構(gòu)加速形成并且增加心肌脈管系統(tǒng)。通過增加穩(wěn)定狀態(tài)的HIF-1α水平，異二聚體HIF-1α/HIF-β形成，它是誘導(dǎo)HIF-相關(guān)基因表達的轉(zhuǎn)錄因子。這些基因中的許多的蛋白產(chǎn)物促進血管生成的發(fā)展。此策略的原理—增加穩(wěn)定狀態(tài)的HIF-1α水平—詳細描述于上文。在又一種實施方案中，本發(fā)明也提供了這種PR39-轉(zhuǎn)染的骨髓細胞，特別是ABM細胞，或當(dāng)這些細胞培養(yǎng)生長時、來源于這些細胞的培養(yǎng)基。
例如，可以用質(zhì)粒載體或腺病毒載體體外轉(zhuǎn)染從一個對象收集來的ABM細胞，所述載體攜帶血管生成細胞因子生長因子或哺乳動物相關(guān)生成促進因子轉(zhuǎn)基因，如HIF-1或EPAS1轉(zhuǎn)基因、或編碼PR39或NOS或FGF家族成員的轉(zhuǎn)基因，如此處所描述，當(dāng)轉(zhuǎn)染的細胞或被注射入治療位點時，或當(dāng)這些細胞培養(yǎng)生長時、來自這些細胞的培養(yǎng)基被注射入治療位點時，在細胞中和/或?qū)ο笾斜磉_所述轉(zhuǎn)基因。
然而，新鮮的骨髓細胞(fresh bone marrow)或溶液中的骨髓細胞難于用編碼此處描述的治療性細胞因子、生長因子和血管生成促進因子的載體轉(zhuǎn)染。為了克服此困難，發(fā)現(xiàn)了下列效應(yīng)當(dāng)骨髓細胞在容器中生長足夠時間段，允許來自骨髓的早期附著細胞粘附于容器并且選出早期附著細胞用于轉(zhuǎn)染時，可以體外(例如，在培養(yǎng)中)被攜帶轉(zhuǎn)基因的載體轉(zhuǎn)染的骨髓細胞被大大增加了?！霸缙诟街毎?earlyattaching cell)”作為術(shù)語應(yīng)用于此，意味著細胞，來自含有骨髓的培養(yǎng)基或來自種植(seed)于容器中的骨髓細胞，其在合適的培養(yǎng)條件下生長大約8小時(例如，過夜)至大約24小時之后，不被洗掉。早期附著細胞大多數(shù)是單核細胞、內(nèi)皮前體細胞、或其它造血系細胞。接種發(fā)生于培養(yǎng)細胞幾小時時期之后，接種的細胞在大約12小時至3天之后開始產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物?？梢杂镁幋a一種或多種血管生成細胞因子、生長因子和/或促進哺乳動物細胞中血管生成的因子的載體接種早期附著細胞，這是應(yīng)用本領(lǐng)域中的任何已知方法實施的，例如通過在接種之后體外接觸大約2小時至大約3天的時期。應(yīng)用的載體可以選自本領(lǐng)域已知的任何載體，包括但不限于此處描述的那些。在制備細胞用于給予患者之前，在接種之后大約2小時至大約3天，載體(例如，病毒或質(zhì)粒)通常被洗掉。
任選地，在放入培養(yǎng)物之前過濾ABM，以去除大于大約300μ至大約200μ的顆粒。也可以從過濾的ABM中分離骨髓細胞，用于在容器中生長，導(dǎo)致生成早期附著細胞。合適的培養(yǎng)條件在本領(lǐng)域是已知的，包括但不限于描述于此處的實施例中的那些。
用于根據(jù)本發(fā)明方法轉(zhuǎn)染骨髓早期附著細胞的合適的轉(zhuǎn)基因包括但不限于，那些編碼這些血管生成促進劑如HIF-1、EPAS1(也稱為HIF-2)、MCP-1、CM-CSF、NOS、FGF和類似物質(zhì)的那些基因。有效量的來自如此處描述而制備的骨髓細胞的轉(zhuǎn)染的早期附著細胞可以被直接給予(即，注射入)患者的所需位點，以在患者的所需位點增強側(cè)支血管形成。用于給予細胞的特別有效的部位包括心肌或骨骼肌，如在腿上，以增強心臟和/或外周缺血組織中的側(cè)支依賴性灌注，所述給予的細胞是用血管生成促進因子轉(zhuǎn)染的。細胞或來自這種細胞的培養(yǎng)基也可以被注射入血管系統(tǒng)，以致于它們經(jīng)血液被輸送至所需部位。
在用于獲得骨髓細胞的增加的轉(zhuǎn)染效率的本發(fā)明方法的非限制性例證中，進行了下列研究如上所述，用腺病毒載體中的X-gal轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染骨髓早期附著細胞。在這些研究中，在轉(zhuǎn)染之后用X-gal對轉(zhuǎn)染的細胞染色合適的一段時期顯示，和用非-粘附的骨髓細胞(non-adherent bone marrow cell)或新鮮的骨髓相比，骨髓早期附著細胞對轉(zhuǎn)染的敏感度實質(zhì)上被增加。
編碼治療蛋白的多核苷酸可以是“功能上附加于”(functionallyappended to)或“可操縱地相關(guān)于”(operatively associated with)信號序列，所述信號序列可以“轉(zhuǎn)運”(transport)編碼產(chǎn)物穿過細胞膜。多種這樣的信號序列是已知的，和可以被本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)用而無需過多的試驗。
預(yù)期用于這種目的的基因轉(zhuǎn)移載體(也稱作“表達載體”(expression vectors))是重組的核酸分子，被用于轉(zhuǎn)運核酸進入宿主細胞，用于其表達和/或復(fù)制。表達載體可以是環(huán)狀的或是線性的，能夠在其中并入多種核酸構(gòu)建體。表達載體典型地以質(zhì)粒的形式出現(xiàn)，其在導(dǎo)入合適的宿主細胞后，導(dǎo)致插入的核酸表達。
已經(jīng)開發(fā)出用于基因治療的合適病毒載體，用于特殊的宿主系統(tǒng)中，特別是哺乳動物系統(tǒng)，包括例如，反轉(zhuǎn)錄病毒載體、其它慢病毒屬(lentivirus)載體如那些基于人類免疫缺陷病毒(HIV)的載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus)載體、皰疹病毒載體、天花病毒載體和類似載體(參見Miller和Rosman，Bio Techniques 7980-990，1992；Anderson等人，Nature 39225-30 Suppl.，1998；Verma和Somia，Nature 389239-242，1997；Wilson，New Engt.J.Med.3341185-1187(1996)，每一文獻在此并入，作為參考)。優(yōu)選的基因轉(zhuǎn)運載體是復(fù)制缺陷型腺病毒，其攜帶cDNA以影響對象的側(cè)支動脈發(fā)育，所述對象遭受進行性冠狀動脈閉塞(progressive coronary occlusion)(Barr等人，″PCGT Catheter-Based Gene Transfer Into the Heart UsingReplication-Deficient Recombinant Adenoviruses，″Journal of CellularBiochemistry，增刊17D，195頁，摘要101頁(1993年3月)；Barr等人，″Efficient catheter-mediated gene transfer into the heart usingreplication-defective adenovirus，″Gene Therapy，卷151-58(1994))?？傊?，所需基因可以被轉(zhuǎn)移至心臟(或骨骼肌)，包括心肌細胞(和骨骼肌細胞)，在體內(nèi)和直接構(gòu)成編碼蛋白的產(chǎn)物。
幾種不同的基因轉(zhuǎn)移方法是可行的，包括輔助因子-依賴的復(fù)制缺陷型人腺病毒5系統(tǒng)(helper-independent replication deficient humanadenovirus 5 system)。基于人腺病毒5的重組腺病毒載體(Virology 163614-617，1988)缺失了來自腺病毒基因組的基本上早期的基因(essentialearly genes)(通常是E1A/E1B)，和從而如果不生長在反式提供缺失的基因產(chǎn)物的允許細胞系(permissive cell lines)中，就不能復(fù)制。替代缺失的腺病毒基因組序列，所需的轉(zhuǎn)基因可以在用復(fù)制缺陷型腺病毒感染的組織/細胞中被克隆和表達。盡管基于腺病毒的基因轉(zhuǎn)移不導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因整合入宿主基因組(少于0.1％的腺病毒-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因并入宿主DNA)，從而不穩(wěn)定，但腺病毒載體可以以高的滴度增殖并充分轉(zhuǎn)染非復(fù)制型細胞(non-replicating cells)。
根據(jù)被治療個體的需要，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以變化導(dǎo)入宿主生物體、細胞或細胞系統(tǒng)的外源性核酸的量。例如，當(dāng)應(yīng)用病毒載體進行基因轉(zhuǎn)移時，可以改變導(dǎo)入欲被轉(zhuǎn)染的細胞的核酸的量，這是通過改變病毒載體的噬斑形成單位(plaque forming units(PFU))的量實施的。
在根據(jù)本發(fā)明的又一種實施方案中，提供了方法，用于增強所需對象的側(cè)支血管形成，這是通過從患者獲得ABM；使ABM在合適的培養(yǎng)條件下在容器中生長一段時間，所述時間足以促進早期附著細胞由骨髓形成，早期附著細胞粘附于容器。用此處描述的載體如上所述在培養(yǎng)物中(即，體外)轉(zhuǎn)染早期附著細胞，所述載體含有編碼一種或多種因子的多核苷酸，所述因子選自血管生成細胞因子、生長因子和哺乳動物血管生成促進因子和類似物質(zhì)，然后，將處理的(即，被轉(zhuǎn)染了的)早期附著細胞(和/或培養(yǎng)基，早期附著細胞在轉(zhuǎn)染后被培養(yǎng)于所述培養(yǎng)基中)直接給予患者的所需部位，以致于向該部位輸送表達的因子。例如，在一種實施方案中，血管生成促進劑可以短暫表達于對象中，所述對象被注射了轉(zhuǎn)染細胞，從而輸送治療性血管生成促進因子或其聯(lián)合物到達缺血部位并導(dǎo)致患者的給予部位的側(cè)支血管形成增強。
如此處所應(yīng)用，短語“骨髓源基質(zhì)細胞”(marrow-derivedstromal cells)意味著CD34陰性/CD45陰性早期附著細胞，其可以從骨髓樣品中得到。
如此處所應(yīng)用，短語“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)”(transcription regulatoryregion)是指控制mRNA轉(zhuǎn)錄起始的核酸或基因構(gòu)建體部分。預(yù)期用于此處的調(diào)節(jié)區(qū)，在不存在非哺乳動物反式激活因子時，典型地含有至少一個最小的啟動子，和響應(yīng)于配體/受體肽復(fù)合物的調(diào)節(jié)元件相結(jié)合。最小的啟動子，當(dāng)結(jié)合于調(diào)節(jié)元件時，起到響應(yīng)于配體/功能性二聚體復(fù)合物而起始mRNA轉(zhuǎn)錄的作用。然而，如果所需的誘導(dǎo)物(其配體)不存在，轉(zhuǎn)錄將不發(fā)生。然而，如此處所描述，甚至在DNA結(jié)合域的配體不存在時，本發(fā)明的一些嵌合蛋白異二聚體激活或抑制mRNA轉(zhuǎn)錄。
如此處所應(yīng)用，短語“可操縱地相關(guān)于”(operatively associatedwith)是指DNA和調(diào)節(jié)序列和效應(yīng)序列的核苷酸如啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止位點和其它信號序列在功能上的關(guān)聯(lián)。例如，DNA和啟動子的可操縱連接是指，DNA和啟動子之間的物理上和功能上的關(guān)聯(lián)，以致于特異地識別、結(jié)合并轉(zhuǎn)錄DNA的RNA聚合酶起始此DNA從啟動子轉(zhuǎn)錄。
優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)進一步包括遍在轉(zhuǎn)錄因子(ubiquitoustranscription factor)的結(jié)合位點。這種結(jié)合位點優(yōu)選地位于啟動子和調(diào)節(jié)元件之間。用于此處的合適的遍在轉(zhuǎn)錄因子在本領(lǐng)域是已知的，包括例如，Sp1。
代表性的真核表達載體包括真核構(gòu)建體，如pSV-2 gpt系統(tǒng)(Mulligan等人，(1979)Nature，277108-114)；PBLUESKRIPT載體(Stratagene，La Jolla，CA)，Genetics Institute描述的表達克隆載體(expression cloning vector)(Science，(1985)228810-815)，和類似載體。這些質(zhì)粒載體中的每一個都能夠促進所需蛋白質(zhì)的表達。
在一種特殊的實施方案中，預(yù)期應(yīng)用于此的基因轉(zhuǎn)移載體是裸質(zhì)粒(naked plasmid)，病毒載體如基于腺病毒、腺相關(guān)病毒、單純皰疹病毒的載體，用于基因治療的合成載體(synthetic vector)，和類似載體(參見，例如Suhr等人，Arch.of Neurol.501252-1268，1993)。例如，用于此處的基因轉(zhuǎn)移載體可以是反轉(zhuǎn)錄病毒載體。預(yù)期用于此處的反轉(zhuǎn)錄病毒載體是基因轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，其帶有表達構(gòu)建體，所述構(gòu)建體含有外源性核酸，位于兩個反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs之間。反轉(zhuǎn)錄病毒載體典型地含有合適的包裝信號，使反轉(zhuǎn)錄病毒載體或用該反轉(zhuǎn)錄病毒載體為模板轉(zhuǎn)錄的RNA，在合適的包裝細胞系中被包裝入病毒顆粒(參見，例如，美國專利4,650,764)。
用于此處的合適的反轉(zhuǎn)錄病毒載體描述于，例如，美國專利5,399,346和5,252,479；和WIPO出版物WO 92/07573、WO 90/06997、WO 89/05345、WO 92/05266和WO 92/14829中，每一文獻以其整體在此并入作為參考。這些文件提供了對方法的描述，所述方法用這種反轉(zhuǎn)錄病毒載體有效地將核酸導(dǎo)入人細胞。其它反轉(zhuǎn)錄病毒載體包括，例如，小鼠乳腺瘤病毒載體(例如，Shackleford等人，(1988)PNAS，USA，859655-9659)，人類免疫缺陷病毒(例如，Naldini等人(1996)Science272165-320)，和類似載體。
本領(lǐng)域中也公知各種方法，用于提供輔助細胞(helper cells)，所述輔助細胞產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒，其基本上不含有復(fù)制的病毒(replicating virus)。參見，例如，美國專利4,650,764；Miller，Human GeneTherapy，15-14，1990；Markowitz等人，Journal of Virology，61(4)1120-1124，1988；Watanabe等人，Molecular and Cellular Biology，3(12)2241-2249，1983；Danos等人，PNAS，856460-6464，1988；和Bosselman等人，Molecular and Cellular Biology，7(5)1797-1806，1987，其公開了方法，用于產(chǎn)生病毒載體和輔助細胞，輔助細胞使產(chǎn)生含有復(fù)制病毒的病毒載體的機會最小化。
適于和多核苷酸包裝的反轉(zhuǎn)錄病毒，是應(yīng)用公知的生成反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的方法產(chǎn)生的，所述多核苷酸編碼治療性蛋白如血管生成生長因子。參見，例如，美國專利4,650,764；Miller，見上1990；Markowitz等人，見上1988；Watanabe等人，見上1983；Danos等人，PNAS，856460-6464，1988；和Bosselman等人，Molecular and CellularBiology，7051797-1806，1987。
在下面的實施例中，闡述了根據(jù)本發(fā)明方面的一些檢測。這些實施例不是限制性的。
實施例實施例1培養(yǎng)骨髓的培養(yǎng)基對內(nèi)皮細胞增殖的效應(yīng) 進行研究，確定獲得的抽吸的豬自體骨髓細胞是否分泌VEGF，一種有效的血管生成因子，和MCP-1，其近來被鑒定為重要的血管生成輔助因子。體外培養(yǎng)骨髓四周。向培養(yǎng)的豬主動脈內(nèi)皮細胞(PAECs)中加入條件培養(yǎng)基，四天后評定增殖情況。用ELISA分析條件培養(yǎng)基中的VEGF和MCP-1水平。在培養(yǎng)四周期間，BM細胞分泌VEGF和MCP-1，以致于它們的濃度以時間相關(guān)的方式增加。得到的培養(yǎng)基以劑量相關(guān)的方式增強PAECs的增殖。結(jié)果提示，BM細胞能夠分泌有效的血管生成因子如VEGF和MCP-1，并且能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞增殖。
豬骨髓培養(yǎng) 在無菌條件下從患有慢性心肌缺血的豬采集骨髓(BM)細胞，置于無防腐劑的肝素(20units/ml BM cells)中，并用300μ和200μ的不銹鋼網(wǎng)孔過濾器過濾。然后，經(jīng)Ficoll-Hypaque梯度離心分離BM細胞并將其在長期培養(yǎng)基(long-term culture medium(LTCM))中(Stem CellTech，Vancouver，British Columbia，Canada)培養(yǎng)，溫度是330℃，T-25培養(yǎng)瓶中帶有5％的CO2。BMCs在每一培養(yǎng)物中的種植密度是7×106/ml。每周去除一半培養(yǎng)基，替換為新鮮的LTCM。將去除的培養(yǎng)基過濾(O.2μ過濾器)并保存在-200℃，用于隨后的酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)和細胞增殖分析。
分離和培養(yǎng)豬主動脈內(nèi)皮細胞 用常規(guī)方法分離新鮮的豬主動脈內(nèi)皮細胞(PAECs)。內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基(EGM-2培養(yǎng)基，Clonetics，San Diego，CA)，其含有2％FBS、氫化可的松、人FGF、VEGF、人EGF、IGF、肝素和抗生素，于37℃，帶有5％的CO2。當(dāng)細胞在大約7天時開始會合時，用2.5％的胰蛋白酶將其分離，其后將其培養(yǎng)在帶有10％FBS的培養(yǎng)基199中。通過典型的內(nèi)皮細胞形態(tài)學(xué)和通過對因子VIII的免疫組織化學(xué)染色，證實它們的身份。傳代3-10次，用于增殖研究。
條件培養(yǎng)基對主動脈內(nèi)皮細胞的效應(yīng) 細胞增殖分析經(jīng)胰蛋白酶消化作用從培養(yǎng)瓶中移除PAECs(傳代3-10次)。將分離的細胞轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板上，以5,000個細胞/孔的種植密度鋪板。在用于增殖和DNA分析試驗之前培養(yǎng)細胞2-3天。在4周時收集BM細胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基，合并來自7個培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)基，用于生物分析。以三倍量將合并的條件培養(yǎng)基的等分試樣(10μl、30μl、100μl或200μl)，或LTCM(200μl，作為對照)加入96孔板中的會合的PAECs中。用條件培養(yǎng)基或?qū)φ张囵B(yǎng)基培養(yǎng)四天后，胰蛋白酶消化PAECs，用細胞計數(shù)器(Coulter Counter BeckmanCorporation，Miami FL)計數(shù)細胞。
條件培養(yǎng)基對PAEC DNA合成的影響 以三倍量將來自合并樣品的條件培養(yǎng)基的等分試樣(10μl、30μl、100μl或200μl)或?qū)φ张囵B(yǎng)基(LTCM，200μl)加入96孔板中的PAECs(和上述相同的種植密度)。2天后，向每孔加入1μCi的氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷。48小時后，用細胞收集器(Mach III M Tomtec，Hamden，CT)采集PAECs中的DNA，用液體閃爍計數(shù)器(Multi-detector LiquidScintillation Luminescence Counter EG&G Wallac，Turku，F(xiàn)inland)計數(shù)放射活性。
通過ELASA VEGF測定條件培養(yǎng)基中的VEGF和MCP-1 用夾心ELISA試劑盒(Chemicon International Inc.，Temecula，CA)測定VEGF在條件培養(yǎng)基中的濃度。簡言之，將用抗人VEGF抗體預(yù)包被的平板用于結(jié)合條件培養(yǎng)基中的VEGF或已知濃度的重組VEGF。通過生物素化的抗VEGF抗體檢測復(fù)合物，所述生物素化抗體結(jié)合于捕獲的VEGF。用鏈親和素-堿性磷酸酶和顯色液反過來檢測生物素化的VEGF抗體?？谷薞EGF抗體和豬VEGF交叉反應(yīng)。
用ELISA測定條件培養(yǎng)基中的MCP-1 用夾心酶聯(lián)免疫分析試劑盒(R & D Systems，Minneapolis，MN)分析條件培養(yǎng)基中的MCP-1濃度將用抗人MCP-1抗體預(yù)包被的平板用于結(jié)合條件培養(yǎng)基中的MCP-1或已知濃度的重組蛋白。用生物素化的抗MCP-1抗體檢測復(fù)合物，所述生物素化的抗體結(jié)合于捕獲的MCP-1。用鏈親和素-堿性磷酸酶和顯色液反過來檢測生物素化的MCP-1抗體?？谷薓CP-1抗體和豬MCP-1交叉反應(yīng)。
結(jié)果 在4周時收集的BM條件培養(yǎng)基以劑量相關(guān)方式增加PAECs的增殖(圖1)。這通過直接計數(shù)細胞數(shù)量和通過測定氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷的吸收而證實(兩種測定方法均為p＜0.001)。劑量相關(guān)反應(yīng)證實了降支；與30μl和100μl相比，200μl條件培養(yǎng)基的增殖被降低(兩個比較均為P＝0.003)。在氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷的吸收研究中觀察到相似的劑量相關(guān)結(jié)果(和200μl相比，30μl和100μl分別是P＝0.03)。
限制數(shù)目(5±4％)的新鮮抽吸的BM細胞對因子VIII染色呈陽性。結(jié)果在圖2中列出。這對照于培養(yǎng)4周的BM細胞粘附層，其值是57±14％，BM細胞粘附層中的60±23％是內(nèi)皮樣細胞，40±28％似乎是巨核細胞。
在4周時期期間，BM條件培養(yǎng)基中的VEGF和MCP-1濃度分別逐漸增加至第一周水平的10倍和3倍(兩個比較均為P＜0.001)(圖3)。與之對照，未暴露于BM的對照培養(yǎng)基中的VEGF和MCP-1水平，分別是0和11±2pg/ml，如圖4所示。
實施例2缺氧對培養(yǎng)的豬骨髓細胞分泌VEGF的影響 證實了缺氧顯著增加VEGF經(jīng)培養(yǎng)的骨髓內(nèi)皮細胞的表達，結(jié)果提示，體外暴露于缺氧，通過增加缺氧誘導(dǎo)的血管生成因子的表達，可以進一步增加欲在缺血肌肉組織中注射的骨髓細胞及其條件培養(yǎng)基的側(cè)支增強效應(yīng)。采集豬骨髓并用300μ和200μ的不銹鋼網(wǎng)孔過濾器連續(xù)過濾。然后用Ficoll-Hypaque梯度離心分離BMCs并在33℃培養(yǎng)，T-75培養(yǎng)瓶中的CO2是5％。當(dāng)細胞在大約7天發(fā)生會合時，它們經(jīng)胰蛋白酶消化1∶3分離。培養(yǎng)4周之后，將BMCs或是暴露于缺氧條件(放置在含有1％氧的艙內(nèi))24至120小時，或是維持在正常條件下。收集得到的條件培養(yǎng)基，經(jīng)ELISA分析VEGF、MCP-1。
暴露于缺氧顯著增加VEGF分泌在24小時，VEGF濃度從常氧下的106±13pg/ml增加至缺氧條件下的1,600±196pg/ml(p＝0.0002)；120小時之后，其從4,163±62增加至6,028±167pg/ml(p＜0.001)。在新鮮分離的BMCs中進行了分別的研究，發(fā)現(xiàn)了相同趨勢。缺氧也減慢了BMCs的增殖速度。MCP-1表達不隨缺氧增加，這不是出乎意料的發(fā)現(xiàn)，原因是已知其啟動子沒有HIF結(jié)合位點。
實施例3骨髓培養(yǎng)基對內(nèi)皮細胞管道形成的效應(yīng) 證明了，用豬內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞共培養(yǎng)技術(shù)，骨髓細胞的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)血管管道在體外形成。在不暴露于骨髓條件培養(yǎng)基時，沒有觀察到對血管管道形成的這種效應(yīng)。結(jié)果提示，骨髓細胞和它們分泌的因子發(fā)揮了促血管生成(pro-angiogenic)效應(yīng)。
實施例4在慢性心肌缺血模型中，經(jīng)心臟內(nèi)輸送自體骨髓對側(cè)支灌注和局部功能的影響 通過在冠狀動脈左回旋支周圍植入漸進性縮窄器(ameroidconstrictors)，在14頭豬中造成慢性心肌缺血。植入4周后，7個動物經(jīng)歷用經(jīng)心內(nèi)膜(transendocardial)注射導(dǎo)管將新鮮抽吸的ABM經(jīng)心內(nèi)膜注射入缺血區(qū)(每個動物2.4ml，在12個位點注射)，7個對照動物用肝素化的鹽水注射。在基線和4周之后，動物經(jīng)歷靜息和起搏超聲心動圖(rest and pacing echocardiogram)評價局部收縮性(心肌肥厚的％)，微球體研究(microsphere study)評價靜息時和腺嘌呤核苷輸注期間的側(cè)支依賴性灌注。注射ABM 4周之后，在ABM處理的豬中側(cè)支血流(表示為缺血區(qū)/正常區(qū)的比值×100)改善，但是在對照組中不改善(ABM靜息時95±13對81±11，P＝0.017；腺嘌呤核苷輸注期間85±19對72±10，P＝0.046；對照組靜息時86±14對86±14，P＝NS；腺嘌呤核苷輸注期間73±17對72±14，P＝0.63)。相似地，ABM處理的豬中收縮性增加，但是在對照組中不增加(ABM靜息時83±21對60±32，P＝0.04；起搏期間91±44對35±43，P＝0.056；對照靜息時69±48對64±46，P＝0.74；起搏期間65±56對37±56，P＝0.23)。
結(jié)果提示，基于導(dǎo)管經(jīng)心內(nèi)膜注射ABM可以增加缺血心肌的側(cè)支灌注和心肌功能，所見提示，本方法可以構(gòu)成新的治療策略，用于獲得最佳的治療性血管生成。
將14頭無特殊病原體(specific-pathogen-free)的重量大約是70kg的家豬麻醉、插管，和貫穿手術(shù)過程接受補充的O22L/分鐘以及1-2％異氟醚吸入。通過右股動脈分離并插入8French的鞘，介入動脈。通過左側(cè)胸廓切開術(shù)分離左回旋動脈，在動脈的極近端部分植入包有金屬的(metal encased)漸進性縮窄器。漸進性縮窄器植入4周后，所有的豬經(jīng)歷(1)選擇性的左冠狀血管造影術(shù)和右冠狀血管造影術(shù)，用于驗證漸進性閉塞(ameroid occlusion)和評價側(cè)支血流；(2)經(jīng)胸超聲心動圖研究；和(3)局部心肌血流分析。
骨髓抽吸和制備以及心肌內(nèi)注射 完成基線評估之后即刻，所有的動物經(jīng)歷用標(biāo)準技術(shù)從左股骨干的BM抽吸。應(yīng)用無防腐劑的肝素化玻璃注射器(20單位肝素/1ml新鮮BM)，BM來自抽吸的2個位點(每個位點3ml)。用300μ和200μ的不銹鋼過濾器，立即連續(xù)粗過濾(macro-filtered)吸出的骨髓。然后，用經(jīng)心內(nèi)膜注射導(dǎo)管在12個位點將骨髓注射入心肌(每個注射位點0.2ml，共2.4m1)，所述位點涉及缺血心肌區(qū)域及其邊界區(qū)。
超聲心動圖研究 在基線和起搏期間，在基線和ABM植入后4周的追蹤評價(follow-up evaluation)期間，記錄動物在中乳頭肌水平處的經(jīng)胸超聲心電圖成像短軸和長軸視圖。通過測定壁增厚百分數(shù)(收縮末期厚度減去舒張末期厚度/舒張末期厚度)×100得到短軸縮短率(fractionalshortening)的測定值。這些測定值是從缺血區(qū)(外側(cè)區(qū)lateral area)和遠部區(qū)域(隔前區(qū)anterior-septal area)得到的。隨后，經(jīng)右股靜脈鞘插入臨時起搏器電極，定位在右心房。使動物心率起搏為180次/分鐘，持續(xù)2分鐘，同時記錄超聲心動圖成像。
局部心肌血流 用多重?zé)晒怙@色微球體(multiple fluorescent coloredmicrospheres)(Interactive Medical Technologies，West Los Angeles，CA)，在靜息時和冠脈舒張最大時進行局部心肌血流測定，并且通過參照樣品技術(shù)(reference sample technique)(Heymann MA，et a1.，ProgCardiovasc Dis 1977；2055-79)定量。經(jīng)6F Judkins left 3.5診斷導(dǎo)管，將熒光微球體(0.8ml，5×106微球體/ml，在帶有0.01％吐溫80的生理鹽水懸浮液中的直徑是15μm)注射入左心房。最大冠脈舒張是通過輸注腺嘌呤核苷誘導(dǎo)的，輸注為恒定速度140μg/kg/分鐘(Fujisawa USA，Deerfield，IL)，在6分鐘期間進入左股靜脈。在輸注的最后2分鐘期間，以和靜息研究的相同方式，進行微球體注射和血液參照抽取(bloodreference withdrawal)。
灌注評價完成之后，用過量的戊巴比妥鈉和KCL處死動物。獲取心臟，用Ringer Lactate沖洗，灌注固定10-15分鐘，隨后用10％緩沖的甲醛浸泡固定3天。固定完成之后，沿短軸將心臟切割為7mm厚的切片。將2個中央的切片中的每一個分為8個相似大小的楔形物，進一步將其切割為心內(nèi)膜和心外膜亞段。用平均8個外側(cè)部缺血區(qū)和8個間隔正常區(qū)(septal normal zone)亞段的測定值來評價心內(nèi)膜區(qū)和心外膜區(qū)的心肌血流。相對的側(cè)支血流也被計算為缺血區(qū)/非缺血區(qū)(IZ/NIZ)血流的比值。
組織病理學(xué) 為了評價通過應(yīng)用注射導(dǎo)管來注射BM抽吸物是否和機械性細胞損傷相關(guān)，在用和體內(nèi)研究相似的注射壓力推入新鮮過濾的ABM抽吸物之前和之后，制備標(biāo)準的BM涂片。由獨立的有經(jīng)驗的技術(shù)人員進行形態(tài)學(xué)評價，所述技術(shù)人員不知道本研究方案。
對樣品心臟組織進行組織病理學(xué)評價。在初步研究中，在UV光下檢查7mm厚的短軸切片，以鑒定熒光標(biāo)記的區(qū)域。將每一被鑒定的區(qū)域切割為3個完整厚度的相鄰的塊(中央，右側(cè)和左側(cè))，將其浸泡固定在10％的緩沖甲醛中。隨后，將每一這樣的塊切為3個水平，其中2個用蘇木精和伊紅(H&E)染色，一個用PAS染色。此外，從每一心臟的缺血區(qū)獲得一個新鮮熒光標(biāo)記的組織塊，包埋入OCT化合物(Sakura Finetek USA Inc.，Torrance，CA)并在液氮中冷凍。將這些驟冷心肌組織的冷凍切片在空氣中干燥，用丙酮固定。用自動Dako免疫染色儀(Dako，Carpenteria，CA)進行免疫過氧化物酶染色(Immunoperoxidasestain)。用3％過氧化氫酶和10％的卵清蛋白封閉內(nèi)源性過氧化物酶和非特異性吸收。用抗CD-34單克隆小鼠抗體(Becton Dickinson，San Jose，CA)作為一抗。連接抗體是生物素化的山羊抗小鼠IgG抗體，三抗是和辣根過氧化物酶連接的鏈親和素。用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)作為發(fā)色原，并用1％的甲基綠復(fù)染切片。脫水和透明之后，封片并用Nikon Labphot顯微鏡檢查切片。
在功效研究中，將來自缺血區(qū)和非缺血區(qū)的完整厚度的1.5平方厘米的切片進行石蠟切片，用H&E、Masson氏三色染色(Masson′strichrome)和因子VIII相關(guān)抗原對每一樣本染色。將免疫過氧化物酶染色的切片用于研究內(nèi)皮細胞群的密度和血管化。后者通過存在管腔而區(qū)分于前者。用來自缺血和/非缺血心肌內(nèi)側(cè)半部的5個因子VIII染色切片的顯微照片樣品評價血管狀態(tài)。用相同顯微照片數(shù)字成像評價內(nèi)皮細胞的密度。用閾強度法(intensity threshold method)，用Sigma-ScanPro形態(tài)學(xué)測定軟件確定內(nèi)皮細胞群的密度。每一樣本(sample)和每一樣品(specimen)的總內(nèi)皮面積隨同相對的內(nèi)皮面積百分數(shù)(內(nèi)皮面積/研究的心肌的面積)一同獲得?？們?nèi)皮面積也被計算為，研究的心肌的非梗塞(能存活的)面積的相對百分數(shù)。將三色染色的切片數(shù)字化，用Sigma-Scan Pro測定藍染膠原蛋白占有的面積以及除心外膜占據(jù)面積之外的切片的總面積。然后，將梗塞面積計算為藍染占有的面積。
操作數(shù)據(jù)(Procedural Data) 用ABM或安慰劑進行的心肌內(nèi)注射和平均血壓、心率的任何急性變化或心律失常的導(dǎo)入均不相關(guān)。在兩組之間，所有的血液動力學(xué)參數(shù)是可以比較的(comparable)。配對比較顯示了和追蹤過程相比相似的血液動力學(xué)參數(shù)指標(biāo)，除了對照組中追蹤時的較高起始平均動脈壓(p＝0.03)，其在起搏或腺嘌呤核苷輸注期間沒有隨后變化。
心肌功能 局部心肌功能評價顯示于下面的表I中。預(yù)干預(yù)相關(guān)的梗塞壁肥厚，表示為靜息時和起搏期間缺血區(qū)與非缺血區(qū)(IZ/NIZ)的比值x100，在兩組間是相似的(分別是P＝0.86和0.96)。心肌內(nèi)注射ABM 4周后，在靜息時和起搏期間發(fā)生局部壁增厚的改善，這是由于側(cè)支依賴的缺血側(cè)壁的壁增厚增加了約50％。盡管在追蹤時的起搏期間在缺血區(qū)觀察到了壁增厚改進的趨勢，在對照動物中沒有觀察到顯著的變化。
表I.缺血壁的局部收縮性

ABM是指自體骨髓(autologous bone marrow)心肌灌注數(shù)據(jù) 局部心肌灌注評價顯示于下面的表II中。在靜息時和腺嘌呤核苷輸注期間，預(yù)干預(yù)相關(guān)的透壁心肌灌注、IZ/NIZ在處理組和對照組之間沒有差異(分別是P＝0.42和0.96)。ABM注射4周后，靜息和起搏期間的相對局部透壁心肌灌注顯著改進。這是由于靜息(增加75％，P＝0.08)和腺嘌呤核苷輸注期間(37％，P＝0.09)缺血區(qū)心肌灌注的絕對改善，而在靜息(增加35％，P＝0.18)或腺嘌呤核苷輸注期間(增加25％，P＝0.26)在非缺血區(qū)沒有觀察到絕對血流的顯著變化。在靜息時，見于缺血區(qū)的局部心肌血流增加由心內(nèi)膜(73％)和心外膜(62％)的改善構(gòu)成，在腺嘌呤核苷輸注期間有一些較小的改善(兩個區(qū)均為40％)。在4周時，和預(yù)干預(yù)值相比，對照組在缺血區(qū)和非缺血區(qū)的透壁、心內(nèi)膜或心外膜灌注上沒有差異。
表II.局部心肌灌注

ABM是指自體骨髓組織病理學(xué)和血管狀態(tài)評價 評價過濾的抽吸物通過注射導(dǎo)管之前和之后的BM涂片揭示了正常結(jié)構(gòu)，沒有大的聚集物和沒有細胞碎片或扭曲細胞形狀的證據(jù)。注射后1天的組織病理學(xué)揭示了急性損害，其特征是纖維蛋白和具有分散細胞浸潤的炎癥通路(inflammatory tract)。浸潤物被表征為單核細胞，其在形態(tài)學(xué)上無法和BM浸潤物區(qū)分開來。細胞構(gòu)成(cellularity)在3天和7天達到最大，隨后經(jīng)時間而衰退。在3周時，和0.2ml相比，0.5ml注射位點處看到更多的纖維化。在顯示出最大細胞浸潤的切片中進行CD34免疫染色，該染色被設(shè)計為鑒定來源于BM的祖細胞。總之，估計4-6％的細胞浸潤物對CD34顯示陽性免疫活性。
占據(jù)全部＜10％的檢測缺血心肌的小面積的斑狀壞死在兩組中均表征了缺血范圍。非缺血區(qū)顯示了正常心肌結(jié)構(gòu)。比較兩組的組織形態(tài)學(xué)特征的變化。任意血管占據(jù)的總面積以及直徑＞50μm的血管數(shù)目沒有差異。然而，在兩組間，缺血區(qū)域?qū)Ψ侨毖獏^(qū)域的因子VIII染色陽性的總面積(帶有管腔和不帶有管腔的內(nèi)皮細胞)的比較顯示了差異。在ABM組中，缺血的側(cè)支依賴區(qū)的內(nèi)皮細胞總面積比非缺血區(qū)觀察到的總面積高100％(11.6±5.0對5.7±2.3％面積，P＝0.016)，而對照組中沒有顯著差異(12.3±5.5對8.2±3.1％面積，P＝0.11)。然而，在兩組的缺血和非缺血區(qū)，血管狀態(tài)的其它參數(shù)，包括任意血管占據(jù)的面積百分數(shù)和＞50μm的血管數(shù)目是相似的。
實施例5在心肌缺血動物模型中，通過預(yù)給予GM-CSF體內(nèi)刺激的骨髓細胞的效應(yīng) 通過在冠狀動脈左回旋支周圍植入漸進性縮窄器，在16頭豬中造成慢性心肌缺血。漸進性縮窄器植入4周減3天后，8個動物經(jīng)歷皮下注射GM-CSF連續(xù)3天(劑量是每日10μg)，隨后(在第4天和漸進性縮窄器植入后恰好4周)用經(jīng)心內(nèi)膜注射導(dǎo)管將新鮮抽吸的ABM經(jīng)心內(nèi)膜注射入缺血區(qū)(每個動物2.4ml，在12個位點注射)，不用GM-CSF刺激的8個對照動物用肝素化的鹽水注射。在基線和4周之后，動物經(jīng)歷靜息和起搏超聲心動圖評價局部收縮性(心肌增厚的百分數(shù))，微球體研究評價靜息時和腺嘌呤核苷輸注期間的側(cè)支依賴性灌注。注射ABM 4周之后，在ABM處理的豬中側(cè)支血流(表示為缺血區(qū)/正常區(qū)的比值×100)改善，但是在對照組中不改善(ABM靜息時85±11對72±16，P＝0.026；腺嘌呤核苷輸注期間83±18對64±19，P＝0.06；對照組靜息時93±10對89±9，P＝0.31；腺嘌呤核苷輸注期間73±17對75±8，P＝0.74)。相似地，ABM處理的豬中收縮性增加，但是在對照組中不增加(ABM靜息時93±33對63±27，P＝0.009；起搏期間84±36對51±20，P＝0.014；對照靜息時72±45對66±43，P＝0.65；起搏期間70±36對43±55，P＝0.18)。
結(jié)果提示，基于導(dǎo)管經(jīng)心內(nèi)膜注射ABM，所述ABM通過系統(tǒng)給予GM-CSF 3天在體內(nèi)被預(yù)刺激，可以增加缺血心肌的側(cè)支灌注和心肌功能，所見提示，本方法可以構(gòu)成新的治療策略，用于獲得最佳的治療性血管生成。
實施例6人類患者的治療 在心臟手術(shù)起始之前大約60分鐘時，用無防腐劑的肝素化玻璃注射器(20單位肝素/1ml新鮮BM)，從髂嵴抽吸骨髓(約5ml)。立即用300μ和200μ的不銹鋼網(wǎng)孔過濾器連續(xù)粗過濾抽吸的骨髓。有經(jīng)驗的血液病學(xué)家將在無菌條件下實施該過程。評價骨髓涂片以證實骨髓制備物的正常組織形態(tài)學(xué)。
可以應(yīng)用向心肌輸送制劑的幾種過程中的任意。這些包括直接經(jīng)心外膜輸送，如可以用手術(shù)方法實施(例如但不限于，經(jīng)胸壁切開或經(jīng)胸壁插入針或其它輸送設(shè)備，或通過胸腔鏡)，或通過幾種經(jīng)皮操作中的任意。下面是經(jīng)皮輸送的一個例子。應(yīng)該強調(diào)的是，下面的例子不意味著，將輸送的選擇限制為例子中描述的具體的基于導(dǎo)管的平臺系統(tǒng)一可以應(yīng)用任何基于導(dǎo)管的平臺系統(tǒng)。
應(yīng)用標(biāo)準的經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)操作，將至少SF的導(dǎo)入鞘(introducer sheath)插入右股動脈或左股動脈。插入動脈鞘之后，貫穿手術(shù)的LV描記和ABM移植部分，給予肝素并隨需要而補充，維持ACT200-250秒。在手術(shù)期間不長于30分鐘的間隔處，以及在手術(shù)結(jié)束時，檢查ACT，以檢驗本要求的一致性。
在標(biāo)準的RAO和/或LAO視圖中，進行左心室造影術(shù)以協(xié)助引導(dǎo)NOGA-STARTM和注射導(dǎo)管，用NOGA-STARTM導(dǎo)管得到LV電-機械圖。8F INJECTION-STAR導(dǎo)管以倒退(retrograde)方式經(jīng)股動脈鞘放置于主動脈瓣。完全末端偏轉(zhuǎn)(full tip deflection)之后，將圓形的遠側(cè)末端輕輕地穿過主動脈瓣下垂，一旦位于LV腔內(nèi)，將其適當(dāng)?shù)厣熘薄?br> 使導(dǎo)管(并入了電磁末端傳感器)的方向為定位在處理區(qū)之一(例如，前部、側(cè)部、下后部或其它部位)。利用NOGATM的安全性質(zhì)，僅當(dāng)穩(wěn)定信號證實LS值＜3時，使針插入并注射。單獨注射0.2cc新鮮抽吸的ABM，將通過經(jīng)心內(nèi)膜途徑輸送至多達兩個處理區(qū)的范圍，在兩個注射位點之間不近于5mm。注射位點的密度將取決于個體對象的LV心肌內(nèi)解剖情況和在心內(nèi)膜表面獲得穩(wěn)定定位，而沒有導(dǎo)管移動或室性期前收縮(PVCs)的能力。
移植入缺血心肌的新鮮抽吸的ABM和側(cè)支血流改善相關(guān)而沒有副作用，這由于幾個原因而在臨床上有重要意義。上面描述的方法學(xué)利用了骨髓以有效和明顯安全的方式誘導(dǎo)局部血管生成反應(yīng)的天然能力。這種血管生成策略可能比目前處于試驗中的許多其它策略的花費低。它也避免了潛在的毒性相關(guān)問題，所述問題是應(yīng)用病毒載體用各種基于基因方法帶來的輕微的問題，但是有明確的可能性。
本發(fā)明基于這樣的概念A(yù)BM是細胞的最佳來源(一個例子是內(nèi)皮祖細胞，但是本發(fā)明不限于這種細胞，原因是骨髓中的許多其它細胞可以非常有助于血管生成效應(yīng))和分泌，例如，血管生成生長因子，它是在轉(zhuǎn)移至另一組織如缺血心臟或外周肢體時需要，以促進新血管生長和重建功能的因子?；颊叩淖泽w骨髓可以被用作關(guān)鍵的治療來源，用以在缺血組織誘導(dǎo)治療性血管生成和/或肌生成，所述缺血組織例如心肌和/或缺血肢體處，其由于動脈閉塞血液灌注受損。抽吸患者的自體骨髓，即ABM捐贈物，如此處所描述地處理，并直接注射入缺血和/或相鄰的非缺血組織，例如，心肌和/或缺血肢體，以促進血管生長。
通過應(yīng)用或是基于導(dǎo)管的經(jīng)心內(nèi)膜注射方法，或是外科(開胸或通過胸腔鏡檢查)經(jīng)心外膜胸廓造口術(shù)方法，將ABM注射入心臟肌肉，例如心肌?？梢杂眠@兩種輸送策略獲得相同的治療目的，這是通過促進血管生成骨髓因子(elements)在靶器官組織例如心肌和/或缺血肢體并入和整合。
根據(jù)本發(fā)明，給予有效量的ABM、骨髓細胞或用血管生成促進因子轉(zhuǎn)染的骨髓細胞，用于治療。有經(jīng)驗的實施者將理解的是，給予的量將取決于許多因素，包括但不限于，意圖的療法、被治療的病理狀態(tài)的嚴重程度、欲被治療的面積的大小和范圍等等。關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的治療，代表性的方案將是，在從大約12至大約15次注射中的每一次中，給予從大約0.2至大約0.5ml的ABM量，給予的ABM總計是從大約2.4至大約6ml。給予的每一劑量將優(yōu)選地包括從大約1至大約2體積百分比的肝素或其它血液抗凝劑如華法林鈉。當(dāng)ABM被培養(yǎng)或刺激和/或和其它藥物或類似物聯(lián)合給予時，每次劑量中存在的ABM量將大約相同，和/或給予的總ABM將和上述量大約相同。認為每次治療中給予的ABM細胞總數(shù)將類似于從大約107至5×108。
在本發(fā)明的另一種實施方案中，血管生成因子基因表達的最大化可以通過共同給予血管各種血管生成刺激物和ABM被增強。因此，根據(jù)本發(fā)明，ABM移植是以或是“單獨”治療劑或是和任何藥理學(xué)藥物、蛋白質(zhì)或基因或任何其它化合物或干預(yù)手段聯(lián)合注射的，所述任何藥理學(xué)藥物、蛋白質(zhì)或基因或任何其它化合物或干預(yù)手段可以增強骨髓產(chǎn)生血管生成生長因子和/或促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管管道形成。“組合”因子可以被直接給予患者或靶組織，或在將骨髓注射入患者之前，在體外和骨髓溫育。這些“組合”因子的例子(盡管不限于這些制劑)是巨核細胞-單核細胞集落刺激因子、單核細胞趨化蛋白1(MCP 1)、EPAS1或缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)。對骨髓的刺激可以通過直接將骨髓暴露于蛋白形式的因子，或者可以用帶有相關(guān)基因的載體轉(zhuǎn)染骨髓細胞。例如，可以用帶有HIF-1或EPAS1轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒載體或腺病毒載體轉(zhuǎn)染骨髓?？梢栽鰪姽撬璁a(chǎn)生血管生成因子的干預(yù)的一個例子是，將骨髓細胞體外暴露于缺氧。此干預(yù)可以對骨髓單獨應(yīng)用，或者和上面列出的任何因子聯(lián)合。這些最佳化策略被設(shè)計為，在直接注射骨髓進入心臟或任何外周缺血組織之前，增加血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達量和/或具有血管生成活性的其它細胞以因子的量。廣義上，本發(fā)明包括心肌內(nèi)注射ABM和任何因子，所述因子將是可以利用，以引起骨髓刺激和/或通過骨髓或其基質(zhì)微環(huán)境，體外或體內(nèi)刺激任何血管生成生長因子產(chǎn)生。
取決于臨床情況，輸送上述治療形式至患者將變化。例如，患有難治性冠狀動脈疾病或缺血性外周血管病的患者將是候選者，進行骨髓抽吸術(shù)，隨后進行ABM心肌或肢體移植，移植進入缺血組織或其邊界區(qū)和/或正常組織，所述正常組織可以作為患病組織的側(cè)支或細胞供應(yīng)來源，用于治療性血管生成和/或肌生成的目的。例如，患有難治性冠狀動脈疾病或缺血性外周血管病的患者將是候選者，進行骨髓抽吸術(shù)，隨后進行ABM心肌或肢體移植移植進入缺血組織或其邊界區(qū)和/或正常組織，所述正常組織可以作為患病組織的側(cè)支或細胞供應(yīng)來源，用于治療性血管生成和/或肌生成的目的。本方法將涉及應(yīng)用骨髓抽吸術(shù)、骨髓采集和處理、隨后應(yīng)用ABM或其要素(生長因子和/或從患者自體骨髓分離的細胞要素)，帶有或不帶有對其輸送形式的任何體外刺激，注射入缺血或非缺血心肌和/或外周缺血組織(如肢體缺血)。骨髓將在標(biāo)準的抗凝/抗聚集溶液(含有檸檬酸鈉和EDTA)中保存，保存在4℃，在無菌環(huán)境中，直至其使用時。
一旦應(yīng)用，骨髓將被過濾，以避免注射殘存的血凝塊或大集合體(macroaggregates)進入靶組織。
骨髓將被注射入心肌，即在治療性心肌血管生成或治療性肌生成中，所述骨髓帶有或不帶有任何輸送形式的刺激因子，或用帶有轉(zhuǎn)基因的載體轉(zhuǎn)染或未用帶有轉(zhuǎn)基因的載體轉(zhuǎn)染，所述轉(zhuǎn)基因被設(shè)計為增強骨髓的血管生成效應(yīng)，這是應(yīng)用或是任何基于導(dǎo)管的經(jīng)心內(nèi)膜注射設(shè)備或通過外科(開胸)經(jīng)心外膜胸廓造口術(shù)，或允許經(jīng)心外膜輸送的任何其它方法實施的。在治療肢體缺血的情形下，將通過直接注射骨髓或其要素將骨髓轉(zhuǎn)移進入腿部肌肉。所述骨髓或其要素帶有或不帶有對其任何輸送形式的體外或體內(nèi)刺激。
每個治療位點的注射量可能是在每個注射位點0.1-5.0cc范圍之間，這取決于具體的骨髓產(chǎn)物和缺血狀態(tài)的嚴重程度和注射的位點。注射的總數(shù)將可能是每療程1-50個注射位點范圍之間。
實施例7豬骨髓培養(yǎng) 在無菌狀態(tài)下從豬采集骨髓細胞(BMCs)，置于無防腐劑的肝素中(20單位/ml BM細胞)并用300μ和200μ的不銹鋼網(wǎng)孔過濾器連續(xù)過濾。然后，用Ficoll-Hypaque梯度離心分離BMCs，種植在T-75燒瓶中，在長期培養(yǎng)基(LTCM)(Stem Cell Tech，Vancouver，BritishColumbia，Canada)中培養(yǎng)過夜，溫度是33℃，T-75培養(yǎng)瓶中的CO2是5％。然后，改變培養(yǎng)基和洗掉非附著細胞。附著的細胞(即，“早期附著細胞”)大多數(shù)是單核細胞、內(nèi)皮前體細胞或其它造血系細胞。早期附著細胞中的單核細胞中的是骨髓源基質(zhì)干細胞。通過lac-Z染色試驗，通過表達標(biāo)記物蛋白，這些細胞顯示出對腺病毒是允許的(permissive)。
BMCs在每一培養(yǎng)皿中的種植密度是7×106/ml。當(dāng)細胞在大約7天開始會合時，通過0.25％胰蛋白酶將它們分離為1∶3。對此研究，傳代3-8次。
腺病毒轉(zhuǎn)染 首先在6-cm的皮氏培養(yǎng)皿(Petri dishes)中培養(yǎng)BMCs 3至14天，允許產(chǎn)生粘附于皮氏培養(yǎng)皿的早期附著細胞層。在開始種植后的那天，沖去非-黏附細胞。然后，用編碼一種或多種細胞因子、生長因子或其它哺乳動物血管生成促進因子的載體接種早期附著細胞，所述其它哺乳動物血管生成促進因子如同但不限于轉(zhuǎn)錄因子HIP-1或HIF-2。此接種可以發(fā)生于種植后的從3至28天，例如，從3至12天或3至8天。接種后大約2小時至3天，從轉(zhuǎn)染的細胞洗去病毒。隨后，轉(zhuǎn)染的細胞可以被注射入患者的靶組織，如心臟的肌肉或腿部的肌肉。
實施例8MSCs具有體外分泌生物活性的側(cè)支-增強因子(collateral-enhancingfactors)的能力 作為HIF-1轉(zhuǎn)導(dǎo)MSCs增加細胞的血管生成潛能的假設(shè)的可行性的第一個試驗，培養(yǎng)小鼠MSCs，連續(xù)地分析條件培養(yǎng)基，分析細胞因子的產(chǎn)量(圖5)。從小鼠的股骨和脛骨采集單核的骨髓細胞，用Ficoll密度梯度分離單核細胞成分。培養(yǎng)細胞10天，用雙磁珠技術(shù)(double magnetic bead technique)，從異源培養(yǎng)細胞分離CD34陰性/CD45陰性細胞。此分離方法涉及，負性地(negatively)選擇不表達細胞標(biāo)記物CD34和CD45的細胞，通過用經(jīng)商業(yè)途徑得到的用這些標(biāo)志物的抗體標(biāo)記的磁珠，將MSCs從異源培養(yǎng)的細胞中純化出來。CD34陰性/CD45陰性-成分被分離出來，這是通過用FITC-標(biāo)記的抗-CD34抗體(Pharmingen，San Diego，CA)標(biāo)記，隨后通過和抗-FITC及抗-CD45磁珠同時溫育(Miltenyi Biotech，Sunnyvale，CA)實施的。將細胞通過磁柱，收集雙陰性成分。隨后，分別培養(yǎng)磁珠-陰性(bead-negative)和磁珠-陽性群。磁珠-陰性群顯示了典型的MSCs形態(tài)，而磁珠-陽性細胞群似乎主要由小的球形細胞構(gòu)成，與淋巴系造血細胞(lymphohematopoietic cells)一致(圖5A和5B)。進行FACS分析，證實細胞不表達淋巴系造血細胞特有的表面標(biāo)記物CD31、CD34、CD45、和CD117，但是確實表達骨髓源基質(zhì)細胞特有的高水平的CD44(95±0.6％)和CD90(99.1±0.1％)和CD105(89±2.1％)。
(這些CD34陰性/CD45陰性細胞在此也稱為“骨髓源基質(zhì)細胞(marrow-derived stromal cells)”或“MSCs”)。重新鋪板分離的MSCs，隨后收集條件培養(yǎng)基24小時。
通過ELISA分析如上制備的條件培養(yǎng)基中血管生成細胞因子的存在情況。用總細胞培養(yǎng)蛋白校正細胞因子水平。數(shù)據(jù)反映了至少3個不同的細胞群，每一細胞群含有從2個小鼠集中的細胞。結(jié)果顯示(圖5)，MSCs表達這樣的已知的側(cè)支增強因子如VEGF、MCP-1和bFGF(也是血管生成素-1和P1DGF(未顯示))。與之對照，CD34+細胞(祖內(nèi)皮細胞)不表達這些因子。
也檢測了分泌入培養(yǎng)MSCs的培養(yǎng)基中的細胞因子的功能，這是通過檢測他們引起內(nèi)皮細胞增殖的能力。收集如上制備的MSC-條件培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)其確實增加了培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖。將MAECs或SMC’s(1×104/孔)鋪板在24孔板中24小時，在帶有0.1％胎牛血清的MEM中。然后，用各種濃度的MSCCM或僅帶有DM-10的對照孔替代培養(yǎng)基。持續(xù)培養(yǎng)72小時，其后，回收細胞，用Coulter計數(shù)器計數(shù)。數(shù)據(jù)報告為相比于對照組的增殖變化的均數(shù)百分數(shù)。
MSCs增加了小鼠缺血后肢的側(cè)支血流 用本領(lǐng)域的已知方法，使24周齡的Balb/C雄性小鼠經(jīng)歷右股動脈末端結(jié)扎(right distal femoral artery ligation)。24小時后，小鼠被隨機分為3組-1組接受如上制備的來自同系小鼠(syngeneic mice)的1×106MSCs，1組接受分離自同系小鼠的1×106成熟內(nèi)皮細胞。1組接受非條件培養(yǎng)基，注射入缺血后肢的內(nèi)收肌。在隨后的28天期間缺血后肢血流恢復(fù)后，應(yīng)用激光多普勒灌注成像(LDPI)(圖6)。
顯示于圖6的這些試驗的結(jié)果證實了，注射MSCs入缺血后肢的內(nèi)收肌顯著增加了測支血流，這種效應(yīng)在注射成熟內(nèi)皮細胞時未發(fā)現(xiàn)。
證實MSCs轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細胞存活和基因產(chǎn)物表達 作為確定MSCs是否提供了遺傳改變(genetic alteration)的合適的靶的起始步驟，檢測了用腺病毒載體體外轉(zhuǎn)導(dǎo)后MSCs的原位存活。為此目的，進行了兩個分別的試驗，一個應(yīng)用含有編碼綠色熒光蛋白(GFP)基因的腺病毒，一個含有編碼β-半乳糖苷酶的基因。如上制備的MSCs被體外轉(zhuǎn)導(dǎo)。初步研究確定，超過90％的MSCs被成功地用含有報告轉(zhuǎn)基因的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，MOI是150(數(shù)據(jù)未顯示)。為追蹤蛋白表達，用Ad.GFP或Ad.β-半乳糖苷酶溫育細胞，MOI是150，溫育2小時，洗滌3次，回收并立即注射入內(nèi)收肌(術(shù)后24小時)。為了追蹤注射的GFP+/MSCs的命運，用Nikon倒置熒光顯微鏡檢測多個內(nèi)收肌和小腿肌切片。為了追蹤β-gal+/MSCs的命運，用商業(yè)上可利用的X-gal試劑盒(Invitrogen)顯影切片并立即注射入小鼠的內(nèi)收肌，所述內(nèi)收肌在之前經(jīng)歷了股動脈結(jié)扎24小時。在第3天、第7天和第14天，處死小鼠。隨后檢測內(nèi)收肌切片，或是在熒光顯微鏡下，或是用X-gal染色，這取決于本領(lǐng)域中已知的合適方案。
在第3天，幾乎沒有細胞被發(fā)現(xiàn)表達所需基因。然而，在第7天和維持至第14天，發(fā)現(xiàn)表達所需基因的許多細胞貫穿內(nèi)收肌組織分布。
因此，試驗不僅在轉(zhuǎn)錄/翻譯機制上證實了細胞存活和保存，也證明了MSCs可以被用作載體，將所需基因?qū)胩囟ńM織如肌肉組織。
體外MSCs的HIF-1α/VP16轉(zhuǎn)染導(dǎo)致側(cè)支增強相關(guān)因子增加，此增加大于缺氧誘導(dǎo)的增加 如上所述分離和鋪板小鼠MSCs。比較3組MSCs。組1-MSCs，培養(yǎng)在常氧條件下；組2-MSCs，培養(yǎng)在1％O2中，組3-MSCs，用如上制備的編碼HIF-1α/VP16的腺病毒轉(zhuǎn)染。將MSCs和病毒溫育2小時，感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection)是200，隨后培養(yǎng)48小時，以允許時間用于基因表達。
隨后，從所有3組細胞收集培養(yǎng)物-條件培養(yǎng)基24小時。用商業(yè)上可得到的ELISA試劑盒，分析培養(yǎng)基中血管生成細胞因子VEGF和β-FGF的存在情況。用總細胞培養(yǎng)蛋白校正細胞因子水平。圖7中顯示的結(jié)果說明，HIF-1α/VP16轉(zhuǎn)染增加了VEGF和βFGF由MSCs表達和分泌，達到基本上大于缺氧時得到的水平。
浸泡這些培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基(MSC條件培養(yǎng)基或MSCCM)被加入內(nèi)皮細胞(EC)和平滑肌細胞(SMC)培養(yǎng)物，以評價MSCCM在細胞增殖中的作用。小鼠主動脈內(nèi)皮細胞(MAECs)分離如下。在無菌條件下，解剖小鼠胸主動脈(n＝10)，移除外膜，然后切成1-2mm的環(huán)狀物。然后，在37℃下用0.25％胰蛋白酶溫育環(huán)狀物20分鐘，，隨后沖洗和收集懸浮細胞。這些細胞培養(yǎng)在補充有10％FBS的極限基本培養(yǎng)基(Minimal Essential Media)中。細胞均一地對因子VIII呈陽性。用修飾的前述方案分離平滑肌細胞(SMC’s)。簡言之，如上收集MAECs后，加入溶于Hanks平衡鹽溶液(1mg/ml)中的膠原酶，37℃溫育達3小時，每15-30分鐘輕柔攪拌。再次收集懸浮細胞，沖洗和重懸浮在補充有10％FBS的培養(yǎng)基199(Medium 199)中。細胞均一地對平滑肌肌動蛋白染色。兩種細胞均傳代3-8次，用于本研究目的。
當(dāng)比較于來自常氧和缺氧條件下MSCs的MSCCM時，來自HIF-1α/VP16-轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSCs的MSCCM增加EC增殖(290％對31％對79％，比較于對照培養(yǎng)基中的增殖，p＜0.001)和SMC增殖(220％對26％對58％，p＜0.001)。
MSCs的HIF-1α/VP16轉(zhuǎn)染導(dǎo)致側(cè)支血流增加。
隨后研究了在小鼠后肢缺血模型中，HIF-1α/VP16轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSCs對側(cè)支血流的影響。1組動物(如上)接受1×105非轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSCs，1組接受HIF-1α/VP16-轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞，第3組接受培養(yǎng)基。如上述監(jiān)測缺血肢體的血流。21天間收集的結(jié)果顯示(圖8)，和用非轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC處理的小鼠中觀察到的情況相比，用轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSCs處理的小鼠證實了側(cè)支血流恢復(fù)的一致的較大增加。
總之，本實驗顯示了，用腺病毒載體中的HIF-1α/VP16轉(zhuǎn)染顯著和驚人地增加了MSCs的體外血管生成效應(yīng)。更重要的是，體內(nèi)研究提示，和單獨注射MSCs相比，本策略導(dǎo)致側(cè)支改善效應(yīng)增加。這些研究提示，用HIF-1α轉(zhuǎn)導(dǎo)MSCs(和最可能地，也用編碼其它血管生成相關(guān)細胞因子如FGF家族蛋白和NOS)將最佳化基于細胞策略的側(cè)支增強效應(yīng)，用于增加缺血組織的側(cè)支血流。
可以用其它具體形式實施本發(fā)明，而不背離其精神或主要特性。因此，對本發(fā)明的前述僅僅公開了其代表性實施方案，其它變化被預(yù)期在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明不限于此處詳述的具體實施方案。而是，可以參照所附的權(quán)利要求作為本發(fā)明范圍和精神的提示。
前面的具體實施方案例證了本發(fā)明實踐。然而，應(yīng)該理解，可以應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或此處公開的其它方法，而不背離本發(fā)明的精神或所附權(quán)利要求的范圍。
權(quán)利要求
1.增強受損骨髓細胞在需要的患者中促進側(cè)支血管發(fā)育能力的方法，所述方法包括使受損的骨髓細胞在合適的培養(yǎng)基中，在合適的培養(yǎng)條件下生長一段時期，所述時期足以促進早期附著細胞從骨髓細胞產(chǎn)生；用載體轉(zhuǎn)染至少一部分早期附著細胞，所述載體包括編碼一種或多種因子的多核苷酸，所述因子選自血管生成細胞因子、生長因子和哺乳動物血管生成促進因子，和培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的早期附著細胞，以致于使一種或多種因子產(chǎn)生，從而增強受損骨髓細胞和/或當(dāng)這些細胞培養(yǎng)生長時、來自這些細胞的培養(yǎng)基促進患者側(cè)支血管發(fā)育的能力，細胞和/或培養(yǎng)基被輸送至所述患者，所述增強作用是和非轉(zhuǎn)染的細胞或從培養(yǎng)生長的非轉(zhuǎn)染細胞得到的培養(yǎng)基的作用相比而言的。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述骨髓細胞由于供體衰老而受損。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述骨髓細胞由于供體患有疾病而受損，所述疾病損害了見于正常青年健康個體中的天然發(fā)生的血管生成過程。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述疾病是高膽固醇血癥。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述供體是患者。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細胞培養(yǎng)生長大約12小時至大約12天。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述時期是從大約12小時至大約3天。
8.權(quán)利要求1所述的方法，進一步包括從供體獲得骨髓和過濾骨髓，以得到骨髓細胞。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述過濾去除了大于從大約300μ至大約200μ的顆粒。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種因子選自缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)、內(nèi)皮PAS域蛋白1(EPAS1)、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、巨核細胞-單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)、PR39、成纖維細胞生長因子(FGF)和一氧化氮合酶(NOS)。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述載體選自質(zhì)粒載體和腺病毒載體。
12.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述載體是腺病毒載體。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述因子選自PR39、FGF和NOS。
14.權(quán)利要求1所述的方法，進一步包括刺激轉(zhuǎn)染的早期附著細胞。
15.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細胞是骨髓源基質(zhì)細胞。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述培養(yǎng)基是通過培養(yǎng)骨髓源基質(zhì)細胞得到的。
17.在所需患者中增強其側(cè)支血管形成的方法，所述方法包括從該患者獲得自體骨髓；使自體骨髓在容器中在合適的培養(yǎng)條件下生長一段時期，所述時期足以促進早期附著細胞由自體骨髓產(chǎn)生；用載體轉(zhuǎn)染至少一部分早期附著細胞，所述載體包括編碼一種或多種因子的多核苷酸，所述因子選自成纖維細胞生長因子(FGF)、NOS和PR39，以致于引起一種或多種因子表達；和直接向患者中的所需部位給予有效量的轉(zhuǎn)染的早期附著細胞和/或來自培養(yǎng)生長中的轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)基，從而增強患者中該部位的側(cè)支血管形成。
18.在所需患者中增強側(cè)支血管形成的方法，所述方法包括使骨髓在合適的培養(yǎng)條件下生長一段時期，所述時期足以促進早期附著細胞由骨髓產(chǎn)生；用載體轉(zhuǎn)染至少一部分早期附著細胞，所述載體包括編碼一種或多種因子的多核苷酸，所述因子選自血管生成細胞因子、生長因子和哺乳動物血管生成促進因子，由早期附著細胞表達；和在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的早期附著細胞和培養(yǎng)一段時期，所述時期適于使一種或多種因子由細胞表達，從而產(chǎn)生條件培養(yǎng)基；和直接向患者中的所需部位給予有效量的轉(zhuǎn)染的早期附著細胞和/或條件培養(yǎng)基，從而增強患者中該部位的側(cè)支血管形成。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述早期附著細胞是骨髓源基質(zhì)細胞，并且細胞被直接給予至患者的缺血部位。
20.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述早期附著細胞是骨髓源基質(zhì)細胞，并且條件培養(yǎng)基被直接給予至患者的缺血部位。
21.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述細胞和/或條件培養(yǎng)基被注射入血流，用于給予所述部位。
22.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述細胞和/或條件培養(yǎng)基被注射入供應(yīng)所述部位的動脈。
23.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述時期是從大約3小時至大約12天。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述時期是從大約3小時至大約3天。
25.權(quán)利要求18所述的方法，進一步包括在培養(yǎng)骨髓獲得早期附著細胞之前過濾骨髓。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述骨髓是自體骨髓。
27.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述因子是促進哺乳動物血管生成的轉(zhuǎn)錄因子。
28.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述載體是腺病毒載體。
29.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述因子選自成纖維細胞生長因子(FGF)、NOS和PR39。
30.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述因子選自FGF-1、FGF-2、FGF-4和FGF-5。
31.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述因子選自誘導(dǎo)型NOS和內(nèi)皮型NOS。
32.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述因子是PR39。
33.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)染的細胞被直接注射入心臟或腿部肌肉，以促進該處的血管生成。
34.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述方法增強心臟或腿部肌肉的側(cè)支血管形成。
35.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述方法促進新植入的心肌細胞的發(fā)育。
36.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述方法增強患有心電通路(cardiac electrical pathway)損害的患者心臟的電傳導(dǎo)性。
37.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述方法增強有受損心肌功能的患者的心肌功能。
38.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述方法治療左心室病理狀態(tài)或右心室病理狀態(tài)，所述狀態(tài)引起患者心臟的心功能受損。
39.治療組合物，其包括來源于骨髓的早期附著細胞，該細胞已經(jīng)用載體被轉(zhuǎn)染，所述載體包括編碼一種或多種因子的多核苷酸，所述因子選自血管生成細胞因子生長因子和血管生成促進因子。
40.權(quán)利要求39所述的治療組合物，進一步包括條件培養(yǎng)基，其中細胞已經(jīng)培養(yǎng)生長一段時期，所述時期足以表達所述因子中的一種或多種。
41.權(quán)利要求39所述的組合物，其中所述多核苷酸進一步包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)可操縱地和多核苷酸相關(guān)聯(lián)。
42.權(quán)利要求39所述的組合物，其中所述轉(zhuǎn)染的細胞通過暴露于缺氧而被刺激過。
43.權(quán)利要求39所述的組合物，進一步包括肝素或另一抗凝劑。
44.權(quán)利要求39所述的組合物，其中所述載體是腺病毒載體。
45.權(quán)利要求39所述的組合物，其中所述早期附著細胞是骨髓源基質(zhì)細胞。
46.權(quán)利要求39所述的組合物，其中所述組合物意圖于被注射入具有缺血組織的患者，并且早期附著細胞來源于從該患者獲得的骨髓。
全文摘要
本發(fā)明提供了方法，用于增強受損骨髓細胞導(dǎo)入患者的缺血部位時促進血管生成的能力，通過用促進血管生成的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染來自培養(yǎng)中的骨髓的早期附著細胞實施。也提供了方法，利用來自自體骨髓的這樣的早期附著細胞，或當(dāng)細胞培養(yǎng)生長時(不必來自自體細胞)、來自這些細胞的培養(yǎng)基，以向患者輸送促進血管生成的轉(zhuǎn)基因或蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)染的早期附著細胞，或當(dāng)這些細胞培養(yǎng)生長時、來自這些細胞的培養(yǎng)基，被導(dǎo)入缺血組織如心臟，以增強側(cè)支血管形成。細胞或培養(yǎng)基也可以被注射入血流(供應(yīng)缺血組織的動脈或任何其它血管或靜脈)。
文檔編號A61K38/43GK1838962SQ200480024156
公開日2006年9月27日 申請日期2004年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月10日
發(fā)明者S·愛潑斯坦, S·富赫斯, R·科爾諾維斯基, M·B·列昂, K·W·卡彭特 申請人:心肌治療有限公司