人源化的FcγR小鼠的制作方法
【專利摘要】提供了遺傳修飾的非人動物和用于產(chǎn)生和使用它們的方法和組合物，其中所述遺傳修飾包括內(nèi)源低親和力FcγR基因座的缺失，并且其中小鼠能夠表達(dá)功能性FcRγ鏈。描述了遺傳修飾的小鼠，包括從內(nèi)源FcγR基因座表達(dá)低親和力人FcγR基因的小鼠，并且其中所述小鼠包含功能性FcRγ鏈。提供了在宿主免疫系統(tǒng)的輔助細(xì)胞上表達(dá)至多5個低親和力人FcγR基因的遺傳修飾的小鼠。
【專利說明】人源化的Fc γ R小鼠
[0001] 本申請是申請?zhí)枮?01080064262. 4、申請日為2010年12月17日、發(fā)明名稱 為"人源化的Fc Y R小鼠"的中國發(fā)明專利申請的分案申請，原申請為國際申請?zhí)枮镻CT/ US2010/060925的國家階段申請，該國際申請要求申請日為2009年12月21日，申請?zhí)枮?61/288, 562的美國臨時申請的優(yōu)先權(quán)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明領(lǐng)域是缺失內(nèi)源鼠 Fc γ R基因的遺傳修飾的非人動物，包括內(nèi)源Fc γ R基 因被人Fc γ R基因替代的遺傳修飾的動物，包括能夠表達(dá)至少2、3、4或5種功能性人低親 和力FcyR基因的小鼠，以及包括包含不表達(dá)內(nèi)源低親和力FcyR基因的免疫細(xì)胞的遺傳 修飾的小鼠。
[0003] 背景
[0004] Fc受體（FcR)是在哺乳動物的進(jìn)行免疫系統(tǒng)的多種功能的免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的表 面上發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)。FcR以多種類型存在于多種細(xì)胞上，并且介導(dǎo)多種免疫功能，例如結(jié)合 附著至被感染的細(xì)胞或侵襲性病原體的抗體、刺激吞噬細(xì)胞或細(xì)胞毒性細(xì)胞以通過抗體介 導(dǎo)的吞噬作用或抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC)破壞微生物或感染的細(xì)胞。
[0005] ADCC是這樣的過程：免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞裂解被抗體結(jié)合的靶細(xì)胞。該過程依賴 于對外源抗原或細(xì)胞的先行接觸，從而產(chǎn)生抗體應(yīng)答。ADCC可通過效應(yīng)細(xì)胞例如天然殺傷 (NK)細(xì)胞，通過效應(yīng)細(xì)胞表面上表達(dá)的FcR對本身結(jié)合至外源抗原或細(xì)胞的抗體的Fc部分 的結(jié)合來介導(dǎo)。由于FcR在免疫應(yīng)答中起著中心作用，因此需要有共表達(dá)多種人FcR的有 用的非人動物，包括共表達(dá)多種人低親和力FcR的非人動物。存在對用于研究和闡明人疾 病治療（特別是抗腫瘤治療和用于治療自身免疫疾病的治療）和藥物開發(fā)（特別是在人抗 體藥劑的開發(fā)、設(shè)計和測試中）的人FcR功能和人的ADCC過程的非人動物模型。
[0006] 附圖概述
[0007] 圖1是小鼠的野生型低未和力Fc γ R基因座的不意圖，顯不了小鼠 Fc γ RIIB，F(xiàn)c γ RIV和Fc γ RIII基因以及用于這些基因的靶向缺失的小鼠 Fc γ R靶向載體， 其包括側(cè)翼連接有位點特異性重組位點的新霉素盒。
[0008] 圖2顯示了就B細(xì)胞（抗-⑶19)，NK細(xì)胞（抗-NKp46)和巨噬細(xì)胞（抗-F4/80) 門控的脾細(xì)胞的直方圖，包括野生型和低親和力FcYRa鏈基因缺陷型小鼠 （mFcYR K0) 的內(nèi)源mFc YRII和mFc YRIII基因的表達(dá)。
[0009] 圖3A-3D顯示了在人源化CD20小鼠（hCD20)和培育成Fc γ R敲除小鼠的人源化 0)20小鼠（hO)20/FcYR K0)中在幾個淋巴細(xì)胞區(qū)室（lymphocyte compartment):骨髓（圖 3A)、血液（圖3B)、淋巴結(jié)（圖3C)和脾（圖3D)中利用具有小鼠 Fc(Ab 168)或人Fc(Ab 735)的人抗-人⑶20抗體對B細(xì)胞進(jìn)行的體內(nèi)耗盡。對于每一個圖，y-軸顯示門控的B 細(xì)胞（B220+/IgM+或B220+/CD19+)的百分比，X-軸顯示每一個動物組的抗體劑量：10mg/kg 對照抗體（C)，2mg/kg人抗-人⑶20抗體（2Ab和10mg/kg人抗-人⑶20抗體（10Ab)。 [0010] 圖4是低親和力小鼠 FcyR基因座的新霉素靶向缺失和用于將兩個人低親和力 Fc YR基因 （hFc YRIIIA和hFc YRIIA)插入缺失的小鼠基因座的第二靶向載體的示意性描 述，所述第二靶向載體包括側(cè)翼連接有位點特異性重組位點的潮霉素盒。為了在血小板上 表達(dá)hFc γ RIIA，使用了可操作地連接于人Fc γ RIIIA-IIA靶向載體的hFc γ RIIA基因的延 長的啟動子區(qū)域；為了阻止在血小板上表達(dá)hFcYRIIA，刪除或?qū)嵸|(zhì)上刪除所述啟動子區(qū) 域。
[0011] 圖5A顯示針對NK細(xì)胞（抗-NKp46和巨噬細(xì)胞（抗-F4/80)的門控的脾細(xì)胞的 直方圖，包括野生型和人？(^1?11從-1從純合子小鼠（人？(^1?11從/^(^1?1從！10)的人 Fc YRIIIA的表達(dá)。
[0012] 圖5B顯示針對嗜中性粒細(xì)胞（抗-Ly6G)和巨噬細(xì)胞（抗-F4/80)的門控的脾細(xì) 胞的直方圖，包括野生型和人？(^1?11從-1從純合子小鼠（人？(^1?11從/^(^1?1從！10)的 人Fc YRIIA的表達(dá)。
[0013] 圖6為包括兩個低親和力人Fc γ R基因 （hFc γ RIIIA和hFc γ RIIA)的插入的低 親和力小鼠 Fc γ R基因座的潮霉素靶向缺失以及用于插入3個額外的低親和力人Fc γ R基 因 （hFc γ RIIB、hFc γ RIIIB和hFc γ RIIC)的第三靶向載體和側(cè)翼連接有位點特異性重組 位點的新霉素盒的不意圖。
[0014] 圖7顯示針對B細(xì)胞（抗-CD19)和嗜中性粒細(xì)胞（抗-Ly6G)的門控的脾細(xì)胞 的直方圖，包括野生型和人Fc γ RIIIA-IIIB-IIA-IIB-IIC純合子小鼠（人Fc γ RIIIA/ Fc γ RIIIB/Fc γ RIIA/Fc γ RIIB/Fc γ RIIC H0)的人 Fc γ RIIB 和人 Fc γ RIIIB 的表達(dá)。
[0015] 概述
[0016] 提供了遺傳修飾的細(xì)胞、非人胚胎、非人動物以及用于產(chǎn)生和使用它們的方法和 組合物。在不同的方面，非人動物包含人FcyR受體、內(nèi)源低親和力FcyR受體的缺失和/ 或人Fc γ R受體在內(nèi)源小鼠低親和力Fc γ R基因座上對內(nèi)源Fc γ R受體的替代。
[0017] 在一個方面，提供了包含功能性FcRY鏈的遺傳修飾的細(xì)胞、非人胚胎和非人動 物，其中所述細(xì)胞、胚胎和動物包含進(jìn)一步修飾，包括用一個或多個低親和力人Fc γ R基因 序列（例如，選自 Fc γ RIIA、Fc γ RIIB、Fc γ RIIC、Fc γ RIIIA、Fc γ RIIIB 及其組合）對低 親和力內(nèi)源非人？(^1?基因序列（例如，？(^1?118、？(^1^和？(^1?111)的替代。
[0018] 在一個實施方案中，細(xì)胞、非人胚胎和非人動物為鼠。在一個實施方案中，功能性 FcRy鏈為小鼠 FcRy鏈。在一個實施方案中，小鼠 FcRy鏈為對于小鼠、細(xì)胞或胚胎而言 是內(nèi)源性的FcRy鏈。
[0019] 在一個實施方案中，細(xì)胞、胚胎和動物為小鼠，并且小鼠表達(dá)人低親和力FcyR受 體的功能性α鏈和功能性內(nèi)源小鼠 Y鏈。
[0020] 在一個方面，提供了遺傳修飾的小鼠，其中小鼠不表達(dá)選自FcYRIIBa鏈、 FcYRIVa鏈、FcYRIIIa鏈及其組合的內(nèi)源α鏈；其中小鼠表達(dá)功能性內(nèi)源小鼠 Y鏈。
[0021] 在具體的實施方案中，小鼠不表達(dá)功能性Fc γ RIIB a鏈，不表達(dá)功能性 FcyRIVa鏈，并且不表達(dá)功能性FcyRIIIa鏈。
[0022] 在一個實施方案中，小鼠基因組包含內(nèi)源FcYRIIBa鏈的缺失、內(nèi)源FcYRIVa 鏈的缺失和內(nèi)源FcYRIIIa鏈的缺失。
[0023] 在一個實施方案中，小鼠包括內(nèi)源FcYRIIBa鏈的缺失、內(nèi)源FcYRIVa鏈的缺 失和內(nèi)源Fc γ RIII a鏈的缺失，并且還包括與野生型小鼠對于相同抗原的能力相比較減 小的對抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力。在一個實施方案中，減小的免疫應(yīng)答包括減小的抗體依 賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC)。在一個實施方案中，減小的免疫應(yīng)答包括在細(xì)胞殺傷測 定中減小的實現(xiàn)抗體依賴性NK細(xì)胞殺傷的能力。在具體的實施方案中，ADCC或抗體依賴 性NK細(xì)胞殺傷的減小為至少50%，在一個實施方案中是至少75%，在一個實施方案中是至 少 90%。
[0024] 在一個實施方案中，小鼠包含內(nèi)源FcyRIIBa鏈的缺失、內(nèi)源FcyRIVa鏈的缺 失和內(nèi)源Fc γ RIII a鏈的缺失，以及還包括在用抗原免疫后與野生型小鼠例如不包含缺 失的相同或相似品系的小鼠相比較，增強的體液抗體應(yīng)答。在一個實施方案中，增強的體液 抗體應(yīng)答為野生型小鼠的2倍。在一個實施方案中，增強的體液抗體應(yīng)答為野生型小鼠的 3倍。在一個實施方案中，增強的體液抗體應(yīng)答為野生型小鼠的5倍。在一個實施方案中， 增強的體液抗體應(yīng)答為野生型小鼠的7倍。在一個實施方案中，增強的體液抗體應(yīng)答為野 生型小鼠的10倍。在具體的實施方案中，體液抗體應(yīng)答通過每微克小鼠的血清蛋白特異性 結(jié)合抗原（已用其免疫小鼠的）的抗體的微克數(shù)來測量。在一個實施方案中，增強的體液 抗體應(yīng)答是就野生型小鼠對其展示耐受性的抗原或野生型小鼠對其展示較弱或最小的體 液免疫應(yīng)答的抗原而言的。在具體的實施方案中，抗原是小鼠抗原。在具體的實施方案中， 抗原是展示與小鼠蛋白具有至少約95%、96%、97%、98%或99%的同一性的人抗原。
[0025] 在一個方面，提供了包含低親和力人FcYRa鏈基因?qū)Φ陀H和力小鼠 FcYRa鏈 基因的替代的遺傳修飾的小鼠，其中所述替代在內(nèi)源小鼠 FcYRa鏈基因基因座上。在一 個實施方案中，低親和力小鼠？(3^1^鏈基因選自？(3￥1?118、？(3￥1?1￥和？(3￥1?111〇鏈基 因。在具體的實施方案中，提供了遺傳修飾的小鼠，其中所述小鼠表達(dá)內(nèi)源FcRy鏈，并且 其中低親和力人FcYRa鏈基因為FcYRIIIAa鏈。在另一個具體的實施方案中，遺傳修 飾的小鼠在NK細(xì)胞上表達(dá)內(nèi)源FcRy鏈和功能性人FcYRIIIAa鏈。在具體的實施方案 中，NK細(xì)胞上的FcYRIIIAa鏈的功能性反映在人抗體介導(dǎo)的NK殺傷（例如，由人抗體介 導(dǎo)的ADCC)。
[0026] 在一個方面，提供了遺傳修飾的細(xì)胞、非人胚胎或非人動物，其中所述遺傳修飾包 括人FcYRa鏈基因?qū)χ辽僖粋€內(nèi)源低親和力FcYRa鏈基因的替代，并且所述細(xì)胞、胚胎 或動物表達(dá)功能性FcRy鏈。在一個實施方案中，功能性FcRy鏈為內(nèi)源FcRy鏈。在一 個實施方案中，低親和力人FcYRa鏈基因選自FcYRIIAa鏈基因、FcYRIIIAa鏈基因及 其組合。在具體的實施方案中，人FcyRIIA基因包含多態(tài)性，其中多態(tài)性選自131His低應(yīng) 答者多態(tài)性和131Arg高應(yīng)答者多態(tài)性。在具體的實施方案中，F(xiàn)c γ RIIA多態(tài)性為131His 低應(yīng)答者多態(tài)性。在一個實施方案中，F(xiàn)c γ RIIIA基因為特定等位基因變體，其中等位基因 變體選自158Val變體和158Phe變體。在具體的實施方案中，F(xiàn)cyRIIIA等位基因變體為 158Val 變體。
[0027] 在一個實施方案中，低親和力人Fc YR基因選自Fc yRIIB、Fc yRIIC、Fc YRIIIB 基因及其組合。在具體的實施方案中，人FcyRIIB基因包含氨基酸置換，其中所述置換選 自232Ile或232Thr置換。在另一個具體的實施方案中，氨基酸置換為232Ile置換。在具 體的實施方案中，F(xiàn)cyRIIIB基因為特定等位基因變體，其中所述等位基因變體選自NA1變 體和NA2變體。在另一個具體的實施方案中，F(xiàn)c γ RIIIB等位基因變體為NA2變體。
[0028] 在一個實施方案中，低親和力人FcyRa鏈基因選自FcyRIIA、FcyRIIB、 Fc γ RIIC、Fc γ RIIIA、Fc γ RIIIB α 鏈基因及其組合。
[0029] 在一個實施方案中，低親和力小鼠 FcYRIVa鏈基因和FcYRIIIa鏈基因被至 少一個低親和力人FcYRa鏈基因替代。在一個實施方案中，低親和力小鼠 FcYRIVa鏈 基因和FcYRIIBa鏈基因被至少一個低親和力人FcYRa鏈基因替代。在一個實施方案 中，低親和力小鼠 FcyRIIBa鏈基因和FcyRIIIa鏈基因被至少一個低親和力人FcyRa 鏈基因替代。在具體的實施方案中，至少一個低親和力人FcYRa鏈基因選自FcyRIIA、 FcYRIIB、FcYRIIC、FcYRIIIA、FcYRIIIBa鏈基因及其組合。在另一個具體的實施方案 中，至少一個低親和力人FcyRa鏈基因選自FcyRIIAa鏈基因、FcyRIIIAa鏈基因及 其組合。在另一個具體的實施方案中，至少一個低親和力人Fc γ R a鏈基因選自Fc γ RIIB、 FCYRIIC、FCYRIIIBa鏈基因及其組合。在另一個具體的實施方案中，低親和力小鼠 FcyR基因被人FcYRIIAa鏈基因和人FcYRIIIAa鏈基因替代。在另一個具體的實施方 案中，低親和力人FcyRIIA和FcyRIIIAa鏈基因包含變體，其中FcyRIIAa鏈基因包含 131His變體并且FcYRIIIAa鏈基因包含158Val變體。在另一個具體的實施方案中，低親 和力小鼠 FcyRa鏈基因被下列低親和力人FcyRa鏈基因替代：？〇^1?118、？(3￥1?11(：和 FcyRIIIB。在另一個具體的實施方案中，低親和力人FcyRIIBa鏈基因和FcyRIIIBa 鏈基因包含變體，其中FcyRIIBa鏈基因包含232Ile變體并且FcyRIIIBa鏈基因包含 NA2變體。
[0030] 在一個實施方案中，遺傳修飾包括小鼠和人染色體1的共線（syntenic)基因組 序列的替代。在具體的實施方案中，遺傳修飾包括：包含低親和力人FcyR基因的基因組 片段對包含內(nèi)源低親和力小鼠 FcyR基因的基因組片段的替代。在另一個具體的實施方 案中，來自染色體1:172, 889, 983至染色體1:172,989,911的小鼠基因組被包含人染色體 1:161，474, 729至染色體1:161，620, 458的人基因組片段替代。
[0031] 在一個方面，提供了遺傳修飾的細(xì)胞、非人胚胎或非人動物，其中遺傳修飾包括一 個或多個內(nèi)源低親和力受體a鏈基因的敲除、包含一個或多個人FcYRa鏈基因的附加體 的存在。在具體的實施方案中，所述細(xì)胞、胚胎或動物表達(dá)功能性FcRy鏈。在具體的實施 方案中，附加體為微小染色體。在一個實施方案中，功能性FcRY鏈對于所述細(xì)胞、胚胎或 動物是內(nèi)源的。
[0032] 在一個方面，提供了遺傳修飾的小鼠，包括用低親和力人FcYRa鏈基因替代低 親和力小鼠 Fc γ Ra鏈基因，小鼠包含小鼠 FcRy鏈基因，并且小鼠表達(dá)功能性人低親和 力FcyR受體。在一個實施方案中，功能性低親和力FcyR受體在其中低親和力FcyR受 體在人中表達(dá)的細(xì)胞類型上表達(dá)。在具體的實施方案中，功能性人低親和力Fc γ R受體為 Fc γ RIIIA并且Fc γ RIIIA在NK細(xì)胞上表達(dá)。
[0033] 在一個實施方案中，小鼠包含兩個小鼠 FcyRa鏈基因的缺失。在另一個實施方 案中，小鼠包含3個小鼠 Fc γ R a鏈基因的缺失。
[0034] 在一個實施方案中，小鼠包括用至少1個人FcYRa鏈基因?qū)?個小鼠 FcYRa 鏈基因的替代。在另一個實施方案中，小鼠包括用至少1個FcYRa鏈基因?qū)?個小鼠 FcyRa鏈基因的替代。在具體的實施方案中，小鼠包括用至少2個人FcYRa鏈基因?qū)? 個小鼠 FcYRa鏈基因的替代。在另一個具體的實施方案中，用3個人FcYRa鏈基因替 代3個小鼠 FcYRa鏈基因。在另一個具體的實施方案中，小鼠包括用至少2個人FcYRa 鏈基因?qū)?個小鼠 FcYRa鏈基因的替代。在另一個具體的實施方案中，用至少3個人 FcyRa鏈基因替代2個小鼠 FcyRa鏈基因。
[0035] 在一個實施方案中，低親和力小鼠 FcyRa鏈基因選自FcyRIIB、FcyRIV、 FcyRIIIa鏈基因及其組合。
[0036] 在一個實施方案中，低親和力人FcyRa鏈基因選自FcyRIIA、FcyRIIB、 FCYRIIC、FCYRIIIA、FCYRIIIBa鏈基因及其組合。在一個實施方案中，低親和力人 FcYRa鏈基因選自FCYRIIA、FCYRIIIAa鏈基因及其組合。在一個實施方案中，低親和 力人？(^1?〇鏈基因選自？(^1?118^(^1?11(：、？(^1?1118〇鏈基因及其組合。
[0037] 在一個實施方案中，用至少1個人Fc YRa鏈基因替代低親和力小鼠 FcYRIVa 鏈基因和FcYRIIIa鏈基因。在一個實施方案中，用至少1個人FcYRa鏈基因替代低 親和力小鼠 FcYRIVa鏈基因和FcYRIIBa鏈基因。在一個實施方案中，用至少1個人 FcyRa鏈基因替代低親和力小鼠 FcyRIIBa鏈基因和FcyRIIIBa鏈基因。在具體的 實施方案中，至少1個人Fc YRa鏈基因選自Fc yRIIA、Fc yRIIB、Fc yRIIC、Fc YRIIIA、 FcYRIIIBa鏈基因及其組合。在另一個具體的實施方案中，至少1個人FcYRa鏈基因 選自？〇^1?1從、？(3￥1?11從 〇鏈基因及其組合。在另一個具體的實施方案中，至少1個人 卩(^1^鏈基因選自？(^1?118、？(^1?11(：、？(^1?1118〇鏈基因及其組合。在另一個具體的 實施方案中，用下列人FcYRa鏈基因：FcyRIIA和FcyRIIIA替代小鼠 a鏈基因。在另 一個具體的實施方案中，用下列人FcyRa鏈基因：？(^1?118、？(^1?11(：和？(^1?1118替代 小鼠 a鏈基因。
[0038] 在一個方面，提供了包含低親和力人FcYRa鏈和小鼠 FcRy鏈亞基的遺傳修飾 的小鼠，其中所述小鼠在選自嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬 細(xì)胞、血小板、朗格漢斯細(xì)胞、樹突細(xì)胞、NK細(xì)胞、肥大細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞及其組合的細(xì)胞 上表達(dá)人FcYRa鏈。在一個實施方案中，小鼠在選自嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒 細(xì)胞、血小板、樹突細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞及其組合的細(xì)胞上表達(dá)人FcyRIIA a鏈。在一個 實施方案中，小鼠能夠進(jìn)行通過表達(dá)的人Fc γ RIIA a鏈起始或介導(dǎo)的吞噬作用、ADCC和 細(xì)胞活化。在一個實施方案中，小鼠表達(dá)在選自巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、 嗜酸性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、至少一種T細(xì)胞類型及其組合的細(xì)胞上表達(dá)人 Fc γ RIIIA a鏈。在一個實施方案中，小鼠能夠進(jìn)行通過在NK細(xì)胞上表達(dá)的人Fc γ RIIIA a 鏈介導(dǎo)的ADCC。在具體的實施方案中，小鼠展示響應(yīng)于包含人Fc的抗體的hFc YRIIIA-介 導(dǎo)的ADCC。
[0039] 在一個實施方案中，小鼠表達(dá)人FcyRIIAa鏈和人FcyRIIIAa鏈。在一個實 施方案中，人FcyRIIAa鏈在血小板上表達(dá)并且人FcyRIIIAa鏈在NK細(xì)胞上表達(dá)。在 一個實施方案中，小鼠能夠進(jìn)行由包含人Fc的抗體介導(dǎo)的ADCC，其中所述介導(dǎo)通過在輔助 細(xì)胞表面上表達(dá)的人FcYRIIAa鏈或人FcYRIIIAa鏈來進(jìn)行。在一個實施方案中，人 FcyRIIAa鏈不在血小板上表達(dá)。在其中人FcyRIIAa鏈不在血小板上表達(dá)的具體實施 方案中，小鼠缺失或?qū)嵸|(zhì)上缺失可操作地連接于人基因組中的人FcYRIIAa鏈的人啟動 子序列。
[0040] 在一個實施方案中，小鼠在選自B細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸 性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞及其組合的細(xì)胞上表達(dá)人Fc γ RIIB a 鏈。在具體的實施方案中，小鼠在B細(xì)胞和肥大細(xì)胞上表達(dá)人FcYRIIBa鏈。在另一個具 體的實施方案中，小鼠能夠進(jìn)行通過表達(dá)的人Fc γ RIIB a鏈介導(dǎo)的免疫復(fù)合物的吞噬作 用。在一個實施方案中，小鼠在選自嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、血小板、樹突 細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞及其組合的細(xì)胞上表達(dá)人FcyRIIC a鏈。在具體的實施方案中，小鼠 能夠進(jìn)行通過表達(dá)的人Fc γ RIIC a鏈啟始的吞噬作用、ADCC和細(xì)胞活化。
[0041] 在一個實施方案中，小鼠在嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞上表達(dá)人FcyRIIIB a 鏈。在具體的實施方案中，小鼠能夠進(jìn)行細(xì)胞活化、吞噬作用、ADCC和脫粒，其中活化、吞噬 作用、ADCC和脫粒通過表達(dá)的人Fc γ RIIIB a鏈介導(dǎo)。
[0042] 在一個方面，提供了包含內(nèi)源FcyRIIB、FcyRIV和FcyRIII基因的缺失和人 Fc γ RIIA、Fc γ RIIB、Fc γ RIIC、Fc γ RIIIA和Fc γ RIIIB基因的插入的小鼠，其中所述小鼠 包含功能性小鼠 FcR γ鏈基因。
[0043] 在一個實施方案中，小鼠包含由內(nèi)源Fc γ RIIB、Fc γ RIV和Fc γ RIII基因編碼的 a 鏈的缺失和由人 Fc γ RIIA、Fc γ RIIB、Fc γ RIIC、Fc γ RIIIA 和 Fc γ RIIIB 基因編碼的 a 鏈的插入。
[0044] 在一個實施方案中，人 Fc YRIIA、Fc YRIIB、Fc YRIIC、Fc YRIIIA 和 Fc YRIIIBa 鏈基因的插入位于小鼠基因組的隨機(jī)位置。
[0045] 在一個實施方案中，人 Fc YRIIA、Fc YRIIB、Fc YRIIC、Fc YRIIIA 和 Fc YRIIIBa 鏈基因的插入位于內(nèi)源小鼠低親和力Fc Y Ra鏈基因座。
[0046] 在一個實施方案中，小鼠在NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上表達(dá)人FcyRIIIA。在具體的實 施方案中，來自小鼠的脾細(xì)胞樣品的所有或大體上所有NK細(xì)胞表達(dá)人Fc γ RIIIA。在具體 的實施方案中，來自小鼠的脾細(xì)胞樣品的所有或大體上所有巨噬細(xì)胞表達(dá)人Fc γ RIIIA。
[0047] 在一個實施方案中，小鼠在選自嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及其組合的細(xì)胞類型上 表達(dá)選自人Fc γ RIIA、人Fc γ RIIIA及其組合的人Fc γ R。在具體的實施方案中，小鼠在 小鼠的脾細(xì)胞樣品的全部或大體上全部嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上表達(dá)人Fc γ RIIA和人 Fc yRIIIAo
[0048] 在一個實施方案中，小鼠在來自小鼠的B細(xì)胞門控的脾細(xì)胞樣品的B細(xì)胞和B 細(xì)胞的嗜中性粒細(xì)胞上表達(dá)人Fc γ RIIB和人Fc γ RIIIB。在具體的實施方案中，小鼠在 來自小鼠的B細(xì)胞門控的脾細(xì)胞樣品的全部或大體上全部B細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞上表達(dá) 卩(^尺1118和卩(^1?118。
[0049] 在一個實施方案中，小鼠還包含人源化⑶20基因。在一個實施方案中，還包含人 源化CD20基因的小鼠在用包含F(xiàn)c的抗-CD20結(jié)合蛋白處理后展示B細(xì)胞的（體內(nèi)）耗盡。 在一個實施方案中，所述耗盡存在于選自骨髓、血液、淋巴結(jié)、脾及其組合的區(qū)室中。在一個 實施方案中，F(xiàn)c為人Fc。在一個實施方案中，F(xiàn)c為小鼠 Fc。在一個實施方案中，抗-CD20 結(jié)合蛋白為抗-CD20抗體。
[0050] 在一個方面，提供了包含本文中描述的遺傳修飾的細(xì)胞。在一個實施方案中，所述 細(xì)胞選自胚胎干細(xì)胞（ES)、多能細(xì)胞、誘導(dǎo)的多能細(xì)胞和全能細(xì)胞。在一個實施方案中，細(xì) 胞選自小鼠細(xì)胞和大鼠細(xì)胞。在具體的實施方案中，細(xì)胞為ES細(xì)胞。在更具體的實施方案 中，細(xì)胞為小鼠 ES細(xì)胞。
[0051] 在一個方面，提供了包含本文中描述的遺傳修飾的非人胚胎。在一個實施方案中， 非人胚胎選自小鼠胚胎和大鼠胚胎。
[0052] 在一個方面，提供了測定治療劑的功效的方法。在一個實施方案中，治療劑為包含 人Fc的抗體（例如，單、雙、三、多特異性的）。在一個實施方案中，治療劑為人抗體。在一 個實施方案中，功效為治療劑介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷（例如，ADCC)的功效。在具體的實施方案中， 人治療劑是包含人免疫球蛋白重鏈的Fc的融合蛋白。在一個實施方案中，給本文中描述的 小鼠施用治療劑并且測量治療劑依賴性ADCC的水平。在一個實施方案中，通過給小鼠施用 治療劑，隨后檢測（例如，從獲自動物的樣品（例如，血液）進(jìn)行體外檢測）治療劑對表達(dá) Fc γ R的細(xì)胞上的人低親和力Fc γ R的結(jié)合來將小鼠用于評估治療劑的ADCC活性。在具體 的實施方案中，從小鼠分離小鼠的輔助細(xì)胞，并且測試其在治療劑存在和不存在的情況下 介導(dǎo)治療劑依賴性ADCC的能力。
[0053] 在一個方面，提供了用于確定低親和力FcyR是否與人疾病或障礙相關(guān)的方法， 包括測定根據(jù)本發(fā)明的小鼠的與人疾病或障礙相關(guān)的性狀的步驟。在一個實施方案中，所 述性狀為與一個或多個低親和力Fc γ R的功能的不存在或喪失相關(guān)的表型。在具體的實施 方案中，疾病或障礙為自身免疫疾病或障礙。在具體的實施方案中，自身免疫疾病或障礙選 自類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)、I型糖尿病、Guillain-Barr6綜合征、硬化 癥、多發(fā)性硬化、Goodpasture' s綜合征、Wegener' s肉芽腫病和實驗性自身免疫腦脊髓炎 (EAE)。在具體的實施方案中，小鼠包含低親和力Fc γ R中的多態(tài)性，并且性狀選自與大部 分不具有多態(tài)性的人群相比較增強的介導(dǎo)ADCC的能力以及與大部分不具有多態(tài)性的人群 相比較減小的介導(dǎo)ADCC的能力。
[0054] 在一個方面，提供了用于在小鼠中產(chǎn)生抗-人FcRa鏈抗體的方法，包括將根據(jù)本 發(fā)明的小鼠與本文中描述的人FcR接觸。在一個實施方案中，識別人的FcR的抗體分離自 小鼠。在另一個實施方案中，鑒定和克隆了編碼識別人FcR的抗體的全部或部分可變區(qū)的 核酸序列。
[0055] 在一個方面，提供了用于測定抗-人FcR抗體將分子靶向表達(dá)FcR的細(xì)胞以吞噬 靶分子的能力的方法，包括將本文中描述的小鼠與包含抗-人FcR抗體的試劑接觸，并且測 量革G分子的吞噬。
[0056] 在一個方面，提供了用于在小鼠中產(chǎn)生針對抗原的抗體的方法，所述抗原在對于 一種或多種Fc Y R為野生型的小鼠中具有差的免疫原性，所述方法包括將本文中描述的缺 失小鼠低親和力FcR但表達(dá)Fc γ R γ鏈的小鼠與在對于一種或多種Fc γ R為野生型的小鼠 中具有差免疫原性的抗原接觸，并鑒定識別所述差抗原性的抗原的抗體。在一個實施方案 中，所述方法包括從小鼠分離抗體。在另一個實施方案中，鑒定和克隆了編碼抗體的全部或 部分可變區(qū)的核酸序列。
[0057] 在一個方面，提供了用于產(chǎn)生能夠產(chǎn)生包含人可變區(qū)的抗體的小鼠的方法，包括 將本文中描述的第一小鼠與第二小鼠交配的步驟，所述第二小鼠包含（a) -個或多個人免 疫球蛋白可變區(qū)基因區(qū)段和一個或多個人恒定區(qū)基因；或（b)可操作地連接于小鼠恒定區(qū) 基因的一個或多個人免疫球蛋白可變區(qū)基因區(qū)段，其中所述人基因區(qū)段在小鼠可變區(qū)基因 區(qū)段的基因座上替代可變區(qū)基因區(qū)段。
[0058] 在一個實施方案中，第二小鼠（a)包含含有一個或多個人免疫球蛋白輕鏈可變區(qū) 基因區(qū)段和人輕鏈恒定基因的轉(zhuǎn)基因和含有一個或多個人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因區(qū) 段和一個或多個人重鏈恒定基因的轉(zhuǎn)基因。在一個實施方案中，包含一個或多個人免疫球 蛋白重鏈可變區(qū)基因區(qū)段的轉(zhuǎn)基因包兩個或更多個重鏈恒定基因并且能夠進(jìn)行類別轉(zhuǎn)換 (class switching)。在具體的實施方案中，小鼠包含失活的內(nèi)源輕鏈基因座和/或失活的 內(nèi)源重鏈基因座。在具體的實施方案中，小鼠包含內(nèi)源輕鏈基因座的缺失和/或內(nèi)源重鏈 基因座的缺失。
[0059] 在一個實施方案中，第二小鼠（b)分別在小鼠重鏈和輕鏈基因座上包含人重鏈和 人輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段。
[0060] 在一個方面，提供了用于選擇抗腫瘤抗體的方法，包括測定抗體介導(dǎo)ADCC的能力 的步驟，其中通過測定由本文中描述的小鼠的細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC來測試抗體介導(dǎo)ADCC的能 力，如果抗體利用本文中描述的遺傳修飾的小鼠的細(xì)胞介導(dǎo)ADCC，則選擇該抗體。在具體 的實施方案中，測定抗體對遺傳修飾的小鼠的細(xì)胞的結(jié)合，并且就其結(jié)合細(xì)胞上的人Fc γ R 的能力選擇抗腫瘤抗體。在具體的實施方案中，人FcyR為低親和力FcyR。
[0061] 在一個實施方案中，抗腫瘤抗體通過與抗腫瘤抗體通過野生型小鼠的細(xì)胞介導(dǎo) ADCC的能力相比較的增強的通過小鼠的細(xì)胞介導(dǎo)ADCC的能力來進(jìn)行鑒定。在具體的實施 方案中，抗腫瘤抗體通過其通過NK細(xì)胞介導(dǎo)ADCC的能力來進(jìn)行鑒定。在具體的實施方案 中，所述NK細(xì)胞表達(dá)人Fc γ RIIIA。
[0062] 在一個實施方案中，提供了用于選擇抗腫瘤試劑的方法，包括給第一非人動物施 用包含人Fc或修飾的人Fc的試劑的步驟，其中第一非人動物按照本發(fā)明進(jìn)行了遺傳修飾 并且包含人腫瘤；給包含腫瘤的第二非人動物施用試劑的步驟；和測定第一非人動物和第 二非人動物在施用試劑后延緩人腫瘤生長的能力，其中如果試劑在第一非人動物中但非在 第二非人動物中展示增強的延緩人腫瘤生長的能力，則其被選擇為抗腫瘤試劑。
[0063] 在一個實施方案中，第一非人動物經(jīng)修飾包含內(nèi)源FcRa -亞基的缺失，并且經(jīng)修 飾包含選自 Fc γ RIIA a -亞基、Fc γ RIIB a -亞基、Fc γ RIIC a -亞基、Fc γ RIIIA a -亞基、 Fc γ RIIIB a -亞基及其組合的人FcR a -亞基。在一個實施方案中，第二動物為野生型動 物。在一個實施方案中，第一非人動物表達(dá)內(nèi)源FcRy鏈。
[0064] 在一個實施方案中，第一非人動物表達(dá)功能性內(nèi)源Fc YRI。
[0065] 在一個方面，提供了用于產(chǎn)生小鼠的方法，所述小鼠缺失低親和力小鼠 FcyR，表 達(dá)功能性 FcR γ 鏈并且包含編碼人Fc γ RIIA、Fc γ RIIB、Fc γ RIIC、Fc γ RIIIA和 Fc γ RIIIB 的a鏈的基因，包括用人FcYRa鏈在小鼠 FcYRa鏈基因座上替代低親和力小鼠 FcyRa鏈的步驟。
[0066] 在一個實施方案中，第一步驟包括缺失內(nèi)源FcyRIIB、FcyRIV和FcyRIII基 因的a鏈和插入人FcyRIIA和FcyRIIIA基因的a鏈；第二步驟包括將人FcyRIIB、 FcyRIIC和FcyRIIIB基因的a鏈插入由第一步驟產(chǎn)生的小鼠的基因組；其中所述小鼠 包含功能性小鼠 FcRy鏈基因.在具體的實施方案中，第二步驟的人FCyRIIB、FcyRIIC 和FcyRIIIB基因的a鏈插入在相對于第一步驟的人FcyRIIA和FcyRIIIA基因的a 鏈的5'。
[0067] 在一個方面，提供了用于測定人治療劑在非靈長類動物中的細(xì)胞殺傷的方法，包 括將細(xì)胞、非人胚胎或非人動物與包含人Fc的人治療劑接觸的步驟，其中所述細(xì)胞、胚胎 或動物包含功能性FcRy鏈并包含一個或多個人FcYRa鏈對一個或多個內(nèi)源低親和力 Fc Y R α鏈基因的替代，以及測定人治療劑通過細(xì)胞、胚胎或動物的低親和力人Fc γ R介導(dǎo) 細(xì)胞殺傷的能力。
[0068] 在一個實施方案中，非靈長類動物為小鼠。在具體的實施方案中，內(nèi)源小鼠 Fc γ R α 鏈基因 Fc γ RIIB、Fc γ RIV 和 Fc γ RIII 被人 Fc γ R α 鏈基因 Fc γ RIIA、Fc γ RIIB、 Fc γ RIIC、Fc γ RIIIA 和 Fc γ RIIIB 替代。
[0069] 在一個實施方案中，細(xì)胞選自B細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性 粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞及其組合。在具體的實施方案中，細(xì)胞為NK 細(xì)胞并且測定通過人或人源化抗體產(chǎn)生的NK細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC。在具體的實施方案中，低親 和力人Fc γ R為人Fc γ RIIIA。
[0070] 在一個方面，提供了用于測定治療劑依賴性血栓形成的方法，包括將在血小板上 表達(dá)人Fc γ RIIA的第一非人動物與治療劑接觸；將不在血小板上表達(dá)人Fc γ RIIA的第二 非人動物與所述治療劑接觸；在第一非人動物和第二非人動物中測量治療劑依賴性血栓形 成的量；和測定治療劑依賴性血栓形成的差異。
[0071] 在一個實施方案中，非人動物選自小鼠和大鼠。
[0072] 在一個實施方案中，將治療劑依賴性血栓形成的測定的差異用于鑒定與向人施用 該治療劑相關(guān)的風(fēng)險。在一個實施方案中，測定的差異導(dǎo)致治療劑給有此需要的人患者的 施用的改變。
[0073] 發(fā)明詳述
[0074] 本發(fā)明不限于描述的特定方法和實驗條件，因為這樣方法和條件可改變。本文中 使用的術(shù)語僅為了描述特定的實施方案，無意起限制作用，因為本發(fā)明的范圍將僅由權(quán)利 要求限定。
[0075] 除非另外定義，否則本文中使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi) 的技術(shù)人員通常理解的相同的含義。雖然與本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方 法和材料可用于實施或測試本發(fā)明，但現(xiàn)在描述特定的方法和材料。本文中提及的所有出 版物通過引用方式全文并入本文。
[0076] 短語"靶向構(gòu)建體"包括含有靶向區(qū)域的多核苷酸分子。靶向區(qū)域包含與靶細(xì)胞、 組織或動物中的序列實質(zhì)上同源的序列并且提供了靶向構(gòu)建體至細(xì)胞、組織或動物的基因 組內(nèi)的位置的整合。在具體的實施方案中，靶向構(gòu)建體還包括特定目標(biāo)核酸序列或基因、 選擇標(biāo)記、控制和/或調(diào)節(jié)序列以及允許通過蛋白質(zhì)的外源添加介導(dǎo)的重組的其它核酸序 列，所述蛋白質(zhì)幫助或促進(jìn)牽涉這類序列的重組。在另一個具體的實施方案中，靶向構(gòu)建體 還包含目標(biāo)基因，其中所述目標(biāo)基因為編碼與由內(nèi)源序列編碼的蛋白質(zhì)具有相似功能的蛋 白質(zhì)的異源基因。
[0077] 除非另外明確地指出，否則術(shù)語"替代"包括其中將DNA序列以這樣的方式置于細(xì) 胞的基因組內(nèi)：用異源序列（例如，小鼠中的人序列）在基因組序列的基因座上替代基因組 中的序列。這樣放置的DNA序列可包括作為用于獲得這樣放置的序列的源DNA的一部分的 一個或多個調(diào)控序列（例如，啟動子、增強子、5'_或3'-非翻譯區(qū)等）。例如，在不同的實 施方案中，替代是異源序列對內(nèi)源序列的置換，該置換導(dǎo)致基因產(chǎn)物從這樣放置的DNA序 列（包括異源序列）產(chǎn)生，但不表達(dá)內(nèi)源序列；替代是用DNA序列置換內(nèi)源基因組序列，所 述DNA序列編碼具有與內(nèi)源基因組序列編碼的蛋白質(zhì)相似的功能的蛋白質(zhì)（例如，內(nèi)源基 因組序列編碼低親和力小鼠 Fc γ R受體，DNA片段編碼一種或多種人低親和力Fc γ R受體， 例如 Fc γ RIIC 和 / 或 Fc γ RIIIB)。
[0078] 術(shù)語"FcyR"包括Fc、例如IgG免疫球蛋白的Fc部分的受體。FcyR基因包括 α鏈，所述α鏈在細(xì)胞表面上表達(dá)并且用作配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并與FcRY鏈的同二聚體或 FcRY鏈與δ鏈的異二聚體結(jié)合。存在幾種不同的FcyR基因并且可根據(jù)在免疫復(fù)合物 中與IgG的優(yōu)先結(jié)合將它們分成低親和力和高親和力類型。人的低親和力Fc γ R基因包括 Fc γ RIIA、Fc γ RIIB、Fc γ RIIC、Fc γ RIIIA和Fc γ RIIIB，并且已在患有自身免疫疾病的人 受試者中描述了在大多數(shù)此類基因內(nèi)天然存在的遺傳差異或多態(tài)性。在閱讀本公開內(nèi)容后 本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到基因組中的一個或多個內(nèi)源低親和力FcyR基因（或全部）可被 一個或多個異源低親和力Fc γ R基因（例如，變體或多態(tài)性例如等位基因形式、來自另一物 種的基因、嵌合形式等）替代。
[0079] 術(shù)語"等位基因變體"包括基因的正常序列的變異，其導(dǎo)致同一基因的一系列不同 形式。所述不同形式可在來自基因的蛋白質(zhì)序列中包含至多20個氨基酸的差異。例如，等 位基因可被理解為相同物理基因基因座上的可選擇的DNA序列，其可以導(dǎo)致或可以不導(dǎo)致 不同的性狀（例如，可遺傳的表型特征）、例如對某些疾病或病況的易感性，其不導(dǎo)致相同 基因的其它等位基因或在不同程度上導(dǎo)致其它等位基因。
[0080] "輔助細(xì)胞"包括參與免疫應(yīng)答的效應(yīng)子功能的免疫細(xì)胞。示例性免疫細(xì)胞包括淋 巴樣或骨髓樣來源的細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞、天然殺傷（NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性 粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、血小板、郎格漢斯細(xì)胞、樹突細(xì)胞、肥大細(xì)胞等。輔助 細(xì)胞通過在它們的表面上表達(dá)的受體例如FcR進(jìn)行免疫系統(tǒng)的特定功能。在具體的實施方 案中，輔助細(xì)胞能夠觸發(fā)通過在細(xì)胞表面上表達(dá)的FcR例如低親和力Fc γ R介導(dǎo)的ADCC。 例如，表達(dá)FcR的巨噬細(xì)胞參與吞噬作用和破壞抗體包被的細(xì)菌。輔助細(xì)胞還可能能夠釋 放介導(dǎo)其它免疫過程的試劑。例如，肥大細(xì)胞可被結(jié)合至FcR的抗體激活以在感染的部位 釋放顆粒例如炎癥分子（例如，細(xì)胞因子）。在不同的其它實施方案中，F(xiàn)cR在輔助細(xì)胞上 的表達(dá)可受其它因子（例如，細(xì)胞因子）調(diào)節(jié)。例如，F(xiàn)cyRI和FcyRIII表達(dá)可通過利用 干擾素 -Y (IFN- γ )的刺激誘導(dǎo)。
[0081] 小鼠和人FcR
[0082] 免疫球蛋白的Fc區(qū)（S卩，恒定區(qū)）的受體（FcR)在免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中起著重要作 用。FcR存在于宿主免疫系統(tǒng)的輔助細(xì)胞上以有效地除去被抗體結(jié)合的外源抗原。FcR也在 平衡免疫系統(tǒng)的輔助細(xì)胞的激活和抑制應(yīng)答中起著重要作用。FcR參與巨噬細(xì)胞的吞噬作 用、肥大細(xì)胞的脫粒、抗體-抗原復(fù)合物的攝取和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)以及其它免疫系統(tǒng)過程。
[0083] 在小鼠和人中，不同的FcR在不同輔助細(xì)胞的表面上差異性表達(dá)，所述輔助細(xì) 胞各自對于存在于表達(dá)的抗體庫中的免疫球蛋白同種型是特異性的。例如，免疫球蛋白 G(IgG)抗體通過IgG受體（Fc γ R)介導(dǎo)效應(yīng)子功能。Fc γ R已被分成3類：高親和力激活性 Fc γ RI (CD64)、低親和力抑制性Fc γ RII (CD32)和低親和力激活性Fc γ RIII (CD16)。雖然 每一類都存在于小鼠和人中，但它們所存在于的免疫細(xì)胞的同種型和亞組的數(shù)目不同。例 如，F(xiàn)cyRIIA和FcyRIIIB在人的輔助細(xì)胞上表達(dá)但據(jù)報道不存在于小鼠中。此外，不同 IgG同種型（例如，IgGl)對每一種FcyR的親和力在人和小鼠中不同。
[0084] 通過Fc γ R的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活或抑制和與抗體對Fc γ R的結(jié)合相關(guān)的效應(yīng) 子功能據(jù)認(rèn)為由FcyR的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的特定序列基序或共受體（co-receptor)的亞基 的特定序列基序介導(dǎo)。激活受體最常見地與包含免疫受體基于酪氨酸活化基序（ITAM)的 常見Y鏈（FcRy鏈）相關(guān)。ITAM包含約9-12個氨基酸的特定序列，該序列包括響應(yīng) 于抗體對FcR的結(jié)合而被磷酸化的酪氨酸殘基。磷酸化導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)。已報道了缺 失編碼FcRy鏈的基因的小鼠（FcRy鏈K0)(例如，參見Takai等人（1994)FcRychain Depletion Results in Pleiotrophic Effector Cell Defects, Cell 76:519-529; van Vugt 等人（1996) FcR γ-chain Is Essential for Both Surface Expression and Function of Human FcyRI(CD64) In Vivo, Blood 87(9):3593-3599 ;和 Park 等人（1998) Resistance of Fc Receptor-deficient Mice to Fatal Glomerulonephritis, J. Clin. Invest. 102 (6) :1229-1238)。FcR γ鏈據(jù)報道為大多數(shù)FcR的正確表面表達(dá)和功能（例 如，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、吞噬作用等）所必需的；根據(jù)一些報道FcRy鏈K0小鼠缺失FcyRI。然 而，其它報道顯示FcR γ鏈K0小鼠確實在某些輔助細(xì)胞的表面上表達(dá)Fc γ RI，并且表達(dá) 的FcyRI據(jù)報道顯示具有功能，功能在于其在表達(dá)的FcRy鏈不存在的情況下在小鼠中 結(jié)合 IgG (Barnes 等人（2002) FcyRI-Deficient Mice Show Multiple Alterations to Inflammatory and Immune Responses, Immunity 16:379-389)。
[0085] 相反地，F(xiàn)c γ RIIB是在其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制性基序 (Ι--Μ)的抑制性受體。與ITAM-樣，ITIM是包含可磷酸化的酪氨酸殘基的序列基序。然 而，在ITM的磷酸化后的下游事件導(dǎo)致免疫細(xì)胞功能的抑制而非激活。Fc γ RIIB缺陷型小 鼠據(jù)報道展示與野生型小鼠相比較增強的抗體應(yīng)答（Takai等人（1996) Augmented humoral and anaphylactic responses in FcgRII-deficient mice, Nature 379:346-349),此為支 持Fc γ RIIB作為B細(xì)胞抗體應(yīng)答的下游調(diào)節(jié)劑的觀察。
[0086] 在人中，F(xiàn)cyRIIA、FcyRIIB、FcyRIIC、FcyRIIIA 和 FcyRIIIB 被認(rèn)為是經(jīng)典 低親和力FcyR基因并且一起位于相同染色體上（Su等人（2002) Genomic organization of classical human low-affinity Fc y receptor genes, Genes and Immunity 3 (Supple 1) :S51-S56)。這些基因展示出幾個與獨特表型例如受體的配體結(jié)合和功能的改變相關(guān)的 多態(tài)性。一些多態(tài)性與自身免疫疾病例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA)和多 發(fā)性硬化（MS)相關(guān)。針對不同的人FcYR(hFcYR)的轉(zhuǎn)基因小鼠已被開發(fā)并且用作疾病模 型、產(chǎn)生高親和力抗體、測試治療性抗體引發(fā)特異性細(xì)胞應(yīng)答的能力、篩選緩解異常免疫應(yīng) 答的化合物（例如，參見 Heijnen 等人（1996)A Human FcgRI/CD64Transgenic Model for In Vivo Analysis of(Bispecific)Antibody Therapeutics, J. Hematother. 4:351-356 ； Heijnen 和 van de ffinkel(1996)Antigen Targeting to Myeloid-specific Human FcgRI/CD64 Triggers Enhanced antibody Responses in Transgenic,J. Clin. Invest. 97 (2) : 331-338 ;美國專利 No. 6, 111, 166、6, 676, 927、7, 351，875、7, 402, 728 和 7, 416, 726)。
[0087] 盡管FcR在提供免疫系統(tǒng)的抗體與輔助細(xì)胞之間的橋梁中起著重要作用，但目前 仍然不存在其中所有低親和力hFc γ R都表達(dá)的模型系統(tǒng)。其中所有低親和力hFc γ R共表 達(dá)的小鼠（包括缺失內(nèi)源小鼠 FcyR的小鼠）在不同的實施方案中可用于精確地反映人 抗體治療劑的效應(yīng)，包括ADCC介導(dǎo)的效應(yīng)。這樣的小鼠可在用于治療人疾病例如RA、I型 糖尿病、SLE和自身免疫性的治療性抗體的工程改造、分析和評估中用作至關(guān)重的工具：提 供能夠?qū)崿F(xiàn)人的免疫過程的更精確評估（特別地在測試人抗體治療劑的情景中）的動物模 型。小鼠還可以是具有低親和力受體的細(xì)胞的有價值的來源，所述細(xì)胞可在體外測定中用 于評估結(jié)合低親和力受體的治療劑的治療劑依賴性細(xì)胞殺傷，并因此而被用于鑒定有用的 人治療劑。
[0088] 內(nèi)源低親和力Fc γ R基因缺陷型小鼠
[0089] 提供了不表達(dá)內(nèi)源低親和力小鼠 FcyR基因但表達(dá)內(nèi)源小鼠 FcRY鏈的遺傳修 飾的非人動物。在不同的實施方案中，F(xiàn)cRy鏈以與野生型小鼠中相同或大體上相同的分 布（即，在細(xì)胞類型中）和水平在小鼠中表達(dá)。內(nèi)源低親和力FcyR基因可在免疫細(xì)胞的 表面上表達(dá)或在動物的周圍組織中以可溶性方式表達(dá)。用于產(chǎn)生不表達(dá)內(nèi)源低親和力小鼠 FcyR基因的非人動物的遺傳修飾通過使用小鼠為例子來方便地說明。可以以多種方式，特 別是實施方案已在本文中進(jìn)行了描述的方式產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的小鼠。
[0090] 圖1中（頂部）提供了顯示FCYR基因在內(nèi)源基因座中的排列的低親和力小鼠 Fc γ R基因基因座的示意圖（未按比例的）。如圖所示，低親和力小鼠 Fc γ R基因 Fc γ RIIB、 Fc γ RIV和Fc γ RIII -起緊密地存在于一條染色體上。這些基因中的每一個基因包含負(fù)責(zé) 結(jié)合抗體分子的Fc部分的α鏈或配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0091] 缺失編碼內(nèi)源低親和力FCYR基因的α鏈的核苷酸序列的遺傳修飾的小鼠可通 過本領(lǐng)域已知的任何方法來產(chǎn)生。例如，可制備缺失低親和力小鼠 FcYRa鏈基因的具有 選擇標(biāo)記基因的靶向載體。圖1舉例說明了被靶向構(gòu)建體靶向的小鼠基因組（底部），所述 構(gòu)建體具有包含內(nèi)源低親和力Fc γ Ra鏈基因座的上游序列的5'同源臂，后接藥物選擇盒 (例如，側(cè)翼連接有l(wèi)oxP序列的新霉素抗性基因）和包含內(nèi)源低親和力FcYRa鏈基因座 的下游序列的3'同源臂。于基因座上同源重組后，內(nèi)源低親和力FcYRa鏈基因座被藥物 選擇盒替代（圖1的底部）。內(nèi)源低親和力Fc γ R a鏈基因基因座因此被缺失，從而產(chǎn)生不 表達(dá)內(nèi)源低親和力小鼠 FcYRa鏈基因的細(xì)胞或非人動物?？勺鬟x地通過隨后添加重組酶 (例如，通過Cre處理）除去藥物選擇盒。
[0092] 在不同實施方案中，遺傳修飾小鼠以使內(nèi)源低親和力小鼠 FcYRa鏈基因失去功 能，產(chǎn)生展示免疫應(yīng)答的缺陷的小鼠，從而使得小鼠對于評估內(nèi)源低親和力小鼠 FcyR基 因在正常和紊亂的免疫功能、IgG-介導(dǎo)的過程以及自身免疫疾病中的協(xié)同以及單獨的作用 是有用的。在不同的實施方案中，修飾內(nèi)源低親和力小鼠 FcyR基因的a鏈但非FcRy鏈， 避免了需要FcRy鏈以進(jìn)行表面表達(dá)和功能的其它內(nèi)源FcR基因（例如，高親和力FcyRI) 的潛在減少，從而維持通過Y鏈依賴性過程介導(dǎo)的各種其它免疫功能和過程。
[0093] 根據(jù)一些方面，F(xiàn)cRy鏈缺陷型小鼠缺失FcyRIII和FcyRI的表面表達(dá)。然而， 已報道在FcR γ鏈缺陷型小鼠的細(xì)胞表面上檢測到Fc γ RI，所述Fc γ RI據(jù)報道具有至少部 分功能。相反地，根據(jù)本發(fā)明的小鼠包含未修飾的內(nèi)源FcRy鏈，其保持天然細(xì)胞表面表達(dá) 模式和需要FcRy鏈的其它FcR基因的細(xì)胞功能。
[0094] 在不同的實施方案，本發(fā)明的小鼠顯示了優(yōu)于其它FcyR基因-缺陷小鼠的有利 方面，所述有利方面在于它們所具有的遺傳修飾導(dǎo)致不完全貢獻(xiàn)于低親和力Fc γ R基因的 其它免疫功能所必需的其它基因的維持。例如，通過功能性FcRy鏈，其它γ鏈依賴性蛋 白（例如，F(xiàn)cyRI)將能夠與FcRy鏈結(jié)合并且在免疫應(yīng)答中參與效應(yīng)細(xì)胞功能。在根據(jù)本 發(fā)明的各種遺傳修飾的小鼠中，據(jù)認(rèn)為維持此類功能（歸因于功能性FcRy鏈的存在）同 時缺失內(nèi)源低親和力FcyR基因（一個或多個α-亞基）使得能夠更精確地闡明FcR在自 身免疫中的作用。
[0095] 低產(chǎn)和力Fc γ R人源化小鼠
[0096] 提供了表達(dá)低親和力人FcyR基因的遺傳修飾的非人動物。低親和力人FcyR基 因可在動物免疫系統(tǒng)的輔助細(xì)胞的表面上表達(dá)或在動物的周圍組織中以可溶性方式表達(dá)。
[0097] 在不同的實施方案中，遺傳修飾包含一個或多個低親和力小鼠 Fc Y R基因的功能 性α鏈的缺失，并且在一些實施方案中包含含有以兩個或更多個、三個或更多個、四個或 更多個或五個低親和力人Fc Y R α亞基基因的替代的其它修飾，其中非人動物表達(dá)功能性 小鼠 FcRY鏈基因。還提供了遺傳修飾的非人胚胎、細(xì)胞和用于產(chǎn)生非人動物、非人胚胎和 細(xì)胞的靶向構(gòu)建體。
[0098] 提供了用于制備表達(dá)人FcyR基因（包括特定多態(tài)性形式或等位基因變體（例 如，單個氨基酸的差異））的小鼠的組合物和方法，包括用于制備從人啟動子和人調(diào)控序 列表達(dá)此類基因的的小鼠的組合物和方法。所述方法包括選擇性地使內(nèi)源低親和力小鼠 FcyR基因失去功能（例如，通過其α鏈的缺失）以及在內(nèi)源低親和力小鼠 FcyR基因的 基因座上利用低親和力人FcyR基因的α鏈在小鼠中表達(dá)低親和力人FcYRa-亞基基 因。通過缺失一個或多個a鏈基因但非FcRy鏈基因來產(chǎn)生低親和力小鼠 FcyR基因的 缺失。所述方法選擇性地使一個或多個內(nèi)源低親和力FcYRa鏈基因失去功能而同時保留 功能性內(nèi)源FcRy鏈。
[0099] 在不同的實施方案中，內(nèi)源FcyRa鏈替代方法對動物中的天然FcyR介導(dǎo)的信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生的破壞相對最小，因為FcYRa鏈的基因組序列在單個片段中被替代，從而通 過包含必需調(diào)控序列保留正常功能性。因此在這樣的實施方案中，F(xiàn)cYRa鏈修飾不影響 其它依賴于功能性FcRy鏈分子的內(nèi)源FcR。此外，在不同實施方案中，修飾不影響包括 FcYRa鏈和內(nèi)源FcRy鏈的功能性受體復(fù)合物的裝配，所述復(fù)合物據(jù)認(rèn)為是一些FcYRa 鏈在細(xì)胞表面上的正確表達(dá)以及由激活的受體產(chǎn)生的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所需要的。因為FcRy 鏈未缺失，在不同實施方案中，包含人FcYRa鏈基因?qū)?nèi)源FcYRa鏈基因的替代的動物 應(yīng)當(dāng)能夠通過IgG免疫球蛋白的Fc部分對存在于輔助細(xì)胞表面上的人Fc YRa鏈的結(jié)合 來處理來自抗體的正常效應(yīng)子功能。
[0100] 在圖4中（上部）提供了缺失的內(nèi)源低親和力小鼠 FcyR基因的示意圖（未按 比例的）。如圖所示，通過用包含人低親和力人FcyRIIA和FcyRIIIA基因的基因組片 段以靶向構(gòu)建體（人Fc γ RIIIA-IIA靶向載體）將人低親和力人Fc γ R基因 Fc γ RIIA和 Fc γ RIIIA插入缺失的內(nèi)源低親和力小鼠 Fc γ R基因的基因座。這些基因的每一個基因包 含負(fù)責(zé)結(jié)合抗體分子的Fc部分的人FcyR基因的a鏈或配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0101] 在內(nèi)源低親和力小鼠 FCYR基因座上表達(dá)低親和力人FCYR基因的遺傳修飾的小 鼠可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法來制圖。例如，可制備引入低親和力人FcyR基因（例 如，F(xiàn)cyRIIA和FcyRIIIA)和選擇標(biāo)記基因的靶向載體。圖4(頂部）舉例說明了包含內(nèi) 源低親和力FcyR基因座的缺失的小鼠基因組。如圖所示，靶向構(gòu)建體包含含有內(nèi)源低親 和力小鼠 FcyR基因座的上游序列的5'同源臂、后接藥物選擇盒（例如，兩側(cè)連接有ΙοχΡ 序列的潮霉素抗性基因）、包含人Fc γ RIIA基因、人HSP76基因和人Fc γ RIIIA基因的基因 組片段以及包含內(nèi)源低親和力小鼠 FcyR基因座的下游序列的3'同源臂。于缺失的基因 座上同源重組后，藥物選擇盒被包含在靶向載體中的序列替代（圖4的底部）。內(nèi)源低親和 力Fc γ R基因基因座因此被低親和力人Fc γ R基因替代，產(chǎn)生表達(dá)低親和力人Fc γ R基因 的細(xì)胞或動物?？扇芜x地通過隨后添加重組酶（例如，通過Cre處理）除去藥物選擇盒。
[0102] 為了在血小板上表達(dá)hFc γ RIIA，靶向構(gòu)建體人hFc γ RIIA-IIA靶向載體包含延 長的序列，該序列包括例如與人基因組中的hFc γ RIIA基因可操作地連接的全部或大體上 全部人啟動子區(qū)域。為了阻止hFc γ RIIA在血小板上表達(dá)，靶向構(gòu)建體缺失可操作地連接 于人的hFc γ RIIA基因的全部或大體上全部啟動子區(qū)域。
[0103] 可使用對于利用兩個人Fc γ R基因的替代所描述的相似技術(shù)實現(xiàn)對嵌合基因座 的其它修飾（圖4的底部）。用兩個人Fc γ R基因替代內(nèi)源低親和力Fc γ R基因基因座的 修飾還可提供用于整合其它低親和力人FcyR基因的起始點。例如，圖6(頂部）中提供 了用兩個人低親和力Fc γ R基因替代的內(nèi)源低親和力Fc γ R基因座的示意圖（未按比例 的）。如圖所示，通過另一個具有包含低親和力人Fc γ RIIB、Fc γ RIIC和Fc γ RIIIB基因 的基因組片段的靶向構(gòu)建體（人FcyRIIB-IIIB-IIC靶向載體）將低親和力人FcyR基因 Fc γ RIIB、Fc γ RIIC和Fc γ RIIIB插入修飾的內(nèi)源低親和力小鼠 Fc γ R基因的基因座。這 些基因的每一個基因包含負(fù)責(zé)結(jié)合抗體分子的Fc部分的人FcyR基因的α鏈或配體結(jié)合 結(jié)構(gòu)域。
[0104] 在內(nèi)源低親和力小鼠 Fc γ R基因座上表達(dá)5個低親和力人Fc γ R基因的遺傳修飾 的小鼠可通過本領(lǐng)域已知的任何方法來產(chǎn)生。例如，可制備引入低親和力人Fc γ R基因（例 如，F(xiàn)cyRIIB、FcyRIIC和Fc YRIIIB)的具有選擇標(biāo)記基因的靶向載體。圖6(頂部）舉 例說明了包含以2個低親和力人Fc γ R基因?qū)?nèi)源低親和力Fc γ R基因座的替代的小鼠基 因組。如圖所示，靶向構(gòu)建體包含含有內(nèi)源低親和力小鼠 Fc Y R基因座的上游序列的5'同 源臂、后接藥物選擇盒（例如，兩側(cè)連接有ΙοχΡ序列的新霉素抗性基因）、包含人Fc γ RIIB 基因、人FcyRIIIB、人HSP77基因、人FcyRIIC基因的基因組片段，后跟含有存在于內(nèi)源基 因座上的低親和力人FcyRIIIA基因的下游序列的3'同源臂。于修飾的基因座上同源重 組后，人Fc γ RIIB、Fc γ RIIIB和Fc γ RIIC基因通過靶向載體中包含的序列被插入先前存 在于內(nèi)源低親和力Fc γ R基因基因座上的人Fc γ RIIIA和Fc γ RIIA基因的5'（圖6的底 部）。因此對修飾的內(nèi)源低親和力Fc YR基因基因座進(jìn)一步修飾以整合3個額外的低親和 力人Fc γ R基因，從而產(chǎn)生表達(dá)5個低親和力人Fc γ R基因的細(xì)胞或動物。藥物選擇盒可 任選通過隨后添加重組酶（例如，通過Cre處理）來除去。圖6(底部分）顯示所得的基因 座的結(jié)構(gòu)，其將表達(dá)可在動物的免疫系統(tǒng)的輔助細(xì)胞的表面上檢測到的并且適當(dāng)時與內(nèi)源 FcR γ鏈獨立結(jié)合的5個低親和力人Fc γ R基因。
[0105] Fc γ R缺陷型小鼠和Fc γ R人源化小鼠的實驗?zāi)Ｐ?br> [0106] 不表達(dá)內(nèi)源低親和力小鼠 FcyR基因的遺傳修飾的非人動物是有用的，其用于例 如闡明單個低親和力FcyR基因在免疫應(yīng)答中的各種功能、通過細(xì)胞介導(dǎo)的免疫（例如， ADCC)測量人治療性抗體的功效、測定Fc γ R在免疫疾病或障礙中的作用、用作免疫疾病或 障礙的模型、產(chǎn)生抗一種或多種FcyR蛋白的抗體、以及用作產(chǎn)生其它目標(biāo)遺傳修飾的小 鼠的交配配偶。
[0107] 在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的小鼠可用于通過給不表達(dá)低親和力Fc γ R基因 的小鼠施用試劑來測定這樣的小鼠的細(xì)胞毒性效應(yīng)的喪失（與野生型小鼠相比較），其中 已知所述試劑在野生型小鼠中觸發(fā)Fc γ R-依賴性細(xì)胞毒性效應(yīng)。在一個實施方案中，將 腫瘤細(xì)胞植入本發(fā)明的小鼠，在隨后的一段時間后，用特異于在腫瘤細(xì)胞表面上表達(dá)的抗 原的抗體注射小鼠。抗體的同種型在注射前是已知的并且通過與在野生型動物中觀察到的 ADCC相比較來分析動物的Fc γ R-依賴性ADCC的減弱。
[0108] 在另一個方面，可將內(nèi)源低親和力受體缺陷型小鼠與其它免疫缺陷型小鼠組合 (例如，通過交配）以產(chǎn)生自身免疫疾病的體內(nèi)模型。例如，重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID)小鼠 在本領(lǐng)域常規(guī)地用作用于研究免疫系統(tǒng)的模型生物。SCID小鼠具有受損的產(chǎn)生T或B淋巴 細(xì)胞或激活補體系統(tǒng)的一些組分的能力，并且不能高效地抵抗感染、排斥腫瘤和排斥移植 物。可將本發(fā)明的低親和力Fc γ Ra -亞基基因缺陷型小鼠培育成SCID小鼠以確定宿主動 物響應(yīng)于抗體治療劑（例如，抗腫瘤抗體）的施用的細(xì)胞耗盡，這可測定ADCC和補體依賴 的細(xì)胞毒性（CDC)在體內(nèi)腫瘤細(xì)胞耗盡中的作用。
[0109] 在另一個方面，提供了包含低親和力人Fc γ R基因?qū)?nèi)源低親和力Fc γ R基因的 替代的遺傳修飾的非人動物。此類動物對于研究完全人抗體和hFc γ R介導(dǎo)的ADCC的藥代 動力學(xué)是有用的。此外，已顯示人FcyR基因展示與疾?。ɡ纾琒LE，RA，Wegener' s肉芽 腫病、Guillain-Barr6綜合征和多發(fā)性硬化）相關(guān)的多態(tài)性或等位基因變體。因此，包含 人Fc γ R基因的特定等位基因或多態(tài)性形式對內(nèi)源低親和力Fc γ R基因的替代的遺傳修飾 的非人動物可用于在動物中研究人自身免疫疾病和與多態(tài)性相關(guān)的性狀。在具體的實施方 案中，人FcyR基因的等位基因形式與對于人IgG的增強的功效相關(guān)。
[0110] 在另一個具體的實施方案中，測定人低親和力FcyR多態(tài)性對人抗體治療劑的功 效的影響。在具體的實施方案中，給包含人FcyR的第一多態(tài)性的第一人源化小鼠施用抗 腫瘤抗體，也給包含人FcyR的第二多態(tài)性的第二人源化小鼠施用抗腫瘤抗體，其中第一 和第二小鼠各自包含人腫瘤細(xì)胞；并且在第一小鼠和第二小鼠中評估抗腫瘤抗體的抗腫瘤 活性。在具體的實施方案中，由醫(yī)生基于抗腫瘤抗體在第一小鼠和第二小鼠中的功效的評 估選擇關(guān)于治療具有第一或第二多態(tài)性和具有相應(yīng)于人腫瘤細(xì)胞的腫瘤的人的治療選擇。
[0111] 人FCYR基因的適當(dāng)多態(tài)性包括本領(lǐng)域已知的全部多態(tài)性。對于人FCYRIIA基 因，多態(tài)性包括例如通過T細(xì)胞響應(yīng)于IgG增殖的能力報道的高應(yīng)答者表型和低應(yīng)答者表 型。高應(yīng)答者多態(tài)性的特征在于位點131上的精氨酸殘基（131Arg)，而低應(yīng)答者的特征在 于位點131上的組氨酸殘基（131His)。在具體的實施方案中，人Fc γ RIIA序列包含131His 多態(tài)性。人FcYRIIAa鏈的代表性蛋白質(zhì)序列示于SEQ ID N0:32中。
[0112] 人FcyRIIB基因的單核苷酸置換在配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（a鏈）中導(dǎo)致錯義置換 并且推定其影響IgG的Fc部分結(jié)合細(xì)胞表面上的FcyRIIB的a鏈的結(jié)合能力。例如， 已顯示小鼠的FcyRIIB基因的跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)的位點232上的蘇氨酸對異亮氨酸的置換 (Ile232Thr)削弱了受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。在具體的實施方案中，人FcyRIIB基因包含異 亮氨酸變體（232Ile)。人FcγRIIBa鏈的代表性蛋白質(zhì)序列示于SEQIDN0 :33中。
[0113] 有人提出人FcyRIIIA基因的等位基因變體牽涉SLE和RA的易感性。該等位 基因變體包括位點158上苯丙氨酸對纈氨酸的置換（Vall58Phe)。纈氨酸等位基因變體 (158Val)經(jīng)表征具有比苯丙氨酸等位基因變體（158Phe)更高的對IgGl和IgG3的親和力。 已有人提出158Phe等位基因變體導(dǎo)致減少的免疫復(fù)合物的清除。在具體的實施方案中，人 FcyRIIIA基因包含158Val等位基因變體。人FcyRIIIAa鏈的代表性蛋白質(zhì)序列示于 SEQ ID N0:35 中。
[0114] 人FcyRIIIB基因的等位基因變體包括嗜中性粒細(xì)胞抗原1(NA1)和嗜中性粒細(xì) 胞抗原2(NA2)等位基因。已有人提出這些等位基因變體牽涉輸血反應(yīng)、同種免疫嗜中性白 血球減少癥（alloimmune neutropaenia)、SLE和Wegener's肉芽腫病。NA2等位基因變體 的特征在于減小的介導(dǎo)吞噬作用的能力。在具體的實施方案中，人FcyRIIIB基因包含NA2 等位基因變體。人FcYRIIIBa鏈的代表性蛋白質(zhì)序列示于SEQ ID N0:36中。
[0115] 在一個方面，遺傳修飾的非人動物對于最優(yōu)化通過治療性抗體的Fc部分觸發(fā)的 FcyR介導(dǎo)的功能是有用的?？衫帽绢I(lǐng)域已知的任何方法修飾抗體的Fc區(qū)域。例如，可 修飾Fc部分（例如，CH2和CH3結(jié)構(gòu)域）中的氨基酸殘基以選擇性增強對人Fc γ RIIIA的 結(jié)合親和力。因此，所得的抗體應(yīng)當(dāng)具有增強的Fc γ RIIIA依賴性ADCC。在具體的實施方 案中，將表達(dá)本發(fā)明的人Fc γ RIIIA的動物用于評估修飾的人抗體的增強的ADCC能力（通 過給動物施用修飾的人抗體，檢測（例如，體外）抗體對表達(dá)Fc γ RIIIA的細(xì)胞的結(jié)合和將 觀察到的ADCC活性與從野生型動物的測定觀察到的ADCC活性相比較）。 實施例
[0116] 實施例1:低親和力FcyR基因缺失型小鼠的產(chǎn)生
[0117] 構(gòu)建用于引入內(nèi)源低親和力小鼠 FcyR基因座的缺失的靶向構(gòu)建體（下文中描述 的）（圖1)。
[0118] 使用VELOCIGENE⑩技術(shù)（參見，例如，美國專利No. 6, 586, 251和 Valenzuela 等人（2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21 (6) :652-659)制備革巴向 構(gòu)建體以修飾細(xì)菌人工染色體（BAC)RP23-395f6(Invitrogen)。修飾RP23-395f6BAC DNA 以缺失內(nèi)源低親和力Fc γ RIIB、Fc γ RIV和Fc γ RIII基因（包括每一個Fc γ R的α鏈）。
[0119] 簡而言之，分別利用引物 mFcR5-up-l(5' -ACCAGGATAT GACCTGTAGA G ; SEQ ID N0:1)和 mFcR3-up-la(GTCCATGGGT AAGTAGAAAC A;SEQ ID N0:2)以及 mFcR5-DN(ATGCGAGCTC ATGCATCTATG TCGGGTGCGG AGAAAGAGGT AATGCATTCT TGCCCAATAC TTAC;SEQIDN0:3)和mFcR3-DN(ACTCATGGAGCCTCAACAGGA ;SEQIDN0:4)產(chǎn)生上游和下 游同源臂。這些同源臂被用于產(chǎn)生缺失內(nèi)源低親和力Fc γ RIIB、Fc γ RIV和Fc γ RIII基因 的α鏈的盒。靶向構(gòu)建體包括l〇x化的新霉素抗性基因，其包含相對于內(nèi)源基因座的5' 和3'區(qū)域同源的序列的同源臂。內(nèi)源FcyRIIB基因的上游和內(nèi)源FcyRIII基因的下游 的基因和/或序列（參見圖1)不被該靶向構(gòu)建體修飾。
[0120] 使用在缺失區(qū)域外部和在靶向構(gòu)建體內(nèi)部的引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)來 確認(rèn)靶向缺失。使用針對mFcR-up-detect(ATCCTGAGTATACTATGACAAGA ;SEQIDN0:5)和 PGK-up-detect(ACTAGTGAGA CGTGCTACTT C;SEQ ID N0:6)的引物通過 PCR 來確認(rèn)缺失的 基因座的上游區(qū)域；使用引物pA-DN-detect(CTCCCACTCATGATCTATAGA ;SEQIDN0:7)和 mFcR-DN-detect(TGGAGCCTCA ACAGGACTCC A;SEQ ID N0:8)來確認(rèn)缺失的基因座的下游區(qū) 域。橫跨上游缺失點的核苷酸序列包括下列序列，所述序列表示與存在于缺失點上的盒序 列連續(xù)連接的Fc γ RIIB基因的下游內(nèi)源小鼠序列（包括在下面的括號內(nèi)）：(GTCCATGGGT AAGTAGAAACA)TTCGCTACC TTAGGACCGT TA(SEQ ID N0:9)。橫跨下游缺失點的核苷酸序列包 括下列序列，其表示與FcyRIII基因上游的內(nèi)源小鼠序列（包括在下面的括號內(nèi)）連續(xù)的 盒序列：CGGGTGCGGA GAAAGAGGTA AT(GCATTCTT GCCCAATACT TA) (SEQ ID N0:10)。
[0121] 通過將靶向BAC DNA(上文中描述的）電穿孔入小鼠 ES細(xì)胞來產(chǎn)生FcyRIIB、 Fc γ RIII和Fc γ RIV缺陷小鼠。通過Taqman?篩選和核型分析確認(rèn)陽性ES細(xì)胞克隆。隨 后將陽性ES細(xì)胞克隆用于植入雌性小鼠以產(chǎn)生一窩低親和力Fc γ R基因缺陷幼鼠。
[0122] 實施例2:低親和力Fc γ R基因缺陷型小鼠的表征
[0123] 從FcyR缺陷型小鼠和野生型小鼠收獲脾，在無菌一次性袋中用10mL的膠原酶-D 灌注。隨后將每一只包含單個脾的袋子置于Stomacher? (Seward)中，在培養(yǎng)基環(huán)境中 勻漿30分鐘。將勻漿的脾轉(zhuǎn)移至10cm培養(yǎng)皿，在37°C溫育25分鐘。使用1:50稀釋度的 0. 5MEDTA，利用移液器分離細(xì)胞，隨后在37°C再溫育另外5分鐘。隨后通過離心（lOOOrpm 進(jìn)行10分鐘）沉淀細(xì)胞，將紅細(xì)胞在4mL ACK緩沖液（Invitrogen)中裂解3分鐘。用 RPMI-1640(Sigma)稀釋脾細(xì)胞，再次離心。將沉淀的細(xì)胞重懸浮于10mL RPMI-1640中，利 用0. 2 μ m細(xì)胞濾過器進(jìn)行過渡。
[0124] 流式細(xì)胞術(shù)。利用下列綴合有熒光團(tuán)的細(xì)胞表面標(biāo)記物：抗_CD19(B細(xì)胞）、 抗-CD3 (T細(xì)胞）、抗-NKp46 (NK細(xì)胞）和抗-F4/80 (巨噬細(xì)胞）在BD LSR II系統(tǒng)（BD Bioscience)上通過FACS鑒定淋巴細(xì)胞群體。針對特定細(xì)胞譜系門控淋巴細(xì)胞，利用大鼠 抗-小鼠 Fc γ RIII/II 抗體（克隆 2. 4G2, BD Biosciences)分析內(nèi)源Fc γ RIII 和 Fc γ RIIB 的表達(dá)?？寺?.4G2識別鼠 FcyRIII和FcyRII的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域上的共同多態(tài)性表位。 結(jié)果顯示在mFcYR K0小鼠的B-細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上不存在可檢測的鼠低親和力 FcyRIII 或 FcyRII (圖 2)。
[0125] ADCC測定。從FcyR基因缺陷型小鼠和野生型小鼠分離脾細(xì)胞，在細(xì)胞殺傷測定 中分析它們進(jìn)行ADCC的能力。使用MACS?技術(shù)（Miltenyi Biotec)分離和分開細(xì)胞 群體。簡而言之，使用磁性標(biāo)記的抗-小鼠 CD3珠粒從脾細(xì)胞耗盡T細(xì)胞。隨后使用磁性 標(biāo)記的抗-小鼠 CD49B珠粒就NK細(xì)胞富集T細(xì)胞耗盡的脾細(xì)胞。單獨地，用不同濃度（范 圍從〇· 1至10 μ g/mL)的小鼠抗-人⑶20抗體（克隆B1 ;Beckman Coulter)在4°C包被 Raji細(xì)胞（表達(dá)人CD20)30分鐘。以100:1和50:1的比率（NK:Raji)將抗體包被的Raji 細(xì)胞與富集的NK細(xì)胞在37°C溫育4小時。使用CytoTox-Glo?細(xì)胞毒性測定法（Promega) 測量細(xì)胞死亡。發(fā)光信號來源于裂解的細(xì)胞并且與死亡細(xì)胞的數(shù)目成正比。就每一個比率 的本底死亡細(xì)胞計數(shù)測定來自對照（無抗-CD20抗體）的發(fā)光，從野生型和K0小鼠的測 量扣除該發(fā)光。計算平均細(xì)胞死亡，通過與野生型相比較測定細(xì)胞殺傷的百分比減少 ADCC)。結(jié)果不于表1中。
[0126] 表 1
[0127]
【權(quán)利要求】
1. 一種制備包含遺傳修飾的小鼠的方法，包括工程化小鼠以包含內(nèi)源FcYRIIBa鏈 基因中的純合破壞、內(nèi)源FcYRIVa鏈基因中的純合破壞、內(nèi)源FcYRIIIa鏈基因中的純 合破壞。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中小鼠包括與野生型小鼠對于相同抗原的能力相比較 減小的對抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中小鼠包括至少50%減小的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì) 胞毒性（ADCC)。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中小鼠包含功能性的FcRy鏈。
5. 如權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中小鼠表達(dá)人⑶20。
6. -種遺傳修飾的小鼠細(xì)胞，其基因組包含內(nèi)源FcyRIIB a鏈基因中的純合破壞，內(nèi) 源FcYRIVa鏈基因中的純合破壞，內(nèi)源FcYRIIIa鏈基因中的純合破壞。
7. 如權(quán)利要求6所述的細(xì)胞，其中細(xì)胞包含功能性的FcRy鏈。
8. 如權(quán)利要求6所述的細(xì)胞，其中細(xì)胞是胚胎干（ES)細(xì)胞。
9. 如權(quán)利要求6所述的細(xì)胞，其中細(xì)胞是天然殺傷（NK)細(xì)胞。
10. 如權(quán)利要求6至9中任一項所述的細(xì)胞，其中細(xì)胞包含人⑶20基因。
11. 一種鼠細(xì)胞，其基因組包含以至少兩個低親和力人FcYRa鏈基因替代內(nèi)源低親 和力FcYRa鏈基因，其中細(xì)胞包含功能性內(nèi)源FcRy鏈并且功能性地表達(dá)至少兩個低親 和力人FcyRa鏈基因。
12. 如權(quán)利11所述的鼠細(xì)胞，其中細(xì)胞是淋巴細(xì)胞。
13. 如權(quán)利要求12所述的鼠淋巴細(xì)胞，其中淋巴細(xì)胞是B細(xì)胞。
14. 如權(quán)利要求12所述的鼠淋巴細(xì)胞，其中淋巴細(xì)胞是天然殺傷細(xì)胞。
15. 如權(quán)利要求11所述的鼠細(xì)胞，其中細(xì)胞是鼠胚胎干細(xì)胞。
16. 如權(quán)利要求11至15中任一項所述的鼠細(xì)胞，其中至少兩個低親和力人FcYRa 鏈基因選自下組：人FcyRIIAa鏈基因、人FcyRIIBa鏈基因、人FcyRIICa鏈基因、人 FcyRIIIAa鏈基因和人FcyRIIIBa鏈基因。
17. 如權(quán)利要求11至15中任一項所述的鼠細(xì)胞，其中至少兩個低親和力人Fc γ R基因 是人FcyRIIAa鏈基因和人FcyRIIIAa鏈基因。
18. 如權(quán)利要求17所述的鼠細(xì)胞，其中人FcYRIIIAa鏈基因包括在氨基酸位點158 上的苯丙氨酸。
19. 如權(quán)利要求17所述的鼠細(xì)胞，其中人FcYRIIIAa鏈基因包括在氨基酸位點158 上的纈氨酸。
20. 如權(quán)利要求11至15中任一項所述的鼠細(xì)胞，其中，鼠細(xì)胞的基因組包含人 FcyRIIBa鏈基因、人FcyRIICa鏈基因和人FcyRIIIBa鏈基因。
21. 如權(quán)利要求13所述的B細(xì)胞，進(jìn)一步包含編碼人⑶20蛋白的人核苷酸序列。
22. -種鼠胚胎，包括權(quán)利要求15所述的胚胎干細(xì)胞。
23. -種鼠天然殺傷細(xì)胞，其基因組包括替代內(nèi)源FCyRIIB、FcyRIII和FcYRIVa鏈 基因的人FcYRIIIAa鏈基因，其中細(xì)胞功能性地表達(dá)人FcYRIIIAa鏈基因和在其表面 上的鼠 FcRy鏈。
24. -種制備遺傳修飾的鼠科動物的方法，其基因組包含以至少兩個低親和力人 FcYRa鏈基因替代內(nèi)源低親和力FcYRa鏈基因，包括使用權(quán)利要求15所述的鼠胚胎干 細(xì)胞。
25. -種制備遺傳修飾的鼠胚胎干細(xì)胞的方法，其基因組包含以至少兩個低親和力 人FcYRa鏈基因替代內(nèi)源低親和力FcYRa鏈基因，該方法包括以至少兩個低親和力人 FcYRa鏈基因替代鼠胚胎干細(xì)胞基因組中的內(nèi)源低親和力FcYRa鏈基因。
26. 如權(quán)利要求22所述的方法，其中內(nèi)源低親和力FcYRa鏈基因被人FcYRIIAa鏈 基因和人FcyRIIIAa鏈基因替代。
27. 如權(quán)利要求22所述的方法，其中內(nèi)源低親和力FcYRa鏈基因被人FcYRIIBa鏈 基因、人FcyRIICa鏈基因和人FcyRIIIBa鏈基因替代。
28. 如權(quán)利要求22所述的方法，其中內(nèi)源低親和力FcYRa鏈基因被人FcYRIIAa 鏈基因、人FcyRIIBa鏈基因、人FcyRIICa鏈基因、人FcyRIIIAa鏈基因和人 FcyRIIIBa鏈基因替代。
【文檔編號】C12N5/10GK104232589SQ201410471291
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2009年12月21日
【發(fā)明者】L·麥克唐納, 涂納新, C·古爾, S·史蒂文斯, A·J·墨菲 申請人:瑞澤恩制藥公司