專利名稱：人骨髓基質細胞來源的線粒體轉運蛋白分子及其編碼序列和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體地說，本發(fā)明涉及新的編碼人線粒體轉運蛋白分子HuBMSC-MCP(human bone marrow stromal cell-derived mitochondriacarrier protein)多肽的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。具體地說，本發(fā)明的多肽是一種新的線粒體轉運蛋白分子。
背景技術：
骨髓基質細胞作為造血微環(huán)境的主要成分，對造血系統(tǒng)的分化和維持至關重要。除了與造血干細胞的直接作用，它們還可以通過分泌大量的細胞因子調控造血干細胞的分化。在一定程度上，某些白血病的發(fā)生與骨髓微環(huán)境的異常有關。骨髓基質細胞除了參與對造血的調控，目前還發(fā)現具有多種生物學功能，諸如，通過分泌趨化因子，生長因子，細胞因子調控免疫系統(tǒng)的發(fā)育和自穩(wěn)；骨髓基質細胞作為間葉細胞，保留了多分化潛能，能夠被誘導分化為成骨細胞，脂肪細胞，肌肉細胞，神經元細胞以及髓鞘細胞等；并且在一定的外界因素誘導下分化為抗原提呈細胞，刺激T細胞活化。因此研究骨髓基質細胞來源相關分子的生物學功能有助于探討白血病的發(fā)病機制、細胞分化、組織形成、免疫調控以及損傷修復，是當前免疫學研究的熱點。
線粒體內膜上鑲嵌著許多與其代謝物質轉運有關的功能相關，結構相似的蛋白質，被統(tǒng)稱為線粒體轉運蛋白超家族(mitochondrial carrier protein)。此超家族分子的結構特點為(1)均含有三個重復區(qū)域，每個區(qū)域包含100個左右的氨基酸；(2)每個區(qū)域包含一個序列基序(PX(D/E)Xh(K/R)X(R/K)X20- 30)(D/E)GX4)a(K/R)GRG，其中h代表疏水性氨基酸，a代表芳香族氨基酸；(3)疏水性分析顯示每一區(qū)域含有兩個跨膜螺旋，其間有一親水區(qū)相連；(4)分子量在28-32kDa之間。該超家族已知的成員包括ADP/ATP轉運蛋白、解偶聯(lián)蛋白、磷酸鹽轉運蛋白、酮戊二酸/蘋果酸轉運蛋白、檸檬酸轉運蛋白、二羧酸轉運蛋白、肉毒堿轉運蛋白、鳥苷酸轉運蛋白及一些未知功能的蛋白，如從釀酒酵母中提取的MRS3及MRS4蛋白，Grave病蛋白等。
特異性免疫反應是由抗原提呈細胞捕獲抗原，經加工、處理后將抗原信息傳遞給T、B淋巴細胞后誘發(fā)產生的，因此，抗原的加工處理和提呈是機體免疫反應的首要環(huán)節(jié)，直接關系到免疫激活或免疫耐受的誘導。
樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是目前已知的機體內功能最強的專職性抗原提呈細胞，其主要通過兩種途徑捕獲抗原構成型巨吞飲和甘露糖受體介導的內吞。有效的內吞是DC發(fā)揮功能的關鍵環(huán)節(jié)。
因此，發(fā)現新的線粒體轉運蛋白分子對于認識機體免疫細胞的作用機制等具有重要價值。線粒體轉運蛋白分子在腫瘤的發(fā)生、生長過程中發(fā)揮重要調控作用，并可能在抗腫瘤、抗炎癥反應、抗感染以及免疫功能調節(jié)等多個領域的免疫診斷和免疫治療方面具有重要的開發(fā)和應用價值。因此，本領域迫切需要開發(fā)新的人骨髓基質細胞來源的線粒體轉運蛋白分子。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種新的人骨髓基質細胞來源的線粒體轉運蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的HuBMSC-MCP多肽，該多肽是人骨髓基質細胞來源的，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有增強樹突狀細胞內吞作用的功能的由(a)衍生的多肽。更佳地，所述多肽具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少80％相同性(a)編碼上述人HuBMSC-MCP的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中192-1154位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1433位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備人HuBMSC-MCP蛋白的方法，該方法包含(a)在表達條件下，培養(yǎng)上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出人HuBMSC-MCP蛋白。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的人HuBMSC-MCP多肽特異性結合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的15-1433個核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進、拮抗人HuBMSC-MCP多肽活性的化合物，以及抑制人HuBMSC-MCP多肽的表達的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是人HuBMSC-MCP多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在HuBMSC-MCP蛋白的方法，它包括將樣品與HuBMSC-MCP蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在HuBMSC-MCP蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測與人HuBMSC-MCP多肽異常表達相關的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測細胞樣品中編碼所述HuBMSC-MCP多肽表達量。
在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進人HuBMSC-MCP多肽活性的激動劑，或者篩選抑制人HuBMSC-MCP多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的人HuBMSC-MCP蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴增反應，或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發(fā)明的第十方面，提供了一種組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的人HuBMSC-MCP多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體。這些組合物可用于促進樹突狀細胞的內吞作用，在治療腫瘤、炎癥、神經系統(tǒng)和心血管病等病癥方面有應用前景。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
圖1是本發(fā)明的人HuBMSC-MCP的cDNA序列。
圖2是本發(fā)明的人HuBMSC-MCP的全長氨基酸序列。
圖3是本發(fā)明的人HuBMSC-MCP與其他線粒體轉運蛋白的氨基酸序列同源性比較圖。上方序列是人HuBMSC-MCP，下方序列是其他線粒體轉運蛋白。相同的氨基酸在多個個序列之間用黑體標出，相似的氨基酸用灰體標出。
圖4是本發(fā)明的人HuBMSC-MCP RT-PCR表達分析，提示HuBMSC-MCP表達于某些腫瘤細胞。
圖5是本發(fā)明的人HuBMSC-MCP的細胞內定位，提示HuBMSC-MCP分布在人線粒體內。
圖6顯示本發(fā)明的人HuBMSC-MCP過表達后，顯著增強DC的內吞活性。
具體實施例方式
本發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，首次分離了骨髓基質細胞來源的新型線粒體轉運蛋白分子(Bone marrow stromal cell-derived mitochondria carrier protein，HuBMSC-MCP)。RT-PCR分析表明HuBMSC-MCP在某些腫瘤細胞中有表達，這表明HuBMSC-MCP維持著某些腫瘤細胞的分化。
此外，本發(fā)明的人線粒體轉運蛋白分子HuBMSC-MCP與已知家族成員有極高的同源性，具有線粒體轉運蛋白超家族成員的全部結構特征。這暗示HuBMSC-MCP與其他家族成員一樣轉運一種與線粒體氧化磷酸化相關的底物，為細胞的生命活動提供能量。共聚焦顯微鏡觀察顯示HuBMSC-MCP與線粒體共定位于人乳腺癌細胞系-MCF-7的偽足中。而偽足的形成是腫瘤細胞穿越血管內皮細胞下基底膜形成轉移的顯著特征，因此，本發(fā)明的人線粒體轉運蛋白分子HuBMSC-MCP可能與腫瘤細胞的侵襲轉移有關，為腫瘤細胞偽足的形成及移動提供能量。同時，本發(fā)明的人線粒體轉運蛋白分子HuBMSC-MCP可顯著增強DC的內吞作用。
因此，HuBMSC-MCP蛋白或其相關的拮抗劑、激動劑等可為治療腫瘤等疾病提供新的免疫診斷和靶向治療途徑，因而具有巨大的應用前景。
在本發(fā)明中，術語“HuBMSC-MCP蛋白”、“HuBMSC-MCP多肽”或“線粒體轉運蛋白分子HuBMSC-MCP”可互換使用，都指具有人線粒體轉運蛋白分子HuBMSC-MCP氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。
如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的HuBMSC-MCP蛋白或多肽”是指HuBMSC-MCP多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化HuBMSC-MCP蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人HuBMSC-MCP蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然人HuBMSC-MCP蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術語“人HuBMSC-MCP多肽”指具有人HuBMSC-MCP蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與人HuBMSC-MCP蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或多個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或多個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人HuBMSC-MCP蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人HuBMSC-MCP DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人HuBMSC-MCP多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人HuBMSC-MCP多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人HuBMSC-MCP多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人HuBMSC-MCP多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人HuBMSC-MCP蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人HuBMSC-MCP多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人HuBMSC-MCP蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行氨基酸替換而產生。
表1

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％ SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼HuBMSC-MCP蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發(fā)明的人HuBMSC-MCP核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用于PCR的引物可根據本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當地選擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或HuBMSC-MCP蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的HuBMSC-MCP多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼人HuBMSC-MCP多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發(fā)明中，人HuBMSC-MCP多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7的表達載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans，J BioChem.2633521，1988)和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體?？傊?，只要能在宿主體內復制和穩(wěn)定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含人HuBMSC-MCP編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，aLaboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄?？膳e的例子包括在復制起始點晚期一側的100到270個堿基對的SV40增強子、在復制起始點晚期一側的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的人HuBMSC-MCP蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療HuBMSC-MCP蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用于篩選促進或對抗HuBMSC-MCP蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組人HuBMSC-MCP蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激人HuBMSC-MCP蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對人HuBMSC-MCP DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于人HuBMSC-MCP基因產物或片段。較佳地，指那些能與人HuBMSC-MCP基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結合并抑制人HuBMSC-MCP蛋白的分子，也包括那些并不影響人HuBMSC-MCP蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的人HuBMSC-MCP基因產物結合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的人HuBMSC-MCP基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人HuBMSC-MCP蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人HuBMSC-MCP蛋白功能的抗體以及不影響人HuBMSC-MCP蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人HuBMSC-MCP基因產物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人HuBMSC-MCP基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
抗人HuBMSC-MCP蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的人HuBMSC-MCP蛋白。此外，與人HuBMSC-MCP蛋白結合的單克隆抗體也可用放射性同位素標記，注入體內可跟蹤其位置和分布。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預防與人HuBMSC-MCP蛋白相關的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷人HuBMSC-MCP蛋白的產生或活性。
抗體也可用于設計成針對體內某一特殊部位的免疫毒素。如人HuBMSC-MCP蛋白高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結合于抗體上。
多克隆抗體的生產可用人HuBMSC-MCP蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與HuBMSC-MCP蛋白發(fā)生相互作用的物質，如配體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
本發(fā)明的多肽或其激動劑和拮抗劑可直接用于疾病治療，例如用于腫瘤方面的治療。在使用時，還可同時使用其他治療劑。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明HuBMSC-MCP多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的HuBMSC-MCP蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內的。
人HuBMSC-MCP蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的。基因治療技術可用于治療由于HuBMSC-MCP蛋白的無表達或異常/無活性的HuBMSC-MCP蛋白的表達所致的細胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計成表達變異的HuBMSC-MCP蛋白，以抑制內源性的HuBMSC-MCP蛋白活性。來源于病毒的表達載體如逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用于將HuBMSC-MCP基因轉移至細胞內。構建攜帶HuBMSC-MCP基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook，et al.)。另外重組人HuBMSC-MCP基因可包裝到脂質體中，然后再轉移至細胞內。
抑制人HuBMSC-MCPmRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交后進行核酸內切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術獲得，如固相磷酸酰胺化學合成法合成寡核苷酸的技術已廣泛應用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內轉錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側的序列長度，核糖核苷之間的連接應用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
能與人HuBMSC-MCP蛋白結合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，必須對人HuBMSC-MCP蛋白分子進行標記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人HuBMSC-MCP蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的人HuBMSC-MCP蛋白水平，可以用作解釋人HuBMSC-MCP蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷HuBMSC-MCP蛋白起作用的疾病。
一種檢測檢測樣品中是否存在HuBMSC-MCP蛋白的方法是利用HuBMSC-MCP蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與HuBMSC-MCP蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在HuBMSC-MCP蛋白。
HuBMSC-MCP蛋白的多聚核苷酸可用于HuBMSC-MCP蛋白相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，HuBMSC-MCP蛋白的多聚核苷酸可用于檢測HuBMSC-MCP蛋白的表達與否或在疾病狀態(tài)下HuBMSC-MCP蛋白的異常表達。如HuBMSC-MCPDNA序列可用于對活檢標本的雜交以判斷HuBMSC-MCP蛋白的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用HuBMSC-MCP蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測HuBMSC-MCP蛋白的轉錄產物。
檢測HuBMSC-MCP基因的突變也可用于診斷HuBMSC-MCP蛋白相關的疾病。HuBMSC-MCP蛋白突變的形式包括與正常野生型HuBMSC-MCP DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價值的。簡而言之，根據本發(fā)明HuBMSC-MCP蛋白的cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細胞雜合細胞。只有那些含有相應于引物的人基因的雜合細胞會產生擴增的片段。
一旦序列被定位到準確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數據相關聯(lián)。這些數據可見于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritance inMan(可通過與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯(lián)機獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關系。
在本發(fā)明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從人骨髓基質細胞cDNA文庫中分離出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長為1433個堿基，其開放讀框位于192-1154位，編碼全長為321個氨基酸的人HuBMSC-MCP蛋白(SEQ ID NO2)。該HuBMSC-MCP蛋白屬于線粒體轉運蛋白家族分子，與ADP/ATP轉運蛋白、解偶聯(lián)蛋白、磷酸鹽轉運蛋白、酮戊二酸/蘋果酸轉運蛋白等氨基酸序列具有一定同源性，在線粒體轉運蛋白結構域內一致性可高達25％以上，相似性則可達50％。RT-PCR分析表明HuBMSC-MCP在多種腫瘤細胞系中表達。因此，HuBMSC-MCP蛋白或其相關的拮抗劑、激動劑等可為治療腫瘤、炎癥、神經系統(tǒng)和心血管病等疾病提供新的免疫診斷和靶向治療途徑，因而具有巨大的應用前景。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人HuBMSC-MCP cDNA的克隆用Trizol試劑(Life Technologies公司)提取人骨髓基質細胞總RNA。然后，從總RNA中分離poly(A)mRNA。將poly(A)mRNA經逆轉錄形成cDNA后，用SuperScriptII克隆試劑盒(購自Gibco)將cDNA片段定向插入到載體的多克隆位點上，轉化DH5α細菌形成cDNA質粒文庫。用雙脫氧法測定隨機挑選克隆的5’末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數據庫進行比較，結果發(fā)現有一個cDNA克隆的DNA序列為新的全長cDNA。通過合成一系列引物對新克隆所含的DNA序列進行雙向測定。計算機分析表明，克隆所含的全長cDNA是一個新的cDNA序列(如SEQ ID NO1和圖1所示)，編碼一個新的蛋白質(如SEQ IDNO2和圖2所示)。此蛋白質被命名為人骨髓基質細胞來源線粒體轉運蛋白分子HuBMSC-MCP，其編碼基因命名為人骨髓基質細胞來源線粒體轉運蛋白分子HuBMSC-MCP基因。
序列SEQ ID NO1全長為1433bp，包括191bp的5’端非編碼區(qū)和276bp的3’端非編碼區(qū)，編碼含321個氨基酸的多肽。理論上計算未糖基化的成熟分子的分子量約為35.4kD。
BLAST分析表明其與已知基因不同，與人線粒體轉運蛋白的氨基酸序列具有一定同源性，一致性達28％，相似性達50％(圖3)，屬于線粒體轉運蛋白(mitochondrial carrier protein)家族分子。
實施例2用RT-PCR方法進行人HuBMSC-MCP的細胞表達分析用Trizol試劑提取處于對數生長期人結腸癌細胞系LoVo、前列腺癌細胞系PC-3、宮頸癌細胞系HeLa、卵巢癌細胞系CaoV3、乳腺癌細胞系MCF-7等細胞的細胞總RNA。取5μg細胞總RNA與1μg Oligo-dT12-18混合，進行反轉錄。反轉錄體系為20μl，反應結束后加80μl ddH2O進行稀釋。PCR擴增HuBMSC-MCP所用的引物如下有義引物5’-GAG ACC AAC ATC CGT GAC-3’(SEQ ID NO3)，反義引物5’CCTCGTCCTT ATGACTTC-3’(SEQ ID NO4)，同時以β-肌動蛋白作為陽性對照。PCR反應體積為50μl，其中含反轉錄模板10μl、0.5mM引物、0.2mM dNTP和1U rTaq DNA聚合酶(Takara)，擴增參數為95℃ 15秒、57℃ 30秒、72℃ 30秒，28個循環(huán)后PCR產物行1.5％瓊脂糖凝膠電泳初步確認。DNA序列分析結果表明該PCR產物的DNA序列與SEQ ID NO1所示的386-971完全相同。
結果顯示，HuBMSC-MCP mRNA在MCF-7乳腺癌細胞系、HeLa宮頸癌細胞系等多數腫瘤細胞中有表達，在LoVo細胞系中未見表達(圖4)。
實施例3人HuBMSC-MCP重組表達在該實施例中，Trizol試劑(Life Technologies公司)提取人骨髓基質細胞總RNA作為模板，經過反轉錄后，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得人HuBMSC-MCP DNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5’端寡核苷酸引物序列為5’-GCG GTA CCG ACT GAG TAC GGT CTT CTA A-3’(SEQ ID NO5)該引物含有KpnI限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是人HuBMSC-MCP的部分編碼序列；3’端引物序列為5’-CGG GAT CCC ATG GCG ACG GGC GGC CAG C-3’(SEQ ID NO6)該引物含有BamHI限制性內切酶的酶切位點、翻譯終止子和人HuBMSC-MCP的部分編碼序列。
將獲得的PCR產物純化后經KpnI和BamHI酶切再與質粒pRsetB(Invitrogen公司)按常規(guī)方法重組并轉化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆鑒定后純化并測序(ABI公司的377型測序儀，BigDye Terminator試劑盒，PE公司)。將正確序列的人HuBMSC-MCPcDNA的質粒轉化大腸桿菌BL21。陽性克隆用KpnI和BamHI酶切鑒定，產物行1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析。經測序證實，已插入了所設計的HuBMSC-MCP編碼序列。
挑表達HuBMSC-MCP的陽性BL21克隆接種于100mlLB培養(yǎng)基中，37℃300rpm振蕩培養(yǎng)12-15hr，1∶10稀釋于預熱的LB培養(yǎng)基繼續(xù)振蕩培養(yǎng)1.5hr，加1M IPTG至1mM后37℃誘導2-6hr，5,000g 4℃離心10min去上清，置冰上用50ml 1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)重懸，超聲(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20％Triton X-100至1％輕搖30min，然后12,000g 4℃離心10min，上清用0.8μm濾膜過濾后，過2mlHis-Sepharose層析柱，1×PBS充分洗滌后，加入500ul洗脫緩沖液室溫靜置30分鐘后收集洗脫液，重復洗脫2-3次，得到人HuBMSC-MCP蛋白。分子量與預測值相符。
實施例4抗人HuBMSC-MCP抗體的產生將實施例3中獲得的重組蛋白人HuBMSC-MCP用來免疫動物以產生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉淀人HuBMSC-MCP基因翻譯產物的能力加以評估。結果發(fā)現，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生結合。
實施例5HuBMSC-MCP真核融合表達載體的構建在該實施例中，Trizol試劑(Life Technologies公司)提取人骨髓基質細胞總RNA作為模板，經過反轉錄后，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得人HuBMSC-MCP DNA作為插入片段。PCR反應參數為95℃ 15秒，58℃30秒，72℃ 45秒，20循環(huán)后72℃延伸10分鐘，
全長HuBMSC-MCP上游引物為5’-GCG GTA CCG ACT GAG TAC GGT CTT CTA A-3’(SEQ ID NO5)，下游引物為5’-CGG GAT CCC ATG GCG ACG GGC GGC CAG C-3’(SEQ ID NO6)，產物編碼全長HuBMSC-MCP蛋白。
PCR產物純化后經KpnI和BamHI酶切，并與pEGFP-N1載體(Clontech公司)按常規(guī)方法重組并轉化至感受態(tài)細菌DH5α。挑取白色克隆進行鑒定、純化并測序。經測序證實，已插入了所設計的HuBMSC-MCP編碼序列。
實施例6HuBMSC-MCP蛋白細胞內定位的免疫熒光分析以實施例5中所構建的HuBMSC-MCP全長融合表達載體質粒DNA利用LipofectAMINE試劑(Invitrogen)進行真核細胞293T的基因轉染。瞬時轉染細胞于轉染后48小時以胰酶消化，鋪于無菌蓋玻片上，在共聚焦顯微鏡下進行觀察。細胞器共定位檢測，待細胞貼壁后，先分別用線粒體、內質網和高爾基器、溶酶體特異性染料進行染色，濃度為1μM，37℃，15分鐘。用PBS洗后，共聚焦顯微鏡下進行觀察。
結果顯示HuBMSC-MCP轉染細胞的熒光信號均散在分布在胞漿內；細胞器共定位實驗結果提示，HuBMSC-MCP分布于線粒體內(圖5)。
實施例7人HuBMSC-MCP顯著增強DC的內吞活性收集體外培養(yǎng)5天的樹突狀細胞，用無血清的RPMI1640洗兩遍，并調細胞濃度至1×107cells/ml。取300μl細胞懸液與20μg體外轉錄的HuBMSC-MCP mRNA混合，加入0.2-cm的電擊杯中，用BTX ECM-830電穿孔儀，505V，99μs，2個電脈沖，中間間隔10sec。電穿孔后24h，取5×105DC與0.1mg/ml FITC-dextran分別在4℃或37℃共孵育60min。冰PBS洗后，流式細胞儀分析。
結果顯示，人HuBMSC-MCP轉染DC后，顯著增強DC的內吞活性(圖6的A和B分別為對照和轉染后的DC)。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>第二軍醫(yī)大學免疫學研究所<120>人骨髓基質細胞來源的線粒體轉運蛋白分子及其編碼序列和用途<130>037861<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1433<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(192)..(1154)<223>
<400>1ggcgccggcg gccacgccgc ggaaggcgcg ggccgagcag agccgggcgt tggagcccgc 60gcgcgcatgg aggcgttgcc ggcagccctc tgagggcagc ggggagacaa gacccggcga 120cctcgcgcat ccctcgagcc gccacgcgct ctcgccaccg ggcggcgacg ggccgcggag 180ccggcgcggc c atg gcg acg ggc ggc cag cag aag gag aac acg ctg ctt 230Met Ala Thr Gly Gly Gln Gln Lys Glu Asn Thr Leu Leu1 5 10cac ctc ttc gcc ggc ggg tgt gga ggc aca gtt ggt gct att ttc act278His Leu Phe Ala Gly Gly Cys Gly Gly Thr Val Gly Ala Ile Phe Thr15 20 25tgt cca cta gaa gtc att aag aca cgg ttg cag tct tca aga tta gct326Cys Pro Leu Glu Val Ile Lys Thr Arg Leu Gln Ser Ser Arg Leu Ala30 35 40 45ctc cgg aca gtc tac tat cct cag gtt cat ctg ggg acc att agt gga374Leu Arg Thr Val Tyr Tyr Pro Gln Val His Leu Gly Thr Ile Ser Gly50 55 60gct gga atg gtg aga cca aca tcc gtg aca cct gga ctc ttt cag gtt422Ala Gly Met Val Arg Pro Thr Ser Val Thr Pro Gly Leu Phe Gln Val65 70 75ctg aag tcg atc ttg gag aaa gag gga cca aag tca ctt ttt aga ggc470
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權利要求
1.一種分離的人HuBMSC-MCP多肽，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有增強樹突狀細胞內吞作用的功能的由(a)衍生的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中192-1154位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1433位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求6所述的載體。
8.一種人HuBMSC-MCP蛋白的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在表達條件下，培養(yǎng)權利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出人HuBMSC-MCP蛋白。
9.一種能與權利要求1所述的人HuBMSC-MCP多肽特異性結合的抗體。
10.一種組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權利要求1所述的多肽以及藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種人骨髓基質細胞來源的新型線粒體轉運蛋白分子(Bonemarrow stromal cell－derived mitochondria carrier protein，HuBMSC－MCP)。本發(fā)明提供編碼此蛋白分子的多核苷酸和經重組技術產生這種蛋白分子的方法。本發(fā)明還公開了編碼這種新型線粒體轉運蛋白分子的多核苷酸的用途。本發(fā)明還證實了HuBMSC－MCP可增強樹突狀細胞內吞作用。
文檔編號A61P29/00GK1631898SQ20031012265
公開日2005年6月29日 申請日期2003年12月24日 優(yōu)先權日2003年12月24日
發(fā)明者王寶梅, 李楠, 吳艷峰, 曹雪濤 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學