專利名稱：微粒體疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的以肽為基礎(chǔ)的疫苗，以及這種疫苗在人和動(dòng)物疾病(例如病毒感染和癌癥)的預(yù)防性和治療性療法中的用途。
背景技術(shù)：
大多數(shù)成功的疫苗以標(biāo)準(zhǔn)減毒的或滅活的病原體產(chǎn)生的中和抗體為基礎(chǔ)。然而，對(duì)于引起慢性炎癥的病原體，例如人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus，HIV)、丙肝病毒(hepatitis C virus，HCV)、分支桿菌(mycobacteria)和寄生蟲，或者在癌癥情況下，T-細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答是決定性的。主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)抗原呈遞和T-細(xì)胞免疫應(yīng)答的分子學(xué)認(rèn)識(shí)，引導(dǎo)了在開發(fā)疫苗的嘗試中應(yīng)用確定的抗原性肽加細(xì)胞因子(cytokine)和/或共激分子(co-stimulatorymolecule)。所有上述嘗試中的基本問題之一是難以構(gòu)建一個(gè)類似于體內(nèi)抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cells，APC)的定性和定量的抗原送遞系統(tǒng)(antigen delivery system)。
CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)識(shí)別抗原是與I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子裝配的小的抗原性肽。在APC的細(xì)胞溶膠中產(chǎn)生抗原性肽，并且隨后易位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)腔中(Rock，K.L.和Goldberg，A.L.Annu Rev Immunol 17，739-779(1999))。合成I類MHC重鏈并且使之插入到ER腔中，在ER腔中該重鏈與b2-微球蛋白(b2-microglobulin，b2M)形成二聚體(dimer)(Natarajan等，Rev Immunogenet 1，32-46(1999)；Pamer E和Cresswell P，Annu RevImmunol.16 323-358(1998))。該二聚體保留在ER中直到與合適的抗原性肽裝配。例如重鏈結(jié)合蛋白(heavy-chain binding protein，BIP)、鈣聯(lián)接蛋白(calnexin)、鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin)和Erp57這樣的陪伴分子(chaperone)催化I類MHC在ER中的二聚合過程以及與肽的裝配(Paulsson K和WangP.，Biocilitil Biophys Acta.1641(1)1-12(2003))。
裝配的I類MHC在APC(例如感染的或惡性細(xì)胞)的細(xì)胞表面上快速表達(dá)。T細(xì)胞受體對(duì)肽-I類MHC的識(shí)別導(dǎo)致CTL殺死表達(dá)感染抗原或腫瘤抗原的靶細(xì)胞。從病毒蛋白或癌蛋白鑒定CTL識(shí)別表位之后，設(shè)計(jì)合成的以肽為基礎(chǔ)的疫苗來激發(fā)T-細(xì)胞免疫性，成為預(yù)防或治療感染性和惡性疾病的有吸引力的途徑(Furman MH和Ploegh HL.，J Clin Invest.110(7)875-9(2002)；Berinstein N.Semin Oncol.30(3)(增刊8)，1-8(2003)；Falk等，Nature348，248-251，(1990)；Van Bleek GM和Nathenson SG.，Nature 348213-216(1990)；Kast，W M.和Melief，C.J.Immunol.Lett.30229-232(1991))。以所述送遞系統(tǒng)為基礎(chǔ)的肽疫苗有很多種不同形式。最簡(jiǎn)單的形式是溶解于水溶液中的肽。直接注射可溶性抗原性肽已表明不能成功刺激CTL應(yīng)答，因?yàn)樗鼈兛焖偕锝到饣蛘哒T導(dǎo)由不成熟APC的抗原刺激產(chǎn)生的T細(xì)胞無反應(yīng)性(Kyburz，D.等，Eur.J.Immunol.231956-1962(1993)；Toes，R.E等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93785 5-7860(1996)；Amoscato等，J.Immunol.161，4023-4032(1998))。據(jù)報(bào)道，使用合成的肽衍生疫苗的附帶的困難是CTL的誘導(dǎo)，雖然它們能殺死與肽外因脈沖的靶細(xì)胞，但是它們不能識(shí)別天然處理并呈遞肽表位的靶細(xì)胞(例如感染的或惡性細(xì)胞)(Dutoit，V.等，J.Clin.Invest.1101813-1822(2002))。
據(jù)報(bào)道，為了選擇正確的肽，在ER中定性控制I類MHC抗原呈遞。只有正確裝配的I類MHC能在APC表面上表達(dá)。佐劑的使用幾乎不能提高合成肽的呈遞質(zhì)量(Schijns，V E.2001.Crit.Rev.Immunol.2175-85(2001))。肽疫苗的改進(jìn)形式是構(gòu)建具有加載肽的重組I類MHC的人工脂膜(BenMohamed等，Lancet Infect Dis.2(7)，425-31(2002))。雖然脂質(zhì)體策略可在給患者注射之前，將結(jié)合肽的I類MHC抗原分子摻入在脂質(zhì)膜中，但是APC的ER中極復(fù)雜的加載系統(tǒng)不能單純地由重組I類MHC抗原、合成肽和脂質(zhì)體的簡(jiǎn)單混合物來仿效。只有少數(shù)幾種肽能與重組I類MHC在體外裝配(Ostergaard Pedersen L等，Eur J Immunol.31(10)，2986-96(2001)。
另外，插入的I類MHC的不正確取向以及缺乏共激分子使得它難以誘導(dǎo)有效免疫應(yīng)答。因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)的APC具有呈遞最佳抗原和引發(fā)天然T細(xì)胞引起的細(xì)胞免疫應(yīng)答的獨(dú)特能力，正在研發(fā)產(chǎn)生一種關(guān)鍵APC即自體固有樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)作為體外疫苗載體的策略(Banchereau，J.等，Annu.Rev.Immunol.18767-811(2000))。最初的研究表明，用作體內(nèi)疫苗的抗原性肽脈沖的DC能誘導(dǎo)CTL應(yīng)答(Tsai，V等，J.Immunol.1581796-1802(1997))。盡管多項(xiàng)人體臨床試驗(yàn)報(bào)道了肯定的證據(jù)，但是沒有生化證據(jù)表明所述脈沖的肽確實(shí)加載到表面I類MHC上，這質(zhì)疑了肽脈沖的APC誘導(dǎo)有效免疫應(yīng)答的功效。
因此，需要另一種可選的疫苗制劑，既能克服上述問題，又能提供常規(guī)疫苗的治療有效性。所述疫苗應(yīng)該實(shí)現(xiàn)APC細(xì)胞的內(nèi)源呈遞抗原(endogenous presented antigen)的質(zhì)量，同時(shí)保持高效并避免副作用。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種疫苗組合物，該疫苗組合物包括分離自動(dòng)物細(xì)胞的翻轉(zhuǎn)的微粒體(inverted microsomes)，或者其膜片段，所述微粒體或其膜片段與外部暴露的肽抗原和主要組織相容性復(fù)合體(MHC)蛋白相結(jié)合。
本發(fā)明的微粒體來自動(dòng)物細(xì)胞，因此可以產(chǎn)生自在真核細(xì)胞中存在的下列區(qū)室(compartment)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、核內(nèi)體或內(nèi)吞作用途徑(endocyticpathway)的成分。
用微粒體或其片段的膜中已經(jīng)存在的MHC蛋白可以分離微粒體?？蛇x地，MHC蛋白隨后可以被導(dǎo)入微粒體或片段中。得自ER的微粒體包括I類和II類MHC分子(Bryant等，Adv Immunol.80，71-114(2002))。
本發(fā)明對(duì)于I類MHC限制性抗原性肽以及II類MHC分子同樣適用。所述組合物中的MHC蛋白就獲得微粒體的細(xì)胞來說，可以是異種來源。
主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的基因簇編碼MHC家族蛋白。MHC分子在所有較高等的脊椎動(dòng)物細(xì)胞上表達(dá)。所述MHC分子首先在小鼠中得以證實(shí)并被稱作H-2抗原(組織相容性-2抗原)。在人體中它們叫做人白細(xì)胞相關(guān)抗原(human-leucocyte-associated antigen，HLA抗原)，因?yàn)樗鼈兪紫仍诎准?xì)胞(血白細(xì)胞)上得到證實(shí)。I類和II類MHC分子是已知的最多形的蛋白質(zhì)，它們個(gè)體彼此之間表現(xiàn)出最大的遺傳變異性，并且它們?cè)诜謩e向細(xì)胞毒性T細(xì)胞和輔助T細(xì)胞呈遞外來蛋白抗原中起著關(guān)鍵作用。I類分子在幾乎所有脊椎動(dòng)物細(xì)胞上表達(dá)，而II類分子限于與輔助T細(xì)胞相互作用的幾種細(xì)胞類型，例如B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。兩類MHC分子都具有免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域和單一的肽結(jié)合溝，該結(jié)合溝結(jié)合從外來蛋白衍生的小的肽片段。每個(gè)MHC分子能結(jié)合一組大的特征性肽，所述肽由蛋白細(xì)胞內(nèi)降解產(chǎn)生。肽MHC復(fù)合體在靶細(xì)胞內(nèi)部形成之后，被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面，在那里它們被T細(xì)胞受體識(shí)別。T細(xì)胞除了表達(dá)識(shí)別靶細(xì)胞表面上肽MHC復(fù)合體的抗原特異性受體之外，還表達(dá)CD4或CD8共同受體，所述共同受體識(shí)別靶細(xì)胞上MHC分子的非多形區(qū)輔助細(xì)胞表達(dá)識(shí)別II類MHC分子的CD4，而細(xì)胞毒性T細(xì)胞表達(dá)識(shí)別I類MHC分子的CD8。(Alberts等，″MolecularBiology of the Cell″，第三版，1229-1235(1994))。
I類MHC由重鏈和β-2-微球蛋白構(gòu)成。人I類MHC重鏈由稱作HLAA、B、C的三種不同的基因座編碼。它們與稱作β-2-微球蛋白的小蛋白非共價(jià)結(jié)合。人I類MHC蛋白的例子是I類HLA組織相容性抗原，如圖13所示的A-2α鏈前體(I類MHC抗原A*2)(數(shù)據(jù)庫登記號(hào)No.P01892)；或I類HLA組織相容性抗原，如圖13所示的B-7α鏈前體(I類MHC抗原B*7)(數(shù)據(jù)庫登記號(hào)No.P01889)。
II類MHC由兩條非共價(jià)鍵合的鏈α鏈和β鏈構(gòu)成。兩條鏈均由I-區(qū)相關(guān)(I-region associated，Ia)抗原中的基因編碼。所述蛋白的例子是II類HLA組織相容性抗原，如圖14所示的DRB3-1β鏈前體(I類MHC抗原DRB3*1)(數(shù)據(jù)庫登記號(hào)No.P79483)；和II類MHC組織相容性抗原HLA-DQα1(DQw4特異性)前體，也在圖14中給出(數(shù)據(jù)庫登記號(hào)A37044)。
I和II類MHC cDNAs和基因組DNAs的序列為公開且可獲得的(www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)。
所有真核細(xì)胞都具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)。所述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜一般構(gòu)成普通動(dòng)物細(xì)胞全部膜的一半以上。它組織成分枝小管的網(wǎng)狀迷路與擴(kuò)展貫穿細(xì)胞溶膠的平囊。認(rèn)為所述小管和囊是相互連接的，使得ER膜形成包封單一內(nèi)部空間的連續(xù)片狀結(jié)構(gòu)。這種高度復(fù)雜的空間稱作ER腔或ER池腔，并且它經(jīng)常占據(jù)細(xì)胞總體積的10％以上。ER膜將ER腔與細(xì)胞溶膠分開，并且介導(dǎo)這兩個(gè)區(qū)室之間的選擇性分子轉(zhuǎn)移。
ER在脂質(zhì)和蛋白的生物合成中起核心作用。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞器來說，ER的膜是產(chǎn)生所有跨膜蛋白和脂質(zhì)的部位，所述細(xì)胞器包括ER本身、高爾基體、溶酶體、核內(nèi)體、分泌小泡和質(zhì)膜。ER膜還通過產(chǎn)生大部分脂質(zhì)而對(duì)線粒體和過氧化物酶體膜有主要貢獻(xiàn)。另外，幾乎所有分泌到細(xì)胞外的蛋白以及那些最終會(huì)被遞送到ER、高爾基體或溶酶體腔的蛋白最初被送遞到ER腔(Alberts等，″Molecular Biology of the Cell″，第三版，577-595(1994))。
溶酶體是一種特定的細(xì)胞器，該細(xì)胞器包括特定的酶，該酶用于降解必須被破壞的內(nèi)源細(xì)胞蛋白，或者用于破壞免疫系統(tǒng)所靶向的需加以破壞的外源蛋白或寄生物。
核內(nèi)體是形成細(xì)胞中部分胞吞途徑的細(xì)胞器。存在由細(xì)胞表面向核內(nèi)體或向溶酶體流動(dòng)的胞吞小泡的恒流。通過外質(zhì)膜的“出芽”過程(稱作“內(nèi)陷”)形成小泡，或者小泡能從它們最后回流到的內(nèi)細(xì)胞器形成。胞吞作用是細(xì)胞將有或沒有結(jié)合配體的外部細(xì)胞受體內(nèi)在化的過程，還是細(xì)胞從它的外部環(huán)境取樣的一條途徑。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可以選擇性地用合適的佐劑(adjuvant)和/或促進(jìn)T-細(xì)胞應(yīng)答的細(xì)胞因子配制成制劑，所述細(xì)胞因子如干擾素或白介素、其它促進(jìn)T-細(xì)胞應(yīng)答的細(xì)胞因子，所述白介素或干擾素如白介素-2(IL-2)、白介素-15(IL-15)、白介素-6(IL-6)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素γ(IFNγ)。所述適合的佐劑為常規(guī)的佐劑。給藥之前，上述物質(zhì)能適當(dāng)?shù)嘏c加載抗原的微粒體混合，或者可以適當(dāng)?shù)刂瞥膳c膜結(jié)合的微粒體的成分。
在本發(fā)明上下文中微粒體是通過主要組織相容性復(fù)合體(MHC)方式呈遞抗原性肽的任何動(dòng)物細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)、溶酶體或核內(nèi)體區(qū)室的細(xì)胞游離膜小泡。ER衍生微粒體的定義以所謂“ER-標(biāo)記(ER-marker)”的存在為基礎(chǔ)，所述“ER-標(biāo)記”是一般在ER中存在的蛋白，例如BIP、p58、鈣聯(lián)接蛋白、鈣網(wǎng)蛋白、TAP相關(guān)蛋白(TAP-associated golycoprotein，tapasin)。溶酶體衍生微粒體的定義以特異性標(biāo)記LAMP1和/或LAMP2的存在為基礎(chǔ)。通過在從動(dòng)物細(xì)胞制備之后在電子顯微鏡下所觀察到的微粒體的形態(tài)識(shí)別它們。
通過任何常規(guī)方法均能分離本發(fā)明組合物中含有的微粒體。合適的方法包括Saraste等和/或Knipe等(Saraste等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83，6425-6429(1986)和Knipe等，J.Virol.21，1128-1139(1977))的方法。上述方法包括細(xì)胞或組織的勻漿，接著通過以7500轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)離心10分鐘分離細(xì)胞核，然后通過以15500rpm離心54分鐘回收“粗”微粒體?！按帧蔽⒘ｓw是粘附有核糖體的微粒體。然后通過蔗糖墊以110000重力加速度單位(g)差速離心(differential centrifugation)60分鐘進(jìn)一步純化重新懸浮的“粗”微粒體。以37000rpm進(jìn)一步蔗糖梯度離心10小時(shí)以將粗微粒體精細(xì)分級(jí)分離(達(dá)到等密度條件(isopyknic condition))，并且通過使用合適的抗體，例如抗-p58抗體，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)測(cè)定含有ER的級(jí)分。
翻轉(zhuǎn)的微粒體是進(jìn)一步加工的結(jié)果，例如對(duì)分離的微粒體反復(fù)的冷凍-融化處理步驟，引起微粒體的外膜的破壞和再形成，使得所述膜的“內(nèi)”面存在于翻轉(zhuǎn)的微粒體的“外側(cè)”上。因此經(jīng)過上述處理得到的微粒體被描述為是“膜內(nèi)側(cè)翻外的(inside-out)”或“翻轉(zhuǎn)的(inverted)”微粒體。制備“膜內(nèi)側(cè)翻外的”或翻轉(zhuǎn)的微粒體的方法使普通微粒體制備物中可見的腔結(jié)構(gòu)(lumen structure)不存在。
在根據(jù)本發(fā)明的組合物中，微粒體可以包括其膜片段。適當(dāng)?shù)?，所述膜片段可以通過包括使用洗滌劑(detergent)或反復(fù)冷凍融化或超聲處理來破碎微粒體結(jié)構(gòu)的方法來制備。類似地還可以加載肽抗原來形成本發(fā)明的組合物。優(yōu)選地，所述膜片段得自帶有對(duì)ER或者對(duì)溶酶體特異性標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)膜。
在本發(fā)明的疫苗組合物中，還可以有一定百分比的非翻轉(zhuǎn)(non-inverted)結(jié)構(gòu)的微粒體，所述非翻轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)即在標(biāo)準(zhǔn)微粒體制備之后原位排列(in situarrangement)的膜取向與微粒體制備之前ER、核內(nèi)體或溶酶體腔的“向內(nèi)”一致。但是，本發(fā)明組合物中至少大約75％至大約95％，合適地至少大約90％的微粒體具有與原位微粒體取向相反的膜取向，因此描述為是“膜內(nèi)側(cè)翻外的”或翻轉(zhuǎn)的微粒體。所述組合物可以因此另外含有一定比例的非翻轉(zhuǎn)的微粒體。
在本發(fā)明的其他具體實(shí)施方式
中，組合物可以是更一致的，并且可以包括至少大約95％、96％、97％、98％、99％或100％的微粒體，所述微粒體與從沒有進(jìn)行進(jìn)一步處理細(xì)胞制備的微粒體相比具有翻轉(zhuǎn)的或反向的(或“膜內(nèi)側(cè)翻外的”)膜取向。
微粒體可以首先加載抗原，然后進(jìn)行進(jìn)一步處理，以提供翻轉(zhuǎn)的或“膜內(nèi)側(cè)翻外的”微粒體，這樣暴露ER膜的內(nèi)表面；或者能從細(xì)胞源制備微粒體，所述細(xì)胞源的微粒體中已經(jīng)存在優(yōu)選的抗原肽；或者可以對(duì)微粒體處理以首先提供翻轉(zhuǎn)的或“膜內(nèi)側(cè)翻外的”的微粒體，然后隨后加載抗原。
通過同等程序可以制備溶酶體和核內(nèi)體。從動(dòng)物細(xì)胞的胞吞區(qū)室純化來的溶酶體微粒體包括溶酶體和核內(nèi)體兩者。在制備ER衍生微粒體的純化程序中分級(jí)分離總的細(xì)胞膜之后，溶酶體膜通過抗該膜的標(biāo)記LAMP1和LAMP2的抗體分辨。
然后處理純化的溶酶體微粒體，得到如上所述的翻轉(zhuǎn)的或“膜內(nèi)側(cè)翻外的”微粒體或膜片段，如果需要，然后可以在酸性條件下加載MHC限制的肽，例如在pH值小于3，優(yōu)選3至3，適當(dāng)?shù)卦诖蠹s2.5的條件下。
要從中制備分離的微粒體總體的動(dòng)物細(xì)胞可以是具有細(xì)胞表達(dá)的MHC分子的任何一般常見的細(xì)胞類型。例如，血液的細(xì)胞或免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，如B-細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，所謂抗原呈遞細(xì)胞(APCs)。但是，還可以使用來自如肝、腎、肺、腦、心、皮膚、骨髓、胰等這樣的組織的細(xì)胞類型。
所述細(xì)胞可以是人或非人動(dòng)物的。適當(dāng)?shù)兀瑒?dòng)物是哺乳動(dòng)物。動(dòng)物可以是嚙齒動(dòng)物物種，例如小鼠、大鼠或天竺鼠(guinea pig)，或者其它物種，例如兔，或者犬或貓科動(dòng)物，或者蹄類物種，例如綿羊、豬、馬、山羊、牛，或非哺乳動(dòng)物物種，例如鳥類(例如家禽，例如雞或火雞)。
從中制備微粒體的細(xì)胞可以是培養(yǎng)的細(xì)胞系。所述細(xì)胞系可以是永生細(xì)胞系。細(xì)胞系可以基本上從非胚胎組織來源產(chǎn)生。
在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式
中，細(xì)胞來源可以是遺傳工程修飾的動(dòng)物細(xì)胞來源，例如細(xì)胞系，或者轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。所述從中制備微粒體的細(xì)胞或組織可以是來自轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的人源化動(dòng)物組織或細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的基因組已經(jīng)通過插入一個(gè)或多個(gè)人類基因而得到修飾。
在與從轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系制備的微粒體有關(guān)的本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，所述轉(zhuǎn)基因是導(dǎo)入另外的一個(gè)或幾個(gè)基因或者一個(gè)或幾個(gè)編碼蛋白的核酸序列。轉(zhuǎn)基因可以是異源基因或同源基因的另外的拷貝，所述轉(zhuǎn)基因選擇性地在組成型啟動(dòng)子或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制之下。轉(zhuǎn)基因可以是細(xì)胞或細(xì)胞系的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，或者是細(xì)胞或細(xì)胞系中的附加型表達(dá)系統(tǒng)(episomal expression system)。
但是，在人用醫(yī)藥領(lǐng)域，預(yù)期發(fā)現(xiàn)本發(fā)明這方面的組合物作為疫苗的最大應(yīng)用。因此，優(yōu)選的是從中制備微粒體的細(xì)胞來源具有與當(dāng)用作疫苗時(shí)與組合物接受者的MHC相匹配的MHC同種異型位(allotope)。
在根據(jù)本發(fā)明這方面的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，從中制備微粒體的細(xì)胞來源可以是當(dāng)用作疫苗時(shí)的組合物的最終接受者。
或者，人細(xì)胞的合適的來源可以來自細(xì)胞系，例如得自非胚胎的細(xì)胞系，適當(dāng)?shù)厥荁-細(xì)胞系，例如細(xì)胞系221。這樣的細(xì)胞系還可以有益地不表達(dá)I類和/或II類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的蛋白。本發(fā)明的這個(gè)具體實(shí)施方式
可以是商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)疫苗的更優(yōu)選的實(shí)施方案，其中從用不同的MHC同種異型位工程化的所述細(xì)胞系制備非個(gè)體疫苗(non-individualvaccine)。
細(xì)胞系221為上述MHC陰性細(xì)胞系的例子。所述細(xì)胞中不存在天然I類MHC表達(dá)，允許對(duì)細(xì)胞系的修飾以表達(dá)任何期望的基因型的I類MHC。這在實(shí)現(xiàn)疫苗組合物的完全免疫作用中是特別重要的，因?yàn)椴煌娜巳罕磉_(dá)不同的MHC蛋白。在本發(fā)明所述組合物中，MHC蛋白就從中獲得微粒體的細(xì)胞來說是異源的。
20％以上的人群表達(dá)一些I類MHC，如HLAA2。在使用MHC陰性細(xì)胞系的情況下，利用常規(guī)基因轉(zhuǎn)移方法，將一個(gè)或多個(gè)相匹配的MHC基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞系中，并且將轉(zhuǎn)基因構(gòu)建到表達(dá)載體中。表達(dá)構(gòu)建體的表達(dá)盒一般包括標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)子，例如細(xì)胞巨化病毒(CMV)啟動(dòng)子、或延伸因子I啟動(dòng)子或肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，插入的轉(zhuǎn)基因和多腺苷酸化信號(hào)(poly-Asignal)，以實(shí)現(xiàn)最優(yōu)的表達(dá)。轉(zhuǎn)染之前，從質(zhì)粒主鏈分離表達(dá)盒，避免在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)細(xì)菌質(zhì)?；?。I類和II類MHC cDNAs和基因組DNA的序列是公開的和可獲得的(www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)。通過使用I類MHC陰性或選擇的MHC類陽性細(xì)胞系可以構(gòu)建I類MHC轉(zhuǎn)染子庫(MHCclass I transfectants Bank)，來分別轉(zhuǎn)染大多數(shù)I類MHC基因。表達(dá)盒的選擇依賴轉(zhuǎn)基因的最佳表達(dá)。
利用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)抗原呈遞細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，例如使用合適的包括編碼感興趣MHC蛋白的核酸序列的載體。術(shù)語“載體”一般指任何核酸載體，可以是RNA，DNA或cDNA?；蛘咻d體可以描述為“表達(dá)載體”。
術(shù)語“載體”或“表達(dá)載體”其中可以包括染色體載體、附加型載體和來自病毒的載體，例如，來自細(xì)菌質(zhì)粒的載體，來自噬菌體的載體，來自轉(zhuǎn)座子的載體，來自酵母游離基因(yeast episome)的載體，來自插入元件(insertion element)的載體，來自酵母染色體元件(yeast chromosomalelement)的載體，來自病毒例如桿狀病毒、乳多空病毒如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體，以及來自它們的組合的載體，例如來自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件如粘粒和噬粒的載體。一般情況下，適合保持、繁殖或表達(dá)在宿主中表達(dá)多肽的核酸的任何載體可以被用于就這方面的表達(dá)。從細(xì)菌質(zhì)粒，例如細(xì)菌質(zhì)粒pUC18，可以構(gòu)建載體。
提供載體用于特異性表達(dá)。所述特異性表達(dá)可以是可誘導(dǎo)表達(dá)或者只在特定細(xì)胞類型中表達(dá)的表達(dá)，或者是可誘導(dǎo)和細(xì)胞特異性表達(dá)?？烧T導(dǎo)載體中優(yōu)選的是通過易于操作的周圍因素例如溫度、營(yíng)養(yǎng)添加劑、低氧和/或細(xì)胞因子或其它生物活性因子的存在誘導(dǎo)表達(dá)的載體。特別優(yōu)選的可誘導(dǎo)載體是化學(xué)品(例如化學(xué)添加劑象抗生素)的水平變化誘導(dǎo)表達(dá)的載體。適合在本發(fā)明中使用的各種載體，包括用于原核和真核宿主的組成型和可誘導(dǎo)表達(dá)載體是公知的并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的。
重組表達(dá)載體包括，例如復(fù)制起點(diǎn)、優(yōu)選來自高表達(dá)基因的啟動(dòng)子定向轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)序列和選擇性標(biāo)記，所述選擇性標(biāo)記允許在暴露給載體之后分離包括該載體的細(xì)胞。
哺乳動(dòng)物表達(dá)載體可以包括復(fù)制起點(diǎn)、合適的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，還可以包括任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)、剪接供體和受體位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列和表達(dá)必需的5′-側(cè)非轉(zhuǎn)錄序列。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體可以沒有增強(qiáng)子元件。
啟動(dòng)子序列可以是任何合適的已知的啟動(dòng)子，例如人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、CMV即時(shí)早期啟動(dòng)子、單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子或逆轉(zhuǎn)錄病毒(long terminalrepeat，LTR)啟動(dòng)子(promoters of retroviral LTR′s)(例如勞斯肉瘤病毒(“RSV”)的啟動(dòng)子)和金屬硫蛋白啟動(dòng)子(如小鼠金屬硫蛋白-I啟動(dòng)子)。啟動(dòng)子可以包括啟動(dòng)子活性所需要的最小序列(例如沒有增強(qiáng)子元件的TATA盒)，例如，CMV啟動(dòng)子的最小序列(mCMV)。優(yōu)選地，啟動(dòng)子是在沒有增強(qiáng)子元件的低基礎(chǔ)水平下能發(fā)揮功能的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子。
優(yōu)選地，啟動(dòng)子與編碼要轉(zhuǎn)染到抗原呈遞細(xì)胞中的MHC蛋白的核酸序列鄰近。包括這里描述的啟動(dòng)子的變體，例如同源或直向同源物(orthologues)，是本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明第一方面的表達(dá)載體的主鏈可以從沒有其自身啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件的載體如質(zhì)粒載體pGL2衍生。增強(qiáng)子能結(jié)合通過DNA折疊位于幾千堿基的啟動(dòng)子區(qū)(Rippe等，TIBS 1995；20500-506(1995))。
表達(dá)載體還可以包括能使載體繁殖的可選擇標(biāo)記，例如抗生素抗性。
包含編碼要轉(zhuǎn)染的MHC蛋白的核酸的載體的核酸序列可以編碼如上所述的報(bào)告蛋白(reporter protein)，例如氯霉素?；D(zhuǎn)移酶(“chloramphenicolacetyl transferase，CAT”)轉(zhuǎn)錄單元，熒光素酶(luciferase)或綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)。報(bào)告基因的應(yīng)用涉及上述基因的表型，這能在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中檢測(cè)到并且用于，例如，分析基因表達(dá)的誘導(dǎo)和/或抑制。在研究基因調(diào)控中使用的報(bào)告基因包括其他公知的報(bào)告基因，如編碼通過生物發(fā)光測(cè)試能檢測(cè)的熒光素酶的lux基因，編碼通過組織化學(xué)分析能檢測(cè)的β-葡萄醛酸糖苷酶的uidA基因，編碼通過組織化學(xué)分析能檢測(cè)的β-半乳糖苷酶的lacZ基因，編碼通過UV光，UV顯微鏡檢查或通過螢光輔助細(xì)胞篩選分析(fluorescence assisted cell sorting，F(xiàn)ACS)能檢測(cè)的增強(qiáng)的綠色熒光蛋白的基因。
包括MHC蛋白的核酸序列的DNA可以是單鏈或雙鏈。單鏈DNA可以是編碼或有義鏈，或者它可以是非編碼或反義鏈。為了治療用途，核酸序列是能在要治療的受治療者中表達(dá)的形式。
載體中的終止序列可以是編碼聚腺苷酸化信號(hào)的腺苷酸化核苷酸的序列。一般地，聚腺苷酸化信號(hào)在要治療的受治療者中是可識(shí)別的，例如用于治療人的來自病毒(如SV40病毒)的相應(yīng)序列。其他終止信號(hào)是本領(lǐng)域公知并可以使用的。
優(yōu)選地，聚腺苷酸化信號(hào)是RNA轉(zhuǎn)錄的雙向終止子。終止信號(hào)可以是猿猴病毒40(simian 40 virus，SV40)的聚腺苷酸化信號(hào)，例如SV40晚期聚(A)?；蛘呓K止序列可以是當(dāng)與CMV啟動(dòng)子結(jié)合時(shí)導(dǎo)致最大表達(dá)的牛生長(zhǎng)激素(bovine growth hormone)的聚腺苷酸化信號(hào)(Yew等，Human GeneTherapy，8575-584(1997))。
另外，表達(dá)載體可以包括另一個(gè)聚腺苷酸化序列，例如SV40早期聚(A)。這樣的另一個(gè)聚(A)可以位于編碼MHC蛋白的核酸序列的上游，減少可能在載體中開始的隱蔽轉(zhuǎn)錄(cryptic transcription)，從而保證載體的基礎(chǔ)基因表達(dá)最小化。
整合病毒基因組的基因表達(dá)可能對(duì)染色體位置效應(yīng)(chromosomalpositional effect)易感。上述效應(yīng)包括轉(zhuǎn)錄沉默(transcriptional silencing)和附近異源增強(qiáng)子帶來的啟動(dòng)子激活。另外，整合的序列能激活附近基因和致癌基因的表達(dá)。通過使用形成插入病毒基因組的邊界元件，減小上述作用。絕緣子(Insulator)如雞β-珠蛋白5′DNase I高敏度位點(diǎn)(5′HS4)為遺傳元件，該元件標(biāo)記位于開放染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域和組成型縮合染色質(zhì)的區(qū)之間的邊界。
稱為支架結(jié)構(gòu)或基質(zhì)附著區(qū)(scaffold or matrix attachment region，S/MAR)的其他元件使染色質(zhì)錨定于核結(jié)構(gòu)并且形成染色體環(huán)，所述染色體環(huán)結(jié)構(gòu)具有使遠(yuǎn)處調(diào)控元件接近相應(yīng)啟動(dòng)子的生理作用。實(shí)例位于人干擾素-γ基因座并且稱作IFN-SAR。絕緣子和S/MAR兩者都能減小位置效應(yīng)，當(dāng)它們與lentiviral載體結(jié)合時(shí)表現(xiàn)出最大活性(Ramezani等，Blood 1014717-24，(2003))。顯而易見，所述元件在整合到宿主細(xì)胞基因組中之后，對(duì)調(diào)控的載體如這里所述的載體有益。
本發(fā)明的組合物包括微粒體，或其片段，所述微粒體或其片段與加載到微粒體中的外部暴露的肽抗原相結(jié)合。所述結(jié)合可以是這樣的，使肽抗原插入到微粒體的膜中；相對(duì)于微粒體的外膜，肽抗原的至少一個(gè)表位暴露。為了使抗原被免疫系統(tǒng)識(shí)別，微粒體的膜還包括對(duì)T-細(xì)胞呈遞肽抗原的MHC蛋白。MHC蛋白在產(chǎn)生微粒體的細(xì)胞的細(xì)胞器中天然存在，或者M(jìn)HC蛋白在制備微粒體之前通過重組DNA技術(shù)被轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中表達(dá)。插入的抗原性肽和MHC蛋白在微粒體的膜中形成結(jié)合體，使得蛋白外露與免疫系統(tǒng)的細(xì)胞相互作用。
在核苷三磷酸(NTP)(例如腺苷三磷酸(ATP))和NTP再生系統(tǒng)存在下通過孵育微粒體和肽抗原，可以將抗原性肽導(dǎo)入或加載到微粒體中。顯然，NTP，例如ATP，有利于肽抗原通過位于微粒體膜中的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(proteintransporter)摻入到微粒體。不必要受到理論束縛，即可看出一旦在NTP存在下孵育微粒體與肽抗原，抗原就能與已經(jīng)在微粒體膜中存在的I類MHC蛋白結(jié)合。可選地，在從里面翻到外面處理之后也可以將抗原性肽加載到微粒體中，在這種情況下不需要NTP。
與微粒體結(jié)合存在的抗原性肽適當(dāng)?shù)鼐哂幸粋€(gè)或幾個(gè)表位。表位是免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn)可識(shí)別的抗原的最小部分，并且可以是線性或不連續(xù)的。因此，MHC結(jié)合肽的任何類型，天然的或合成的或人工修飾的都包括在內(nèi)。
抗原性肽可以來自外部來源即非自身的，或者自身的即自身抗原(autoantigen)。外來抗原性肽可以源自病毒、細(xì)菌、酵母、真菌、原生動(dòng)物或其它微生物(即傳染性物質(zhì))，或者高級(jí)生命形式，例如植物或動(dòng)物。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式
中，抗原可以是自身抗原，例如由贅生性細(xì)胞(neoplastic cell)或癌細(xì)胞表達(dá)的抗原，正常自身蛋白(本發(fā)明用于自身免疫失調(diào)的耐受(tolerising)疫苗情況下)。
抗原來自贅生性細(xì)胞或癌細(xì)胞的情況下，細(xì)胞可以來自黑素瘤、肺腺癌、結(jié)腸癌、乳癌或白血病細(xì)胞。自身免疫疾病包括但不限于多發(fā)性硬化(MS)、全身紅斑狼瘡、1-型或胰島素依賴型糖尿病、抗磷脂綜合征、重癥肌無力、肌炎、斯耶格倫氏綜合征(Sjogren’s Syndrome)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式
中，優(yōu)選制備具有一種以上類型的抗原性肽，或者具有經(jīng)修飾以提高免疫原性序列的抗原性肽的組合物。在制備微粒體之前，也可以用一種以上類型的MHC分子轉(zhuǎn)染細(xì)胞。所述一種以上類型的MHC分子用作具有一種以上類型MHC同種異型位的疫苗時(shí)，在組合物接受者情況下有用。
在本發(fā)明該方面的優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，提供了如上定義的組合物，其中微粒體中抗原與MHC分子的比例對(duì)于特異性免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)是最佳的，例如在0.1至1.5范圍內(nèi)，優(yōu)選從0.2至1.2或0.5至1.0，最優(yōu)選0.2-0.5至1.0。加載的抗原性肽的量可以根據(jù)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的水平而不同。
定義的主要疾病的抗原性肽能容易地從科學(xué)文獻(xiàn)中選擇或者通過生物信息方法鑒定(Renkvist等，Cancer Immunol Immunother 50，3-15(2001)；Coulie等，Immunol Rev 188，33-42(2002)；De Groot等，Vaccine 19(31)，4385-95(2001))。
例如，流感病毒產(chǎn)生的肽SIINFEKL和ASNENMETM，或來自黑素瘤細(xì)胞的肽YLQLVFGIEV。
表1給出I類HLA限制性癌/睪丸抗原的詳細(xì)信息；表2給出I類HLA限制性黑素細(xì)胞分化抗原；表3給出I類HLA限制性廣泛表達(dá)抗原；表4給出I類HLA限制性腫瘤特異抗原；表5給出II類HLA限制性抗原；表6給出融合蛋白衍生表位；以及表7給出給定HLA等位基因識(shí)別的表位頻數(shù)。
其他實(shí)例為表8中選自Anthony等Clinical Immunol.，vol.103，第264-276頁(2002)的丙肝病毒(HCV)肽；表9中選自Kaul等J.Clinical Invest.，vol.107，第1303-1310頁(2001)的人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)；表10中選自Koziel等，J.Virol.，vol.67，第7522-7532頁(1993)的丙肝病毒(HCV)肽；和表11中選自He等PNAS USA，vol.96，第5692-5697頁(1999)的丙肝病毒(HCV)肽。
抗原性肽表位可以作為單體或表位的重復(fù)序列而存在，例如二聚體、三聚體、四聚體、或更高的聚體如五聚體、六聚體、七聚體、八聚體、九聚體或十聚體?？梢允褂帽砦恍蛄械钠?，以及包括表位序列的重疊序列(overlapping sequence)。
除非上下文另有具體說明，術(shù)語“肽”包括多肽和蛋白兩者。
上述肽包括類似物、同系物、同源物、同工型、衍生物、融合蛋白和具有相似結(jié)構(gòu)的蛋白，或者是這里定義的相關(guān)多肽。
這里使用的術(shù)語“類似物”指和這里描述的蛋白序列有相似或相同功能的肽，但是不必包括與所述氨基酸序列相似或相同的氨基酸序列或者具有與這里描述的蛋白的結(jié)構(gòu)相似或相同的結(jié)構(gòu)。肽的氨基酸序列如果滿足下面標(biāo)準(zhǔn)中的至少一項(xiàng)，則與這里描述的肽的氨基酸序列“類似”(a)具有與這里描述的肽的氨基酸序列至少30％(更優(yōu)選地，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少99％)相同的氨基酸序列的肽；(b)由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼這里描述的肽序列的至少5個(gè)氨基酸殘基(更優(yōu)選地，至少10個(gè)氨基酸殘基，至少15個(gè)氨基酸殘基，至少20個(gè)氨基酸殘基，至少25個(gè)氨基酸殘基，至少40個(gè)氨基酸殘基，至少50個(gè)氨基酸殘基，至少60個(gè)氨基酸殘基，至少70個(gè)氨基酸殘基，至少80個(gè)氨基酸殘基，至少90個(gè)氨基酸殘基，至少100個(gè)氨基酸殘基，至少125個(gè)氨基酸殘基，或至少150個(gè)氨基酸殘基)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列所編碼的肽；或者(c)由與編碼這里描述的肽的核苷酸序列至少30％(更優(yōu)選地，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少99％)相同的核苷酸序列所編碼的肽。
雜交的嚴(yán)謹(jǐn)條件特征是低鹽濃度或高溫條件。例如，高嚴(yán)謹(jǐn)條件定義為在0.5M的NaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM的乙二酸四乙酸二鈉(EDTA)條件下和與固相載體結(jié)合的DNA雜交，并且用0.1×SSC/0.1％SDS在68℃下洗滌(Ausubel等編著，″Current Protocols in Molecular Biology″l，第2.10.3頁，Green Publishing Associates出版，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.，New York，(1989))。在一些情況下低嚴(yán)謹(jǐn)條件可能是必需的。根據(jù)本發(fā)明中使用的，中等嚴(yán)謹(jǐn)程度定義為包括在42℃下在0.2×SSC/0.1％SDS中洗滌(Ausubel等(1989)上文)。通過加入漸增量的甲酰胺使雜交核酸雙螺旋不穩(wěn)定，使之也能進(jìn)行更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交。這樣容易利用特定雜交條件，并且一般根據(jù)期望的結(jié)果來選擇。一般情況下，對(duì)于與靶DNA 95至100％同源性的探針，在50％甲酰胺存在下的常規(guī)雜交溫度是42℃，對(duì)于90至95％同源性的是37℃，對(duì)于70至90％同源性的是32℃。
與這里所描述的肽有“類似結(jié)構(gòu)”的肽指，和這里描述的肽的結(jié)構(gòu)有類似的二級(jí)、三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)的肽。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法能測(cè)定肽的結(jié)構(gòu)，所述方法包括但不限于X-射線結(jié)晶法(X-ray crystallography)、核磁共振法(nuclear magnetic resonance)和晶體電子顯微法(crystallographicelectron microscopy)。
這里使用的術(shù)語“融合蛋白”指包括(i)這里描述的肽或其片段、相關(guān)肽或其片段的氨基酸序列和(ii)異源肽的氨基酸序列(即不是這里描述的肽序列)的肽。
這里使用的術(shù)語“同系物(homologue)”指包含與這里描述的肽的序列相似的氨基酸序列但是不必具有相似或相同功能的肽。
這里使用的術(shù)語“同源物(orthologue)”指(i)包含與這里描述的肽的序列相似的氨基酸序列和(ii)具有相似或相同功能的非人類肽(non-humanpeptide)。
這里使用的術(shù)語“相關(guān)的肽”指這里描述的肽的同系物、類似物、同工型(isoform)、同源物，或它們的任何組合。
這里使用的術(shù)語“衍生物”指包括通過導(dǎo)入氨基酸殘基取代、缺失或添加而改變的上述肽的氨基酸序列的肽。衍生肽具有與這里描述的肽相似或相同的功能。
這里使用的術(shù)語“片段”指包括與這里描述的肽的氨基酸序列的至少5個(gè)氨基酸殘基(優(yōu)選地，至少10個(gè)氨基酸殘基、至少15個(gè)氨基酸殘基、至少20個(gè)氨基酸殘基、至少25個(gè)氨基酸殘基、至少40個(gè)氨基酸殘基、至少50個(gè)氨基酸殘基、至少60個(gè)氨基酸殘基、至少70個(gè)氨基酸殘基、至少80個(gè)氨基酸殘基、至少90個(gè)氨基酸殘基、至少100個(gè)氨基酸殘基)的氨基酸序列的肽，細(xì)節(jié)上做必要的修改(mutatis mutandis)。所述肽的片段可能具有或不具有該肽的功能活性。
這里使用的術(shù)語“同工型(isoform)”指由相同基因編碼的肽的變體，但是它們的等電點(diǎn)(pI)或者分子量(MW)不同，或者兩者都不同。所述同工型的氨基酸組成可以不同(例如作為供選擇的剪接或限制性蛋白水解的結(jié)果)，另外，可選地，可以由不同的翻譯后修飾(例如，糖基化作用、?；饔?、磷酸化作用)產(chǎn)生。如這里使用的，術(shù)語“同工型”還指只以單一形式存在的肽，即所述同工型不表達(dá)為幾種變體。
通過為了最佳比較(optimal comparison)目的而調(diào)整序列(例如，為了與序列進(jìn)行最佳排列(best alignment)，在第一個(gè)序列中引入缺口)并且比較相應(yīng)位點(diǎn)(position)的氨基酸殘基或核苷酸，測(cè)定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸序列的同一性百分率?！白罴雅帕小笔菍?dǎo)致最高同一性百分率的兩個(gè)序列的排列。相比較的序列中相同的氨基酸殘基或核苷酸的數(shù)目確定同一性百分率(即，同一性％＝相同位點(diǎn)的數(shù)目/總的位點(diǎn)的數(shù)目×100)。
利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的數(shù)學(xué)算法能完成兩個(gè)序列之間的同一性百分率的測(cè)定。比較兩個(gè)序列的數(shù)學(xué)算法的實(shí)例是Karlin和Altschul的算法，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)872264-2268、根據(jù)Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877改良。Altschul等，J.Mol.Biol.(1990)215403-410的NBLAST和XBLAST程序并入了這樣的算法。利用NBLAST程序能進(jìn)行BLAST核苷酸檢索，分?jǐn)?shù)＝100，詞長(zhǎng)＝12，獲得與編碼這里描述的肽序列的核酸分子同源的核苷酸序列。利用XBLAST程序能進(jìn)行BLAST蛋白檢索，分?jǐn)?shù)＝50，詞長(zhǎng)＝3，獲得和這里描述的肽同源的氨基酸序列。能使用根據(jù)Altschul等，NucleicAcids Res.(1997)253389-3402所述的Gapped BLAST，以獲得為比較目的的缺口排列?？蛇x地，PSI-Blast能被用來進(jìn)行重復(fù)搜索，檢測(cè)分子之間的遠(yuǎn)距離相關(guān)性(Id.)。當(dāng)使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序時(shí)，能使用各程序的默認(rèn)參數(shù)(例如，XBLAST和NBLAST)。參見，例如，http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
用于比較序列的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)例子是Myers和Miller的算法，CABIOS(1989)。是GCG序列排列軟件包的一部分的ALIGN程序(2.0版)并入了這樣的算法。本領(lǐng)域公知的序列分析的其他算法包括Torellis和Robotti Comput Appl.Biosci.(1994)103-5中描述的ADVANCE和ADAM；和Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)852444-8中描述的PASTA。FASTA中，ktup是設(shè)置搜索敏度和速度的控制選項(xiàng)。
技術(shù)人員知道各種氨基酸具有相似性質(zhì)。一個(gè)或幾個(gè)其他某種氨基酸經(jīng)常能取代一種物質(zhì)的一個(gè)或幾個(gè)同種氨基酸，但是不消除那種物質(zhì)的期望的活性。因此氨基酸甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸經(jīng)常能彼此互相取代(具有脂肪支鏈的氨基酸)。這些可能的取代中優(yōu)選的是使用甘氨酸和丙氨酸互相取代(因?yàn)樗鼈兙哂邢鄬?duì)短的支鏈)和使用纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸互相取代(因?yàn)樗鼈兙哂休^大的疏水性脂肪支鏈)。經(jīng)常能被彼此取代的其他氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(帶有芳香側(cè)鏈的氨基酸)；賴氨酸、精氨酸和組氨酸(帶有堿性側(cè)鏈的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(帶有酸性側(cè)鏈的氨基酸)；天冬酰胺和谷酰胺(帶有酰胺側(cè)鏈的氨基酸)；和半胱氨酸和甲硫氨酸(帶有含硫的側(cè)鏈的氨基酸)。這種性質(zhì)的取代作用經(jīng)常稱作“保守性(conservative)”或“半保守性(semi-conservative)”氨基酸取代。
也可以進(jìn)行相對(duì)于這里描述的肽序列的氨基酸序列的氨基酸缺失或插入。因此，例如，對(duì)所述肽的活性不具有實(shí)質(zhì)性作用的氨基酸，或者至少不消除所述活性的氨基酸可被缺失。也可以對(duì)這里描述的肽序列進(jìn)行氨基酸插入。上述方法用做改變本發(fā)明蛋白的性質(zhì)(例如有助于鑒定、純化或表達(dá)蛋白，所述蛋白從重組來源獲得，包括融合蛋白)。所述相對(duì)于重組來源的肽的序列的氨基酸變化可以利用任何合適的技術(shù)進(jìn)行，例如通過利用定點(diǎn)誘變(site-directed mutagenesis)。當(dāng)然可以通過標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)合成技術(shù)來制備分子，例如固相肽合成，或通過可利用的生物化學(xué)技術(shù)來制備。
可以理解的是，本發(fā)明的范圍內(nèi)的氨基酸取代或插入，能利用天然存在的或非天然存在的氨基酸進(jìn)行。不管是不是使用天然的或合成的氨基酸，優(yōu)選只存在L-氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明，能使用在抗原呈遞細(xì)胞(APC)中代表內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體或核內(nèi)體的純化的微粒體在I類或II類MHC分子上加載抗原性肽。這里描述的體外和體內(nèi)免疫的結(jié)果表明根據(jù)T細(xì)胞的增殖和IL-2的產(chǎn)生測(cè)定，加載肽的微粒體表現(xiàn)出比加載肽的APC強(qiáng)得多的應(yīng)答。通過定量測(cè)定肽接受的I類MHC分子的量，APC表面上接受的I類分子低于放射化學(xué)檢測(cè)限制。然而，在微粒體中檢測(cè)到顯著量的肽結(jié)合I類MHC。另外，與細(xì)胞表面相比較，在微粒體中檢測(cè)到類似量的共同刺激的分子，B7.1和B7.2。因此，加載有抗原性肽的微粒體代表有效疫苗組合物。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，APC的ER中50％以上的I類MHC分子是肽接受的。通過“膜內(nèi)側(cè)翻外的”過程，加載Kb特異性卵清蛋白(OVA)肽的微粒體能在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答。相反，使用相同肽脈沖的APCs具有的刺激T細(xì)胞應(yīng)答的能力小得多。若微粒體包括共激分子，則與APC分離的微粒體代表著未來針對(duì)各種各樣疾病的肽疫苗的有希望的賦形劑。
除了在微粒體制備之前將選擇的MHC基因轉(zhuǎn)染到動(dòng)物細(xì)胞中之外，還可以用編碼共激分子的基因轉(zhuǎn)染或共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，所述編碼共激分子的基因例如B7的基因和/或編碼細(xì)胞因子的基因，所述細(xì)胞因子例如白細(xì)胞介素或干擾素，所述白介素例如IL-2。在細(xì)胞因子情況下，轉(zhuǎn)基因與CD2或CD4的跨膜結(jié)構(gòu)域融合，使細(xì)胞因子定向進(jìn)入ER膜。另外，為了富集MHC水平，ER、KDEL或其他ER滯留信號(hào)(retention signalling)中的共激分子和膜結(jié)合細(xì)胞因子(Nilsson T和Warren G.，Curr Opin Cell Biol.6(4)，517-21(1994))將在ER中用于滯留轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因C-末端進(jìn)行標(biāo)記。所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá)盒與I類MHC轉(zhuǎn)基因相似。
因此，根據(jù)本發(fā)明，所述疫苗組合物可以和一種或幾種能促進(jìn)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子，例如干擾素或白介素，例如IL-2、IL-15、IL-6、GM-CSF、IFNγ、促進(jìn)T細(xì)胞應(yīng)答的細(xì)胞因子和/或常規(guī)佐劑共同給藥。上述物質(zhì)可以在給藥之前與加載抗原的微粒體適當(dāng)?shù)鼗旌?，或者可以適當(dāng)?shù)刂苽涑晌⒘ｓw的膜結(jié)合成分。所述膜結(jié)合成分可以利用如上所述的重組DNA技術(shù)來引入，在最終用來形成微粒體的細(xì)胞器中基因工程表達(dá)細(xì)胞因子，或者所述細(xì)胞因子可以被加載到微粒體膜中或者與表面蛋白結(jié)合。
在微粒體制劑中表達(dá)的膜結(jié)合細(xì)胞因子可以通過用包括選擇性帶有ER滯留信號(hào)的與膜錨定蛋白融合的細(xì)胞因子分子的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染抗原呈遞細(xì)胞來制備。例如，通過構(gòu)建包括編碼融合蛋白的核酸的載體可以制備包括膜結(jié)合IL-2分子的微粒體，所述融合蛋白包括與IL-2的C-末端融合的CD2膜結(jié)構(gòu)域和ER滯留信號(hào)，例如來自E15-9K腺病毒蛋白的16氨基酸序列，其中ER滯留信號(hào)與CD2蛋白的C-末端融合。載體在抗原呈遞細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致在細(xì)胞的細(xì)胞器，即ER中的細(xì)胞因子的蓄積，能制備含有膜結(jié)合細(xì)胞因子的微粒體。
另外，適當(dāng)包括針對(duì)疫苗的特異性免疫應(yīng)答的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)，例如通過象酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)這樣的技術(shù)檢測(cè)血清細(xì)胞因子(例如IL-2和/或IFNγ)，或者使用肽加載微粒體的體外T細(xì)胞應(yīng)答測(cè)定，或者細(xì)胞增殖測(cè)定。
在最簡(jiǎn)單形式中，本發(fā)明提供一種組合物，該組合物包括分離的動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微粒體或者其膜片段，所述微粒體或其膜片段與外部暴露的肽抗原和主要組織相容性復(fù)合體(MHC)蛋白相結(jié)合。適當(dāng)?shù)嘏渲瞥梢呙缃o藥。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了根據(jù)本發(fā)明第一或第二方面用于醫(yī)藥的組合物。因此本發(fā)明的這個(gè)方面延伸至患有疾病或病癥的受治療者的治療或預(yù)防方法，包括對(duì)受治療者施用如上定義的疫苗的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了如上定義的組合物在制備用于疾病的預(yù)防或治療的疫苗中的用途。所述疾病可以是微生物或病毒引起的感染，或者它可以是特征在于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和/或腫瘤生成的癌癥?；蛘?，所述疾病可以是自身免疫疾病，其中疫苗具有誘導(dǎo)對(duì)自身抗原的耐受性的治療用途。根據(jù)本發(fā)明的這方面的用途還延伸至這樣的疾病的治療方法，該方法包括對(duì)需要的受治療者施用所述組合物。適當(dāng)?shù)?，能通過任何常規(guī)途徑施用本發(fā)明的疫苗組合物，例如肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、口服或通過對(duì)腦脊液注射給藥。
能使用本發(fā)明的疫苗治療的疾病或病癥包括但不限于黑素瘤、肺腺癌、結(jié)腸癌、乳癌或白血病。自身免疫疾病包括但不限于多發(fā)性硬化(MS)、全身紅斑狼瘡、1-型或胰島素依賴型糖尿病、抗磷脂綜合征、重癥肌無力、肌炎、斯耶格倫氏綜合征和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis)。另外，病毒感染，例如HIV感染、皰疹病毒感染、丙肝病毒感染；或寄生蟲感染，例如瘧原蟲原生寄生蟲感染，瘧疾的成因物質(zhì)，例如鐮狀瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、伯氏瘧原蟲(Plasmodiumberghei)、約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii)、或諾氏瘧原蟲(Plasmodiumknowlesi)，或者另一種寄生蟲，例如鼠弓形體(Toxoplasma gondii)、或布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、或痢疾變形蟲(Entamoeba histolytica)、或蘭伯氏賈第蟲(Giardia lambia)，或細(xì)菌感染，例如大腸桿菌E.coli 0157、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)等。
還可以預(yù)見到，在對(duì)患者施用本發(fā)明組合制劑之前，本發(fā)明的微粒體在加載肽抗原時(shí)，可以與抗原呈遞細(xì)胞(APC)融合。適當(dāng)?shù)兀谥委熤皬幕颊呷〉肁PC，但是也可以從同種異體來源獲得。在這樣情況下，使用細(xì)胞的同種異體來源，免疫抑制藥物也可以形成治療方案的一部分。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了制備如上定義的疫苗組合物的方法，該方法包括在核苷三磷酸(NTP)存在下孵育微粒體群和抗原性肽，接著進(jìn)一步處理，制備翻轉(zhuǎn)的微粒體并且在生理稀釋劑和選擇性包括的佐劑中配制得到制劑。象葡萄糖這樣的試劑被包括其中，具有保持制備的微粒體疫苗的構(gòu)象的能力。適當(dāng)?shù)?，將孵育所得的微粒體洗滌，并重懸于疫苗的生理稀釋劑溶液中，所述稀釋劑包括一定量的抗原性肽以防止存在于微粒體膜上的MHC-肽復(fù)合物解離。
在核苷三磷酸(NTP)，例如ATP、GTP、CTP、TTP或UTP存在下，進(jìn)行用抗原加載微粒體的過程。也可以在一種以上類型的抗原肽的存在下實(shí)施抗原加載方法。在這種方法中，多種抗原可以被加載到微粒體中。
通過進(jìn)一步處理微粒體可以制備翻轉(zhuǎn)的微粒體，即在使膜重組并且適合形成“膜內(nèi)側(cè)翻外”形式微粒體的條件下分裂微粒體的膜。因此反復(fù)冷凍-融解步驟的利用在這方面是合適的。例如，能在合適的介質(zhì)或緩沖液(例如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS))中懸浮微粒體，然后暫時(shí)浸入液氮中合適的時(shí)間，適當(dāng)?shù)?分鐘至5分鐘，優(yōu)選2分鐘，然后移至37℃，例如在水浴中，保持適當(dāng)時(shí)間，適當(dāng)?shù)?-6分鐘，優(yōu)選4分鐘。冷凍-融解重復(fù)步驟的次數(shù)可以是3-5次，適當(dāng)?shù)?次重復(fù)步驟。
在本發(fā)明這方面的另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述方法包括用抗原加載如上所述制備的翻轉(zhuǎn)微粒體。為了將抗原性肽加載到翻轉(zhuǎn)微粒體中，NTP的存在可能不是必需的(盡管可能是值得的)。
根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供了在密封容器中包括如上定義的組合物和一種或幾種細(xì)胞因子和/或佐劑的部分的試劑盒。合適地，試劑盒包括如上定義的本發(fā)明方法或用途的說明。
根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供了試劑盒部分，所述部分包括如上定義的組合物和一種或幾種細(xì)胞因子和/或佐劑分子以對(duì)受治療者單獨(dú)、依次或同時(shí)給藥。
本發(fā)明第二方面和隨后幾個(gè)方面的優(yōu)選特征與第一方面一樣，細(xì)節(jié)上作必要的修改(mutatis mutandis)。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，提供了用于疾病的預(yù)防或治療的疫苗組合物，所述疾病的特征是定義的抗原或由感染物質(zhì)引起的潛在免疫原性的肽序列的表達(dá)，或者特征是天然細(xì)胞抗原的表達(dá)，其中組合物是通過下面的方法制備的(1)獲得表達(dá)MHC蛋白的抗原呈遞細(xì)胞的樣品；(2)在分離微粒體制品的條件下將細(xì)胞勻漿；(3)制備抗原性肽，例如利用重組DNA技術(shù)，或者從天然組織來源、或感染物質(zhì)的來源分離，或者在大多數(shù)情況下從合成的抗原性肽分離；(4)在NTP存在下孵育抗原性肽和微粒體，將抗原性肽加載給微粒體；(5)進(jìn)一步處理步驟(4)中加載的微粒體，制備翻轉(zhuǎn)微粒體群；(6)適當(dāng)時(shí)在生理稀釋劑和/或佐劑中配制加載的翻轉(zhuǎn)微粒體的疫苗。
如上所述，還可以從分離的細(xì)胞群或細(xì)胞系制備微粒體。在微粒體制備之前可能已經(jīng)用表達(dá)選擇的蛋白的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞或細(xì)胞系。
根據(jù)上述方案，用抗原性肽對(duì)微粒體加載，然后接著處理，制備翻轉(zhuǎn)的微粒體。但是，在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，可以首先制備翻轉(zhuǎn)微粒體，然后用抗原加載，在這種情況下步驟(4)中NTP的存在不一定是必需的。
如上所討論的，本發(fā)明的疫苗組合物優(yōu)選包括翻轉(zhuǎn)微粒體，更優(yōu)選均勻的翻轉(zhuǎn)微粒體群。但是，所述翻轉(zhuǎn)微粒體群中也可以存在沒有翻轉(zhuǎn)的微粒體。
細(xì)胞可以是MHC陰性的，這樣允許用編碼選用于疫苗的MHC類分子的合適的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞系?？乖闹苽湟部梢园ɡ没瘜W(xué)方法合成抗原性肽。
在NTP存在下發(fā)生用抗原性肽對(duì)沒有翻轉(zhuǎn)的微粒體加載。翻轉(zhuǎn)微粒體的加載沒有表現(xiàn)出必需存在NTP，但是這是優(yōu)選的。


參照下面的實(shí)施例和附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明，提供實(shí)施例和附圖的目的只是為了詳細(xì)描述而不是為了限制本發(fā)明。參考下面的附圖，其中圖1顯示用RAW309Cr.1細(xì)胞的微粒體中交聯(lián)劑修飾的OVA肽進(jìn)行的H2-Kb分子的交聯(lián)。125I-標(biāo)記的ANB-NOS-OVA肽在存在或不存在ATP再生系統(tǒng)下、或者存在或不存在10倍摩爾過量天然OVA-肽下，與RAW309Cr.1細(xì)胞的微粒體混合。交聯(lián)的H-2Kb已標(biāo)明；圖2顯示RAW309Cr.1細(xì)胞的微粒體中OVA-肽接受H-2Kb的濃度。對(duì)于OVA-肽接受H-2Kb的半定量，在UV照射下，分別用微粒體或RAW309Cr.1細(xì)胞孵育10nM標(biāo)記的肽。用R218抗血清沉淀H-2分子，并且通過磷成像(phospho-imaging)定量測(cè)定交聯(lián)的Kb分子；圖3顯示微粒體中或RAW309Cr.1細(xì)胞的表面上H-2分子的測(cè)定。在10％SDS-PAGE上分離30微克來自RAW309Cr.1微粒體或RAW309Cr.1細(xì)胞的NP40溶胞產(chǎn)物的蛋白。以指定的滴定法稀釋溶胞產(chǎn)物并且在SDS-PAGE上分離。通過R218抗-H-2抗血清檢測(cè)H-2分子的免疫印跡；
圖4顯示RAW309Cr.1細(xì)胞的微粒體中B7.1、B7.2和ICAM-1的測(cè)定。在10％SDS-PAGE上分離30微克來自RAW309Cr.1微粒體或RAW309Cr.1細(xì)胞的NP40溶胞產(chǎn)物的蛋白。通過特異性抗體檢測(cè)B7.1、B7.2和ICAM-1的免疫印跡；圖5顯示OVA-肽編輯的微粒體對(duì)B3Z T細(xì)胞的刺激。如材料和方法中所述使用來自2×105RAW309Cr.1細(xì)胞的微粒體加載OVA或Ld-特異性肽，。用OVA肽脈沖2×105RAW309Cr.1細(xì)胞(參見材料和方法)。洗滌之后，肽脈沖的2×105RAW309Cr.1細(xì)胞、OVA-加載的微粒體、Ld-肽加載的微粒體和沒有肽的微粒體與105B3Z細(xì)胞共同培養(yǎng)過夜。A)用PBS洗滌之后，用LacZ底物ONPG通過總的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物分析B3Z細(xì)胞中LacZ活性。37℃下孵育4小時(shí)之后讀取吸光度(415納米)。用100nM OVA肽培養(yǎng)的B3Z細(xì)胞和正?；|(zhì)被用作B3Z刺激的陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。B)對(duì)這些培養(yǎng)物的上清液通過ELISA測(cè)定IL-2產(chǎn)生。將實(shí)驗(yàn)重復(fù)四次，得到相同結(jié)果。誤差條指明三份培養(yǎng)物的SEM；圖6顯示用由不同濃度的OVA-肽預(yù)先加載的2×105RAW309Cr.1細(xì)胞的微粒體對(duì)B3Z T細(xì)胞的刺激。加載有指定的不同濃度OVA-肽的微粒體與B3Z細(xì)胞一起培養(yǎng)過夜，然后測(cè)定LacZ活性；圖7顯示OVA-肽編輯的微粒體刺激體內(nèi)特異性T細(xì)胞應(yīng)答。用OVA-編輯微粒體(OVA-edited microsomes)或Ld-肽加載微粒體或OVA肽或OVA-脈沖RAW309Cr.1細(xì)胞i.s.對(duì)C57BL/6(H-2b)小鼠致敏，并且7天之后用相同刺激激發(fā)。所述激發(fā)之后6天，從脾中分離富集的T細(xì)胞并且以105細(xì)胞/孔與指定的刺激物培養(yǎng)。在與T細(xì)胞共同培養(yǎng)之前對(duì)RAW309Cr.1細(xì)胞照射三天之后，收集上清液用于細(xì)胞因子ELISA(b)并且用[3H]胸苷(a)對(duì)培養(yǎng)物脈沖。結(jié)果代表每個(gè)治療小組至少三只小鼠的小組，并且實(shí)驗(yàn)重復(fù)四次，得到相似結(jié)果。誤差條指示三份培養(yǎng)物的SEM。對(duì)Balb/c(H-2d)小鼠實(shí)施類似實(shí)驗(yàn)作為陰性對(duì)照；圖8顯示T細(xì)胞受體(Tcell receptor，TCR)誘導(dǎo)的MAK激酶的激活。分別用OVA-脈沖的RAW309Cr.1、OVA-微粒體和抗-CD3/CD28刺激來自O(shè)VA-微粒體免疫的C57BL/6的107 T細(xì)胞。通過抗-p-ERK和抗-p-JNK抗體檢測(cè)ERK和JNK的激活。通過作為加載對(duì)照的抗-ERK和抗-JNK檢測(cè)ERK和JNK的相似水平；圖9顯示在微粒體中而不是在RAW309Cr.1細(xì)胞的表面檢測(cè)OVA-接受H-2Kb。10 nM125I-標(biāo)記的ANB-NOS-OVA肽在指定濃度下與或不與天然OVA肽混合?；旌想呐c相當(dāng)于107 RAW309Cr.1細(xì)胞的微粒體或者與107RAW309Cr.1細(xì)胞孵育。交聯(lián)的H2-Kb分子已標(biāo)明；圖10顯示流感病毒肽編輯的Kb-微粒體在體內(nèi)誘導(dǎo)T-細(xì)胞應(yīng)答的研究結(jié)果(每組5只小鼠)；圖11顯示DC和制備的微粒體的電子顯微照相照片(A)放大×12000和(B)放大×40000是來自RAW細(xì)胞的制備的微粒體；(C)放大×40000是反復(fù)冷凍-融解和加載肽而翻轉(zhuǎn)的微粒體，顯示開放的或翻轉(zhuǎn)的微粒體。在照片中看不到加載的肽；圖12顯示對(duì)來自A2黑素瘤患者的MAGE-A2特異性T-細(xì)胞進(jìn)行研究的結(jié)果；圖13顯示I類MHC抗原A2α鏈母體和B7α鏈母體(登記號(hào)分別是P01892和P01889)的氨基酸序列；圖14顯示II類MHC抗原DRB3-1β-鏈母體和HLA-DQα1(DQw4特異性)母體-人類(登記號(hào)分別是P79483和A37044)的氨基酸序列。
具體實(shí)施例方式
材料和方法細(xì)胞系和動(dòng)物B3Z是表達(dá)LacZ的CD8 T細(xì)胞雜交瘤，該雜交瘤響應(yīng)對(duì)SIINFEKL肽特異性的T細(xì)胞受體的激活，I類H-2Kb MHC分子呈遞所述SIINFEKL肽。RAW309Cr.1，一種Kd/Kb鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系，用作APCs，從ATCC(ATCCTIB-69)獲得。所有的細(xì)胞在含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco′smodified Eagle′s medium)中培養(yǎng)。獲得6周齡的雌性C57BL/6小鼠H-2b和Balb/c小鼠H-2d。根據(jù)被認(rèn)可的的方案對(duì)動(dòng)物進(jìn)行所有的處理。
抗體、肽和肽修飾利用常規(guī)F-moc化學(xué)方法，在肽合成儀(431A型，Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)中合成所有的肽，并且接著通過高效液相色譜(HPLC)純化。將純化的肽溶解于PBS。
通過將第三個(gè)殘基異亮氨酸取代為酪氨酸以用于碘化作用，并通過使疊氮基苯與第七位賴氨酸的ε-氨基上的硝基共價(jià)偶聯(lián)來修飾肽OVA 257-264(SIINFEKL)。上述硝基可以被光活化。通過將200微升二甲基亞砜(DMSO)中的0.5毫克ANB-NOS(N-5-疊氮基-2-硝基苯甲?；蹒牾啺?與100微升PBS中的100微克肽和50微升CPAS(3-[環(huán)己基氨基]-1-丙磺酸)(0.5摩爾/升，pH10)混合來進(jìn)行交聯(lián)劑修飾。使反應(yīng)在冰上進(jìn)行30分鐘。為了去除過量的ANB-NOS和離子，通過在Sephadex G-10上凝膠過濾，并接著通過HPLC來純化混合物。用氯胺-T-催化的碘化作用(125I)標(biāo)記一等份的肽(1微克)。修飾和標(biāo)記實(shí)驗(yàn)避光進(jìn)行。
抗血清、免疫沉淀和SDS-PAGE抗H2的兔抗清(R218)由Karolinska研究所Dr.Sune Kvist友情提供。對(duì)證實(shí)的H2特異性的單克隆抗體(Y3)由劍橋大學(xué)的Tim Elliot友情提供。抗JNK、ERK、p-ERK和p-JNK抗血清從(Santa Cruz Biotechnology)獲得。根據(jù)Li等(J Biol Chem..274(13)，8649-54(1999))所述進(jìn)行免疫沉淀、免疫印跡和SDS-PAGE。Protein-A-Sepharose從Pharmacia(Uppsala，瑞典)獲得。
實(shí)施例1微粒體制備和肽結(jié)合測(cè)定根據(jù)Saraste等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83，6425-6429(1986))的步驟制備和純化來自RAW309Cr.1的微粒體，RAW309Cr.1為一種Kd/Kb鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系。I類免疫遺傳學(xué)是RAW細(xì)胞和Balb/c小鼠中的Kb。
以利用Saraste等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83，6425-6429(1986))和Knipe等(J.Virol.21，1128-1139(1977))對(duì)微粒體膜分級(jí)分離的改良方法為基礎(chǔ)從B細(xì)胞制備微粒體。所有步驟在0-4℃下進(jìn)行。
·收集3×109細(xì)胞并且用冷的PBS沖洗一次。
·在含有10微升苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)(100mM)的20毫升STKMM-緩沖液中重懸浮細(xì)胞。
·4℃下以1500轉(zhuǎn)/分(rpm)轉(zhuǎn)5分鐘。
·在10毫升H2O(有5微升PMSF)中重懸浮。
·在40毫升杜恩斯組織勻漿器(Dounce)中勻漿，20個(gè)沖程。
·加入30毫升STKMM并且充分混合。
·倒在JA-18試管中。
·4℃下以7500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。
·小心地將上清液收集到新試管中。
·4℃下以15500轉(zhuǎn)/分離心54分鐘。
·用10毫升STKMM緩沖液小心沖洗沉淀團(tuán)，然后用吸移管將沉淀團(tuán)重懸浮于1毫升RM緩沖液中并且在15毫升杜恩斯勻漿器(douncer)中勻漿。粗微粒體以AOD280＝60的濃度稀釋。
·在含有5 mM苯甲脒的5毫升的0.33M蔗糖的頂部鋪上總微粒體(上述)，接著在由1毫升的2M蔗糖/5mM苯甲脒組成的蔗糖墊的頂部鋪上。
·在SW41轉(zhuǎn)子中以110000×g離心60分鐘在上述墊的頂部得到總微粒體帶。小心收集總微粒體帶。然后將2M蔗糖/5mM苯甲脒緩慢加入微粒體，得到45％(重量/體積，w/v)蔗糖最終濃度。
·利用Paulsson等(J Biol Chem.277(21)，18266-71(2002))描述的方法的改進(jìn)方法通過浮選法(floatation)將微粒體再分級(jí)分離。將3毫升的45％(w/v)蔗糖中的100微升總的微粒體放置在SW41超離心試管的底部，蓋上下面的蔗糖溶液30％的1毫升，27.5％、25％、22.5％和20.0％的各1.9毫升(所有的溶液含有5mM苯甲脒)。
·4℃下以37000轉(zhuǎn)/分離心10小時(shí)之后(達(dá)到等密度條件)，通過向上移動(dòng)收集25個(gè)各300微升的級(jí)分。
·通過用抗-p58抗體(p58是一種ER蛋白)進(jìn)行蛋白印跡測(cè)定ER級(jí)分。
·在肽加載和免疫實(shí)驗(yàn)中使用倒入的ER級(jí)分。
交聯(lián)混合物在總體積100微升RM緩沖液(250 mM蔗糖，50mM三乙醇胺鹽酸鹽(TEA-HCl)，50mM KOAc，2mM MgOAc2，和1mM二硫蘇糖醇(DL-Dithiothreitol，DTT))中含有50或100nM(125I)的ANB-NOS-肽和10微升的微粒體(60A280/毫升)?；旌现?，立即在室溫下在366納米照射樣品5分鐘。然后通過RM緩沖液中0.5-M蔗糖墊離心回收膜。用冷的RM緩沖液將膜洗滌一次。洗滌的膜溶解用于免疫沉淀或免疫印跡。如Li等(J Biol Chem.274(13)，8649-54(1999))所述，與ATP的交聯(lián)反應(yīng)包括ATP再生系統(tǒng)?；旌?00nM的(125I)ANB-NOS-肽和107細(xì)胞，相當(dāng)于在總體積100微升的RM緩沖液中制備10微升微粒體所使用的細(xì)胞量，進(jìn)行RAW309Cr.1細(xì)胞上表面Kb分子的交聯(lián)?；旌现?，立即在室溫下照射樣品5分鐘。用RM緩沖液洗滌去除過量肽。細(xì)胞溶解用于用Y3抗體的免疫沉淀。
通過4℃下將RAW309Cr.1細(xì)胞與Y3抗體孵育15分鐘進(jìn)行對(duì)表面I類MHC的檢測(cè)。洗滌之后，細(xì)胞溶解于1％ NP40溶胞緩沖液，并且用蛋白-A珠沉淀澄清的溶胞產(chǎn)物。用R218抗血清通過免疫印跡檢測(cè)沉淀的I類MHC。
室溫下利用ATP再生系統(tǒng)將微粒體與天然肽混合10分鐘進(jìn)行肽編輯用于刺激T細(xì)胞。離心之后通過RM緩沖液中蔗糖墊去除過量肽。加載的微粒體在液氮中交替冷凍/融解，然后37℃水浴，反復(fù)10次。將處理過的微粒體以(6A280/毫升)的濃度重新懸浮于PBS中并且保存在-80℃待用。在1毫升基質(zhì)中將100nM肽和107細(xì)胞混合過夜或者在37℃在1毫升PBS中混合4小時(shí)來制備肽脈沖的RAW309Cr.1細(xì)胞。脈沖的細(xì)胞在與B3Z T細(xì)胞混合之前用PBS洗滌，或者將上述混合物直接加給B3Z。
實(shí)施例2B3ZT細(xì)胞雜交瘤的激活向總體積200微升的105B3Z細(xì)胞的培養(yǎng)物加入包括肽-編輯微粒體、肽-脈沖RAW309Cr.1細(xì)胞、OVA肽的所制備刺激物。加入PBS和抗-CD3/CD28包被小球分別作為陰性對(duì)照或陽性對(duì)照。過夜孵育之后，通過使用鄰硝基苯基b-D-吡喃半乳糖苷(Sigma)底物L(fēng)acZ活性指示B3Z的激活。由于B3Z細(xì)胞本身表達(dá)Kb且呈遞SIINFEKL，所以通過向基質(zhì)中加入SIINFEKL的系列稀釋液測(cè)定OVA-響應(yīng)的線性范圍。
實(shí)施例3在微粒體中而不是在APC表面上檢測(cè)肽-接受I類MHC分子有人報(bào)道過使用交聯(lián)劑修飾的肽和分離的來自RAW309Cr.1的ER微粒體測(cè)定體外肽轉(zhuǎn)運(yùn)和加載(Li等，J Biol Chem.274(13)，8649-54(1999))。測(cè)試檢查ATP存在下肽跨越ER膜的易位以及隨后在I類MHC分子上加載肽(Wang等J Immunol.157(1)，213-20(1996))。
為了測(cè)定微粒體膜中肽-接受I類MHC分子，將交聯(lián)劑(ANB-NOS)與H2-Kb-結(jié)合卵清蛋白(OVA)肽(殘基257-264，SIIFEKL)的賴氨酸殘基的ε-氨基結(jié)合，并且用酪氨酸取代位置3上的異亮氨酸殘基用于碘化作用。上述修飾使得在組裝期間OVA肽與H2-Kb分子光致交聯(lián)(photo-cross-linking)。為了定量比較微粒體中和活RAW309Cr.1細(xì)胞表面上的肽-接受H2-Kb，修飾的OVA肽用125I標(biāo)記，并且在UV照射下與RAW309Cr.1和活RAW309Cr.1細(xì)胞的微粒體孵育。接著用抗-H2抗體Y3通過免疫沉淀分析肽-結(jié)合的H2-Kb分子。不存在ATP時(shí)，只有幾個(gè)Kb分子與OVA肽組裝；同時(shí)在ATP存在下，顯著量的Kb分子與OVA肽交聯(lián)(圖1)。這個(gè)結(jié)果證明ER中存在大量肽接受的I類分子。
對(duì)微粒體中和RAW309Cr.1表面上OVA-交聯(lián)Kb的半定量分析表明，與微粒體中肽接受Kb分子的高水平相反，APC表面上OVA-結(jié)合的Kb分子低于放射化學(xué)可檢測(cè)水平(圖2)，再一次證明肽-接受I類MHC分子主要在ER中，但是不在APC表面。在競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中，證明這種修飾的OVA肽與Kb的結(jié)合是特異性的。為了檢驗(yàn)修飾的OVA-肽的親合力，標(biāo)記的所述OVA肽與其不同濃度的天然形式競(jìng)爭(zhēng)。天然OVA肽在報(bào)道肽的濃度下競(jìng)爭(zhēng)50％的報(bào)道肽，并且在10倍報(bào)道肽的濃度下完全破壞結(jié)合(圖2)。此外，Ld特異性肽不能競(jìng)爭(zhēng)OVA結(jié)合。這表明修飾的OVA-肽的結(jié)合親和性是Kb特異性的并且與它的天然形式相似。為了定量測(cè)定與從106RAW309Cr.1得到的微粒體中Kb分子結(jié)合的肽的量，在ATP存在下，標(biāo)記的肽與微粒體孵育。交聯(lián)之后，I類MHC沉淀出并且測(cè)定肽-結(jié)合Kb的每分鐘衰變數(shù)(disintegrationsper minute，dpm)，并且轉(zhuǎn)化為肽的濃度。結(jié)果表明，大約500至1000個(gè)肽與一個(gè)細(xì)胞中的微粒體中的Kb分子結(jié)合。另外，ER中I類MHC分子的總量比RAW309Cr.1細(xì)胞表面上的多(圖3)。因此，來自APC的微粒體能將足夠的肽-I類MHC復(fù)合體送遞給T細(xì)胞。
實(shí)施例4APC的微粒體中存在B7和ICAM1完全T細(xì)胞應(yīng)答需要來自抗原-MHC復(fù)合體和如B7的共激分子的信號(hào)(Acuto等，Immunol Rev.192，21-31(2003))。和所有的膜蛋白一樣，共激分子在ER中合成，接著在APC的表面上表達(dá)。為了定量測(cè)定分離的微粒體中B7和ICAM-1共激分子的量，溶解相當(dāng)于5×106RAW309Cr.1的微粒體，并且分別使用對(duì)上述分子特異性的抗血清進(jìn)行蛋白印跡分析澄清的溶胞產(chǎn)物。在比較中，還用相同的抗體對(duì)5×106RAW309Cr.1的總細(xì)胞溶胞產(chǎn)物進(jìn)行印跡。通過密度分析定量測(cè)定B7.1、B7.2和ICAM-1帶的密度。在微粒體樣品中容易測(cè)定B7和ICAM-1(圖4)。微粒體中測(cè)定的量是總的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的大約一半。肽-編輯微粒體中足量共激分子的存在能模擬APC的功能表面，提供抗原-MHC和對(duì)T細(xì)胞的共同刺激信號(hào)。
實(shí)施例5加載Kb特異性O(shè)VA肽的微粒體在體外刺激T細(xì)胞為了研究肽-加載微粒體誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞應(yīng)答的能力，通過反復(fù)冷凍-融解方法(材料和方法)對(duì)天然OVA肽-編輯微粒體進(jìn)行膜內(nèi)側(cè)翻外的處理。使用處理過的微粒體和OVA-肽脈沖的RAW309Cr.1刺激識(shí)別Kb-SHNFEKL復(fù)合體的B3Z T細(xì)胞雜交瘤(Fremont等，Proc Natl Acad Sci U S A.92(7)，2479-83(1995)；Shastri N和Gonzalez F.，J Immunol.150(7)，2724-36(1993))。洗滌出過量肽之后，通過誘導(dǎo)IL-2產(chǎn)生和IL-2-啟動(dòng)子啟動(dòng)的LacZ的表達(dá)，OVA編輯的微粒體刺激B3Z T細(xì)胞(圖5)。通過B3Z細(xì)胞對(duì)沒有肽或加載了Ld特異性肽的微粒體沒有應(yīng)答性，支持OVA-Kb誘導(dǎo)的B3Z應(yīng)答的特異性(圖5)。此外，B3Z對(duì)OVA-編輯微粒體的應(yīng)答水平與OVA-肽的量有關(guān)(圖6)。OVA-脈沖的RAW309Cr.1在過量肽的存在下能誘導(dǎo)B3Z應(yīng)答(Schott等，Proc Natl Acad Sci U S A.99(21)，13735-40(2002))。
但是，如果通過洗滌去除了過量的肽，OVA-脈沖的RAW309Cr.1不再能誘導(dǎo)B3Z應(yīng)答。如果OVA本身能誘導(dǎo)B3Z細(xì)胞產(chǎn)生IL-2(圖5)，表明不是RAW309Cr.1，而是OVA本身都B3Z的刺激物。最近報(bào)道了SIINFEKL體外誘導(dǎo)Kb限制T細(xì)胞應(yīng)答的能力，提出CTL能彼此呈遞肽(Schott等Proc Natl Acad Sci U S A.99(21)，13735-40(2002))。但是，肽-編輯微粒體在體外誘導(dǎo)CTL應(yīng)答，但是肽-脈沖的RAW309Cr.1不誘導(dǎo)，這與肽結(jié)合結(jié)果相吻合(圖2)，并且表明肽-編輯微粒體能模擬APCs，有效地將抗原性肽呈遞給TCR，并且刺激CTL的全應(yīng)答。
實(shí)施例6用Kb-特異性O(shè)VA肽加載的微粒體在體內(nèi)誘導(dǎo)OVA-肽應(yīng)答為了進(jìn)一步檢驗(yàn)OVA-編輯微粒體在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，使用來自RAW309Cr.1細(xì)胞的OVA-編輯微粒體、加載有Ld-特異性肽的微粒體、可溶性O(shè)VA肽、OVA肽脈沖的RAW309Cr.1和PBS在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。分別用上述刺激物兩次皮下注射五組C57BL/6或Balb/c小鼠，每組5只小鼠。注射間隔是一周。第二次注射之后6天，從脾分離T細(xì)胞，并且分別用五種源刺激物體外交叉刺激。另外，使用抗-CD3/CD28包被小球作為陽性對(duì)照。PBS刺激的T細(xì)胞對(duì)任何刺激沒有響應(yīng)，而抗-CD3/CD28在所有的組中誘導(dǎo)增殖響應(yīng)。OVA-肽脈沖的RAW309Cr.1和加載有Ld-特異性肽的微粒體不誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答(圖7)。相反，來自O(shè)VA-編輯微粒體和OVA肽C57BL/6組的T細(xì)胞體外對(duì)OVA-編輯微粒體應(yīng)答，而對(duì)OVA-脈沖的RAW309Cr.1或加載有Ld-肽的微粒體不應(yīng)答(圖7)。IL-2產(chǎn)生的非常有說服力的結(jié)果(圖7)再次證實(shí)OVA-編輯微粒體在體內(nèi)誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞應(yīng)答(圖7)。Balb/c具有H-2d，因此，沒有誘導(dǎo)的OVA應(yīng)答。
實(shí)施例7OV-微粒體激活的TCR信號(hào)傳輸途徑為了分析響應(yīng)OVA-微粒體刺激的TCR信號(hào)傳輸，使用從OVA-微粒體免疫C57BL/6小鼠分離的T細(xì)胞來體外誘導(dǎo)TCR信號(hào)傳輸。在用抗-CD3/CD28或用OVA-編輯微粒體，但是不用OVA-脈沖的RAW309Cr.1(圖8)刺激的T細(xì)胞中檢測(cè)ERK和JNK的激活。因此，生物化學(xué)證據(jù)證明響應(yīng)微粒體上OVA-Kb的特異性TCR信號(hào)傳輸，并且進(jìn)一步證明用抗原性肽編輯微粒體能在體內(nèi)誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答。
實(shí)施例8流感病毒肽加載的微粒體將來自小鼠流感病毒的Kb特異性肽(ASNENMETM)加載到來自Kb特異性RAW細(xì)胞的微粒體中。使用加載的微粒體對(duì)C57BL/6小鼠免疫接種。在分開的組中，使用PBS或肽作為對(duì)照。經(jīng)7天時(shí)間施用兩次抗原之后，從脾分離T-細(xì)胞，并且與PBS或肽、肽、或肽-加載微粒體交叉培養(yǎng)三天。在免疫接種之后第四天測(cè)定T-細(xì)胞增殖。結(jié)果如圖10所示。
實(shí)施例9對(duì)黑素瘤細(xì)胞的作用一對(duì)一地用從手術(shù)活組織檢查純化的自體固有的腫瘤細(xì)胞，并用重組-人白細(xì)胞介素-2(r-human IL-2)(10單位/毫升(U/mL))四次(每次給藥間隔5天)分別刺激從三名A2黑素瘤患者(P1，P2，P3)分離的T-細(xì)胞。通過細(xì)胞毒性測(cè)試對(duì)特異性抗腫瘤應(yīng)答進(jìn)行分析，并且與腫瘤細(xì)胞系K259比較。將MAGE肽加載給從221-A2人B-細(xì)胞系分離的微粒體，其中缺失MHC基因座，并且接著用HLA-A2轉(zhuǎn)染。來自黑素瘤患者的T-細(xì)胞系在正常培養(yǎng)基中與肽、微粒體或肽-加載微粒體培養(yǎng)三天。第三天測(cè)定增殖。結(jié)果如圖12所示。
討論這些結(jié)果證明，能使用來自ER的微粒體來處理I類MHC上的編輯的抗原性肽，處理過的微粒體能重新構(gòu)成APC的功能表面來誘導(dǎo)CTL應(yīng)答，因此，與共同刺激因子分子結(jié)合的微粒體I類MHC送遞的抗原性肽是肽疫苗的新形式。
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表1I類HLA-限制癌/睪丸抗原。發(fā)現(xiàn)睪丸的正常精母細(xì)胞和/或精原細(xì)胞表達(dá)這些抗原。發(fā)現(xiàn)MAGE-3、MAGE-4和GAGE基因有時(shí)也在胎盤中表達(dá)[26、24]。發(fā)現(xiàn)NY-ESO-1抗原在正常卵巢細(xì)胞中表達(dá)[18]。


a當(dāng)與首次報(bào)道表位序列的文獻(xiàn)不同時(shí)，給定參考文獻(xiàn)中描述的腫瘤間組織分布。
表2I類HLA-限制黑素細(xì)胞分化抗原。這些抗原只能在相同譜系的(lineage)正常和贅生性細(xì)胞(即黑素細(xì)胞、皮膚、視網(wǎng)膜、周圍神經(jīng)節(jié))中或者在前列腺的正常細(xì)胞中表達(dá)

a兩個(gè)不同的研究小組同時(shí)發(fā)現(xiàn)這個(gè)基因并且給它兩個(gè)不同的名字，分別是MART-1和Melan-A。
表3I類HLA-限制性廣泛表達(dá)的抗原


aCAP-1是這種肽的另一個(gè)名字b當(dāng)與第一次報(bào)道表位序列的文獻(xiàn)不同時(shí)，給定參考文獻(xiàn)中描述的腫瘤間組織分布c端粒酶在大多數(shù)人腫瘤中表達(dá)列出的那些顯示易于被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞溶解d所有的上皮組織表達(dá)粘蛋白，象高糖基化分子。
表4 I類HLA-限制腫瘤特異性抗原，包括特有的(CDK-4、MUM-2、MUM2、β-連環(huán)蛋白、HLA-A2-R170I、ELF2m、肌球蛋白-m、凋亡蛋白酶-8(caspase)，KIAA0205、HSP70-2m)和共有的(CAMEL、TRP-2/INT2、GnT-V、G250)抗原

aVLPDVFIRC(V)＝都被CTL識(shí)別的九肽和十二肽b這種抗原在正常細(xì)胞中不表達(dá)，因?yàn)閷?duì)精巢組織沒有進(jìn)行試驗(yàn)，在獲得更多信息之前不清楚這種抗原屬于哪類。
表5II類HLA-限制抗原


a所有上皮細(xì)胞高度表達(dá)糖基化粘蛋白，而贅生性細(xì)胞經(jīng)常顯示具有正常蛋白序列的高糖基化粘蛋白b當(dāng)與第一次報(bào)道表位序列的文獻(xiàn)不同時(shí)，給定參考文獻(xiàn)中描述的腫瘤間組織分布。
表6融合蛋白衍生的表位(正常組織中從來沒有發(fā)現(xiàn)融合蛋白)

a這些bcr-abl表位不是真的融合蛋白產(chǎn)生的表位，因?yàn)樗鼈儚耐獠縝cr-abl結(jié)合衍生。
表7給定HLA等位基因識(shí)別的表位頻率

表8以前測(cè)得的在HCV-暴露患者中被識(shí)別的HCV肽

選自Anthony等Clinical Immunol.，vol.l03，第264-276頁(2002)。
表9HIV-CTL肽表位

選自Kaul等，J.Clinical Invest.，vol.107，第1303-1310頁(2001)
表10HCV病毒肽抗原

選自Koziel等，J.Virol.，vol.67，第7522-7532(1993)表11HCV病毒肽抗原

選自He等PNAS USA，vol.96，第5692-5697頁(1999)。
權(quán)利要求
1.一種疫苗組合物，該組合物包括分離自動(dòng)物細(xì)胞的翻轉(zhuǎn)的微粒體，或者其膜片段，所述微粒體或其膜片段與外部暴露的肽抗原和主要組織相容性復(fù)合體蛋白相結(jié)合。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述微粒體來自細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中，所述主要組織相容性復(fù)合體蛋白來自與從中獲得微粒體的細(xì)胞異種的來源。
4.如前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，其中，所述組合物還含有一種或幾種共激分子。
5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中，所述共激分子選自由B7和IL-2組成的組。
6.如前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，其中，所述抗原來自病毒、細(xì)菌、酵母、真菌或原生動(dòng)物來源。
7.如前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，其中，所述抗原為自身抗原。
8.如權(quán)利要求6所述的組合物，其中，所述抗原來自贅生性細(xì)胞或癌細(xì)胞，或者為正常自身蛋白。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中，所述贅生性細(xì)胞或癌細(xì)胞選自黑素瘤、肺腺癌、結(jié)腸癌、乳癌或白血病細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的組合物，該組合物用于藥物中。
11.對(duì)忠有疾病或病癥的受治療者治療或預(yù)防的方法，該方法包括對(duì)受治療者施用權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的疫苗而治療所述疾病或病癥的步驟。
12.權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的組合物在制備預(yù)防或治療疾病病癥的疫苗中的用途。
13.如權(quán)利要求12所述的用途，其中，所述疾病為由病毒、細(xì)菌、酵母、真菌或原生動(dòng)物引起的感染。
14.如權(quán)利要求12所述的用途，其中，所述疾病為癌癥。
15.如權(quán)利要求14所述的用途，其中，所述癌癥為黑素瘤、肺腺癌、結(jié)腸癌、乳癌或白血病。
16.如權(quán)利要求12所述的用途，其中，所述疾病為自身免疫疾病。
17.如權(quán)利要求16所述的用途，其中，所述自身免疫疾病為多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或全身紅斑狼瘡。
18.一種制備權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的疫苗組合物的方法，該方法包括在核苷三磷酸存在下孵育微粒體群和抗原，接著處理以制備翻轉(zhuǎn)的微粒體，并且在生理稀釋劑和選擇性含有的佐劑中將得到的制品制成制劑。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述微粒體來自細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述主要組織相容性復(fù)合體蛋白來自與從中獲得微粒體的細(xì)胞異種的來源。
21.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述主要組織相容性復(fù)合體蛋白來自與從中獲得微粒體的細(xì)胞自身的來源。
22.如權(quán)利要求18-21中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述組合物還包括一種或幾種共激分子。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述共激分子選自B7和IL-2組成的組。
24.如權(quán)利要求18-23中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述抗原為來自病毒、細(xì)菌、酵母、真菌或原生動(dòng)物的抗原。
25.如權(quán)利要求18-23中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述抗原為自身抗原。
26.如權(quán)利要求18-23中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述抗原來自贅生性細(xì)胞或癌細(xì)胞，或者為正常自身蛋白。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中，所述贅生性細(xì)胞或癌細(xì)胞選自黑素瘤、肺腺癌、結(jié)腸癌、乳癌或白血病細(xì)胞。
28.一種試劑盒，該試劑盒包括在密封容器中的權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的組合物以及一種或幾種細(xì)胞因子和/或佐劑。
29.如權(quán)利要求28所述的試劑盒，其中，所述細(xì)胞因子是I1-2或IFNγ。
30.一種試劑盒，該試劑盒包括權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的組合物以及一種或幾種細(xì)胞因子和/或佐劑，用于對(duì)受治療者單獨(dú)、依次或同時(shí)給藥。
31.如權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中，所述細(xì)胞因子為I1-2或IFNγ。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，該組合物包括來自動(dòng)物細(xì)胞的翻轉(zhuǎn)的微粒體，或者其膜片段，所述微粒體或其膜片段與外部暴露的肽抗原和主要組織相容性復(fù)合體蛋白相結(jié)合。
文檔編號(hào)A61P37/00GK1856322SQ200480027398
公開日2006年11月1日 申請(qǐng)日期2004年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月1日
發(fā)明者王平, 李蘇翎 申請(qǐng)人:瑪麗皇后和威斯特-弗爾德學(xué)院