專利名稱：卵巢癌抗獨特型微抗體的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了一種高效生產(chǎn)卵巢癌抗獨特型微抗體的方法，以及有關(guān)的工程細(xì)胞的構(gòu)建、卵巢癌抗獨特型微抗體表達(dá)和純化工藝。
背景技術(shù)：
1974年Jerne根據(jù)現(xiàn)代免疫學(xué)對抗體分子獨特型的認(rèn)識，在Burnet“克隆選擇學(xué)說”的基礎(chǔ)上提出了著名的免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說。該學(xué)說認(rèn)為，任何抗體分子或淋巴細(xì)胞的抗原受體上都存在著獨特型，它們可被機(jī)體內(nèi)另一些淋巴細(xì)胞識別而刺激誘發(fā)產(chǎn)生抗獨特型。以獨特型同抗獨特型的相互識別為基礎(chǔ)，免疫系統(tǒng)內(nèi)構(gòu)成“網(wǎng)絡(luò)”聯(lián)系，在免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。根據(jù)免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說，抗獨特型抗體(anti-Id或Ab2β)(抗原刺激機(jī)體后產(chǎn)生抗體，這種抗體Ab1再次刺激機(jī)體產(chǎn)生抗抗體Ab2，抗抗體分為三種，其中一種為抗獨特型抗體，抗獨特型抗體中的Ab2β具有模擬抗原的作用)。具有模擬原始抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對始動抗原的特異性抗體或細(xì)胞免疫應(yīng)答，因而可抑制Ab1與相應(yīng)抗原的結(jié)合反應(yīng)。Ab2β具有與外來抗原相似的氨基酸排列順序或空間構(gòu)型，它能夠在體內(nèi)模擬始動抗原的作用，應(yīng)用Ab2β的這一特性，可有目的地制備Ab2β，將其作為抗原的替代物用于基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)研究。同時，Ab2β不僅可激發(fā)針對外來抗原或自身抗原Ab1產(chǎn)生前體細(xì)胞，使機(jī)體對入侵到體內(nèi)的抗原迅速發(fā)生免疫應(yīng)答，而且與記憶細(xì)胞的存在有關(guān)。當(dāng)抗原被其誘發(fā)的免疫應(yīng)答清除后，由于記憶細(xì)胞識別抗原受體具有更高的親和力，因而Ab2β替代原始抗原可能足夠刺激記憶細(xì)胞的增殖和存活。對Ab2β自模擬抗原的機(jī)制研究表明，Ab2β不僅具有模擬抗原的作用，同時又是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，參與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)
(1)Ab2β可以通過模擬抗原的序列或結(jié)構(gòu)，激活特異的細(xì)胞克隆，從而擴(kuò)大對特定抗原的體液免疫反應(yīng)。
(2)機(jī)體還可將Ab2β以抗獨特型肽的形式提呈給T細(xì)胞，使CD4+T細(xì)胞大量增殖，參與細(xì)胞免疫，有實驗表明此種反應(yīng)有可能不受MHC限制。
由于鼠源化抗體蛋白在人體內(nèi)誘發(fā)免疫反應(yīng)而限制了其在人體內(nèi)的應(yīng)用。因此，從80年代中期人們就開始研究用基因工程的方法對鼠單抗進(jìn)行改造或人源化。其中小分子抗體是重要的方法之一。1993年，意大利學(xué)者Pessi首先在其文章中使用了微抗體(minibody)一詞，來命名一種人工合成的僅有61個殘基，但又具有結(jié)合金屬活性的抗體。有研究者在荷瘤小鼠進(jìn)行了完整的IgG，F(xiàn)(ab’)2，scFv，和微抗體的免疫顯像效果和治療效果的比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微抗體的顯像效果最好，而在治療效果中以完整IgG和微抗體為佳。
卵巢腫瘤是婦科常見腫瘤，占女性生殖器官腫瘤的32％。它可發(fā)生于任何年齡，從嬰幼兒到老年均可見到，但生育年齡的發(fā)病率最高。由于卵巢位于盆腔內(nèi)，發(fā)病初期很少有癥狀，其惡性腫瘤極易擴(kuò)散并出現(xiàn)腹水。目前國內(nèi)外尚缺乏實用的早期診斷方法，而一旦發(fā)現(xiàn)，往往已屬晚期。盡管對于卵巢癌的治療近年來已有了長足的進(jìn)展，但卵巢癌5年生存率仍徘徊在30％左右，病死率超過宮頸癌和宮體癌之和，嚴(yán)重危害廣大婦女的健康。美國National CancerInstitute 1999年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，卵巢癌的發(fā)病率是女性癌癥發(fā)病率的第五位。其中白種女性、日本、西班牙和菲律賓中發(fā)病最高的年齡段為30-54歲。
由于目前已發(fā)現(xiàn)的腫瘤抗原極少，且難以大量制備。因而利用Ab2β的特性制備腫瘤疫苗倍受重視，稱為″抗獨特型疫苗″。Wagner等用抗獨特型抗體ACA125作為疫苗治療了16例晚期或復(fù)發(fā)的上皮性卵巢癌。這些患者接受了3至9次的ACA125免疫治療，其中9例患者誘導(dǎo)產(chǎn)生了Ab3(Ab2β注入荷腫瘤的動物或病人可誘導(dǎo)出稱之為抗-抗-獨特型抗體的Ab3)和特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)，3例患者IFN-y升高。這些患者的平均無進(jìn)展生存期為11個月，而Ab3陰性組為8個月。Remartz等用ACA125對45例晚期或復(fù)發(fā)的卵巢癌患者進(jìn)行主動免疫治療，患者外周血T淋巴細(xì)胞內(nèi)IFN-r，，IL-2，IL-4增加。
COC166-9鼠單克隆抗體對卵巢上皮癌具有較好的特異性，免疫組織化學(xué)染色證實80％卵巢上皮癌染色陽性，而與其他惡性組織交叉反應(yīng)較少，在已檢測過的正常組織中尚未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。用COC166-9免疫同系小鼠，制備出來的抗獨特型抗體6B11具有模擬卵巢癌抗原OC166-9的功能，可在體內(nèi)外誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗卵巢癌體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。我們將6B11scFv(單鏈可變區(qū))與帶有人IgG1鉸鏈區(qū)的重鏈CH3片段融合構(gòu)建小分子抗體基因，即抗獨特型微抗體(anti-Idminibody)基因，并進(jìn)行表達(dá)。由于該抗體，通過與CH3融合，增加了分子量和穩(wěn)定性，實現(xiàn)了部分人源化。在體內(nèi)應(yīng)用時，具有scFv片段和其他融合蛋白無法比擬的優(yōu)越性。
但由于6B11VLVHhC基因是真核生物基因，目前公開的6B11VLVHhC基因5′端起始序列的G和C含量較高，含有較多的大腸桿菌的稀有密碼子，在大腸桿菌中的表達(dá)量很低，不適宜大規(guī)模生產(chǎn)。
本發(fā)明系統(tǒng)提供了一種高效生產(chǎn)卵巢癌抗獨特型微抗體的方法。通過優(yōu)化編碼卵巢癌抗獨特型微抗體的核苷酸序列，優(yōu)化表達(dá)載體/宿主菌組合，同時改進(jìn)發(fā)酵工藝，提高卵巢癌抗獨特型微抗體的表達(dá)水平。同時簡便純化工藝，獲得高表達(dá)、高得率、極具產(chǎn)業(yè)化價值的一種卵巢癌抗獨特型微抗體生產(chǎn)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種高效和/或簡便的生產(chǎn)卵巢癌抗獨特型微抗體的方法。
本發(fā)明的另一目的就是提供卵巢癌抗獨特型微抗體的編碼序列和用于該方法的表達(dá)載體及工程細(xì)胞。
在本發(fā)明的第一方面，就是提供了一種編碼卵巢癌抗獨特型微抗體的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列編碼區(qū)與SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
在另一優(yōu)選例中，所述的核苷酸序列含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，就是提供了一種表達(dá)載體與宿主菌的優(yōu)化組合，其特征在于，所述的表達(dá)載體含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體是pTrcHisA/6B11VLVHhC。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種工程細(xì)胞，其特征在于，它整合有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種生產(chǎn)卵巢癌抗獨特型微抗體的方法，該方法包括步驟a)在適合的表達(dá)條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出卵巢癌抗獨特型微抗體；b)分離純化出表達(dá)的卵巢癌抗獨特型微抗體。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的步驟(a)的培養(yǎng)條件包括(i)氮源含有機(jī)氮源和無機(jī)氮源，其中有機(jī)氮源如蛋白胨、酵母粉，或二者的混合物，總濃度0.1-3％；無機(jī)氮源如氨水或NH4Cl、(NH4)2SO4等銨鹽，濃度0-1.5％。
(ii)無機(jī)鹽包括磷酸鹽、枸鹽酸鹽、Mg2+鹽等。較佳地，磷酸鹽緩沖體系濃度20-200mM，pH5-8；Mg2+鹽0-5mM。
(iii)在培養(yǎng)基中添加維生素B1作為補(bǔ)充維生素，濃度1～1000PPM。
(iv)根據(jù)M9培養(yǎng)基中的微量元素配方，微量元素可加0.1-2ml/L培液。
(v)碳源包括甘油、葡萄糖、乳糖等?？梢允菃我惶荚?，也可以是混合碳源。較佳地，碳源選自下組甘油濃度為0.1-3％；乳糖濃度為0.1-3％；葡萄糖濃度為0.1-1.5％。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的步驟(b)的分離條件包括(vi)對發(fā)酵樣品通過離心和/或過濾方式取出發(fā)酵上清液，獲得菌體；(vii)破碎細(xì)胞，獲得破菌液；(viii)對破菌液進(jìn)行離心以去除破菌上清液，獲得沉淀；(ix)將沉淀進(jìn)行變復(fù)性；(x)通過鹽析和/超濾進(jìn)行初步層化后，或直接通過層析純化方法，從而得到純度達(dá)到95％的純品。


圖1顯示了表達(dá)質(zhì)粒pTrcHisA/6B11VLVHhC的構(gòu)建過程。
附圖2是人卵巢癌抗獨特型微抗體基因6B11VLVHhC的PCR擴(kuò)增與電泳鑒定，其中泳道1為1kb DNA Ladder，泳道2為6B11VLVHhC基因的PCR產(chǎn)物。
具體實施例方式
本發(fā)明人通過深入而廣泛的研究，通過基因編碼序列的優(yōu)化設(shè)計，將卵巢癌抗獨特型微抗體編碼序列轉(zhuǎn)入大腸桿菌，從而實現(xiàn)了高水平表達(dá)，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
在另一優(yōu)選例中，通過表達(dá)質(zhì)粒和宿主菌的優(yōu)化組合，進(jìn)一步提高了卵巢癌抗獨特型微抗體的表達(dá)水平。
在另一優(yōu)選例中，還通過發(fā)酵工藝的優(yōu)化，不僅提高了卵巢癌抗獨特型微抗體表達(dá)量，而且簡化了分離純化工藝。
外源基因的高水平表達(dá)，至少涉及宿主、載體和克隆基因三者之間的相互關(guān)系，也受其所處的環(huán)境條件的影響，本研究通過優(yōu)化選擇多種表達(dá)載體，如pBADHisA、pBAD/gIIIA、pTrcHisA等，獲得表達(dá)載體/宿主菌的優(yōu)化組合。將修飾后的6B11VLVHhC插入不同的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過表達(dá)實驗結(jié)果，優(yōu)選載體pTrcHisA-宿主菌JF1125組合，實現(xiàn)了在大腸桿菌中的高效表達(dá)，表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的50％左右。質(zhì)粒pTrcHisA拷貝數(shù)高，帶有trc啟動子、rrnBanti-termination region及rrnB轉(zhuǎn)錄終止子，可使外源基因得到高效穩(wěn)定表達(dá)；同時，宿主菌JF1125在發(fā)酵過程中不易受到微生物的侵染。
為大規(guī)模獲得卵巢癌抗獨特型微抗體，需要在發(fā)酵罐中進(jìn)行表達(dá)培養(yǎng)。本發(fā)明研究了中試發(fā)酵工藝，優(yōu)化后的表達(dá)水平達(dá)到1500mg/L。
經(jīng)過本發(fā)明的反復(fù)實驗，優(yōu)化后的表達(dá)條件如下(1)培養(yǎng)基高密度改良M9培養(yǎng)基。
(2)發(fā)酵條件培養(yǎng)溫度28～40℃，更佳為30～37℃；pH6.0～8.0，更佳為6.5～7.5；誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.1～2mM，更佳為0.2～1mM。
在發(fā)酵表達(dá)后，對表達(dá)的卵巢癌抗獨特型微抗體包涵體蛋白進(jìn)行分離。通常，發(fā)酵樣品先以離心、過濾等方式去除發(fā)酵液上清，獲得菌體。緩沖溶液懸浮菌體后，以超聲波破碎、高壓機(jī)械破碎等方式進(jìn)行完全破菌，獲得破菌液。然后對破菌液進(jìn)行離心以去除破菌上清液，獲得沉淀。沉淀含目的蛋白質(zhì)卵巢癌抗獨特型微抗體。對破菌沉淀進(jìn)行變復(fù)性，獲得的有活性的卵巢癌抗獨特型微抗體再進(jìn)行下步純化。純化一般包括兩個步驟，第一步采用鹽析和/或超濾進(jìn)行初步純化，第二步采用層析純化方法。適用于本發(fā)明的層析技術(shù)包括陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。
經(jīng)不同變復(fù)性和層析過程比較，優(yōu)化的純化方法包括1.采用高壓壓榨破碎菌體的方式，獲得粗包涵體。
2.采用含有一定變性劑條件下的洗滌液純化包涵體，獲得純度大于85％的包涵體。
3.采用含有高濃度的變性劑溶解包涵體。
4.采用稀釋復(fù)性的方式，復(fù)性微抗體蛋白，獲得有活性的微抗體目的蛋白。
5.采用超濾的方式替換緩沖體系，使樣品適合進(jìn)行層析純化。
6.采用一步陰離子交換層析的方式，并且選擇一定的梯度洗脫的方式，獲得純度大于95％的微抗體純品，同時去除了核酸等其他雜質(zhì)。
經(jīng)過上步純化，可得到卵巢癌抗獨特型微抗體純品，純化得率40％以上，純度95％以上，純品得率約500mg/L發(fā)酵液。
純化后卵巢癌抗獨特型微抗體可用常規(guī)技術(shù)制成各種劑型。
在本發(fā)明的一個實例中，提供了卵巢癌抗獨特型微抗體基因的獲得及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，優(yōu)化后的基因使得表達(dá)卵巢癌抗獨特型微抗體的表達(dá)量提高。
在本發(fā)明的另一個實例中，經(jīng)過表達(dá)載體和宿主菌的組合優(yōu)化，進(jìn)一步提高了卵巢癌抗獨特型微抗體的表達(dá)量。
在本發(fā)明的另一個實例中，經(jīng)過發(fā)酵工藝的優(yōu)化，進(jìn)一步提高了卵巢癌抗獨特型微抗體的表達(dá)量。
在本發(fā)明的另一個實例中，經(jīng)過純化，可得到純品500mg/L。
純化后原液加入適當(dāng)輔料，制成卵巢癌抗獨特型微抗體的注射用粉針劑。初步穩(wěn)定性試驗表明，該粉針劑穩(wěn)定。
中試研究表明，產(chǎn)品制造工藝穩(wěn)定，操作簡單，周期短，成本低，每升發(fā)酵液可獲得卵巢癌抗獨特型微抗體純品500mg。適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)優(yōu)化后的卵巢癌抗獨特型微抗體基因非常適合在大腸桿菌中表達(dá)，具有高表達(dá)、高穩(wěn)定的特點。
(2)優(yōu)化的表達(dá)載體和宿主菌的組合進(jìn)一步提高了表達(dá)量，通過控制關(guān)鍵的發(fā)酵工藝條件，使表達(dá)水平達(dá)到1500mg/L。
(3)變復(fù)性工藝簡單，蛋白復(fù)性率高。
(4)純化工藝簡便，回收率高，使得大規(guī)模生產(chǎn)卵巢癌抗獨特型微抗體成為可能。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1目的基因的獲得及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建目的基因的獲得人卵巢癌抗獨特型微抗體基因來源于北京人民醫(yī)院婦科腫瘤研究中心，我們設(shè)計了引物對之進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的基因序列如SEQ ID NO1所示。設(shè)計一對引物，用PCR的方法對未優(yōu)化的基因5′端序列進(jìn)行定點修飾，同時引入NcoI、EcoRI酶切位點。
表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建選擇大腸桿菌JF1125作為宿主菌，并對該菌株進(jìn)行了改造，將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒pTrcHisA/6B11VLVHhC轉(zhuǎn)化大腸桿菌JF1125。從含100μg/ml氨芐青霉素和34μg/ml氯霉素的LB平板上分別挑取單克隆(JF1125/pTrcHisA/6B11VLVHhC)，接種到3ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床上300rpm振蕩過夜，接種于于20mL LB(氨芐青霉素濃度為100μg/ml和34μg/ml氯霉素)培養(yǎng)液中，在37℃，250rpm條件下培養(yǎng)至OD600＝0.5-1.0，此時細(xì)胞處于對數(shù)生長期；無菌條件下加入IPTG至終濃度為1mM，繼續(xù)在37℃，250rpm條件下誘導(dǎo)表達(dá)，3小時后取樣，SDS-PAGE檢測表達(dá)情況。結(jié)果表明在41KD附近有一表達(dá)條帶，分子量與微抗體的理論分子量基本一致。
實施例2表達(dá)載體和宿主菌的優(yōu)化組合選擇大腸桿菌JF1125作為宿主菌，并對該菌株進(jìn)行了改造，將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒pTrcHisA/6B11VLVHhC、pBADHisA/6B11VLVHhC，pBAD/gIIIA/6B11VLVHhC分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌JF1125。從含100μg/ml氨芐青霉素和34μg/ml氯霉素的LB平板上分別挑取單克隆，接種到3ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床上300rpm振蕩過夜，接種于于20mL LB(氨芐青霉素濃度為100μg/ml和34μg/ml氯霉素)培養(yǎng)液中，在37℃，250rpm條件下培養(yǎng)至OD600＝0.5-1.0，此時細(xì)胞處于對數(shù)生長期；然后在無菌條件下向菌株JF1125/pTrcHisA/6B11VLVHhC的培養(yǎng)液加入IPTG至終濃度為1mM、菌株JF1125/JF1125/pTrcHisA/6B11VLVHhC和JF1125/JF1125/pBAD/gIIIA/6B11VLVHhC培養(yǎng)液中加入阿拉伯糖至終濃度0.002％，繼續(xù)在37℃，250rpm條件下誘導(dǎo)表達(dá)，3小時后取樣，SDS-PAGE檢測表達(dá)情況。
根據(jù)SDS-PAGE圖譜掃描結(jié)果如下

通過實驗比較，采用菌株JF1125/pTrcHisA/6B11VLVHhC獲得的人卵巢癌抗獨特型微抗體表達(dá)量最高，效果明顯。
實施例3卵巢癌抗獨特型微抗體發(fā)酵配制LB發(fā)酵種子液300ml和M9發(fā)酵培養(yǎng)基2.7L，配制50％葡萄糖與5％CA補(bǔ)料100ml。放在250ml三角燒瓶中。消毒。種子液冷卻后接種。達(dá)到OD 0.6～1后，停止培養(yǎng)，接種上罐?？刂茰囟?7℃，pH＝7.0，培養(yǎng)至OD到3.0，加入0.6g IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，3小時后收罐，期間流加補(bǔ)料維持菌生長。離心收集菌體，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示目的蛋白表達(dá)水平達(dá)到50％。
實施例4卵巢癌抗獨特型微抗體純化


經(jīng)過以上純化工藝，最后可得蛋白純品500mg/L。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海新生源醫(yī)藥研究有限公司<120>卵巢癌抗獨特型微抗體的生產(chǎn)方法<160>2<210>1<211>1143<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)…(1143)<223>優(yōu)化的人卵巢癌抗獨特型微抗體基因<400>1ATGGGAGATA TCGAACTTAC TCAATCACCG CTGTCCCTGC CTGTCAGTCT50TGGAGATCAA GCCTCCATCT CTTGCAGATC TAGTCAGAAC CTTGTACACA100GTAATGGAAA CACCTATTTA CATTGGTACC TGCAGAAGCC AGGCCAGTCT150CCAAAGCTCC TGATCTACATA GTTTCCAACC GATTTTCTGG GGTCCCAGAC200AGGTTCAGTG GCAGTGGATC AGGGACAGAT TTCACACTCA AGATCAGCAG250AGTGGAGGCT GATGATCTGG GAGTTTATTT CTGCTCTCAG AGTACACATT300TTCCGTACAC GTTCGGAGGG GGGACAAAGT TGGAAATAAA ACGGGGTGGA350GGCGGTTCAG GCGGAGGTGG CTCTGGCGGT GGCGGATCGC AGGTCAAACT400GCAGGAGTCT GGCCCTGGGA TATTGCAGCC CTCCCAGACC CTCAGTCTGA450CTTGTTCTTT CTCTGGGCTT TCACTGCACA CTTATGGTAT AGGAGTAGGC500TGGATTCGTC AGCCTTCAGG GAAGGGTCTG GAGTGGCTGG CACACATTTG550GTGGAATAAT AATAAGTACT ATAACACAGC CCTGAAGAGC CGGCTCACTG600TCTCCAAGGA CGCCTCCAAC AACCAGGTAT TCCTCAACAT CGCCAGTGTG650GACACTGCAG ATACTGCCAC ATACTACTGT GCTCGAATAG CCCTTATTAC700
TACGAAAATA GCGTGGTACT TCGATGTCTG GGGCCAAGGC ACCACGGTCA750CCGTCTCCTC AGGATCCGAG TCCAAATCTT GTGACAAAAC TCACACATGC800CCACCGTGCC CACTCGAGGG GCAGCCCCGA GAACCACAGG TGTACACCCT850GCCCCCATCC CGGGATGAGC TGACCAAGAA CCAGGTCAGC CTGACCTGCC900TGGTCAAAGG CTTCTATCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT950GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACG CCTCCCGTGC TGGACTCCGA1000CGGCTCCTTC TTCCTCTACA GCAAGCTCAC CGTGGACAAG AGCAGGTGGC1050AGCAGGGGAA CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC1100CACTACACGC AGAAGAGCCT CTCCCTGTCT CCGGGTAAAT GA1142<210>2<211>380<212>PRT<213>智人<400>2MET Gly Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser1 5 10 15Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Leu Val20 25 30His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly35 40 45Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ile Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly50 55 60Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu65 70 75 80Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser85 90 95Gln Ser Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu100 105 110Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly115 120 125Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro130 135 140Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Leu Ser Leu His145 150 155 160Thr Tyr Gly Ile Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly165 170 175Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn Asn Asn Lys Tyr Tyr Asn180 185 190Thr Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Val Ser Lys Asp Ala Ser Asn Asn195 200 205
Gln Val Phe Leu Asn Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr210 215 220Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Ala Leu Ile Thr Thr Lys Ile Ala Trp Tyr225 230 235 240Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser245 250 255Glu Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Leu260 265 270Glu Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg275 280 285Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly290 295 300Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro305 310 315 320Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser325 330 335Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln340 345 350Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His355 360 365Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys370 375 380
權(quán)利要求
1.一種編碼卵巢癌抗獨特型微抗體的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列編碼區(qū)與SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
2.如權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，含有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
3.一種表達(dá)載體和宿主菌的優(yōu)化組合，其特征在于，所述的表達(dá)載體含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列。
4.一種工程細(xì)胞，其特征在于，它整合有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體。
5.如權(quán)利要求4所述的工程細(xì)胞，其特征在于，它是大腸桿菌。
6.一種生產(chǎn)卵巢癌抗獨特型微抗體的方法，其特征在于，該方法包括步驟(a)在適合的表達(dá)條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求4所述的工程細(xì)胞，從而表達(dá)出卵巢癌抗獨特型微抗體；(b)分離純化出表達(dá)的卵巢癌抗獨特型微抗體。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)的培養(yǎng)條件包括培養(yǎng)溫度28～40℃，更佳為30～37℃；pH6.0～8.0，更佳為6.5～7.5；誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.1～2mM，更佳為0.2～1mM。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)的分離條件包括(i)對發(fā)酵樣品通過離心和/或過濾方式取出發(fā)酵上清液，獲得菌體；(ii)破碎細(xì)胞，獲得破菌液；(iii)對破菌液進(jìn)行離心以去除破菌上清液，獲得沉淀；(iv)將沉淀進(jìn)行變復(fù)性；(v)通過鹽析和/或超濾進(jìn)行初步純化，或直接通過層析純化方法，從而得到純度達(dá)到95％的純品。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種編碼卵巢癌抗獨特型微抗體的核苷酸序列，高效生產(chǎn)卵巢癌抗獨特型微抗體的生產(chǎn)方法，以及有關(guān)的工程細(xì)胞構(gòu)建、表達(dá)和純化的工藝。優(yōu)化后的卵巢癌抗獨特型微抗體基因，非常適合在大腸桿菌中表達(dá)，同時通過優(yōu)化組合表達(dá)質(zhì)粒和宿主菌以及發(fā)酵工藝優(yōu)化，提高了表達(dá)量，具有高表達(dá)、高穩(wěn)定的優(yōu)點。本發(fā)明可高效、簡便、低成本的獲得卵巢癌抗獨特型微抗體純品。
文檔編號C07K1/00GK1854295SQ20051002536
公開日2006年11月1日 申請日期2005年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月25日
發(fā)明者任軍, 黃陽濱, 孫九如, 顧小偉, 賴偉萍, 沈麗麗 申請人:上海新生源醫(yī)藥研究有限公司