專利名稱：：包含c4bp核心蛋白質(zhì)和單體抗原的產(chǎn)品及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及大分子裝配體，例如融合蛋白，其包含佐劑和抗原，與單獨(dú)使用該抗原相比，這種裝配體能引起針對該抗原的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。
背景技術(shù)：
：佐劑提高針對抗原的免疫應(yīng)答，因此在疫苗中可用。但是只有有限幾種佐劑被許可用于人體，并且因?yàn)樽饔酶鼜?qiáng)的佐劑是從動物研究中獲知的，因此對于可安全使用于人體、具有更強(qiáng)作用的免疫佐劑的需要是非常明顯的。最近的幾篇綜述，請見“疫苗佐劑進(jìn)展”(“Advancesinvaccineadjuvants”)(NatureBiotechnology，1999年第17卷，1075-1081頁)和“疫苗佐劑的發(fā)現(xiàn)和傳遞的最新進(jìn)展”(“RecentAdvancesinthediscoveryanddeliveryofvaccineadjuvants”)(NatureReviewsinDrugDiscovery，2003年第2卷，727-735頁)。補(bǔ)體系統(tǒng)由一系列血清蛋白組成，這些蛋白質(zhì)在針對外來抗原的免疫系統(tǒng)的應(yīng)答中具有重要作用。補(bǔ)體系統(tǒng)在其中的主要組分被切割時被活化，并且產(chǎn)物單獨(dú)或與其它蛋白質(zhì)一起激活其它的補(bǔ)體蛋白質(zhì)造成蛋白質(zhì)水解級聯(lián)反應(yīng)。補(bǔ)體系統(tǒng)的活化會帶來多種應(yīng)答，包括血管通透性增強(qiáng)、吞噬細(xì)胞的趨化性、炎癥細(xì)胞的活化、對外來顆粒的調(diào)理作用、以及對細(xì)胞的直接殺傷作用和組織損傷。補(bǔ)體系統(tǒng)的活化可能是由抗原-抗體復(fù)合物所引發(fā)的(經(jīng)典途徑)，或者正常緩慢的活化可能在例如細(xì)菌和病毒等入侵生物細(xì)胞壁的存在下被放大(旁路途徑)。補(bǔ)體系統(tǒng)與細(xì)胞免疫系統(tǒng)通過涉及C3的特異性途徑來相互作用，C3是在經(jīng)典途徑和旁路途徑的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。C3的蛋白質(zhì)水解活化會產(chǎn)生大的片段(C3b)，并暴露出可與外來的親核物質(zhì)(例如入侵生物或外來細(xì)胞的細(xì)胞表面蛋白)共價相互作用的化學(xué)反應(yīng)性的內(nèi)在硫酯鍵。其結(jié)果是潛在的抗原用C3b“標(biāo)記”并保持與該蛋白相結(jié)合一直到C3b被進(jìn)一步水解為iC3b和C3d，g。所述后者片段分別是補(bǔ)體受體CR3和CR2的配體(CR2也被稱為CD21)。這樣用C3b標(biāo)記抗原成為了靶向帶有這些受體的免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的機(jī)制。這種靶向機(jī)制對于免疫應(yīng)答的增強(qiáng)是重要的，這首先被以下實(shí)驗(yàn)證明，其中小鼠的循環(huán)C3耗盡并用抗原(綿羊紅細(xì)胞)免疫，C3的去除減弱了抗體對這種抗原的應(yīng)答(M.B.Pepys，J.Exp.Med.，140，126-145，1974)。通過在遺傳上缺失C3或缺失產(chǎn)生C3的補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)的上游組分(即C2和C4)的動物進(jìn)行的研究證明了C3的作用(J.M.Ahearn和D.T.Fearon，Adv.Immunol.，46，183-219，1989)。最近表明，與未經(jīng)修飾的抗原對照相比，模型抗原與兩個以上拷貝的鼠C3d片段序列的線性結(jié)合造成小鼠抗體應(yīng)答的顯著增強(qiáng)(1000-10000倍)(P.W.Dempsey等，Science，271，348-350，1996；WO96/17625，PCT/GB95/02851)。這種增強(qiáng)效應(yīng)在不使用傳統(tǒng)佐劑例如弗氏完全佐劑的情況下也可以發(fā)生，而這種佐劑具有毒性而不適于人類使用。已證明這種顯著效應(yīng)的機(jī)制是多價的C3d構(gòu)建體與B細(xì)胞上的CR2高親和力結(jié)合，之后CR2與另一種B細(xì)胞膜蛋白質(zhì)CD19以及膜結(jié)合免疫球蛋白共連接，來產(chǎn)生對B細(xì)胞細(xì)胞核的信號。然而，經(jīng)證明產(chǎn)生大量含有三個C3d拷貝的同源重組蛋白質(zhì)是非常困難的。主要問題在于1)含有(三個)重復(fù)序列的構(gòu)建體的遺傳不穩(wěn)定性；2)來自在大腸桿菌中形成的包涵體的重組蛋白質(zhì)的折疊(或溶解和再折疊)。使含有C3d基因的重復(fù)拷貝的構(gòu)建體的遺傳不穩(wěn)定性最小化的一個方法在WO99/35260和WO01/77324中有描述。這些申請中描述的技術(shù)是使用編碼C3d重復(fù)片段的DNA的不同序列。使用補(bǔ)體4結(jié)合蛋白(C4bp)的多聚化系統(tǒng)在WO91/11461有描述。人C4b結(jié)合蛋白(C4BP)是具有高分子量(570kDa)的血漿糖蛋白，它具有由7條相同的α鏈和1條β鏈組成的蜘蛛形結(jié)構(gòu)。C4bpα鏈具有負(fù)責(zé)該分子裝配成多聚體的C末端核心區(qū)域。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)模型，在一個C4bp單體+498位的半胱氨酸與另一單體+510位的半胱氨酸形成二硫鍵。僅含7條α鏈的次要形式也已在人血漿中發(fā)現(xiàn)。這種血漿糖蛋白的天然功能是抑制補(bǔ)體活化的經(jīng)典途徑。C4bpα鏈的大部分由長度大約60個氨基酸的8個串聯(lián)排列的結(jié)構(gòu)域組成，稱為補(bǔ)體控制蛋白(CCP)重復(fù)序列。WO91/11461提出C4bp蛋白質(zhì)進(jìn)行多聚化的能力可以用來制備包含全部和部分C4bp和目的生物蛋白質(zhì)的融合蛋白。在WO91/11461中描述的融合蛋白中優(yōu)選包括一個或多個CCP重復(fù)序列(也稱為SCR)。WO91/11461還建議將該融合蛋白用作疫苗。現(xiàn)已制出一些具體蛋白質(zhì)，其包含與乙肝e抗原片段融合的至少一個C4bpSCR區(qū)域。所使用的e抗原片段是能夠形成多聚體結(jié)構(gòu)的核心抗原片段。LibyhM.T.等(1997，Blood，90，3978-3983)提出，所有的CCP都能被耗盡(僅余下C末端57個氨基酸)而不阻止多聚化。C4bp的這段C末端區(qū)域在這里被稱為C4bp核心。Shinya等(1999，Biomed&Pharmacother，Vol.53471)也闡述了具有自體裝配的多聚體可溶性CD4-C4bp融合蛋白，其中該融合蛋白是在人293細(xì)胞系中表達(dá)的。在Oudin等(2000，JournalofImmunology，Vol.1641505)中也描述了C4bp的用途。Christiansen等(2000，JournalofVirology，Vol.744672)討論了CD46-C4bp融合蛋白的治療用途。WO2004/020639提供了在原核宿主中獲得重組融合蛋白的方法，其包含C4bpα鏈的C末端核心蛋白質(zhì)任選與異源多肽融合的支架，所述重組融合蛋白能夠在原核宿主細(xì)胞中形成可溶性形式的多聚體。發(fā)明概述本發(fā)明是基于有關(guān)C4bp融合蛋白的具體種類的新發(fā)現(xiàn)。上面討論的一些現(xiàn)有技術(shù)提出，在C4bp部分基本上是惰性載體的基礎(chǔ)上，C4bp融合蛋白運(yùn)載目的治療性蛋白質(zhì)的用途。前文所述WO91/11461例舉了包含可形成多聚體的抗原的融合蛋白。與之相比，本發(fā)明是基于能自然形成多聚體的抗原不適于與C4bp核心融合，因?yàn)檫@種抗原事實(shí)上可能干擾C4bp核心裝配成多聚體。另外，已有證明，令人驚訝的是，C4bp核心與單體抗原的融合會導(dǎo)致針對該抗原強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。在隨后的例子中顯示包含單體抗原的融合蛋白引起高滴度、抑制性抗體應(yīng)答，與之相比，當(dāng)抗原與弗氏佐劑共同注射時會引起低滴度、非抑制性的抗體應(yīng)答。因此，本發(fā)明提供了通過將單體抗原與C4bp核心蛋白質(zhì)在復(fù)合物中結(jié)合提高單體抗原免疫原性的方法。在優(yōu)選方法中，所述單體抗原與C4bp核心蛋白質(zhì)共價結(jié)合。在更優(yōu)選的方法中，所述單體抗原與C4bp核心蛋白遺傳性融合。本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)針對抗原的抗體高滴度的方法，以及高滴度抗血清的用途，所述抗血清是通過在通過被動免疫的感染性或惡性疾病預(yù)防和/或治療中使用所述方法來產(chǎn)生的。在優(yōu)選方法中，通過分離超免疫血漿或血清中的免疫球蛋白級分而部分純化針對所述抗原的高滴度抗體，在最佳方法中，所述超免疫血漿或血清的免疫球蛋白級分是從將用所述抗血清來預(yù)防或治療感染性或惡性疾病的同一物種個體中分離出來的。因此本發(fā)明提供了產(chǎn)品，其包含了C4bp核心蛋白質(zhì)；和單體抗原。此第一和第二組分可以是融合蛋白的形式。或者，它們可以通過化學(xué)偶聯(lián)，所述偶聯(lián)通過第一組分的任一個氨基酸側(cè)鏈，或通過特異性加到第一組分上的氨基酸的側(cè)鏈來化學(xué)偶聯(lián)所述第二組分。所述第一或第二組分可被緊密但非共價結(jié)合。例如，所述第一組分的氨基酸側(cè)鏈可被修飾以具有附加的生物素基團(tuán)，并且該生物素可用來與鏈霉抗生物素蛋白組合(鏈霉抗生物素蛋白作為第二組分)，或者與鏈霉抗生物素蛋白融合的抗原可通過該生物素與第一組分組合。在另外的可能性中，生物素化的抗原和生物素化的第一組分可以通過加入鏈霉抗生物素蛋白質(zhì)并純化所得的復(fù)合物而緊密但非共價地結(jié)合在一起。為避免疑問，命名“第一”和“第二”組分并不暗示或表示在該兩種組分的產(chǎn)物中的具體線性順序。這兩種組分可以任何順序連接。因此當(dāng)兩種組分都是多肽并且所述產(chǎn)物被制成融合蛋白，這兩種組分的N末端和C末端順序可以任意交換。本發(fā)明還提供了編碼所述第一和第二組分的融合蛋白的核酸。本發(fā)明還提供了包含所述核酸的載體和攜帶所述載體的宿主細(xì)胞。在另一項(xiàng)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備產(chǎn)品的方法，所述產(chǎn)品包含C4bp核心蛋白質(zhì)；和多肽單體抗原，該方法包括表達(dá)編碼以融合蛋白形式的這兩種組分的核酸，以及回收所述產(chǎn)品。在另一項(xiàng)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備產(chǎn)品的方法，所述產(chǎn)品包含C4bp核心蛋白質(zhì)；和非-多肽單體抗原，該方法包括表達(dá)編碼C4bp核心蛋白質(zhì)的核酸，將所述核心蛋白質(zhì)與所述抗原連接，以及回收所述產(chǎn)品。制備所述產(chǎn)品的方法可在真核或原核細(xì)胞中進(jìn)行。本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)對抗原的免疫應(yīng)答的方法，這種方法包含將有效量的根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)品給予受試者。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的產(chǎn)品在治療人體或動物體的方法，特別是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法中的用途。本發(fā)明還提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明的產(chǎn)品與藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑的聯(lián)合。本發(fā)明還提供了制備在針對感染性物質(zhì)的被動免疫中使用的保護(hù)性免疫血清的方法，該方法包含用本發(fā)明的產(chǎn)品接種動物，從該動物回收抗血清。然后該抗血清可用于對人受試者的被動免疫方法。該人受試者可以是感染、或有感染該感染性物質(zhì)風(fēng)險的受試者。附圖簡述圖1給出C4bp核心蛋白質(zhì)的比對。圖2給出在大腸桿菌中表達(dá)蛋白質(zhì)的結(jié)果。圖3給出在還原和非還原條件的凝膠上電泳的本發(fā)明蛋白質(zhì)的對比。
發(fā)明內(nèi)容C4bpα鏈的核心蛋白質(zhì)這里指“C4bp核心蛋白質(zhì)”或“核心蛋白質(zhì)”，或“C4bp支架”。這些術(shù)語可以互換。這一蛋白質(zhì)可以是哺乳動物的C4bp核心蛋白質(zhì)，或是其能夠形成多聚體并發(fā)揮佐劑作用的片段，或是其能夠形成多聚體并能夠發(fā)揮佐劑作用合成的或嵌合的變體。本發(fā)明中，C4bp核心蛋白質(zhì)或包含所述核心蛋白質(zhì)的C4bpα鏈片段(請見下文詳述)用作佐劑。SEQIDNO1的人C4bp核心蛋白質(zhì)對應(yīng)于本領(lǐng)域已知可形成多聚體的全長C4bp蛋白質(zhì)序列的氨基酸+493到+549。本發(fā)明進(jìn)一步包括了所述C4bp核心的衍生物在提高抗原免疫原性中的用途。這些衍生物包括其突變體，其可能包含氨基酸缺失、添加特別是半胱氨酸殘基的添加或取代、由C4bp家族的不同成員的部分的融合而形成的雜合或嵌合分子和/或環(huán)狀排列的蛋白質(zhì)支架，都可用于保持上述的佐劑性質(zhì)。本發(fā)明還可以使用基于不同物種C4bp核心序列比對得到的人工共有C4bp序列。在很多可能性中的這類嵌合分子的一個例子在下文給出(SEQID20，圖1)。因此佐劑可能是C4bp核心以及可選的與所述核心融合的一個或多個SCR。在一個最優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明產(chǎn)品的C4bp組分是C4bpα鏈的核心蛋白質(zhì)，即這里限定的不與任何C4bpSCR序列相連的核心蛋白質(zhì)。在這項(xiàng)具體實(shí)施方案中，所述C4bp核心理想地由SEQIDNO1的殘基1-57或其同系物的對應(yīng)殘基組成，或由SEQIDNO1或其同系物的至少47個氨基酸的片段組成。本發(fā)明產(chǎn)品的C4bp核心可另外包含N端或C端的延伸部分如靈活接頭。通常這種接頭長度是幾個氨基酸，如長度是1至20個，例如2至10個氨基酸。一種這樣的接頭是(Glym-Ser)n接頭，其中m和n相互獨(dú)立為1到4。這些在本領(lǐng)域用來使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域彼此連接。因此所述第一組分可與所述第二組分通過這樣的接頭相連。優(yōu)選當(dāng)?shù)谝唤M分是C4bp核心時，它位于產(chǎn)品的C末端。本領(lǐng)域存在許多哺乳動物C4bp蛋白質(zhì)的序列。這些包括人C4bp核心蛋白質(zhì)(SEQIDNO1)。本領(lǐng)域還有許多人C4bp核心蛋白質(zhì)的同系物。有兩類同系物直向同系物(orthologue)和側(cè)向同系物(paralogue)。直向同系物的定義為不同生物體中的同源性基因，即這些基因具有共同祖先，這一共同祖先與產(chǎn)生這些基因的物種形成事件同時發(fā)生。側(cè)向同系物的定義為相同生物體內(nèi)衍生有基因、染色體或基因組復(fù)制的同源基因，即基因的共同祖先從最后一次物種形成事件起出現(xiàn)。例如，搜索GenBank、原始基因組痕跡(rawgenomictrace)以及EST(表達(dá)的序列標(biāo)簽)數(shù)據(jù)庫顯示了在包括黑猩猩、獼猴、兔、大鼠、狗、馬、小鼠、豚鼠、豬和牛內(nèi)的物種的哺乳動物C4bp核心SEQIDNO1同系物蛋白。C4bpSEQIDNO1的側(cè)向同系物和直向同系物已經(jīng)包括在圖1中的比對中?？傊?，SEQIDNOs1-19的比對如圖1所示?？梢钥闯?，所有19個序列具有高度相似性，盡管在C末端有較大程度的變異。并且，用如BLAST的常用搜索程序，可通過搜索DNA或蛋白質(zhì)序列的數(shù)據(jù)庫鑒定出C4bp核心蛋白質(zhì)。如果在數(shù)據(jù)庫中沒有所需的哺乳動物源的C4bp蛋白質(zhì)，可使用本領(lǐng)域已經(jīng)有的常規(guī)克隆方法得到它?；旧希@項(xiàng)技術(shù)包含用編碼現(xiàn)有的C4bp核心蛋白質(zhì)之一的核酸作為探針回收并確定其它目的物種中的C4bp核心蛋白質(zhì)的序列。對此存在多種技術(shù)，例如用合適的基因組DNA或mRNA來源(例如從胚胎中或活躍分裂的分化細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞中)PCR擴(kuò)增并克隆該基因，或使用包括從哺乳動物獲得cDNA文庫(例如來自上述來源之一的cDNA文庫)的方法，在中度到高度嚴(yán)格度條件(例如0.03M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉，大約50℃至60℃)用已知的C4bp核酸探測所述文庫，并回收編碼那種哺乳動物的全部或部分C4bp蛋白質(zhì)的cDNA。當(dāng)?shù)玫搅瞬糠謈DNA后，全長編碼序列可通過引物延伸技術(shù)來確定。能夠形成多聚體的C4bp核心蛋白質(zhì)的片段可包含至少47個氨基酸，優(yōu)選至少50個氨基酸。該片段形成多聚體的能力可通過以下方法檢測根據(jù)本發(fā)明在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)該片段，在可多聚化全部57個氨基酸C4bp核心的條件回收所述C4bp片段，并確定該片段是否也形成多聚體。理想地，C4bp核心的片段包含有SEQIDNO1的至少殘基6-52或其同系物的對應(yīng)殘基。也可以使用C4bp核心的變體和能夠形成多聚體的片段，所述變體類似保留了形成多聚體的能力(對于片段可如上述測定)。所述變體優(yōu)選與野生型哺乳動物C4bp核心或其多聚體形成片段有至少70％，更優(yōu)選至少80％，甚更優(yōu)選至少90％，例如至少95％或最優(yōu)選至少98％的序列同一性。一方面，C4bp核心應(yīng)該是包含SEQIDNo1的出現(xiàn)在位置12的甘氨酸、出現(xiàn)在位置28的丙氨酸、出現(xiàn)在位置29、34、36和41的亮氨酸、出現(xiàn)在位置32的酪氨酸、出現(xiàn)在位置33的賴氨酸、以及優(yōu)選出現(xiàn)在位置6和18的兩個半胱氨酸殘基的核心。理想地，該變體將會保留在這些殘基之間的相對空間距離。上述指定的同一性程度是相對于SEQIDNOs1-20中任一或其可形成多聚體的片段。最優(yōu)選所述指定的同一性程度是相對于SEQIDNO1或其可形成多聚體的片段。序列同一性程度可以通過GAP算法確定，該算法是在本領(lǐng)域廣泛使用的算法“Wisconsin程序包”的一部分，可從Accelrys(原為GeneticsComputerGroup，Madison，WI)獲得。GAP使用Needlema和Wunsch算法以最大化匹配數(shù)目和最小化缺口數(shù)目的方式來比對兩條完整的序列。GAP可用來比對具有相似長度的短的緊密相關(guān)序列，因此適合于確定某一序列是否達(dá)到上述的同一性水平。GAP可以在默認(rèn)參數(shù)的條件下使用。哺乳細(xì)胞C4bp核心蛋白質(zhì)的合成變體包含具有在C末端或N末端的一個或更多個氨基酸取代、缺失、插入或添加的變體。取代是最有可能的。取代包括保守取代。保守取代的例子包括對于通常稱為Dayhoff組的相似氨基酸的組的那些取代。如下所示可以制備并檢測其形成多聚體并用作佐劑的能力的C4bp核心蛋白質(zhì)的片段和變體包括SEQIDNOs37到44，如表1所示表1A＝SEQIDNO，B＝序列，C＝％同一性，參比具有相同長度的SEQIDNO1的片段計(jì)算。如果使序列缺失，除了N末端或C末端的截短，優(yōu)選將缺失限制在不超過1個、2個或3個可以是連續(xù)的或不連續(xù)的缺失。如果作插入，或者核心蛋白質(zhì)序列的N端或C端延伸，理想地?cái)?shù)目也應(yīng)該受限制，以保證核心蛋白質(zhì)的長度不超過野生型序列長度20個氨基酸以上，優(yōu)選不超過15個氨基酸，更優(yōu)選不超過10個氨基酸。因此在SEQIDNO1的情況中，經(jīng)過插入或延長修飾的核心蛋白質(zhì)，理想地在長度上不超過77個氨基酸?？乖乖悄軌虮豢贵w或T細(xì)胞受體識別的任何分子。然而，并非所有的抗原都是免疫原。免疫原是引起免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)。一方面，本發(fā)明使不是免疫原的抗原變成免疫原，并使作為弱的免疫原的抗原變成較好的免疫原。本發(fā)明一個重要特征是當(dāng)將抗原通過與C4bp核心遺傳融合而產(chǎn)生時，單體抗原是極優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈儾粫璧KC4bp核心蛋白質(zhì)裝配成寡聚的因而具有功能的形式。但是另一方面，當(dāng)抗原通過化學(xué)方法或非共價偶聯(lián)到C4bp核心蛋白質(zhì)時，所述抗原可以是非單體的。因此單體抗原可分為兩個主要組1)抗原可以是自然狀態(tài)下是多聚的(二聚的或更高級別的多聚體)的親本蛋白質(zhì)的片段或衍生物，但該抗原自身在親本蛋白質(zhì)形成多聚體的條件下并不形成多聚體；和2)自然狀態(tài)是單體的抗原。這兩種抗原的例子將在下文詳細(xì)討論。單體抗原具有相同點(diǎn)在于，它們可以在單條DNA上編碼，并且當(dāng)這條DNA與編碼C4bp核心蛋白質(zhì)的DNA融合并隨后翻譯成蛋白質(zhì)時，該抗原通過抗原上的唯一點(diǎn)與單條C4bp核心蛋白質(zhì)鏈相連。這種抗原的簡單例子是來自雞蛋白的溶菌酶。編碼全長溶菌酶開放閱讀框架的cDNA可以不妨礙所得融合蛋白的C4bp部分的裝配的方式與C4bp核心開放閱讀框架融合。。生物合成之后，與C4bp核心融合的單條多肽鏈將，例如通過蛋白酶，被加工從而在多肽鏈內(nèi)部產(chǎn)生新的N末端和C末端。如果通過蛋白水解切割產(chǎn)生的兩條或更多條鏈通過例如二硫鍵來相互連接，那么C4bp融合蛋白質(zhì)在加工結(jié)束時會與通常不認(rèn)為是單體的蛋白質(zhì)相連接。然而，為本發(fā)明的目的，這種類型的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是單體的，因?yàn)樗鼈儽痪幋a為單個開放閱讀架中的單個融合蛋白。這種類型的一個例子是胰島素原，它在生物合成后被加工成具有稱為A和B的兩條鏈，這兩條鏈通過二硫鍵相連。胰島素原的片段，稱為C肽鏈，在融合蛋白前體的蛋白水解加工后去除。所述單體抗原可以來源于在其自然狀態(tài)下并非必須是單體的蛋白質(zhì)。因此許多自然中處于多聚體狀態(tài)的抗原可以被修飾，例如通過蛋白質(zhì)改造技術(shù)，從而它們變成單體的。有三個例子。作為這種抗原的例子是一種來源于流感病毒血凝素蛋白質(zhì)的抗原。已知該抗原在其自然狀態(tài)下形成復(fù)合的三聚體結(jié)構(gòu)(Wilson等，Nature289，366-373，1981)。但是，有可能通過去除使該分子三聚體化的卷曲螺旋來得到單體片段。Jeon和Arnon的工作提供一個具體例子(ViralImmunology15，165-176，2002)。這些作者只使用了血凝素的殘基96-261，以得到只包含所述血凝素球狀區(qū)域的片段。另一個例子是瘧原蟲子孢子表面蛋白質(zhì)1(MSP1)。這個巨大(約200kDa)的蛋白質(zhì)裝飾了造成瘧疾感染的血液階段的子孢子的表面。該蛋白質(zhì)一般通過C末端GPI錨(其中GPI是糖基化磷脂酰肌醇)固定在子孢子表面。這種GPI錨之前是氨基酸的疏水段。由于這種錨，在自然中發(fā)現(xiàn)全長MSP1和稱為MSP1.19的C末端片段(即使當(dāng)子孢子入侵紅細(xì)胞的時候其仍是膜結(jié)合的)都不呈單體狀態(tài)。具有單個疏水跨膜區(qū)域的許多膜蛋白都有同樣的情況。本發(fā)明最好通過刪除所述疏水段來進(jìn)行。關(guān)于MSP1.19蛋白質(zhì)與C4bp核心蛋白質(zhì)的融合請見下面的例子描述。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，本發(fā)明的產(chǎn)品是瘧原蟲MSP1單體的抗原性片段與C4bp核心蛋白質(zhì)的融合。所述瘧原蟲MSP1抗原性片段可包含由約50到約200個，優(yōu)選約50到約150個氨基酸。所述抗原性片段可以來自任何瘧原蟲物種，如惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)、或間日瘧原蟲(Plasmodiumvivax)、或卵形瘧原蟲(Plasmodiumovale)、或三日瘧原蟲(Plasmodiummalariae)(這些都能導(dǎo)致人的疾病)或約氏瘧原蟲。盡管缺失是獲得單體或寡聚體蛋白質(zhì)的最簡單的方法，有些時候突變一個或多個氨基酸就足夠了。一個這樣的例子是Cpn10，與呈主要同種型的C4bp核心相似，Cpn10蛋白質(zhì)在它的天然狀態(tài)是七聚體蛋白質(zhì)。Cpn10的單個氨基酸的突變使它轉(zhuǎn)變成單體突變體，這使其適合與C4bp核心蛋白質(zhì)融合(Guidry等，BMCBiochemistry4，14-26，2003)。另一種使此蛋白質(zhì)單體化的方法是缺失N末端或C末端的氨基酸，(Llorca等，Biochem.BiophysicaActa1337，47-56，1997；Seale和Horowitz，J.Biol.Chem.270，30268-30270，1995)，從而缺失負(fù)責(zé)亞基之間的相互作用的區(qū)域?？傮w來講，對于那些具有裝配成寡聚體結(jié)構(gòu)(例如病毒衣殼蛋白)的強(qiáng)烈傾后，從而破壞與它們?nèi)诤系腃4bp核心蛋白質(zhì)的裝配的蛋白來講，缺失負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的區(qū)域或者突變界面的殘基的原理可用于得到單體蛋白質(zhì)。抗原可以被分為兩類，這兩類都適用于本發(fā)明。第一類是外源抗原，并且包括在傳染性生物體中的所有分子。細(xì)菌免疫原、寄生蟲免疫原以及病毒免疫原都可以用作多肽部分來制備用作疫苗的多聚體或者異多聚體C4bp融合蛋白。這些免疫原的細(xì)菌來源包括引起細(xì)菌性肺炎、腦膜炎、霍亂、白喉、百日咳、破傷風(fēng)、肺結(jié)核和麻風(fēng)病的那些。寄生蟲來源包括瘧疾寄生蟲，如瘧原蟲、錐形蟲和利什曼原蟲種。病毒來源包括痘病毒，例如天花病毒，牛痘病毒和orf病毒；皰疹病毒，如I型和II型單純皰疹病毒，B-病毒，水痘-帶狀皰疹病毒，巨細(xì)胞病毒，以及Epstein-Barr病毒；腺病毒，如乳腺腺病毒(mastadenovirus)；乳多空病毒(papovavirus)，如乳頭瘤病毒(papillomavirus)如HPV16，以及多瘤病毒(polyomavirus)如BK和JC病毒；微小病毒(parvovirus)，如腺伴隨病毒；呼腸孤病毒(reovirus)，如1、2、3型呼腸孤病毒；環(huán)狀病毒(orbivirus)，如科洛拉多蜱傳熱；輪狀病毒(rotavirus)，如人類輪狀病毒；甲病毒屬，如東部腦炎病毒以及委內(nèi)瑞拉腦炎病毒；風(fēng)疹病毒(rubivirus)，如風(fēng)疹(rubella)；黃病毒(flavivirus)，如黃熱病毒，登革熱病毒，日本腦炎病毒，蜱傳性(Tick-borne)腦炎病毒，和丙型肝炎病毒；冠形病毒，如人冠形病毒；副粘病毒，例如1，2，3，4型副流感病毒以及腮腺炎；麻疹病毒(morbillivirus)，如麻疹病毒(measlesvirus)；肺病毒，如呼吸道合胞病毒；水泡性病毒，如水泡性口炎病毒；狂犬病毒(lyssavirus)，如狂犬病毒(rabivirus)；正粘病毒，如A和B型流感；布尼亞病毒(bunyavirus)，如長曲棍球病毒(laCrossevirus)；白蛉病毒(phlebovirus)，如山谷熱病毒(RiftValleyfevervirus)；納伊羅病毒(nairovirus)，如剛果出血熱病毒；噬肝DNA病毒科(hepadnaviridae)，如乙型肝炎；沙粒病毒(arenavirus)，如1cm病毒，套鎖病毒(lassovirus)以及胡寧病毒(Juninvirus)；逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如HTLVI，HTLVII，HIV-1和HIV-2；腸道病毒，如1、2、3型脊髓灰質(zhì)炎病毒，柯薩奇病毒，艾柯病毒，人類腸道病毒，甲型肝炎病毒，戊型肝炎病毒，諾瓦克病毒(Norwalk-virus)；鼻病毒，如人類鼻病毒；以及纖絲病毒科(filoviridae)，如馬爾堡病毒(Marburgvirus)及埃博拉病毒(Ebolavirus)。來自這些細(xì)菌、病毒以及寄生蟲來源的抗原可以用來制備用作疫苗的多聚體蛋白質(zhì)。所述多聚體可包含帶有不同抗原的單體的混合物。來自這些細(xì)菌、病毒以及寄生蟲來源的抗原可以被認(rèn)為是外源性抗原，因?yàn)樗鼈円话悴淮嬖谟谒拗髦?，并且在宿主基因組中是不被編碼的。相反，內(nèi)源性抗原一般存在于宿主中或者在宿主基因組中被編碼，或者兩者皆有。產(chǎn)生對內(nèi)源性抗原的免疫應(yīng)答的能力在治療攜帶所述抗原的腫瘤，或者中和針對腫瘤的生長因子中是有用的。第一類同源性抗原的例子就是HER2，其為稱為Herceptin的單克隆抗體的靶。第二類生長因子類的內(nèi)源性抗原的例子是促性腺激素釋放激素(稱為GnRH)，它對前列腺的一些癌癥有營養(yǎng)作用。用本發(fā)明制備的免疫原可用于研究或者治療目的。例如，研究應(yīng)用包括產(chǎn)生抗血清來預(yù)測在基因組序列數(shù)據(jù)中的基因產(chǎn)物。此需求應(yīng)用于原核生物(如細(xì)菌)和真核生物(包括真菌和哺乳動物)的基因產(chǎn)物。抗原可以是本領(lǐng)域?qū)τ谝呙绯Ｓ玫娜魏伍L度，從短肽到很大的蛋白質(zhì)。非多肽型免疫原可能是例如糖或者核酸。奈瑟氏種和肺炎鏈球菌種的多糖外殼是可用于本發(fā)明目的的多糖的例子。當(dāng)非多肽免疫原是本發(fā)明的部分產(chǎn)品時，所述免疫原可以通過常規(guī)的合成方法共價連接到所述產(chǎn)品的第一組分。通常，所述免疫原可能連接到包含所述第一組分的C4bp核心蛋白質(zhì)的N-或C-末端，或者連接到氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)(例如賴氨酸的ε-氨基或者半胱氨酸的巰基)，或它們的組合。每個融合蛋白可加入一個以上的免疫原。為了輔助偶聯(lián)，可將半胱氨酸殘基加到所述C4bp核心蛋白質(zhì)，例如作為N-或C-末端。本發(fā)明在產(chǎn)生免疫應(yīng)答上有很多優(yōu)勢。例如，使用多聚體可以允許若干抗原同時呈遞到免疫系統(tǒng)。從而可以制備能引起針對一個以上抗原決定簇的免疫應(yīng)答的多價疫苗，所述抗原決定簇可在單個或若干不同生物體中存在。因此，在另一方面，所述單體抗原可能是包含兩個不同抗原決定簇的合成抗原，所述抗原決定簇來自兩個不同生物體或者來自同一生物體的兩種不同蛋白質(zhì)。后者的例子是子孢子抗原序列的融合物，例如與MSP1序列連接的環(huán)子孢子蛋白的兩個或更多NANP重復(fù)序列。后者的第二個例子是由Neirynck等描述的((NatureMedicine5，1157-1163，1999))與單體的流感血凝素片段融合的M2e序列。所以，根據(jù)本發(fā)明形成的疫苗可以用于針對一種以上疾病的同時接種，或者同時靶向于在已知病原體上的多個抗原決定簇。這些決定簇可能存在于單個的單體單元中或者在組合起來提供異源多聚體的不同的單體單元上。C4bp核心融合蛋白特別在免疫中是有用的，因?yàn)樗龊诵牡鞍踪|(zhì)在正常情況下存在于接受免疫者的血清或者血漿中，并且所述核心蛋白質(zhì)并不引起針對其本身的免疫應(yīng)答。已知C4bp蛋白質(zhì)在很多哺乳動物物種中都存在，并且對于哺乳動物物種合適的同系物可以通過標(biāo)準(zhǔn)的基因克隆技術(shù)由本領(lǐng)域技術(shù)人員發(fā)現(xiàn)。核酸本發(fā)明的產(chǎn)品可以通過用編碼所述蛋白質(zhì)的核酸構(gòu)建體，在原核生物或真核生物的宿主細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白來制備。如果抗原是多肽，從核酸序列中表達(dá)融合蛋白將可以被用來生產(chǎn)本發(fā)明的產(chǎn)品。所以本發(fā)明提供編碼本發(fā)明產(chǎn)品的核酸構(gòu)建體，通常是DNA或RNA。所述構(gòu)建體通常為可復(fù)制載體的形式，其中編碼所述蛋白質(zhì)的序列可操作地與適于在理想的宿主細(xì)胞中表達(dá)所述蛋白的啟動子可操作地連接?？赡軙o所述載體提供復(fù)制起點(diǎn)及可選地啟動子的調(diào)節(jié)物。所述載體可能含有一個或者更多個選擇性標(biāo)記基因。本領(lǐng)域已知有很多這樣的真核生物和原核生物的表達(dá)載體，并且本發(fā)明可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的個人偏好利用任何的載體。多種原核生物宿主細(xì)胞可以用于本發(fā)明的方法。這些宿主可包括埃希氏菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、嗜熱菌屬、沙門氏菌屬、腸細(xì)菌屬或鏈霉菌屬的菌株。例如，如果來自埃希氏菌屬的大腸桿菌在本發(fā)明方法中使用，所用的此細(xì)菌的優(yōu)選菌株包括BL21(DE3)的衍生物，包括C41(DE3)，C43(DE3)或者CO214(DE3)(如WO98/02559所述并且可得)。甚更優(yōu)選，缺乏原噬菌體DE3的這些菌株的衍生物在啟動子不是T7啟動子時可用。原核生物載體包括載體細(xì)菌質(zhì)粒，例如來自大腸桿菌的質(zhì)粒包括ColEI、pCR1、pBR322、pMB9以及它們的衍生物；更寬的宿主范圍的質(zhì)粒例如RP4；噬菌體DNA，例如λ噬菌體的各種衍生物，例如NM989；以及其它DNA噬菌體，例如M13和絲狀的單鏈DNA噬菌體?？梢杂脴?biāo)準(zhǔn)的重組DNA方法來操縱這些以及其它載體，來引入與啟動子可操作連接的本發(fā)明的核酸。所述啟動子可能是誘導(dǎo)型啟動子。合適的啟動子包括T7啟動子、tac啟動子、trp啟動子、λ啟動子PL或PR、及其它本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的啟動子。也可使用多種真核生物宿主細(xì)胞，包括例如酵母、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞。哺乳動物細(xì)胞包括CHO和小鼠細(xì)胞、非洲綠猴細(xì)胞如COS-1、和人細(xì)胞。已知適合表達(dá)蛋白質(zhì)的很多真核生物載體。這些載體可以被設(shè)計(jì)為通過染色體摻入真核生物細(xì)胞基因組或者保留在基因組以外，或只短暫保留在真核細(xì)胞中。這些核酸可以可操作地連接到合適的啟動子，如有力的病毒啟動子(包括CMV啟動子)，和SV40T-抗原啟動子或逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR。為了得到本發(fā)明的產(chǎn)品，攜帶本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞可在適于表達(dá)所述蛋白質(zhì)的環(huán)境中培養(yǎng)，并且從所述培養(yǎng)基的細(xì)胞回收所述蛋白質(zhì)。細(xì)胞培養(yǎng)編碼根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白的質(zhì)粒可以用常用的轉(zhuǎn)化技術(shù)引入宿主細(xì)胞中，并在有助于產(chǎn)生所述融合蛋白的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。如果使用誘導(dǎo)型啟動子，一開始在缺無所述誘導(dǎo)物時培養(yǎng)所述細(xì)胞，然后一旦所述細(xì)胞生長到較高密度就加入所述誘導(dǎo)物從而獲得最大的蛋白質(zhì)回收。細(xì)胞培養(yǎng)條件在本領(lǐng)域公知，所述條件可根據(jù)同樣已知的方法來使用。盡管WO91/11461認(rèn)為原核生物宿主細(xì)胞可用于制備基于C4bp的蛋白質(zhì)，但對于此制備沒有試驗(yàn)證據(jù)。最近，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和在原核生物表達(dá)系統(tǒng)中制備的C4bp核心融合的蛋白質(zhì)依然保持它們的功能活性。這在WO2004/020639中公開，其內(nèi)容引入文本作為參考。這些方法可以在本發(fā)明融合蛋白的制備中使用。從培養(yǎng)物中回收蛋白質(zhì)一旦所述細(xì)胞已生長到可以產(chǎn)生所述蛋白，就可以從所述細(xì)胞中回收所述蛋白質(zhì)。因?yàn)槲覀凅@奇地發(fā)現(xiàn)，所述蛋白質(zhì)保持可溶，所述細(xì)胞通常被離心沉淀下來并通過超聲處理而裂解。例如在更高速(如一小時15,000rpm)的離心后蛋白質(zhì)級分保持可溶并且此級分依然存留在上清中。在所述上清蛋白質(zhì)級分中的融合蛋白可以用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)層析技術(shù)的任何合適組合來進(jìn)一步純化。我們已經(jīng)使用離子交換層析然后凝膠過濾層析。其它層析技術(shù)如親和層析也可用。在一個具體實(shí)施方案中，我們發(fā)現(xiàn)在裂解物離心后或在任何的其它純化步驟之后加熱上清樣品都會有助于回收蛋白質(zhì)。所述樣品可以被加熱到約70-80℃約10-30分鐘。根據(jù)所述蛋白質(zhì)的意向用途，所述蛋白質(zhì)可以用更多的純化步驟(例如透析)或者濃縮步驟(例如凍干)來處理。組合物及其用途根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)品可以以藥物組合物的形式來制備。所述產(chǎn)品會與一或多種藥學(xué)可接受的載體或者稀釋劑一起存在。所述組合物將根據(jù)意向用途和產(chǎn)品的給予途徑來制備。因此本發(fā)明提供了包含多聚體形式的本發(fā)明產(chǎn)品以及一或多種藥學(xué)可接受載體或稀釋劑的組合物，以及所述組合物在治療或預(yù)防人或動物受試者的免疫治療方法中的用途。藥物可接受的載體或者稀釋劑包括在適合經(jīng)口、直腸、經(jīng)鼻、局部(包括頰和舌下)、陰道或腸胃外(包括皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)，鞘內(nèi)、硬膜外)給予的配制劑中使用的那些。這些配制劑可方便地以單位劑量形式(dosageform)存在并且可以用在藥學(xué)領(lǐng)域內(nèi)公知的任何方法來制備。液體的藥學(xué)可給予組合物可以通過，例如通過溶解、分散等本發(fā)明融合蛋白及載體中的可選藥學(xué)佐劑(例如，水、生理鹽水葡萄糖溶液、甘油、乙醇以及類似物質(zhì))來制備，從而形成溶液或懸液。如果需要的話，要給予的所述組合物也可能包含輔助物質(zhì)如pH緩沖劑及類似的物質(zhì)。制備這種劑量形式的實(shí)際方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知或?qū)⑹秋@而易見的。例如見Remington’sPharmaceuticalSciences，MackPublishingCompany，Easton，Pennsylvania，19thEdition，1995。根據(jù)本發(fā)明的組合物可另外包含一或多種佐劑，例如礦物質(zhì)鹽類如氫氧化鋁或磷酸鈣，或者細(xì)胞因子如自介素-12或GM-CSF。合適的佐劑的更完整的清單在SinghandO’Hagan，NatureBiotechnology，17，1075-1081，1999的表1中已經(jīng)給出，其內(nèi)容引入本文作為參考。根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)品，理想地以組合物或配制劑的形式，可通過給予人或動物受試者本產(chǎn)品或其組合物，來用于本文所述的治療方法。減輕接受治療的受試者的癥狀的有效量將由醫(yī)生根據(jù)病人及所治療的情況來決定?？芍苽浒秶?.25-95％的活性成分以及來自無毒載體的配平組成(balancemakeup)的劑量形式或者組合物。腸胃外給藥一般是以皮下、肌肉內(nèi)或者靜脈內(nèi)注射為特征?？勺⑸鋭?injectable)可以常用形式來制備，所述常用形式為液體溶液或懸液、適合在注射前溶解或懸浮于液體中的固體形式、或者乳狀液。適當(dāng)?shù)馁x形劑是，例如水、生理鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇或類似物質(zhì)。一個最近設(shè)計(jì)的腸胃外給藥的途徑是植入緩釋或者持續(xù)釋放系統(tǒng)，這樣就保持了恒定的劑量水平。見例如美國專利No.3,710,795。所述產(chǎn)品的劑量將由所述抗原的性質(zhì)決定，并且可由在常用疫苗配制劑中給予所述抗原的實(shí)際操作來決定。被動免疫在另一方面，本發(fā)明提供了用包含抗體的免疫血清被動免疫受試者的方法，所述免疫血清是通過給宿主受試者接種本發(fā)明的產(chǎn)品而獲得的。所述宿主受試者可以是人或非人的哺乳動物。所以在另一方面中，本發(fā)明提供了通過這種方法獲得的免疫血清，以及這種免疫血清在治療人體或動物體的方法中的用途。DNA疫苗在另一方面，本發(fā)明提供了包含編碼本發(fā)明重組融合蛋白產(chǎn)品的核酸序列的真核生物表達(dá)載體，該載體用于人體或動物的治療。這種治療可通過引入編碼引發(fā)免疫應(yīng)答的抗原的核酸序列來達(dá)到其治療效果。核酸的運(yùn)輸可以用質(zhì)粒載體(以“裸露的”或配制的形式)或重組表達(dá)載體來實(shí)現(xiàn)。DNA接種的綜述，見AdaG.和RamshawI，inExpertOpinioninEmergingDrugs8，27-35，2003。很多可以用于基因傳遞的病毒載體包括腺病毒、皰疹病毒、牛痘病毒或RNA病毒如逆轉(zhuǎn)錄病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以是鼠的或鳥的逆轉(zhuǎn)錄病毒的衍生物?？梢圆迦雴蝹€外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的例子包括但不局限于Moloney鼠白血病病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(MuMTV)、鼠乳腺癌病毒(MuMTV)、和Rous肉瘤病毒(RSV)。當(dāng)受試者是人的時候，可以使用如長臂猿白血病病毒(gibbonapeleukaemiavirus，GaLV)的載體。所述載體會包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，具體為足以指導(dǎo)RNA合成啟動的啟動子區(qū)域。合適的真核生物啟動子包括小鼠的金屬硫蛋白I基因的啟動子(Hamer等，1982，J.Molec.Appl.Genet.1273)；皰疹病毒的TK啟動子(McKnight，1982，Cell31355)；SV40早期啟動子(Benoist等，1981，Nature290304)；Rous肉瘤病毒啟動子(Gorman等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA796777)；和巨細(xì)胞病毒啟動子(Foecking等，1980，Gene45101)。將本發(fā)明此方面的載體作為質(zhì)粒載體或者作為病毒載體的一部分給予受試者，可能被很多不同途徑影響。質(zhì)粒DNA可以是裸露的或者用陽離子以及中性的脂類(脂質(zhì)體)配制或者被微包囊化來作直接或間接的運(yùn)輸。DNA序列也可以被包含在病毒(如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、痘病毒)載體中，這些載體可以用于直接或間接的運(yùn)輸。運(yùn)輸途徑包括但并不局限于經(jīng)口、肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)(Sato，Y.etal.，1996，Science273352-354)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、肝內(nèi)、吸入、陰道內(nèi)滴注(Bagarazzi等，1997，JMed.Primatol.2627)、直腸內(nèi)、腫瘤內(nèi)、或腹膜內(nèi)。所以，本發(fā)明包括作為藥學(xué)組合物的本文所述載體，其可用于用所述DNA載體轉(zhuǎn)染一些細(xì)胞，這樣就會表達(dá)治療性多肽并且具有治療作用，也就是誘導(dǎo)對抗原的免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明的藥學(xué)組合物是通過使根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體成為適于給予受試者的形式(用溶劑、載體、運(yùn)輸系統(tǒng)、賦形劑、和添加劑或輔助劑)來制備的。經(jīng)常使用的溶劑包括滅菌的水和生理鹽水(緩沖的或非緩沖的)。一種載體包括金顆粒，它可以通過生命系統(tǒng)(biolistically)傳遞(如在氣壓下)。其它經(jīng)常使用的載體或運(yùn)輸系統(tǒng)包括陽離子脂質(zhì)體、螺旋形(cochleate)和微膠囊，這些可以以液體溶液給予、密閉在運(yùn)輸膠囊中、或者摻入食物。給予基因運(yùn)輸載體的另一種配制劑涉及脂質(zhì)體。將脂質(zhì)體包裹提供了給予多核苷酸以及表達(dá)載體的另一種配制劑。脂質(zhì)體是由一個或多個脂質(zhì)雙層環(huán)繞的水性區(qū)室(compartment)組成的顯微囊泡。通常見Bakker-Woudenberg等，1993，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12(Suppl.1)S61，和Kim，1993，Drugs46618。脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的組成相似，所以結(jié)果脂質(zhì)體可以被安全給予并可生物降解。根據(jù)制備方法，脂質(zhì)體可能是單層的或多層的，并且脂質(zhì)體可在直徑從0.02μM到大于10μM的尺寸變化。見例如Machy等，1987，LIPOSOMESINCELLBIOLOGYANDPHARMACOLOGY(JohnLibbey)，和Ostro等，1989，AmericanJ.Hosp.Phann.461576.中所述。表達(dá)載體可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)被包裹在脂質(zhì)體中。各種各樣不同的脂質(zhì)體組合物以及合成方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。見例如US-A-4,844,904，US-A-5,000,959，US-A-4,863,740，US-A-5,589,466，US-A-5,580,859，和US-A-4,975,282，這些都引入本文作為參考。通常，脂質(zhì)體包裹的載體的給予劑量將隨病人的年齡、體重、身高、性別、一般醫(yī)療狀態(tài)以及之前的醫(yī)療歷史等因素而變化。具體配制劑的劑量范圍可以通過使用合適的動物模型來確定。本發(fā)明可以通過以下的實(shí)施例來闡明。實(shí)施例1-惡性瘧原蟲MSP1.19-兔C4bp的融合蛋白。這個實(shí)施例闡明了單體抗原(包含惡性瘧原蟲MSP1的氨基酸1567-1661)與兔核心C4bp蛋白質(zhì)的融合。這個融合蛋白叫做AVD174，在細(xì)菌株C41(DE3)中表達(dá)并從中純化。所述融合蛋白本身可不需要添加任何佐劑單獨(dú)免疫兔子?？寺【幋aMSP1蛋白質(zhì)殘基1567-1661的合成的294bpDNA片段，用NdeI和BamHI消化，并且連接到已經(jīng)用NdeI和BamHI消化的pAVD181。這樣就形成編碼95個氨基酸的MSP1.19蛋白片段的開放閱讀框架與在T7晚期啟動子下游的兔C4bpα鏈的C末端57個殘基融合。通過DNA測序來檢查這個稱為pAVD174的構(gòu)建物。編碼AVD174融合蛋白的核苷酸序列是atgttaaacatttcccagcaccagtgcgttaagaaacagtgcccgcagaactctggttgtttccgtcatctggacgagcgtgaagagtgcaaatgtctgctgaactacaaacaggaaggtgataaatgtgttgagaacccaaacccgacctgtaacgaaaacaacggcggttgtgacgctgatgctaaatgcaccgaggaagacagcggttctaacggtaagaaaatcacctgcgagtgtactaaaccggactcctacccgctgttcgacggtatcttttgctccGGATCCGAGGTCCCGGAAGGCTGTGAGCAGGTGCAAGCGGGTCGCCGTCTCATGCAGTGTCTCGCAGACCCATACGAAGTGAAAATGGCCCTGGAGGTCTACAAGCTGTCTCTGGAGATTGAACTCCTGGAACTGCAGCGCGATAAGGCACGTAAAAGCTCTGTGCTGCGCCAGCTGTAA(SEQIDNO21)這個構(gòu)建體編碼的融合蛋白AVD174的氨基酸序列如下MLNISQHQCVKKQCPQNSGCFRHLDEREECKCLLNYKQEGDKCVENPNPTCNENNGGCDADAKCTEEDSGSNGKKITCECTKPDSYPLFDGIFCSGSEVPEGCEQVQAGRRLMQCLADPYEVKMALEVYKLSLEIELLELQRDKARKSSVLRQL(SEQIDNO22)SEQIDNO22的殘基1-95對應(yīng)于惡性瘧原蟲MSP1(單體抗原)的殘基1567-1661，并且SEQIDNO22的殘基98-154對應(yīng)于兔C4bp核心蛋白質(zhì)的57個殘基。GS接頭序列出現(xiàn)在這兩個組分之間。所述蛋白質(zhì)的大約分子量為17,319道爾頓，理論pI為5.05。表達(dá)使編碼惡性瘧原蟲-兔C4bp核心蛋白質(zhì)的質(zhì)粒pAVD174在大腸桿菌菌株C41(DE3)中表達(dá)。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在LB培養(yǎng)基中于37℃生長到OD600大約為0.6，然后加入IPTG至終濃度0.5mM誘導(dǎo)表達(dá)，并使所述培養(yǎng)物在37℃再生長三個小時，然后通過離心來收獲所述細(xì)胞。AVD174融合蛋白的純化從1升的C41(DE3)細(xì)胞中純化蛋白質(zhì)AVD174。在含有20mM的MESpH6.5以及5mMEDTA的緩沖液中通過超聲處理來裂解細(xì)胞后，所有的融合蛋白都發(fā)現(xiàn)在可溶級分中。離心后的上清上樣于HitrapS柱子。陽離子柱(HiTrapS)在20mMMESpH6.5，20mMEDTA緩沖液(緩沖液A)中平衡柱子。所述蛋白質(zhì)用10個柱體積的梯度從緩沖液A到緩沖液B(緩沖液A加0.5MNaCl)來洗脫。AVD174在大約200mMNaCl的濃度被洗脫。包含AVD174的HiTrapS級分用Millipore濃縮器(截?cái)嘀?0K)濃縮，然后上樣到凝膠過濾柱。凝膠過濾柱(Superdex20026/60prepgrade)用20mMpH8.0的Tris緩沖液，150mMNaCl平衡Superdex20026/60柱子，然后上樣來自HiTrapS級分的濃縮的AVD174蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)在兩個峰被洗脫。正確折疊并且裝配的蛋白質(zhì)在156mls被洗脫，而在120mls洗脫的較早的次要的峰并不是正確裝配或折疊的。生物物理性質(zhì)含有二硫鍵((存在于除了鼠之外在所有的核心蛋白質(zhì)除了鼠源的核心蛋白，見圖1))的C4bp融合蛋白的寡聚體狀態(tài)可以簡單地通過比較存在或不存在還原劑β巰基乙醇((BME))的SDS-PAGE凝膠中所述蛋白質(zhì)的行為來檢查。在不存在BME的情況下AVD177蛋白的表觀大小約為140KDa，然而在BME存在的情況下它被還原了，分析其表觀分子量剛超過20KDa。質(zhì)譜AVD147蛋白質(zhì)在被β巰基乙醇還原并用N-乙基馬來酰亞胺(NEM)烷基化后通過電子噴射質(zhì)譜進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示將14個NEM分子加入((每個125Da))分子量被確定為19,072Da蛋白質(zhì)。內(nèi)毒素水平純化蛋白質(zhì)中的內(nèi)毒素水平用LAL((鱟變形細(xì)胞裂解物))試劑盒形式Biowhittaker測定為每微克蛋白質(zhì)21EU。實(shí)施例2-惡性瘧原蟲falciparumMSP1.19蛋白與-人C4bp蛋白的融合蛋白。這個實(shí)施例闡明了單體抗原(包含瘧原蟲falciparum惡性瘧原蟲MSP1的氨基酸1567-1661)與人C4bp核心蛋白核心蛋白質(zhì)的融合。這種融合蛋白在細(xì)菌株C41(DE3)中表達(dá)并從中純化。所述融合蛋白本身可不需要添加任何佐劑單獨(dú)免疫人?？寺【幋aMSP1蛋白質(zhì)殘基1567-1661的一個合成的的294個堿基對bp的DNA片段，編碼MSP1的1567-1661段氨基酸被用NdeI和BamHI消化酶切，并且連接到已經(jīng)用NdeI和BamHI消化被這兩個酶切好的pAVD181質(zhì)粒。這樣就形成的開放的可讀框編碼95個氨基酸的MSP1.19蛋白片段的開放閱讀框架融合到與在T7晚期啟動子下游的人子的C4bp的α鏈的碳C末端的57個殘基融合，在T7晚期啟動字的下游。通過DNA測序來檢查這個稱為pAVD177的構(gòu)建體被叫做PAVD174，通過DNA測序證明其可靠性。編碼AVD177融合蛋白的核算核苷酸序列是atgttaaacatttcccagcaccagtgcgttaagaaacagtgcccgcagaactctggttgtttccgtcatctggacgagcgtgaagagtgcaaatgtctgctgaactacaaacaggaaggtgataaatgtgttgagaacccaaacccgacctgtaacgaaaacaacggcggttgtgacgctgatgctaaatgcaccgaggaagacagcggttctaacggtaagaaaatcacctgcgagtgtactaaaccggactcctacccgctgttcgacggtatcttttgctccGGATCCgagacccccgaaggctgtgaacaagtgctcacaggcaaaagactcatgcagtgtctcccaaacccagaggatgtgaaaatggccctggaggtatataagctgtctctggaaattgaacaactggaactacagagagacagcgcaagacaatccactttggataaagaactataa(SEQIDNO23)這個構(gòu)建體編碼的融合蛋白AVD177的氨基酸序列如下MLNISQHQCVKKQCPQNSGCFRHLDEREECKCLLNYKQEGDKCVENPNPTCNENNGGCDADAKCTEEDSGSNGKKITCECTKPDSYPLFDGIFCSGSETPEGCEQVLTGKRLMQCLPNPEDVKMALEVYKLSLEIEQLELQRDSARQSTLDKEL(SEQIDNO24)SEQIDNO24的殘基1-95對應(yīng)于瘧原蟲falciparum惡性瘧原蟲MSP1(單體抗原)的殘基1567-1661，并且SEQIDNO序列號24的殘基98-154對應(yīng)號氨基酸殘基與于人子的C4bp核心蛋白核心蛋白質(zhì)相的57個殘基對應(yīng)。一個GS連接頭序列出現(xiàn)在這兩個成分組分之間。這個所述蛋白質(zhì)的大約分子量為17,261道爾頓，理論等電點(diǎn)pI為4.72。表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)如圖2所示。該圖中顯示了AVD77蛋白質(zhì)在未誘導(dǎo)(U)或者在37℃或30℃誘導(dǎo)后在三種不同的細(xì)菌株C41(DE3)，BL21(DE3)和C43(DE3)中表達(dá)的SDS-PAGE凝膠。所述凝膠上的泳道如下泳道1分子量標(biāo)記(由上到下66，60，46，36，28，20，14，12，6KDa)泳道2C41(DE3)誘導(dǎo)前泳道3C41(DE3)37℃誘導(dǎo)后三小時泳道4C41(DE3)30℃誘導(dǎo)后三小時泳道5BL21(DE3)誘導(dǎo)前泳道6BL21(DE3)37℃誘導(dǎo)后三小時泳道7BL21(DE3)30℃誘導(dǎo)后三小時泳道8C43(DE3)誘導(dǎo)前泳道9C43(DE3)37℃誘導(dǎo)后三小時泳道10C43(DE3)30℃誘導(dǎo)后三小時可以看出，在C41(DE3)和菌株C41(DE3)中獲得了好的表達(dá)。相反，在被測條件下，在菌株BL21(DE3)中沒有發(fā)現(xiàn)表達(dá)(見圖2)。在30℃和37℃在LB培養(yǎng)基中生長培養(yǎng)物到光密度(OD600)約為0.6，然后加入IPTG至終濃度0.5mM的來誘導(dǎo)表達(dá)。AVD177融合蛋白的純化從在37℃誘導(dǎo)后生長3小時的1升C41(DE3)細(xì)胞中純化蛋白質(zhì)AVD177。在細(xì)菌沉淀裂解后，所有的融合蛋白都存在于可溶級分中。在包含20mMMESpH6.5和5mMEDTA的緩沖液中，通過超聲處理來裂解細(xì)胞。離心后的上清上樣至MonoS柱。陽離子柱(MonoSHR10/10)在20mMMESpH6.5，20mMEDTA緩沖液(緩沖液A)中平衡柱子。所述蛋白質(zhì)用從緩沖液A到緩沖液B的10個柱體積的梯度來洗脫，緩沖液B是緩沖液A加0.5MNaCl。AVD177在大約200mMNaCl的濃度被洗脫。含有AVD177的MonoS級分用Millipore濃縮器(截?cái)?0K)濃縮，然后上樣至凝膠過濾柱。凝膠過濾柱(Superdex20026/60prepgrade)用20mMpH8.0的Tris緩沖液(pH8.0)，150mM氯化鈉NaCl平衡Superdex20026/60柱子，然濃縮后上樣的通過來自MonoS級分的濃縮的AVD177蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)洗脫有在兩個峰被洗脫。正確折疊并且聚集裝配的蛋白質(zhì)在150mls時被洗脫，而在115mls洗脫的較早的次要的峰不是正確裝配或折疊的。生物物理性質(zhì)含有二硫鍵(存在于除了鼠之外所有的核心蛋白質(zhì)，見圖1)的C4bp融合蛋白的寡聚體狀態(tài)可以簡單地通過比較存在或不存在還原劑β巰基乙醇(BME)的SDS-PAGE凝膠中所述蛋白質(zhì)的行為來檢查。在不存在BME的情況下AVD177蛋白的表觀大小約為140KDa，然而在BME存在的情況下它被還原了，分析其表觀分子量剛超過20KDa。質(zhì)譜AVD147蛋白質(zhì)在被β巰基乙醇還原并用N-乙基馬來酰亞胺(NEM)烷基化后通過電子噴射質(zhì)譜進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示將14個NEM分子加入(每個125Da)分子量被確定為19,072Da蛋白質(zhì)。內(nèi)毒素水平純化蛋白質(zhì)中的內(nèi)毒素水平用LAL(鱟變形細(xì)胞裂解物)試劑盒形式Biowhittaker測定為每微克蛋白質(zhì)21EU。實(shí)施例2-惡性瘧原蟲MSP1.19-人C4bp的融合蛋白。這個實(shí)施例闡明了單體抗原(包含惡性瘧原蟲MSP1的氨基酸1567-1661)與人C4bp核心蛋白質(zhì)的融合。這種融合蛋白在細(xì)菌株C41(DE3)中表達(dá)并從中純化。所述融合蛋白本身可不需要添加任何佐劑單獨(dú)免疫人?？寺【幋aMSP1蛋白質(zhì)殘基1567-1661的合成的294bpDNA片段，用NdeI和BamHI消化，并且連接到已經(jīng)用NdeI和BamHI消化的pAVD181。這樣就形成編碼95個氨基酸的MSP1.19蛋白片段的開放閱讀框架與在T7晚期啟動子下游的人C4bpα鏈的C末端57個殘基融合。通過DNA測序來檢查這個稱為pAVD177的構(gòu)建體。編碼AVD177融合蛋白的核苷酸序列是atgttaaacatttcccagcaccagtgcgttaagaaacagtgcccgcagaactctggttgtttccgtcatctggacgagcgtgaagagtgcaaatgtctgctgaactacaaacaggaaggtgataaatgtgttgagaacccaaacccgacctgtaacgaaaacaacggcggttgtgacgctgatgctaaatgcaccgaggaagacagcggttctaacggtaagaaaatcacctgcgagtgtactaaaccggactcctacccgctgttcgacggtatcttttgctccGGATCCgagacccccgaaggctgtgaacaagtgctcacaggcaaaagactcatgcagtgtctcccaaacccagaggatgtgaaaatggccctggaggtatataagctgtctctggaaattgaacaactggaactacagagagacagcgcaagacaatccactttggataaagaactataa(SEQIDNO23)這個構(gòu)建體編碼的融合蛋白AVD177的氨基酸序列如下MLNISQHQCVKKQCPQNSGCFRHLDEREECKCLLNYKQEGDKCVENPNPTCNENNGGCDADAKCTEEDSGSNGKKITCECTKPDSYPLFDGIFCSGSETPEGCEQVLTGKRLMQCLPNPEDVKMALEVYKLSLEIEQLELQRDSARQSTLDKEL(SEQIDNO24)SEQIDNO24的殘基1-95對應(yīng)于惡性瘧原蟲MSP1(單體抗原)的殘基1567-1661，并且SEQIDNO24的殘基98-154對應(yīng)于人C4bp核心蛋白質(zhì)的57個殘基。GS接頭序列出現(xiàn)在這兩個組分之間。所述蛋白質(zhì)的大約分子量為17,261道爾頓，理論pI為4.72。表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)如圖2所示。該圖中顯示了AVD77蛋白質(zhì)在未誘導(dǎo)(U)或者在37℃或30℃誘導(dǎo)后在三種不同的細(xì)菌株C41(DE3)，BL21(DE3)和C43(DE3)中表達(dá)的SDS-PAGE凝膠。所述凝膠上的泳道如下泳道1分子量標(biāo)記(由上到下66，60，46，36，28，20，14，12，6KDa)泳道2C41(DE3)誘導(dǎo)前泳道3C41(DE3)37℃誘導(dǎo)后三小時泳道4C41(DE3)30℃誘導(dǎo)后三小時泳道5BL21(DE3)誘導(dǎo)前泳道6BL21(DE3)37℃誘導(dǎo)后三小時泳道7BL21(DE3)30℃誘導(dǎo)后三小時泳道8C43(DE3)誘導(dǎo)前泳道9C43(DE3)37℃誘導(dǎo)后三小時泳道10C43(DE3)30℃誘導(dǎo)后三小時可以看出，在C41(DE3)和菌株C41(DE3)中獲得了好的表達(dá)。相反，在被測條件下，在菌株BL21(DE3)中沒有發(fā)現(xiàn)表達(dá)(見圖2)。在30℃和37℃在LB培養(yǎng)基中生長培養(yǎng)物到光密度(OD600)約為0.6，然后加入IPTG至終濃度0.5mM的來誘導(dǎo)表達(dá)。AVD177融合蛋白的純化從在37℃誘導(dǎo)后生長3小時的1升C41(DE3)細(xì)胞中純化蛋白質(zhì)AVD177。在細(xì)菌沉淀裂解后，所有的融合蛋白都存在于可溶級分中。在包含20mMMESpH6.5和5mMEDTA的緩沖液中，通過超聲處理來裂解細(xì)胞。離心后的上清上樣至MonoS柱。陽離子柱(MonoSHR10/10)在20mMMESpH6.5，20mMEDTA緩沖液(緩沖液A)中平衡柱子。所述蛋白質(zhì)用從緩沖液A到緩沖液B的10個柱體積的梯度來洗脫，緩沖液B是緩沖液A加0.5MNaCl。AVD177在大約200mMNaCl的濃度被洗脫。含有AVD177的MonoS級分用Millipore濃縮器(截?cái)?0K)濃縮，然后上樣至凝膠過濾柱。凝膠過濾柱(Superdex20026/60prepgrade)用20mMpH8.0的Tris緩沖液，150mMNaCl平衡Superdex20026/60柱子，然后上樣來自MonoS級分的濃縮的AVD177蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)在兩個峰被洗脫。正確折疊并且裝配的蛋白質(zhì)在150mls時被洗脫，而在115mls洗脫的較早的次要的峰不是正確裝配或折疊的。生物物理性質(zhì)包含二硫鍵(存在于除鼠之外所有的核心蛋白質(zhì)，見圖1)的C4bp融合蛋白的寡聚體狀態(tài)可以容易地通過比較在存在或不存在還原劑β巰基乙醇(BME)的SDS-PAGE凝膠中所述蛋白質(zhì)的行為來檢查。結(jié)果見圖3所示，其中顯示了SDS-PAGE凝膠，其顯示了在還原條件下(左，+BME)和非還原條件下(右，-BME)分析的AVD177蛋白通過分子量標(biāo)記來區(qū)分(從上至下依次為66，60，46，36，28，20，14，12，6kDa)。從圖3可見，在不存在BME情況下，AVD177蛋白質(zhì)的表觀大小約為140kDa，而在BME存在的情況下它被還原了，分析其表觀分子量剛超過20KDa。質(zhì)譜AVD177蛋白被BME還原并經(jīng)N-乙基馬來酰胺(NEM)烷基化后，通過電子噴射質(zhì)譜來檢查。結(jié)果顯示，將14個NEM分子(每個125Da)加入其分子量被確定為19,015Da的蛋白質(zhì)。內(nèi)毒素水平純化蛋白質(zhì)的內(nèi)毒素水平用Biowhittaker的LAL(鱟變形細(xì)胞裂解物)檢測試劑盒確定為每毫克蛋白質(zhì)38EU。實(shí)施例3-突變的惡性瘧原蟲MSP1.19-兔C4bp融合蛋白通過例子，這里描述了第二個惡性瘧原蟲MSP1.19-兔C4bp蛋白質(zhì)。它的主要區(qū)別在于與pAVD174和pAVD177對于單體抗原基因的具密碼子利用不同，并且也包含三個氨基酸改變(見Uthaipibull等，JMolBiol.307，1381-1394，2001的描述)。這種融合蛋白被稱作AVD178。編碼AVD178融合蛋白的核苷酸序列為atgctgaatatttcccagcaccagtgcgtaaagaaacagtgtcctcagaactctggttgcttccgccatctggacgaacgcgaatattgcaaatgccgtctgaactacaaacaggaaggtgacaagtgcgttctgaacccgaacccaacttgtaacgagaacaacggtggctgcgatgctgatgctaaatgcactgaagaagacagcggttctaacggcaaaaaaatcacctgcgagtgcaccaaaccggacagctatccgctgttcgacggcattttttgttctggatccGAGGTCCCGGAAGGCTGTGAGCAGGTGCAAGCGGGTCGCCGTCTCATGCAGTGTCTCGCAGACCCATACGAAGTGAAAATGGCCCTGGAGGTCTACAAGCTGTCTCTGGAGATTGAACTCCTGGAACTGCAGCGCGATAAGGCACGTAAAAGCTCTGTGCTGCGCCAGCTGTAA(SEQIDNO25)此構(gòu)建體編碼的融合蛋白AVD178的氨基酸序列如下MLNISQHQCVKKQCPQNSGCFRHLDEREYCKCRLNYKQEGDKCVLNPNPTCNENNGGCDADAKCTEEDSGSNGKKITCECTKPDSYPLFDGIFCSGSEVPEGCEQVQAGRRLMQCLADPYEVKMALEVYKLSLEIELLELQRDKARKSSVLRQL(SEQIDNO26)三個突變的氨基酸為粗體并劃了下劃線。SEQIDNO25的殘基1-95對應(yīng)于帶三個突變的惡性瘧原蟲MSP1(單體抗原)的殘基1567-1661，并且SEQIDNO24的殘基98-154對應(yīng)于兔C4bp核心蛋白質(zhì)的57個殘基。GS接頭序列出現(xiàn)在這兩個組分之間。AVD178的表達(dá)，純化和表在此過程基本上與AVD174和AVD177蛋白所描述的。從HiTrapS柱洗脫是在大約200mM。在凝膠過濾中，所述寡聚體蛋白質(zhì)在159mls體積時被洗脫。質(zhì)譜中，每個單體上帶14個NEM殘基時分子量為19,133Da。內(nèi)毒素水平被測量為每毫克蛋白質(zhì)58EU。實(shí)施例4-約氏瘧原蟲MSP1.19-鼠C4bp融合蛋白克隆如下制備AVD108蛋白編碼MSP1.19的合成DNA片段和來自約氏瘧原蟲的部分MSP1.33，作為NdeI-BamHI片段被克隆到鼠C4bpα鏈的C末端54個氨基酸的上游。編碼融合蛋白AVD108的核苷酸序列如下ATGAGATCTCACATTGCCTCTATTGCTTTGAACAACTTGAACAAGTCTGGTTTGGTAGGAGAAGGTGAGTCTAAGAAGATTTTGGCTAAGATGCTGAACATGGACGGTATGGACTTGTTGGGTGTTGACCCTAAGCATGTTTGTGTTGACACTAGAGACATTCCTAAGAACGCTGGATGTTTCAGAGACGACAACGGTACTGAAGAGTGGAGATGTTTGTTGGGTTACAAGAAGGGTGAGGGTAACACCTGCGTTGAGAACAACAACCCTACTTGCGACATCAACAACGGTGGATGTGACCCAACCGCCTCTTGTCAAAACGCTGAATCTACCGAAAACTCCAAGAAGATTATTTGCACCTGTAAGGAACCAACCCCTAACGCCTACTACGAGGGTGTTTTCTGTTCTTCTTCCGGATCCGAGGCCTCTGAAGACCTTAAGCCTGCGCTTACAGGCAACAAGACCATGCAGTATGTGCCAAATTCACACGATGTGAAAATGGCTCTGGAGATCTACAAGCTGACTCTGGAGGTTGAACTACTACAGCTCCAGATACAAAAGGAGAAACACACTGAAGCACACTAA(SEQIDNO27)蛋白質(zhì)AVD108的氨基酸序列如下MRSHIASIALNNLNKSGLVGEGESKKILAKMLNMDGMDLLGVDPKHVCVDTRDIPKNAGCFRDDNGTEEWRCLLGYKKGEGNTCVENNNPTCDINNGGCDPTASCQNAESTENSKKIICTCKEPTPNAYYEGVFCSSSGSEASEDLKPALTGNKTMQYVPNSHDVKMALEIYKLTLEVELLQLQIQKEKHTEAH(SEQIDNO28)SEQIDNO28的殘基3-138對應(yīng)于約氏瘧原蟲MSP1(單體抗原)的殘基1619-1753，并且SEQIDNO28的殘基141-194對應(yīng)于兔C4bp核心蛋白質(zhì)的54個殘基。GS接頭序列出現(xiàn)在這兩個組分之間，短的編碼限制性位點(diǎn)的序列位于第一組分之前。AVD108的表達(dá)在大腸桿菌菌株C41(DE3)中表達(dá)AVD108蛋白質(zhì)。在37℃于LB培養(yǎng)基中生長三升培養(yǎng)物至光密度(OD600)約為0.6，然后加入IPTG至終濃度為0.7mM的來誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)后四小時，離心收獲所述細(xì)胞。在緩沖液A(50mMTrispH9，5mMEDTA)中裂解所述細(xì)胞，通過離心除去細(xì)胞碎片。AVD108的純化和表征用四個柱層析步驟來純化AVD108蛋白。在第一步陰離子交換層析步驟中使用DEAEHR16/10柱。將所述蛋白質(zhì)加到緩沖液A中，并在緩沖液B(緩沖液A加1MNaCl)的梯度中被洗脫。AVD108在180-300mMNaCl之間的寬的峰中被洗脫。在第二步疏水相互作用層析步驟中，將包含來自DEAE柱的AVD108的集中級分上樣至Macro-Prep苯基瓊脂糖柱，在1M到0MNaCl的下降的鹽梯度中被洗脫。在最后兩步層析步驟中，AVD108蛋白質(zhì)在SuperdexS20026/60柱通過凝膠過濾純化。首先，通過加入終濃度為8M的尿素來變性所述蛋白質(zhì)，在4℃溫育過夜。單體在203mls體積處從此柱洗脫。通過在4℃相對于緩沖液H(20mMTrispH7.5，150mMNaCl)透析過夜來復(fù)性后，在上樣到相同柱之前，在緩沖液H中平衡?，F(xiàn)在在164mls體積處洗脫寡聚體。通過質(zhì)譜，確定質(zhì)量為21,257Da。通過Biowhittaker的LAL檢測試劑盒測得的內(nèi)毒素水平為每毫克蛋白質(zhì)4EU。實(shí)施例5-用惡性瘧原蟲MSP1.19-兔C4bp融合蛋白來免疫免疫用如實(shí)施例1中所述制備的AVD174蛋白質(zhì)來免疫三只新西蘭白兔(NZW)。免疫方案如下每只兔子以兩周的間隔接受四次注射(也就是說，在第0，14，28和42天)。每次注射是皮下的，其包含在緩沖的等滲鹽水溶液中的345微克(或20毫微摩爾)蛋白質(zhì)，而不加入任何已知佐劑。平行地，用弗氏佐劑中的212微克(或20毫微摩爾)的AVD172蛋白質(zhì)來免疫三只NZW兔。AVD172與AVD174相同，但缺少兔C4bp的C末端57個氨基酸。AVD172具有如下氨基酸序列MLNISQHQCVKKQCPQNSGCFRHLDEREECKCLLNYKQEGDKCVENPNPTCNENNGGCDADAKCTEEDSGSNGKKITCECTKPDSYPLFDGIFCS(SEQIDNO29)。免疫方案如下每只兔子以兩周的間隔接受四次注射(也就是說，在第0，14，28和42天)。對每只兔子的第一次注射用完全弗氏佐劑通過真皮內(nèi)給予，而隨后的三次用不完全弗氏佐劑中通過皮下給予。抗體滴度在最后一次注射后一周(即第63天)抗惡性瘧原蟲子孢子表面MSP1的抗體滴度，用在丙酮固定的惡性瘧原蟲感染的紅細(xì)胞涂片上的間接免疫熒光來測定(如Ling等，Vaccine15，1562-1567，1997對于約氏瘧原蟲所述)。在用AVD174蛋白質(zhì)免疫的兔子中的兩個最高滴度為1/81,920。在用弗氏佐劑中的AVD172蛋白質(zhì)免疫的兔子中，兩個最高滴度為1/20,480。這證明將單體抗原與C4bp核心融合比給予弗氏佐劑中的相同的單體抗原能誘導(dǎo)更高的免疫滴度。產(chǎn)生抗體的表征抗體的高滴度并不足以預(yù)防或治療感染，眾所周知抗原免疫產(chǎn)生的抗體的特異性至關(guān)重要。GuevaraPatino等，(J.Exp.Med.186，1689-1699，1997)已經(jīng)詳細(xì)介紹了檢測針對MSP1.19的封閉型和抑制型抗體的方法。這些方法用于檢測是否有抑制型抗體的存在(所述抗體十分有用，因?yàn)樗鼈兡茏钄郙SP1.42加工為MSP1.33和MSP1.19從而預(yù)防紅細(xì)胞被感染)。抑制型抗體僅僅在AVD174蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的抗體中被發(fā)現(xiàn)。它們無一在用AVD172蛋白質(zhì)免疫的兔子的抗血清中被發(fā)現(xiàn)。相反，弗氏佐劑中的AVD172蛋白質(zhì)，正如人的天然瘧疾感染一樣，能誘導(dǎo)封閉型抗體并且是有害的(見GuevaraPatino等，如上所述)。實(shí)施例6-用約氏瘧原蟲MSP1.19-鼠C4bp融合蛋白來免疫免疫小鼠用如實(shí)施例5所述制備的AVD108蛋白質(zhì)來免疫六只BALB/c小鼠。不使用佐劑，所述蛋白質(zhì)在緩沖的等滲鹽溶液中。每次注射使用40微克(1.9毫微摩爾)蛋白質(zhì)。以4周的間隔(也就是說，在第0，28和56天)皮下注射每只小鼠三次。平行地，用23微克(也是1.9毫微摩爾)AVD183蛋白質(zhì)免疫六只BALB/c小鼠，這種蛋白質(zhì)與AVD108相同，但缺少鼠C4bp的C末端的54個氨基酸(即它僅是約氏瘧原蟲MSP1.19蛋白質(zhì))。每次注射使用23微克此蛋白質(zhì)(與AVD108使用相同的緩沖等滲鹽水溶液)。在第0，28和56天皮下注射每只小鼠三次。抗體滴度在最后一次注射后兩周(即第70天)抗約氏瘧原蟲子孢子表面MSP1的抗體滴度，通過在丙酮固定的約氏瘧原蟲感染的紅細(xì)胞涂片上的間接免疫熒光來測定(描述如Ling等，Vaccine15，1562-1567，1997)。結(jié)果顯示，六只免疫AVD108蛋白的小鼠中有5只抗體滴度為1/40,960，第六只小鼠滴度為1/10,240。與此相反，以1/80稀釋免疫AVD183蛋白的小鼠中沒有一只檢測到針對MSP1的抗體。這證明將單體MSP1.19抗原融合至C4bp核心會使所獲得的抗原的滴度增高最高達(dá)500倍。寄生蟲攻擊用致死劑量的5,000個約氏瘧原蟲感染的紅細(xì)胞來攻擊如上所述免疫的兩組各六只小鼠。此項(xiàng)檢測已被Ling等(如上所述)描述過。所述六只用AVD183蛋白質(zhì)免疫過的小鼠在寄生蟲攻擊后7天內(nèi)全部死亡。另一方面，六只用AVD108免疫過的小鼠中的五只存活，并且其血液中沒有寄生蟲存在(如顯微鏡檢的薄血涂片的吉姆薩染色所評估)。第六只小鼠，在第70天具有滴度1/10,240，它在攻擊后19天死亡；在第19天通過吉姆薩染色可見此小鼠超過70％的紅細(xì)胞被感染?？傊?，攻擊實(shí)驗(yàn)證明，用在不存在任何已知佐劑時與C4bp核心蛋白質(zhì)融合的單體抗原來免疫，能保護(hù)不被致死性的瘧原蟲感染。目前已相信，這是第一例用單個蛋白而無任何已知佐劑伴隨來對抗瘧原蟲感染的成功接種。實(shí)施例7-流感血凝素-C4bp融合蛋白這個實(shí)施例證明了單體抗原(包含流感病毒A的HA1血凝素蛋白質(zhì)的殘基91-261)與人、兔和鼠的核心C4bp蛋白質(zhì)的融合。正常情況下，全長HA1在病毒體細(xì)胞表面裝配成三聚體，因此只用此肽片段就能有效地將其轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w抗原。這些稱為AVD272到AVD274的融合蛋白在細(xì)菌菌株C41(DE3)中表達(dá)并從其純化。這些融合蛋白單獨(dú)被用于免疫小鼠和兔而不添加任何佐劑。AVD272中，HA1片斷(如Jeon和Arnon，ViralImmunology，15，165-176，2002所述)與鼠C4bp支架融合。AVD272的氨基酸序列如下kafsncypydvpdyaslrslvassgtlefitegftwtgvtqnggsnackrgpgsgffsrlnwltksgstypvlnvtmpnndnfdklyiwgihhpstnqeqtslyvqasgrvtvstrrsqqtiipnigsrpwvrglssrisiywtivkpgdvlvinsngnliaprgyfkmrGSEASEDLKPALTGNKTMQYVPNSHDVKMALEIYKLTLEVELLQLQIQKEKHTEAH(SEQIDNO30)AVD273中，HA1片段與兔C4bp支架融合。AVD273的氨基酸序列如下kafsncypydvpdyaslrslvassgtlefitegftwtgvtqnggsnackrgpgsgffsrlnwltksgstypvlnvtmpnndnfdklyiwgihhpstnqeqtslyvqasgrvtvstrrsqqtiipnigsrpwvrglssrisiywtivkpgdvlvinsngnliaprgyfkmrGSEVPEGCEQVQAGRRLMQCLADPYEVKMALEVYKLSLEIELLELQRDKARKSSVLRQL(SEQIDNO31)AVD274中，HA1片段與人C4bp支架融合。AVD274的氨基酸序列如下kafsncypydvpdyaslrslvassgtlefitegftwtgvtqnggsnackrgpgsgffsrlnwltksgstypvlnvtmpnndnfdklyiwgihhpstnqeqtslyvqasgrvtvstrrsqqtiipnigsrpwvrglssrisiywtivkpgdvlvinsngnliaprgyfkmrGSETPEGCEQVLTGKRLMQCLPNPEDVKMALEVYKLSLEIEQLELQRDSARQSTLDKEL(SEQIDNO32)用不加入任何佐劑的AVD272蛋白質(zhì)(2毫微摩爾)以兩周的間隔(即在第0，14和28天)皮下免疫小鼠三次，顯示了可觀的抗體滴度(如Jeon等上述確定)，以及針對5LD50劑量的小鼠適應(yīng)性A/PR/8/34菌株的致命攻擊的明顯保護(hù)作用。實(shí)施例8-流感M2肽-C4bp融合蛋白這個實(shí)施例闡明單體抗原(包含流感病毒A的M2蛋白質(zhì)的殘基2-24，胞外部分)到人、兔和鼠的核心C4bp蛋白質(zhì)的融合。正常情況下，全長M2被裝配成在病毒體和被感染的細(xì)胞內(nèi)的四聚體，因此只用此肽片段會有效地將其轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w抗原。這些命名為AVD275到AVD278的融合蛋白在菌株C41(DE3)中表達(dá)并從其純化。這些融合蛋白自身被用于免疫小鼠和兔而不加任何佐劑。AVD275中，胞外M2肽(如Neirynck等NatureMedicine5，1157-1163，1999所述)與鼠C4bp支架融合。AVD275的氨基酸序列如下SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDGSEASEDLKPALTGNKTMQYVPNSHDVKMALEIYKLTLEVELLQLQIQKEKHTEAH(SEQIDNO33)AVD276中，胞外M2肽與兔C4bp支架融合。AVD276的氨基酸序列如下SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDGSEVPEGCEQVQAGRRLMQCLADPYEVKMALEVYKLSLEIELLELQRDKARKSSVLRQL(SEQIDNO34)AVD277中，胞外M2肽與人C4bp支架融合。AVID277的氨基酸序列如下SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDGSETPEGCEQVLTGKRLMQCLPNPEDVKMALEVYKLSLEIEQLELQRDSARQSTLDKEL(SEQIDNO35)AVD278中，其中兩個半胱氨酸被絲氨酸殘基取代的胞外M2肽的變體與人C4bp支架融合。AVD278的氨基酸序列如下SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDGSETPEGCEQVLTGKRLMQCLPNPEDVKMALEVYKLSLEIEQLELQRDSARQSTLDKEL(SEQIDNO36)用不加入任何佐劑的AVD275蛋白質(zhì)(2毫微摩爾)以兩周的間隔(即第0，14和28天)皮下免疫小鼠三次，顯示了可觀的抗體滴度(基本如Neirynck等上述確定)，以及針對5LD50劑量的小鼠適應(yīng)性A/PR/8/34菌株的致命攻擊的明顯保護(hù)作用。權(quán)利要求1.一種產(chǎn)品，其包含C4bp核心蛋白質(zhì)；和單體抗原。2.根據(jù)權(quán)利要求1的產(chǎn)品，其中所述C4bp核心由SEQIDNO1的殘基1-57或其同系物的對應(yīng)殘基，或者SEQIDNO1或其同系物的至少47個氨基酸的片段組成。3.根據(jù)權(quán)利要求2的產(chǎn)品，其中所述同系物是SEQIDNO2-20中的任意一種。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的產(chǎn)品，其中所述同系物是與SEQIDNO1-20中任意一種具有至少70％氨基酸同一性的變體。5.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的產(chǎn)品，其中所述單體抗原融合到所述C4bp核心蛋白質(zhì)N-或C-末端。6.根據(jù)權(quán)利要求5的產(chǎn)品，其中所述融合是通過靈活的接頭。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的產(chǎn)品，其中所述單體抗原是瘧原蟲裂殖體表面蛋白質(zhì)1的單體抗原片段。8.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的產(chǎn)品，其中所述單體抗原是流感病毒血凝素蛋白質(zhì)或流感M2e肽的單體抗原片段。9.一種組合物，其包含權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的產(chǎn)品及藥學(xué)上可接受稀釋劑、載體或佐劑。10.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的產(chǎn)品或權(quán)利要求9的組合物，其用于人體或動物體的治療方法。11.免疫治療瘧疾的方法，包括給予個體有效量的根據(jù)權(quán)利要求7的產(chǎn)品。12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述個體被瘧疾寄生蟲感染。13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其用于預(yù)防性接種。14.根據(jù)權(quán)利要求7的產(chǎn)品，其用于瘧疾的治療或預(yù)防。15.根據(jù)權(quán)利要求7的產(chǎn)品在制備治療或預(yù)防瘧疾的藥物中的用途。16.制備抗瘧原蟲寄生蟲的抗體的辦法，所述辦法包括將根據(jù)權(quán)利要求7的產(chǎn)品引入非人哺乳動物，并從這種哺乳動物中回收免疫血清。17.針對受試者疾病的進(jìn)行被動免疫的方法，所述辦法包括給予所述受試者包含抗體的免疫血清，所述包含抗體的血清是通過用根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的產(chǎn)品來接種宿主受試者得到的。18.被動免疫治療人類受試者的瘧疾的方法，所述方法包括給予所述人有效量的根據(jù)權(quán)利要求16產(chǎn)生的免疫血清。19.通過權(quán)利要求16的方法得到的免疫血清，其用于人受試者的瘧疾的免疫治療的方法。20.免疫治療流感的方法，包括給予個體有效量的根據(jù)權(quán)利要求8的產(chǎn)品。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述個體被流感病毒感染。22.權(quán)利要求20的方法，其用于預(yù)防性接種。23.根據(jù)權(quán)利要求8的產(chǎn)品，其用于治療或預(yù)防流感。24.根據(jù)權(quán)利要求8的產(chǎn)品在制備用于治療或預(yù)防流感的藥物中的用途。25.產(chǎn)生抗流感抗體的辦法，所述辦法包括將根據(jù)權(quán)利要求8的產(chǎn)品引入非人哺乳動物，并從所述哺乳動物中回收免疫血清。26.人受試者的流感的被動免疫治療方法，所述辦法包括給予所述人有效量的根據(jù)權(quán)利要求25產(chǎn)生的免疫血清。27.通過權(quán)利要求25的方法得到的免疫血清，其用于人受試者的流感的免疫治療方法。28.制備產(chǎn)品的方法，其包括C4bp核心蛋白質(zhì)；和非多肽單體抗原，所述方法包括表達(dá)編碼第一組分的核酸，將所述融合蛋白連接到第二組分上，并回收所述產(chǎn)品。29.制備產(chǎn)品的方法，所述產(chǎn)品包括C4bp核心蛋白質(zhì)；和多肽單體抗原的融合物，所述方法包括表達(dá)編碼所述融合物的核酸，并回收所述產(chǎn)品。30.權(quán)利要求28或29的方法，其中所述核酸在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)。31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述融合蛋白以多聚體形式回收。32.提高單體抗原的免疫原性的方法，所述方法包括將所述抗原連接到C4bp核心蛋白質(zhì)上。33.表達(dá)載體，其包括編碼C4bp核心蛋白質(zhì)和多肽單體抗原的融合蛋白的核酸序列，所述核酸序列與宿主細(xì)胞中的功能性啟動子可操作地連接。34.權(quán)利要求33的表達(dá)載體，其中所述C4bp核心蛋白質(zhì)如權(quán)利要求2至5中任一項(xiàng)所限定。35.權(quán)利要求33或34的表達(dá)載體，其中所述單體抗原如權(quán)利要求7或8所限定。36.用權(quán)利要求33至35中任一項(xiàng)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌宿主細(xì)胞。37.用權(quán)利要求33至35中任一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)化的真核宿主細(xì)胞。38.權(quán)利要求33至35中任一項(xiàng)的表達(dá)載體在治療人體或動物體的方法中的用途。全文摘要本發(fā)明提供了包含C4bp核心蛋白質(zhì)和單體抗原的產(chǎn)品，理想地該產(chǎn)品為融合蛋白的形式。單體抗原包括瘧疾和流感抗原。C4bp核心蛋白質(zhì)提供單體抗原的多聚復(fù)合體，或其混合物的裝配。所述復(fù)合體用作疫苗。文檔編號A61K39/385GK1867588SQ200480029924公開日2006年11月22日申請日期2004年8月12日優(yōu)先權(quán)日2003年8月12日發(fā)明者弗蓋爾·希爾申請人:阿維迪斯公司