專利名稱：用于治療眼新血管疾病的組合治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及眼科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明涉及采用能抑制血小板衍生生長因子(PDGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的試劑的組合治療眼的新血管疾病。
背景技術(shù)：
血管發(fā)生，又被稱作新生血管形成，包括由現(xiàn)存的血管形成新枝(sprout)，以及它們侵入周圍的組織。一種相關(guān)的過程，血管發(fā)生(vasculogenesis)包括業(yè)已存在于整個(gè)組織中的內(nèi)皮細(xì)胞和成血管細(xì)胞的分化，以及它們隨后連接在一起以便形成血管。
血管發(fā)生廣泛出現(xiàn)在發(fā)育期間，并且還出現(xiàn)在創(chuàng)傷愈合期間的健康身體內(nèi)，以便在損傷或傷害之后恢復(fù)血液流向組織。不過，血管發(fā)生也與癌和腫瘤形成相關(guān)。實(shí)際上，腫瘤組織中血管的量是乳腺癌(Weidner等，(1992)J.Natl.Cancer Inst.841875-1887)、前列腺癌(Weidner等，(1993)Am.J.Pathol.143401-409)、腦腫瘤(Li等，(1994)Lancet 34482-86)和黑素瘤(Foss等，(1996)Cancer Res.562900-2903)的有力的消極預(yù)后指標(biāo)。最近發(fā)現(xiàn)，血管發(fā)生與許多醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的其他疾病狀態(tài)相關(guān)，包括風(fēng)濕病學(xué)、皮膚病學(xué)、心臟病學(xué)和眼科學(xué)。具體地講，不希望的或病理學(xué)組織特異性血管發(fā)生與某些特殊疾病狀態(tài)相關(guān)，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化和銀屑病(參見例如，F(xiàn)an等，(1995)Trends Pharmacol.Sci.1657；和Folkman(1995)Nature Med.127)。另外，血管通透性的改變被認(rèn)為在正常和病理學(xué)生理過程中起著作用(Cullinan-Bove等，(1993)Endocrinol.133829；Senger等，(1993)Cancer andMetastasis Reviews 12303)。盡管血管生成過程在上述每一種疾病中都可能與發(fā)育血管發(fā)生和腫瘤血管發(fā)生共有很多特征，但是各自可能具有由于周圍細(xì)胞的影響產(chǎn)生的特殊的特征。
若干眼疾病涉及血管發(fā)生的改變。例如，糖尿病性視網(wǎng)膜病，是導(dǎo)致成年人失明的第三大原因(在美國占失明人數(shù)的幾乎7％)，與廣泛的血管生成事件相關(guān)。非增殖性視網(wǎng)膜病伴隨著視網(wǎng)膜內(nèi)的周細(xì)胞的選擇性喪失，并且它們的喪失導(dǎo)致了相關(guān)毛細(xì)血管的擴(kuò)張，并且導(dǎo)致了血流的增加。在擴(kuò)張的毛細(xì)血管中，內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并且形成外翻，它形成微動(dòng)脈瘤，并且相鄰的毛細(xì)血管被阻塞，從而微動(dòng)脈瘤周圍的視網(wǎng)膜區(qū)域沒有被灌注。最終，支路血管出現(xiàn)在相鄰的微動(dòng)脈瘤區(qū)域之間，并且可以看到具有微動(dòng)脈瘤的早期糖尿病性視網(wǎng)膜病和無灌注的視網(wǎng)膜區(qū)域的臨床圖像。微動(dòng)脈瘤泄漏，并且毛細(xì)血管可能出血，導(dǎo)致滲出物和出血。一旦確定了背景糖尿病性視網(wǎng)膜病的起始階段，所述狀況會(huì)發(fā)展數(shù)年時(shí)間段，發(fā)展成增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病，并且導(dǎo)致大約5％的失明病例。當(dāng)視網(wǎng)膜的某些區(qū)域持續(xù)喪失它們的毛細(xì)血管并變得不能灌注，從而導(dǎo)致在視網(wǎng)膜盤和其他地方出現(xiàn)新血管時(shí)，發(fā)生增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病。這些新血管生長成玻璃體，并且容易出血，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜前出血。在晚期增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病中，大量的玻璃體出血可能填充玻璃體腔的大部分。另外，新血管伴隨著纖維組織增殖，它可能導(dǎo)致牽引視網(wǎng)膜脫離。
糖尿病性視網(wǎng)膜病主要與糖尿病的持續(xù)時(shí)間相關(guān)；因此，隨著人群年齡和糖尿病患者生活的更長，糖尿病性視網(wǎng)膜病的流行率將增加。激光治療目前被用于非增殖性和增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病。黃斑區(qū)周圍的泄漏性微動(dòng)脈瘤的病灶激光治療使患有臨床上顯著的黃斑水腫的患者視力的喪失降低了50％。在增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病中，全視網(wǎng)膜光凝固導(dǎo)致了在整個(gè)視網(wǎng)膜上散布數(shù)千個(gè)微小的灼傷(避開黃斑區(qū))；這種治療能降低失明比例60％。黃斑水腫和增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病的早期治療能預(yù)防95％的患者在五年時(shí)間內(nèi)失明，而晚期治療只能防止50％的患者失明。因此，早期診斷和治療是重要的。
涉及新生血管形成的另一種眼疾病是年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)，這是一種影響65歲以上的大約1/10的美國人的疾病。AMD的特征是黃斑，即視網(wǎng)膜中心區(qū)的一系列病理學(xué)變化，這種變化伴隨著降低的視敏度，特別是影響中心視力。AMD涉及被稱為視網(wǎng)膜色素上皮的單層細(xì)胞，它緊位于感覺視網(wǎng)膜下面。這些細(xì)胞滋養(yǎng)并且支持與它們接觸的視網(wǎng)膜部分，即，包含視色素的感光細(xì)胞。視網(wǎng)膜色素上皮位于玻璃膜上，它是基底膜復(fù)合物，在AMD患者中，它會(huì)增厚并且硬化。新血管可能從下脈絡(luò)膜穿透玻璃膜，它包括豐富的血管床。這些血管可能會(huì)泄漏流體或者在視網(wǎng)膜色素上皮下面出血，并且還可能在視網(wǎng)膜色素上皮和感覺視網(wǎng)膜之間出血。隨后的纖維狀瘢痕形成會(huì)破壞感光細(xì)胞的營養(yǎng)，并且導(dǎo)致這些細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致中央視敏度的喪失。這種類型的年齡相關(guān)性黃斑病變被稱作“潮濕”類型的，這是因?yàn)樾孤┑难芎鸵暰W(wǎng)膜下水腫或血液。潮濕類型只占年齡相關(guān)性黃斑病變病例的10％，但是導(dǎo)致了老年人中90％的病例因?yàn)辄S斑變性而為法定盲?！案稍铩鳖愋偷哪挲g相關(guān)性黃斑病變涉及視網(wǎng)膜色素上皮的分解，以及上面感光細(xì)胞的喪失。干燥類型的病變會(huì)降低視力，但是通常只有20/50-20/100的水平。
AMD伴隨著中心視力的失真，使目標(biāo)變大或變小或直線出現(xiàn)扭曲、彎曲或沒有中心段。在潮濕類型的AMD中，在黃斑區(qū)可能注意到感覺視網(wǎng)膜的小的脫離，不過，視網(wǎng)膜下新生血管膜的最終診斷需要熒光素血管造影術(shù)。在所述干燥類型中，玻璃疣可能干擾黃斑區(qū)的色素沉著模式。玻璃疣是視網(wǎng)膜色素上皮的基底膜的贅疣，它能突出進(jìn)入細(xì)胞，從而導(dǎo)致所述細(xì)胞前部膨脹；它們作為年齡相關(guān)性黃斑病變的危險(xiǎn)因素的原因尚不清楚。目前還沒有用于治療干燥類型的年齡相關(guān)性黃斑病變的方法。激光治療被用于潮濕類型的年齡相關(guān)性黃斑病變，并且最初消除了新生血管膜，并且在18個(gè)月時(shí)阻止了大約50％患者的進(jìn)一步視力喪失。不過，到60個(gè)月時(shí)，只有20％的患者仍然有顯著效果。
業(yè)已鑒定了血管發(fā)生的多種分子介體，包括堿性和酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF，bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子α和β(TGFα，TGFβ)、血小板衍生生長因子(PDGF)、血管生成素、血小板衍生內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(PD-ECGF)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。參與血管發(fā)生的其他刺激物包括血管生成素(angiopoietin)-1、Del-1、卵泡抑素(follistatin)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、苗條蛋白、midkine、胎盤生長因子、多效蛋白(PTN)、progranulin、增殖蛋白和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。另外，血管發(fā)生的控制還可以通過由身體產(chǎn)生的血管發(fā)生的多種負(fù)調(diào)節(jié)劑介導(dǎo)，包括angioarrestin、血管抑素(血纖蛋白溶酶原片段)、抗血管生成抗凝血酶III、軟骨-衍生的抑制劑(CDI)、CD59補(bǔ)體片段、內(nèi)皮抑制素(endostatin)(膠原XVIII片段)、纖連蛋白片段、gro-β、肝素酶、肝素多聚己糖片段、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、干擾素α/β/γ、干擾素誘導(dǎo)型蛋白(IP-10)、白細(xì)胞介素-12、kringle 5(血纖蛋白溶酶原片段)、金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)、2-甲氧雌甾二醇、胎盤核糖核酸酶抑制劑、血纖蛋白溶酶原激活物抑制劑、血小板因子-4(PF4)、促乳素16kD片段、增殖蛋白-相關(guān)蛋白(PRP)、類視黃醇、四氫皮質(zhì)醇-S、血小板反應(yīng)蛋白-1(TSP-1)、脈管抑素(vasculostatin)和血管抑制因子(vasostatin)(鈣網(wǎng)蛋白片段)。
在上述血管生成調(diào)節(jié)劑中，VEGF似乎作為伴隨著腫瘤生長的異常血管發(fā)生的正調(diào)節(jié)劑發(fā)揮關(guān)鍵作用(綜述參見Brown等，(1996)Control of Angiogenesis(Goldberg and Rosen，eds.)Birkhauser，Basel，和Thomas(1996)J.Biol.Chem.271603-606)。另外，最近業(yè)已研究了信號(hào)傳導(dǎo)分子的PDGF家族的PDGF-B成員的作用，因?yàn)樗坪踉谘苤車?xì)胞的形成、擴(kuò)增和正常功能方面發(fā)揮作用，所述血管周圍細(xì)胞有時(shí)被稱作壁細(xì)胞，例如，血管平滑肌、腎小球膜細(xì)胞和周細(xì)胞。
盡管對(duì)與發(fā)育、傷口愈合和腫瘤形成伴隨的血管發(fā)生或新生血管形成的了解較多，但仍然需要確定在血管發(fā)生和眼血管發(fā)生之間是否存在差異。很顯然，盡管伴隨著，例如，心臟上的側(cè)支血管形成的血管發(fā)生可能對(duì)生物有利并且適應(yīng)生物，但伴隨著例如AMD的病理性眼新生血管形成沒有已知的好處，并且通常會(huì)導(dǎo)致失明(有關(guān)綜述參見Campochiaro(2000)J.Cell.Physiol.184301-10)。因此，盡管對(duì)伴隨新生血管形成的分子事件的理解業(yè)已取得了進(jìn)展，但仍然需要利用這些理解去開發(fā)用于治療新血管疾病的其他方法，所述疾病包括眼新血管疾病和諸如與AMD和糖尿病性視網(wǎng)膜病伴隨出現(xiàn)的脈絡(luò)膜新生血管形成的疾病。
發(fā)明概述業(yè)已驚奇地發(fā)現(xiàn)，抗-VEGF和抗-PDGF劑的組合，在治療眼新血管疾病時(shí)能提供協(xié)同治療效果。
因此，本發(fā)明特征在于用于治療被診斷患有或有危險(xiǎn)發(fā)展為新血管疾病的患者的方法。該方法包括給所述患者施用抗-VEGF劑和抗-PDGF劑，作為主要或輔助治療。
一方面，本發(fā)明提供了用于抑制有所述需要的患者的新血管疾病的方法，其通過同時(shí)或相互間隔約90天之內(nèi)給患者施用PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑來實(shí)現(xiàn)，使用量足以抑制所述患者的新血管疾病。
另一方面，本發(fā)明提供了用于治療有所述需要的患者的方法，所述患者被診斷患有或有危險(xiǎn)發(fā)展為新血管疾病，其通過同時(shí)或相互間隔90天之內(nèi)給患者施用PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑來實(shí)現(xiàn)，以足以治療患者的用量施用。
在這些方面的特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括在相互間隔大約10天內(nèi)施用PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑。在本發(fā)明方法的另一種實(shí)施方案中，所述PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑是在相互間隔5天內(nèi)施用的。在本發(fā)明方法的另一種實(shí)施方案中，所述PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑是在相互間隔約24小時(shí)內(nèi)施用的。在本發(fā)明方法的特定實(shí)施方案中，所述PDGF拮抗劑和所述VEGF拮抗劑是同時(shí)施用的。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括施用PDGF拮抗劑，它是PDGF-B拮抗劑。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括施用VEGF拮抗劑，它是VEGF-A拮抗劑。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括施用PDGF拮抗劑，它是核酸分子、適體、反義RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、環(huán)肽、抗體、抗體片段的結(jié)合片段、糖、聚合物或小有機(jī)化合物。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括施用VEGF拮抗劑，它是核酸分子、適體、反義RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、環(huán)肽、抗體、抗體片段的結(jié)合片段、糖、聚合物或小有機(jī)化合物。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括施用VEGF拮抗劑，它是適體，如EYE001適體。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括施用VEGF拮抗劑，它是抗體或其結(jié)合片段。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括施用PDGF拮抗劑，它是適體、抗體或其結(jié)合片段。在另一種具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括施用PDGF拮抗劑，它是反義寡核苷酸。
在本發(fā)明這一方面的另一種實(shí)施方案中，所述PDGF拮抗劑和/或所述VEGF拮抗劑是前藥。
在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法提供了用于抑制或治療眼新血管疾病的手段。在某些實(shí)施方案中，適合通過本發(fā)明的方法治療或抑制的眼新血管疾病包括缺血性視網(wǎng)膜病、虹膜新生血管形成、眼內(nèi)新生血管形成、年齡相關(guān)性黃斑變性、角膜新生血管形成、視網(wǎng)膜新生血管形成、脈絡(luò)膜新生血管形成、糖尿病性視網(wǎng)膜缺血或增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法提供了用于抑制或治療有所述需要的患者或被診斷患有或有危險(xiǎn)發(fā)展為這種疾病的患者的銀屑病或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的手段。
本發(fā)明還提供了包括PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑的，以及可以藥用的載體的藥用組合物。在這一方面，PDGF和VEGF拮抗劑的使用量都足以抑制所述患者的新血管疾病。
在這一方面的一種實(shí)施方案中，所述藥用組合物包括PDGF拮抗劑，它是PDGF-B拮抗劑。在另一種實(shí)施方案中，所述藥用組合物包括VEGF拮抗劑，它是VEGF-A拮抗劑。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物包括PDGF拮抗劑，它是核酸分子、適體、反義RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、環(huán)肽、抗體、抗體片段的結(jié)合片段、糖、聚合物或小有機(jī)化合物。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物包括VEGF拮抗劑，它是核酸分子、適體、反義RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、環(huán)肽、抗體、抗體片段的結(jié)合片段、糖、聚合物或小有機(jī)化合物。
在其他特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物包括VEGF拮抗劑，它是適體，如EYE001適體。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物包括VEGF拮抗劑，它是抗體或其結(jié)合片段。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物包括PDGF拮抗劑，它是抗體或其結(jié)合片段。在另一種具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物包括PDGF拮抗劑，它是反義寡核苷酸。
本發(fā)明的藥用組合物可以包括可以藥用的載體，它包括小球體或水凝膠制劑。
在另一種實(shí)施方案中，所述PDGF拮抗劑和/或所述VEGF拮抗劑是前藥。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物提供了用于抑制或治療眼新血管疾病的手段。在某些實(shí)施方案中，適合通過本發(fā)明的藥用組合物治療或抑制的眼新血管疾病包括缺血性視網(wǎng)膜病、虹膜新生血管形成、眼內(nèi)新生血管形成、年齡相關(guān)性黃斑變性、角膜新生血管形成、視網(wǎng)膜新生血管形成、脈絡(luò)膜新生血管形成、糖尿病性視網(wǎng)膜缺血或增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物提供用于在有所述需要的患者，或被診斷患有或有危險(xiǎn)發(fā)展為這種疾病的患者中抑制或治療銀屑病或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的手段。
本發(fā)明還提供了包括PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑的藥物包(pharmaceutical pack)。在這一方面的一種實(shí)施方案中，所述藥物包包括PDGF拮抗劑，它是PDGF-B拮抗劑。在這一方面的另一種實(shí)施方案中，所述藥物包包括VEGF拮抗劑，它是VEGF-A拮抗劑。
在另一種實(shí)施方案中，所述藥物包的PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑是分別且以單獨(dú)劑量形式制備的。在另一種實(shí)施方案中，所述藥物包的PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑是一起制備的。
在某些特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物包包括VEGF拮抗劑，它是適體，如EYE001適體。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物包包括VEGF拮抗劑，它是抗體或其結(jié)合片段。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物包包括PDGF拮抗劑，它是抗體或其結(jié)合片段。在其他特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物包包括PDGF拮抗劑，它是反義寡核苷酸。在這一方面的另一種實(shí)施方案中，所述PDGF拮抗劑和/或所述VEGF拮抗劑是前藥。
附圖簡述

圖1(A)是人PDGF-B的核酸序列(GenBank編號(hào)X02811)(SEQID NO1)的示意圖。
圖1(B)是人PDGF-B的氨基酸序列(GenBank編號(hào)CAA26579)(SEQ ID NO2)的示意圖。
圖1(C)是人PDGF-A的核酸序列(GenBank編號(hào)X06374)(SEQ ID NO11)的示意圖。
圖1(D)是人PDGF-A的多肽序列(GenBank編號(hào)CAA29677)(SEQ ID NO12)的示意圖。
圖2(A)是人VEGF的核酸序列(GenBank編號(hào)NM_003376)(SEQ ID NO3)的示意圖。
圖2(B)是人VEGF多膚氨基酸序列(GenBank編號(hào)NP_003367)(SEQ ID NO4)的示意圖。
圖3(A)是人PDGFR-B核酸序列(GenBank編號(hào)NM_002609)(SEQ ID NO5)的示意圖。
圖3(B)是人PDGFR-B多肽序列(GenBank編號(hào)NP_002600)(SEQ ID NO6)的示意圖。
圖3(C)是人PDGFR-A核酸序列(GenBank編號(hào)NM_006206)(SEQ ID NO13)的示意圖。
圖3(D)是人PDGFR-A多肽序列(GenBank編號(hào)NP_006197)(SEQ ID NO14)的示意圖。
圖4(A)是人VEGFR-1(Flt-1)核酸序列(GenBank編號(hào)AF063657)(SEQ ID NO7)的示意圖。
圖4(B)是人VEGFR-1(Flt-1)多肽序列(GenBank編號(hào))(SEQID NO8)的示意圖。
圖4(C)是人VEGFR-2(KDR/Flk-1)核酸序列(GenBank編號(hào)AF035121)(SEQ ID NO9)的示意圖。
圖4(D)是人VEGFR-2(KDR/Flk-1)多肽序列(GenBank編號(hào)AAB88005)(SEQ ID NO10)的示意圖。
圖5是比較對(duì)照處理(cont)、Gleevec處理(抗-PDGF劑)和MacugenTM處理(即pegaptanib處理，抗-VEGF劑)的角膜新生血管形成測定結(jié)果，與用MacugenTM和Gleevec的組合處理結(jié)果(抗-PDGF/抗-VEGF組合治療)的圖示。
圖6(A)是出現(xiàn)在對(duì)照(PEG-處理的)小鼠角膜上的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。
圖6(B)是出現(xiàn)在Gleevec-處理的小鼠角膜上的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。
圖6(C)是出現(xiàn)在MacugenTM-處理的小鼠角膜上的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。
圖6(D)是出現(xiàn)在用MacugenTM和Gleevec兩者處理的小鼠角膜上的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。
圖7(A)是熒光顯微鏡圖像的照片圖示，表示正常的角膜脈管系統(tǒng)不會(huì)受到施用APB5(PDGFR抗體，抗-PDGF劑)的影響。
圖7(B)是熒光顯微鏡圖像的照片圖示，表示正常的角膜脈管系統(tǒng)不受施用Gleevec的影響。
圖7(C)是熒光顯微鏡圖像的照片圖示，表示正常的角膜脈管系統(tǒng)不受同時(shí)施用MacugenTM(Mac)和Gleevec的影響。
圖7(D)是熒光顯微鏡圖像的照片圖示，表示正常的角膜脈管系統(tǒng)不受施用PEG的影響。
圖8是激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新生血管形成測定結(jié)果的圖示，比較了對(duì)照處理(cont)、Gleevec處理(抗-PDGF劑)和MacugenTM處理(即pegaptanib處理，抗-VEGF劑)與用MacugenTM和Gleevec組合處理的結(jié)果(抗-PDGF/抗-VEGF組合治療)。
圖9是激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新生血管形成測定結(jié)果的圖示，比較了對(duì)照-處理的(cont)、APB5-處理的(抗-PGFR抗體，它起著抗-PDGF劑的作用)和Macugen處理(即pegaptanib處理，抗-VEGF適體)與用Macugen和APB5(Mac+APB5)組合處理的結(jié)果。
圖10是視網(wǎng)膜發(fā)育模型結(jié)果的圖示，比較了對(duì)照處理(cont)、ARC-127處理(抗-PDGF劑)和Macugen處理(即pegaptanib處理，抗-VEGF劑)與用Macugen和ARC-127組合處理(抗-PDGF/抗-VEGF組合治療)的結(jié)果。
圖11是角膜新生血管形成測定結(jié)果的圖示，比較了對(duì)照處理(cont)、ARC-127處理(抗-PDGF劑)和Macugen處理(即pegaptanib處理，抗-VEGF劑)與用Macugen和ARC-127組合處理(抗-PDGF/抗-VEGF組合治療)的結(jié)果。
圖12(A)是出現(xiàn)在對(duì)照小鼠角膜中的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。
圖12(B)是出現(xiàn)在ARC-127-處理的小鼠角膜中的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。
圖12(C)是出現(xiàn)在Macugen-處理的小鼠角膜中的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。
圖12(D)是出現(xiàn)在用Macugen和ARC-127處理的小鼠角膜中的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。
圖13是角膜新生血管形成測定結(jié)果的圖示，比較了對(duì)照處理(cont)、APB-5處理(抗-PDGF劑)和Macugen處理(即pegaptanib處理，抗-VEGF劑)與用Macugen和APB-5組合處理(抗-PDGF/抗-VEGF組合治療)的結(jié)果。
圖14是角膜新生血管形成測定結(jié)果的圖示，比較了對(duì)照處理(cont)、APB-5處理(抗-PDGF劑)和Macugen-處理(即pegaptanib處理，抗-VEGF劑)與用Macugen和APB-5組合處理(抗-PDGF/抗-VEGF組合治療)的結(jié)果。
發(fā)明詳述在本說明書中所提到的所有文獻(xiàn)、專利和專利申請(qǐng)都被收作本文參考。
定義在本文中，以下術(shù)語和短語具有下面所具有的含義。除非另有說明，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所普遍了解的相同含義。
“拮抗劑”表示能部分或完全抑制靶分子的活性或產(chǎn)生的試劑。具體地講，術(shù)語“拮抗劑”，在本文中選擇性地使用時(shí)，表示能夠降低PDGF、PDGFR、VEGF或VEGFR基因表達(dá)水平、mRNA水平、蛋白水平或蛋白活性的試劑。拮抗劑的示例性形式包括，例如，蛋白、多肽、肽(如環(huán)肽)、抗體或抗體片段、肽模擬物、核酸分子、反義分子、核酶、適體、RNAi分子和小有機(jī)分子。拮抗劑抑制VEGF/VEGFR和PDGF/PDGFR配體/受體靶的示例性的非限定性機(jī)制包括抑制配體合成和/或穩(wěn)定性(例如，使用靶定配體基因/核酸的反義、核酶或RNAi組合物)、阻斷配體與它的同源受體的結(jié)合(例如，使用抗-配體適體、抗體或可溶性引誘同源受體)、抑制受體合成和/或穩(wěn)定性(例如，使用靶定配體受體基因/核酸的反義、核酶或RNAi組合物)、阻斷受體與它的同源受體的結(jié)合(例如，使用受體抗體)和阻斷受體被它的同源配體的激活(例如，使用受體酪氨酸激酶抑制劑)。另外，所述拮抗劑可以直接或間接抑制靶分子。
在本文中，術(shù)語“抗體”意在包括完整的抗體，例如，任何同種型的抗體(IgG、IgA、IgM、IgE等)，并且包括能夠識(shí)別并且還能與脊椎動(dòng)物(例如，哺乳動(dòng)物)蛋白、糖類等特異性起反應(yīng)的它們的片段?？贵w可以使用常規(guī)技術(shù)片段化，并且以上述完整抗體相同的方式篩選這些片段的用途。因此，該術(shù)語包括抗體分子的蛋白酶剪切的片段或重組制備的部分，它能夠與某些蛋白選擇性地起反應(yīng)。所述蛋白酶解和/或重組片段的非限定性例子包括Fab、F(ab′)2、Fab′、Fv和單鏈抗體(scFv)，它包括通過肽接頭結(jié)合的V[L]和/或V[H]結(jié)構(gòu)域。所述scFv′s可以共價(jià)或非共價(jià)連接，以便形成具有兩個(gè)或兩個(gè)以上結(jié)合位點(diǎn)的抗體。本發(fā)明包括多克隆抗體、單克隆抗體或抗體的其他純化制劑和重組抗體。
在這里，術(shù)語“適體”，可以與術(shù)語“核酸配體”互換使用，它表示核酸，所述核酸通過它適應(yīng)特殊的三維構(gòu)象的能力，能結(jié)合靶分子并且對(duì)它具有拮抗作用(即，抑制)。本發(fā)明的靶是PDGF或VEGF(或它們的同源受體PDGFR或VEGFR之一)，因此，使用了術(shù)語PDGF適體或核酸配體或VEGF適體或核酸配體(或PDGFR適體或核酸配體或VEGFR適體或核酸配體)。所述適體對(duì)靶的抑制可以通過下述方式進(jìn)行靶的結(jié)合，催化性改變靶，以修飾/改變靶或靶的功能活性的方式與靶起反應(yīng)，作為自殺抑制劑與靶共價(jià)附著，促進(jìn)靶和其他分子之間的反應(yīng)。適體可以包括多個(gè)核糖核苷酸單位、脫氧核糖核苷酸單位或這兩種類型核苷酸殘基的混合物。適體還可以包括一個(gè)或多個(gè)修飾過的堿基、糖或磷酸酯主鏈單位，正如在本文中進(jìn)一步描述的。
“抗體拮抗劑”表示本文所定義的抗體分子，它能阻斷或顯著減弱靶PDGF或VEGF的一種或多種活性。例如，VEGF抑制抗體可以抑制或減弱VEGF刺激血管發(fā)生的能力。
如果兩個(gè)序列的每一個(gè)堿基都匹配，即能夠形成沃森-克里克(Watson Crick)堿基對(duì)，那么一種核苷酸序列就是與另一種核苷酸序列“互補(bǔ)的”。術(shù)語“互補(bǔ)鏈”在這里可以與術(shù)語“互補(bǔ)體”互換使用。核酸鏈的互補(bǔ)體可以是編碼鏈的互補(bǔ)體或非編碼鏈的互補(bǔ)體。
短語“保守殘基”或“保守性氨基酸取代”表示基于某些共同特性的氨基酸分組。確定獨(dú)立氨基酸之間的共同特性的功能性途徑是分析同源生物的相應(yīng)蛋白之間的氨基酸變化的歸一化頻率。根據(jù)所述分析，可以確定氨基酸的組，其中，一組中的氨基酸優(yōu)選能夠彼此交換，因此，它們?cè)趯?duì)總的蛋白結(jié)構(gòu)的影響上最彼此類似(Schulz，G.E.和R.H.Schirmer，Principles of Protein Structure，Springer-Verlag)。以這種方式確定的氨基酸組的例子包括(i)帶電荷的組，由Glu和Asp、Lys、Arg和His組成，(ii)帶正電荷的組，由Lys、Arg和His組成，(iii)帶負(fù)電荷的組，同Glu和Asp組成，(iv)芳族組，由Phe、Tyr和Trp組成，(v)氮環(huán)組，由His和Trp組成，(vi)大的脂族非極性組，由Val、Leu和Ile組成，(vii)略微極性組，由Met和Cys組成，(viii)小殘基組，由Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln和Pro組成，(ix)脂族組，由Val、Leu、Ile、Met和Cys組成，和(x)小羥基組，由Ser和Thr組成。
除上面所列舉的組之外，每一種氨基酸殘基可以形成它自身的組，并且由單獨(dú)的氨基酸形成的組可以簡單地通過本領(lǐng)域常用的氨基酸的單字母和/或三字母的縮寫來表示。
在本文中，術(shù)語“相互作用”實(shí)際上表示包括分子之間的可檢測的關(guān)系或結(jié)合(例如，生物化學(xué)相互作用)，如蛋白-蛋白、蛋白-核酸、核酸-核酸和蛋白-小分子或核酸-小分子之間的相互作用。
術(shù)語“相互作用的蛋白”表示能夠與目標(biāo)蛋白相互作用、結(jié)合和/或以其他方式結(jié)合的蛋白，例如，PDGF或VEGF蛋白，或它們的相應(yīng)的同源受體。
在本文中，與核酸，如DNA或RNA相應(yīng)的術(shù)語“分離的”，表示與存在于所述大分子天然來源中的其他DNAs或RNAs分別分離的分子。類似的，在本文中，與多肽相應(yīng)的術(shù)語“分離的”表示與所述多肽的來源中存在的其他蛋白分離的蛋白分子。在本文中，術(shù)語分離的還表示在通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)時(shí)基本上不含細(xì)胞材料、病毒材料或培養(yǎng)基的核酸或肽，或者在通過化學(xué)合成時(shí)基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)試劑。
“分離的核酸”表示包括核酸片段，它不是作為片段天然存在的，并且不會(huì)以天然狀態(tài)被發(fā)現(xiàn)。術(shù)語“分離的”在這里還用于表示多肽，它是從其他細(xì)胞蛋白中分離的，并且表示包括純化的和重組多肽兩者。
在本文中，術(shù)語“標(biāo)記”和“可檢測標(biāo)記”表示能夠檢測的分子，包括，但不局限于，放射性同位素、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光部分、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑、染料、金屬離子、配體(例如，生物素或半抗原)等。術(shù)語“熒光劑”表示能夠表現(xiàn)出可檢測范圍的熒光的物質(zhì)或它的部分。可以在本發(fā)明中使用的標(biāo)記的具體例子包括熒光素、若丹明、丹酰、傘形酮、德克薩斯紅、魯米諾、NADPH、α-β-半乳糖苷酶和辣根過氧化物酶。
“基因在細(xì)胞中的表達(dá)水平”表示由所述細(xì)胞中的基因編碼的mRNA，以及前-mRNA新生轉(zhuǎn)錄物，轉(zhuǎn)錄物加工中間物，成熟mRNA和降解產(chǎn)物的水平，以及由所述基因翻譯的蛋白的水平。
在本文中，術(shù)語“核酸”表示多核苷酸，如脫氧核糖核酸(DNA)，且如果合適的話，還表示核糖核酸(RNA)。該術(shù)語還應(yīng)當(dāng)被理解成包括由核苷酸類似物制備的RNA或DNA類似物作為等同物，以及在用于所述實(shí)施方案時(shí)，單鏈(有義或反義)和雙鏈多核苷酸、ESTs、染色體、cDNAs、mRNAs和rRNAs是可以被稱作核酸的分子的代表性例子。
術(shù)語“寡核苷酸”表示核苷酸或核苷單體的寡聚體或多聚體，它是由天然存在的堿基糖類和糖間(主鏈)鍵組成的。該術(shù)語還包括修飾過的或取代過的寡聚體，包括非天然存在的單體或它的部分，它們起著類似的作用。取代過的寡聚體的整合是基于多種因素的，包括增強(qiáng)了的細(xì)胞攝取，或增強(qiáng)了的核酸酶抗性，并且是根據(jù)本領(lǐng)域公知方法選擇的。完整的寡核苷酸或者僅是它的一部分可以包括取代過的寡聚體。
術(shù)語“百分比同一性”表示兩種氨基酸序列或兩種核苷酸序列之間的序列同一性。同一性可以通過比較在每一種序列上的位置確定，它們可以是為了比較而進(jìn)行比對(duì)的。當(dāng)比較的序列上的相同位置被相同的堿基或氨基酸所占據(jù)時(shí)，所述分子在該位置上是相同的；當(dāng)相同的位點(diǎn)被相同或類似的氨基酸殘基(例如，在空間和/或電子性質(zhì)方面類似)所占據(jù)時(shí)，所述分子可以被稱作在該位置上是同源的(類似的)。同源性、相似性或同一性的百分比表示由比較序列所共有的位置上相同或相似氨基酸的數(shù)目的函數(shù)?？梢允褂酶鞣N比對(duì)算法和/或程序，包括Hidden Markov Model(HMM)、FASTA和BLAST。HNiM、FASTA和BLAST可以從以下機(jī)構(gòu)獲得the National Centerfor Biotechnology Information、National Library of Medicine、National Institutes of Health，Bethesda，Md.和the EuropeanBioinformatic Institute EBI。在一種實(shí)施方案中，兩種序列的百分比同一性可以通過所述GCG程序確定，其缺口權(quán)重為1，例如，對(duì)每一個(gè)氨基酸缺口進(jìn)行加權(quán)，就如同它是兩個(gè)序列之間的單個(gè)氨基酸或核苷酸錯(cuò)配。用于比對(duì)的其他技術(shù)描述于以下文獻(xiàn)中Methods inEnzymology，vol.266Computer Methods for MacromolecularSequence Analysis(1996)，ed.Doolittle，Academic Press，Inc.，adivision of Harcourt Brace & Co.，San Diego，California，美國。如果需要的話，將允許序列中存在缺口的比對(duì)程序用于比對(duì)所述序列。Smith Waterman是一種類型的允許在序列比對(duì)中存在缺口的算法(參見(1997)Meth.Mol. Biol.70173-187)。同樣，采用Needleman和Wunsch比對(duì)方法的GAP程序可用于比對(duì)序列。包括使用HMM的更多的技術(shù)和算法描述于以下文獻(xiàn)中Sequence，Structure，andDatabanksA Practical Approach(2000)，ed.Oxford UniversityPress，Incorporated and in BioinformaticsDatabases and Systems(1999)ed.Kluwer Academic Publishers。另一種檢索策略使用了MPSRCH軟件，該軟件在MASPAR計(jì)算機(jī)上運(yùn)行。MPSRCH使用Smith-Watermnan算法在大量并行計(jì)算機(jī)上對(duì)序列進(jìn)行評(píng)分。這種方法改善了挑選關(guān)系較遠(yuǎn)的匹配的能力，并且特別能耐受小的缺口和核苷酸序列錯(cuò)誤。可以將核酸編碼的氨基酸序列用于檢索蛋白和DNA數(shù)據(jù)庫。具有獨(dú)立序列的數(shù)據(jù)庫描述于以下文獻(xiàn)中Methods inEnzymology，ed.Doolittle，同上。數(shù)據(jù)庫包括Genbank、EMBL和日本的DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ)。
“完全匹配的”在表示雙鏈體時(shí)，表示由形成所述雙鏈體的多核苷酸或寡核苷酸鏈彼此形成了雙鏈結(jié)構(gòu)，以便在每一條鏈上的每一個(gè)核苷酸都與另一條鏈上的核苷酸發(fā)生了沃森-克里克堿基配對(duì)。該術(shù)語還可以包含可以應(yīng)用的核苷類似物的配對(duì)，如脫氧肌苷、具有2-氨基嘌呤堿基的核苷等。靶多核苷酸和寡核苷酸或多核苷酸之間的雙鏈體的錯(cuò)配表示所述雙鏈體上的一對(duì)核苷酸不能進(jìn)行沃森-克里克結(jié)合。在提到三鏈體時(shí)，該術(shù)語表示三鏈體由完全配對(duì)的雙鏈體和第三條鏈組成，其中，每一個(gè)核苷酸都與完全匹配的雙鏈體上的堿基對(duì)發(fā)生了Hoogsteen或反向Hoogsteen結(jié)合。
術(shù)語“RNA干擾”、“RNAi”或“siRNA”都表示通過將一個(gè)或多個(gè)雙鏈RNAs導(dǎo)入靶細(xì)胞中來減弱基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)的任何方法，所述RNA與目標(biāo)基因同源(特別是與目標(biāo)基因，例如，PDGF或VEGF的信使RNA同源)。
多態(tài)變體還可以包括“單核苷酸多態(tài)性”(SNPs)，其中，所述多核苷酸序列有一個(gè)堿基的改變(例如，在PDGF或VEGF中的一個(gè)堿基的改變)。SNPs的存在可以是，例如，某些群體、疾病狀態(tài)或出現(xiàn)疾病狀態(tài)的傾向的指標(biāo)。
異?！疤卣?profile)”，例如，腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)狀態(tài)表示因?yàn)榧膊顟B(tài)而改變的細(xì)胞的各種成分的含量。細(xì)胞成分包括RNA水平、蛋白豐度水平或蛋白活性水平。
在這里，術(shù)語“蛋白”可以與術(shù)語“肽”和“多肽”互換使用。術(shù)語“重組蛋白”表示通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的本發(fā)明的的蛋白，其中，一般將編碼表達(dá)的蛋白或RNA的DNA插入合適的表達(dá)載體，該表達(dá)載體又被用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，以便產(chǎn)生異源蛋白或RNA。另外，短語“源于”，在關(guān)于編碼重組蛋白的重組基因時(shí)，是指在“重組蛋白”的含義內(nèi)，包括具有天然蛋白的氨基酸序列，或與它類似的通過突變產(chǎn)生的氨基酸序列的蛋白，所述突變包括天然存在的蛋白的取代和缺失。
在本文中，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”表示核酸序列(編碼例如，靶核酸之一，或它的反義轉(zhuǎn)錄物)，業(yè)已將所述核酸序列導(dǎo)入了細(xì)胞。對(duì)于導(dǎo)入了它的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或細(xì)胞來說，轉(zhuǎn)基因可以是部分或完全異源的，即，外源的，或者與導(dǎo)入了它的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或細(xì)胞的內(nèi)源基因同源，不過，它們被設(shè)計(jì)成或已經(jīng)以這樣的方式插入所述動(dòng)物的基因組，以便改變插入了它的細(xì)胞的基因組(例如，它被插入的位置不同于天然基因的位置，或者它的插入導(dǎo)致了敲除)。轉(zhuǎn)基因還能夠以附加體的形式存在于細(xì)胞中。轉(zhuǎn)基因可以包括一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，以及任何其他核酸，如內(nèi)含子，它們可能是所選核酸的最佳表達(dá)所必需的。
“新血管疾病”表示以改變了的或不受調(diào)控的血管發(fā)生為特征的疾病，其中伴隨著致癌性或致瘤性轉(zhuǎn)化的疾病，即，癌癥除外。新血管疾病的例子包括銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和眼新血管疾病，包括糖尿病性視網(wǎng)膜病和年齡相關(guān)性黃斑變性。
在本文中，術(shù)語“新生血管形成”和“血管發(fā)生”可以互換使用。新生血管形成和血管發(fā)生表示產(chǎn)生新血管進(jìn)入細(xì)胞、組織或器官。血管發(fā)生的控制通常在某些疾病狀態(tài)中發(fā)生改變，并且，在很多場合下，與所述疾病相關(guān)的病理學(xué)損傷與改變了的、不受調(diào)控的或不受控制的血管發(fā)生相關(guān)。持久的、不受調(diào)控的血管發(fā)生出現(xiàn)在多種疾病狀態(tài)中，包括以內(nèi)皮細(xì)胞異常生長為特征的疾病，并且支持在這些狀況中出現(xiàn)的病理學(xué)損傷，包括血管的泄漏和通透性。
“眼新血管疾病”是以患者眼中改變了的或不受調(diào)控的血管發(fā)生為特征的疾病。實(shí)例性的眼新血管疾病包括視神經(jīng)盤新生血管形成、虹膜新生血管形成、視網(wǎng)膜新生血管形成、脈絡(luò)膜新生血管形成、角膜新生血管形成、玻璃體新生血管形成、綠內(nèi)障、血管翳、翼狀胬肉、黃斑水腫、糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病性黃斑水腫、血管原性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜變性、葡萄膜炎、視網(wǎng)膜炎性疾病和增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變。
術(shù)語“治療”受試者的新血管疾病或“治療”患有新血管疾病的受試者表示讓所述受試者接受藥物治療，例如，施用藥物，以便減弱新血管疾病的至少一種癥狀。因此，在本文中，術(shù)語“治療”意在包括治愈和改善新血管狀況或疾病的至少一種癥狀。因此，在本文中，“治療”包括施用或開處藥用組合物，用于治療或預(yù)防眼新血管疾病。
“患者”表示任何動(dòng)物。術(shù)語“動(dòng)物”包括哺乳動(dòng)物，包括，但不局限于人和其他靈長類。該術(shù)語還包括家畜，如牛、豬、羊、馬、狗和貓。
“PDGF”或“血小板衍生生長因子”表示能影響血管發(fā)生或血管生成過程的哺乳動(dòng)物血小板衍生生長因子。在本文中，術(shù)語“PDGF”包括PDGF的各種亞型，包括PDGF-B(參見圖1(A)和(B))和PDGF-A(參見圖1(C)和(D))。另外，在本文中，術(shù)語“PDGF”表示PDGF-相關(guān)的血管生成因子，如PDGF-C和PDGF-D，它們通過同源PDGF受體起作用，刺激血管發(fā)生或血管生成過程。具體地講，術(shù)語“PDGF”表示生長因子種類的任何成員，它能夠(i)與諸如PDGFR-B(參見圖3(A)和(B))或PDGFR-A(參見圖3(C)和(D))的PDGF受體結(jié)合；(ii)激活與VEGF受體相關(guān)的酪氨酸激酶活性；和(iii)從而影響血管發(fā)生或血管生成過程。在本文中，術(shù)語“PDGF”一般表示生長因子種類的以下成員，它能通過結(jié)合并且激活反應(yīng)性細(xì)胞類型上的血小板衍生生長因子細(xì)胞表面受體(即，PDGFR)來誘導(dǎo)DNA合成和有絲分裂發(fā)生。PDGFs能實(shí)現(xiàn)的特殊生物學(xué)作用包括，例如定向細(xì)胞遷移(趨化性)和細(xì)胞激活；磷脂酶激活；增強(qiáng)了的磷脂酰肌醇周轉(zhuǎn)和前列腺素代謝；刺激反應(yīng)性細(xì)胞的膠原和膠原酶合成；改變細(xì)胞代謝活性，包括基質(zhì)合成，細(xì)胞因子產(chǎn)生，和脂蛋白吸收；在缺少PDGF受體的細(xì)胞中增殖性反應(yīng)的間接誘導(dǎo)；和有效的血管收縮活性。術(shù)語“PDGF”表示包括“PDGF”多肽及其相應(yīng)的“PDGF”編碼基因或核酸。
“PDGF-A”表示PDGF的A鏈多肽及其相應(yīng)的編碼基因或核酸。
“PDGF-B”表示PDGF的B鏈多肽及其相應(yīng)的編碼基因或核酸。
“VEGF”或“血管內(nèi)皮生長因子”表示能影響血管發(fā)生或血管生成過程的哺乳動(dòng)物血管內(nèi)皮生長因子。在本文中，術(shù)語“VEGF”包括VEGF的各種亞型(又被稱作血管通透因子(VPF)和VEGF-A)(參見圖2(A)和(B))，它們是通過例如，VEGF-A/VPF基因的可變剪接產(chǎn)生的，包括VEGF121、VEGF165和VEGF189。另外，在本文中，術(shù)語“VEGF”表示VEGF-相關(guān)的血管生成因子，如PIGF(胎盤生長因子)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E，它們通過同源VEFG受體起作用，刺激血管發(fā)生或血管生成過程。具體地講，術(shù)語“VEGF”表示生長因子種類的任何成員，它能(i)與諸如VEGFR-1(Flt-1)(參見圖4(A)和(B))、VEGFR-2(KDR/Flk-1)(參見圖4(C)和(D))或VEGFR-3(FLT-4)的VEGF受體結(jié)合；(ii)激活與VEGF受體相關(guān)的酪氨酸激酶活性；和(iii)從而影響血管發(fā)生或血管生成過程。術(shù)語“VEGF”意在包括“VEGF”多肽及其相應(yīng)的“VEGF”編碼基因或核酸。
“PDGF拮抗劑”表示能夠部分或完全減弱，或抑制PDGF活性或產(chǎn)生的試劑。PDGF拮抗劑能夠直接或間接減少或抑制特殊的PDGF，如PDGF-B。另外，與上述“拮抗劑”的定義一致的“PDGF拮抗劑”可以包括能夠作用于PDGF配體或它的同源受體，從而減弱或抑制PDGF-相關(guān)的受體信號(hào)的試劑。因此，所述“PDGF拮抗劑”的例子包括，例如靶定PDGF核酸的反義、核酶或RNAi組合物；抗-PDGF適體、抗-PDGF抗體或可溶性PDGF受體誘餌，其能防止PDGF與它的同源受體結(jié)合；靶定同源PDGF受體(PDGFR)核酸的反義、核酶或RNAi組合物；抗-PDGFR適體或抗-PDGFR抗體，其能結(jié)合同源PDGFR受體；和PDGFR酪氨酸激酶抑制劑。
“VEGF拮抗劑”表示能部分或完全減弱或抑制VEGF活性或產(chǎn)生的試劑。VEGF拮抗劑能夠直接或間接減弱或抑制特殊的VEGF，如VEGF165。另外，與上述“拮抗劑”定義一致的“VEGF拮抗劑”可以包括能夠作用于VEGF配體或它的同源受體，從而減弱或抑制VEGF-相關(guān)的受體信號(hào)的試劑。因此，所述“VEGF拮抗劑”的例子包括，例如靶定VEGF核酸的反義、核酶或RNAi組合物；抗-VEGF適體、抗-VEGF抗體或可溶性VEGF受體誘餌，其能防止VEGF與它的同源受體結(jié)合；靶定同源VEGF受體(VEGFR)核酸的反義、核酶或RNAi組合物；能結(jié)合同源VEGFR受體的抗-VEGFR適體或抗-VEGFR抗體；和VEGFR酪氨酸激酶抑制劑。
“足以抑制新血管疾病的量”表示在本發(fā)明組合中用于治療或預(yù)防新形成疾病或它的癥狀所必需的拮抗劑的有效量。用于實(shí)施本發(fā)明用來治療性治療由新血管疾病導(dǎo)致或造成所述新血管疾病的狀況的活性拮抗劑的“有效量”根據(jù)施用方式、新血管疾病的解剖學(xué)部位、患者的年齡、體重和一般健康狀況而改變。最后，醫(yī)生或獸醫(yī)決定合適的量和劑量方案。所述量被稱作足以抑制新血管疾病的量。
通過以下詳細(xì)說明和權(quán)利要求書，可以了解本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)。
多肽X的“變體”表示具有肽X的氨基酸序列的多肽，其中，有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了改變。所述變體可以具有“保守性”改變，其中，取代的氨基酸具有類似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)特性(例如，用異亮氨酸取代亮氨酸)。更罕見的是，變體可能具有“非保守性”改變(例如，用色氨酸取代甘氨酸)。類似的微小變化還可以包括氨基酸缺失或插入，或這兩者。決定哪些氨基酸殘基可以被取代、插入或缺失而又不消除生物學(xué)或免疫學(xué)活性的指南可以使用本領(lǐng)域所熟知的計(jì)算機(jī)程序發(fā)現(xiàn)，例如，LASERGENE軟件(DNASTAR)。
術(shù)語“變體”，在用于表示多核苷酸序列時(shí)，可以包括與基因或它的編碼序列相關(guān)的多核苷酸序列。該定義還可以包括，例如，“等位基因的”、“剪接”、“物種”或“多態(tài)”變體。剪接變體可以與參考分子具有顯著同一性。不過，由于在mRNA加工期間外顯子的可變剪接，一般具有更多或更小數(shù)目的多核苷酸。相應(yīng)的多肽可以具有額外的功能結(jié)構(gòu)域，或者缺少所述結(jié)構(gòu)域。物種變體是在物種之間不同的多核苷酸序列。一般，所得到的多肽彼此具有顯著的氨基酸同一性。多態(tài)變體是特定物種的個(gè)體之間特定基因的多核苷酸序列的變化。
術(shù)語“載體”表示能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與它連接的其他核酸的核酸分子。一種類型的有用的載體是附加體，即，能夠進(jìn)行染色體外復(fù)制的核酸。有用的載體是能夠自主復(fù)制和/或表達(dá)與它連接的核酸的載體。能夠指導(dǎo)可操作地與它連接的基因的表達(dá)的載體在本文中被稱作“表達(dá)載體”。一般，可用于重組DNA技術(shù)中的表達(dá)載體通常是“質(zhì)?！毙问降模话惚硎经h(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，在它們的載體形式中，它們不與染色體結(jié)合。在本說明書中，“質(zhì)粒”和“載體”可以互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是載體的最常使用的形式。不過，本發(fā)明意在包括這樣的其他形式的表達(dá)載體，它們發(fā)揮等同的功能，并且它們隨后為本領(lǐng)域所公知。
組合治療本發(fā)明部分基于VEGF和PDGF活性的特殊抑制作用，其中使用合適的生長因子拮抗劑作為有效的治療手段，用于治療患有新血管疾病的患者。PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑的組合施用，提供了治療眼新血管疾病的比單獨(dú)施用任意一種拮抗劑更高的治療益處。鑒于證明這兩種因子在刺激視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)的血管發(fā)生方面沒有表現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用的研究，抗-VEGF和抗-PDGF劑的組合作用是出乎意料的(參見Castellon等，(2001)Exp.Eye Res.74523-35)。
PDGF和VEGF是新血管在身體，特別是在眼中生長的重要刺激物。為了抑制PDGF和VEGF生物學(xué)活性而進(jìn)行的組合治療提供了用于治療或預(yù)防新血管疾病的方法。
因此，本發(fā)明涉及使用組合治療抑制新血管疾病的方法和組合物。具體地講，本發(fā)明利用在血管細(xì)胞中起作用的兩種不同的細(xì)胞間通訊信號(hào)傳導(dǎo)途徑，即PDGF和VEGF信號(hào)傳導(dǎo)，作為新血管疾病，如眼新血管疾病的治療靶。這種組合方法特別可用于治療任何數(shù)目的以眼新生血管形成的發(fā)展為標(biāo)志的眼科學(xué)疾病或病癥，包括，但不局限于，視神經(jīng)盤新生血管形成、虹膜新生血管形成、視網(wǎng)膜新生血管形成、脈絡(luò)膜新生血管形成、角膜新生血管形成、玻璃體新生血管形成、綠內(nèi)障、血管翳、翼狀胬肉、黃斑水腫、糖尿病性黃斑水腫、血管原性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜變性、黃斑變性、葡萄膜炎、視網(wǎng)膜炎性疾病和增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變。所述組合治療，由抑制PDGF(如PDGF-B)和VEGF(如VEGF-A)信號(hào)傳導(dǎo)的拮抗劑組成，與單獨(dú)使用這兩種治療相比，產(chǎn)生了增強(qiáng)了的治療功效。盡管在下面討論的例子，描述了單一PDGF拮抗劑和單一VEGF拮抗劑的組合，但可以理解的是，多種拮抗劑的組合可能是所需的。
根據(jù)本發(fā)明的抗-PDGF和抗-VEGF組合治療可以單獨(dú)進(jìn)行，或者與其他治療組合進(jìn)行，并且可以在家庭、醫(yī)務(wù)室、診所、醫(yī)院門診室或醫(yī)院提供。治療一般在醫(yī)院開始，從而醫(yī)生能夠密切觀察治療效果，并且進(jìn)行任何需要的調(diào)整。組合治療持續(xù)時(shí)間取決于接受治療的新血管疾病的類型、患者的年齡和狀況、患者疾病的階段和類型以及患者對(duì)治療的反應(yīng)。另外，有發(fā)展為新血管疾病的較大風(fēng)險(xiǎn)的人(例如，糖尿病患者)可以接受治療，以抑制或延緩癥狀的發(fā)作。本發(fā)明所提供的一個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)是，將PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑的組合用于治療新血管疾病，使得能夠施用低劑量的每一種拮抗劑，和較少的總的活性拮抗劑，因此以較低的毒性和副作用以及低成本提供了相似的功效。
所述組合的每一種成分的施用劑量和頻率可以獨(dú)立地控制。例如，一種拮抗劑可以每天施用三次，而第二種拮抗劑可以每天施用一次。組合治療能夠以斷斷續(xù)續(xù)的循環(huán)形式提供，它包括靜止時(shí)間段，以便患者身體有機(jī)會(huì)從任何尚無法預(yù)料的副作用中恢復(fù)。所述拮抗劑還可以一起制備，以便一次施用能夠送遞兩種拮抗劑。
PDGF和VEGF拮抗劑靶PDGF最初是從血小板裂解物分離的，并且被確定為存在于血清而不是血漿中的主要生長促進(jìn)活性。首先顯示PDGF的促有絲分裂活性作用在結(jié)締組織細(xì)胞上，如成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，并且存在于培養(yǎng)物中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中。業(yè)已鑒定了兩種同源PDGF同工型，PDGF A和B，它們是由獨(dú)立的基因(位于7號(hào)和22號(hào)染色體上)編碼的。來自血小板的最主要的種類是AB異源二聚體，盡管所有三種可能的二聚體(AA、AB和BB)都是天然存在的。在翻譯之后，PDGF二聚體被加工成大約30kDa的分泌蛋白。
業(yè)已鑒定了以高親和力結(jié)合PDGF的兩種細(xì)胞表面蛋白，α和β(Heldin等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)783664；Williams等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)795867)。這兩個(gè)種類都包括五個(gè)免疫球蛋白-樣細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是由激酶插入結(jié)構(gòu)域隔開的。在過去幾年中，業(yè)已闡明了三種PDGF同工型對(duì)三種受體二聚體(α/α、α/β和β/β)的特異性。α-受體同源二聚體能以高的親和力結(jié)合所有三種PDGF同工型，β-受體同源二聚體只能以高的親和力結(jié)合PDGF BB，而結(jié)合PDGF AB的親和力低大約10倍，并且α/β-受體異源二聚體能夠以高親和力結(jié)合PDGF BB和PDGF AB(Westermark & Heldin(1993)Acta Oncologica 32101)。所述特異性模式似乎是由于A-鏈只能結(jié)合α-受體，而B-鏈能以高親和力結(jié)合α和β-受體亞基兩者的能力造成的。
總的來說，本發(fā)明提供了能夠抑制一種或多種PDGF活性的試劑。這些PDGF-抑制劑，或PDGF拮抗劑能夠作用于一種或多種形式的所述PDGF配體。血小板衍生生長因子包括A-鏈(PDGF-A)和B-鏈(PDGF-B)的同源或異源二聚體，它們通過結(jié)合兩種相關(guān)的受體酪氨酸激酶，[α]-受體(PDGFR-[α])和[β]-受體(PDGFR-[β])并且使其二聚化發(fā)揮作用。另外，業(yè)已鑒定了所述PDGFR復(fù)合物的兩種新的蛋白酶激活配體，PDGF-C和PDGF-D(參見Li等，(2000)Nat.Cell.Biol.2302-9；Bergsten等，(2001)Nat.Cell.Biol.3512-6；和Uutele等，(2001)Circulation 1032242-47)。由于所述PDGFRs的不同的配體結(jié)合特異性，已知PDGFR-[α][α]能結(jié)合PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB和PDGF-CC；PDGFR-[β][β]能結(jié)合PDGF-BB和PDGF-DD；而PDGFR-[α][β]能結(jié)合PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC和PDGF-DD(參見Betsholtz等，(2001)BioEssays 23494-507)。
VEGF是分泌的二硫鍵連接的同源二聚體，它能選擇性地刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，遷移，并且產(chǎn)生基質(zhì)降解酶(Conn等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)871323-1327)；Ferrara和Henzel(1989)Biochem.Biophys.Res.Commun.161851-858)；Pepper等，(1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.181902-906；Unemori等，(1992)J.Cell.Physiol.153557-562)，它們都是形成新血管所需要的過程。VEGF以四種形式(VEGF-121、VEGF-165、VEGF-189、VEGF-206)存在，這是由于VEGF基因的可變剪接產(chǎn)生的(Houck等，(1991)Mol.Endocrinol.51806-1814；Tischer等，(1991)J.Biol.Chem.26611947-11954)。兩種較小的形式是可擴(kuò)散的，而較大的兩種形式保持主要位于細(xì)胞膜上，這是它們對(duì)肝素高親和力的結(jié)果。VEGF-165還能與肝素結(jié)合，并且是最豐富的形式。VEGF-121，即不能與肝素結(jié)合的唯一形式，似乎對(duì)VEGF受體具有較低的親和力(Gitay-Goren等，(1996)J.Biol.Chem.2715519-5523)以及較低的促有絲分裂效力(Keyt等，(1996)J.Biol.Chem.2717788-7795)。VEGF的生物學(xué)作用是由兩種酪氨酸激酶受體(Flt-1和Flk-1/KDR)介導(dǎo)的，它們的表達(dá)在很大程度上局限于內(nèi)皮來源的細(xì)胞(de Vries等，(1992)Science 255989-991；Millauer等，(1993)Cell 72835-846；Terman等，(1991)Oncogene 6519-524)。盡管兩種功能性受體的表達(dá)都是高親和力結(jié)合所必需的，但內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的趨化性和促有絲分裂信號(hào)傳導(dǎo)似乎主要是通過KDR受體進(jìn)行的(Park等，(1994)J.Biol.Chem.26925646-25654；Seetharam等，(1995)Oncogene 10135-147；Waltenberger等，(1994)J.Biol.Chem.26988-26995)。最近業(yè)已在缺少VEGF基因的單個(gè)等位基因(Carmeliet等，(1996)Nature 380435-439；Ferrara等，(1996)Nature 380439-442)或Flt-1的兩個(gè)等位基因(Fong等，(1995)Nature 37666-70)或Flk-1基因(Shalaby等，(1995)Nature 37662-66)的小鼠體內(nèi)證實(shí)了VEGF和VEGF受體對(duì)血管發(fā)育的重要性。在每一種場合下，都發(fā)現(xiàn)血管形成的明顯的異常導(dǎo)致了胚胎致死。
現(xiàn)在已知由組織缺氧誘導(dǎo)的補(bǔ)償性血管生成是通過VEGF介導(dǎo)的(Levy等，(1996)J.Biol.Chem.2746-2753)；Shweiki等，(1992)Nature 359843-845)。在人類中所做的研究業(yè)已表明，在血管生成性視網(wǎng)膜疾病的玻璃體中存在高濃度的VEGF，但是在無活性的或非-新生血管形成疾病狀態(tài)中不存在所述高濃度的VEGF。在實(shí)驗(yàn)黃斑下手術(shù)之后切斷的人類脈絡(luò)膜組織同樣表現(xiàn)出高的VEGF水平。
除了是唯一的已知內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原之外，VEGF是血管生成生長因子中獨(dú)特的，表現(xiàn)在它在誘導(dǎo)血管對(duì)大分子的通透性瞬時(shí)增加的能力方面(因此，它的最初的和替代的名稱是血管通透因子，VPF)(參見Dvorak等，(1979)J.Immunol.122166-174；Senger等，(1983)Science 219983-985；Senger等，(1986)CancerRes.465629-5632)。增加了的血管通透性和所導(dǎo)致的血漿蛋白在血管外間隙的沉積，有助于通過提供內(nèi)皮細(xì)胞遷移的臨時(shí)基質(zhì)形成新血管(Dvorak等，(1995)Am.J.Pathol.1461029-1039)。通透性過高確實(shí)是新血管的特有特征，包括與腫瘤相關(guān)的血管。
PDGF和VEGF拮抗劑概要本發(fā)明提供了一起用于新血管疾病的組合治療的PDGF和VEGF的拮抗劑(即，抑制劑)。特異性PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑為本領(lǐng)域所公知，并且簡單地描述于以下部分?，F(xiàn)在或者已經(jīng)是技術(shù)人員能夠得到的其他PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑包括抗體、適體、反義寡聚體、核酶和RNAi組合物，它們能夠通過本領(lǐng)域的常規(guī)實(shí)踐結(jié)合本說明書的教導(dǎo)和指導(dǎo)鑒定和生產(chǎn)，包括在下面進(jìn)一步提供的部分。
PDGF拮抗劑一般，PDGF(例如，PDGF-B)的抑制可以通過多種方式實(shí)現(xiàn)。例如，可以獲得能抑制PDGF的活性或產(chǎn)生的多種PDGF拮抗劑，并且可將其用于本發(fā)明的方法。示例性的PDGF拮抗劑包括PDGF的核酸配體或適體，如在下文中所描述的。另外，所述PDGF拮抗劑可以是，例如，抗-PDGF抗體或抗體片段。因此，通過抑制它與受體的結(jié)合可以使所述PDGF分子失活。另外，能在核酸水平上抑制PDGF表達(dá)的諸如反義RNA、核酶和RNAi分子的核酸分子可用作本發(fā)明的拮抗劑。其他PDGF拮抗劑包括肽、蛋白、環(huán)肽或小有機(jī)化合物。另外，通過破壞它的下游信號(hào)傳導(dǎo)，能夠抑制PDGF的信號(hào)傳導(dǎo)活性，例如，通過使用多種小分子酪氨酸激酶抑制性拮抗劑，包括下面所描述的拮抗劑?；衔锘蛟噭┢鹬鳳DGF拮抗劑作用的能力可以按照本領(lǐng)域已知的方法確定，且另外，可以參見以下文獻(xiàn)，例如，Dai等，(2001)Genes & Dev.151913-25；Zippel，等，(1989)Eur.J.Cell Biol.50(2)428-34；和Zwiller，等，(1991)Oncogene6219-21。
本發(fā)明還包括本領(lǐng)域所公知的PDGF拮抗劑，以及下文所支持的，以及屬于普通技術(shù)人員知識(shí)范圍內(nèi)的任何和所有等同試劑。例如，抗PDGF的抑制性抗體為本領(lǐng)域所公知，例如，描述于美國專利號(hào)5,976,534、5,833,986、5,817,310、5,882,644、5,662,904、5,620,687、5,468,468和PCT WO 2003/025019中的那些，所述文獻(xiàn)內(nèi)容被以全文形式收作本文參考。另外，本發(fā)明包括N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，它是PDGF拮抗劑，例如公開于美國專利號(hào)5,521,184和WO2003/013541、WO 2003/078404、WO 2003/099771、WO 2003/015282和WO 2004/05282中的那些，所述文獻(xiàn)被以全文形式收作本文參考。
能阻斷PDGF作用的小分子為本領(lǐng)域所公知，例如，描述于美國專利號(hào)6,528,526(PDGFR酪氨酸激酶抑制劑)、6,524,347(PDGFR酪氨酸激酶抑制劑)、6,482,834(PDGFR酪氨酸激酶抑制劑)、6,472,391(PDGFR酪氨酸激酶抑制劑)、6,696,434、6,331,555、6,251,905、6,245,760、6,207,667、5,990,141、5,700,822、5,618,837和5,731,326中的那些，所述文獻(xiàn)內(nèi)容被以全文形式收作本文參考。
能阻斷PDGF作用的蛋白和多肽為本領(lǐng)域所公知，例如，描述于美國專利號(hào)6,350,731(PDGF肽類似物)、5,952,304中的那些，所述文獻(xiàn)內(nèi)容被以全文形式收作本文參考。
能抑制EGF和/或PDGF受體酪氨酸激酶的雙單-和雙環(huán)芳基和雜芳基化合物為本領(lǐng)域所公知，例如，描述于例如美國專利號(hào)5,476,851、5,480,883、5,656,643、5,795,889和6,057,320中的那些，所述文獻(xiàn)內(nèi)容被以全文形式收作本文參考。
用于抑制PDGF的反義寡核苷酸為本領(lǐng)域所公知，例如，描述于美國專利號(hào)5,869,462和5,821,234中的那些，每一份文獻(xiàn)的內(nèi)容都以全文形式收作本文參考。
用于抑制PDGF的適體(又被稱作核酸配體)為本領(lǐng)域所公知，例如，描述于例如美國專利號(hào)6,582,918、6,229,002、6,207,816、5,668,264、5,674,685和5,723,594中的那些，每一份文獻(xiàn)的內(nèi)容都以全文形式收作本文參考。
本領(lǐng)域所公知的用于抑制PDGF的其他化合物包括，描述于美國專利號(hào)5,238,950、5,418,135、5,674,892、5,693,610、5,700,822、5,700,823、5,728,726、5,795,910、5,817,310、5,872,218、5,932,580、5,932,602、5,958,959、5,990,141、6,358,954、6,537,988和6,673,798中的那些，每一份文獻(xiàn)的內(nèi)容都以全文形式收作本文參考。
VEGF拮抗劑VEGF(例如，VEGF-A)的抑制是通過多種方式實(shí)現(xiàn)的。例如，能抑制VEGF活性或產(chǎn)生的多種VEGF拮抗劑，包括核酸分子，如適體、反義RNA、核酶、RNAi分子和VEGF抗體可以獲得，并且能夠用于本發(fā)明的方法中。示例性的VEGF拮抗劑包括VEGF的核酸配體或適體，正如下文所描述的。對(duì)VEGF-A的特別有用的拮抗劑是EYE001(以前稱為NX1838)，它是修飾過的、PEG化的適體，它能以高的和特異性親和力結(jié)合主要的可溶性人VEGF同工型(參見，美國專利號(hào)6,011,020；6,051,698；和6,147,204)。所述適體能夠以與針對(duì)VEGF的高親和力抗體類似的方式結(jié)合并且使VEGF失活。另一種有用的VEGF適體是EYE001，它是非-PEG化的形式的。另外，所述VEGF拮抗劑可以是，例如，抗-VEGF抗體或抗體片段。因此，通過抑制它與受體結(jié)合使VEGF分子失活。另外，能在核酸水平上抑制VEGF表達(dá)或RNA穩(wěn)定性的諸如反義RNA、核酶和RNAi分子的核酸分子可用作本發(fā)明的方法和組合物中的拮抗劑。其他VEGF拮抗劑包括肽、蛋白、環(huán)肽和小有機(jī)化合物。例如，能結(jié)合VEGF受體而又無伴隨的信號(hào)傳導(dǎo)活性的可溶性截短形式的VEGF也可用作拮抗劑。另外，VEGF的信號(hào)傳導(dǎo)活性可以通過破壞它的下游信號(hào)傳導(dǎo)抑制，例如，通過使用多種拮抗劑，包括VEGF受體酪氨酸激酶活性的小分子抑制劑，正如下文所進(jìn)一步描述的。
化合物或試劑起著VEGF拮抗劑作用的能力，可以按照本領(lǐng)域所熟知的多種標(biāo)準(zhǔn)方法確定。例如，VEGF的生物學(xué)活性之一是通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合來增強(qiáng)血管通透性。所述相互作用導(dǎo)致了緊密的內(nèi)皮連接的松弛，其后果是造成血管流體的泄漏。通過VEGF誘導(dǎo)的血管泄漏可以在體內(nèi)測量，其通過跟蹤由于皮內(nèi)注射VEGF導(dǎo)致的伊文思藍(lán)染料從豚鼠脈管系統(tǒng)的泄漏來進(jìn)行(Dvorak等，inVascular Permeability Factor/Vascular Endothelial Growth Factor，Microvascular Hyperpermeability，and Angiogenesis，和(1995)Am.J.Pathol.1461029)。類似地，可以將所述測定方法用于測量拮抗劑阻斷VEGF的這種生物學(xué)活性的能力。
在血管通透性測定的有用的例子中，VEGF165(20-30nM)與EYE001(30nM-1μM)或候選VEGF拮抗劑離體(ex vivo)預(yù)混合，并且隨后通過皮內(nèi)注射施用到豚鼠背部的剔毛的皮膚中。在注射之后30分鐘，按照標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)注射部位周圍的伊文思藍(lán)染料泄漏進(jìn)行定量，其通過使用計(jì)算機(jī)化的形態(tài)度量分析系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。能抑制VEGF-誘導(dǎo)的指示染料從脈管系統(tǒng)中泄漏的化合物被認(rèn)為是本發(fā)明的方法和組合物的有用拮抗劑。
用于確定化合物是否是VEGF拮抗劑的另一種測定方法是所謂的角膜血管發(fā)生測定。在該測定方法中，將含有VEGF165(3pmol)的methacyrate聚合物沉淀植入大鼠的角膜基質(zhì)中，以誘導(dǎo)血管生長進(jìn)入正常的無血管角膜。然后將候選VEGF拮抗劑通過靜脈內(nèi)途徑施用到大鼠體內(nèi)，劑量為1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg，每天一次或兩次，施用5天時(shí)間。在治療時(shí)間段結(jié)束時(shí)，對(duì)所有個(gè)體的角膜進(jìn)行顯微照相。新血管在角膜組織中發(fā)育的程度，以及候選化合物對(duì)它們的抑制作用，隨后通過顯微照片的標(biāo)準(zhǔn)化形態(tài)度量分析進(jìn)行定量。與用磷酸緩沖鹽水(PBS)處理相比，能抑制角膜中VEGF-依賴型血管發(fā)生的化合物被認(rèn)為是本發(fā)明的方法和組合物的有用的拮抗劑。
還使用早熟性視網(wǎng)膜病的小鼠模型鑒定了候選VEGF拮抗劑。在一個(gè)有用的例子中，分別將9、8、8、7和7只小鼠同窩崽放置在室內(nèi)空氣中或者增加含氧量，并且通過腹膜內(nèi)用磷酸緩沖鹽水(PBS)或候選VEGF拮抗劑進(jìn)行處理(例如，以1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg/天進(jìn)行處理)。然后通過在來自所有處理過的和對(duì)照小鼠的每只眼的20個(gè)組織學(xué)切片中進(jìn)行顯微鏡鑒定和新血管芽計(jì)數(shù)來估計(jì)測定終點(diǎn)，即新毛細(xì)血管通過角膜的內(nèi)界膜長出到玻璃體液中。相對(duì)未處理過的對(duì)照而言處理過的小鼠的視網(wǎng)膜新脈管系統(tǒng)的減少被確定為鑒定有用的VEGF拮抗劑。
在另一種示例性的篩選測定方法中，使用體內(nèi)人類腫瘤異種移植測定鑒定候選VEGF拮抗劑。在這種篩選測定中，在植入裸鼠中的人類腫瘤異種移植物(A673橫紋肌肉瘤和Wilms腫瘤)中檢測候選VEGF拮抗劑的體內(nèi)功效。然后用候選VEGF拮抗劑處理小鼠(例如，10mg/kg，每天腹膜內(nèi)施用一次，然后發(fā)展為確定的腫瘤(200mg))。用對(duì)照試劑處理對(duì)照組。被確定為相對(duì)對(duì)照而言能抑制A673橫紋肌肉瘤生長和Wilms腫瘤的候選化合物被認(rèn)為是本發(fā)明的方法和組合物的有用的拮抗劑。
測定VEGF拮抗劑活性的其他方法為本領(lǐng)域所公知，并且在下文進(jìn)一步描述。
本發(fā)明還包括本領(lǐng)域所公知的VEGF拮抗劑，以及下面所支持的那些，和普通技術(shù)人員知識(shí)范圍內(nèi)的任何和所有等同試劑。例如，針對(duì)VEGF的抑制抗體為本領(lǐng)域所公知，例如，描述于美國專利號(hào)6,524,583、6,451,764(VRP抗體)、6,448,077、6,416,758、6,403,088(針對(duì)VEGF-C)、6,383,484(針對(duì)VEGF-D)、6,342,221(抗-VEGF抗體)、6,342,219、6,331,301(VEGF-B抗體)和5,730,977，和PCT公開號(hào)WO 96/30046、WO 97/44453和WO 98/45331中的那些，所述文獻(xiàn)內(nèi)容被以全文形式收作本文參考。
VEGF受體的抗體同樣為本領(lǐng)域所公知，例如，描述于例如美國專利號(hào)5,840,301、5,874,542、5,955,311、6,365,157和PCT公開號(hào)WO 04/003211中的那些，所述文獻(xiàn)內(nèi)容被以全文形式收作本文參考。
通過例如抑制VEGFR-相關(guān)的酪氨酸激酶活性阻斷VEGF的作用的小分子為本領(lǐng)域所公知，例如，描述于美國專利號(hào)6,514,971、6,448,277、6,414,148、6,362,336、6,291,455、6,284,751、6,177,401、6071,921和6001,885(VEGF表達(dá)的類視黃醇抑制劑)中的那些，每一份文獻(xiàn)的內(nèi)容都以全文形式收作本文參考。
能阻斷VEGF的作用的蛋白和多肽為本領(lǐng)域所公知，例如，描述于美國專利號(hào)6,576,608、6,559,126、6,541,008、6,515,105、6,383,486(VEGF引誘受體)、6,375,929(VEGF引誘受體)、6,361,946(VEFG肽類似物抑制劑)、6,348,333(VEGF引誘受體)、6,559,126(能結(jié)合VEGF并且阻斷與VEGFR結(jié)合的多肽)、6,100,071(VEGF引誘受體)和5,952,199中的那些，每一份文獻(xiàn)的內(nèi)容都以全文形式收作本文參考。
能夠介導(dǎo)對(duì)VEGF和/或VEGFR基因表達(dá)和/或活性的RNA干擾(RNAi)的短的干擾核酸(siNA)、短的干擾RNA(siRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、微型RNA(miRNA)和短的發(fā)夾RNA(shRNA)為本領(lǐng)域所公知，例如，描述于PCT公開號(hào)WO 03/070910中的那些，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容以全文形式收作本文參考。
用于抑制VEGF的反義寡核苷酸為本領(lǐng)域所公知，例如，描述于，例如，美國專利號(hào)5,611,135、5,814,620、6,399,586、6,410,322和6,291,667中的那些，每一份文獻(xiàn)的內(nèi)容都以全文形式收作本文參考。
用于抑制VEGF的適體(又被稱作核酸配體)為本領(lǐng)域所公知，例如，描述于，例如，美國專利號(hào)6,762,290、6,426,335、6,168,778、6,051,698和5,859,228中的那些，每一份文獻(xiàn)的內(nèi)容都以全文形式收作本文參考。
抗體拮抗劑本發(fā)明包括針對(duì)PDGF和VEGF以及它們的同源受體PDGFR和VEGFR的拮抗劑抗體。本發(fā)明的抗體拮抗劑能夠阻斷配體與它的同源受體結(jié)合。因此，本發(fā)明的PDGF拮抗劑抗體包括針對(duì)PDGF以及PDGFR靶的抗體。
本發(fā)明的拮抗劑抗體包括單克隆抑制抗體。單克隆抗體，或其片段，包括所有免疫球蛋白類型，如IgM、IgG、IgD、IgE、IgA或其亞型，如IgG亞型或其混合物。IgG及其亞型是有用的，如IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgGM。所述IgG亞型IgG1/kappa和IgG2b/kapp被作為有用的實(shí)施方案?？梢蕴岬降钠味际墙囟痰幕蛐揎椷^的抗體片段，具有一個(gè)或兩個(gè)抗原互補(bǔ)結(jié)合部位，它表現(xiàn)出針對(duì)哺乳動(dòng)物PDGF或VEGF(或它們的同源受體)的高的結(jié)合和中和活性，如部分抗體具有相當(dāng)于所述抗體的結(jié)合部位，并且是由輕鏈和重鏈形成的，如Fv、Fab或F(ab′)2片段，或單鏈片段。截短的雙鏈片段，如Fv、Fab或F(ab′)2是特別有用的。例如，所述片段可以通過酶促方法通過用諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶的酶消除所述抗體的Fc部分，通過化學(xué)氧化或通過對(duì)抗體基因進(jìn)行遺傳學(xué)操作獲得。同樣可能并且有利的是使用遺傳學(xué)操作的、非截短的片段。所述抗-PDGF或VEGF抗體或其片段可以單獨(dú)使用或以混合物使用。
所述新型抗體、抗體片段、它們的混合物或衍生物對(duì)PDGF或VEGF(或它們的同源受體)的結(jié)合親和力有利地在1×10-7M-1×10-12M，或1×10-8M-1×10-11M，或1×10-9M-5×10-10M范圍內(nèi)。
例如，用于遺傳操作的抗體基因可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方式從雜交瘤細(xì)胞中分離，為此，培養(yǎng)抗體生產(chǎn)性細(xì)胞，并且當(dāng)細(xì)胞的光密度足夠時(shí)，用已知方式從所述細(xì)胞中分離mRNA，其通過用硫氰酸胍裂解細(xì)胞，用乙酸鈉酸化，用苯酚、氯仿/異戊醇提取，用異丙醇沉淀，并且用乙醇洗滌來實(shí)現(xiàn)。然后用mRNA通過使用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。合成的cDNA可以直接或者在遺傳操作之后插入合適的動(dòng)物、真菌、細(xì)菌或病毒載體中，并且在合適的宿主生物中表達(dá)，所述遺傳操作為例如，定點(diǎn)誘變，導(dǎo)入插入、倒位、缺失或堿基交換。有用的細(xì)菌或酵母載體是pBR322、pUC18/19、pACYC184、λ或酵母μ載體，用于克隆所述基因，并且在諸如大腸桿菌(E.coli)的細(xì)菌或諸如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母中表達(dá)。
本發(fā)明還涉及能合成PDGF或VEGF抗體的細(xì)胞。所述細(xì)胞包括按上述方法轉(zhuǎn)化過的動(dòng)物、真菌、細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。它們有利地是雜交瘤細(xì)胞或三體瘤(trioma)細(xì)胞，通常是雜交瘤細(xì)胞。例如，所述雜交瘤細(xì)胞可以通過已知方式從用PDGF或VEGF(或它們的同源受體)免疫的動(dòng)物生產(chǎn)，并且分離它們的產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞，篩選這些細(xì)胞的PDGF或VEGF-結(jié)合抗體，并且隨后使這些細(xì)胞與，例如，人或動(dòng)物，例如，小鼠骨髓瘤細(xì)胞、人類淋巴母細(xì)胞或異種雜交瘤細(xì)胞融合(參見，例如，Koehler等，(1975)Nature 256496)，或通過用合適的病毒感染所述細(xì)胞，以便產(chǎn)生無限增殖化細(xì)胞系。通過融合產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞系是有用的，并且小鼠雜交瘤細(xì)胞系是特別有用的。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞系能分泌IgG類型的有用抗體。本發(fā)明的mAb抗體能夠以高親和力結(jié)合，并且減弱或中和PDGF或VEGF的生物學(xué)(例如，血管生成)活性。
本發(fā)明還包括所述抗-PDGF或VEGF抗體的衍生物，它們保留了它們的PDGF或VEGF-抑制活性，同時(shí)改變了與將它們用作藥物試劑相關(guān)的一種或多種其他特性，例如，血清穩(wěn)定性或生產(chǎn)的效力。所述抗-PDGF或VEGF抗體衍生物的例子包括肽，由抗體的抗原結(jié)合區(qū)衍生的肽模擬物(peptidomimetics)，和與固體或液體載體結(jié)合的抗體、抗體片段或肽，所述載體如聚乙二醇，玻璃，合成聚合物，如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯或天然聚合物，如纖維素、Sepharose或瓊脂糖，或與酶、毒素或放射性或非放射性標(biāo)記，如3H、123I、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、36Cl、57Co、55Fe、59Fe、90Y、99mTc、75Se的綴合物或與熒光/化學(xué)發(fā)光標(biāo)記共價(jià)結(jié)合的抗體、片段或肽，所述標(biāo)記如若丹明、熒光素、異硫氰酸鹽、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、熒光胺、金屬螯合物、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或生物素。
所述新型抗體、抗體片段、其混合物及衍生物可以直接地，在干燥之后，例如冷凍干燥之后，在與上述載體附著之后或在與其他藥用活性和輔助物質(zhì)配制之后用于生產(chǎn)藥用制劑。可以提及的活性和輔助物質(zhì)的例子是其他抗體，具有殺微生物或抑微生物作用的抗微生物活性物質(zhì)，一般如抗生素或磺胺、抗腫瘤劑、水、緩沖劑、鹽水、醇、脂肪、蠟、惰性媒介物或其他常規(guī)用于腸胃外產(chǎn)品的其他物質(zhì)，如氨基酸、增稠劑或糖。所述藥用制劑可用于控制疾病，并且可用于控制眼新血管疾病和包括AMD和糖尿病性視網(wǎng)膜病的疾病。
所述新型抗體、抗體片段、其混合物或衍生物可以直接或者在與上述固體或液體載體、酶、毒素、放射性或非放射性標(biāo)記或與熒光/化學(xué)發(fā)光標(biāo)記結(jié)合之后用于治療或診斷。
本發(fā)明的人PDGF或VEGF單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法獲得。例如，用人PDGF或VEGF(或它們的同源受體)對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫。純化的人PDGF和VEGF可以通過商業(yè)渠道獲得(例如，從Cell Sciences，Norwood，MA，以及其他供應(yīng)商那里購買)。另外，人PDGF或VEGF(或它們的同源受體)可以用人胎盤組織方便地純化。用于產(chǎn)生抗-人PDGF或VEGF抗體的哺乳動(dòng)物不受限制，并且可以是靈長類、嚙齒類(如小鼠、大鼠或兔子)、牛、綿羊、山羊或狗。
然后，將產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，如脾細(xì)胞從免疫的動(dòng)物體內(nèi)取出，并且與骨髓瘤細(xì)胞融合。所述骨髓瘤細(xì)胞為本領(lǐng)域所熟知(例如，可以使用p3x63-Ag8-653、NS-0、NS-1或P3U1細(xì)胞)。細(xì)胞融合操作可以通過本領(lǐng)域所公知的任何常規(guī)方法完成。
在進(jìn)行了細(xì)胞融合操作之后的細(xì)胞隨后在HAT選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以選擇雜交瘤。然后篩選能產(chǎn)生抗人單克隆抗體的雜交瘤。例如，這種篩選可以通過夾心酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或類似方法進(jìn)行，其中，讓產(chǎn)生的單克隆抗體與固定了人PDGF或VEGF(或它們的同源受體)的孔結(jié)合。在這種場合下，可以采用對(duì)免疫過的動(dòng)物的免疫球蛋白特異的抗體作為第二抗體，所述抗體是用酶，如過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶等標(biāo)記過的?？梢酝ㄟ^讓所述標(biāo)記酶與它的底物起反應(yīng)并且測量所產(chǎn)生的顏色來檢測所述標(biāo)記。作為底物，可以生產(chǎn)3，3-二氨基聯(lián)苯胺、2，2-二氨基雙鄰聯(lián)茴香胺、4-氯萘酚，4-氨基安替比林、鄰苯二胺等。
通過上述操作，可以篩選能產(chǎn)生抗-人PDGF或VEGF抗體的雜交瘤。然后通過常規(guī)有限稀釋方法或軟瓊脂方法克隆所選擇的雜交瘤。如果需要的話，可以使用含血清的或不含血清的培養(yǎng)基大規(guī)模培養(yǎng)所述克隆的雜交瘤，或者可以接種到小鼠腹腔內(nèi)，并且從腹水中回收，從而可以獲得大量的克隆的雜交瘤。
然后從所述選擇的抗-人PDGF或VEGF單克隆抗體中選擇具有防止相應(yīng)的配體/受體對(duì)的結(jié)合和激活(例如，在基于細(xì)胞的PDGF或VEGF測定系統(tǒng)中(參見上文))的能力的單克隆抗體用于進(jìn)一步分析和操作。如果所述抗體阻斷受體/配體結(jié)合和/或激活的話，這意味著實(shí)驗(yàn)的單克隆抗體具有減弱或中和人PDGF或VEGF的PDGF或VEGF活性的能力。就是說，所述單克隆抗體能特異性地識(shí)別和/或干擾人PDGF或VEGF(或它們的同源受體)的關(guān)鍵結(jié)合部位。
本發(fā)明的單克隆抗體還包括通過如下方法產(chǎn)生的雜交和重組抗體剪接抗-PDGF或VEGF抗體的可變(包括高變)結(jié)構(gòu)域與恒定結(jié)構(gòu)域(例如，“人源化的”抗體)，或輕鏈與重鏈，或來自一種物種的鏈與來自另一種物種的鏈，或融合體與異源蛋白，而不管來源物種或免疫球蛋白類型或亞型的名稱，以及抗體片段[例如，F(xiàn)ab、F(ab)2和Fv]，只要它們具有希望的生物學(xué)活性就行。[參見例如，美國專利號(hào)4,816,567和Mage & Lamoyi，in Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，pp.79-97(Marcel Dekker，Inc.)，New York(1987)]。
因此，術(shù)語“單克隆的”表示所獲得的抗體的性質(zhì)是來自抗體的基本上均勻的群體，并且不被理解成必須通過任何特定方法生產(chǎn)抗體。例如，要用于本發(fā)明中的單克隆抗體可以通過最初由Kohler &Milstein，Nature 256495(1975)描述的雜交瘤方法制備，或者可以通過重組DNA方法(美國專利號(hào)4,816,567)制備?！鍐慰寺】贵w“還可以從利用在以下文獻(xiàn)中描述的技術(shù)制備的噬菌體文庫中分離例如，McCafferty等，Nature 348552-554(1990)。
非人(例如，鼠類)抗體的“人源化的”形式是特殊的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab)2或抗體的其他抗原結(jié)合亞序列)，它包括來自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗體的大部分是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中，來自受體抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)的殘基被來自非人物種(供體抗體)如小鼠、大鼠或兔子的CDRs的殘基所取代，它具有所需要的特異性、親和力和能力。在某些場合下，人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人FR殘基所取代。另外，人源化抗體可以包括既不存在于受體抗體中，又不存在于輸入的CDR或FR序列中的殘基。進(jìn)行上述修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)并且最優(yōu)化抗體的特性。一般，人源化抗體基本上包括至少一種，通常兩種可變結(jié)構(gòu)域的全部，其中，CDR區(qū)的全部或基本上全部都相當(dāng)于非人免疫球蛋白的CDR區(qū)，而FR殘基的全部或基本上全部都相當(dāng)于人免疫球蛋白共有序列的FR殘基。所述人源化抗體最優(yōu)地還包括免疫球蛋白的恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。
人源化非人抗體的方法為本領(lǐng)域所熟知。一般，將來自非人來源的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基導(dǎo)入人源化抗體。所述非人氨基酸殘基通常被稱作“輸入”殘基，它通常來自“輸入”可變結(jié)構(gòu)域。人源化基本上可以按照Winter及其同事的方法進(jìn)行(Jones等，(1986)Nature321522-525；Riechmann等，(1988)Nature 332323-327；和Verhoeyen等，(1988)Science 2391534-1536)，其中用嚙齒類CDRs或CDR序列取代人類抗體的相應(yīng)序列。因此，所述“人源化的”抗體是嵌合抗體，其中，業(yè)已用來自非人物種的相應(yīng)序列取代了明顯小于完整的人類可變結(jié)構(gòu)域的序列。實(shí)踐中，人源化抗體通常是人類抗體，其中，某些CDR殘基，及可能的某些FR殘基被來自嚙齒類抗體的類似位點(diǎn)的殘基所取代。
選擇輕鏈和重鏈人可變結(jié)構(gòu)域用于制備人源化抗體對(duì)于減弱抗原性來說是非常重要的。按照所謂的“最佳配合”方法，用嚙齒類抗體的可變結(jié)構(gòu)域序列對(duì)已知人類可變-結(jié)構(gòu)域序列的整個(gè)文庫進(jìn)行篩選。然后與嚙齒類序列最接近的人類序列被用作人源化抗體的人構(gòu)架(FR)(Sims等，(1993)J.Immunol.，1512296；和Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.，196901)。另一種方法使用來自輕鏈或重鏈的特定亞型的所有人類抗體共有序列的特定構(gòu)架。相同的構(gòu)架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，894285；和Presta等，(1993)J.Immnol.，1512623)。
另外，重要的是將抗體人源化，其中保留對(duì)抗原的高親和力，以及其他有利的生物學(xué)特性。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，根據(jù)一種有用的方法，通過利用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念的人源化的產(chǎn)物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型是可以普遍獲得的，并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉?？梢垣@得用于說明和展示選定的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序。檢查所述展示允許分析有關(guān)殘基在候選免疫球蛋白序列發(fā)揮功能中的作用，即，分析能影響候選免疫球蛋白與它的抗原結(jié)合的能力的殘基。這樣，可以從共有序列和輸入序列中選擇并且組合FR殘基，從而獲得需要的抗體特性，如增強(qiáng)了的對(duì)靶抗原的親和力。一般，CDR殘基直接并且最主要地參與影響抗原結(jié)合。
本發(fā)明還包括針對(duì)PDGF或VEGF的人類單克隆抗體。所述抗體可以通過雜交瘤方法制備。業(yè)已描述了用于生產(chǎn)人單克隆抗體的人類骨髓瘤和小鼠-人異種骨髓瘤細(xì)胞系，例如，參見Kozbor(1984)J.Immunol.，133，3001；Brodeur，等，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；和Boerner等，(1991)J.Immunol.，14786-95。
現(xiàn)在可能生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如，小鼠)，它在免疫后能夠在不存在內(nèi)源免疫球蛋白產(chǎn)生的前提下產(chǎn)生所有的人類抗體譜。例如，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，在嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失，導(dǎo)致了內(nèi)源抗體產(chǎn)生的完全抑制。將人類種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到種系突變型小鼠體內(nèi)，會(huì)導(dǎo)致在受到抗原攻擊后產(chǎn)生人類抗體(參見，例如，Jakobovits等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，902551；Jakobovits等，(1993)Nature，362255-258；和Bruggermann等，(1993)Year in Immuno.，733)。
另外，可以將噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，(1990)Nature，348552-553)用于由來自未免疫過的供體的免疫球蛋白可變(V)結(jié)構(gòu)域基因譜體外生產(chǎn)人類抗體和抗體片段(有關(guān)綜述可以參見例如，Johnson等，(1993)Current Opinion in Structural Biology.3564-571)。V-基因片段的若干來源可用于噬菌體展示.例如，Clackson等((1991)Nature，352624-628)從來自免疫過的小鼠脾臟的V基因的小型隨機(jī)組合文庫中分離了多樣性的抗-唑酮抗體陣列?？梢詷?gòu)建來自未免疫過的人類供體的V基因譜，并且可以基本上按下文所描述的技術(shù)分離針對(duì)多樣性抗原陣列(包括自身抗原)的抗體Marks等，((1991)J.Mol.Biol.，222581-597，或Griffith等，(1993)EMBO J.，12725-734)。
在天然免疫反應(yīng)中，抗體基因以高比例積累突變(體細(xì)胞高變)。所導(dǎo)入的某些變化可能產(chǎn)生較高的親和力，并且，表現(xiàn)出高親和力表面免疫球蛋白的B細(xì)胞優(yōu)選在隨后的抗原攻擊中復(fù)制并分化。通過采用被稱作“鏈改組”的技術(shù)可以模擬這種自然過程(參見Marks等，(1992)Bio.Technol.，10779-783)。在該方法中，通過噬菌體展示獲得的“第一”人類抗體的親和力能夠通過用從未免疫過的供體內(nèi)獲得的V結(jié)構(gòu)域基因的天然存在的變體譜(所有組成成分)依次取代重鏈和輕鏈V區(qū)基因進(jìn)行改良。這種技術(shù)能夠產(chǎn)生親和力在nM范圍內(nèi)的抗體和抗體片段。Waterhouse等業(yè)已描述了用于制備非常大的噬菌體抗體譜的策略((1993)Nucl.Acids Res.，212265-2266)。
還可將基因改組用于從嚙齒類抗體生產(chǎn)人類抗體，其中，所述人類抗體對(duì)起始嚙齒類抗體具有類似親和力和特異性。根據(jù)該方法，它又被稱作“表位印記”，通過噬菌體展示技術(shù)獲得的嚙齒類抗體的重鏈或輕鏈V結(jié)構(gòu)域基因被人類V結(jié)構(gòu)域基因譜所取代，從而產(chǎn)生了嚙齒類-人類嵌合體。選擇抗原，導(dǎo)致了能夠恢復(fù)功能性抗原結(jié)合部位的人類可變結(jié)構(gòu)域的分離，即表位控制(印記)配偶體的選擇。在重復(fù)所述過程，以便取代其余的嚙齒類V結(jié)構(gòu)域時(shí)，獲得了人類抗體(參見PCT WO 93/06213，1993年4月1日公開)。與通過CDR嫁接進(jìn)行嚙齒類抗體的傳統(tǒng)人源化不同，這種技術(shù)提供了完整的人類抗體，它不具備來自嚙齒類的構(gòu)架或CDR殘基。
適體拮抗劑本發(fā)明提供了針對(duì)PDGF和/或VEGF(或它們的同源受體)的適體拮抗劑。適體，又被稱作核酸配體，是非天然存在的核酸，它能夠結(jié)合，并且一般拮抗(即，抑制)預(yù)先選擇的靶。
適體可以通過生產(chǎn)寡聚體或寡核苷酸的任何已知方法制備。很多合成方法為本領(lǐng)域所公知。例如，包括殘余的嘌呤核糖核苷酸，并且具有合適的3′-末端，如顛倒的胸苷殘基(Ortigao等，AntisenseResearch and Development，2129-146(1992))或位于3′-末端的兩個(gè)硫代磷酸酯鍵以防止最終被3′-外切核酸酶降解的2′-O-烯丙基修飾過的寡聚體，可以通過固相β-氰乙基亞磷酰胺化學(xué)方法(Sinha等，Nucleic Acids Res.，124539-4557(1984))在任何可以通過商業(yè)渠道獲得的DNA/RNA合成儀上合成。一種方法是核糖核苷酸的2′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)保護(hù)策略(Usman等，J.Am.Chem.Soc.，1097845-7854(1987))，并且所有需要的3′-O-亞磷酰胺是通過商業(yè)渠道獲得的。另外，氨基甲基聚苯乙烯可以用作支持材料，這是因?yàn)樗挠欣匦?McCollum和Andrus(1991)TetrahedronLett.，324069-4072)?？梢栽诤铣善陂g通過使用由商業(yè)渠道獲得的熒光素亞磷酰胺，將熒光素添加到底物RNA的5′-末端。一般，可以通過標(biāo)準(zhǔn)的RNA循環(huán)合成適體寡聚體。在組裝結(jié)束時(shí)，通過在密封的小瓶中在55℃下用濃氨水-乙醇(3∶1 v/v)處理8小時(shí)除去所有堿不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)。乙醇能抑制2′-O-TBDMS基團(tuán)的過早除掉，該基團(tuán)的過早除掉會(huì)在去保護(hù)的堿性條件下，在所得到的核糖核苷酸位置上導(dǎo)致明顯的鏈裂解(Usman等，(1987)J.Am.Chem.Soc.，1097845-7854)。在冷凍干燥之后，用三乙胺三氫氟化物/三乙胺/N-甲基吡咯烷酮的混合物在60℃下處理TBDMS保護(hù)的寡聚體2小時(shí)，以在中性條件下快速并且有效地除掉甲硅烷基保護(hù)基團(tuán)(參見Wincott等，(1995)Nucleic Acids Res.，232677-2684)。然后可以用丁醇沉淀完全去保護(hù)的寡聚體，其中按照Cathala和Brunel的方法進(jìn)行((1990)Nucleic Acids Res.，18201)。純化可以通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳或通過離子交換HPLC(Sproat等，(1995)Nucleosides and Nucleotides，14255-273)和反相HPLC的組合進(jìn)行。為了在細(xì)胞中使用，通過在丙酮中用高氯酸鈉沉淀將合成的寡聚體轉(zhuǎn)化成它們的鈉鹽。然后使用小型的一次性的凝膠過濾柱除掉痕量的殘余鹽，所述柱可以通過商業(yè)渠道獲得。作為最后的步驟，可以通過基質(zhì)輔助的激光解吸質(zhì)譜分析法(Pieles等，(1993)Nucleic AcidsRes.，213191-3196)以及通過核苷堿基組成分析檢查所分離的寡聚體的真實(shí)性。
當(dāng)所述核苷酸亞單位可用于酶促操作時(shí)，所公開的適體可以通過酶促方法生產(chǎn)。例如，可以通過體外RNA聚合酶T7反應(yīng)制備RNA分子。所述分子還可以通過能表達(dá)T7的細(xì)菌菌株或細(xì)胞系制備，隨后從所述細(xì)胞中分離。正如下文所討論的，所公開的適體還可以使用載體和啟動(dòng)子直接在細(xì)胞中表達(dá)。
所述適體，與本發(fā)明的其他核酸分子類似，還可以包括化學(xué)修飾過的核苷酸。在核酸的診斷或治療用途中要處理的一個(gè)問題是，磷酸二酯形式的寡核苷酸在體液中在表現(xiàn)出所需效果之前可能被細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外酶，如內(nèi)切核酸酶和外切核酸酶快速降解?？梢詫?duì)核酸配體進(jìn)行某些化學(xué)修飾，以提高核酸配體的體內(nèi)穩(wěn)定性，或者增強(qiáng)或者介導(dǎo)核酸配體的送遞(參見例如，美國專利申請(qǐng)?zhí)?,660,985，標(biāo)題為“High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing ModifiedNucleotides”)，所述文獻(xiàn)被專門收作本文參考。
本發(fā)明所預(yù)期的核酸配體的修飾包括，但不局限于提供了其他化學(xué)基團(tuán)的修飾，它向核酸配體堿基或向總體上的核酸配體整合了額外的電荷、可極化性、疏水性、氫鍵結(jié)合、靜電相互作用和不確定性(fluxionality)。所述修飾包括，但不局限于，2′-號(hào)位置的糖修飾，5-號(hào)位置的嘧啶修飾，8-號(hào)位置的嘌呤修飾，在環(huán)外胺上的修飾，4-硫尿苷的取代，5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代；主鏈修飾，硫代磷酸酯或磷酸烷基酯修飾，甲基化，不常見的堿基對(duì)組合，如異堿基(isobase)異胞苷(isocytidine)和異胍(isoguanidine)等。修飾還可以包括3′和5′修飾，如用糖部分加帽或修飾。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述核酸配體是RNA分子，它是在嘧啶殘基的糖部分上2′-氟(2′-F)修飾的。
通過導(dǎo)入這種修飾，以及通過沿RNA的磷酸酯主鏈修飾和取代，可以大大加強(qiáng)所述適體的穩(wěn)定性。另外，可以在核堿基(nucleobase)本身上進(jìn)行多種修飾，這種修飾能抑制降解，并且能夠增強(qiáng)需要的核苷酸相互作用或減弱不需要的核苷酸相互作用。因此，一旦知道了適體的序列，就可以通過下文所描述的合成方法或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法進(jìn)行修飾或取代。
其他修飾包括整合修飾過的堿基(或修飾過的核苷或修飾過的核苷酸)，它們是存在于核糖核酸(即，A、C、G和U)和脫氧核糖核酸(即，A、C、G和T)的標(biāo)準(zhǔn)堿基、糖和/或磷酸酯主鏈化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化形式。所述范圍內(nèi)包括，例如Gm(2′-甲氧基鳥嘌呤核苷酸)、Am(2′-甲氧基腺苷酸)、Cf(2′-氟胞嘧啶核苷酸)、Uf(2′-氟尿苷酸)、Ar(核糖腺嘌呤核苷酸)。所述適體還可以包括胞嘧啶或任何胞嘧啶-相關(guān)的堿基，包括5-甲基胞嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、2-硫胞嘧啶、5-鹵代胞嘧啶(例如，5-氟代胞嘧啶、5-溴代胞嘧啶、5-氯代胞嘧啶和5-碘代胞嘧啶)、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、5-三氟甲基胞嘧啶、N4，N4-橋亞乙基胞嘧啶(ethanocytosine)、吩嗪胞苷、吩噻嗪胞苷、咔唑胞苷或吡啶并吲哚胞苷。所述適體還可以包括鳥嘌呤或任何鳥嘌呤-相關(guān)的堿基，包括6-甲基鳥嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、2-丙基鳥嘌呤、6-丙基鳥嘌呤、8-鹵代鳥嘌呤(例如，8-氟代鳥嘌呤、8-溴代鳥嘌呤、8-氯代鳥嘌呤和8-碘代鳥嘌呤)、8-氨基鳥嘌呤、8-巰基鳥嘌呤、8-硫代烷基鳥嘌呤、8-羥基鳥嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤或3-脫氮鳥嘌呤。所述適體還可以包括腺嘌呤或任何腺嘌呤-相關(guān)的堿基，包括6-甲基腺嘌呤、N6-異戊烯腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-N6-異戊烯腺嘌呤、8-鹵代腺嘌呤(例如，8-氟代腺嘌呤、8-溴代腺嘌呤、8-氯代腺嘌呤和8-碘代腺嘌呤)、8-氨基腺嘌呤、8-巰基腺嘌呤、8-硫代烷基腺嘌呤、8-羥基腺嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-鹵代腺嘌呤(例如，2-氟代腺嘌呤、2-溴代腺嘌呤、2-氯代腺嘌呤和2-碘代腺嘌呤)、2-氨基腺嘌呤、8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮腺嘌呤或3-脫氮腺嘌呤。還包括尿嘧啶或任何尿嘧啶-相關(guān)的堿基，包括5-鹵代尿嘧啶(例如，5-氟代尿嘧啶、5-溴代尿嘧啶、5-氯代尿嘧啶、5-碘代尿嘧啶)、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5′-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羥基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羥基乙酸、假尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-偶氮尿嘧啶或4-硫尿嘧啶。
本領(lǐng)域所公知的其他修飾過的堿基變體的例子包括，但不局限于在37C.F.R.§1.822(p)(1)中所列舉的，例如，4-乙酰胞苷、5-(羧基羥甲基)尿苷、2′-甲氧基胞苷、5-羧甲基氨基甲基-2-thioridine、5-羧甲基氨基甲基尿苷、二氫尿苷、2′-O-甲基假尿嘧啶核苷、b-D-半乳糖基Q核苷(queosine)、肌苷、N6-異戊烯腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿嘧啶核苷、1-甲基鳥苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥苷、2-甲基腺苷、2-甲基鳥苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鳥苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿苷、b-D-甘露糖基Q核苷(mannosylqueosine)、5-甲氧羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲基硫代N6-異戊烯腺苷、N-((9-b-D-呋喃核糖基-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨甲?；?蘇氨酸、N-((9-b-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-甲基-氨甲?；?蘇氨酸、尿苷-5-羥基乙酸甲酯、尿苷-5-羥基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶核苷、Q核苷、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫尿苷、2-硫尿苷、4-硫尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-b-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)氨甲?；?蘇氨酸、2′-O-甲基-5-甲基尿苷、2′-O-甲基尿苷、wybutosine、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷。
還包括在以下文獻(xiàn)中描述的修飾過的核堿基美國專利號(hào)3,687,808、3,687,808、4,845,205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617、5,645,985、5,830,653、5,763,588、6,005,096和5,681,941。本領(lǐng)域所公知的修飾過的核苷和核苷酸糖主鏈變體的例子包括，但不局限于這樣的變體，它具有，例如，2′核糖基取代基，如F、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2、CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2ON(CH3)2、OCH2OCH2N(CH3)2、O(C1-10烷基)、O(C2-10鏈烯基)、O(C2-10炔基)、S(C1-10烷基)、S(C2-10鏈烯基)、S(C2-10炔基)、NH(C1-10烷基)、NH(C2-10鏈烯基)、NH(C2-10炔基)和O-烷基-O-烷基。所需的2′核糖基取代基包括2′-甲氧基(2′-OCH3)、2′-氨基丙氧基(2′OCH2CH2CH2NH2)、2′-烯丙基(2′-CH2-CH＝CH2)、2′-O-烯丙基(2′-O-CH2-CH＝CH2)、2′-氨基(2′-NH2)和2′-氟(2′-F)。所述2′-取代基可以在阿糖基(上游)位置或核糖基(下游)位置上。
本發(fā)明的適體可以由上文所述的核苷酸和/或核苷酸類似物或者這兩者的組合組成，或者是寡核苷酸類似物。本發(fā)明的適體可以在不影響該寡聚體與PDGF或VEGF(或它們的同源受體)結(jié)合的功能的位置上包括核苷酸類似物。
有若干種技術(shù)可適用于改善或加強(qiáng)核酸配體對(duì)特定靶分子的結(jié)合或?qū)ζ渌m體的選擇。一種技術(shù)，一般稱作“體外遺傳學(xué)”(參見Szostak(1992)TIBS，1989)，涉及通過從隨機(jī)序列庫中選擇來分離適體拮抗劑?？梢苑蛛x所公開的適體的核酸分子庫可以包括與大約二十到四十個(gè)核苷酸的可變序列側(cè)接的不變序列。該方法業(yè)已被稱作通過指數(shù)富集進(jìn)行的配體選擇進(jìn)化(Selective Evolution of Ligandsby EXponential Enrichment)(SELEX)。通過SELEX和相關(guān)方法制備本發(fā)明的適體拮抗劑的組合物和方法為本領(lǐng)域所公知，并且教導(dǎo)于以下文獻(xiàn)中，例如，美國專利號(hào)5,475,096，標(biāo)題為“Nucleic AcidLigands”，和美國專利號(hào)5,270,163，標(biāo)題為“Methods for IdentifyingNucleic Acid Ligands”，每一份文獻(xiàn)都被專門以全文形式收作本文參考。一般，所述SELEX方法，以及具體地講，VEGF和PDGF適體和制劑進(jìn)一步描述于以下文獻(xiàn)中，例如，美國專利申請(qǐng)?zhí)?,668,264、5,696,249、5,670,637、5,674,685、5,723,594、5,756,291、5,811,533、5,817,785、5,958,691、6,011,020、6,051,698、6,147,204、6,168,778、6,207,816、6,229,002、6,426,335、6,582,918，每一份文獻(xiàn)的內(nèi)容都被專門收作本文參考。
簡單地講，SELEX方法涉及從候選寡核苷酸的混合物中選擇，并且使用相同的通用選擇方法逐步重復(fù)與所選擇的靶的結(jié)合、分開和擴(kuò)增，以便獲得實(shí)際上任何需要的結(jié)合親和力和選擇性標(biāo)準(zhǔn)。從通常包括隨機(jī)化序列片段的核酸混合物開始，所述SELEX方法包括讓所述混合物在有利于結(jié)合的條件下與靶接觸，從業(yè)已特異性地結(jié)合到靶分子的核酸中分開未結(jié)合的核酸，解離所述核酸-靶復(fù)合物，擴(kuò)增從核酸-靶復(fù)合物上解離的核酸，以得到核酸的富含配體的混合物，然后重復(fù)結(jié)合、分開、解離和擴(kuò)增步驟多達(dá)需要的循環(huán)次數(shù)，以得到對(duì)靶分子具有高度特異性高親和力的核酸配體。
業(yè)已為實(shí)現(xiàn)多種特殊目的對(duì)基本SELEX方法進(jìn)行了改進(jìn)。例如，美國專利號(hào)5,707,796，標(biāo)題為“Method for Selecting Nucleic Acidson the Basis of Structure”，描述了利用SELEX方法與凝膠電泳組合選擇具有特殊結(jié)構(gòu)特征的核酸分子，如彎曲的DNA。美國專利號(hào)5,763,177，標(biāo)題為“Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichmentPhotoselection of Nucleic Acid Ligands and SolutionSELEX”描述了用于選擇含有光反應(yīng)性基團(tuán)的核酸配體的基于SELEX的方法，所述基團(tuán)能夠結(jié)合和/或光交聯(lián)和/或光滅活靶分子。美國專利號(hào)5,580,737，標(biāo)題為“High-Affinity Nucleic Acid LigandsThat Discriminate Between Theophylline and Caffeine”，描述了用于鑒定高特異性核酸配體的方法，所述配體能夠區(qū)別密切相關(guān)的分子，所述方法可能是非肽的，被稱作Counter-SELEX。美國專利號(hào)5,567,588，標(biāo)題為“Systematic Evolution of Ligands by EXponentialEnrichmentSolution SELEX”，描述了一種基于SELEX的方法，它能夠高效分開對(duì)靶分子具有高親和力和低親和力的寡核苷酸。
SELEX方法包括鑒定包含修飾過的核苷酸的高親和力核酸配體，所述修飾過的核苷酸能賦予配體改善了的特征，如改善了的體內(nèi)穩(wěn)定性或改善了的送遞特征。所述修飾的例子包括在核糖和/或磷酸酯和/或堿基位置上的化學(xué)取代。SELEX方法鑒定的包括修飾過的核苷酸的核酸配體描述于美國專利號(hào)5,660,985中，標(biāo)題為“HighAffinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides”，該文獻(xiàn)描述了含有在嘧啶的5-和2′-位置上進(jìn)行過化學(xué)修飾的核苷酸衍生物的寡核苷酸。美國專利號(hào)5,580,737，同上，描述了高特異性核酸配體，它包括一個(gè)或多個(gè)用2′-氨基(2′-NH2)、2′-氟(2′-F)和/或2′-O-甲基(2′-OMe)修飾過的核苷酸。美國專利申請(qǐng)?zhí)?8/264,029，于1994年6月22日提交，標(biāo)題為“Novel Method of Preparation ofKnown and Novel 2′Modified Nucleosides by IntramolecularNucleophilic Displacement”，現(xiàn)已放棄，描述了包括各種2′-修飾過的嘧啶的寡核苷酸。
SELEX方法包括將選擇的寡核苷酸與其他選擇的寡核苷酸和非寡核苷酸功能單位組合，分別如美國專利號(hào)5,637,459，標(biāo)題為“Systematic Evolution of Ligands by EXponential EnrichmentChimeric SELEX”，和美國專利號(hào)5,683,867，標(biāo)題為“SystematicEvolution of Ligands by EXponential EnrichmentBlended SELEX”所述。上述專利允許將寡核苷酸的多種形狀和其他特性，以及有效擴(kuò)增和復(fù)制特性與其他分子的所需特性組合在一起。
SELEX方法還包括將選定的核酸配體與親脂性化合物或非免疫原性、高分子量化合物在診斷性或治療性復(fù)合物中組合，如美國專利號(hào)6,011,020，標(biāo)題為“Nucleic Acid Ligands Complexes”所述，所述文獻(xiàn)以全文形式收作本文參考。
所述適體拮抗劑可以通過使用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)改良。分子模擬系統(tǒng)的例子為CHARMm和QUANTA程序，Polygen Corporation(Waltham，Mass.)。CHARMm執(zhí)行能量最小化和分子動(dòng)力學(xué)功能。QUANTA執(zhí)行分子結(jié)構(gòu)的構(gòu)建、圖形模擬和分析。QUANTA能夠相互構(gòu)建、修飾、顯示并且分析分子相互之間的表現(xiàn)。上述應(yīng)用可適用于確定并且顯示RNA和DNA分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
然后可以檢驗(yàn)具有上述各種修飾的適體的功能，其中使用適合目標(biāo)PDGF或VEGF功能的任何合適的測定方法，如PDGF基于細(xì)胞的增殖活性測定。
修飾可以在SELEX方法之前或之后進(jìn)行。SELEX方法之前的修飾得到了具有對(duì)它們的SELEX靶的特異性以及改善的體內(nèi)穩(wěn)定性的核酸配體。在SELEX方法之后對(duì)2′-OH核酸配體進(jìn)行修飾，能夠?qū)е麦w內(nèi)穩(wěn)定性的改善，而又不會(huì)對(duì)核酸配體的結(jié)合能力產(chǎn)生負(fù)面影響。
可用于生產(chǎn)本發(fā)明的適體的其他修飾為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知。所述修飾可以在SELEX方法之后進(jìn)行(以前鑒定的未修飾過的配體的修飾)或者通過整合到SELEX方法中進(jìn)行。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，一般來說適體或核酸配體，和具體地講VEGF適體是最穩(wěn)定的，并因此當(dāng)5′-加帽和3′-加帽時(shí)是有效的，能夠減弱對(duì)外切核酸酶的易感性，并且提高整體穩(wěn)定性。因此，在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明是基于一般來說對(duì)適體的加帽的，以及具體地講對(duì)抗-VEGF適體的加帽的，其中使用位于5’末端的5′-5′反向核苷帽結(jié)構(gòu)和位于3’末端的3′-3′反向核苷帽結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明提供了抗-VEGF和/或抗-PDGF適體，即，核酸配體，它在5’末端帶有5′-5′-反向核苷帽，并且在3’末端帶有3′-3′反向核苷帽。
某些特別有用的本發(fā)明的適體是抗-VEGF適體組合物，包括，但不局限于在它們的末端具有5′-5′和3′-3′反向核苷酸帽結(jié)構(gòu)的組合物。所述抗-VEGF加帽的適體可以是RNA適體、DNA適體或具有混合的(即，RNA和DNA)組合物的適體。本發(fā)明的合適的抗-VEGF適體序列包括核苷酸序列GAAGAAUUGG(SEQ ID NO15)；或核苷酸序列UUGGACGC(SEQ ID NO16)；或核苷酸序列GUGAAUGC(SEQ ID NO17)。特別有用的是本發(fā)明的加帽的抗-VEGF的適體，它具有以下序列X-5′-5′-CGGAAUCAGUGAAUGCUUAUACAUCCG-3′-3′-X(SEQ ID NO18)其中每一個(gè)C、G、A和U分別表示天然存在的核苷酸胞苷、胍、腺嘌呤和尿苷，或與它相應(yīng)的修飾過的核苷酸；X-5′-5′是在所述適體的5′末端加帽的反向核苷酸；3′-3′-X是在所述適體的3′末端加帽的反向核苷酸；而其余的核苷酸或修飾過的核苷酸依次通過5′-3′磷酸二酯鍵連接。在某些實(shí)施方案中，加帽的抗-VEGF適體的每一個(gè)核苷酸單獨(dú)具有2′核糖基取代，如-OH(它是核糖核酸(RNAs)的標(biāo)準(zhǔn))，或-H(它是脫氧核糖核酸(DNAs)的標(biāo)準(zhǔn))。在其他實(shí)施方案中，2′核糖基位置被O(C1-10烷基)、O(C1-10鏈烯基)、F、N3或NH2取代基所取代。
在更具體的非限定性例子中，5′-5′加帽的抗-VEGF適體可能具有以下結(jié)構(gòu)Td-5′-5′-CfGmGmArArUfCfAmGmUfGmAmAmUfGmCfUfUfAmUfAmCfAmUfCfCfGm3′-3′-Td(SEQ ID NO19)其中，“Gm”表示2′-甲氧基鳥嘌呤核苷酸，“Am”表示2′-甲氧基腺苷酸，“Cf”表示2′-氟胞嘧啶核苷酸，“Uf”表示2′-氟尿苷酸，“Ar”表示核糖腺嘌呤核苷酸，而“Td”表示脫氧核糖胸苷酸。
反義、核酶和DNA酶拮抗劑靶定PDGF和VEGF的反義寡核苷酸和核酶，通過抑制從這些信使RNAs的蛋白翻譯或通過分別靶定相應(yīng)的PDGF或VEGF mRNs的降解實(shí)現(xiàn)PDGF/VEGF的抑制作用。上述PDGF和VEGF-靶定的核酸提供了用于設(shè)計(jì)和合成PDGF和VEGF核酶和反義寡核苷酸的有用的序列。設(shè)計(jì)和合成反義寡核苷酸和核酶的方法為本領(lǐng)域所公知。本發(fā)明提供了其他指導(dǎo)。
在設(shè)計(jì)特異性和有效的mRNA-靶定的寡核苷酸(反義ODNs)和核酶和反義中的一個(gè)問題是鑒定靶mRNA內(nèi)的反義配對(duì)的可接近位點(diǎn)(它本身折疊成部分自我配對(duì)的二級(jí)結(jié)構(gòu))。計(jì)算機(jī)輔助的預(yù)測RNA配對(duì)可接近性的算法和分子篩選的組合，能夠制備針對(duì)大部分mRNA靶的特異性和有效的核酶和/或反義寡核苷酸。實(shí)際上，業(yè)已描述了若干種確定靶RNA分子對(duì)反義或核酶抑制劑的可接近性的方法。一種方法利用體外篩選測定，其中使用盡可能多的反義寡聚脫氧核苷酸(參見Monia等，(1996)Nature Med.，2668-675；和Milner等，(1997)Nature Biotechnol.，15537-541)。另一種方法使用ODNs的隨機(jī)文庫(Ho等，(1996)Nucleic Acids Res.，241901-1907；Birikh等，(1997)RNA 3429-437；和Lima等，(1997)J.Biol.Chem.，272626-638)?？梢酝ㄟ^RNA酶H切割監(jiān)控可接近的位點(diǎn)(參見Birikh等，同上；和Ho等，(1998)Nature Biotechnol.，1659-63)。RNA酶H能夠催化DNA-RNA雙鏈體的RNA鏈的磷酸二酯主鏈的水解切割。
在另一種方法中，涉及使用半隨機(jī)、嵌合的化學(xué)合成的ODNs的庫，它被用于鑒定被RNA酶H切割的在體外合成的RNA靶上的可接近的位點(diǎn)。然后利用引物延伸分析鑒定靶分子中的這些位點(diǎn)(參見Lima等，同上)。用于設(shè)計(jì)RNA中的反義靶的其他方法基于計(jì)算機(jī)輔助的RNA折疊模型。若干報(bào)導(dǎo)業(yè)已公開了利用隨機(jī)核酶文庫篩選有效的切割(參見Campbell等，(1995)RNA 1598-609；Lieber等，(1995)Mol.Cell Biol.，15540-551；和Vaish等，(1997)Biochem.，366459-6501)。
利用ODNs和RNA酶H的隨機(jī)或半隨機(jī)文庫的其他體外方法可能比計(jì)算機(jī)模擬更有效(Lima等，同上)。不過，體外合成的RNA的使用不能預(yù)測反義ODNs在體內(nèi)的可接近性，因?yàn)樽罱挠^察表明了多核苷酸的退火相互作用受RNA-結(jié)合蛋白的影響(參見Tsuchihashi等，(1993)Science，26799-102；Portman等，(1994)EMBO J.，13213-221；和Bertrand和Rossi(1994)EMBO J.，132904-2912)。內(nèi)容被收作本文參考的美國專利號(hào)6,562,570，提供了用于在存在細(xì)胞提取物的條件下確定mRNA內(nèi)的可接近位點(diǎn)的組合物和方法，所述提取物模擬了體內(nèi)條件。
簡單地講，該方法涉及在雜交條件下在反應(yīng)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基包括含有內(nèi)源RNA-結(jié)合蛋白的細(xì)胞提取物，或者由于存在一種或多種RNA-結(jié)合蛋白而模仿細(xì)胞提取物，使天然的或體外合成的RNAs與特定的反義ODNs、核酶或DNAzymes，或與隨機(jī)或半隨機(jī)ODN、核酶或DNAzyme文庫一起溫育。與靶RNA中的可接近位點(diǎn)互補(bǔ)的任何反義ODN、核酶或DNAzyme，能夠與所述位點(diǎn)雜交。在使用特定的ODNs或ODN文庫時(shí)，RNA酶H是在雜交期間存在的，或者是在雜交之后添加的，以切割業(yè)已發(fā)生了雜交的RNA。在使用核酶或DNAzymes時(shí)，可能存在RNA酶H，但不一是必需的，因?yàn)楫?dāng)發(fā)生了雜交時(shí)所述核酶和DNAzymes能切割RNA。在某些場合下，使用了在細(xì)胞提取物中的隨機(jī)或半隨機(jī)ODN文庫，其含有內(nèi)源mRNA、RNA-結(jié)合蛋白和RNA酶H。
然后，可以用各種方法鑒定靶RNA上的業(yè)已結(jié)合了反義ODNs、核酶或DNAzymes并且發(fā)生了切割的位點(diǎn)。例如，可以將依賴于末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的聚合酶鏈反應(yīng)(TDPCR)用于這一目的(參見Komura和Riggs(1998)Nucleic Acids Res.，261807-11)。通過逆轉(zhuǎn)錄步驟將RNA模板轉(zhuǎn)化成DNA，然后進(jìn)行TDPCR。在本發(fā)明中，TDPCR方法需要的3′末端是通過使用任何合適的依賴于RNA的DNA聚合酶(例如，逆轉(zhuǎn)錄酶)對(duì)目標(biāo)靶RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的。這一目的是通過讓第一種ODN引物(P1)與所述RNA的位于接受研究的靶RNA分子部分下游的區(qū)域(即，沿RNA分子上的5′→3′方向)雜交。在存在dNTPs的情況下，所述聚合酶從P1的3’末端將RNA拷貝成DNA，并且在通過反義ODN/RNA酶H、核酶或DNAzyme產(chǎn)生的切割位點(diǎn)終止拷貝。新的DNA分子(被稱作第一鏈DNA)起著TDPCR方法的PCR部分的第一模板的作用，它被用于鑒定存在于RNA上的相應(yīng)的可接近的靶序列。
例如，然后可以使用TDPCR方法，即，具有鳥苷三磷酸(rGTP)的逆轉(zhuǎn)錄DNA在存在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)的條件下起反應(yīng)，以在DNA分子的3′末端添加(rG)2-4尾巴。然后連接雙鏈ODN接頭，其在一股鏈上具有3′2-4突出端，它與(rG)2-4尾巴堿基配對(duì)。然后添加兩個(gè)PCR引物。第一個(gè)是接頭引物(LP)，它與TDPCR接頭的鏈互補(bǔ)，該接頭連接在(rG)2-4尾巴上(有時(shí)稱作下部鏈)。另一個(gè)引物(P2)可能與P1相同，不過可以是相對(duì)P1嵌套的，即，它與靶RNA在至少部分位于由P1結(jié)合的區(qū)域上游的區(qū)域互補(bǔ)(即，在RNA分子上的3′→5′方向)，不過，它位于接受研究的靶RNA分子的部分的下游。就是說，接受研究以確定它是否具有可接近的結(jié)合位點(diǎn)的靶RNA分子的部分，是互補(bǔ)于P2的區(qū)域上游的部分。然后在存在DNA聚合酶和dNTPs的條件下用已知方式進(jìn)行PCR，以擴(kuò)增由引物L(fēng)P和P2限定的DNA片段。然后可以通過多種已知方法中的任何一種捕獲擴(kuò)增的產(chǎn)物，并且隨后用自動(dòng)化DNA測序儀測序，從而提供對(duì)切割位點(diǎn)的精確鑒定。一旦確定了所述性質(zhì)，就可以合成確定序列的反義DNA或核酶，以在體外和體內(nèi)使用。
在表達(dá)特定基因中的反義干預(yù)可以通過使用合成的反義寡核苷酸序列實(shí)現(xiàn)(參見，例如，Lefebvre-d′Hellencourt等，(1995)Eur.Cyokine Netw.，67；Agrawal(1996)TIBTECH，14376；和Lev-Lehman等，(1997)Antisense Therap.Cohen and Smicek，eds.(Plenum Press，New York))。簡單地講，反義寡核苷酸序列可以是短的DNA序列，通常為15-30聚體，不過，可以小到7聚體(參見Wagner等，(1994)Nature 372333)，它被設(shè)計(jì)成與目標(biāo)靶mRNA互補(bǔ)，并且形成RNAAS雙鏈體。這種雙鏈體的形成能夠防止相關(guān)mRNA的加工、剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)或翻譯。另外，某些AS核苷酸序列在與它們的靶mRNA雜交時(shí)能夠引起細(xì)胞RNA酶H活性，從而導(dǎo)致mRNA降解(參見Calabretta等，(1996)Semin.Oncol.，2378)。在這種場合下，RNA酶H會(huì)切割所述雙鏈體的RNA成分，并且能夠潛在地釋放AS，以進(jìn)一步與靶RNA的其他分子雜交。通過AS與基因組DNA相互作用產(chǎn)生的另一種作用模式，所述相互作用形成了三重螺旋，它能夠轉(zhuǎn)錄失活。
作為上文所討論的反義序列的非限定性、補(bǔ)充性或替代性例子，可以將核酶用于抑制基因功能。當(dāng)反義治療受到化學(xué)計(jì)量的因素限制時(shí)，這是特別必要的。然后可以使用靶定相同序列的核酶。核酶是具有RNA催化能力的RNA分子，它能夠切割靶RNA上的特定位點(diǎn)。由核酶切割的RNA分子的數(shù)目大于由1∶1化學(xué)計(jì)量推測的數(shù)目(參見Hampel和Tritz(1989)Biochem.，284929-33；和Uhlenbeck(1987)Nature，328596-600)。因此，本發(fā)明還可以利用核酶序列，所述序列靶定PDGF或VEGF mRNA種類的可接近的結(jié)構(gòu)域，并且包括合適的催化中心。按照本領(lǐng)域所公知的以及本文中所進(jìn)一步討論的方法制備和送遞核酶。核酶可以與反義序列組合使用。
核酶能催化RNA的磷酸二酯鍵切割。業(yè)已鑒定了若干種核酶結(jié)構(gòu)家族，包括I組內(nèi)含子、RNA酶P、丁型肝炎病毒核酶、錘頭核酶和發(fā)夾核酶，其最初來自煙草環(huán)斑病毒衛(wèi)星RNA(sTRSV)的負(fù)鏈(參見Sullivan(1994)Investig.Dermatolog(Suppl.)10395S；和美國專利號(hào)5,225,347)。后兩個(gè)家族來自類病毒和擬病毒，其中，核酶被認(rèn)為能夠分離單體和在滾環(huán)復(fù)制期間產(chǎn)生的寡聚體(參見Symons(1989)TIBS，14445-50；Symons(1992)Ann.Rev.Biochem.，61641-71)。錘頭和發(fā)夾核酶基序通常最適合用于基因治療的mRNAs的反式切割。用于本發(fā)明的核酶類型是按照本領(lǐng)域已知方法選擇的。發(fā)夾核酶現(xiàn)在用于臨床實(shí)驗(yàn)，并且是特別有用的類型。一般，核酶的長度為30-100核苷酸。
被設(shè)計(jì)用于催化切割靶mRNA轉(zhuǎn)錄物的核酶分子為本領(lǐng)域所公知(例如，PDGF(SEQ ID NO1)或VEGF(SEQ ID NO3)，并且還可用于防止mRNA的翻譯(參見，例如，PCT國際公開號(hào)WO 90/11364；Sarver等，(1990)Science，2471222-1225和美國專利號(hào)5,093,246)。盡管能夠在位點(diǎn)特異性識(shí)別序列切割mRNA的核酶可用于破壞特定的mRNAs，但錘頭核酶的使用是特別有用的。錘頭核酶能在由旁側(cè)區(qū)限定的位置切割mRNAs，所述旁側(cè)區(qū)形成了與靶mRNA的互補(bǔ)堿基配對(duì)。唯一的要求是，靶mRNA具有兩個(gè)堿基的以下序列5′-UG-3′。錘頭核酶的構(gòu)建和生產(chǎn)是本領(lǐng)域所公知的，并且更全面地描述于以下文獻(xiàn)中Haseloff和Gerlach((1988)Nature，334585)。
本發(fā)明的核酶還包括RNA內(nèi)切核糖核酸酶(以下稱之為“Cech-型核酶”)，如在嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)中天然存在的酶(被稱作IVS，或L-19 IVS RNA)，并且其在以下文獻(xiàn)中業(yè)已被Thomas Cech及同事進(jìn)行過充分的介紹(參見Zaug等，(1984)Science，224574-578；Zaug和Cech(1986)Science，231470-475；Zaug，等，(1986)Nature，324429-433；國際專利申請(qǐng)?zhí)朩O88/04300；Been和Cech(1986)Cell，47207-216)。Cech-型核酶具有八個(gè)堿基對(duì)的活性位點(diǎn)，它能與靶RNA序列雜交，然后發(fā)生靶RNA的切割。本發(fā)明包括所述Cech-型核酶，它靶定八個(gè)堿基對(duì)的活性位點(diǎn)序列。盡管本發(fā)明不局限于操作機(jī)制的特定理論，但錘頭核酶在本發(fā)明中的使用，與使用PDGF/VEGF-定向的反義相比具有優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樽钚碌膱?bào)導(dǎo)表明，錘頭核酶通過阻斷RNA翻譯和/或mRNA靶的特異性切割起作用。
正如在反義方法中那樣，核酶可以由修飾過的寡核苷酸構(gòu)成(例如，用于改善的穩(wěn)定性、靶定等)，并且被送遞到能表達(dá)靶mRNA的細(xì)胞。有用的送遞方法涉及使用“編碼”所述核酶的DNA構(gòu)建體，它受強(qiáng)組成型pol III或pol II啟動(dòng)子的控制，從而受感染的細(xì)胞能產(chǎn)生足夠量的核酶，以破壞靶定的信使并且抑制翻譯。由于核酶與反義分子不同，是催化性的，所以需要較低的細(xì)胞內(nèi)濃度實(shí)現(xiàn)它的效力。
如上文所述，如果需要的話，核酸酶抗性是通過本領(lǐng)域所公知的任何方法提供的，它大體上不會(huì)干擾反義寡脫氧核苷酸或核酶的生物學(xué)活性，正如使用和送遞方法所需要的(Iyer等，(1990)J.Org.Chem.，554693-99；Eckstein(1985)Ann.Rev.Biochem.，54367-402；Spitzer和Eckstein(1988)Nucleic Acids Res.，1811691-704；Woolf等，(1990)Nucleic Acids Res.，181763-69；和Shaw等，(1991)Nucleic Acids Res.，1811691-704)。正如上文對(duì)適體所描述的，可以對(duì)反義寡核苷酸或核酶進(jìn)行非限定性代表性修飾，以增強(qiáng)核酸酶抗性，包括修飾磷酸酯主鏈上的亞磷或氧雜原子、短鏈烷基或環(huán)烷基糖間鍵或短鏈雜原子或雜環(huán)糖間鍵。這些包括，例如制備2′-氟化的、O-甲基化的、膦酸甲酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和嗎啉代寡聚體。例如，所述反義寡核苷酸或核酶可以具有硫代磷酸酯鍵，其連接在四-六個(gè)3′-末端核苷酸堿基之間。另外，硫代磷酸酯鍵可以連接所有的核苷酸堿基。硫代磷酸酯反義寡核苷酸在有效并且在動(dòng)物體內(nèi)表現(xiàn)出足夠的藥物動(dòng)力學(xué)半衰期的濃度下通常不表現(xiàn)出明顯的毒性(參見Agarwal等，(1996)TIBTECH，14376)并且是核酸酶抗性的。另外，對(duì)AS-ODN的核酸酶抗性可以通過在3′-末端具有形成環(huán)的九核苷酸序列提供，它的核苷酸序列為CGCGAAGCG。抗生物素蛋白-生物素綴合反應(yīng)的使用，還可用于改善AS-ODNs對(duì)血清核酸酶降解的保護(hù)作用(參見Boado和Pardridge(1992)Bioconj.Chem.，3519-23)。根據(jù)這種概念，在它們的3′-末端對(duì)AS-ODN試劑進(jìn)行單一生物素化。在與抗生物素蛋白起反應(yīng)時(shí)，它們形成了緊密的、核酸酶抗性復(fù)合物，其與未綴合的ODNs相比，具有6倍高的穩(wěn)定性。
其他研究業(yè)已表明了反義寡脫氧核苷酸的體內(nèi)延伸(Agarwal等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)887595)。據(jù)推測，該方法可用作從循環(huán)中排除外來AS-寡核苷酸的清除機(jī)制，這取決于在發(fā)生了延伸的附著的寡核苷酸中游離的3′-末端的存在。因此，在所述重要位置上的部分硫代磷酸酯、環(huán)保護(hù)或生物素-抗生物素蛋白應(yīng)當(dāng)足以確保所述AS-寡脫氧核苷酸的穩(wěn)定性。
除了使用上述修飾過的堿基之外，可以制備核苷酸的類似物，其中，核苷酸的結(jié)構(gòu)發(fā)生了根本的改變，并且，所述核苷酸類似物更適合作為治療劑或?qū)嶒?yàn)試劑。核苷酸類似物的例子是肽核酸(PNA)，其中DNA(或RNA)中的脫氧核糖(或核糖)磷酸酯主鏈被聚酰胺主鏈所取代，它與在肽上出現(xiàn)的情況類似。業(yè)已顯示PNA類似物能夠抗酶的降解作用，并且在體內(nèi)和體外具有延長的壽命。另外，業(yè)已顯示PNAs與互補(bǔ)DNA序列的結(jié)合比DNA分子更強(qiáng)。這種觀察是由于PNA鏈和DNA鏈之間的電荷排斥的缺乏造成的。可以對(duì)寡核苷酸進(jìn)行的其他修飾包括聚合物主鏈、嗎啉代聚合物主鏈(參見，例如，美國專利號(hào)5,034,506，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容被收作本文參考)、環(huán)狀主鏈或無環(huán)主鏈、糖模擬物或任何其他修飾，包括能夠改善寡核苷酸的藥物動(dòng)力學(xué)特性的修飾。
本發(fā)明的另一方面涉及利用DNA酶減弱靶mRNA的表達(dá)，例如，PDGF或VEGF。DNA酶整合了反義和核酶技術(shù)的某些機(jī)制特征。設(shè)計(jì)DNA酶，從而它們能識(shí)別特定的靶核酸序列，這點(diǎn)更像是反義寡核苷酸，不過，它們能催化并且特異性地切割靶核酸這點(diǎn)更像是核酶。
目前有兩種基本類型的DNA酶，并且，這兩種酶都是由Santoro和Joyce鑒定的(參見，例如，美國專利號(hào)6,110,462)。10-23 DNA酶包括環(huán)狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)連接兩個(gè)臂。這兩個(gè)臂通過識(shí)別特定靶核酸序列提供了特異性，而所述環(huán)狀結(jié)構(gòu)提供了在生理學(xué)條件下的催化功能。
簡單地講，為了設(shè)計(jì)能特異性地識(shí)別并且切割靶核酸的DNA酶，本領(lǐng)域技術(shù)人員首先必須鑒定獨(dú)特的靶序列。這可以使用與反義寡核苷酸相同的方法實(shí)現(xiàn)。在某些例子中，所述獨(dú)特的或重要的序列是富含G/C的大約18-22個(gè)核苷酸。高G/C含量有助于確保DNA酶和靶序列之間的較強(qiáng)的相互作用。
在合成DNA酶時(shí)，能將所述酶靶向信使的特異性反義識(shí)別序列是分開的，從而它構(gòu)成DNA酶的兩個(gè)臂，并且將DNA酶的環(huán)放在這兩個(gè)特殊的臂之間。
制備和施用DNA酶的方法可以參見，例如，U.S.6110462。類似地，體外或體內(nèi)送遞DNA核酶的方法包括本文所闡述的送遞RNA核酶的方法。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到，與反義寡核苷酸類似，可以對(duì)DNA酶進(jìn)行任選地修飾，以提高穩(wěn)定性并且改善對(duì)降解的抗性。
RNAi拮抗劑本發(fā)明的某些實(shí)施方案利用了用于通過RNA干擾(RNAi)實(shí)現(xiàn)VEGF和PDGF的抑制的材料和方法。RNAi是序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因抑制方法，它可在真核細(xì)胞中發(fā)生。一般，該方法涉及通過與所述序列同源的雙鏈RNA(dsRNA)誘導(dǎo)的特定序列的mRNA的降解。例如，相當(dāng)于特定單鏈mRNA(ss mRNA)的序列的長的dsRNA的表達(dá)，會(huì)使所述信使不穩(wěn)定，從而“干擾”相應(yīng)基因的表達(dá)。因此，通過導(dǎo)入dsRNA能夠抑制任何選定的基因，所述dsRNA相當(dāng)于所述基因的mRNA的全部或主要部分。看來，當(dāng)長的dsRNA表達(dá)時(shí)，首先通過核糖核酸酶III將它加工成長度為少至21-22個(gè)堿基對(duì)的較短的dsRNA寡核苷酸。因此，RNAi可以通過相對(duì)較短的同源dsRNAs的導(dǎo)入或表達(dá)實(shí)現(xiàn)。實(shí)際上，相對(duì)較短的同源dsRNAs的使用，可能具有某些優(yōu)點(diǎn)，正如下文所討論的。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有受雙鏈RNA(dsRNA)影響的至少兩個(gè)途徑。在RNAi(序列特異性)途徑上，首先將最初的dsRNA分解成短的干擾(si)RNAs，如上文所述。siRNAs具有大約21個(gè)核苷酸的有義和反義鏈，它在各自的3’末端與兩個(gè)核苷酸的突出端形成大約19個(gè)核苷酸的si RNAs。短的干擾RNAs被認(rèn)為提供了允許靶定特定信使RNA進(jìn)行降解的序列信息。相反，非特異性途徑是通過具有任何序列的dsRNA觸發(fā)的，只要它的長度至少為大約30個(gè)堿基對(duì)就行。非特異性作用的發(fā)生是因?yàn)閐sRNA激活了兩種酶PKR(雙鏈RNA-激活的蛋白激酶)，在它的活性形式下能對(duì)翻譯起始因子eIF2進(jìn)行磷酸化，以關(guān)閉所有的蛋白合成，以及2′，5′寡腺苷酸合成酶(2′，5′-AS)，它合成的分子能激活RNA酶L，即一種靶定所有mRNAs的非特異性酶。所述非特異性途徑可能代表了宿主對(duì)應(yīng)激或病毒感染的反應(yīng)，并且，一般，所述非特異性途徑的影響在本發(fā)明的特別有用的方法中得到了最小化。值得注意地是，似乎需要較長的dsRNAs來誘導(dǎo)非特異性途徑，因此，短于大約30個(gè)堿基對(duì)的dsRNAs在通過RNAi實(shí)現(xiàn)基因抑制方面是特別有用的(參見，例如，Hunter等，(1975)J.Biol.Chem.，250409-17；Manche等，(1992)Mol.Cell Biol.，125239-48；Minks等，(1979)J.Biol.Chem.，25410180-3；和Elbashir等，(2001)Nature，411494-8)。
用于實(shí)現(xiàn)RNAi的某些雙鏈寡核苷酸的長度小于30個(gè)堿基對(duì)，并且可能包括核糖核酸的大約25、24、23、22、21、20、19、18或17個(gè)堿基對(duì)。本發(fā)明的dsRNA寡核苷酸任選地包括3′突出端。非限定性的示例性的2-核苷酸3′突出端可以由任何類型的核糖核苷酸殘基組成，并且甚至可以由2′-脫氧胸苷殘基組成，這降低了RNA合成的成本，并且可以提高siRNAs在細(xì)胞培養(yǎng)基以及在轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞中的核酸酶抗性(參見Elbashi等，(2001)Nature，411494-8)。
具有50、75、100或者甚至500個(gè)堿基對(duì)或更多的較長的dsRNAs還可用于本發(fā)明的某些實(shí)施方案中。用于實(shí)現(xiàn)RNAi的dsRNAs的示例性濃度為大約0.05nM、0.1nM、0.5nM、1.0nM、1.5nM、25nM或100nM，盡管根據(jù)處理過的細(xì)胞的性質(zhì)、基因靶和本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠方便地認(rèn)識(shí)的其他因素可以使用其他濃度。示例性的dsRNAs可以化學(xué)合成或者使用合適的表達(dá)載體在體外或體內(nèi)生產(chǎn)。示例性的合成的RNAs包括使用本領(lǐng)域已知方法化學(xué)合成的21個(gè)核苷酸的RNAs(例如，加速RNA亞磷酰胺和胸苷亞磷酰胺(Proligo，德國))。合成的寡核苷酸可以使用本領(lǐng)域公知的方法脫保護(hù)，并且凝膠純化(參見例如，Elbashir等，(2001)Genes Dev.，15188-200)。較長的RNAs可以從啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，如本領(lǐng)域公知的T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子。沿兩種可能的方向放置在體外啟動(dòng)子下游的單一RNA靶能夠轉(zhuǎn)錄所述靶的兩股鏈，以形成具有需要的靶序列的dsRNA寡核苷酸。
用于設(shè)計(jì)寡核苷酸的特定序列可以是包含在表達(dá)的靶基因信使中的任何連續(xù)的核苷酸序列(例如，PDGF的序列(例如，SEQ IDNO2)或VEGF的序列(例如，SEQ ID NO4)?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的程序和算法選擇合適的靶序列。另外，可以按上文另外所述選擇最佳序列，其中使用為了預(yù)測特定單鏈核酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并且允許選擇有可能出現(xiàn)在折疊的mRNA的暴露的單鏈區(qū)的那些序列而設(shè)計(jì)的程序。用于設(shè)計(jì)合適的寡核苷酸的方法和組合物可以參見，例如，美國專利號(hào)6,251,588，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容被收作本文參考。一般，mRNA被認(rèn)為是線性分子，它包括指導(dǎo)蛋白在核糖核苷酸序列內(nèi)合成的信息。不過，研究業(yè)已揭示在大部分mRNAs中存在大量二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。RNA中的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件大部分是通過相同RNA分子的不同區(qū)域之間的沃森-克里克類型的相互作用形成的。重要的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件包括分子內(nèi)雙鏈區(qū)、發(fā)夾環(huán)、雙鏈體RNA中的凸起和內(nèi)部環(huán)。三級(jí)結(jié)構(gòu)元件是在二級(jí)結(jié)構(gòu)元件彼此接觸或者與單鏈區(qū)接觸時(shí)形成的，以產(chǎn)生更復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)。很多研究人員業(yè)已測量了大量RNA雙鏈體結(jié)構(gòu)的結(jié)合能，并且已推導(dǎo)出可用于預(yù)測RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的一系列規(guī)則(參見例如，Jaeger等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)867706(1989)；和Turner等，(1988)Ann.Rev.Biophys.Biophys.Chem.，17167)。所述規(guī)則可用于鑒定RNA結(jié)構(gòu)元件，并且具體地講，用于鑒定單鏈RNA區(qū)，它可能代表了mRNA的靶向沉默RNAi、核酶或反義技術(shù)的特別有用的片段。因此，可以鑒定mRNA靶的特定片段，以用于設(shè)計(jì)介導(dǎo)RNAi的dsRNA寡核苷酸，以及用于設(shè)計(jì)本發(fā)明的合適的核酶和錘頭核酶組合物。
可以通過用異源靶基因轉(zhuǎn)染將dsRNA寡核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞，其中使用本領(lǐng)域所公知的諸如脂質(zhì)體的載體組合物，例如Lipofectamine2000(Life Technologies，Rockville MD)，正如生產(chǎn)商對(duì)于貼壁細(xì)胞系所描述的。靶定內(nèi)源基因的dsRNA寡核苷酸的轉(zhuǎn)染可以使用Oligofectamine(Life Technologies)進(jìn)行。對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞系來說，在共轉(zhuǎn)染編碼hGFP的pAD3之后，可以通過熒光顯微鏡術(shù)檢查轉(zhuǎn)染效力(Kehlenback等，(1998)J.Cell.Biol.，141863-74)。RNAi的效力可以在導(dǎo)入dsRNAs之后通過多種測定方法中的任意一種評(píng)估。所述方法包括，但不局限于使用抗體的蛋白印跡分析，所述抗體在新蛋白合成抑制之后使內(nèi)源庫周轉(zhuǎn)足夠時(shí)間后識(shí)別靶定的基因產(chǎn)物，以及RNA印跡分析，用于測定現(xiàn)有靶mRNA的水平。
用于本發(fā)明的RNAi技術(shù)的其他組合物、方法和應(yīng)用提供于以下文獻(xiàn)中美國專利號(hào)6,278,039、5,723,750和5,244,805，所述文獻(xiàn)的被收作本文參考。
受體酪氨酸激酶抑制劑拮抗劑本發(fā)明還包括本領(lǐng)域所公知的酪氨酸激酶拮抗劑以及它的變體和替代物，這些變體和替代物可以使用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)獲得，并且將現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)收作本文參考。PDGF(和VEGF)的細(xì)胞外信號(hào)通過由所述PDGF受體(和VEGF受體)實(shí)現(xiàn)的酪氨酸激酶介導(dǎo)的磷酸化事件與細(xì)胞的其他部分聯(lián)系，并且它影響了細(xì)胞膜結(jié)合的信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物下游的底物蛋白。因此，作用于PDGF(和/或VEGF)信號(hào)傳導(dǎo)的受體激酶階段的拮抗劑也可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。
對(duì)于諸如PDGFR或VEGFR的酪氨酸激酶受體酶來說具有選擇性的多種類型的酪氨酸激酶抑制劑是已知的(參見，例如，Spada和Myers((1995)Exp.Opin.Ther.Patents，5805)和Bridges((1995)Exp.Opin.Ther.Patents，51245)。另外，Law和Lydon業(yè)已歸納了酪氨酸激酶抑制劑的抗癌潛力((1996)Emerging DrugsTheProspect For Improved Medicines，241-260)。例如，美國專利號(hào)6,528,526描述了取代過的喹喔啉化合物，它能選擇性地抑制血小板衍生生長因子-受體(PDGFR)酪氨酸激酶活性。PDGFR酪氨酸激酶活性的已知抑制劑包括基于喹啉的抑制劑，其由Maguire等，((1994)J.Med.Chem.，372129)和Dolle，等，((1994)J.Med.Chem.，372627)報(bào)道。一種類型的基于苯基氨基-嘧啶的抑制劑最近由Traxler等，在EP 564409，由Zimmerman等，((1996)Biorg.Med.Chem.Lett.，61221-1226)，以及由Buchdunger等，((1995)Proc.Nat.Acad.Sci.(USA)，922558)報(bào)道。可用于抑制PDGF受體酪氨酸激酶活性的喹唑啉衍生物包括雙單-和雙環(huán)芳基化合物和雜芳基化合物(參見，例如，WO 92/20642)、喹喔啉衍生物(參見(1994)Cancer Res.，546106-6114)、嘧啶衍生物(日本公開專利申請(qǐng)No.87834/94)和二甲氧基喹啉衍生物(參見Abstracts of the 116th Annual Meeting of the Pharmaceutical Societyof Japan(Kanazawa)(1996)，2，p.275，29(C2)15-2)。
VEGFR酪氨酸激酶抑制劑的例子包括噌啉衍生物，例如，描述于美國專利號(hào)6,514,971中的那些，該專利的內(nèi)容以它們的全文形式收作本文參考。其他這樣的噌啉衍生物同樣是已知的，例如，(1995)J.Med Chem.，383482-7公開了4-(3-溴苯胺基)噌啉；(1968)J.Chem.Soc.C，(9)1152-5公開了6-氯-4-苯氧基噌啉；(1984)J.Karnatak Univ.，Sci.，2982-6公開了某些4-苯胺基噌啉；和(1973)Indian J.Chem.，11211-13公開了某些4-苯基硫代噌啉。另外，(1973)J.Karnatak Univ.，1825-30公開了某些4-苯氧基噌啉，(1984)J.Karnatak Univ.，Sci.，2982-6公開了兩種化合物4-(4-甲氧基苯胺基)-6，7-二甲氧基噌啉和4-(3-氯苯胺基)-6，7-二甲氧基噌啉。另外，在4-號(hào)位置上具有通過選自--O--、--S--、--NH--和--CH2--的基團(tuán)連接的苯環(huán)的某些噌啉描述于以下文獻(xiàn)中美國專利號(hào)5,017,579、美國專利號(hào)4,957,925、美國專利號(hào)4,994,474和EP 0302793A2。
用于抑制VEGFR和/或PDGFR的其他相關(guān)的化合物可以通過篩選新型化合物對(duì)目標(biāo)受體酪氨酸激酶活性的影響獲得，其中使用常規(guī)測定方法。候選PDGFR或VEGFR小分子有機(jī)抑制劑的有效抑制作用，可以使用基于細(xì)胞的測定系統(tǒng)監(jiān)控，以及使用本領(lǐng)域所公知的其他測定系統(tǒng)。
例如，對(duì)于針對(duì)VEGF-受體酪氨酸激酶的活性的一種檢測如下。所述檢測是使用Flt-1 VEGF-受體酪氨酸激酶進(jìn)行的。詳細(xì)過程如下在室溫下將溶于20mM Tris.HCl pH7.5、3mM二氯化錳(MnCl2)、3mM氯化鎂(MgCl2)、10μM釩酸鈉、0.25mg/ml聚乙二醇(PEG)20000、1mM二硫蘇糖醇和3μg/.mu.l poly(Glu、Tyr)4∶1(Sigma，Buchs，瑞士)、8μM[33P]-ATP(0.2μCi)、1％二甲基亞砜和0-100μM的要檢測的化合物中的30μl激酶溶液(10ng的Flt-1的激酶結(jié)構(gòu)域(參見Shibuya，等，(1990)Oncogene，5519-24)一起溫育10分鐘。然后通過添加10μl的0.25M乙二胺四乙酸(EDTA)pH7終止所述反應(yīng)。使用多通道分配器(LABSYSTEMS，美國)，將20μl的等分試樣應(yīng)用到PVDF(＝聚二氟乙烯(polyvinyl difluoride))Immobilon P膜(Millipore，美國)上，通過微量滴定過濾器歧管并且與真空連接。在完全消除液體之后，在含有0.5％磷酸(H3PO4)的水浴中連續(xù)洗滌所述膜四次，并且用乙醇洗滌一次，每次振蕩溫育10分鐘，然后安裝在Hewlett PackardTopCount Manifold上，并且在添加10μl Microscint.RTM.(β-閃爍計(jì)數(shù)器液體)之后測量放射性。通過對(duì)三種濃度的每一種化合物的抑制百分比的線性回歸分析測定IC50-值(濃度通常為0.01μmol、0.1μmol和1μmol).活性酪氨酸抑制劑化合物的IC50-值可以在0.01μM-100μM范圍內(nèi)。
另外，VEGF-誘導(dǎo)的VEGFR酪氨酸激酶/自身磷酸化活性可以用其他實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞上證實(shí)。簡單地講，將能永久性表達(dá)人VEGF受體(VEGFR/KDR)的轉(zhuǎn)染過的CHO細(xì)胞接種到六孔細(xì)胞培養(yǎng)平板中的完全培養(yǎng)基中(含有10％胎牛血清(FCS))，并在37℃下，在5％CO2中溫育，直到表現(xiàn)出大約80％的匯合。在培養(yǎng)基(不含F(xiàn)CS，含有0.1％牛血清清蛋白)中稀釋要檢測的化合物，并且添加到細(xì)胞中(對(duì)照包括不含實(shí)驗(yàn)化合物的培養(yǎng)基)。在37℃下溫育2小時(shí)之后，添加重組VEGF，最終的VEGF濃度為20ng/ml)。在37℃下再溫育5分鐘之后，用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，并且馬上在每孔100μl的裂解緩沖液中裂解。然后對(duì)裂解液進(jìn)行離心，以除去細(xì)胞核，并且使用商業(yè)化蛋白測定(BIORAD)來測定上清液的蛋白濃度。所述裂解液隨后可以直接使用，或者需要的話在-200℃下保存。
然后進(jìn)行夾心ELISA，以測量KDR-受體磷酸化將KDR的單克隆抗體固定在黑色ELISA平板上(購自Packard的OptiPlateTM，HTRF-96)。然后洗滌所述平板，并且用溶于PBS的1％BSA飽和其余的游離蛋白結(jié)合位點(diǎn)。然后將細(xì)胞裂解液(20μg蛋白/孔)與和堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗磷酸酪氨酸抗體(例如，PY20AP購自Transduction Laboratories，Lexington，KY)一起在4℃下在所述平板上溫育過夜。再次洗滌所述平板，然后使用發(fā)光AP底物(CDP-Star，ready to use，with Emerald II；Applied-Biosystems TROPIXBedford，MA)證實(shí)抗磷酸酪氨酸抗體與捕獲的磷酸化受體的結(jié)合。用Packard Top Count Microplate Scintillation Counter測量發(fā)光。正對(duì)照(用VEGF或PDGF刺激的)和負(fù)對(duì)照(不用VEGF或PDGF刺激)信號(hào)之間的差異，相當(dāng)于VEGF-誘導(dǎo)的KDR-受體磷酸化(＝100％)。測試物質(zhì)的活性是作為VEGF-誘導(dǎo)的KDR-受體磷酸化的％抑制計(jì)算的，其中，誘導(dǎo)最大抑制作用1/2的所述物質(zhì)的濃度被定義為ED50(50％抑制作用的有效劑量)?；钚岳野彼嵋种苿┗衔锏腅D50值在0.001μM-6μM范圍內(nèi)，通常在0.005μM-0.5μM范圍內(nèi)。
藥用制劑和治療施用所述抗-VEGF和抗-PDGF劑可用于治療新血管疾病，包括銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和眼新血管疾病。特別感興趣的是使用PDGF-B拮抗劑化合物與VEGF-A拮抗劑的組合抑制諸如黃斑變性或糖尿病性視網(wǎng)膜病的眼新血管疾病的治療方法。因此，一旦診斷患者有危險(xiǎn)發(fā)展為新血管疾病或患有這種疾病，就通過施用PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑的組合對(duì)所述患者進(jìn)行治療，以分別阻斷PDGF和VEGF的消極作用，從而抑制新血管疾病的發(fā)展，并且減輕與新生血管形成相關(guān)的有害作用。本發(fā)明方法的實(shí)施，不會(huì)導(dǎo)致角膜水腫。正如上文所討論的，可以將多種PDGF和VEGF拮抗劑用于本發(fā)明中。
根據(jù)本發(fā)明的抗-PDGF和抗-VEGF組合治療可以單獨(dú)進(jìn)行或者與其他治療組合進(jìn)行，并且可以在家庭、醫(yī)務(wù)室、診所、醫(yī)院門診部或醫(yī)院提供。一般，治療是在醫(yī)院開始的，從而醫(yī)生能夠密切觀察治療效果，并且進(jìn)行任何需要的調(diào)整。組合治療的持續(xù)時(shí)間取決于要治療的新血管疾病的類型、患者的年齡和狀況、患者疾病的階段和類型以及患者對(duì)治療的反應(yīng)。另外，有發(fā)展為新血管疾病的較大風(fēng)險(xiǎn)的人(例如，糖尿病患者)可以接受治療，以抑制或延緩癥狀的發(fā)作。本發(fā)明所提供的一個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)是，將PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑組合用于治療新血管疾病，使得能夠施用低劑量的每一種拮抗劑，以及較少的總的活性拮抗劑，因此以較低毒性和副作用以及低成本提供了類似的功效。
組合治療的每一種拮抗劑的施用都可以通過任何合適的方法進(jìn)行，它導(dǎo)致了與其他拮抗劑組合的所述拮抗劑的濃度能有效治療新血管疾病。例如，每一種拮抗劑都可以與合適的載體物質(zhì)混合，并且一般它的使用量占組合物總重量的1-95％。所述組合物還能夠以適合眼、口、腸胃外(例如，靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下)、直腸、經(jīng)皮、鼻或吸入施用的劑量形式提供。因此，所述組合物可以是以下形式的，例如，片劑、膠囊、丸劑、粉末、顆粒、懸浮液、乳劑、溶液、凝膠(包括水凝膠)、糊劑、軟膏、乳膏、藥膏、送遞裝置、栓劑、灌腸劑、可注射的、植入物、噴霧劑或氣溶膠。含有一種拮抗劑或兩種或兩種以上拮抗劑的所述藥用組合物可以按照常規(guī)制藥方法制備(參見，例如，RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，(20th ed.)ed.A.R.Gennaro，2000，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，PA.和Encyclopedia 0f Pharmaceutical Technology，eds.，J.Swarbrick和J.C.Boylan，1988-2002，Marcel Dekker，NewYork)。
在一個(gè)有用的方面，將PDGF和VEGF拮抗劑的組合進(jìn)行腸胃外施用(例如，通過肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、眼內(nèi)、玻璃體內(nèi)、眼球后、結(jié)膜下、subtenon或皮下注射或植入)或全身性施用。用于腸胃外或全身性施用的制劑包括無菌水溶液或非水溶液、懸浮液或乳劑。可以使用多種含水載體，例如，水、緩沖過的水、鹽水等。其他合適媒介物的例子包括聚丙二醇、聚乙二醇、植物油、明膠、水凝膠、氫化naphalenes和可注射的有機(jī)酯，如油酸乙酯。所述制劑還可以包括輔助物質(zhì)，如防腐劑、濕潤劑、緩沖劑、乳化劑和/或分散劑。生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用于控制活性成分的釋放。
另外，可以通過口攝入施用PDGF和VEGF拮抗劑的組合。用于口服使用的組合物能夠以固體或液體形式制備，其按照藥用組合物生產(chǎn)領(lǐng)域的任何已知方法進(jìn)行。
用于口服施用的固體劑量形式包括膠囊、片劑、丸劑、粉末和顆粒。一般，所述藥用制劑包括與無毒的可以藥用的賦形劑混合的活性成分(如PDGF小有機(jī)分子拮抗劑和VEGF小有機(jī)分子拮抗劑)。所述賦形劑可以包括，例如，惰性稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、纖維素、淀粉、磷酸鈣、磷酸鈉、高嶺土等。還可以使用粘合劑、緩沖劑和/或潤滑劑(例如，硬脂酸鎂)。片劑和丸劑還可以使用腸溶衣制備。所述組合物可任選地包括增甜劑、增香劑、著色劑、加香劑和防腐劑，以提供更可口的制劑。
例如，所述PDGF和VEGF拮抗劑可以通過玻璃體內(nèi)注射進(jìn)行眼內(nèi)施用，進(jìn)入眼，以及進(jìn)行結(jié)膜下和subtenon注射。其他施用途徑包括經(jīng)鞏膜、眼球后、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)和靜脈內(nèi)。另外，拮抗劑的組合可以使用藥物送遞裝置或眼內(nèi)植入物送遞(參見下文)。
用于口服施用的液體劑量形式包括可以藥用的乳劑、溶液、懸浮液、糖漿和軟的膠囊。這些形式包括本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑，如水或油介質(zhì)，并且還可以包括佐劑，如濕潤劑、乳化劑和懸浮劑。
在某些場合下，PDGF和VEGF拮抗劑的組合還可以局部施用，例如，通過貼劑或通過直接施用于區(qū)域，如容易患或患有新血管疾病的表皮或眼，或通過離子電滲療法。
用于眼使用的與無毒的可以藥用的賦形劑混合的制劑包括含有活性成分的片劑。所述賦形劑可以是，例如，惰性稀釋劑或填料(例如，蔗糖和山梨糖醇)、潤滑劑、助流劑和抗結(jié)合劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸鋅、硬脂酸、二氧化硅、氫化植物油或滑石)。
所述PDGF和VEGF拮抗劑可以在片劑或其他媒介物中混合，或者可以分隔。在一種例子中，第一種拮抗劑包含在片劑的內(nèi)側(cè)，而第二種拮抗劑在外側(cè)，從而第二種拮抗劑的大部分是在第一種拮抗劑釋放之前釋放的。如果需要的話，片劑形式的拮抗劑可以使用藥用送遞裝置送遞(參見下文)。
一般，每一種拮抗劑的使用量應(yīng)當(dāng)足以抑制或減弱或消除新血管疾病的有害作用或癥狀。與載體材料混合以生產(chǎn)單一劑量的活性拮抗劑成分的用量可以根據(jù)要治療的受試者和特定的施用模式改變。
請(qǐng)求保護(hù)的組合的每一種拮抗劑的劑量取決于若干因素，包括狀況的嚴(yán)重性，所述狀況是要治療的還是要預(yù)防的，以及接受治療的人的年齡、體重和健康。另外，有關(guān)特定患者的藥物基因組學(xué)(pharmacogenomic)(基因型對(duì)治療的藥物代謝動(dòng)力學(xué)、藥物動(dòng)力學(xué)或效力特征的影響)信息可能影響使用的劑量。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解能夠根據(jù)多種因素稍微調(diào)整確切的單一劑量，所述因素包括要施用的特定的PDGF和VEGF拮抗劑的組合、施用時(shí)間、施用途徑、制劑的性質(zhì)、排泄速度、要治療的特定的新血管疾病、疾病的嚴(yán)重性以及新血管疾病的解剖學(xué)位置(例如，眼相對(duì)體腔)。考慮到多種施用途徑的不同的效力，預(yù)計(jì)需要的劑量有較大的波動(dòng)。例如，一般，預(yù)計(jì)口服施用需要比通過靜脈內(nèi)或玻璃體內(nèi)注射施用更高的劑量水平。可以通過標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)驗(yàn)的最優(yōu)化途徑調(diào)整所述劑量水平的變化，所述途徑為本領(lǐng)域所熟知。確切的治療有效劑量水平和模式通常是通過主治醫(yī)師，如眼科醫(yī)生考慮上述因素確定的。
一般，在給人口服施用時(shí)，所述PDGF拮抗劑或VEGF拮抗劑的劑量通常在大約0.001mg-大約200mg/天范圍內(nèi)，理想地為大約1mg-100mg/天，更理想地為大約5mg-大約50mg/天。最高達(dá)大約200mg/天的劑量可能是必要的。為了通過注射施用所述PDGF拮抗劑或VEGF拮抗劑，所述劑量通常大約為0.1mg-大約250mg/天，理想地為大約1mg-大約20mg/天，或大約3mg-大約5mg/天。注射可以每天進(jìn)行最多約四次。一般，在通過腸胃外途徑或全身地給人施用時(shí)，與所述PDGF拮抗劑組合使用的VEGF拮抗劑的劑量通常為大約0.1mg-大約1500mg/天，或大約0.5mg-大約10mg/天，或大約0.5mg-大約5mg/天。最高達(dá)大約3000mg/天的劑量可能是必要的。
在給人眼施用時(shí)，與所述PDGF拮抗劑組合使用的VEGF拮抗劑的劑量通常為大約0.15mg-大約3.0mg/天，或大約0.3mg-大約3.0mg/天，或大約0.1mg-1.0mg/天。
例如，為了眼的使用，PDGF-B和VEGF-A適體藥物物質(zhì)是在pH5-7的磷酸緩沖鹽水中配制的?？梢蕴砑託溲趸c或鹽酸進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。在一種工作制劑中，PDGF-B適體和VEGF-A適體，如EYE001是以三種不同的濃度單獨(dú)配制的3mg/100μl、2mg/100μl和1mg/100μl，包裝在裝有無菌的27號(hào)針頭的無菌的1ml，USP I型等級(jí)玻璃注射器中。藥物產(chǎn)品的組合是不含防腐劑的，并且只可用于玻璃體內(nèi)一次注射使用。所述活性成分是PDGF-B和VEGF-A藥物物質(zhì)，濃度為30mg/ml、20mg/ml和10mg/ml。所述賦形劑是氯化鈉，USP；磷酸二氫鈉，一水合物，USP；磷酸氫二鈉，七水合物，USP；氫氧化鈉，USP；鹽酸，USP；和注射用水，USP。這種形式下，所述PDGF-B和VEGF-A適體藥物產(chǎn)物是可直接使用的無菌溶液形式的，它是在一次性使用的玻璃注射器中提供的。在使用之前至少30分鐘(不過不超過4小時(shí))將注射器從冷藏中取出，以使溶液達(dá)到室溫。注射器內(nèi)容物的施用，涉及將帶螺紋的塑料柱塞桿連接在注射器筒內(nèi)的橡膠塞子。然后取出所述橡膠端帽，以施用所述產(chǎn)品。PDGF-B和VEGF-A適體是以100μl的玻璃體內(nèi)注射液形式施用的，施用三次，間隔28天?；颊呙看尉驮\接受3mg/注射。如果必要，將劑量降低到2mg或1mg，并進(jìn)一步到0.1mg。
所施用的藥物的具體量取決于成分的具體組合。在需要的劑量組合中，PDGF拮抗劑與VEGF拮抗劑的重量比為大約50∶1，大約20∶1，大約10∶1，或大約4∶1，大約2∶1，或大約1∶1。
有用的組合治療包括PDGF-B適體拮抗劑和VEGF-A適體拮抗劑。所述拮抗劑是以所述PDGF-B適體拮抗劑與VEGF-A適體拮抗劑的重量比為從大約0.1比大約5.0至大約5.0比0.1組合使用的。這兩種拮抗劑(PDGF-B與VEGF-A拮抗劑)的有用范圍為從大約0.5至大約2.0，或從大約2.0至0.5，不過，另一種有用的比例為從大約1.0至大約1.0，最終取決于所述PDGF-B適體拮抗劑和VEGF-A適體拮抗劑的選擇。
在組合治療中每一種藥物的施用可獨(dú)立地為每天1-4次，施用一天至一年時(shí)間，并且甚至可以使患者終生施用。慢性的、長期施用在很多情況下需要指出。所述劑量可以作為單劑施用或者分成多劑。一般，需要的劑量應(yīng)當(dāng)以設(shè)定的間隔時(shí)間施用較長時(shí)間，通常至少用幾周時(shí)間，盡管幾個(gè)月或更長的施用時(shí)間可能是必要的。
除了治療以前存在的新血管疾病之外，包括PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑的組合治療可以預(yù)防性地進(jìn)行施用，以預(yù)防或延緩所述疾病的發(fā)作。在預(yù)防性應(yīng)用中，給易患或另外有風(fēng)險(xiǎn)患特定新血管疾病的患者施用所述PDGF和VEGF拮抗劑。另外，施用的確切時(shí)間選擇和施用的量取決于多種因素，如患者的健康狀態(tài)、體重等。
在一種工作實(shí)例中，給需要用它治療的哺乳動(dòng)物施用所述PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑的組合，通常以可以注射的藥用組合物形式施用。在所述組合方面，例如，PDGF-B適體和VEGF-A適體可以單獨(dú)施用或者以包括這兩種成分的藥用組合物形式施用。一般，優(yōu)選的是，所述施用可以通過注射或通過使用藥物送遞裝置進(jìn)行。腸胃外、全身性或經(jīng)皮施用也是可以接受的。
如上文所討論的，當(dāng)所述PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑同時(shí)施用時(shí)，所述施用可以是在時(shí)間上依次進(jìn)行的或者同時(shí)進(jìn)行的，依次施用的方法是一種施用模式。當(dāng)所述PDGF和VEGF拮抗劑依次施用時(shí)，每一種成分的施用可以通過相同或不同的方法進(jìn)行。不過，對(duì)于依次施用來說，可以使用以下方法在大約五秒鐘時(shí)間內(nèi)施用所述PDGF拮抗劑(最多達(dá)大約三次注射)，然后每六周時(shí)間持續(xù)施用VEGF拮抗劑，最多達(dá)每年注射大約九次。所述PDGF拮抗劑可以在每一次VEGF拮抗劑注射的同時(shí)施用，或者可以使用的次數(shù)更少，這由醫(yī)生決定。依次施用還包括組合，其中，單獨(dú)的拮抗劑可以以不同次數(shù)施用，或者通過不同的途徑施用，或者為上述兩者，但它們組合起作用以提供有利的效果，例如，抑制新血管疾病。還要指出的是，通過注射施用是特別有用的。
可以將本發(fā)明的藥用組合物配制成基本上在施用之后馬上或者在施用之后任何預(yù)定時(shí)間段釋放活性PDGF和VEGF拮抗劑，其中使用控釋制劑。例如，包括PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑中的至少一種的藥用組合物能夠以持續(xù)釋放組合物的形式提供。馬上或持續(xù)釋放組合物的使用取決于要治療的狀況的性質(zhì)。如果所述狀況由急性或超急性疾病組成的話，一般用馬上釋放形式進(jìn)行治療優(yōu)于長時(shí)間釋放組合物。對(duì)某些預(yù)防性或長期治療來說，持續(xù)釋放組合物也可能是合適的。
在控釋制劑中施用每一種拮抗劑是有用的，其中，所述拮抗劑單獨(dú)或組合具有(i)窄的治療指數(shù)(例如，導(dǎo)致有害副作用或毒性反應(yīng)的血漿濃度和導(dǎo)致治療效果的血漿濃度之間的差異較?。灰话?，治療指數(shù)TI被定義為半致死劑量(LD50)與半有效劑量(ED50)的比例)；(ii)在胃腸道中的窄的吸收窗口；或(iii)短的生物學(xué)半衰期，從而在一天內(nèi)需要經(jīng)常服藥，以便將血漿水平維持在治療水平上。
可以采用多種策略獲得控釋，其中，釋放速度超過了治療性拮抗劑的降解或代謝速度。例如，控釋可以通過適當(dāng)選擇制劑參數(shù)和成分獲得，包括例如，合適的控釋組合物和包衣。其例子包括單一或多個(gè)單位片劑或膠囊組合物、油溶液、懸浮液、乳劑、微型膠囊劑、小球體、納米顆粒(nanoparticle)、貼劑和脂質(zhì)體。用于制備所述持續(xù)釋放或控釋制劑的方法為本領(lǐng)域所熟知。
包括PDGF拮抗劑和/或VEGF拮抗劑或這兩者的藥用組合物還可以使用藥物送遞裝置，如植入物送遞。所述植入物可以是生物可降解的或生物相容性植入物，或者可以是不能生物降解的植入物。所述植入物可以是活性劑能夠滲透或不能滲透的。眼用藥物送遞裝置可以插入眼的腔室，如前部或后部腔室，或者在鞏膜、脈絡(luò)膜間隙或者玻璃體外部的無血管區(qū)之中或之上植入。在一種實(shí)施方案中，所述植入物可以放置在無血管部位上面，如鞏膜上，從而能夠進(jìn)行藥物的經(jīng)鞏膜擴(kuò)散，使藥物到達(dá)需要的部位，例如，眼內(nèi)間隙和眼的黃斑。另外，經(jīng)鞏膜擴(kuò)散的部位可以靠近新生血管形成部位，如接近黃斑的部位。
如上文所述，本發(fā)明涉及將獨(dú)立的藥用組合物組合在藥物包中。因此，本發(fā)明的組合是以藥物包的成分形式提供的。可以將至少兩種拮抗劑配制在一起，或者單獨(dú)配制，并且以獨(dú)立的劑量使用。本發(fā)明的拮抗劑在以鹽的形式制備時(shí)也是有用的。
一般，所述藥物包包括(1)一定量的PDGF拮抗劑，和可以藥用的載體、媒介物或稀釋劑，它在第一種單位劑量形式中；(2)一定量的VEGF拮抗劑，和可以藥用的載體、媒介物或稀釋劑，它在第二種單位劑量形式中；和(3)容器。所述容器可用于分隔成分，并且可以包括，例如，分隔開的瓶子或分隔開的箔包裝。如果需要，所述獨(dú)立的拮抗劑組合物還可以容納在單一的、未分開的容器中。所述藥物包還可以包括施用獨(dú)立的PDGF和VEGF拮抗劑的指南。當(dāng)獨(dú)立的成分是以不同的劑量形式施用時(shí)，以不同的劑量水平施用的，或者需要由處方醫(yī)生決定所述組合的單獨(dú)成分的效價(jià)時(shí)，所述藥物包是特別有利的。在一種實(shí)施方案中，將所述藥物包設(shè)計(jì)成每次分配一個(gè)所述PDGF和VEGF拮抗劑的劑量，以用于它們預(yù)期的用途。在另一種例子中，將藥物包設(shè)計(jì)成包括在包裝中并排放置的一排PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑，通過包裝上的說明告知用戶要施用的一對(duì)拮抗劑。一種示例性的藥物包是所謂的氣泡(blister)包裝，這種包裝為藥物包裝工業(yè)所熟知。
效力新血管疾病的抑制是通過任何可接受的測量血管生成是否延緩或減弱的方法評(píng)估的。這包括直接觀察和間接評(píng)估，如通過評(píng)估主觀癥狀或客觀生理學(xué)指標(biāo)。例如，治療效力，可以根據(jù)新生血管形成、微血管病、血管泄漏或血管水腫或它們的任何組合的預(yù)防或恢復(fù)評(píng)估。用于評(píng)估眼新血管疾病的抑制作用的治療效力還可以以穩(wěn)定或改善視敏度的形式確定。
在確定特定組合治療在治療或預(yù)防眼新血管疾病時(shí)的效力時(shí)，還可以由眼科醫(yī)生在注射之后幾天以及緊在下一次注射前的至少一個(gè)月后對(duì)患者進(jìn)行臨床評(píng)估。還可以根據(jù)眼科醫(yī)生的要求在前四個(gè)月每個(gè)月一次地進(jìn)行ETDRS視敏度、柯達(dá)彩色膠片照相術(shù)和熒光素血管造影術(shù)。
例如，為了評(píng)估PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑組合治療眼新生血管形成的效力，進(jìn)行的研究涉及施用一次或多次的玻璃體內(nèi)注射PDGF-B適體與VEGF-A適體的組合(例如，EYE001的PEG化的形式)，用于患有對(duì)于年齡相關(guān)性黃斑變性繼發(fā)的凹窩下(subfoveal)脈絡(luò)膜新生血管形成的患者，其按照眼科學(xué)領(lǐng)域所熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。在一種工作研究中，患有對(duì)于年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)繼發(fā)的凹窩下脈絡(luò)膜新生血管形成(CNV)的患者接受PDGF-B適體和VEGF-A適體的一次玻璃體內(nèi)注射。監(jiān)控所述組合的效力，例如，通過眼科評(píng)估。在治療之后三個(gè)月患者表現(xiàn)出穩(wěn)定的或改善的視力，例如，在ETDRS圖表上表現(xiàn)出視力的3-線或更多改善被認(rèn)為接受了有效劑量的PDGF-B適體和VEGF-A適體的組合，該劑量能抑制眼新血管疾病。
在工作研究例子中，患有對(duì)于年齡相關(guān)性黃斑變性繼發(fā)的凹窩下CNV并且在ETDRS圖表上視敏度低于20/200的患者接受PDGF-B適體和VEGF-A適體的一次玻璃體內(nèi)注射。起始劑量為每次在玻璃體內(nèi)注射0.25mg的每一種拮抗劑。還實(shí)驗(yàn)了每一種拮抗劑的0.5mg、1、2mg和3mg的劑量。還通過眼底照相和熒光素血管造影術(shù)進(jìn)行了全面的眼科檢查。組合的藥物產(chǎn)品是可直接使用的無菌溶液，它由溶解在10mM磷酸鈉和0.9％氯化鈉緩沖液注射液中的所述PDGF-B適體和VEGF-A適體組成，所述注射液處于無菌的、無致熱原的1cc玻璃注射器筒中，將包衣的塞子連接在塑料柱塞上，并且將橡膠端蓋連接在預(yù)先連接的27號(hào)針頭上。所述PDGF-B和VEGF-A適體是以每一種適體1mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml或30mg/ml的藥物濃度提供的(用寡核苷酸含量表示)，以提供100μl的送遞體積。在注射所述PDGF-B和VEGF-A適體之后大約3個(gè)月，進(jìn)行敏度研究，以便評(píng)估治療效果。在治療之后，患者表現(xiàn)出穩(wěn)定的或改善的視力，例如，在ETDRS圖表上表現(xiàn)出3-線或以上的視力增加的患者被認(rèn)為接受了有效劑量的組合的PDGF-B和VEGF-A適體，它們抑制眼新血管疾病。
實(shí)施例以下實(shí)施例說明了制備和實(shí)施本發(fā)明的某些方式，但是，并不意味著限定本發(fā)明的范圍，因?yàn)榭梢杂闷渌椒ǐ@得類似結(jié)果。
實(shí)施例1角膜新生血管形成(角膜NV)角膜新生血管形成是廣泛使用的動(dòng)物模型，它允許明確顯現(xiàn)眼中的異常血管生長。生長成正常無血管角膜的血管可以很好地建立，使它成為研究血管退化的有吸引力的模型。為了誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)角膜NV，通過肌內(nèi)施用鹽酸氯胺酮(25mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)對(duì)雄性C57BL/6小鼠(18-20g；Charles River，Wilmington，MA)進(jìn)行麻醉。局部施用NaOH(2μl，0.2mM)。通過使用#21刀片(Feather，Osaka，日本)施加平行于角膜緣的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，取出角膜和角膜緣上皮。7天之后，通過每天兩次腹膜內(nèi)注射25mg/kg的pegaptanibsodium(MacugenTM(Eyetech Pharmaceuticals，New York，NY)，抗-VEGF適體試劑，又被稱作EYE001)，或通過每天兩次管飼法口服施用50mg/kg的Gleevec/STI57((又被稱作CGP57148B)，2-苯基氨基嘧啶-相關(guān)的酪氨酸激酶-抑制性抗-PDGF劑，購自NovartisPharma AG，Basel，瑞士)或這兩者，共處理小鼠7天時(shí)間。在角膜NV誘導(dǎo)之后14天，使小鼠靜脈內(nèi)接受20μg/g的異硫氰酸熒光素偶聯(lián)的伴刀豆凝集素A凝集素(Vector Laboratories，Burlingame，CA)，同時(shí)用鹽酸甲苯噻嗪和鹽酸氯胺酮進(jìn)行深度麻醉。30分鐘之后，摘出小鼠眼，并且對(duì)角膜進(jìn)行扁平封固(flat-mounted)。通過熒光顯微鏡術(shù)顯現(xiàn)角膜NV，并且使用Openlab軟件定量。由血管覆蓋的角膜的百分比是以角膜總面積的百分比形式計(jì)算的。
研究了在應(yīng)用NaOH之后pegaptanib sodium和Gleevec對(duì)角膜新生血管形成的影響，以及對(duì)角膜緣和角膜上皮的損傷。與未處理過的和Gleevec處理的眼相比，用pegaptauib sodium(Macugen)處理過的動(dòng)物表現(xiàn)出血管生長的19.6％的降低(p＝0.0014)(圖5)。與對(duì)照和用Gleevec單獨(dú)處理的動(dòng)物相比，用pegaptanib sodium和Gleevec(Mac+Glee)處理的動(dòng)物在角膜上表現(xiàn)出新血管生長的顯著減弱(35.6％p＜0.0001)(圖5)。在減弱血管生長方面，組合治療同樣比pegaptanib sodium(Macugen)單獨(dú)治療更有效(16％p＜0.0145)。
在圖6和7中還示出了代表性的角膜新生血管形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖6(D)是熒光顯微鏡圖像的照片圖示，表明與用Macugen(圖6(C))或Gleevec(圖6(B))處理的個(gè)體相比，組合(Mac+Gleevec)-處理的角膜表現(xiàn)出新血管形成的有效抑制。圖6(A)是熒光顯微鏡圖像的照片圖示，示出了在對(duì)照(PEG-處理的)角膜上新生血管形成的程度。圖7是熒光顯微鏡圖像的照片圖示，表示單獨(dú)(圖7(A)(APB5-處理的)和圖7(B)(Gleevec-處理的))和組合處理(圖7(C))只能抑制新血管生長，而不能影響形成的血管。圖7(D)是熒光顯微鏡圖像的照片圖示，示出了在對(duì)照(PEG-處理的)角膜上新生血管形成的程度。
實(shí)施例2脈絡(luò)膜新生血管形成(CNV)實(shí)驗(yàn)CNV通常被用作年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的模型。在該模型中，脈絡(luò)膜的血管生長突破玻璃膜，并且進(jìn)入視網(wǎng)膜，與AMD患者體內(nèi)觀察到的類似。為了誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)CNV，通過肌內(nèi)施用鹽酸氯胺酮(25mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)對(duì)雄性C57BL/6小鼠(18-20g；Charles River，Wilmington，MA)進(jìn)行麻醉，并且用1％托品酰胺擴(kuò)張瞳孔。使用二極管激光凝固(75-μm斑點(diǎn)大小，0.1-秒持續(xù)時(shí)間，90mW，Oculight SL laser，IRIDEX，Mountain View，CA)和作為接觸透鏡的手持式蓋玻片產(chǎn)生四個(gè)灼傷。灼傷位于視網(wǎng)膜后極的3、6、9和12點(diǎn)鐘的位置。在激光時(shí)產(chǎn)生的氣泡，表明了玻璃膜的破裂，它是獲得脈絡(luò)膜新生血管形成的重要因素，因此，僅將在所有四個(gè)灼傷上都產(chǎn)生氣泡的小鼠用在本研究中。7天之后，通過每天兩次腹膜內(nèi)注射25mg/kg的pegaptanib sodium或通過每天兩次管飼50mg/kg的Gleevec/STI57(Novartis Pharma AG，Basel，瑞士)或同時(shí)進(jìn)行這兩者來處理小鼠7天時(shí)間。在使用APB5(抗-小鼠PDGFRb(CD140b)抗體(抗-PDGF劑)，購自eBioscience，San Diego，CA)的實(shí)驗(yàn)中，通過腹膜內(nèi)注射每天兩次施用5mg/kg抗體，在用PECAM染色的扁平封固的脈絡(luò)膜中測量脈絡(luò)膜NV損傷的面積。通過熒光顯微鏡術(shù)檢查扁平封固，并且通過Openlab軟件定量。
與未處理過的對(duì)照相比，用pegaptanib sodium(MacugenTM)處理的眼表現(xiàn)出CNV面積降低了24％(p＝0.007)(圖8)。相反，APB5-處理的眼與對(duì)照相比沒有明顯的差別(與對(duì)照相比CNV面積減少了6.5％)。與對(duì)照眼或用pegaptanib sodium(22％p＝0.011)或APB5(39.5％p＜0.0001)單獨(dú)處理的眼相比，用pegaptanib sodium和APB5二者處理的眼表現(xiàn)出CNV面積的明顯減少(46％p＝0.001)(圖8)。
在使用PDGFRβ抑制劑時(shí)，觀察到了類似的傾向。Gleevec處理的眼與對(duì)照眼相比沒有表現(xiàn)出顯著差別(4.2％)(圖9)。不過，用pegaptanib sodium(MacugenTM)處理的眼的CNV面積與對(duì)照明顯不同(少27％，p＝0.0034)。重要的是，用pegaptanib sodium和Gleevec處理過的動(dòng)物(M8cugen+Gleevec)與對(duì)照眼相比表現(xiàn)出最小量的CNV(46％p＜0.0001)，且與pegaptanib sodium單獨(dú)處理的眼相比表現(xiàn)出CNV面積減少了19％(p＝0.0407)(圖9)。
實(shí)施例3新生小鼠模型研究了施用pegaptanib sodium(MacugenTM)和ARC-127(Archemix Corp.，Cambridge，MA)，即具有序列CAGGCUACGNCGTAGAGCAU CANTGATCCU GT(參見來自U.S.6,582,918的SEQ ID NO146，所述文獻(xiàn)被以全文形式收作本文參考)的PEG化的抗-PDGF適體或這兩者對(duì)視網(wǎng)膜血管發(fā)育的影響，所述序列在6、20和30號(hào)位置上具有2′-氟-2′-脫氧尿苷，在8、21、28和29號(hào)位置上具有2′-氟-2′-脫氧胞苷，在9、15、17和31號(hào)位置上具有2′-O-甲基-2′-脫氧鳥苷，在22號(hào)位置上具有2′-O-甲基-2′-脫氧腺苷，在10和23號(hào)位置的“N”上具有六甘醇亞磷酰胺，并且在32號(hào)位置上具有顛倒方向的T(即，3′-3′-連接的)。新生的C57BL/6小鼠每天一次注射(腹膜腔內(nèi))100μg的ARC-127或100μg的Macugen或這兩者，在出生后當(dāng)天0(P0)開始。在P4摘出小鼠眼。在扁平封固的視網(wǎng)膜上顯現(xiàn)視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)，其通過用PECAM和NG-2免疫染色，或者通過用ConA-FITC灌注，并且通過熒光顯微鏡術(shù)分析實(shí)現(xiàn)。
注射ARC-127，能完全阻斷壁細(xì)胞被招募用于發(fā)育視網(wǎng)膜的血管。另外，與對(duì)照未-處理的視網(wǎng)膜相比，在P4觀察到了較少的血管生長。相反，Macugen不會(huì)干擾正常的血管發(fā)育。不過，與單獨(dú)使用ARC-127處理的小鼠相比，用Macugen和ARC-127兩者處理的小鼠表現(xiàn)出類似的，但是明顯更嚴(yán)重的缺陷。
在圖10中示出的結(jié)果表明，Macugen對(duì)發(fā)育中的視網(wǎng)膜的血管沒有影響。PDGFR-B拮抗劑ARC-127能影響血管長出和形態(tài)學(xué)。不過，Macugen與ARC-127組合，比它們單獨(dú)對(duì)血管的影響更嚴(yán)重。
實(shí)施例4用抗-PDGF適體和抗-VEGF抗體的組合治療在本實(shí)施例中，用上述角膜新生血管形成模型，用抗-PDGF適體和抗-VEGF抗體證實(shí)了組合治療的效力。為了誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)角膜NV，通過肌內(nèi)施用鹽酸氯胺酮(25mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)對(duì)雄性C57BL/6小鼠(18-20g；Charles River，Wilmington，MA)進(jìn)行麻醉。局部應(yīng)用NaOH(2μl，0.2mM)。通過使用#21刀片(Feather，Osaka，日本)施加平行于角膜緣的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)取出角膜和角膜緣上皮。7天之后，通過腹膜內(nèi)注射25mg/kg具有以下結(jié)構(gòu)40Kd PEG-5′-CAGGCTACGCGTAG-AGCATCATGATCCTG(iT)-3′的抗-PDGF適體(其中，iT表示最后的核苷酸是沿反方向的(3′-3′連接的))和描述于U.S.6,342,221(被收作本文參考)中的100μg的抗-VEGF抗體2C3組合處理所述小鼠。在角膜NV誘導(dǎo)之后14天，小鼠靜脈內(nèi)接受20μg/g的異硫氰酸熒光素偶聯(lián)的伴刀豆凝集素A凝集素(VectorLaboratories，Burlingame，CA)，同時(shí)用鹽酸甲苯噻嗪和鹽酸氯胺酮深度麻醉。30分鐘之后，摘出小鼠眼，并且對(duì)角膜進(jìn)行扁平封固。通過熒光顯微鏡術(shù)觀察角膜NV，并且通過Openlab軟件定量。由血管覆蓋的角膜的百分比是作為總角膜面積的百分比計(jì)算的。結(jié)果表明，組合治療的效力優(yōu)于用抗-PDGF適體或抗-VEGF抗體單獨(dú)治療的結(jié)果。
在單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中，檢驗(yàn)了兩種相關(guān)的抗-PDGF適體與U.S.6,342,221中所描述的100μg的抗-VEGF抗體2C3組合的效果。檢驗(yàn)了PEG化的和未-PEG化的的形式的以下兩種抗-PDGF適體(i)CAGGCUACGN CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT(參見U.S.6,582,918的SEQ ID NO146，所述文獻(xiàn)被以全文形式收作本文參考)，其在6、20和30號(hào)位置上具有2′-氟-2′-脫氧尿苷，在8、21、28和29號(hào)位置上具有2′-氟-2′-脫氧胞苷，在9、15、17和31號(hào)位置上具有2′-O-甲基-2′-脫氧鳥苷，在22號(hào)位置上具有2′-O-甲基-2′-脫氧腺苷，在10和23號(hào)位置的“N”上具有六甘醇亞磷酰胺，并且在32號(hào)位置上具有顛倒方向的T(即，3′-3′-連接的)；和(ii)CAGGCUACGN CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT(參見U.S.5,723,594的SEQ ID NO87，所述文獻(xiàn)被以全文形式收作本文參考)，其在8號(hào)位置的C上具有O-甲基-2-脫氧胞苷，在9、17和31號(hào)位置的Gs上具有2-O-甲基-2-脫氧鳥苷，在22號(hào)位置的A上具有2-O-甲基-2-脫氧腺嘌呤，在30號(hào)位置上具有2-O-甲基-2-脫氧尿苷，在6和20號(hào)位置的U上具有2-氟-2-脫氧尿苷，在21、28和29號(hào)位置的C上具有2-氟-2-脫氧胞苷，在10和23號(hào)位置的N上具有五甘醇(pentaethylene glycol)亞磷酰胺間隔基，并且在32號(hào)位置上具有顛倒方向的T(即，3′-3′-連接的)。提供適當(dāng)?shù)膶?duì)照，以便檢測與單獨(dú)的抗-PDGF適體或抗-VEGF抗體的治療相比，組合治療的改善了的抗新血管作用。以上結(jié)果證實(shí)了組合治療的效力好于單獨(dú)使用抗-PDGF適體或抗-VEGF抗體的治療的效力。
實(shí)施例5抗-PDGF適體和抗-VEGF適體的組合能阻斷脈絡(luò)膜新生血管形成(CNV)在本實(shí)施例中，利用上述脈絡(luò)膜新生血管形成模型證實(shí)了用抗-PDGF適體和抗-VEGF適體在阻斷脈絡(luò)膜新生血管形成方面的組合治療效力。實(shí)驗(yàn)性的CNV通常被用作年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的模型。在該模型中，脈絡(luò)膜的血管生長突破玻璃膜，并且進(jìn)入視網(wǎng)膜，與在AMD患者中觀察到的類似，為了誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)CNV，通過肌內(nèi)施用鹽酸氯胺酮(25mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)對(duì)雄性C57BL/6小鼠(18-20g；Charles River，Wilmington，MA)進(jìn)行麻醉，并且用1％托品酰胺擴(kuò)張瞳孔。使用二極管激光凝固(75-μm斑點(diǎn)大小，0.1-秒持續(xù)時(shí)間，90mW，Oculight SL laser，IRIDEX，MountainView，CA)和作為接觸透鏡的手持式蓋玻片產(chǎn)生四個(gè)灼傷。所述灼傷位于視網(wǎng)膜后極的3、6、9和12點(diǎn)鐘的位置上。在激光時(shí)產(chǎn)生氣泡，表明了玻璃膜的破裂，它是獲得脈絡(luò)膜新生血管形成的重要因素，因此，僅將在所有四個(gè)灼傷都產(chǎn)生了氣泡的小鼠用于本研究。7天之后，通過每天兩次腹膜內(nèi)注射25mg/kg的pegaptanib sodium處理小鼠。在使用抗-PDGF適體的實(shí)驗(yàn)中，將具有以下結(jié)構(gòu)40KdPEG-5′-CAGGCTACGCGTAGAGCATCATGA-TCCTG(iT)-3′(其中iT表示最后的核苷酸是顛倒方向的(3′-3′連接的))的25mg/kg的抗-PDGF適體與pegaptanib sodium共施用。在用PECAM染色的扁平封固的脈絡(luò)膜中測量脈絡(luò)膜NV損傷的面積。通過熒光顯微鏡術(shù)檢查扁平封固，并且通過Openlab軟件定量。結(jié)果表明，用組合治療處理的眼與對(duì)照眼或與單獨(dú)使用pegaptanib sodium或抗-PDGF適體處理的眼相比表現(xiàn)出明顯更小的CNV面積。
在獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，與抗-VEGF治療組合檢驗(yàn)了兩種相關(guān)的抗-PDGF適體的效果，其通過每天兩次腹膜內(nèi)注射25mg/kg的pegaptanibsodium實(shí)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)了PEG化的和未-PEG化的形式的以下兩種抗-PDGF適體
(i)CAGGCUACGN CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT(參見U.S.6,582,918的SEQ ID NO146，所述文獻(xiàn)被以全文形式收作本文參考)，在6、20和30號(hào)位置上具有2′-氟-2′-脫氧尿苷，在8、21、28和29號(hào)位置上具有2′-氟-2′-脫氧胞苷，在9、15、17和31號(hào)位置上具有2′-O-甲基-2′-脫氧鳥苷，在22號(hào)位置上具有2′-O-甲基-2′-脫氧腺苷，在10和23號(hào)位置的“N”上具有六甘醇亞磷酰胺，并且在32號(hào)位置上具有顛倒方向的T(即，3′-3′-連接的)；和(ii)CAGGCUACGN CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT(參見U.S.5,723,594的SEQ ID NO87，所述文獻(xiàn)被以全文形式收作本文參考)，在8號(hào)位置的C上具有O-甲基-2-脫氧胞苷，在9、17和31號(hào)位置的Gs上具有2-O-甲基-2-脫氧鳥苷，在22號(hào)位置的A上具有2-O-甲基-2-脫氧腺嘌呤，在30號(hào)位置上具有2-O-甲基-2-脫氧尿苷，在6和20號(hào)位置的U上具有2-氟-2-脫氧尿苷，在21、28和29號(hào)位置的C上具有2-氟-2-脫氧胞苷，在10和23號(hào)位置的N上具有五甘醇亞磷酰胺間隔基，且在32號(hào)位置上具有顛倒方向的T(即，3′-3′-連接的)。提供了合適的對(duì)照，以便檢測與單獨(dú)的抗-PDGF適體或抗-VEGF適體治療相比，組合治療具有改善了的抗-新血管作用。結(jié)果表明，組合治療在阻斷脈絡(luò)膜新生血管形成方面的效力，好于用抗-PDGF適體或抗-VEGF適體單獨(dú)治療的效力。
實(shí)施例6角膜新生血管形成(角膜NV)-退化將實(shí)施例1的角膜NV模型用于研究抗-VEGF適體和抗-PDGF適體的組合。10天之后，通過每天兩次腹膜內(nèi)注射25mg/kg的pegaptanib sodium(MacugenTM，Eyetech Pharmaceuticals，NewYork，NY)，抗-VEGF適體試劑)和/或每天一次施用50mg/kg的ARC-127(Archemix Corp.，Cambridge，MA，抗-PDGF適體，具有以下結(jié)構(gòu)40Kd PEG-5′-CAGGCTACGCGTAGAGCATCATGA-TCCTG(iT)-3′(其中iT表示最后的核苷酸是顛倒方向的(3′-3′連接的))處理小鼠10天時(shí)間。在角膜NV誘導(dǎo)之后第20天，摘出眼，并且對(duì)角膜進(jìn)行扁平封固。使用CD31染色(BD BiosciencesPharmingen，San Diego，CA)顯現(xiàn)角膜NV，并且用Metamorph軟件進(jìn)行定量。由血管覆蓋的角膜的百分比是以角膜總面積的百分比形式計(jì)算的。
在圖11和12中示出了pegaptanib sodium和/或ARC-127對(duì)于在應(yīng)用NaOH之后使角膜新生血管形成退化和對(duì)角膜緣和角膜的上皮損傷方面的作用。與第20天的對(duì)照相比，用ARC-127處理的動(dòng)物沒有表現(xiàn)出血管生長的明顯減弱。與第10天的對(duì)照相比，第20天的對(duì)照表現(xiàn)出角膜新生血管形成增加了12.92％。與第20天的對(duì)照相比，單獨(dú)使用pegaptanib sodium(Macugen)處理過的動(dòng)物表現(xiàn)出血管生長減弱了13.81％(p≤.016)。與對(duì)照相比，用pegaptanib sodium和ARC-127處理的動(dòng)物表現(xiàn)出角膜新血管生長的明顯減弱(26.85％，p≤.002)。
實(shí)施例7角膜新生血管形成(角膜NV)-退化將實(shí)施例1的角膜NV模型用于研究抗-VEGF適體和抗所述PDGFB受體的抗體的組合。在14天后，通過每天兩次腹膜內(nèi)注射25mg/kg的pegaptanib sodium(Macugen，抗-VEGF適體試劑)和/或每天兩次通過管飼口服施用50mg/kg的APB5(抗所述PDGFB受體的多克隆抗體)處理小鼠14天。在角膜NV誘導(dǎo)之后第28天，小鼠通過靜脈內(nèi)途徑接受20μg/g的異硫氰酸熒光素偶聯(lián)的伴刀豆凝集素A凝集素(Vector Laboratories，Burlingame，CA)，同時(shí)用鹽酸甲苯噻嗪和鹽酸氯胺酮進(jìn)行深度麻醉。30分鐘之后，摘出小鼠眼，并且對(duì)角膜進(jìn)行扁平封固。通過熒光顯微鏡術(shù)顯現(xiàn)角膜NV，并且通過Openlab軟件定量。由血管覆蓋的角膜的百分比是以角膜總面積的百分比形式計(jì)算的。
在圖13中示出了pegaptanib sodium和/或APB5對(duì)在應(yīng)用NaOH之后使角膜新生血管形成退化，以及對(duì)角膜緣和角膜上皮損傷的影響。與對(duì)照相比，用pegaptanib sodium(Macugen)處理過的動(dòng)物表現(xiàn)出血管生長減弱了8.3％。與對(duì)照相比，用pegaptanib sodium和APB5處理的動(dòng)物在角膜上表現(xiàn)出顯著更少的新血管生長(21.4％)。
實(shí)施例8角膜新生血管形成(角膜NV)-退化(添加治療劑的順序)將實(shí)施例1的角膜NV模型用于研究使用抗-VEGF適體和抗所述PDGFB受體的抗體進(jìn)行組合治療的添加順序的影響。14天之后，通過每天兩次腹膜內(nèi)注射25mg/kg的pegaptanib sodium(Macugen，抗-VEGF適體試劑)和/或通過每天兩次管飼口服施用50mg/kg的APB5(eBioscience，San Diego，CA)，即抗所述PDGFB受體的多克隆抗體，在不同的時(shí)間點(diǎn)處理小鼠7天時(shí)間。在角膜NV誘導(dǎo)之后第28天，小鼠通過靜脈內(nèi)途徑接受20μg/g的異硫氰酸熒光素偶聯(lián)的伴刀豆凝集素A凝集素(Vector Laboratories，Burlingame，CA)，同時(shí)用鹽酸甲苯噻嗪和鹽酸氯胺酮深度麻醉。30分鐘之后，摘出小鼠眼，并且對(duì)角膜進(jìn)行扁平封固。通過熒光顯微鏡術(shù)顯現(xiàn)角膜NV，并且通過Openlab軟件定量。由血管覆蓋的角膜的百分比是以角膜總面積的百分比形式計(jì)算的，并且結(jié)果如圖14所示。
與對(duì)照相比，在應(yīng)用NaOH之后對(duì)角膜新生血管形成的退化和對(duì)角膜緣和角膜上皮的損傷方面，在第21-28天單獨(dú)使用pegaptanibsodium或在第14-21天單獨(dú)使用APB5隨后不進(jìn)行處理的作用具有很小的影響。與對(duì)照相比，從第14-21天用APB5處理，以及從21-28天用pegaptanib sodium處理的動(dòng)物在角膜上表現(xiàn)出更少的新血管生長(13.4％)。
等同方案在不超出本發(fā)明的范圍和精神的前提下，對(duì)本發(fā)明上述方法和體系所進(jìn)行的各種修飾和改變對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。盡管業(yè)已結(jié)合特定的理想實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了說明，但應(yīng)當(dāng)理解的是，所請(qǐng)求保護(hù)的發(fā)明不應(yīng)當(dāng)過分局限于所述具體實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解或者能夠在只進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)的情況下確定，本文所描述的本發(fā)明的具體實(shí)施方案的許多等同方案。所述等同方案意在包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于在有需要的患者抑制新血管疾病的方法，該方法包括給所述患者施用(i)PDGF拮抗劑；和(ii)VEGF拮抗劑，其中，所述PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑是同時(shí)或相互間隔90天內(nèi)施用的，使用量足以抑制所述患者的新血管疾病。
2.一種用于治療被診斷患有或有危險(xiǎn)發(fā)展為新血管疾病的患者的方法，該方法包括給所述患者施用(i)PDGF拮抗劑；和(ii)VEGF拮抗劑，其中，所述PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑是同時(shí)或相互間隔90天內(nèi)施用的，以足以治療患者的用量施用。
3.如權(quán)利要求1或2的方法，其中，所述PDGF拮抗劑和所述VEGF拮抗劑是相互間隔10天內(nèi)施用的。
4.如權(quán)利要求3的方法，其中，所述PDGF拮抗劑和所述VEGF拮抗劑是相互間隔5天內(nèi)施用的。
5.如權(quán)利要求4的方法，其中，所述PDGF拮抗劑和所述VEGF拮抗劑是相互間隔24小時(shí)內(nèi)施用的。
6.如權(quán)利要求5的方法，其中，所述PDGF拮抗劑和所述VEGF拮抗劑是同時(shí)施用的。
7.如權(quán)利要求1或2的方法，其中，所述PDGF拮抗劑是PDGF-B拮抗劑。
8.如權(quán)利要求1或2的方法，其中，所述VEGF拮抗劑是VEGF-A拮抗劑。
9.如權(quán)利要求1或2的方法，其中，所述PDGF拮抗劑是核酸分子、適體、反義RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、環(huán)肽、抗體、抗體結(jié)合片段或小有機(jī)化合物。
10.如權(quán)利要求1或2的方法，其中，所述VEGF拮抗劑是核酸分子、適體、反義RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、環(huán)肽、抗體或抗體片段、糖、聚合物或小有機(jī)化合物。
11.如權(quán)利要求10的方法，其中，所述VEGF拮抗劑是適體。
12.如權(quán)利要求11的方法，其中，所述適體是EYE001。
13.如權(quán)利要求10的方法，其中，所述VEGF拮抗劑是抗體或其結(jié)合片段。
14.如權(quán)利要求1或2的方法，其中，所述PDGF拮抗劑是核酸分子、適體、反義RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、環(huán)肽、抗體或抗體片段、糖、聚合物或小有機(jī)化合物。
15.如權(quán)利要求14的方法，其中，所述PDGF拮抗劑是抗體或其結(jié)合片段。
16.如權(quán)利要求14的方法，其中，所述PDGF拮抗劑是反義寡核苷酸。
17.如權(quán)利要求1或2的方法，其中，所述新血管疾病是眼新血管疾病。
18.如權(quán)利要求17的方法，其中，所述眼新血管疾病是缺血性視網(wǎng)膜病、虹膜新生血管形成、眼內(nèi)新生血管形成、年齡相關(guān)性黃斑變性、角膜新生血管形成、視網(wǎng)膜新生血管形成、脈絡(luò)膜新生血管形成、糖尿病性視網(wǎng)膜缺血和增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病。
19.如權(quán)利要求1或2的方法，其中，所述新血管疾病是銀屑病或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
20.一種藥用組合物，其包括(i)PDGF拮抗劑；(ii)VEGF拮抗劑；和(iii)可以藥用的載體，其中，所述PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑的用量足以抑制患者的新血管疾病。
21.如權(quán)利要求20的組合物，其中，所述PDGF拮抗劑是PDGF-B拮抗劑。
22.如權(quán)利要求20的組合物，其中，所述VEGF拮抗劑是VEGF-A拮抗劑。
23.如權(quán)利要求20的組合物，其中，所述PDGF拮抗劑是核酸分子、適體、反義RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、環(huán)肽、抗體或抗體片段、糖、聚合物或小有機(jī)化合物。
24.如權(quán)利要求20的組合物，其中，所述VEGF拮抗劑是核酸分子、適體、反義RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、環(huán)肽、抗體或抗體、抗體結(jié)合片段或小有機(jī)化合物。
25.如權(quán)利要求23的組合物，其中，所述PDGF拮抗劑是抗體或其結(jié)合片段。
26.如權(quán)利要求23的組合物，其中，所述PDGF拮抗劑是反義寡核苷酸。
27.如權(quán)利要求24的組合物，其中，所述VEGF拮抗劑是適體。
28.如權(quán)利要求27的組合物，其中，所述適體是EYE001。
29.如權(quán)利要求24的組合物，其中，所述VEGF拮抗劑是抗體或其結(jié)合片段。
30.一種藥物包，其包括(i)PDGF拮抗劑；和(ii)VEGF拮抗劑。
31.如權(quán)利要求30的藥物包，其中，所述PDGF拮抗劑是PDGF-B拮抗劑。
32.如權(quán)利要求30的藥物包，其中，所述VEGF拮抗劑是VEGF-A拮抗劑。
33.如權(quán)利要求30的藥物包，其中，所述PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑是獨(dú)立地并且以單獨(dú)劑量制備的。
34.如權(quán)利要求31的藥物包，其中，所述PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑是一起制備的。
35.如權(quán)利要求30的藥物包，其中，所述VEGF拮抗劑是適體。
36.如權(quán)利要求35的藥物包，其中，所述適體是EYE001。
37.如權(quán)利要求30的藥物包，其中，所述VEGF拮抗劑是抗體或其結(jié)合片段。
38.如權(quán)利要求30的藥物包，其中，所述VEGF拮抗劑是反義寡核苷酸。
39.如權(quán)利要求30的藥物包，其中，所述PDGF拮抗劑是抗體或其結(jié)合片段。
40.如權(quán)利要求30的藥物包，其中，所述PDGF拮抗劑是反義寡核苷酸。
41.如權(quán)利要求20的藥用組合物，其中，所述可以藥用的載體包括小球體或水凝膠。
42.如權(quán)利要求30的藥物包，還包括選自小球體和水凝膠的送遞媒介物。
43.如權(quán)利要求1、2或18中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述PDGF拮抗劑是前藥。
44.如權(quán)利要求1、2或18中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述VEGF拮抗劑是前藥。
45.如權(quán)利要求20的藥用組合物，其中，所述PDGF拮抗劑是前藥。
46.如權(quán)利要求20的藥用組合物，其中，所述VEGF拮抗劑是前藥。
47.如權(quán)利要求30的藥物包，其中，所述PDGF拮抗劑是前藥。
48.如權(quán)利要求30的藥物包，其中，所述VEGF拮抗劑是前藥。
全文摘要
本發(fā)明特征在于用于治療被診斷患有或有危險(xiǎn)發(fā)展為新血管疾病的患者的方法，其通過給所述患者施用PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明特征也在于用于治療或預(yù)防新血管疾病的含有PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑的藥用組合物。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1934255SQ200480031700
公開日2007年3月21日 申請(qǐng)日期2004年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月27日
發(fā)明者D·施馬, P·卡利亞斯, A·P·亞當(dāng)米斯 申請(qǐng)人:(Osi)眼睛科技公司