專利名稱：作為磷酸酶抑制劑的釩化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新穎的化合物和它們抑制磷酸酶、特別是肌醇磷酸酶的用途。這些化合物因而可用于治療神經(jīng)變性疾病以及其他其中抑制細(xì)胞程序死亡將是有益的病癥。
釩酸鹽、過(guò)氧釩(pV)和雙過(guò)氧釩(bpV)衍生物是熟知的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP酶)的抑制劑，其中bpV比其他兩種分子種類更加有力[Posner，1994#157][Cuncic，1999#221]。釩酸鹽是一種磷酸鹽類似物，是PTP-1B的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，而過(guò)釩酸鹽不可逆地氧化PTP-1B的催化性半胱氨酸[Huyer，1997#220]。最近已經(jīng)合成了過(guò)氧釩化合物，它們顯示比過(guò)釩酸鹽更高的穩(wěn)定性[Posner，1994#157]。除了其他生物功能以外，它們還都表現(xiàn)胰島素模擬特性[Rumora，2001#153]，例如增加脂肪細(xì)胞中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)[Shisheva，1993#260]，增強(qiáng)胰島素受體-介導(dǎo)的胰島素受體底物(IRS)-1的酪氨酸磷酸化[Wilden，1995#259]，和通過(guò)抑制與胰島素受體激酶(IRK)有關(guān)的PTP酶來(lái)誘導(dǎo)IRK磷酸化[Band，1997#155]。
胰島素模擬下游效應(yīng)被認(rèn)為主要發(fā)源于參與胰島素受體去磷酸化的PTP酶的抑制，導(dǎo)致胰島素信號(hào)延長(zhǎng)[Shechter，1990#258]。全部PTP酶都共同具有相同的活性位點(diǎn)，即所謂的CX5R基序。在有些磷酸肌醇磷酸酶中也發(fā)現(xiàn)這種序列同源性，例如SAC磷酸酶、Myotubularin(MTM)和PTEN(在染色體10上缺失的磷酸酶與張力蛋白同系物)(關(guān)于評(píng)論，參見(jiàn)No 98)。后者起初被認(rèn)為是一種PTP酶，但是隨后顯示針對(duì)3-磷酸化磷酸肌醇(PI)如PI(3)P、PI(3，4，5)P3和I(3，4，5)P4具備更高的親和性[Maehama，1998#175]。
PTEN是一種腫瘤抑制劑，它在很多癌細(xì)胞中或突變或缺失[Li，1997#255][Steck，1997#256][Waite，2002#262](No 289)。3-磷酸化脂質(zhì)主要是由磷酸肌醇3激酶(PI3K)響應(yīng)于細(xì)胞外刺激而生成。通過(guò)使細(xì)胞內(nèi)PI(3，4，5)P3去磷酸化，PTEN抵消PI3K，因此抑制蛋白激酶B(PKB)活性(No 232，No 236，No 265)，它是PI3K的主要下游靶之一。PKB也稱Akt[Downward，1998#254]，是病毒致癌蛋白v-akt的哺乳動(dòng)物同源物(No284)。由于PI(3，4，5)P3是參與細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)發(fā)送的重要第二信使[Stephens，1993#257]，可以說(shuō)PTEN終止細(xì)胞中的重要信號(hào)發(fā)送途徑，引起細(xì)胞程序死亡(No 202)。
另外，PTEN已經(jīng)顯示借助PI3K/PKB途徑的負(fù)調(diào)節(jié)來(lái)阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展(No 235)，并且參與血管生成的調(diào)節(jié)(No 191)。惡性黑素瘤中PTEN的喪失引起PKB的活化(No 275)。Stocker等[Stocker，2002#186]最近已經(jīng)指出在缺乏PTEN的果蠅突變體中，PI(3，4，5)P3的水平增加直接影響PKB。PI(3，4，5)P3與PKB的N-末端血小板-白細(xì)胞C激酶底物同源(PH)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，隨后引起構(gòu)型改變(No 287)和其向膜的募集。在易位后，PKB在兩個(gè)主要位點(diǎn)被磷酸化(Thr308和Ser473)，這是其活性的關(guān)鍵(No 285)。蘇氨酸被磷酸肌醇依賴性激酶-1(PDK-1)所磷酸化(No 286)，后者繼而被與它們PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合的PI(3，4，5)P3所活化(關(guān)于評(píng)論，參見(jiàn)[Downward，1998#254][Hill，2002#237])。磷酸化絲氨酸殘基的激酶仍然未知。
我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，某些釩類化合物代表一類新型PTEN抑制劑，即bpV化合物。根據(jù)PTP酶的體外和體內(nèi)證明，這些抑制劑顯示顯著更低的對(duì)于PTEN的IC50值。因而，使用這些分子可以區(qū)分不同的磷酸酶。
因而在第一方面，本發(fā)明提供下式含釩化合物或者其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于抑制磷酸酶的藥物中的用途 其中L-L’是
或 L’是COO、CONR5、CONHR6、CH2NR5R6；或者其中L和L’一起構(gòu)成下列基團(tuán) 或基團(tuán) 其中L”是O、S或NH；R1、R2、R3、R4、R5和R6獨(dú)立地是H；羥基；C1-6烷基，可選地被羥基或NR7R8取代；C3-6環(huán)烷基，可選地被羥基或NR7R8取代；苯基，可選地被C1-3烷基、羥基、NR7R8或SO3取代；(OCH2CH2)n(NHCH2CH2)n；氨基酸或者由2至5個(gè)氨基酸組成的肽；且R7和R8獨(dú)立地是H或C1-6烷基。
在第二方面，本發(fā)明提供了下式含釩化合物或者其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于抑制磷酸酶的藥物中的用途 其中L-L’是
或 L’是COO、CONR5、CONHR6、CH2NR5R6；或者其中L和L’一起構(gòu)成下列基團(tuán) 或基團(tuán) 其中L”是O、S或NH；R1、R2、R3、R4、R5和R6獨(dú)立地是H；羥基；C1-6烷基，可選地被羥基或NR7R8取代；C3-6環(huán)烷基，可選地被羥基或NR7R8取代；苯基，可選地被C1-3烷基、羥基、NR7R8或SO3取代；(OCH2CH2)n(NHCH2CH2)n；氨基酸或者由2至5個(gè)氨基酸組成的肽；且R7和R8獨(dú)立地是H或C1-6烷基。
優(yōu)選用在本發(fā)明中的化合物包括雙過(guò)氧(聯(lián)吡啶)氧代釩酸鉀(bpV(bipy))、雙過(guò)氧(1，10-菲咯啉)氧代釩酸鉀(pV(菲咯啉))、雙過(guò)氧(吡啶甲酸)氧代釩酸鉀(pV(pic))和雙過(guò)氧(苯基雙胍)氧代釩酸鉀(pV(biguan))。
特別是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)兩種化合物pV(phenbig)(雙過(guò)氧(苯基雙胍)氧代釩酸二鉀)或bpV(HOpic)(雙過(guò)氧(5-羥基吡啶-2-羧基)氧代釩酸二鉀)特異性地抑制PTEN，而非SopB、MTM或PTP。因此，這些化合物將特別可用于治療糖尿病。
從R1R2N-C(＝NH)-NH-C(＝E)-NR3R4(E＝NH、S、O)配體衍生的過(guò)氧釩酸鹽是新穎的化合物，代表本發(fā)明的獨(dú)立方面。與之相似，從2-吡啶甲酰胺配體(無(wú)論它們是N，N還是N，O配位化合)衍生的過(guò)氧釩酸鹽也是新穎的，代表本發(fā)明的獨(dú)立方面。
如本文所討論，本文所述化合物可用作磷酸酶、特別是PTEN的抑制劑。因此，它們可用于治療神經(jīng)變性疾病，例如阿爾茨海默氏病，以及受益于細(xì)胞程序死亡抑制的疾病或病癥，例如傷口愈合、灼傷、心臟肥大、缺氧、缺血、糖尿病和運(yùn)動(dòng)損傷。另外，癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞程序死亡更具抵抗力，因而本發(fā)明化合物將可用于與常規(guī)化療劑聯(lián)合保護(hù)更有可能經(jīng)歷細(xì)胞程序死亡的正常細(xì)胞。
本文所述藥物可以呈現(xiàn)單元?jiǎng)┬停縿┖蓄A(yù)定量的每一活性成分。這樣一種單元可適于提供5-100mg/天的化合物，優(yōu)選5-15mg/天、10-30mg/天、25-50mg/天、40-80mg/天或60-100mg/天。就式I化合物而言，提供在100-1000mg/天范圍內(nèi)的劑量，優(yōu)選100-400mg/天、300-600mg/天或500-1000mg/天。這類劑量可以在單一劑量中或者作為大量離散的劑量提供。最終劑量當(dāng)然將依賴于所治療的病癥、給藥的途徑和患者的年齡、體重與條件，將由醫(yī)生酌量。
本文所述化合物最優(yōu)選地是以適當(dāng)組合物的形式給藥。作為適當(dāng)?shù)慕M合物，可以提及所有常用于全身或局部給藥的組合物。藥學(xué)上可接受的載體應(yīng)當(dāng)基本上是惰性的，以便不與活性組分發(fā)生作用。適合的惰性載體包括水、醇、聚乙二醇、礦物油或石油凝膠、丙二醇等。所述藥物制備物可以被配制成以任意適宜方式給藥，用在人類或獸醫(yī)學(xué)中。
如下文所詳述，本發(fā)明的藥物組合物可以被具體配制成以固體或液體形式給藥，包括采取下列方式的那些(1)口服給藥，例如頓服劑(水性或非水性溶液或懸液)、片劑、大丸劑、粉劑、顆粒劑、應(yīng)用于舌的糊劑；(2)腸胃外給藥，例如皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射，例如無(wú)菌溶液或懸液；(3)局部用藥，例如應(yīng)用于皮膚的霜?jiǎng)?、軟膏劑或噴霧劑；或者(4)陰道內(nèi)或直腸內(nèi)，例如陰道栓、霜?jiǎng)┗蚺菽瓌２贿^(guò)，在某些實(shí)施方式中，可以簡(jiǎn)單地將主體成分溶解或懸浮在無(wú)菌水中。在某些實(shí)施方式中，藥物制備物是非致熱的，也就是不升高患者的體溫。本文所用的措辭“有效量”意味著一種或多種活性劑、材料或者包含一種或多種包含本發(fā)明活性劑的組合物就在動(dòng)物中產(chǎn)生一定所需效果而言有效的量。公認(rèn)的是當(dāng)一種活性劑被用于達(dá)到治療效果時(shí)，構(gòu)成“有效量”的實(shí)際劑量將因大量條件而異，包括所治療的特定病癥、疾病的嚴(yán)重性、患者的大小與健康、給藥的途徑等。醫(yī)藥技術(shù)人員利用醫(yī)藥領(lǐng)域熟知的方法能夠容易地確定適當(dāng)?shù)膭┝俊４朕o“藥學(xué)上可接受的”在本文中用于表示這樣的化合物、材料、組合物和/或劑型，它們?cè)诤侠淼尼t(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)適合用于與人類和動(dòng)物組織接觸，沒(méi)有過(guò)度的毒性、刺激作用、變態(tài)反應(yīng)或者其他問(wèn)題或并發(fā)癥，與合理的利益/風(fēng)險(xiǎn)比相匹配。
本文所用的措辭“藥學(xué)上可接受的載體”表示藥學(xué)上可接受的材料、組分或媒介物，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包封材料，參與運(yùn)載或運(yùn)輸主體活性劑從機(jī)體的一個(gè)器官或部分到機(jī)體的另一器官或部分。每一載體在與制劑其他成分相容的意義上必須是“可接受的”。一些能夠充當(dāng)藥學(xué)上可接受載體的材料實(shí)例包括(1)糖類，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；(4)粉狀黃蓍膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石；(8)賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟；(9)油類，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯類，例如油酸乙基酯和月桂酸乙基酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)藻酸；(16)無(wú)熱原水；(17)等滲鹽水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩沖溶液；和(21)其他用在藥物制劑中的無(wú)毒相容性物質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，一種或多種活性劑可以含有堿性官能團(tuán)，例如氨基或烷基氨基，因而能夠與藥學(xué)上可接受的酸生成藥學(xué)上可接受的鹽。
術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”在這方面表示相對(duì)無(wú)毒的、本發(fā)明化合物的無(wú)機(jī)與有機(jī)酸加成鹽。這些鹽可以在最終的本發(fā)明化合物分離與純化期間就地制備，或者單獨(dú)使經(jīng)過(guò)純化的本發(fā)明化合物的游離堿形式與適合的有機(jī)或無(wú)機(jī)酸反應(yīng)，再分離所生成的鹽。代表性鹽包括氫溴酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、乙酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來(lái)酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、萘甲酸鹽、甲磺酸鹽、葡庚糖酸鹽、乳糖酸鹽和月桂基磺酸鹽等(Berge，Bighley et al.，1977)?；钚詣┑乃帉W(xué)上可接受的鹽包括這些化合物的常規(guī)無(wú)毒性鹽或季銨鹽，例如從無(wú)毒的有機(jī)或無(wú)機(jī)酸生成。例如，這類常規(guī)無(wú)毒性鹽包括從無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸衍生的鹽，無(wú)機(jī)酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等，有機(jī)酸例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、棕櫚酸、馬來(lái)酸、羥基馬來(lái)酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水楊酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富馬酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸、羥乙磺酸等。在其他情況下，一種或多種活性劑可以含有一個(gè)或多個(gè)酸性官能團(tuán)，因而能夠與藥學(xué)上可接受的堿生成藥學(xué)上可接受的鹽。這些鹽同樣可以在最終的化合物分離與純化期間就地制備，或者單獨(dú)使經(jīng)過(guò)純化的化合物的游離酸形式與適合的堿反應(yīng)，例如藥學(xué)上可接受的金屬陽(yáng)離子的氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽；氨；或者藥學(xué)上可接受的有機(jī)伯胺、仲胺或叔胺。
代表性堿金屬或堿土金屬鹽包括鋰、鈉、鉀、鈣、鎂和鋁鹽等?？捎糜谏蓧A加成鹽的代表性有機(jī)胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等(例如參見(jiàn)Berge等，見(jiàn)上)。在組合物中也可以存在濕潤(rùn)劑、乳化劑和潤(rùn)滑劑，例如月桂基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、矯味與香味劑、防腐劑和抗氧化劑。藥學(xué)上可接受的抗氧化劑的實(shí)例包括(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，例如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基化羥基茴香醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒(méi)食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。本發(fā)明的制劑包括適合于口服、經(jīng)鼻、局部(包括口腔和舌下)、直腸、陰道和/或腸胃外給藥的那些。制劑可以適宜地呈現(xiàn)單元?jiǎng)┬停⑶铱梢越柚帉W(xué)領(lǐng)域熟知的任意方法加以制備?；钚猿煞挚梢耘c載體材料聯(lián)合形成單一劑型的量將因所治療的宿主、特定的給藥方式而異?；钚猿煞挚梢耘c載體材料聯(lián)合形成單一劑型的量一般將是該化合物產(chǎn)生治療效果的量。一般而言，以百分之一百計(jì)，這種量將是約1％至約99％的活性成分，優(yōu)選約5％至約70％，最優(yōu)選約10％至約30％。制備這些制劑或組合物的方法包括使活性劑與載體和可選的一種或多種輔助成分締合。一般而言，制劑如下制備將本發(fā)明活性劑與液體載體或微細(xì)粉碎的固體載體或者二者均勻和緊密地締合，然后如果必要的話使產(chǎn)物成形。
適合于口服給藥的本發(fā)明制劑可以是膠囊劑、扁囊劑、丸劑、片劑、錠劑(lozenge)(使用矯味基質(zhì)，通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠)、粉劑、顆粒劑，或者在水性或非水性液體中的溶液或懸液，或者水包油型或油包水型乳劑，或者酏劑或糖漿劑，或者錠劑(pastille)(使用惰性基質(zhì)，例如明膠和甘油，或者蔗糖和阿拉伯膠)和/或漱口劑等，各自含有預(yù)定量的本發(fā)明化合物作為活性成分。本發(fā)明化合物也可以作為大丸劑、藥糖劑或糊劑給藥。在口服給藥的本發(fā)明固體劑型中(膠囊劑、片劑、丸劑、糖錠劑、粉劑、顆粒劑等)，活性成分與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體混合，例如檸檬酸鈉或磷酸二鈣，和/或任意下列成分(1)填充劑或補(bǔ)充劑，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；(2)粘合劑，例如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯膠；(3)保濕劑，例如甘油；(4)崩解劑，例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉；(5)溶解延遲劑，例如石蠟；(6)吸收加速劑，例如季銨化合物；(7)濕潤(rùn)劑，例如鯨蠟醇和甘油單硬脂酸酯；(8)吸收劑，例如高嶺土和膨潤(rùn)土；(9)潤(rùn)滑劑，例如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉和/或其混合物；和(10)著色劑。在膠囊劑、片劑和丸劑的情況下，藥物組合物還可以包含緩沖劑。也可以采用相似類型的固體組合物作為軟與硬填充明膠膠囊劑中的填充劑，使用賦形劑例如乳糖，以及高分子聚乙二醇等。片劑可以借助壓制或模制法制備，可選地還有一種或多種輔助成分。壓制片可以使用粘合劑(例如明膠或羥丙基甲基纖維素)、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如淀粉羥乙酸鈉或交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)、表面活性或分散劑加以制備。模制片可以在適合的機(jī)械中模制用惰性液體稀釋劑濕潤(rùn)的粉狀活性成分混合物來(lái)制備。
片劑和本發(fā)明藥物組合物的其他固體劑型、例如糖錠劑、膠囊劑、丸劑和顆粒劑，可以可選地被刻劃或者帶有包衣和外殼，例如腸溶衣和藥物制劑領(lǐng)域熟知的其他包衣。經(jīng)過(guò)配制，它們也可以提供其中活性成分的緩慢或控制釋放，例如使用不同比例的羥丙基甲基纖維素，以提供所需的釋放行為，以及其他聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和/或微球。它們可以如下滅菌例如通過(guò)細(xì)菌截留性濾器過(guò)濾，或者以無(wú)菌固體組合物的形式摻入滅菌劑，可以在使用前不久將它們?nèi)苡跓o(wú)菌的水或者一些其他無(wú)菌的可注射介質(zhì)。這些組合物還可以可選地含有乳濁劑，可以是任選以延遲方式僅僅或者優(yōu)先在胃腸道的某一部分釋放活性成分的組合物。可以使用的包埋組分實(shí)例包括聚合物質(zhì)和蠟類?；钚猿煞忠部梢允俏⒛野獾男问?，如果適當(dāng)?shù)脑捄幸环N或多種上述賦形劑。本發(fā)明化合物的口服給藥液體劑型包括藥學(xué)上可接受的乳劑、微乳劑、溶液、懸液、糖漿劑和酏劑。除了活性成分以外，液體劑型可以含有本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑，例如水或其他溶劑，增溶劑和乳化劑，例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐基酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油類(特別是棉籽油、花生油、玉米油、麥胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和脫水山梨醇的脂肪酸酯及其混合物。除了惰性稀釋劑以外，口服組合物還可以包括助劑，例如濕潤(rùn)劑、乳化與懸浮劑、甜味劑、矯味劑、著色劑、香料和防腐劑。除了活性化合物以外，懸液可以含有懸浮劑，例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇與脫水山梨醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁(aluminum metahydroxide)、膨潤(rùn)土、瓊脂和黃蓍膠及其混合物。
直腸或陰道給藥的本發(fā)明藥物組合物制劑可以呈栓劑，它可以通過(guò)將一種或多種本發(fā)明化合物與一種或多種適合的無(wú)刺激性賦形劑或載體混合來(lái)制備，所述賦形劑或載體例如包含可可脂、聚乙二醇、栓劑用蠟或水楊酸鹽，它們?cè)谑覝叵率枪腆w，但是在體溫下是液體，因此將在直腸或陰道腔中融化，釋放出活性劑。適合于陰道給藥的本發(fā)明制劑也包括陰道栓、棉塞、霜?jiǎng)⒛z、糊劑、泡沫或噴霧制劑，含有本領(lǐng)域已知適用的載體。本發(fā)明化合物的局部或透皮給藥劑型包括粉劑、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、霜?jiǎng)?、洗劑、凝膠、溶液、貼劑和吸入劑。可以將活性化合物在無(wú)菌條件下與藥學(xué)上可接受的載體和可能需要的任意防腐劑、緩沖劑或推進(jìn)劑混合。
除了本發(fā)明的活性化合物以外，軟膏劑、糊劑、霜?jiǎng)┖湍z可以含有賦形劑，例如動(dòng)物與植物脂肪、油類、蠟類、石蠟、淀粉、黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨潤(rùn)土、硅酸、滑石和氧化鋅或其混合物。除了本發(fā)明化合物以外，粉劑和噴霧劑可以含有賦形劑，例如乳糖、滑石、硅酸、氫氧化鋁、硅酸鈣和聚酰胺粉末，或者這些物質(zhì)的混合物。噴霧劑可以另外含有慣用的推進(jìn)劑，例如含氯氟烴和揮發(fā)性未取代的烴，例如丁烷和丙烷。透皮貼劑具有向機(jī)體提供本發(fā)明化合物的控制遞送的附加優(yōu)點(diǎn)。這類劑型可以通過(guò)將藥物溶解或分散在恰當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中來(lái)制備。也可以使用吸收增強(qiáng)劑，以增加活性劑跨越皮膚的通量。通過(guò)提供速率控制膜或者將活性劑分散在聚合物基質(zhì)或凝膠中，可以控制這類通量的速率。
眼科制劑、眼用軟膏劑、粉劑和溶液等也涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。適合于腸胃外給藥的本發(fā)明藥物組合物包含一種或多種本發(fā)明化合物與一種或多種藥學(xué)上可接受的無(wú)菌等滲水性或非水性溶液、分散體、懸液或乳液或者無(wú)菌粉末的組合，所述粉末可以在即將使用前復(fù)原為無(wú)菌可注射的溶液或分散體，它們可以含有抗氧化劑、緩沖劑、制菌劑、賦予制劑與預(yù)期接受者血液等滲的溶質(zhì)或者懸浮或增稠劑。可以用在本發(fā)明藥物組合物中的適合的水性與非水性載體實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其適合的混合物、植物油(例如橄欖油)和可注射的有機(jī)酯(例如油酸乙酯)。利用包衣材料如卵磷脂、在分散體的情況下維持所需的粒徑以及利用表面活性劑，可以維持恰當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。
這些組合物也可以含有助劑，例如防腐劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑和分散劑。通過(guò)包含各種抗細(xì)菌和抗真菌劑，例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，可以確保防止微生物的作用。也可能需要在組合物中包括等滲劑，例如糖類、氯化鈉等。另外，通過(guò)包含延遲吸收的成分，例如單硬脂酸鋁和明膠，可以帶來(lái)可注射藥物形式的延長(zhǎng)吸收。在有些情況下，為了延長(zhǎng)活性劑的效果，需要延緩活性劑從皮下或肌內(nèi)注射劑中的吸收。這可以利用水溶性差的結(jié)晶性或無(wú)定形材料的液體懸液實(shí)現(xiàn)?；钚詣┑奈账俾室虼艘蕾囉谒娜芙馑俾?，后者繼而可以依賴于晶體大小和結(jié)晶形式。作為替代選擇，通過(guò)將活性劑溶解或懸浮在油性媒介中，實(shí)現(xiàn)腸胃外給藥活性劑形式的延遲吸收?？勺⑸涞膬?chǔ)庫(kù)形式通過(guò)在生物降解性聚合物如聚交酯-聚乙交酯中生成主體化合物的微囊包封基質(zhì)來(lái)制備。根據(jù)活性劑與聚合物的比例和所采用特定聚合物的屬性，可以控制活性劑釋放的速率。其他生物降解性聚合物的實(shí)例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。儲(chǔ)庫(kù)型可注射制劑也可以通過(guò)將活性劑包合在與機(jī)體組織相容的脂質(zhì)體或微乳中來(lái)制備。
在本發(fā)明化合物作為藥物對(duì)人和動(dòng)物給藥時(shí)，它們可以以原樣或者作為藥物組合物給藥，所述組合物例如含有0.1至99.5％(更優(yōu)選0.5至90％)活性成分與藥學(xué)上可接受的載體的組合。除了上述組合物以外，可以利用其中含有適量治療劑的覆蓋物，例如硬膏、繃帶、敷料、紗布?jí)|等。正如上文所詳述，治療組合物可以在支架(stent)、裝置、假體和植入物上給藥/遞送。
本文所述化合物可以按照下列一般工藝合成通式[M]n[V(＝O)(O2)2(L-L)](其中M＝Na、K或NH4)過(guò)氧釩酸鹽的合成在典型的工藝中，K2[V(＝O)(O2)2(pic)].H2O(pic＝吡啶-2-羧酸)如下制備向V2O5(0.69g，3.8mmol)和KOH(0.49g，8.8mmol)加入蒸餾水，生成黃色-褐色懸液。然后加入H2O2(0.5ml，30％w/v)，生成亮橙色溶液，有一些褐色沉淀。將亮色溶液通過(guò)燒結(jié)玻璃濾器過(guò)濾，放置30分鐘。向反應(yīng)混合物加入更多的H2O2(10ml)，繼之以加入吡啶甲酸(0.97g，7.9mmol)。將溶液攪拌另外30分鐘，然后滴加乙醇(40ml)，沉淀出亮黃色化合物。將該溶液在4℃放置兩天，過(guò)濾收集全部所生成的黃色固體，用無(wú)水乙醇洗滌3次，在減壓下干燥過(guò)夜(收率在40與80％之間不等，這依賴于所使用的L-L配體)?？梢越柚t外、紫外-可見(jiàn)光、1H NMR和51V NMR光譜鑒別pV配合物。利用元素分析確認(rèn)樣品的純度。
這種合成工藝基于以前的文獻(xiàn)報(bào)道[1]Alan Shaver，Jesse B.Ng，.David A.Hall，Bernadette Soo Lum和Barry I.Posner，Inorg.Chem.1993，32，3109-3113[2]Barry I.Posner，Robert Faureb，James W.Burgess，A.Paul Bevand，Danielle Lachance，Guiyi Zhang-Sun，I.George Fantus，Jesse B.Ng，DavidA.Hall，Bernadette Soo Lum和Alan Shavers，J.Biol.Chem.1994，269，4596-4604通式[V(＝O)(L-L)2]和[M]2[V(＝O)(L-L)2](M＝Na、K、NH4)釩酸鹽的合成在典型的合成工藝中，[V(＝O)(pic)2].H2O如下制備向[V(＝O)(SO4)].3H2O(0.72g，3.30mmol)的水(20mL)溶液加入吡啶甲酸(0.83g，6.5mmol)的水(20mL)溶液。滴加2M NaOH升高pH至4.4。過(guò)濾分離所沉淀的淺藍(lán)色固體，用甲醇和二乙醚洗滌若干次。在減壓下干燥固體(收率在45與90％之間不等，這依賴于所使用的L-L配體)?？梢越柚t外與紫外-可見(jiàn)光譜、質(zhì)譜和磁動(dòng)量測(cè)定法鑒別釩酸鹽配合物。利用元素分析確認(rèn)樣品的純度。
這種合成工藝基于以前的文獻(xiàn)報(bào)道[1]Marco Melchior，Katherine H.Thompson，Janet M.Jong，Steven J.Rettig，Ed Shuter，Violet G.Yuen，Ying Zhou，John H.McNeill和ChrisOrvig，Inorg.Chem.1999，38，2288-2293在第三方面，本發(fā)明提供抑制磷酸酶的方法，包括對(duì)受治療者給予有效量的如本文所述的化合物。確切而言，該磷酸酶是PTEN，更確切地，本發(fā)明提供治療神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默氏病以及受益于細(xì)胞程序死亡抑制的疾病或病癥如傷口愈合、灼傷、心臟肥大、缺氧、缺血和運(yùn)動(dòng)損傷的方法。另外，癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞程序死亡更具抵抗力，因而本發(fā)明化合物將可用于與常規(guī)化療劑聯(lián)合以保護(hù)更有可能經(jīng)歷細(xì)胞程序死亡的正常細(xì)胞。
現(xiàn)在將參照下列實(shí)施例描述本發(fā)明，它們不應(yīng)以任何方式被解釋為限制本發(fā)明實(shí)施例涉及下列附圖，其中

圖1顯示bpV化合物(bpV(bipy)、bpV(phen)、bpV(HOpic)和bpV(pic))對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶PTP-β與PTP-1B和磷酸肌醇3-磷酸酶PTEN的IC50值。PTP酶實(shí)驗(yàn)如下進(jìn)行使用pNPP作為底物，抑制劑濃度在100μM與1nM之間?？梢詤^(qū)分兩組抑制劑之間的顯著性差異。芳族bpV顯示更高的納摩爾級(jí)IC50，不過(guò)，極性bpV化合物抑制PTP需要微摩爾濃度。PTEN研究是利用基于孔雀綠的磷酸鹽釋放測(cè)定法來(lái)實(shí)現(xiàn)。我們使用PI(3，4，5)P3作為底物，在沒(méi)有和有bpV抑制劑的存在下測(cè)量所釋放的磷酸鹽，抑制劑的濃度為0.1至500nM。這些PTP抑制劑能夠被認(rèn)定是非常有力的PTEN抑制劑，在低納摩爾濃度下顯示50％抑制作用。全部IC50都是一式三份測(cè)定的平均+/-S.E.。利用Prism GraphPad進(jìn)行計(jì)算。
圖2abpV化合物的胰島素模擬性質(zhì)將饑餓72h的NIH3T3和UM-UC-3細(xì)胞與濃度在10μM與0.1μM之間的全部四種bpV抑制劑溫育15分鐘。借助SDS-PAGE分析細(xì)胞溶解產(chǎn)物，隨后使用pSer473 PKB、Mass PKB和微管蛋白抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。全部四種bpV在最高濃度(10μM)下都顯示PKB的磷酸化，表明對(duì)胰島素途徑的誘導(dǎo)作用。1μM和0.1μM沒(méi)有或者僅僅實(shí)現(xiàn)輕微的磷酸化。bpV(phen)顯示在胰島素模擬性質(zhì)上不太有力，與其他化合物相比PKB磷酸化較低。圖表顯示代表三種其他抑制劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖2b由生長(zhǎng)因子、bpV(pic)和bpV(phen)誘導(dǎo)的酪氨酸殘基磷酸化使休眠NIH3T3細(xì)胞暴露于10％NCS、50、10與0.5μg/mL胰島素和各種濃度的bpV(pic)與bpV(phen)達(dá)15分鐘。利用特異性抗磷酸酪氨酸抗體進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡分析證明所預(yù)期的蛋白質(zhì)譜帶圖案，就10μM bpV(pic)而言給出最高的磷酸化信號(hào)。相比之下，10μM bpV(phen)誘導(dǎo)較低的磷酸化速率，與用10％刺激的成纖維細(xì)胞相似。在納摩爾范圍下的濃度對(duì)酪氨酸殘基的磷酸化沒(méi)有意義。與對(duì)照細(xì)胞相比，用0.01μM bpV和0.5μg/mL胰島素共同刺激細(xì)胞沒(méi)有導(dǎo)致磷酸化改變。分子大小標(biāo)注在右邊。該圖顯示三種其他抑制劑的代表性印跡。
圖2cbpV(pic)的細(xì)胞毒性將NIH3T3細(xì)胞用各種濃度的bpV(pic)、bpV(HOpic)、bpV(bipy)和bpV(phen)處理，溫育2小時(shí)。向細(xì)胞加入MTT(5mg/mL)后，溫育另外4小時(shí)。最后，在570nm測(cè)量OD。高達(dá)10μM的濃度對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有影響，不過(guò)100μM bpV影響成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致約40％的細(xì)胞損失。1mM的最高施用劑量殺死幾乎80％的細(xì)胞。在第二項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中得到相同的結(jié)果。
圖3bpV(pic)和bpV(phen)溫育后的肌動(dòng)蛋白重排使NIH3T3細(xì)胞生長(zhǎng)，溫育(0.1-10μM)，固定在8-室載物片上，用TRITC-毒傘素和DAPI染色。利用免疫熒光顯微鏡檢查分析細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白染色。僅用載體處理的對(duì)照細(xì)胞顯示經(jīng)典的肌動(dòng)蛋白分布。用0.1μMbpV(pic)和bpV(phen)處理后，即使24小時(shí)后形態(tài)學(xué)也仍然沒(méi)有變化。只有高達(dá)1和10μM的濃度經(jīng)24小時(shí)導(dǎo)致形態(tài)學(xué)變化。肌動(dòng)蛋白纖絲開(kāi)始重排，細(xì)胞和核聚攏。成纖維細(xì)胞開(kāi)始脫落和死亡。這些發(fā)現(xiàn)表明化合物的毒性開(kāi)始于微摩爾濃度?？潭葪l＝10μm。
圖3在PI3K抑制劑Ly294002和mTOR抑制劑雷帕霉素的存在下微摩爾bpV(pic)對(duì)PKB磷酸化的影響將靜止成纖維細(xì)胞分別用Ly294002(10μM)和雷帕霉素(50nM)預(yù)溫育20分鐘和30分鐘。然后用10或1μMbpV(pic)處理。PI3K抑制劑Ly294002減少bpV(pic)誘導(dǎo)的PKB磷酸化。相形之下，mTOR抑制劑雷帕霉素增加PKB的磷酸化水平。
圖5體內(nèi)PTEN抑制作用的劑量依賴性圖5a用不同濃度全部四種bpV化合物溫育5分鐘并用0.5μg/mL胰島素刺激15分鐘的饑餓成纖維細(xì)胞以濃度-依賴性方式在檢測(cè)pSer473的蛋白質(zhì)印跡上顯示增加PKB磷酸化。利用NIH Image程序，密度測(cè)定分析獲得的體內(nèi)IC50值在較低的納摩爾范圍內(nèi)。
圖5b在PTEN-陰性細(xì)胞系UM-UC中完成的相似實(shí)驗(yàn)在相同濃度下沒(méi)有改變PKB Ser473的磷酸化水平，表明bpV抑制劑靶向于PTEN。圖表顯示來(lái)自重復(fù)兩次的代表性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖6Ly294002以及與沒(méi)有bpV(pic)的劑量依賴性PKB抑制作用實(shí)驗(yàn)如下進(jìn)行其中將經(jīng)過(guò)Ly294002預(yù)處理的NIH3T3細(xì)胞在存在或不存在200nM bpV(pic)下溫育，繼之以用10μg/mL胰島素刺激15分鐘。在PKB蛋白質(zhì)印跡上分析細(xì)胞樣品。本圖所示結(jié)果證明PTEN抑制劑bpV(pic)能夠部分地取消Ly294002依賴性PKB抑制作用。利用NIH Image分析譜帶的光密度，在PrismGraph中計(jì)算和繪圖。如圖所示，5μMLy294002足以完全抑制PKB活化，不過(guò)在200nM bpV(pic)的存在下，仍然發(fā)生磷酸化。因此，PTEN抑制劑改變Ly294002的IC50。
圖7一類新的PTEN抑制劑bpV的特征總結(jié)實(shí)施例1PTEN的克隆和表達(dá)將人PTEN的DNA序列的編碼區(qū)克隆到pGEX-4T2表達(dá)載體(Pharmacia)中。在18℃下，使用100μM IPTG，在大腸桿菌DH5菌株中誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)過(guò)夜。使用谷胱甘肽瓊脂糖4B(Pharmacia)，按照廠商手冊(cè)純化GST-融合蛋白。使用GST抗體(Novagen)，在蛋白質(zhì)印跡上確認(rèn)蛋白質(zhì)的完整性和特異性。
bpV(pic)的合成K2[V(＝O)(O2)2(pic)].H2O(pic＝吡啶-2-羧酸)如下制備向V2O5(0.69g，3.8mmol)和KOH(0.49g，8.8mmol)加入蒸餾水，生成黃色-褐色懸液。然后加入H2O2(0.5ml，30％w/v)，生成亮橙色溶液，有一些褐色沉淀。將亮色溶液通過(guò)燒結(jié)玻璃濾器過(guò)濾，放置30分鐘。向反應(yīng)混合物加入更多的H2O2(10ml)，繼之以加入吡啶甲酸(0.97g，7.9mmol)。將溶液攪拌另外30分鐘，然后滴加乙醇(40ml)，沉淀出亮黃色化合物。將該溶液在4℃放置兩天，過(guò)濾收集全部所生成的黃色固體，用無(wú)水乙醇洗滌3次，在減壓下干燥過(guò)夜(收率在40與80％之間不等，這依賴于所使用的L-L配體)。收率1.62g；58％。借助NMR和IR光譜表征這種化合物，借助元素分析確定其純度。元素分析實(shí)測(cè)值C，19.7；H，2.0；N，3.7；C6H4NO7K2V.2H2O計(jì)算值C，19.6；H，2.1；N，3.8.IRν(KBr)1630(CO)；951(VO)，860，872(OO)cm-1.51V NMR(D2O)-744.1ppm.
蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP酶)測(cè)定法使用合成底物對(duì)-硝基苯基磷酸酯(pNPP)和磷酸酶PTP-1B與PTP-β(Upstate Biotechnology)進(jìn)行蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP酶)測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定條件為25mM HEPES pH 7.2、50mM NaCl、5mM DTT、2.5mM EDTA、100μg/mL BSA、1mM pNPP(Sigma)和分別4單位PTP-1B與10單位PTP-β。加入酶，開(kāi)始測(cè)定，在30℃于預(yù)加熱的ELISA讀數(shù)室內(nèi)進(jìn)行15分鐘。在410nm波長(zhǎng)下，每30秒監(jiān)測(cè)吸光度的線性增加。在含有PTP酶抑制劑的相同測(cè)定系統(tǒng)中進(jìn)行抑制作用研究，所述抑制劑例如bpV(bipy)、bpV(HOpic)與bpV(phen)(Calbiochem)和所合成的化合物bpV(pic)，濃度在100μM與1nM之間。
PTEN的孔雀綠磷酸鹽釋放測(cè)定法和IC50研究利用基于孔雀綠染劑的磷酸鹽釋放測(cè)定法(No 230，No 83)測(cè)量重組PTEN的酶活性。標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定條件為200mM Tris pH 7.4、50ng/μL BSA和15ng/μL PTEN。使用合成脂質(zhì)PI(3，4，5)P3dC16(Cell Signals)作為PTEN的底物。將脂質(zhì)溶于甲醇/H2O，貯存在-20℃。在用在這些PIP酶實(shí)驗(yàn)之前，將適量脂質(zhì)干燥，重新懸浮在1％辛基糖苷(Sigma)中。聲波處理10分鐘后，脂質(zhì)樣品準(zhǔn)備加入到酶測(cè)定系統(tǒng)中。全部測(cè)定都開(kāi)始于向預(yù)加熱的含有PI(3，4，5)P3dC16的緩沖溶液加入酶。在30℃溫育室內(nèi)進(jìn)行線性PIP酶反應(yīng)達(dá)30分鐘。為了終止酶反應(yīng)，向酶溶液加入0.7體積的有色試劑(2.3mg/mL孔雀綠的3.6M HCl溶液和17mM鉬酸銨)。使混合物顯色20分鐘，測(cè)量625nm的吸光度。就全部抑制劑研究而言，將濃度從0.1nM直至500nM的抑制劑與PTEN預(yù)溫育，酶測(cè)定法開(kāi)始于加入150μM經(jīng)過(guò)聲波處理的脂質(zhì)。為了標(biāo)化磷酸鹽釋放，采用磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線。全部實(shí)驗(yàn)都重復(fù)進(jìn)行三次。利用GraphPad Prism進(jìn)行IC50計(jì)算。
細(xì)胞毒性測(cè)定法進(jìn)行MTT測(cè)定法來(lái)測(cè)量bpV化合物的細(xì)胞毒性。將NIH3T3細(xì)胞重新懸浮在無(wú)血清培養(yǎng)基中，暴露于濃度在1mM與0.1nM之間的全部四種bpV化合物達(dá)2小時(shí)。向細(xì)胞加入MTT溶液(5mg/mL)(LancasterSynthesis Ltd)，進(jìn)一步溫育4小時(shí)。將細(xì)胞沉淀重新懸浮在含有100mMHCl的DMSO中，在570nm下測(cè)量。
毒傘素染色為了監(jiān)測(cè)形態(tài)學(xué)變化，使NIH3T3細(xì)胞在8孔室載物片上生長(zhǎng)，分別與濃度在0.1與10μM之間的bpV(pic)和bpV(phen)溫育6小時(shí)和24小時(shí)。將成纖維細(xì)胞用4％低聚甲醛(PFA)固定，用0.2％Triton滲透，用10％NCS(新生牛血清)封閉。為了染色肌動(dòng)蛋白纖絲，將細(xì)胞與TRITC-毒傘素(Sigma)(1∶1000)溫育1小時(shí)。最后，將核用DAPI(Sigma)染色，固定。利用TRITC和DAPI濾器，在顯微鏡上評(píng)估形態(tài)學(xué)分析，利用照相機(jī)捕獲圖片。
組織培養(yǎng)在37℃和5％CO2下，使NIH3T3細(xì)胞(5-20代)在6孔平板中的10％NCS DMEM(GIBCO BRL)中生長(zhǎng)。在含有0.5％NCS的DMEM中使細(xì)胞饑餓72小時(shí)。在使用之前，將培養(yǎng)基換為0％DMEM。使PTEN-膀胱腫瘤細(xì)胞系UM-UC-3細(xì)胞(No 195，No 196)在10％MEM(GIBCO BRL)中生長(zhǎng)，也用0.5％MEM饑餓三天，最后與無(wú)血清MEM溫育。
PKB測(cè)定bpV化合物對(duì)胰島素信號(hào)發(fā)送途徑的活化作用為了確定四種bpV化合物的胰島素模擬性質(zhì)，使NIH3T3和UM-UC-3細(xì)胞暴露于濃度為0.1、1和10μM的bpV(bipy)、bpV(phen)、bpV(HOpic)和bpV(pic)達(dá)15分鐘。將細(xì)胞用PBS洗滌一次，用80μL SDS-PAGE緩沖液溶解(250mM Tris pH 6.8、20％甘油、4％SDS、0.01％溴酚藍(lán)、50mM巰基乙醇)。將樣品煮沸15分鐘，貯存在-20℃，直至如前段所述在蛋白質(zhì)印跡上分析。
NIH3T3細(xì)胞的磷酸酪氨酸測(cè)定法如前文所述使NIH3T3細(xì)胞生長(zhǎng)和饑餓。饑餓72小時(shí)后，將細(xì)胞分別與10％NCS；50、10與0.5μg/mL胰島素(Sigma)；10、1、0.1與0.01μMbpV(pic)與bpV(phen)溫育15分鐘。如上所述制備細(xì)胞溶解產(chǎn)物，使用抗磷酸酪氨酸抗體(Upstate)在蛋白質(zhì)印跡上分析全部樣品。
在PI3K抑制劑Ly294002和mTOR抑制劑雷帕霉素存在下的PKB測(cè)定法為了研究PI3K和mTOR對(duì)bpV-依賴性胰島素模擬特性的影響，我們將NIH3T3細(xì)胞分別用10μM Ly294002(Promega)和50nM雷帕霉素(Calbiochem)處理20分鐘和30分鐘，繼之以與10μM或1μM bpV(pic)溫育15分鐘。在PKB蛋白質(zhì)印跡上分析細(xì)胞溶解產(chǎn)物。
PKB測(cè)定bpV化合物對(duì)PTEN的抑制效應(yīng)的劑量依賴性為了研究釩酸鹽分子對(duì)PTEN的抑制效力，向細(xì)胞加入濃度從1nM直至100nM的bpV(bipy)、bpV(HOpic)、bpV(pic)和bpV(phen)達(dá)5分鐘，繼之以用0.5μg/mL胰島素刺激15分鐘。按照完全相同的方式處理UM-UC-3細(xì)胞。使用PKB抗體，在蛋白質(zhì)印跡上分析細(xì)胞樣品。
Ly294002劑量依賴性為了發(fā)現(xiàn)bpV(pic)對(duì)Ly294002-依賴性PKB抑制作用是否具有影響，我們完成了一項(xiàng)劑量響應(yīng)實(shí)驗(yàn)，對(duì)兩組休眠成纖維細(xì)胞施用濃度從0.01直至100μM的Ly294002，溫育20分鐘。然后將一批細(xì)胞進(jìn)一步用200nMbpV(pic)處理5分鐘，最后將全部細(xì)胞用10μg/mL胰島素刺激15分鐘。如前文所述收集細(xì)胞溶解產(chǎn)物。利用GraphPad Prism進(jìn)行計(jì)算和繪圖。蛋白質(zhì)印跡分析將所有細(xì)胞溶解產(chǎn)物樣品裝載于10％SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至PKB分析用PVDF膜和磷酸酪氨酸檢測(cè)用硝基纖維素膜。就PKB蛋白質(zhì)印跡而言，將膜用含5％奶粉的TBST封阻1小時(shí)，繼之以與抗Mass-PKB抗體(1∶1000)或抗磷酸-PKB(Ser473)抗體(1∶1000)在TBST中溫育2小時(shí)。最后，使膜暴露于辣根過(guò)氧化物酶-綴合二級(jí)抗血清(BIORAD)(1∶1000)的5％奶粉溶液達(dá)1小時(shí)。使用ECLTM溶液(Amersham)展開(kāi)蛋白質(zhì)印跡。為了檢測(cè)磷酸化的酪氨酸殘基，將硝基纖維素膜用2.5％奶粉封阻1小時(shí)，先與特異性抗磷酸酪氨酸抗體(4G10)(1∶3000)溫育1小時(shí)，最后與辣根過(guò)氧化物酶-綴合二級(jí)抗小鼠抗血清溫育。全部PKB和磷酸酪氨酸實(shí)驗(yàn)在三項(xiàng)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中完成，使用特異性微管蛋白抗體(1∶1000)重新探查全部膜。利用公共結(jié)構(gòu)域NIH Image V1.62程序(由U.S.National Institutes of Health開(kāi)發(fā)，在互聯(lián)網(wǎng)上可從http://rsb.info.nih.gov/nih-image/獲得)進(jìn)行譜帶的密度分析。使用對(duì)應(yīng)的Mass PKB標(biāo)化pS473譜帶密度，以任意單位表示，目的是證明相對(duì)于對(duì)照的變化。
結(jié)果蛋白酪氨酸磷酸酶PTP-1B和PTP-β的IC50PTP酶測(cè)定法使用pNPP作為底物，在沒(méi)有和有bpV抑制劑的存在下進(jìn)行。我們證明了每一不同化合物的IC50值(表1)。可以區(qū)分兩組bpV化合物，芳族(bpV(bipy)和bpV(phen))和極性抑制劑(bpV(HOpic)和bpV(pic))。芳族分子的PTP-β測(cè)定獲得的IC50值分別為60.3nM(+/-9.6)和343nM(+/-88.5)。這些結(jié)果相當(dāng)于以前公布過(guò)的數(shù)值。令人驚訝的是，兩種極性化合物bpV(HOpic)和bpV(pic)的IC50高達(dá)4.9μM(+/-0.9)和12.7μM(+/-3.2)。非受體樣PTP-1B也能測(cè)量到相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果(IC50值參見(jiàn)圖1)。
PTEN被bpV化合物抑制IC50分析PTEN是一種3-磷酸酶，針對(duì)PI(3)P、PI(3，4，5)P3和IP4顯示底物親和性。我們建立了一種使用PI(3，4，5)P3作為底物的PTEN磷酸鹽釋放測(cè)定法。這種酶測(cè)定法基于多年以前所建立的一種方法(No 230，No83)。使用酸性孔雀綠染劑(OD625)檢測(cè)游離無(wú)機(jī)磷酸鹽。以前建立這種測(cè)定法用于磷酸肌醇磷酸酶PTEN(No 131)。PTEN的Km值為約150μM，這相當(dāng)于1.72的摩爾百分比(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，我們可能首次確定bpV化合物不僅抑制PTP，而且阻滯PTEN的磷酸肌醇磷酸酶活性。為了進(jìn)一步鑒別抑制效力，我們通過(guò)溫育適量PTEN與150μM PI(3，4，5)P3dC16和各種濃度的全部四種bpV化合物，完成了IC50研究。IC50研究的結(jié)果總結(jié)在圖1中。就全部四種抑制劑而言，我們測(cè)量到驚人低的IC50，數(shù)值在14與38nM之間。這些數(shù)字比PTP酶低10至100倍，表明這類抑制劑顯示高得多的PTEN活性位點(diǎn)親和性。此外，我們不能檢測(cè)到兩組不同的bpV之間的顯著性差異，表明這些釩酸鹽在PTEN活性中心的結(jié)合不受不同配體的影響。這些發(fā)現(xiàn)鑒別了一類新的非常有力的PTEN抑制劑，它們能夠被開(kāi)發(fā)作為未來(lái)藥理研究中非常有用的工具。
PKB測(cè)定法bpV化合物對(duì)胰島素信號(hào)發(fā)送途徑的活化作用過(guò)去已經(jīng)顯示，高劑量的釩酸鹽pV和bpV導(dǎo)致PKB磷酸化(No 184，234)。為了評(píng)估雙過(guò)氧釩酸鹽對(duì)胰島素信號(hào)發(fā)送途徑活化的這種功能，我們溫育了饑餓NIH3T3和UM-UC-3細(xì)胞與濃度從0.1μM至10μM的bpV(pic)、bpV(HOpic)、bpV(bipy)和bpV(phen)。圖2a證明使用抗pS473和Mass PKB抗體在PKB蛋白質(zhì)印跡上所揭示的結(jié)果。在NIH3T3細(xì)胞中，全部化合物在10μM濃度下都給出最高的磷酸化PKB信號(hào)。通過(guò)使用1μM的bpV(pic)、bpV(HOpic)和bpV(bipy)，我們?nèi)匀荒軌驒z測(cè)到微弱的信號(hào)，不過(guò)就bpV(phen)而言，未見(jiàn)磷酸化。就任意pV化合物而言，最低濃度(100nM)都沒(méi)有導(dǎo)致PKB的磷酸化，這暗示著胰島素模擬性質(zhì)僅在微摩爾范圍內(nèi)是可檢測(cè)的。有趣的是，bpV(phen)模擬胰島素途徑的效力似乎低于其他分子。這可能由于信號(hào)發(fā)送級(jí)聯(lián)中的靶不同。延長(zhǎng)與bpV分子溫育的時(shí)間后沒(méi)有能夠觀察到磷酸化PKB的進(jìn)一步活化(數(shù)據(jù)未示出)。相比之下，在UM-UC-3中所揭示的結(jié)果顯示更高的磷酸化PKB背景水平，其原因是在這種細(xì)胞系中不存在PTEN。除此以外，PKB的刺激的發(fā)生方式與NIH3T3細(xì)胞所述相似。
將bpV預(yù)溫育長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)，進(jìn)行全部四種抑制劑的穩(wěn)定性的評(píng)估。可以觀察到?jīng)]有差異(利用NIH Image測(cè)量光密度)，表明這些分子在我們的測(cè)定條件下是高度穩(wěn)定的(數(shù)據(jù)未顯示)。Mass PKB抗體的蛋白質(zhì)印跡分析顯示全部樣品的信號(hào)一致，說(shuō)明在全部細(xì)胞中的表達(dá)水平是均勻的。
bpV抑制劑增加酪氨酸殘基的磷酸化為了檢測(cè)酪氨酸殘基的磷酸化，這是胰島素信號(hào)發(fā)送途徑中的一個(gè)主要特性，我們溫育了休眠成纖維細(xì)胞與不同濃度的bpV(pic)和bpV(phen)(10μM至0.01μM)、NCS(10％)和胰島素(50、10和0.5μg/mL)。磷酸化酪氨酸殘基的蛋白質(zhì)印跡分析揭示了受刺激細(xì)胞的蛋白質(zhì)譜帶的典型圖案(圖2b)(No 277，278，279)。陰性對(duì)照顯示相似的圖案，不過(guò)信號(hào)微弱得多，并且有些譜帶不存在。在用10μM bpV(pic)處理的細(xì)胞中能夠檢測(cè)到最高程度的酪氨酸磷酸化，這與已公布的用10μM原釩酸鈉(No 279)、100μM釩酸鹽(No 282)或0.5mM過(guò)釩酸鹽(No 238)揭示的酪氨酸殘基磷酸化數(shù)據(jù)相一致。這些結(jié)果顯示最高劑量的bpV(pic)甚至比50μg/mL胰島素和10％NCS更加有力。與在PKB分析中證明的結(jié)果相一致，10μM bpV(phen)的刺激作用低于相同濃度的bpV(pic)。這給出了另一個(gè)證據(jù)，即bpV(phen)于其他化合物相比具有較低的胰島素模擬效力。用1和0.1μM bpV(pic)處理導(dǎo)致與用0.5μg/mL胰島素溫育后所揭示的相似的信號(hào)。此外，最低濃度(0.01μM)與陰性對(duì)照不可區(qū)分。總結(jié)這些結(jié)果，可以說(shuō)bpV化合物僅在微摩爾濃度下顯示胰島素模擬特征，并且在芳族bpV(phen)與極性bpV(pic)之間在酪氨酸磷酸化方面存在顯著的差異。
bpV化合物的細(xì)胞毒性通過(guò)進(jìn)行MTT測(cè)定法——一種經(jīng)由線粒體脫氫酶測(cè)量活細(xì)胞活性的方法，我們清楚地顯示濃度高達(dá)10μM的全部四種化合物對(duì)成纖維細(xì)胞的存活沒(méi)有影響(圖2c)。只有高達(dá)100μM的濃度是顯著細(xì)胞毒性的，殺死約40％的細(xì)胞。用1mM抑制劑處理引起約80％細(xì)胞死亡。這表明能夠體外抑制PTEN磷酸酶活性的劑量不影響細(xì)胞活力。在四種化合物之間可以觀察到細(xì)胞毒性沒(méi)有差異。
由肌動(dòng)蛋白重排所代表的抑制劑暴露后形態(tài)學(xué)變化用毒傘素-TRITC和DAPI免疫染色的NIH3T3細(xì)胞顯示成纖維細(xì)胞的細(xì)胞骨架形態(tài)。成纖維細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白染色是一項(xiàng)成熟的技術(shù)(No 280，No 281)。肌動(dòng)蛋白應(yīng)激纖維的出現(xiàn)和分布可以是細(xì)胞完整性的體現(xiàn)(No283，No 266，No 271)，進(jìn)而以肌動(dòng)蛋白重排作為手段，可以測(cè)量藥物的細(xì)胞毒性。僅用載體處理的對(duì)照細(xì)胞顯示經(jīng)典的細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)和應(yīng)激纖維的出現(xiàn)(圖3a-d)。用0.1μM bpV(pic)和bpV(phen)處理6小時(shí)和24小時(shí)后，細(xì)胞形態(tài)學(xué)仍然沒(méi)有變化(圖3e-h)。只有用高達(dá)1和10μM的濃度溫育24小時(shí)才揭示有形態(tài)學(xué)改變，以肌動(dòng)蛋白應(yīng)激纖維的喪失和受影響細(xì)胞邊緣處F-肌動(dòng)蛋白厚區(qū)的存在為特征(圖3kj，l，n+p)。成纖維細(xì)胞開(kāi)始脫落和死亡。此外，細(xì)胞和核聚攏，這是死亡細(xì)胞的典型特性。暴露于1和10μM bpV僅6小時(shí)的成纖維細(xì)胞顯示與在對(duì)照細(xì)胞中可見(jiàn)的相似的肌動(dòng)蛋白分布和形態(tài)學(xué)。這些發(fā)現(xiàn)表明化合物的毒性開(kāi)始于微摩爾濃度。此外，在兩組bpV化合物內(nèi)可以觀察到?jīng)]有顯著性差異，證明在細(xì)胞毒性方面，極性與芳族bpV釩酸鹽之間不存在差異。
Ly294002和雷帕霉素對(duì)bp釩酸鹽誘導(dǎo)的胰島素途徑的影響
Ly294002是一種熟知的PI 3-K抑制劑，它阻滯PKB的磷酸化。相形之下，雷帕霉素抑制mTOR，也就是所謂的雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶。我們研究了這兩種抑制劑對(duì)bp釩酸鹽誘導(dǎo)的胰島素途徑的影響。將NIH3T3細(xì)胞與適當(dāng)劑量的Ly294002和雷帕霉素預(yù)溫育，然后分別暴露于10和1μM bpV(pic)。正如以前所證明的，饑餓的未刺激的成纖維細(xì)胞需要微摩爾濃度的bpV來(lái)誘導(dǎo)PKB的Ser473的磷酸化(圖2a)。如圖4所示，10μMbpV(pic)導(dǎo)致高度的磷酸化。加入50nM雷帕霉素給出相似的刺激作用，不過(guò)與Ly294002預(yù)溫育實(shí)現(xiàn)了磷酸化速率減小。這證實(shí)了釩酸鹽對(duì)PKB磷酸化作用是一種PI 3-K依賴性途徑。另外，我們能夠顯示在1μMbpV(pic)濃度下(更長(zhǎng)的暴露時(shí)間，圖4)，沒(méi)有信號(hào)是可見(jiàn)的，盡管如此，與雷帕霉素預(yù)溫育引發(fā)Ser473磷酸化，表明mTOR在這種信號(hào)發(fā)送途徑中的角色。
bpV化合物在納摩爾濃度下刺激PKB磷酸化在研究bpV抑制劑效力的過(guò)程中，我們利用全部四種化合物進(jìn)行濃度依賴性實(shí)驗(yàn)。將休眠NIH3T3細(xì)胞與濃度為1nM直至100nM的bpV(HOpic)、bpV(pic)、bpV(bipy)和bpV(phen)溫育。這些化合物以劑量-依賴性方式誘導(dǎo)PKB的磷酸化(圖5a)。利用最低濃度、例如1和10nM不能建立活化，不過(guò)與對(duì)照(0.5μg/mL胰島素)相比，利用20nM bpV(pic)、bpV(HOpic)和bpV(bipy)(約20％)能夠檢測(cè)到輕微增加。更高的濃度、例如60nM至100nM導(dǎo)致磷酸化PKB信號(hào)的顯著增強(qiáng)。利用NIH Image程序測(cè)量光密度，根據(jù)三項(xiàng)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以計(jì)算IC50值。這些抑制系數(shù)可以在bpV(pic)的48nM(+/-8.5)與bpV(HOpic)的96nM(+/-16.3)之間?？偨Y(jié)這些結(jié)果，可以說(shuō)PTEN也能被較低納摩爾濃度的bpV化合物體內(nèi)抑制，如同體外所確定(圖1)。因而，PKB的刺激是由于由PTEN抑制所引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)PI(3，4，5)3水平增加。此外，我們?cè)趦山M抑制劑之間不能檢測(cè)到任何差異，表明PTEN磷酸酶的活性位點(diǎn)對(duì)于大小或電荷沒(méi)有限制。通過(guò)確立有關(guān)PTP和PTEN的抑制作用的這種明顯差異，可以開(kāi)發(fā)這些分子作為區(qū)分不同種類磷酸酶的有用工具。
bpV對(duì)UM-UC-3細(xì)胞中的PKB磷酸化沒(méi)有影響為了進(jìn)一步證實(shí)bpV抑制PTEN、從而實(shí)現(xiàn)更高的PI(3，4，5)P3水平、導(dǎo)致PKB磷酸化的事實(shí)，我們?cè)赑TEN陰性腫瘤細(xì)胞系UM-UC-3中重復(fù)相同的實(shí)驗(yàn)。使饑餓的UM-UC-3細(xì)胞暴露于相似濃度的全部四種抑制劑。pS473蛋白質(zhì)印跡分析沒(méi)有顯示任何PKB刺激作用(圖5b)。即使最高劑量的100nM bpV抑制劑也僅略微增加磷酸化，暗示發(fā)生了bpV IC50的轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果再次表明PTEN和隨后的PI(3，4，5)3在我們的細(xì)胞系統(tǒng)中是bpV化合物誘導(dǎo)的PKB活化中的關(guān)鍵分子。
PTEN抑制劑bpV(pic)能夠部分取消Ly294002誘導(dǎo)的PKB抑制作用與各種濃度Ly294002(0.01至100μM)單獨(dú)預(yù)溫育的休眠NIH3T3細(xì)胞在pSer473蛋白質(zhì)印跡上給出顯著低于用200nM bpV(pic)共同處理的信號(hào)。這種IC50的轉(zhuǎn)移清楚地證明bpV(pic)能夠取消Ly294002誘導(dǎo)的PKB抑制作用。將蛋白質(zhì)印跡信號(hào)的光密度分析標(biāo)化為對(duì)照，計(jì)算抑制作用。圖6所示圖形證明有與沒(méi)有bpV(pic)的實(shí)驗(yàn)的顯著性差異。bpV化合物的存在使Ly294002誘導(dǎo)的抑制作用減少。這些結(jié)果給出清楚的證據(jù)，即在我們的細(xì)胞系統(tǒng)中，bpV充當(dāng)PTEN抑制劑，隨后增加PI(3，4，5)P3水平，導(dǎo)致PKB的磷酸化。
下列六種化合物被測(cè)試為肌醇磷酸酶的抑制劑 配體N-苯基雙胍 配體喹啉V(+V)pV(phenbig)V(+IV)喹啉4V(+IV)phenbig4
配體鄰-羥基吡啶甲酸 配體吡啶甲酸V(+V)pV(OHpic)V(+V)pV(pic)V(+IV)OHpic4 V(+IV)pic4
配體異喹啉配體菲咯啉V(+V)pV(isoqu)V(+V)pV(phen)在本研究中測(cè)試的化合物總結(jié)pV＝過(guò)氧釩酸鹽；釩(+V)配合物VO(O2)2(配體)；釩(+IV)配合物VO(配體)2PTP-β
pV(phen)＞pV(pic)＞pV(OHpic)＞OHpic4＞phenbig4＞喹啉4＞pV(isoqu)＞pic4＞pV(phenbig)
SopB
pV(OHpic)＞pV(isoqu)＞pic4＞OHpic4＞pV(phenbig)＞phenbig4＞喹啉4MTM
pV(pic)＜pV(OHpic)＜pV(phen)＜pVisoqu)＜pV(phenbig)＜OHpic4＜phenbig4＜pic4＜喹啉4
PTEN
全部化合物都看來(lái)在低nM范圍內(nèi)抑制；pV(phenbig)和OHpic4看來(lái)是非常良好的抑制劑。
討論很多年來(lái)，PTEN被描述為一種腫瘤抑制劑，在很多癌組織中突變(No240、246、247、267)?，F(xiàn)在確定，它作為腫瘤抑制劑的作用主要是通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)PI3K/PKB信號(hào)發(fā)送途徑來(lái)發(fā)揮(No 236、232、265)。即使很多最近的研究鑒別PTEN為一種磷酸酶(No 98)及其在代謝和疾病中的角色(No267、268、246、247)，不過(guò)這種蛋白質(zhì)不存在特異性抑制劑。研究主要是在無(wú)PTEN細(xì)胞系(No 106、164、233、236)或PTEN陰性果蠅突變體(No 175)中完成。這里所列工作是第一項(xiàng)描述一類非常有力的PTEN抑制劑的研究。我們能夠證明，熟知的雙過(guò)氧釩(bpV)類蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP酶)抑制劑對(duì)PTEN顯示非常高的親和性。我們?cè)隗w外和體內(nèi)鑒別了這些化合物，檢測(cè)到與PTP酶抑制性質(zhì)相比顯著的差異。這些胰島素模擬物引發(fā)了細(xì)胞生長(zhǎng)因子刺激后活化的途徑。它們的特性主要表現(xiàn)為抑制PTP酶，使靶蛋白如胰島素受體底物IRS-1去磷酸化。為了在我們的細(xì)胞系統(tǒng)中評(píng)估bpV的這些胰島素模擬特性，我們對(duì)成纖維細(xì)胞施用微摩爾劑量，分析PKB的Ser473殘基(圖2a)和酪氨酸殘基(圖2b)的磷酸化程度。與文獻(xiàn)相一致(No140)，我們證明在兩種情況下磷酸化水平都有增加。
在PTP酶測(cè)定法中，我們揭示了在極性(bpV(HOpic)和bpV(pic))和芳族(bpV(phen)和bpV(bipy))bpV之間存在明顯的差異。后者導(dǎo)致更高的納摩爾IC50值，不過(guò)極性化合物在高達(dá)微摩爾的濃度下實(shí)現(xiàn)50％抑制(圖1)。與已公布數(shù)據(jù)的差異可能是由于測(cè)定條件。已經(jīng)描述過(guò)IC50值可以依賴于緩沖條件，例如DTT和EDTA濃度(No 146，206)。為了分析PTEN活性，我們使用酸性孔雀綠染劑進(jìn)行磷酸鹽釋放測(cè)定(No 230，No 83)。這種測(cè)定法已經(jīng)成功地應(yīng)用于PTEN(No 131)，給出1與10nmol游離無(wú)機(jī)磷酸鹽之間的線性結(jié)果(No 231)。在相同的研究中，已顯示這種方法適合于研究在各種抑制劑存在下的磷酸酶活性。顯然，采用全部bpV的抑制研究揭示了在低納摩爾濃度下的PTEN抑制作用。這證實(shí)了bpV對(duì)PTEN的更高親和性。此外，正如PTP酶所觀察到的，在極性與芳族化合物之間不存在可檢測(cè)的顯著性差異。這可能是由于PTEN活性位點(diǎn)更開(kāi)放的結(jié)構(gòu)(No 165)，由此與含有更封閉結(jié)構(gòu)的PTP酶形成鮮明對(duì)照(No Sonnenberg等，2003，Liu等，2003)。基于這些體外數(shù)據(jù)，我們使用經(jīng)不同濃度bpV處理、用胰島素刺激的休眠成纖維細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)研究。最近顯示，饑餓的成纖維細(xì)胞需要用某一劑量的生長(zhǎng)因子刺激，目的是檢測(cè)PKB磷酸化的藥物依賴性變化(Byrne等)。由于PTEN抑制劑引起PTEN活性喪失，從而增加PI(3，4，5)P3水平，我們預(yù)期用釩酸鹽處理后引起PKB的劑量-依賴性活化。我們能夠清楚地證明磷酸化Ser473的增加與細(xì)胞暴露于納摩爾bpV相關(guān)(圖5a)。利用密度測(cè)定分析，我們確定不同化合物的50％抑制濃度在48與99nM之間。這些數(shù)值與我們?cè)诿笢y(cè)定法中所收到的結(jié)果相當(dāng)。與體外結(jié)果的輕微變化可能是由于釩酸鹽的膜滲透性延遲。由于已公布過(guò)胰島素和釩酸鹽也活化PKB(No 184，234)，不過(guò)是在比此處所用更高的濃度下，我們?cè)赑TEN陰性UM-UC-3細(xì)胞系中重復(fù)了相同的實(shí)驗(yàn)。正如所提出的，bpV沒(méi)有激發(fā)PKB活化，表明這些化合物靶向于PTEN(圖5b)。最后，為了進(jìn)一步證實(shí)我們的發(fā)現(xiàn)，我們研究了PI3K抑制劑Ly294002在我們的細(xì)胞系統(tǒng)中的影響。如果bpV經(jīng)由PI3K-依賴性途徑發(fā)揮作用，那么將預(yù)期這些化合物能夠援助Ly294002誘導(dǎo)的PKB抑制作用。應(yīng)用適當(dāng)濃度的Ly294002防止了PKB磷酸化(圖6)。不過(guò)，用bpV(pic)共同處理能夠取消這種抑制作用，這清楚地證明bpV靶向于PTEN，繼而引起PI(3，4，5)P3水平增加和PI3K/PKB下游途徑活化。
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權(quán)利要求
1.下式含釩化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于抑制磷酸酶的藥物中的用途 其中L-L’是 或 L’是COO、CONR5、CONHR6、CH2NR5R6；或者其中L和L’一起構(gòu)成下列基團(tuán) 或基團(tuán) 其中L”是O、S或NH；R1、R2、R3、R4、R5和R6獨(dú)立地是H；羥基；C1-6烷基，可選地被羥基或NR7R8取代；C3-6環(huán)烷基，可選地被羥基或NR7R8取代；苯基，可選地被C1-3烷基、羥基、NR7R8或SO3取代；(OCH2CH2)n(NHCH2CH2)n；氨基酸或者由2至5個(gè)氨基酸組成的肽；且R7和R8獨(dú)立地是H或C1-6烷基。
2.下式含釩化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于抑制磷酸酶的藥物中的用途 其中L-L’是 或 L’是COO、CONR5、CONHR6、CH2NR5R6；或者其中L和L’一起構(gòu)成下列基團(tuán) 或基團(tuán) 其中L”是O、S或NH；R1、R2、R3、R4、R5和R6獨(dú)立地是H；羥基；C1-6烷基，可選地被羥基或NR7R8取代；C3-6環(huán)烷基，可選地被羥基或NR7R8取代；苯基，可選地被C1-3烷基、羥基、NR7R8或SO3取代；(OCH2CH2)n(NHCH2CH2)n；氨基酸或者由2至5個(gè)氨基酸組成的肽；且R7和R8獨(dú)立地是H或C1-6烷基。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所要求保護(hù)的用途，其中該藥物用于抑制肌醇磷酸酶如PTEN。
4.如權(quán)利要求1至3任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的用途，其中該藥物用于治療其中需要抑制細(xì)胞程序死亡的疾病。
5.如權(quán)利要求4所要求保護(hù)的用途，其中該疾病或病癥是神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默氏病、傷口愈合、灼傷、心臟肥大、缺氧、缺血、糖尿病、運(yùn)動(dòng)損傷和作為抗癌劑。
6.如權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的用途，其中該化合物是雙過(guò)氧(聯(lián)吡啶)氧代釩酸鉀(bpV(bipy))、雙過(guò)氧(1，10-菲咯啉)氧代釩酸鉀(pV(菲咯啉))、雙過(guò)氧(吡啶甲酸)氧代釩酸鉀(pV(pic))和雙過(guò)氧(苯基雙胍)氧代釩酸鉀(pV(biguan))。
7.如權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的用途，其中該化合物是pV(phenbig)(雙過(guò)氧(苯基雙胍)氧代釩酸二鉀)或bpV(OHpic)(雙過(guò)氧(5-羥基吡啶-2-羧基)氧代釩酸二鉀)。
8.如權(quán)利要求7所要求保護(hù)的用途，其中該藥物用于治療糖尿病。
9.下式的含釩化合物 其中L-L’是 或 L’是CONR5和CONHR6；且其中R1是C1-6烷基。
10.下式的含釩化合物 其中L-L’是 或 L’是CONR5和CONHR6；且其中R1是C1-6烷基。
11.下式的含釩化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽 其中L和L’一起構(gòu)成下列基團(tuán) 其中L”是O、S或NH；R1、R2、R3和R4獨(dú)立地是H；C1-6烷基，可選地被羥基或NR7R8取代；C3-6環(huán)烷基，可選地被羥基或NR7R8取代；苯基，可選地被C1-3烷基、羥基、NR7R8或SO3取代；(OCH2CH2)n(NHCH2CH2)n；氨基酸或者由2至5個(gè)氨基酸組成的肽；且R7和R8獨(dú)立地是H或C1-6烷基。
12.藥物制劑，包含如權(quán)利要求9至11任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的化合物以及可選的一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
全文摘要
本發(fā)明描述了新穎的釩化合物以及它們作為磷酸酶、特別是肌醇磷酸酶的抑制劑的用途。還描述了該化合物治療神經(jīng)變性疾病的用途。
文檔編號(hào)A61K31/28GK1914215SQ200480041315
公開(kāi)日2007年2月14日 申請(qǐng)日期2004年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月4日
發(fā)明者R·沃朔爾斯基, E·羅斯瓦茲, R·維拉爾 申請(qǐng)人:帝國(guó)學(xué)院創(chuàng)新有限公司