專(zhuān)利名稱(chēng)：使用鞭毛蛋白防止輻射的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鞭毛蛋白在防止哺乳動(dòng)物凋亡效果中的應(yīng)用。更特別地，本發(fā)明涉及鞭毛蛋白在防止哺乳動(dòng)物暴露于壓力，如放射和癌癥癥治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
從正常細(xì)胞進(jìn)展到腫瘤細(xì)胞涉及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的副性機(jī)制缺失，包括對(duì)生長(zhǎng)抑制刺激物的對(duì)抗和缺失了對(duì)生長(zhǎng)因子和激素的依賴(lài)。基于放射和細(xì)胞毒性藥物的傳統(tǒng)的腫瘤治療方法依靠正常細(xì)胞和惡性細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控的不同。傳統(tǒng)的腫瘤治療使細(xì)胞面對(duì)嚴(yán)重的基因毒性壓力。在這些情況下，大部分正常細(xì)胞被捕獲，因而保存下來(lái)，而腫瘤細(xì)胞持續(xù)分裂和死亡。
可是，常規(guī)腫瘤治療方法的本質(zhì)是使正?？焖俜至鸦蛴械蛲鰞A向的組織具有風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)這些正?？焖俜至训募?xì)胞的損傷產(chǎn)生了腫瘤治療中常見(jiàn)的副作用，(敏感組織造血組織，小腸，毛囊)。這些組織的天然敏感性使問(wèn)題復(fù)雜化了通常腫瘤細(xì)胞獲得在自殺(凋亡)機(jī)制中的缺陷，引起正常敏感組織死亡的那些治療步驟也許不會(huì)損傷癌癥細(xì)胞。常規(guī)的減少癌癥治療副作用的方法基于(a)使腫瘤細(xì)胞對(duì)治療更敏感，(b)使癌癥治療對(duì)腫瘤細(xì)胞更特異，或(c)治療后促進(jìn)正常組織再生(如，促紅細(xì)胞生成素，GM-CSF，和KGF)。
仍需要一種能夠減輕與癌癥治療中的化療和放療相關(guān)的副作用的治療劑。本發(fā)明完成了這種需要，并提供了其他相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及從一種或多種誘發(fā)凋亡的治療中保護(hù)患者的方法，其包括向患者給藥含有藥學(xué)上可接受劑量的誘導(dǎo)NF-kB的藥劑的組合物。該藥劑可以是鞭毛蛋白或TGFβ，其可是潛伏的(latent)TGFβ。治療可以是癌癥治療，其可以是化療或放療。
本發(fā)明還涉及治療患組成活性NF-kB癌癥的哺乳動(dòng)物的方法，其包括向哺乳動(dòng)物投藥含有藥學(xué)上可接受劑量的誘導(dǎo)NF-kB的藥劑的組合物。該藥劑可以是鞭毛蛋白或TGFβ，其可是潛伏的TGFβ。該藥劑可以在癌癥治療前、同癌癥治療一起、或在癌癥治療后給藥。治療可以是化療或放療。
本發(fā)明還涉及由于治療癌癥癥引發(fā)的正常組織損傷的哺乳動(dòng)物的方法，其包括向哺乳動(dòng)物投藥含有藥學(xué)上可接受劑量的誘導(dǎo)NF-kB的藥劑的組合物。該藥劑可以是鞭毛蛋白或TGFβ，其可是潛伏的TGFβ。該藥劑可以在癌癥治療前、同癌癥治療一起、或在癌癥治療后給藥。治療可以是化療或放療。
本發(fā)明還涉及治療由于壓力引起的正常組織損傷的哺乳動(dòng)物的方法，其包括向哺乳動(dòng)物投藥含有藥學(xué)上可接受劑量的誘導(dǎo)NF-kB的藥劑的組合物。該藥劑可以是鞭毛蛋白或TGFβ，其可是潛伏的TGFβ。該藥劑可以在治療患病動(dòng)物前、同治療患病動(dòng)物一起、或在治療患病動(dòng)物后給藥。
本發(fā)明還涉及在哺乳動(dòng)物中調(diào)節(jié)細(xì)胞年齡的方法，其包括向哺乳動(dòng)物投藥含有藥學(xué)上可接受劑量的誘導(dǎo)NF-kB的藥劑的組合物。該藥劑可以是鞭毛蛋白或TGFβ，其可是潛伏的TGFβ。該藥劑可以在治療患病動(dòng)物前、同治療患病動(dòng)物一起、或在治療患病動(dòng)物后給藥。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，其含有誘導(dǎo)NF-kB活性的藥劑、化療藥物、以及任選地藥學(xué)上可接受的佐劑、稀釋劑或載體。該藥劑可以是鞭毛蛋白或TGFβ，其可是潛伏的TGFβ。
本發(fā)明還涉及篩選NF-kB誘導(dǎo)劑的方法，其包括向NF-kB激活的表達(dá)系統(tǒng)中加入猜想的誘導(dǎo)劑，并單獨(dú)向NF-kB激活的表達(dá)系統(tǒng)中加入對(duì)照，由此通過(guò)增加NF-kB激活的表達(dá)水平的能力來(lái)鑒別NF-kB的誘導(dǎo)劑。
本發(fā)明還涉及從放射影響中保護(hù)哺乳動(dòng)物的方法，其包括向所述哺乳動(dòng)物投藥含有藥學(xué)上可接受劑量的誘導(dǎo)NF-kB的藥劑的組合物。該藥劑可以是鞭毛蛋白，其可以衍生自沙門(mén)氏菌種。組合物可以與射線(xiàn)防護(hù)劑一同給藥。射線(xiàn)防護(hù)劑可以是抗氧化劑，其可以是氨磷汀或維生素E。射線(xiàn)防護(hù)劑還可以是細(xì)胞因子，其可以是干細(xì)胞因子。
本發(fā)明還涉及從誘發(fā)凋亡的一種或多種治療或狀態(tài)中保護(hù)患者的方法，其包括向所述患者投藥含有藥學(xué)上可接受劑量的誘導(dǎo)NF-kB鞭毛蛋白的藥劑的組合物。該藥劑可以是鞭毛蛋白，其可以衍生自沙門(mén)氏菌種。治療可以是癌癥治療，其可以是化療或放療。狀態(tài)可以是壓力，其可以是放射、受傷、中毒、感染和發(fā)燒應(yīng)激。
本發(fā)明還涉及篩選凋亡調(diào)節(jié)劑的方法，其包括向以細(xì)胞為基礎(chǔ)的凋亡系統(tǒng)中添加猜想的調(diào)節(jié)劑，并單獨(dú)向以細(xì)胞為基礎(chǔ)的凋亡系統(tǒng)中添加對(duì)照物，由此通過(guò)改變凋亡速率的能力來(lái)鑒別凋亡調(diào)節(jié)劑，其中猜想的調(diào)節(jié)劑來(lái)自哺乳動(dòng)物寄生蟲(chóng)。
本發(fā)明還涉及篩選NF-kB調(diào)節(jié)劑的方法，其包括向NF-kB激活的表達(dá)系統(tǒng)中加入猜想的調(diào)節(jié)劑，并分別向NF-kB激活的表達(dá)系統(tǒng)中添加對(duì)照物，由此通過(guò)改變NF-kB激活的表達(dá)的能力來(lái)鑒別NF-kB調(diào)節(jié)劑，其中猜想的調(diào)節(jié)劑來(lái)自哺乳動(dòng)物寄生蟲(chóng)。寄生蟲(chóng)的種可以是，但不局限于沙門(mén)氏菌、支原體和衣原體。
本發(fā)明還涉及篩選TGFβ調(diào)節(jié)劑的方法，其包括向TGFβ激活的表達(dá)系統(tǒng)中加入猜想的調(diào)節(jié)劑，并單獨(dú)向TGFβ激活的表達(dá)系統(tǒng)中添加對(duì)照物，由此通過(guò)改變TGFβ激活的表達(dá)的能力來(lái)鑒別TGFβ調(diào)節(jié)劑，其中猜想的調(diào)節(jié)劑來(lái)自哺乳動(dòng)物寄生蟲(chóng)。TGFβ可以是潛伏的TGFβ。寄生蟲(chóng)的種可以是，但不局限于沙門(mén)氏菌、支原體和衣原體。
本發(fā)明還涉及篩選p53調(diào)節(jié)劑的方法，其包括向p53激活的表達(dá)系統(tǒng)中加入猜想的調(diào)節(jié)劑，并單獨(dú)向p53激活的表達(dá)系統(tǒng)中添加對(duì)照物，由此通過(guò)改變p53激活的表達(dá)的能力來(lái)鑒別p53調(diào)節(jié)劑，其中猜想的調(diào)節(jié)劑來(lái)自哺乳動(dòng)物寄生蟲(chóng)。寄生蟲(chóng)的種可以是，但不局限于沙門(mén)氏菌、支原體和衣原體。
本發(fā)明還涉及通過(guò)本文描述的任何一種方法鑒別的調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明還涉及含有本文描述的調(diào)節(jié)劑的組合物。該組合物可以是含有藥學(xué)上可接受劑量的本文所述調(diào)節(jié)劑的藥學(xué)組合物。
本發(fā)明還涉及治療癌癥癥的方法，其包括向需要治療的患者投藥含有增強(qiáng)凋亡的調(diào)節(jié)劑的藥學(xué)組合物。
本發(fā)明還涉及從一種或多種誘導(dǎo)凋亡的治療中保護(hù)患者的方法，其包括向所述患者投藥含有抑制凋亡的調(diào)節(jié)劑的藥物組合物。一種或多種治療可以是腫瘤治療。腫瘤治療可以是化療或放療。


圖1表明在未感染細(xì)胞中沙門(mén)氏菌感染導(dǎo)致NF-kB核定位的發(fā)生。HT29細(xì)胞在玻璃蓋片上生長(zhǎng)，或者模擬感染，未處理的，用鼠鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染的，或用TNFα(10ng/ml)處理的。組AHT29細(xì)胞模擬感染或用從ssaH啟動(dòng)子表達(dá)GFP的鼠傷寒沙門(mén)氏菌株SJW1103G以100MOI感染，該啟動(dòng)子僅在感染的宿主細(xì)胞內(nèi)有活性。使用明視場(chǎng)顯微鏡(BF)給細(xì)胞照相，如所述用免疫熒光檢測(cè)GFP或DAPI。圖像結(jié)合(疊加)揭示細(xì)胞被感染。組BHT29細(xì)胞未處理、用鼠傷寒沙門(mén)氏菌株1103處理、或用TNFα處理。通過(guò)間接免疫熒光如所述監(jiān)測(cè)在各種狀態(tài)下NF-kB p65(RelA)的定位。使用明視場(chǎng)顯微鏡(BF)觀察細(xì)胞，用DAPI染色細(xì)胞核，用FITC觀察p65(RelA)。DAPI染色被誤染成紅色使得結(jié)合(疊加)顯影更易被區(qū)別。
圖2表示沙門(mén)氏菌培養(yǎng)液中的蛋白因子導(dǎo)致NF-kB激活。組A如所示處理濃縮100倍的沙門(mén)氏柏林菌培養(yǎng)液，如所示用感染細(xì)菌激發(fā)HT29細(xì)胞。通過(guò)EMSA從處理45分鐘后制備的全部細(xì)胞提取液中分析NF-kB DNA結(jié)合活性。用p65(RelA)-特異的和p50特異的抗體超遷移(supershifts)確定NF-kB DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物的確實(shí)性(Authenticity)。組B在Superose12柱上通過(guò)凝膠滲入色譜分析濃縮的沙門(mén)氏柏林菌培養(yǎng)液(IN)。在10％SDS-PAGE上通過(guò)分級(jí)法分析洗脫的蛋白部分，并用考馬斯蘭觀察染色。顯示出色譜分析和在凝膠上的分子量標(biāo)記。如所示每級(jí)分的試樣用于刺激HT29細(xì)胞，用用于NF-kBDNA結(jié)合活性的EMSA分析得到的WCEs。組C在POROS HQ基質(zhì)上通過(guò)陰離子交換色譜分析濃縮的沙門(mén)氏柏林菌培養(yǎng)液(IN)。如所示用增加濃度梯度的NaCl洗脫蛋白質(zhì)，在10％SDS-PAGE上分析，并用考馬斯蘭(CB)染色觀察。如所示每部分的輸入和試樣用于刺激HT29細(xì)胞，用用于NF-kB DNA結(jié)合活性的EMSA分析得到的WCEs。從復(fù)制的10％SDS-PAGE凝膠分離的蛋白帶B1-B6和凝膠空白的相應(yīng)洗脫物，與從最初和最終NaCl緩沖梯度液來(lái)源的緩沖液樣品一起用于刺激HT29細(xì)胞，用用于NF-kB DNA結(jié)合活性的EMSA分析得到的WCEs。
圖3表示如質(zhì)譜測(cè)定法所鑒別的，沙門(mén)氏菌培養(yǎng)液中的NF-kB激活因子是鞭毛蛋白。用胰蛋白酶消化帶2的微毛細(xì)管HPLC前后質(zhì)譜測(cè)定。計(jì)數(shù)沙門(mén)氏菌肽相應(yīng)的峰值，相應(yīng)數(shù)字的肽序列在右側(cè)被鑒定。
圖4表示鞭毛蛋白突變不能激活NF-kB。組A在未感染細(xì)胞(UN)、如所示用野生型大腸桿菌DH5α、野生型沙門(mén)氏柏林菌或SopE-突變、SopB-突變、SopE-/SopB-雙突變、野生型鼠傷寒沙門(mén)氏菌1103、fliC-突變(fliC∷Tn10)、fliC-/fljB-雙突變?cè)贛OI 50直接感染HT29細(xì)胞45分鐘制備的WCEs中用EMSAs分析NF-kB DNA結(jié)合活性。組B從未感染細(xì)胞(UN)或用如所示的從野生型和突變細(xì)菌的無(wú)菌過(guò)濾的濃縮培養(yǎng)液激發(fā)HT29細(xì)胞后45分鐘制備的WCEs中用EMSA法分析NF-kB DNA結(jié)合活性。
圖5表示在沙門(mén)氏菌感染過(guò)程中需要鞭毛蛋白激活多種信號(hào)途徑，從而導(dǎo)致NF-kB核定位。組A未處理的HT29細(xì)胞，用TNFα(10ng/ml)或茴香霉素[An](20μg/ml)/PMA(12.5ng/ml)雞尾酒刺激15分鐘的HT29細(xì)胞，或如所述用野生型鼠傷寒沙門(mén)氏菌株1103或鼠傷寒沙門(mén)氏菌fliC-/fljB-雙突變株134感染HT29細(xì)胞。在指定時(shí)間或TNF處理細(xì)胞10分鐘或茴香霉素/PMA處理細(xì)胞15分鐘時(shí)制備WCE，并用于EMSAs以分析NF-kB DNA結(jié)合活性，或用于使用抗IKK或抗IKK抗體的免疫激酶分析(KA)以測(cè)定在他們各自底物GST-IkBα1-54和GST-cJun1-79中IKK和IKK激酶活性(如所示)。每種提取物中相當(dāng)量的蛋白質(zhì)(40μg)的免疫印跡分析(IB)在SDS-PAGE凝膠上分級(jí)，并轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上，用所示抗體雜交以檢測(cè)大多數(shù)IKK，JNK，ERK，和p38，如所示。使用ERK和p38的含磷的特異性抗體檢測(cè)激活的ERK和p38的免疫印跡分析被顯示。組B免疫熒光分析，通過(guò)間接免疫熒光分析顯示出鞭毛蛋白突變的沙門(mén)氏菌不能感染HT29細(xì)胞，HT29細(xì)胞的純化的鞭毛蛋白刺激導(dǎo)致了NF-kB核p65(RelA)定位。處理的圖像表明在蓋玻片上生長(zhǎng)的HT29細(xì)胞基本上與圖1A和B相同。DAPI染色的假著色被用于增強(qiáng)DAPI染色的核和p65核定位的影響觀察。
圖6表明純化的鞭毛蛋白激活信號(hào)途徑以及模擬野生型沙門(mén)氏菌感染，在腸上皮細(xì)胞感染前基因表達(dá)。未處理的或用TNFα(10ng/ml)或用茴香霉素[An](20μg/ml)/PMA(12.5ng/ml)雞尾酒10分鐘處理的、或用鞭毛蛋白(1μg/ml)處理指定時(shí)間的HT29細(xì)胞。制備WCE，用EMSA分析其N(xiāo)F-kB DNA結(jié)合活性，用使用ERK或p38的含磷的特異性抗體的免疫激酶分析(KA)或免疫印跡分析檢測(cè)活性，并用如圖5A所示的激酶特異性抗體檢測(cè)所示的大多數(shù)激酶含量。組A檢測(cè)NF-kB DNA結(jié)合活性的EMSA。組B如圖5A的檢測(cè)IKK，JNK，ERK和p38激酶活性和蛋白含量的免疫印跡和激酶分析。組C未處理的、野生型和鞭毛蛋白雙突變鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染的，TNFα(10ng/ml)或鞭毛蛋白(1mg/ml)刺激的細(xì)胞的感染前基因表達(dá)的半定量RT-PCR。在指定處理后的指定時(shí)間收集HT29細(xì)胞，用分離的RNA合成初始鏈cDNA，隨后該cDNA于用IL1α、IL1β、IL-8、TNFα、MCP1和β肌動(dòng)蛋白的基因特異性引物的RT-PCR中。β肌動(dòng)蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)以標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)模式。得到的PCR產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上分離，并用溴化二氨乙苯啡啶染色以便觀察。
圖7表示鞭毛蛋白介導(dǎo)的NF-kB的激活是MyD88依賴(lài)的。感染野生型沙門(mén)氏柏林菌(100MOI)，IL-1(20ng/ml)，純化的鞭毛蛋白(1μl/ml)(如所示)，從野生型沙門(mén)氏柏林菌和SopE-/SopB-雙突變沙門(mén)氏柏林菌株SE1SB2(S2，如所示)的無(wú)菌過(guò)濾的和濃縮的100kDa的過(guò)濾滯留物上清(spt)被用于激發(fā)野生型、MyD88-/-缺失或TLR2-/-/TLR4-/-雙缺失MEF，如所示。處理45分鐘后制備WCEs，用EMSA檢查以分析NF-kB DNA結(jié)合活性。用IL-2(20ng/ml)作為陽(yáng)性對(duì)照以監(jiān)控MyD88的功能。
圖8表示TLR5抑制鞭毛蛋白介導(dǎo)的NF-kB受體基因活性。在6孔平板中轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞，用指定的DN-TLR哺乳動(dòng)物表達(dá)載體或反義TLR5(AS TLR5)(2g/孔)、2XNF-kB Luc受體基因(100ng/孔)、pRL-TKRenilla熒光素酶用于標(biāo)準(zhǔn)化(50ng/孔)，與空的載體pCDNA3.1DNA調(diào)整至每孔DNA總量為4g，重復(fù)三次。組A在未刺激細(xì)胞(淺色陰影)和TNFα(10ng/ml)處理的細(xì)胞(深色陰影)中的2XNF-kB Luc受體基因的折疊誘導(dǎo)。刺激后12小時(shí)制備裂解液。圖示出各自的試驗(yàn)結(jié)果。組B用鞭毛蛋白(1μg/ml)處理如圖8A轉(zhuǎn)染的HT29細(xì)胞，制備裂解液，如圖8A所示分析。圖示出各自的試驗(yàn)結(jié)果。
圖9表示小腸上皮細(xì)胞的鞭毛蛋白刺激導(dǎo)致了一系列的TLR基因激活。用鞭毛蛋白(1mg/ml)刺激HT29細(xì)胞，3小時(shí)后用Trizol分離RNA，并用該RNA合成第一鏈cDNA。圖示出如所述用每種TLR基因特異性引物產(chǎn)生的RT-PCR產(chǎn)物。用β肌動(dòng)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)模式。
圖10表示在多種細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)TLR5，其對(duì)鞭毛蛋白具有不同的反應(yīng)。組A從未刺激的T84、HT29、A549、HeLa、293T、T98G細(xì)胞制備全細(xì)胞提取液，在8％的SDS-PAGE凝膠上分離，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用抗TLR5抗體雜交作免疫印跡分析(IB)。通過(guò)用抗肌動(dòng)蛋白抗體雜交檢測(cè)加入的蛋白量。組BHT29、A549、HeLa、293T和T98G細(xì)胞未處理(——)、用鞭毛蛋白(F)處理或用TNFα(T)處理，45分鐘后制備WCEs，并用于EMSA以監(jiān)控NF-kB DNA的結(jié)合活性。用p65(RelA)特異抗體復(fù)合物的超遷移檢測(cè)NF-kB帶移位的確實(shí)性。
圖11表示p53缺陷加速了小鼠中GI癥狀的發(fā)展。組A腹腔注射PFTα(10mg/kg)從一次9Gy量的γ射線(xiàn)以及部分累積射線(xiàn)量12.5Gy(5×2.5Gy)中保護(hù)C57B1/6J小鼠(如果沒(méi)有指明，此處和以下使用6-8周雄性小鼠)。對(duì)于一次受12.5和25GyIR的小鼠，PFTα在小鼠的生存上沒(méi)有作用(表示出各自的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；以每分鐘4Gy的劑量速率使用Shepherd4000 Ci銫137輻射源)。組B在對(duì)低劑量(10Gy)和高劑量(15Gy)的γ射線(xiàn)的相對(duì)敏感性上野生型和p53缺陷的C57B1/6J小鼠不同與p53缺陷小鼠相比，野生型對(duì)10Gy更敏感，而對(duì)15Gy更有抗性。組C用11Gy的全身γ射線(xiàn)處理小鼠，12小時(shí)后從野生型或p53缺陷的同源的C57B1/6J小鼠注射1.5×107骨髓細(xì)胞(此劑量在未重建(nonreconstituted)的對(duì)照組小鼠中引起100％的死亡率)。兩個(gè)月后，造血功能完全恢復(fù)后，用全身γ射線(xiàn)量15Gy處理動(dòng)物，表現(xiàn)骨髓p53狀態(tài)不同的兩組間的死亡率沒(méi)有差別。組D15Gyγ射線(xiàn)輻射后在指定的時(shí)間上野生型和p 53缺陷小鼠的小腸損傷動(dòng)力學(xué)的比較表明在p53缺陷小鼠中損傷加速(蘇木素-曙紅染色，石蠟切片；放大X125)。如果是陰窩切片，24h組包括TUNEL染色圖片厚重的凋亡在野生型很明顯，而在p53缺陷上皮不明顯。
圖12表明在野生型和p53缺陷小鼠的小腸中細(xì)胞增殖和生存的動(dòng)力學(xué)。組A用IR處理后野生型和p53缺陷小鼠的小腸中增值率的比較。(左)用14C胸腺嘧啶脫氧核苷(每只動(dòng)物10μCi)腹腔注射處理或未處理的4周齡野生型和p53缺陷小鼠用15Gyγ射線(xiàn)照射的放射自顯影的全身切片(放大X1.7)(Westphal et al 1997)。箭頭指小腸。(右)15Gyγ射線(xiàn)照射后在不同時(shí)間的野生型和p53缺陷小鼠小腸中BrdU結(jié)合的比較。在殺死小鼠前2小時(shí)注射BrdU(50mg/kg)，如前所述進(jìn)行免疫染色(Watson & Pritchard 2000)。在更大倍數(shù)下(X400)表示96h組的片斷。組B15Gyγ射線(xiàn)照射后不同時(shí)間上在野生型和p53缺陷小鼠小腸中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞/陰窩數(shù)的比較。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上分析3只動(dòng)物，從每個(gè)動(dòng)物中制備5個(gè)回腸橫切片，用顯微鏡分析，以評(píng)估陰窩和絨毛數(shù)。在X200放大倍數(shù)下(100-30陰窩)在5個(gè)隨機(jī)的視野下計(jì)數(shù)陰窩中的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，用BrdU陽(yáng)性細(xì)胞平均值作圖。組C15Gyγ射線(xiàn)照射后不同時(shí)間上在野生型和p53缺陷小鼠小腸中追蹤BrdU標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)量和位置。照射前30注射BrdU，在指定時(shí)間處死小鼠。在p53-缺陷小鼠中觀察到從陰窩向絨毛的加速遷移，及隨后的標(biāo)記細(xì)胞的快速消失。
圖13表明重組鞭毛蛋白能激活NF-kB。
圖14顯示了檢測(cè)鞭毛蛋白從輻射中保護(hù)小鼠的各種試驗(yàn)。向C56BL6小鼠(6周齡，雄性)，每組10只靜脈注射2.0μg(0.1mg/kg)或5.0μg(0.25mg/kg)溶于PBS的鞭毛蛋白。四小時(shí)后，用15Gy照射小鼠，每天檢測(cè)小鼠的生存。
圖15顯示靜脈注射或未注射0.25mg/kg的鞭毛蛋白的小鼠用15Gyγ射線(xiàn)處理后的小腸上皮組織切片(HE染色)。與鞭毛蛋白處理的小鼠的接近正常的組織形態(tài)學(xué)相比，對(duì)照組小鼠的隱窩和絨毛有完全的損傷。
圖16顯示鞭毛蛋白在小鼠對(duì)全身γ射線(xiàn)量10Gy的敏感性中的作用。
圖17顯示在小鼠對(duì)全部體重γ射線(xiàn)量13Gy(左)和10Gy(右)的敏感性中照射前在指定時(shí)間靜脈注射鞭毛蛋白的作用。
圖18顯示鞭毛蛋白在小鼠對(duì)全部體重γ射線(xiàn)量10，13和15Gy的敏感性中的作用。
圖19顯示細(xì)菌鞭毛蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。F41和Ca骨架痕跡、疏水核心分布的結(jié)構(gòu)信息。四個(gè)不同的疏水核心是D1、D2a、D2b、和D3。所有的疏水側(cè)鏈原子用Ca骨架顯示。側(cè)鏈原子用顏色的標(biāo)記Ala，黃色；Leu，Ile，或Val，橙色；Phe和Tyr，紫色(碳鏈)和紅色(氧原子)。C，鞭毛蛋白氨基酸序列中的不同結(jié)構(gòu)特性的位置和結(jié)構(gòu)域。如所示，從上到下F41片段用藍(lán)色表示；三個(gè)b-薄層折疊為褐色；有螺旋的二級(jí)結(jié)構(gòu)分布為黃色；b-結(jié)構(gòu)為綠色，b-折轉(zhuǎn)為紫色；每50個(gè)殘基的tic標(biāo)記為藍(lán)色；D0，D1，D2，D3結(jié)構(gòu)域；在第一元素中的軸向亞單位接觸區(qū)為青色；高度保守的氨基酸序列為紅色，變異區(qū)為紫羅蘭色；F41區(qū)的點(diǎn)突變產(chǎn)生不同的超盤(pán)繞元素。底下的字母表示突變?cè)氐男螒B(tài)學(xué)L(D107E，R124A，R124S，G426A)，L-型直鏈；R(A449V)，R-型直鏈；C(D313Y，A414V，A427V，N433D)，彎曲的33。(Samatey等Nature，2001)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明是基于從由壓力引起的凋亡中保護(hù)正常的細(xì)胞和組織的，該壓力包括，但不局限于，化療、放療和輻射。在細(xì)胞中有兩個(gè)主要的調(diào)控凋亡的機(jī)制p53路徑(前凋亡)和NF-kB途徑(抗凋亡)。兩種途徑在腫瘤中通常都不受控制p53通常缺失，而NF-kB變得組成型激活。因此，在正常細(xì)胞中抑制p53和激活NF-kB可以防止其被壓力引起的死亡，如腫瘤治療，但并不會(huì)使腫瘤細(xì)胞對(duì)抗治療，因?yàn)檫@些控制機(jī)制不受控制了。這與傳統(tǒng)的p53和NF-kB的觀念相反，傳統(tǒng)認(rèn)為p53和NF-kB應(yīng)分別被激活和抑制。
本發(fā)明涉及誘導(dǎo)NF-kB的活性，以從凋亡中保護(hù)正常細(xì)胞。通過(guò)在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)NF-kB的活性，可以從細(xì)胞壓力和細(xì)胞老化造成的凋亡中保護(hù)正常細(xì)胞，該壓力發(fā)生在腫瘤治療和極高熱中；暴露于有害劑量的射線(xiàn)，如核能廠(chǎng)、國(guó)防工業(yè)或放射藥物生產(chǎn)的工人，士兵。在許多腫瘤細(xì)胞中，由于NF-kB是組成型被激活的，誘導(dǎo)NF-kB活性可以從凋亡中保護(hù)細(xì)胞，而對(duì)腫瘤細(xì)胞沒(méi)有益處。一旦正常細(xì)胞被修復(fù)，NF-kB活性可恢復(fù)到正常水平。NF-kB活性可被誘導(dǎo)以保護(hù)此種放療和化療敏感組織，如造血系統(tǒng)(包括免疫系統(tǒng))，內(nèi)臟上皮和毛囊。
NF-kB活性誘導(dǎo)子還可用于各種其他的應(yīng)用。哺乳動(dòng)物暴露于各種嚴(yán)重狀態(tài)引起的病理后果和死亡可來(lái)源于對(duì)壓力反應(yīng)的正常生理機(jī)制的激活，這些狀態(tài)包括但不局限于，射線(xiàn)、創(chuàng)傷、中毒、感染、老化、和高溫應(yīng)激，該生理機(jī)制的激活如誘導(dǎo)漸進(jìn)的細(xì)胞死亡(凋亡)或釋放生物活性蛋白，細(xì)胞因子。
凋亡通常具有從創(chuàng)傷或遺傳上損傷的細(xì)胞中“清理”組織的功能，而細(xì)胞因子可動(dòng)員生物體的防御系統(tǒng)對(duì)抗病源?？墒窃趪?yán)重?fù)p傷的狀態(tài)下，兩種壓力反應(yīng)自身可引起死亡。例如，射線(xiàn)導(dǎo)致的死亡可來(lái)源于發(fā)生在造血、免疫和消化系統(tǒng)的大量p53介導(dǎo)的凋亡。合理的藥物調(diào)節(jié)NF-kB可在嚴(yán)重的壓力下增強(qiáng)生存。控制這些因子可允許對(duì)損傷器官中的細(xì)胞炎癥反應(yīng)和生死抉擇進(jìn)行控制。
NF-kB的保護(hù)作用可通過(guò)多種基因的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)，這些基因編碼a)阻斷兩種主要凋亡途徑的抗凋亡蛋白，b)誘導(dǎo)HP和其他干細(xì)胞增殖和生存的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，和c)潛伏的ROS-清掃抗過(guò)氧化蛋白，如MnSOD(SOD-2)。因此，通過(guò)NF-kB短暫激活的輻射防護(hù)，不僅僅可以實(shí)現(xiàn)腫瘤患者的凋亡抑制，由于同時(shí)發(fā)生的免疫刺激作用，還可以降低二級(jí)癌癥癥發(fā)生率的可能性，如果通過(guò)激活Toll類(lèi)似受體而實(shí)現(xiàn)NF-kB被激活。
作為靶，NF-kB途徑的另一個(gè)吸引特性是其被認(rèn)為是輻射防護(hù)劑的多種天然因子激活。其中，有多種病源相關(guān)的分子類(lèi)型(PAMPs)。PAMPs是宿主生物體中不存在的分子，其特征是病源的大組，不容易突變。他們被Toll類(lèi)似受體(TLRs)識(shí)別，Toll類(lèi)似受體是內(nèi)在免疫的主要感受器成分。TLRs直接地或通過(guò)細(xì)胞因子的釋放誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的遷移或激活，可作為免疫系統(tǒng)的初級(jí)警告機(jī)制。TLRs是I型膜蛋白，作為同或異二聚物發(fā)揮作用。與配體結(jié)合后，TLRs募集MyD88蛋白，對(duì)于多數(shù)TLRs，MyD88蛋白是不可缺少的信號(hào)轉(zhuǎn)接器。隨后的信號(hào)系列產(chǎn)生的作用包括(i)激活NF-kB途徑，(ii)激活MAPKs，包括Jun N-末端激酶(JNK)。Toll-類(lèi)受體配體激活的NF-kB途徑產(chǎn)生了作為潛伏輻射防護(hù)劑的配體吸引物。不像細(xì)胞因子，許多PAMPs除激活TLRs外沒(méi)什么作用，因此不產(chǎn)生副作用。而且，許多PAMPs存在于人類(lèi)。
與其免疫細(xì)胞的激活功能一致，所有的TLRs在脾和外周血白細(xì)胞中表達(dá)，在其他的淋巴器官和白細(xì)胞系中具有更多的TLR特異模式表達(dá)。可是，TLRs也表達(dá)在身體的其他組織和器官，如TLR1廣范表達(dá)，TLR5也表達(dá)在GI上皮和內(nèi)皮，TLRs2、6、7、8已知在肺表達(dá)。
1.定義應(yīng)當(dāng)理解此處使用的術(shù)語(yǔ)僅僅是為了描述特定的實(shí)施例而不是限制本發(fā)明。必須注意，如說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中所使用的，單數(shù)“a”“an”和“the”除非特別指明，包括多重指代的含義。
在本文使用的術(shù)語(yǔ)“給藥”，當(dāng)用于描述誘導(dǎo)NF-kB活性的制劑的劑量時(shí)，指該制劑的一次或多次給藥劑量。
在本文使用的術(shù)語(yǔ)“類(lèi)似物”，當(dāng)用于肽或多肽的上下文時(shí)，指包含一種或多種非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸或傳統(tǒng)氨基酸的其他結(jié)構(gòu)變異的肽或多肽。
在本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”指IgG、IgM、IgA、IgD、或IgE類(lèi)抗體，或其片段或衍生物，包括Fab、F(ab’)2、Fd和單鏈抗體、微型雙功能抗體、雙特異抗體、雙功能抗體、及其衍生物。抗體可以是單克隆抗體、多克隆抗體、親和力純化的抗體、或其混合物，其呈現(xiàn)出對(duì)相關(guān)抗原決定簇或其衍生的序列的足夠的特異性結(jié)合。抗體還可以是嵌合的抗體。可以通過(guò)一種或多種本領(lǐng)域已知的化學(xué)的、肽或多肽半族的連接衍生出抗體?？贵w還可以與化學(xué)半族連接。
本文中使用的“凋亡”指細(xì)胞死亡的形式，包括胞內(nèi)細(xì)胞器完整性保存而細(xì)胞體積的漸進(jìn)收縮；如光鏡或電鏡觀察到的染色體濃縮(即核濃縮)；和/或DNA斷裂成核小體大小的片段，如離心沉淀分析所確定的。細(xì)胞死亡發(fā)生在細(xì)胞膜完整性缺失時(shí)(如膜泡)，完整的細(xì)胞片段(凋亡小體)被巨噬細(xì)胞吞胞(engulfment)。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“癌癥”指任何一種特征為對(duì)抗凋亡刺激的狀態(tài)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“癌癥治療”指任何本領(lǐng)域中已知的治療癌癥的方法，包括但不局限于化療和放療。
本文的術(shù)語(yǔ)“與結(jié)合”用于描述投藥誘導(dǎo)NF-kB活性的制劑和額外的治療時(shí)，在額外的治療前、與其一同或在其后或與其結(jié)合給藥。
本文的術(shù)語(yǔ)“衍生物”，當(dāng)用于肽或多肽的上下文時(shí)，指不同于初級(jí)結(jié)構(gòu)(氨基酸或氨基酸類(lèi)似物)的肽或多肽。通過(guò)描述，衍生物可以通過(guò)糖基化、轉(zhuǎn)錄后修飾的一種方式而不同。例如肽或多肽由于在異種系統(tǒng)表達(dá)可以展現(xiàn)糖基化模式。如果保留至少一種生物學(xué)活性，那么這些肽或多肽是根據(jù)本發(fā)明的衍生物。其他衍生物包括但不局限于具有共價(jià)修飾的N-或C-末端的融合肽或融合多肽，PEG化的(PEGylated)肽和多肽，與脂質(zhì)半族相關(guān)的肽或多肽、烷基化的肽或多肽、通過(guò)氨基側(cè)鏈功能組與其它肽、多肽或化學(xué)物連接的肽或多肽，本領(lǐng)域中應(yīng)該理解的額外的修飾。
本文中的術(shù)語(yǔ)“鞭毛蛋白”指的是任何來(lái)源的鞭毛蛋白，包括但不局限于任何細(xì)菌種。鞭毛蛋白可以是沙門(mén)氏菌種。還可以特異地是所述鞭毛蛋白的片段、變異、類(lèi)似物、同源物、或衍生物及其結(jié)合。此處所述的各種片段、變異、類(lèi)似物、同源物、或衍生物可以與野生型鞭毛蛋白具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、或99％的同一性。
本文的術(shù)語(yǔ)“片段”，當(dāng)用于肽或多肽的上下文時(shí)，指8-50個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽。片段的長(zhǎng)度可以是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)氨基酸。
本文中的術(shù)語(yǔ)“同源物”，當(dāng)用于肽或多肽的上下文時(shí)，指享有共同進(jìn)化祖先的肽或多肽。
本文的術(shù)語(yǔ)“潛伏的TGFβ”指不具活性的TGFβ前體。潛伏的TGFβ可以是含有活性TGFβ和潛伏相關(guān)肽(LAP)的TGFβ前體。潛伏的TGFβ還可以含有連接到潛伏的TGFβ結(jié)合蛋白的LAP。潛伏的TGFβ還可以是大的潛伏的復(fù)合物。進(jìn)一步，潛伏的TGFβ可以被修飾的潛伏的TGFβ，從而轉(zhuǎn)染成活性TGFβ的速率或轉(zhuǎn)染成TGFβ的能力降低。被修飾的潛伏的TGFβ可以是，例如，防止或降低轉(zhuǎn)染為活性TGFβ的TGFβ變異。
本文的術(shù)語(yǔ)“TGFβ”指任何活性或潛伏的TGFβ的異構(gòu)體，包括但不局限于TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβ4、或TGFβ5及其組合。還可以特異地指所述TGFβ異構(gòu)體的片段、變異、類(lèi)似物、同源物、或衍生物，及其組合。此處所述的各種片段、變異、類(lèi)似物、同源物、或衍生物可以與TGFβ異構(gòu)體具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、或99％的同一性。
此處所述的術(shù)語(yǔ)“治療”或“治療”，當(dāng)指從狀態(tài)中保護(hù)哺乳動(dòng)物時(shí)，意味著保護(hù)、抑制、壓制或清除狀態(tài)。保護(hù)狀態(tài)包括在狀態(tài)發(fā)生前向哺乳動(dòng)物投藥本發(fā)明的組合物。抑制狀態(tài)涉及在狀態(tài)誘導(dǎo)后但在臨床癥狀前向哺乳動(dòng)物投藥本發(fā)明的組合物。壓制狀態(tài)涉及臨床癥狀出現(xiàn)后向哺乳動(dòng)物投藥本發(fā)明的組合物使此狀態(tài)降低或維持。消除狀態(tài)涉及臨床癥狀出現(xiàn)后向哺乳動(dòng)物投藥本發(fā)明的組合物使哺乳動(dòng)物不再遭受此種狀態(tài)。
如此處所述，術(shù)語(yǔ)“腫瘤細(xì)胞”指對(duì)抗凋亡刺激的任何細(xì)胞。
如此處所述，術(shù)語(yǔ)“變異”當(dāng)在肽或多肽的上下文時(shí)，指通過(guò)氨基酸的插入、缺失或保守性替代使肽或多肽的氨基酸序列不同，但保留了至少一種生物功能。為了本發(fā)明的目的，“生物活性”包括，但不局限于通過(guò)特異抗體的結(jié)合能力。氨基酸的保守替代，即，用具有相似特性的不同氨基酸取代(如，親水性、帶電區(qū)的程度和分布)的氨基酸可被本領(lǐng)域中作所識(shí)別典型地涉及較小變化。這些小變化可部分地通過(guò)考慮氨基酸的疏水指數(shù)鑒別，如本領(lǐng)域中已知的。Kyte等J.Mol.Biol.157105-132(1982)。氨基酸的疏水指數(shù)是以考慮它的疏水性和電荷為基礎(chǔ)的。本領(lǐng)域中已知相似疏水指數(shù)的氨基酸可被取代，仍保留蛋白功能。在一方面，疏水指數(shù)2的氨基酸被取代。氨基酸的疏水性還可被用于揭示可導(dǎo)致蛋白質(zhì)保持功能的取代基。在肽中大部分氨基酸的疏水性可允許計(jì)算該肽的最大局部平均疏水性，其是一個(gè)有用的指數(shù)，被報(bào)道與抗原性和免疫原性有關(guān)。美國(guó)專(zhuān)利No.4554101在此引入作參考。具有相似疏水性值的氨基酸取代可使肽保留生物活性，例如免疫原性，如本領(lǐng)域中知道的。在一方面，用親水性相差±2的氨基酸中進(jìn)行取代。氨基酸的疏水性和親水性指數(shù)都受該氨基酸特定的側(cè)鏈的影響。與此觀察相一致的，與生物功能一致的氨基酸取代被認(rèn)為是依賴(lài)氨基酸的相對(duì)相似性，特別是這些氨基酸的側(cè)鏈，如通過(guò)疏水性、親水性、電荷、大小、和其他特性所揭示的。
2.治療方法a.組成型地激活的NF-kB腫瘤本發(fā)明涉及治療遭受組成型地激活NF-kB癌癥癥的哺乳動(dòng)物的治療，包括向哺乳動(dòng)物投藥含有治療潛伏劑量的誘導(dǎo)NF-kB活性的制劑。誘導(dǎo)NF-kB活性的制劑可以與腫瘤治療物聯(lián)合給藥。
該制劑可以與其它抗腫瘤治療如化療或放療同時(shí)或分次(metronomically)給藥。此處的術(shù)語(yǔ)“同時(shí)”或“同時(shí)地”指其它抗腫瘤治療和本發(fā)明的化合物在48小時(shí)、優(yōu)選24小時(shí)、更優(yōu)選12小時(shí)、更優(yōu)選6小時(shí)、最優(yōu)選3小時(shí)或更少時(shí)間的間隔。此處的術(shù)語(yǔ)“分次”指與化療在不同的時(shí)間內(nèi)，以某種相對(duì)重復(fù)給藥和/或化療方案的頻率給藥。
可以在任何暴露于腫瘤治療前的時(shí)間點(diǎn)上給藥，包括但不局限于暴露前48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、3、2、或1小時(shí)?？梢栽谌魏文[瘤治療后的時(shí)間點(diǎn)上給藥，包括但不局限于暴露后1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48小時(shí)。
腫瘤治療可以包括給藥細(xì)胞毒性制劑或抑制細(xì)胞的制劑，或其結(jié)合。細(xì)胞毒性制劑防止癌癥細(xì)胞增殖，其通過(guò)(1)干擾細(xì)胞復(fù)制DNA的能力(2)誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞中的細(xì)胞死亡或凋亡。抑制細(xì)胞的制劑通過(guò)調(diào)節(jié)、干擾或抑制細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的過(guò)程發(fā)揮作用，其調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖有時(shí)在低的持續(xù)水平。
可作為細(xì)胞毒性劑的化合物種類(lèi)包括烷化劑(包括但不局限于氮芥子氣、次乙亞胺衍生物、烷基磺酸鹽、亞硝基脲、和三氮烯)尿嘧啶芥子氣、氮芥、環(huán)磷酰胺(Cytoxan)、異環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三乙烯基-三聚氰胺、三乙烯基硫磷酰胺、白消安、卡氯芥、環(huán)己亞硝脲、鏈脲霉素、達(dá)卡巴嗪、和蒂清；抗代謝物(包括但不局限于葉酸抗體、嘧啶類(lèi)似物、嘌呤類(lèi)似物、和腺苷脫氨酶抑制劑)甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟脲苷、阿糖胞苷、6-巰基嘌呤、6-硫鳥(niǎo)嘌呤、氟達(dá)拉濱磷酸鹽、pentostatine、和gemcitabine；天然產(chǎn)品及其衍生物(例如，長(zhǎng)春蔓生物堿、抗腫瘤抗生素、酶、淋巴因子和鬼臼毒素)長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春地辛、博來(lái)霉素、放線(xiàn)菌素D、正定霉素、阿霉素、epirubicin、柔紅霉素、阿糖胞苷、泰素(泰素在商售上為T(mén)axol)，光神霉素、去氧間型霉素、絲裂霉素-C、1-天冬酰胺酶、干擾素(優(yōu)選IFN-α)、足葉乙甙和替尼泊苷。
其他的增生的細(xì)胞毒制劑是navelbene、CPT-11、阿那曲唑、來(lái)曲唑、吉西他濱、reloxafine、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺和droloxafine。
影響微管的制劑干擾細(xì)胞有細(xì)分裂，于是產(chǎn)生了本領(lǐng)域熟知的細(xì)胞毒性。用于本發(fā)明的影響微管的制劑包括，但不局限于allocolchicine(NSC406042)、halichondrinB(NSC609395)、秋水仙堿(NSC757)、秋水仙堿衍生物(如NSC33410)、dolastatin10(NSC376128)、美登素(NSC153858)、rhizoxin(NSC332598)、paclitaxel(Taxol，NSC125973)、Taxol衍生物(如，衍生物(如NSC608832)，thiocolchicine NSC361792)、三苯甲半胱氨酸(NSC83265)、長(zhǎng)春堿硫酸鹽(NSC49842)、長(zhǎng)春新堿硫酸鹽(NSC67574)、天然和合成的埃坡霉素，包括但不局限于埃坡霉素A、埃坡霉素B和discodermolide(見(jiàn)Service，(1996)Science，2742009)磷雌氮芥、nocodazole、MAP4等等。這些制劑的例子也描述在Bulinski(1997)J Cell Sci 1103055-3346；Panda(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9410560-10564；Muhlradt(1997)Cancer Res.573344-3346；Nicolaou(1997)Nature 387268-272；Vasquez(1997)Mol Biol Cell 8973-985；和Panda(1996)JBiolChem27129807-29812。
另外適合的細(xì)胞毒制劑還有epidophyllotoxin；抗新生物酶；topoisomerase抑制劑；甲基芐肼；米托蒽醌；鉑聯(lián)合復(fù)合物如順式鉑和炭鉑；生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑；生長(zhǎng)抑制劑；抗激素治療劑；亞葉酸；恩世康；和造血生長(zhǎng)因子。
細(xì)胞生長(zhǎng)抑劑可以包括但不局限于激素和類(lèi)固醇(包括合成的類(lèi)似物)17α炔雌醇、己烯雌酚、睪丸激素、強(qiáng)的松、氟羚甲基睪丸素、屈他雄酮丙酸鹽、睪丸激素、甲地孕酮、甲基脫氫皮質(zhì)甾醇、甲基睪丸激素、脫氫皮質(zhì)甾醇、去炎松、hlorotrianisene、羥孕酮、氨基導(dǎo)眠能、磷雌氮芥、安宮黃體酮醋酸鹽、醋酸亮丙瑞林、氟化酰胺、托瑞米芬、諾雷德。
其他的細(xì)胞生長(zhǎng)抑劑是抗血管生成劑，如矩陣金屬蛋白酶抑制劑、和其他的VEGF抑制劑，如抗VEGF抗體和小分子如ZD6474和SU6668頁(yè)包括在內(nèi)。Genetech的抗Her2抗體也可以被使用。一種合適的EGFR抑制劑是EKB-569(不可逆的抑制劑)。還包括對(duì)EGFR具免疫特異性的Imclone抗體C225和src抑制劑。
作為細(xì)胞生長(zhǎng)抑劑的合適的制劑還包括Casodex(bicalutamide，Astra Zeneca)，其提供了男性激素依賴(lài)的癌癥非增殖。依然另外一種細(xì)胞生長(zhǎng)抑劑的例子是男性激素Tamoxifen，其抑制雌激素依賴(lài)的乳腺癌癥的增殖或生長(zhǎng)。細(xì)胞增殖信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑是細(xì)胞生長(zhǎng)抑劑。代表的例子包括表皮生長(zhǎng)因子抑制劑、Her-2抑制劑、MEK-1激酶抑制劑、MAPK激酶抑制劑、PI3抑制劑、Src激酶抑制劑、和PDGF抑制劑。
可以根據(jù)本發(fā)明治療各種腫瘤，包括但不局限于膀胱(包括加速的和轉(zhuǎn)移的膀胱癌癥)，乳腺、結(jié)腸(包括結(jié)腸直腸癌癥)，腎，肝臟，肺(包括小和非小細(xì)胞肺癌癥和肺腺癌癥)，卵巢，前列腺，睪丸，泌尿生殖道，淋巴系統(tǒng)，直腸，喉，胰腺(包括外分泌胰腺癌癥)，食管，胃，膽囊，子宮，甲狀腺，和皮膚(包括鱗狀細(xì)胞癌癥)；淋巴血系的造血系統(tǒng)癌癥，包括白血病，急性淋巴細(xì)胞白血病，急性淋巴母細(xì)胞白血病，B-細(xì)胞淋巴瘤，T-細(xì)胞淋巴瘤，赫杰森氏病，非赫杰森氏淋巴瘤，毛細(xì)胞淋巴瘤，組織細(xì)胞淋巴瘤，和Burketts淋巴瘤；骨髓血系的造血腫瘤，包括急、慢性髓性白血病，再生障礙性疾病，骨髓白血病和原髓細(xì)胞白血??；中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)腫瘤包括星細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、和雪旺氏細(xì)胞瘤；間葉細(xì)胞來(lái)源的腫瘤包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和骨肉瘤；其他的腫瘤包括黑素瘤、xenodermapigmentosum、keratoactanthoma、精原細(xì)胞瘤、甲狀腺濾泡癌癥、畸胎癌癥。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明用于治療胃腸道腫瘤。
B腫瘤治療副作用的治療本發(fā)明還涉及哺乳動(dòng)物的治療方法，該哺乳動(dòng)遭受組成型活性NF-kB癌癥癥治療所引起的正常組織損傷，該方法包括向哺乳動(dòng)物投藥含有治療潛伏量的誘導(dǎo)NF-kB活性的制劑的組合物。誘導(dǎo)NF-kB活性的制劑可以與上述腫瘤治療聯(lián)合給藥。
C細(xì)胞老化的調(diào)節(jié)本發(fā)明還涉及在哺乳動(dòng)物中調(diào)節(jié)細(xì)胞老化的方法，其包括向哺乳動(dòng)物投藥含有治療潛伏量的誘導(dǎo)NF-kB活性的制劑的組合物。誘導(dǎo)NF-kB活性的制劑可以其他治療聯(lián)合給藥。
該制劑可以在其它治療前任何時(shí)間給藥，包括但不局限于48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、3、2、或1小時(shí)。該制劑可以在其它治療后任何時(shí)間給藥，包括但不局限于給藥后1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48小時(shí)。
D治療壓力本發(fā)明還涉及治療壓力引起的正常組織損傷的的哺乳動(dòng)物的方法，其包括向哺乳動(dòng)物投藥含有治療潛伏量的誘導(dǎo)NF-kB活性的制劑的組合物。誘導(dǎo)NF-kB活性的制劑可以其他治療聯(lián)合給藥。壓力可以來(lái)源于任何原因，包括但不局限于射線(xiàn)、創(chuàng)傷、中毒、感染、和高熱應(yīng)激。
含有NF-kB誘導(dǎo)劑的組合物可以在暴露于壓力前的任何時(shí)間給藥，包括但不局限于48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、3、2、或1小時(shí)。含有NF-kB誘導(dǎo)劑的組合物可以在暴露于壓力后的任何時(shí)間給藥，包括但不局限于壓力后1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48小時(shí)。
E放射本發(fā)明還涉及從射線(xiàn)暴露中保護(hù)細(xì)胞的方法。離子輻射造成的正常細(xì)胞的損傷和死亡是對(duì)受射細(xì)胞的直接放射誘導(dǎo)的損傷和對(duì)涉線(xiàn)誘導(dǎo)壓力的活性遺傳性漸進(jìn)的細(xì)胞反應(yīng)共同導(dǎo)致的死亡或凋亡。在許多放射敏感的器官中凋亡在細(xì)胞缺失中起重要作用(即，造血和免疫系統(tǒng)，消化道上皮等)，其衰竭確定了生物體一般的放射敏感性。
對(duì)離子射線(xiàn)的暴露(IR)可以是短期的或長(zhǎng)期的，可以是一次或多次劑量，可以是全身或局部。因此，核事故或軍事攻擊可涉及全身暴露于一次的高劑量射線(xiàn)(有時(shí)隨后有長(zhǎng)期的放射性同位素中毒)。對(duì)于骨髓移植患者的預(yù)處理也是同樣(其嚴(yán)格控制使用的量)，當(dāng)有必要為供體骨髓準(zhǔn)備造血器官時(shí)，從受體血前體中“清除”他們。腫瘤治療可涉及多次劑量的局部放射，如果全身放射，則其大大超過(guò)了致死量。放射性同位素的中毒和治療導(dǎo)致了靶器官長(zhǎng)期局部暴露于射線(xiàn)(如，125I吸入的情況的甲狀腺)。最后，有許多離子射線(xiàn)的物理形式在其生物作用的嚴(yán)重性中顯著不同。
在分子和細(xì)胞水平，放射粒子能產(chǎn)生DNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜和其他大分子結(jié)構(gòu)的斷裂和交聯(lián)。離子射線(xiàn)還可以通過(guò)增加自由基和活性氧種(ROS)誘導(dǎo)細(xì)胞成分的二級(jí)損傷。多種修復(fù)系統(tǒng)對(duì)抗此損傷，如恢復(fù)DNA完整性和保真度的許多DNA修復(fù)途徑，清除自由基和ROS及減少被氧化的蛋白和脂質(zhì)的抗氧化化學(xué)物和酶。細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)DNA損傷和延長(zhǎng)細(xì)胞周期性進(jìn)展，直至損傷恢復(fù)或決定細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或漸進(jìn)性細(xì)胞死亡(凋亡)。
射線(xiàn)可以引起哺乳動(dòng)物器官損傷，從野生型突變和低劑量的致癌癥作用到幾乎導(dǎo)致死亡的高劑量。生物體的整個(gè)放射敏感性通過(guò)許多敏感組織發(fā)生的病理改變決定，其包括造血系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和具有高速率細(xì)胞反轉(zhuǎn)的分化的上皮細(xì)胞。
導(dǎo)致死亡的γ射線(xiàn)的急性病理作用隨劑量不同而不同，通過(guò)某些器官的衰竭而確定，其定義了生物體對(duì)每種特定劑量的敏感性的閾值。因此，低劑量致死發(fā)生于骨髓發(fā)育不全，而通過(guò)誘導(dǎo)腸道癥狀的中劑量加快了殺傷。非常高的射線(xiàn)引起神經(jīng)壞死而導(dǎo)致立即死亡。
射線(xiàn)急性毒性期存活的生物體可遭受長(zhǎng)的遠(yuǎn)期的結(jié)果，包括受輻射幾個(gè)月或幾年后，射線(xiàn)誘導(dǎo)的癌癥癥和暴露器官的纖維化(如腎臟，肝臟或肺)。
細(xì)胞DNA是IR的主要靶子，其通過(guò)直接或間接的機(jī)制(自由基為基礎(chǔ)的)引起多種類(lèi)型的DNA損傷(基因毒的壓力)。所有的有機(jī)體保留了DNA修復(fù)系統(tǒng)，其可地恢復(fù)放射損傷的DNA；DNA修復(fù)過(guò)程中的錯(cuò)誤可導(dǎo)致突變。
腫瘤通常對(duì)γ射線(xiàn)更敏感，可用多種對(duì)正常組織產(chǎn)生相對(duì)低的損傷局部劑量治療，。但是，在一些情況下，正常組織的損傷是腫瘤治療中γ射線(xiàn)應(yīng)用的一個(gè)限制性因子。在傳統(tǒng)的腫瘤治療中使用γ射線(xiàn)、三維適形、或更聚焦點(diǎn)的BeamCath傳送也具有劑量限制的毒性，其是由累積的射線(xiàn)產(chǎn)生，并誘導(dǎo)快速再生的正常組織的干細(xì)胞損傷，如骨髓和胃腸(GI)道。
在高劑量下，射線(xiàn)誘導(dǎo)的致死與所述的造血和胃腸射線(xiàn)癥狀相關(guān)。造血癥狀的特征是造血細(xì)胞和其祖先細(xì)胞的缺失，導(dǎo)致了不能生成血和淋巴系統(tǒng)。死亡通常是感染(免疫抑制的結(jié)果)、出血和/或貧血的結(jié)果。GI癥狀由腸道上皮中多數(shù)細(xì)胞死亡引起，主要是小腸，隨后是腸壁的不完整，并死于菌血癥和敗血癥。造血癥狀通常在低劑量射線(xiàn)比較多，導(dǎo)致比GI癥狀延遲的死亡。
在過(guò)去，射線(xiàn)防護(hù)劑典型的是抗氧化劑-包括合成的和天然的。最近，細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子被加入到射線(xiàn)防護(hù)劑中；這些射線(xiàn)防護(hù)劑的機(jī)制被認(rèn)為是有助于敏感組織的再生。在兩組射線(xiàn)防護(hù)劑中沒(méi)有明確的功能區(qū)別，可是，一些細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞抗氧化蛋白的表達(dá)，如過(guò)氧化鎂岐化酶(MnSOD)和金屬硫蛋白。
特定制劑的防護(hù)檢測(cè)可用劑量調(diào)節(jié)因子(DMF或DRF)表示。用一定范圍的射線(xiàn)劑量照射輻射防護(hù)劑處理的目標(biāo)物和未處理的對(duì)照物，然后比較其生存或其他終結(jié)點(diǎn)，從而確定DMF。DMF通常被計(jì)算30天的生存率(用對(duì)照組的LD50/30除以藥物處理組的LD50/30)，并定量造血系統(tǒng)的保護(hù)。為了分析胃腸道系統(tǒng)的保護(hù)，LD50和DMF被計(jì)算6或7天的生存。除非特別指明，此處的DMF值是30天的。
NF-kB誘導(dǎo)劑在細(xì)胞水平以及在整個(gè)有機(jī)體水平具有強(qiáng)的促生存活性。為了對(duì)超致死劑量的射線(xiàn)反應(yīng)，NF-kB誘導(dǎo)劑抑制腸道和造血系統(tǒng)癥狀，其是主要的急性射線(xiàn)暴露的致死原因。作為這些特性的結(jié)果，NF-kB誘導(dǎo)劑可用于治療天然放射事件和核事故的作用。而且，由于NF-kB誘導(dǎo)劑通過(guò)不同于以前所知的所有射線(xiàn)防護(hù)劑的機(jī)制發(fā)揮作用，他們可與其他射線(xiàn)防護(hù)劑聯(lián)合使用，從而，大大地增加了對(duì)離子射線(xiàn)的防護(hù)范圍。
與傳統(tǒng)射線(xiàn)防護(hù)劑(如自由基清除劑)相反，抗凋亡制劑也許不能降低一級(jí)放射介導(dǎo)的損傷，但是可以對(duì)抗二級(jí)事件，包括對(duì)一級(jí)損傷的活性細(xì)胞反應(yīng)，因而補(bǔ)足了存在的防護(hù)線(xiàn)。皮斐松-α，p53的藥物抑制劑(哺乳動(dòng)物細(xì)胞中一種主要的放射反應(yīng)調(diào)節(jié)劑)，是此種新的射線(xiàn)防護(hù)劑的例子。可是，p53抑制劑的活性限于保護(hù)造血系統(tǒng)，在消化系統(tǒng)沒(méi)有保護(hù)作用(胃腸道癥狀)，因此，降低了這類(lèi)化合物的治療價(jià)值。具有很寬活性范圍的抗凋亡藥物絕對(duì)是需要的。
NF-kB誘導(dǎo)劑可被用作射線(xiàn)防護(hù)劑，通過(guò)超出目前方法(存在的生物防護(hù)劑的防護(hù)和應(yīng)用)可達(dá)到的水平地增加人機(jī)體對(duì)射線(xiàn)的抵抗力來(lái)擴(kuò)大可容忍的放射劑量，并大大地增加了核事故或大規(guī)模日光粒子事件中人員的生存機(jī)會(huì)。NF-kB誘導(dǎo)劑鞭毛蛋白的大概DMF(30天生存)大于1.5，其比目前報(bào)道任何天然化合物都有效。
NF-kB誘導(dǎo)劑還可用于治療低劑量輻射引起的不可替代的細(xì)胞缺失，例如，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和生殖器官中。NF-kB誘導(dǎo)劑還可被用于癌癥癥化療中，以治療化療產(chǎn)生的副作用，包括禿頭癥。
再一個(gè)實(shí)施例中，治療受輻射的哺乳動(dòng)物，包括向哺乳動(dòng)物投藥含有治療有效量的NF-kB誘導(dǎo)劑的組合物。含有NF-kB誘導(dǎo)劑的組合物可以與一種或多種輻射防護(hù)劑聯(lián)合給藥。一種或多種輻射防護(hù)劑可以是任何治療受輻射的制劑，包括但不局限于抗氧化劑、自由基清除劑和細(xì)胞因子。
NF-kB誘導(dǎo)劑還可以抑制放射誘導(dǎo)的DNA和其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷的漸進(jìn)性細(xì)胞死亡；可是，NF-kB誘導(dǎo)劑不能處理細(xì)胞的損傷，也不能防止突變。自由基和反應(yīng)氧族(ROS)是引起突變和其他細(xì)胞內(nèi)損傷的主要原因?？寡趸瘎┖妥杂苫宄齽┛捎行У胤雷o(hù)自由基產(chǎn)生的損傷。NF-kB誘導(dǎo)劑和抗氧化劑或自由基清除劑聯(lián)合使用可導(dǎo)致受射哺乳動(dòng)物更小范圍的損傷、高的生存和改善的健康狀態(tài)。實(shí)際上可用于本發(fā)明的抗氧化劑和自由基清除劑包括但不局限于硫醇、如半胱氨酸、巰基乙胺、谷胱甘肽和膽紅素；amifostine(WR-2721)；維生素A；維生素C；維生素E；和類(lèi)黃酮，如印度荷力羅勒(Ocimum sanctum)，orientin，和vicenin。
NF-kB誘導(dǎo)劑還可以與多種通過(guò)補(bǔ)充和/或保護(hù)射線(xiàn)敏感干細(xì)胞群而提供放射防御的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子聯(lián)合給藥?？赏ㄟ^(guò)使用干細(xì)胞因子(SCF，c-試劑盒配體)、flt-3配體和白細(xì)胞介素1片段IL-1 b-rd而實(shí)現(xiàn)具有最少副作用的放射防護(hù)?？梢酝ㄟ^(guò)誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖(所有提到的細(xì)胞因子)及防止其凋亡(SCF)實(shí)現(xiàn)防護(hù)。治療允許輻射前白細(xì)胞及其前體集聚，從而使輻射后免疫系統(tǒng)可以得到快速重建。SCF可有效地防止受輻射小鼠的死亡，DMF在1.3-1.35，其也可以有效地對(duì)抗腸道癥狀。Flt-3配體也可以提供對(duì)小鼠(在LD100/30時(shí)，30天生存率70-80％，相當(dāng)于DMF)1.2)和兔子(15，16)的強(qiáng)保護(hù)。
一些因子，本質(zhì)上不是細(xì)胞因子，刺激免疫細(xì)胞增殖，可以與NF-kB誘導(dǎo)劑聯(lián)合使用。5-AED(5-雄甾烯二酮)是類(lèi)固醇，可刺激細(xì)胞因子的表達(dá)并增加對(duì)細(xì)菌和病毒感染的抗性。輻射前24小時(shí)向小鼠皮下注射5-AED可改善生存，DMF＝1.26。合成的化合物，如三氯代銨(二氧乙烯-O，O’-)碲酸鹽(AS-101)可被用于誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的分泌，可與NF-kB誘導(dǎo)劑聯(lián)合使用。
生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子可被用于提供腸道癥狀的保護(hù)。角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)促進(jìn)腸粘膜的增殖和分化，在腸陰窩增加輻射后的細(xì)胞生存。造血細(xì)胞因子和放射防護(hù)SCF可以增加腸干細(xì)胞的生存及相關(guān)的短期有機(jī)體生存。
NF-kB誘導(dǎo)劑可保護(hù)腸道(GI)和造血系統(tǒng)的癥狀。由于暴露于全身致死輻射15Gy的小鼠多數(shù)死于腸道癥狀，含有NF-kB誘導(dǎo)劑和一種或多種GI癥狀抑制劑的組合物可更有效。用于本發(fā)明的GI癥狀抑制劑包括但不局限于細(xì)胞因子，如SCF和KGF。
含有NF-kB誘導(dǎo)劑的組合物可在輻射暴露于輻射前的任何時(shí)間給藥，包括但不局限于包括但不局限于暴露前48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、3、2、或1小時(shí)。含有NF-kB誘導(dǎo)劑的組合物可以在暴露于輻射后的任何時(shí)間給藥，包括但不局限于包括但不局限于暴露后1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48小時(shí)。
3.制劑本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)NF-kB活性的制劑。制劑可以是人工合成的化合物或天然存在的化合物。制劑可以是低分子量的化合物、多肽或肽、或片段、類(lèi)似物、同源物、其變異或衍生物。
制劑還可以是誘導(dǎo)NF-kB細(xì)胞因子的，包括但不局限于IL2、IL6、TNF和TGFβ。制劑還可以是前列腺素。制劑還可以是生長(zhǎng)因子，包括但不局限于KGF和PDGF。制劑還可以是誘導(dǎo)NF-kB活性的抗體。
A.鞭毛蛋白在一個(gè)實(shí)施例中，制劑是鞭毛蛋白，其可來(lái)自細(xì)菌包括但不局限于沙門(mén)氏菌屬，如鼠傷寒沙門(mén)氏菌。如以下的實(shí)施例中所示的，在細(xì)胞水平和作為一個(gè)整體的有機(jī)體，鞭毛蛋白具有強(qiáng)的促生存活性(pro-survival)。
具有有益特性的NF-kB誘導(dǎo)劑的片段、變異、類(lèi)似物、同源物或衍生物，如鞭毛蛋白可通過(guò)以鞭毛蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的合理設(shè)計(jì)得到。沙門(mén)氏菌鞭毛蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)在文獻(xiàn)中報(bào)道了(圖19)。鞭毛蛋白在N末端和C末端具有保守結(jié)構(gòu)域(D1和D2)，以及一個(gè)中間的高變異區(qū)(D3)(Samatey，等2001，Eaves-Pyles T.等2001a)。通過(guò)大腸桿菌埃希氏菌屬鉸鏈區(qū)分離的含有氨基酸D1和D2及羰基D1和D2(ND1-2/ECH/CD2)的重組蛋白的結(jié)果表明當(dāng)連接到ECH元件時(shí)D1和D2具有生物活性。這種嵌合體，并不僅僅是鉸鏈區(qū)，在兩個(gè)小腸上皮細(xì)胞系誘導(dǎo)IkBα降解、NF-kB激活和NO及IL8生成。非保守的D3區(qū)在鞭毛蛋白細(xì)絲表面上，含有主要的抗原決定簇。鞭毛蛋白的有效的促炎性活性可能位于高保守的N和CD1和D2區(qū)。
B.寄生蟲(chóng)的NF-kB誘導(dǎo)劑鞭毛蛋白的特性表明額外的NF-kB調(diào)節(jié)劑可存在于寄生蟲(chóng)。有許多寄生蟲(chóng)依賴(lài)于凋亡抑制，因?yàn)闆](méi)有宿主細(xì)胞，他們不能存活。這些生物體經(jīng)過(guò)適應(yīng)通過(guò)分泌抗凋亡因子而在宿主有機(jī)體中有效地存活。像發(fā)展的腫瘤，這些生物體分泌的因子能增強(qiáng)其自身的存活，而解決與宿主壓力反應(yīng)防御機(jī)制的沖突。
來(lái)自寄生或共生的生物體的抗凋亡因子通過(guò)數(shù)百萬(wàn)年的適應(yīng)而最小化了可影響宿主生存的傷害。結(jié)果，這些因子很少需要，如果有額外的修飾，可被直接應(yīng)用或小量修飾后應(yīng)用。這些因子可用于治療壓力介導(dǎo)的凋亡，如與化療或放療相關(guān)的副作用。
本發(fā)明還涉及篩選用于鑒別NF-kB調(diào)節(jié)劑的寄生蟲(chóng)的方法。該候選的調(diào)節(jié)劑可來(lái)自人或非人源寄生蟲(chóng)。寄生蟲(chóng)優(yōu)選宿主細(xì)胞外寄生蟲(chóng)。寄生蟲(chóng)還可以是共生體。本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑可分離自的寄生蟲(chóng)包括但不局限于支原體、衣原體和沙門(mén)氏菌?？赏ㄟ^(guò)此處所述的篩選方法以及生物化學(xué)和基因選擇方法、體外試驗(yàn)、細(xì)胞死亡保護(hù)劑和體內(nèi)來(lái)鑒別這些調(diào)節(jié)劑。
4.組合物本發(fā)明還涉及含有治療有效劑量的NF-kB誘導(dǎo)劑的組合物。該組合物可以是藥物組合物，可以使用本領(lǐng)域熟知的方法制備。如上所述，含有NF-kB誘導(dǎo)劑的組合物可以給藥于哺乳動(dòng)物用于治療凋亡相關(guān)的狀態(tài)，包括但不局限于暴露于輻射、癌癥治療的副作用、壓力和細(xì)胞老化。組合物可以包括另外的制劑，包括但不局限于輻射防護(hù)劑或化療藥物。
A.給藥本發(fā)明的組合物可以以任何方式給藥，包括但不局限于口服、腸道外、舌下、經(jīng)皮的、直腸、經(jīng)粘膜、局部、經(jīng)吸入、經(jīng)頰給藥或其組合。腸道外給藥包括但不局限于靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)、和關(guān)節(jié)內(nèi)給藥。在獸醫(yī)中的應(yīng)用，可以根據(jù)常規(guī)獸醫(yī)操作以適當(dāng)?shù)呐浞叫问浇o藥組合物。獸醫(yī)可以確定最適合特定動(dòng)物的藥方劑量和給藥途徑。
B.配方本發(fā)明的組合物可以以傳統(tǒng)的方式以片劑或錠劑配方。例如，用于口服給藥的片劑或膠囊配方可以包含常規(guī)的賦形劑包括但不局限于結(jié)合制劑、填充劑、滑潤(rùn)劑、分解質(zhì)和濕潤(rùn)劑。結(jié)合制劑包括但不局限于糖漿、accacia、凝膠、山梨醇、黃芪膠、淀粉的黏液和聚乙烯吡咯烷酮。填充劑包括但不局限于乳糖、糖、微晶體纖維素、玉米淀粉、磷酸鈣、和山梨醇?；瑵?rùn)劑包括但不局限于硬脂酸鎂、硬脂酸、滑石、聚乙烯乙二醇、和硅石。分解質(zhì)包括但不局限于土豆淀粉、乙醇酸鈉淀粉。濕潤(rùn)劑包括但不局限于月桂醇硫酸鈉。根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法將片劑包被。
本發(fā)明的組合物還可以是液體配方，包括但不局限于水或油性懸濁液、溶液、乳狀液、糖漿和西也劑。組合物也可被配方成干燥的產(chǎn)物，使用前用水或適合的媒介物構(gòu)建。這種液體制劑何以含有添加劑包括但不局限于懸浮劑、乳化劑、非水性媒介或防腐劑。懸浮劑包括但不局限于山梨醇糖漿、甲基纖維素、葡萄糖/蔗糖糖漿、凝膠、羥乙基纖維素、羰甲基纖維素、硬脂酸鋁和氫化可食的脂肪。乳化劑包括但不局限于卵磷脂、山梨醇單油酸鹽和阿拉伯樹(shù)膠。非水性媒介包括但不局限于食用油、杏仁油、分級(jí)的椰子油、油脂、丙烯乙二醇和乙烯乙醇。防腐劑包括但不局限于甲基或丙基p-羥基安息香酸鹽和山梨酸。
本發(fā)明的組合物還可以被配方成栓劑、氣可以含有栓劑的基礎(chǔ)成分，包括但不局限于可可黃油或甘油酯。本發(fā)明的組合物還可被配方成吸入劑包括但不局限于溶液、懸浮液、或乳劑，可以粉末形式或使用推動(dòng)劑如二氯二氟甲烷或三氯二氟甲烷以氣霧劑形式給藥。本發(fā)明的組合物還可以被配方成經(jīng)皮的配方，其包括水或非水媒介，包括但不局限于乳霜、藥膏、洗劑、糊、藥用糊、塊或膜。
本發(fā)明的組合物還可被配方成腸外投藥，包括但不局限于注射或持續(xù)浸劑。用于注射的配方可以是油或水性介質(zhì)中的懸浮液、溶液、或乳劑的形式，可以含有配方制劑包括但不局限于懸浮的、穩(wěn)定的、和分散的制劑。組合物還可以以粉末的形式被提供，使用恰當(dāng)?shù)拿浇橹亟ǎǖ痪窒抻谙^(guò)毒的，無(wú)熱原質(zhì)的水。
本發(fā)明的組合物還可以被配方成貯存制劑，其可通過(guò)植入或肌肉內(nèi)注射給藥。組合物還可被配方成合適的聚合體或疏水物質(zhì)(例如以可接受的油形式的乳化劑)、離子交換樹(shù)脂、或保守的溶液衍生物(例如保守的溶液衍生鹽)。
C.劑量用于治療的制劑的治療有效劑量隨被治療狀態(tài)、需要誘導(dǎo)NF-kB活性的時(shí)間長(zhǎng)短、病人的年齡和狀態(tài)的不同而不同，最終由參加的醫(yī)師決定?？墒牵话愣?，用于成年病人治療的劑量通常在每天約0.001mg/kg-200mg/kg。劑量可以是大約每天1μg/kg-100μg/kg。通常可一次地給藥所需劑量，或在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔內(nèi)多次給藥，如，一天給藥2，3，4或更多次。通常想要或需要多次劑量，因?yàn)橐坏┎辉俳o藥制劑，在正常的細(xì)胞內(nèi)NF-kB活性會(huì)降低。
NF-kB誘導(dǎo)劑的劑量可以是任何劑量，包括但不局限于1μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、75μg/kg、100μg/kg、125μg/kg、150μg/kg、175μg/kg、200μg/kg、225μg/kg、250μg/kg、275μg/kg、300μg/kg、325μg/kg、350μg/kg、375μg/kg、400μg/kg、425μg/kg、450μg/kg、475μg/kg、500μg/kg、525μg/kg、575μg/kg、600μg/kg、625μg/kg、675μg/kg、700μg/kg、725μg/kg、775μg/kg、800μg/kg、825μg/kg、852μg/kg、875μg/kg、900μg/kg、925μg/kg、950μg/kg、975μg/kg或1mg/kg。
5.篩選方法本發(fā)明還涉及鑒別誘導(dǎo)NF-kB活性的制劑的方法。可以通過(guò)一種方法鑒別誘導(dǎo)NF-kB活性的制劑，該方法包括將猜想的NF-kB活性誘導(dǎo)劑加到NF-kB激活的表達(dá)系統(tǒng)，與對(duì)照比較NF-kB激活表達(dá)的水平，藉由增加NF-kB激活表達(dá)系統(tǒng)的水平的能力鑒別NF-kB活性的誘導(dǎo)劑。
候選制劑可存在于數(shù)據(jù)庫(kù)中(即，許多化合物)。例如，此種制劑可以被表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)中的DNA分子編碼。候選制劑可存在于條件的介質(zhì)或細(xì)胞提取物。其他此類(lèi)制劑包括本領(lǐng)域熟知的“小分子”化合物，分子量小于105道爾頓，優(yōu)選小于104道爾頓，跟優(yōu)選小于103道爾頓。此種候選制劑可以作為組合的數(shù)據(jù)庫(kù)的成員被提供，其包括根據(jù)多種預(yù)定的化學(xué)合成制備的合成制劑(如肽)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠理解根據(jù)確定的步驟可以制備此數(shù)據(jù)庫(kù)的多種類(lèi)別，并可根據(jù)此處的方法同時(shí)或相繼地篩選候選制劑的數(shù)據(jù)庫(kù)成員。
可以以各種形式進(jìn)行篩選方法，包括體外、細(xì)胞基礎(chǔ)的和體內(nèi)分析。任何細(xì)胞可用于細(xì)胞基礎(chǔ)的分析中。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、更優(yōu)選地包括人或非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)細(xì)胞。細(xì)胞基礎(chǔ)的篩選可以使用表達(dá)NF-kB激活的代用品標(biāo)記的基因修飾的腫瘤細(xì)胞來(lái)進(jìn)行。此種標(biāo)記包括但不局限于細(xì)菌β半乳糖苷酶、熒光素酶和增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)?？蓱?yīng)用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)量代用品標(biāo)記的表達(dá)量包括但不局限于比色、發(fā)光和熒光。
將猜想調(diào)節(jié)劑加入細(xì)胞，如通過(guò)混合，的條件是如果基本上沒(méi)有干擾凋亡或信號(hào)的其他調(diào)節(jié)化合物存在，細(xì)胞能夠進(jìn)行凋亡或信號(hào)的條件。有效的條件包括但不局限于允許細(xì)胞生長(zhǎng)的恰當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)、溫度、pH和氧狀態(tài)。恰當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)典型地是固體或液體介質(zhì)，其含有生長(zhǎng)因子和可吸收的碳、氮、和磷酸源，以及恰當(dāng)?shù)柠}、礦物質(zhì)、金屬和其他營(yíng)養(yǎng)物，如維生素，并包括細(xì)胞可在其中生長(zhǎng)并表現(xiàn)出凋亡和信號(hào)的介質(zhì)。例如，對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，介質(zhì)可以含有10％胎牛血清的Dulbecco修飾的Eagle介質(zhì)。
可以在各種容器中培養(yǎng)細(xì)胞，包括但不局限于組織培養(yǎng)瓶、試管、微量滴定皿、和培養(yǎng)板。培養(yǎng)在適合細(xì)胞的溫度、pH和二氧化碳含量的條件下進(jìn)行。此培養(yǎng)條件也在本領(lǐng)域的范圍。
將猜想調(diào)節(jié)劑加入細(xì)胞的方法包括電穿孔、微注射、細(xì)胞表達(dá)(即使用包括裸核酸分子、重組病毒、逆轉(zhuǎn)錄酶病毒表達(dá)載體和腺病毒表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng))，使用有助于細(xì)胞通透的離子配對(duì)試劑和去垢劑。
本發(fā)明具有多個(gè)方面，通過(guò)下述非限制性實(shí)施例描述。
實(shí)施例1P53缺陷加速小鼠腸道癥狀的發(fā)展哺乳動(dòng)物離子輻射的初期致死原因依賴(lài)于射線(xiàn)劑量。達(dá)到9-10Gy的劑量，小鼠12-20天后死亡，主要是由于致命的骨髓缺失造血綜合征(HP)。在此劑量下，受輻射小鼠可通過(guò)骨髓移植得到挽救。受到大于15Gy的動(dòng)物在處理后7-12天死亡(在造血綜合征殺死之前)，死于小腸-胃腸道綜合征(GI)的并發(fā)癥(Gudkov&Komarova 2003)。在HP和GI綜合征兩種情況下，組織的致死性損傷來(lái)自于大多數(shù)p53依賴(lài)的凋亡(Potten1992，Merritt 1994，Cui等1995，Potten等1994)，此觀察使得我們可以較早地建議p53可以確定放射誘導(dǎo)的死亡。同樣的，p53缺陷小鼠對(duì)抗通過(guò)HP癥狀進(jìn)行殺傷的射線(xiàn)劑量(Westphal等1997，Komarov等1999)，通過(guò)小分子的p53抑制劑皮斐松α(PFT)(pifithrin-alpha)暫時(shí)藥物地抑制p53可以降低6-11Gyγ射線(xiàn)在野生型動(dòng)物中引起的死亡(Komarov等1999)。通過(guò)證實(shí)作為實(shí)驗(yàn)性化療和放療結(jié)果的毛發(fā)缺失(禿頭癥)的p53依賴(lài)，進(jìn)一步強(qiáng)化了p53對(duì)基因毒性壓力的敏感組織因子的定義(Botchkarev等2000)。因此，基于上述觀察，大家可以期待p53在高劑量的IR后的致死性GI綜合征的發(fā)展中持續(xù)起重要的作用。令人吃驚的是，p53缺陷使小鼠對(duì)高劑量導(dǎo)致致死的胃腸道綜合征的IR敏感(圖11)。IR后在p53缺陷上皮的隱窩中持續(xù)的細(xì)胞增殖于加速的隱窩受損細(xì)胞的死亡和快速的絨毛破壞相關(guān)。P53通過(guò)誘導(dǎo)小腸隱窩的生長(zhǎng)停滯延長(zhǎng)生存，因而保持腸道完整性(圖12)。所以，p53的促凋亡功能加速了造血癥狀，而其生長(zhǎng)停滯功能延緩了胃腸道癥狀。
小腸細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)已被詳細(xì)的分析了。腸道上皮的細(xì)胞增殖局限于隱窩，其中有干細(xì)胞和早期增殖的祖細(xì)胞。一系列細(xì)胞分裂后，已近分化的隱窩干細(xì)胞的后代移到絨毛，在絨毛頂脫落。在小鼠的小腸中，細(xì)胞的整個(gè)“旅途”(增生部分到絨毛頂)一般需要3-5天(Potten1992，Potten等1997，Booth等2002，Somosy等2002)。雖然小腸對(duì)γ射線(xiàn)的反應(yīng)在病理形態(tài)學(xué)水平上已被詳細(xì)研究了，仍不明白的是到底是什么引起的GI致死，包括初級(jí)事件。死亡可以上皮隱窩細(xì)胞損傷及隨后的絨毛剝脫，而導(dǎo)致的液體和電解質(zhì)失衡、菌血癥和毒血癥的直接后果。除了炎性和間質(zhì)反應(yīng)，內(nèi)皮的功能喪失是導(dǎo)致死亡的重要因素(Potten等1997，Somosy等2002)?？傃灾?，對(duì)防止IR誘導(dǎo)的HP癥狀的有效方法，p53的藥物抑制并不能對(duì)抗GI癥狀(如果不是有害的)。因此，有必要發(fā)展一種其他的方法，在其他機(jī)制上對(duì)小腸上皮進(jìn)行放射性保護(hù)，例如，NF-kB的激活和隨后的細(xì)胞死亡的抑制。
實(shí)施例2沙門(mén)氏菌感染激活NF-kB沙門(mén)氏菌感染導(dǎo)致有效的IKK和NF-kB激活以及促炎性基因的激活(Elewaut等1999)。先前的研究表明在培養(yǎng)的腸上皮細(xì)胞中大約30-40％的腸上皮細(xì)胞在典型的沙門(mén)氏菌感染中被感染(Valdivia等1996)。我們希望解決這個(gè)問(wèn)題，宿主細(xì)胞大約30％的細(xì)菌感染是怎樣使NF-kB DNA的結(jié)合活性增加到作為T(mén)NFα治療劑量的幾乎所有的宿主細(xì)胞中的NF-kB活性的。
為了詳細(xì)檢測(cè)這個(gè)現(xiàn)象，假感染或在MOI50時(shí)用野生型鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染HT29細(xì)胞1小時(shí)，該鼠傷寒沙門(mén)氏菌用編碼沙門(mén)氏菌ssaH啟動(dòng)子控制的綠色熒光蛋白(GFP)的質(zhì)粒pFM10.1轉(zhuǎn)染，僅當(dāng)細(xì)菌侵入宿主細(xì)胞是才具功能(Valdivia等1997)。用沙門(mén)氏菌侵入的細(xì)胞通過(guò)直接的熒光顯微鏡檢測(cè)GFP的表達(dá)來(lái)檢測(cè)。P65(RelA)定位通過(guò)使用間接的免疫熒光檢測(cè)，用FITC連接的驢抗兔抗體檢測(cè)兔抗p65抗體。DAPI用于染色核。
如圖1A所示，GFP的表達(dá)發(fā)生在大約30-40％的細(xì)胞。下一步我們檢測(cè)在未處理的(假感染)、沙門(mén)氏菌感染或TNFα(10ng/ml)刺激的細(xì)胞中NF-kB亞單位p65的定位。P65(RelA)定位于未處理細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，而p65(RelA)定位于沙門(mén)氏菌感染或TNFα處理細(xì)胞的細(xì)胞核上(圖1B)。這些結(jié)果表明沙門(mén)氏菌感染幾乎在所有的細(xì)胞激活NF-kB，盡管只有一少部分被感染。
實(shí)施例3鞭毛蛋白激活NF-kB因?yàn)榕囵B(yǎng)的小腸上皮細(xì)胞感染沙門(mén)氏菌僅導(dǎo)致大概30％的感染，而幾乎全部的細(xì)胞中NF-kB都被激活，我們期望NF-kB的激活是對(duì)宿主細(xì)胞識(shí)別細(xì)菌結(jié)構(gòu)成分或細(xì)菌產(chǎn)物的反應(yīng)，而不是通過(guò)侵入過(guò)程。侵入自身被證明在激活上述認(rèn)為的促炎癥基因過(guò)程中不是必要的(16)。為了研究此種可行性，使用未處理的或煮沸20分鐘的消毒過(guò)濾的柏林沙門(mén)氏菌培養(yǎng)液激發(fā)HT29小腸上皮細(xì)胞，通過(guò)暴露45分鐘后制備的全細(xì)胞提取物(WCEs)的電遷移分析(EMSA)分析NF-kBDNA的結(jié)合活性(3，40)。在兩種條件下觀察到對(duì)培養(yǎng)液反應(yīng)的潛伏激活，表明激活因子是熱穩(wěn)定的。
隨后用DNase、RNase、蛋白激酶K或在100kDa的centricon過(guò)濾器上粗略地分離處理天然消毒過(guò)濾濃縮的培養(yǎng)液。然后用各種處理的培養(yǎng)液激發(fā)HT29腸上皮細(xì)胞45分鐘后制備WCEs，用EMSA分析NF-kB DNA的結(jié)合活性(圖2A)。通過(guò)鼠傷寒沙門(mén)氏菌1103的HT29細(xì)胞的直接感染或暴露于如所述培養(yǎng)液(supt)，誘導(dǎo)NF-kB DNA結(jié)合活性，而發(fā)現(xiàn)活性誘導(dǎo)劑對(duì)蛋白激酶消化敏感，并通過(guò)100kDa過(guò)濾器保留(圖2A)。為了進(jìn)一步確定NF-kB誘導(dǎo)活性的身份，用Superose12凝膠通透色譜(圖2B)和陰離子交換色譜(圖2C)分離消毒過(guò)濾濃縮的培養(yǎng)液培養(yǎng)基。分析色譜分離的水性部分對(duì)激活HT29細(xì)胞中NF-kB的能力，并用EMSA分析。如在考馬斯蘭染色凝膠中所見(jiàn)(圖2B，上)，對(duì)應(yīng)增加的大約55kDa的蛋白質(zhì)，NF-kB DNA結(jié)合活性增強(qiáng)(圖2B，下組4-6泳道)。如所示的在POROS HQ基質(zhì)上的陰離子交換色譜和如所示的具有增加的鹽梯度的結(jié)合蛋白洗提液(圖2C)證明了NF-kB NDNA結(jié)合誘導(dǎo)活性對(duì)應(yīng)了含有增加的含量的55kDa的蛋白質(zhì)的色譜部分(圖2C，上，數(shù)據(jù)未顯示)。圖2C中的洗提液被濃縮，并在預(yù)備的12％SDS-PAGE凝膠上分離，從膠上切除B1-B6的帶，洗提蛋白質(zhì)，沉淀，復(fù)性，并用于刺激HT29細(xì)胞。通過(guò)EMSA分析這些細(xì)胞中的全部細(xì)胞提取液的NF-kB DNA結(jié)合誘導(dǎo)活性，僅有對(duì)應(yīng)55kDa蛋白的帶2(B2)能過(guò)引起NF-kB DNA結(jié)合活性，而從開(kāi)始或最后的鹽剃度緩沖液不能激活NF-kB DNA結(jié)合活性(圖2C，F(xiàn))。
進(jìn)一步對(duì)B1-B6蛋白帶的蛋白和凝膠的空白區(qū)進(jìn)行蛋白測(cè)序。B2蛋白質(zhì)的胰蛋白酶消化和電分散離子捕獲LC/MS分析鑒別出一個(gè)21個(gè)肽的氨基酸序列。鞭毛蛋白(21個(gè)肽的覆蓋率為75％)毫無(wú)疑問(wèn)地被鑒定為誘導(dǎo)NF-kB DNA結(jié)合活性的蛋白質(zhì)(圖3)。
實(shí)施例4在腸上皮中需要鞭毛蛋白激活NF-kB為了確認(rèn)鞭毛蛋白到底是不是在腸上皮暴露于直接的細(xì)菌感染或治病沙門(mén)氏菌的過(guò)濾的培養(yǎng)液后NF-kB活性觸發(fā)的因子，我們從非鞭毛蛋白的大腸桿菌DH5α、致病的柏林沙門(mén)氏菌2229、異源柏林沙門(mén)氏菌2229SopE-突變、異源柏林沙門(mén)氏菌2229SopB-突變、異源柏林沙門(mén)氏菌2229SopE-/B-雙突變(SE1SB2株)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌1103、異源鼠傷寒沙門(mén)氏菌fliC-Tn10插入突變(株86)和鼠傷寒沙門(mén)氏菌1103異源雙突變fliC-/fljB-中制備了感染細(xì)菌，煮沸，過(guò)濾培養(yǎng)液。SopE是病原性沙門(mén)氏菌噬菌體編碼的蛋白被注入宿主細(xì)胞，并作為小RhoGTPases Rac1和CdC42啟動(dòng)的細(xì)胞骨架重排的交換因子發(fā)揮作用，最終激活MAPK、SAPK和NF-kB途徑(7，15)，而SopB是作為磷酸肌糖磷酸酶發(fā)揮作用的沙門(mén)氏蛋白，參加細(xì)胞骨架重排和刺激宿主細(xì)胞分泌氯(44)。用細(xì)菌和培養(yǎng)液激發(fā)HT29小腸上皮細(xì)胞，45分鐘后制備WCEs提取液，通過(guò)EMSA分析NF-kB DNA結(jié)合活性。沙門(mén)氏菌株能夠激活NF-kB，而不能產(chǎn)生鞭毛蛋白的沙門(mén)氏菌株(如所述的fliC和fliC-/fljB-突變)也不能激活NF-kB(圖4A&B)。大腸桿菌DH5α是非鞭毛蛋白，不產(chǎn)生鞭毛蛋白，不能激活NF-kB。通過(guò)多種試驗(yàn)我們還注意到柏林沙門(mén)氏菌的直接感染比如圖4A的鼠傷寒沙門(mén)氏菌通常激活更多的NF-kB，而兩種菌種的培養(yǎng)液幾乎同樣地激活NF-kB(圖4B)。我們相信這種區(qū)別也許是由于在感染期間柏林沙門(mén)氏菌比鼠傷寒沙門(mén)氏菌向細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中釋放更多的鞭毛蛋白，因?yàn)閺膬煞N柏林沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的培養(yǎng)液中純化并加入相同劑量的色譜純化的鞭毛蛋白而產(chǎn)生相似的NF-kB激活。還注意到的是雙鞭毛蛋白基因突變與在單相I鞭毛蛋白fliC∷Tn10插入突變(圖4A&4B中接近最后一泳道)中觀察到的很小的激活相比不能激活NF-kB，原因可能是相II鞭毛蛋白的有限的表達(dá)(從fljB)，盡管此處使用的沙門(mén)氏菌株遺傳上不能或很少遷移鞭毛蛋白產(chǎn)物的相。由于在小腸上皮細(xì)胞的直接感染中需要鞭毛蛋白激活NF-kB途徑，很可能鞭毛蛋白也是其他小腸上皮細(xì)胞的致病性沙門(mén)氏菌感染激活的主要的促有絲分裂和壓力激活的信號(hào)途徑的主要決定因子。小腸上皮細(xì)胞直接的沙門(mén)氏菌感染導(dǎo)致JNK激活(8)，也通過(guò)IKK激活NF-kB(3)。
實(shí)施例5鞭毛蛋白觸發(fā)有絲分裂激活的蛋白激酶、壓力激活的蛋白激酶和IKK信號(hào)途徑的活性。
對(duì)于向腸腔表面的侵入，小腸上皮細(xì)胞作為哨兵發(fā)揮作用，其可通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞因子基因如IL-8和巨噬細(xì)胞化學(xué)吸引蛋白1(MCP1)促炎癥的細(xì)胞因子基因如TNFα、IL-1和IL-6(1，4-6)吸引免疫細(xì)胞到局部。這些基因的表達(dá)主要依賴(lài)轉(zhuǎn)錄因子的活性，這些轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)對(duì)MAPK、SAPK和IKK信號(hào)途徑的信號(hào)傳導(dǎo)的反應(yīng)被激活。由于NF-kB被認(rèn)為是促炎癥基因的中樞調(diào)節(jié)/激活劑，我們決定檢測(cè)不產(chǎn)生鞭毛蛋白的沙門(mén)氏菌突變株在激活MAPK、SAPK和IKK信號(hào)途徑的作用，并與野生型沙門(mén)氏菌感染的腸上皮或暴露于純化的鞭毛蛋白的腸上皮比較。野生型鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染HT29細(xì)胞導(dǎo)致了MAPK、ERK1&2、SAPKsp38和JNK和IKK的激活(圖5)，如通過(guò)免疫印跡(IB)分析中的活性指示磷酸特異性抗體分析或分別使用底物GST-cJun1-79和GST-IkBα1-54的JNK和IKK的抗體特異性免疫激酶分析(KA)所確定的那樣。有趣的是，MAPK刺激在本質(zhì)上是短暫的，在45分鐘開(kāi)始激活降低，而p38、JNK和IKK隨時(shí)間超過(guò)一小時(shí)增加。如圖4所見(jiàn)，fliC-/fljB-雙突變沙門(mén)氏菌也不能誘導(dǎo)IKK和NF-kB的活性(如圖5所示)。令人吃驚的是，fliC-/fljB-雙突變沙門(mén)氏菌不能誘導(dǎo)SAPKs p38和JNK，僅能暫時(shí)地(15分鐘)激活MAPK。此結(jié)果是令人疑惑的，原因是其他沙門(mén)氏菌蛋白如SopE和SopE2能夠激活小的GTPaseRac和CdC42，這些Rho家族的GTPases與JNK和p38的激活相聯(lián)系(7，8，14，15)可是在鞭毛蛋白負(fù)株中沒(méi)有功能。
與野生型沙門(mén)氏菌相比，fliC-/fljB-雙突變沙門(mén)氏菌不能侵入HT29細(xì)胞，如基因刺激防護(hù)/侵入分析(gentamycinprotection/invasion assay)中所確定的。鞭毛蛋白fliC-/fljB-雙突變沙門(mén)氏菌在其侵入HT29細(xì)胞的能力中顯示出4級(jí)不同的幅度。為了進(jìn)一步說(shuō)明這一點(diǎn)，我們用野生型沙門(mén)氏菌和fliC-/fljB-雙突變沙門(mén)氏菌(株134)感染HT29細(xì)胞，用在沙門(mén)氏菌ssaH啟動(dòng)子控制下編碼表達(dá)GFP的質(zhì)粒pFM10.1轉(zhuǎn)染兩種菌株，僅當(dāng)細(xì)菌侵入宿主細(xì)胞是才發(fā)揮功能(10，36)。很明顯野生型沙門(mén)氏菌能夠感染HT29細(xì)胞(GFP，圖5B)而鞭毛蛋白突變細(xì)菌不能侵入HT29細(xì)胞，如沒(méi)有GFP表達(dá)所驗(yàn)證的(圖5B)。為了確定為了侵入，鞭毛蛋白是否足夠或需要其他細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白，我們將純化的鞭毛蛋白或消毒過(guò)濾的培養(yǎng)液或其混合加入HT29細(xì)胞，用沙門(mén)氏菌fliC-/fljB-雙突變激發(fā)HT29細(xì)胞，并分析侵入。使用純化的鞭毛蛋白和/或fliC-/fljB-雙突變株2培養(yǎng)液的所有試驗(yàn)組合不能侵入腸上皮細(xì)胞都。不相信鞭毛蛋白基因和III型分泌系統(tǒng)有直接的關(guān)聯(lián)以傳遞細(xì)菌產(chǎn)物蛋白如，SopE、SopE2和SipA或其他在抑制細(xì)菌整合中起重要作用的Sip蛋白(7，14，15，45，46)的有效性。而且，為了評(píng)估鞭毛蛋白刺激p65(RelA)在腸上皮細(xì)胞中核定位的有效性，我們用純化的鞭毛蛋白激發(fā)HT29細(xì)胞，并使用間接免疫熒光檢測(cè)p65(RelA)的定位，發(fā)現(xiàn)p65(RelA)幾乎定位于每一個(gè)細(xì)胞核(如圖5B所示)。
在HT29細(xì)胞中純化的鞭毛蛋白(0.5μg/ml)有效地激活NF-kB，這與TNF(10ng/ml)處理的HT29細(xì)胞中觀察得到的時(shí)間依賴(lài)的方式相似(圖6A)，其中WCEs在暴露后的指定的各個(gè)時(shí)間上制備，用EMSAs分析NF-kB DNA結(jié)合活性。在這些相同的提取液中分析MAPK、SAPK和IKK信號(hào)途徑(圖6B)，使用激活特異的磷酸抗體檢測(cè)MAPK和p38激酶活性或抗體特異性免疫沉淀激酶分析檢測(cè)JNK和IKK活性，證明JNK和IKK活性在一小時(shí)內(nèi)增加而p38和MAPK(ERK1&2)活性在30分鐘達(dá)到最大，在一小時(shí)時(shí)下降到可注意的低水平(如圖6B所示)。MAPK、SAPK和IKK信號(hào)分子ERK1&2，p38，JNK，和IKK在小腸上皮細(xì)胞中對(duì)暴露于純化的鞭毛蛋白的反應(yīng)曲線(xiàn)與野生型沙門(mén)氏菌感染的小腸上皮細(xì)胞驚人的相似(圖5A)。從這些觀察中我們得出結(jié)論，此處檢測(cè)到的信號(hào)系統(tǒng)暫時(shí)的激活(MAPK，SAPK和IKK)反映了沙門(mén)氏菌感染的早期狀況，幾乎可專(zhuān)有地通過(guò)小腸上皮細(xì)胞對(duì)鞭毛蛋白的識(shí)別和反應(yīng)確定。
我們希望進(jìn)一步檢測(cè)純化鞭毛蛋白沙門(mén)氏菌中的和鞭毛蛋白在腸上皮細(xì)胞中暫時(shí)的促炎癥細(xì)胞因子基因表達(dá)的作用，以便區(qū)分鞭毛蛋白單獨(dú)、鞭毛蛋白化的沙門(mén)氏菌或非鞭毛蛋白化的沙門(mén)氏菌感染。HT29細(xì)胞未處理、用TNFα(10ng/ml)刺激、或用鞭毛蛋白(0.5μg/ml)刺激、或用野生型鼠傷寒沙門(mén)氏菌或沙門(mén)氏菌fliC/fljB雙突變(MOI50)感染。在處理或感染指定的時(shí)間后，在冰冷的PBS中回收HT29細(xì)胞，在Trizol中裂解細(xì)胞沉淀，純化RNA，并用其制備第一鏈cDNA鏈(見(jiàn)實(shí)驗(yàn)步驟)。cDNA水溶液用于半定量RT-PCR反應(yīng)中，使用IL1α、IL1β、IL-8、TNFα、MCP1和β肌動(dòng)蛋白基因特異性引物(根據(jù)要求提供序列)，在含溴化二氨乙苯啡啶的1.2％的瓊脂糖凝膠的上分離產(chǎn)物。已知的NF-kB靶基因IL1β、IL-8、TNFα、MCP1的表達(dá)在對(duì)TNFα或純化的鞭毛蛋白暴露的反應(yīng)中增加(圖6C)。野生型沙門(mén)氏菌感染也能導(dǎo)致這些基因的激活，盡管相比之下TNFα、MCP1的表達(dá)是短暫的，發(fā)生在感染之后。沙門(mén)氏菌fliC-/fljB-雙突變不能誘導(dǎo)IL-1β、IL-8和TNFα的表達(dá)，但是可誘導(dǎo)MCP1的表達(dá)，盡管水平比野生型沙門(mén)氏菌低，而且，MCP1的表達(dá)不是暫時(shí)的而是持續(xù)整個(gè)時(shí)間(9h)(圖6C)。作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的β肌動(dòng)蛋白的表達(dá)水平用于比較。有趣的是，在所有的處理激發(fā)的HT29細(xì)胞在反應(yīng)中都刺激了非NF-kB靶基因，IL-1α。很明顯，沙門(mén)氏菌fliC-/fljB-雙突變能激活其他不知道的信號(hào)途徑，導(dǎo)致IL-1α的表達(dá)。
實(shí)施例6
鞭毛蛋白以MyD88-依賴(lài)的方式激活NF-kB DNA結(jié)合由于鞭毛蛋白能夠激活與促炎癥基因激活一致的需要的信號(hào)途徑，這種活性與細(xì)胞因子激活相關(guān)，如TNFα激活所有存在其細(xì)胞表面受體的細(xì)胞(見(jiàn)圖1和圖5C中的p65[RelA]核定位)，我們決定檢測(cè)Toll類(lèi)受體其是已知的病源識(shí)別受體在暴露于鞭毛蛋白是激活NF-kB途徑的潛力。為了檢測(cè)這種假說(shuō)，我們檢測(cè)了表達(dá)腺病毒的顯性負(fù)性MyD88(aa152-296)(47)在HT29細(xì)胞中鞭毛蛋白誘導(dǎo)的BNF-kB激活中的作用。MyD88是IL-1受體和所有已知TLR利用的轉(zhuǎn)接蛋白，TLR通過(guò)他們的細(xì)胞質(zhì)信號(hào)區(qū)與IL-1同源，在NF-kB途徑的立即激活中是必須的(48，49)。DN-MyD88在HT29細(xì)胞中的表達(dá)阻滯了EMSA檢測(cè)到的在IL-1或暴露于鞭毛蛋白的反應(yīng)中的NF-kB DNA結(jié)合活性的激活，與TLR介導(dǎo)的NF-kB的激活作用一致。為了進(jìn)一步檢測(cè)這種可能性，我們開(kāi)始使用野生型、MyD88-/-和TLR2-/-/TLR4-/-MEF(從日本大阪大學(xué)S.Akira得到的禮物)證實(shí)MyD88的作用，并檢測(cè)兩種TLR對(duì)鞭毛蛋白反應(yīng)或?qū)χ苯拥囊吧蜕抽T(mén)氏菌感染導(dǎo)致NF-kB激活的有效作用(圖7)。在野生型和TLR缺陷MEFs中，野生型沙門(mén)氏菌感染有效地激活NF-kB(泳道2和5)，但這種激活在MyD88缺陷的MEFs中缺失(泳道10)。用濃縮的滅菌過(guò)濾的野生型柏林沙門(mén)氏菌或雙SopE-/SopB-異源突變柏林沙門(mén)氏菌SE1SB2株培養(yǎng)液激發(fā)的所有三種細(xì)胞，在野生型MEF和TLR2/4雙缺陷細(xì)胞中激活NF-kB，而在MyD88缺陷細(xì)胞中不能激活NF-kB(比較泳道11、12與泳道3，4，6，7，16和17)。在野生型MEF中暴露與純化的鞭毛蛋白(0.5μg/ml)有力地激活NF-kB，因而消除了LPS在這些實(shí)驗(yàn)中在NF-kB的激活中起作用的可能性。也可通過(guò)TLR2/4雙缺陷MEF的有力激活排除LPS作為NF-kB激活劑的可能性(泳道16和17)。TLR2和4分別對(duì)細(xì)菌脂肽、肽聚糖、某些LPSs和γ陰性L(fǎng)PS發(fā)生反應(yīng)(50-52)。IL-1刺激證實(shí)了在IL-1傳遞和鞭毛蛋白介導(dǎo)的信號(hào)中需要MyD88的功能。
為了進(jìn)一步確定TLRs在鞭毛蛋白識(shí)別中的作用，我們分析了TLRs過(guò)度表達(dá)在通常對(duì)鞭毛蛋白反應(yīng)弱的細(xì)胞中激活NF-kB的能力。選擇對(duì)純化鞭毛蛋白輕度反應(yīng)的細(xì)胞可以保證鞭毛蛋白使用的信號(hào)成分和轉(zhuǎn)接器的存在和功能，限制性因子看起來(lái)僅僅是對(duì)鞭毛蛋白反應(yīng)的受體。我們發(fā)現(xiàn)Hela細(xì)胞和HEK293細(xì)胞對(duì)IL-1反應(yīng)激活NF-kB DNA結(jié)合活性，而對(duì)暴露于鞭毛蛋白反應(yīng)弱，我們選擇HEK293細(xì)胞進(jìn)一步使用，是因?yàn)樗麄冇懈鼜?qiáng)的轉(zhuǎn)染效率。氨基末端FLAG決定簇標(biāo)記的TLR1-9(Yale Univ.和R.Ulevitch，TSRI的R.Medzhitov來(lái)的禮物)(42，43)在HEK293細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后與2x-NF-kB-依賴(lài)的啟動(dòng)子啟動(dòng)的熒光素酶受體基因一起過(guò)度表達(dá)，確定了在未處理、鞭毛蛋白(0.5μg/ml)或TNFα(10ng/ml)的反應(yīng)中的熒光素酶的表達(dá)。TLR5是唯一的一種其表達(dá)導(dǎo)致可見(jiàn)的鞭毛蛋白激發(fā)細(xì)胞反應(yīng)的TLR(見(jiàn)表1)。
為了進(jìn)一步確定TLR5作為T(mén)LR通過(guò)其鞭毛蛋白激活NF-kB的可能性，我們通過(guò)去除每個(gè)TLR的羧基部分使其成為T(mén)IR結(jié)構(gòu)域的保守的色氨酸來(lái)構(gòu)建顯性負(fù)性信號(hào)突變。IL-1受體中相似的突變?nèi)∠似鋵?dǎo)致NF-kB活性的能力(54，55)。每一個(gè)DN-TLR和反義TLR5克隆(AS-TLR5)被克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pCDNA3.1(Invitrogen)。所有的突變蛋白很好的表達(dá)。每一個(gè)DN-TLR哺乳動(dòng)物表達(dá)載體和具有2xNF-kBLuc的空載體如上所述被轉(zhuǎn)染到對(duì)鞭毛蛋白反應(yīng)好的HT29細(xì)胞中。不轉(zhuǎn)染的細(xì)胞未處理、用TNFα(10ng/ml)或純化的鞭毛蛋白(0.5μg/ml)刺激。觀察到受體基因表達(dá)不被對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞TNFα刺激反應(yīng)的DN-TLR表達(dá)影響(圖8A)；可是，僅表達(dá)DN-TLR5或反義TLR5構(gòu)建分別導(dǎo)致了接近50％和25％的鞭毛蛋白介導(dǎo)的受體基因活性的抑制(圖8B)，而DN-TLR2也被發(fā)現(xiàn)可中度抑制鞭毛蛋白介導(dǎo)的受體表達(dá)。這些結(jié)果意味著TLR5是細(xì)胞表面識(shí)別鞭毛蛋白并啟動(dòng)導(dǎo)致NF-kB活性的信號(hào)途徑的一部分。DN-TLR2在NF-kB依賴(lài)的受體基因激活中的作用可以是非特異的，因?yàn)榕c其它DN-TLRs相比，它的表達(dá)也抑制了TNFα介導(dǎo)的受體激活。DN-TLR2還可以競(jìng)爭(zhēng)TLR2和TLR5享有的未知的轉(zhuǎn)接器蛋白。在任何情況下，TLR2和TLR4如圖7的結(jié)果所示在鞭毛蛋白介導(dǎo)的NF-kB的激活中不是必要的。
實(shí)施例7鞭毛蛋白介導(dǎo)的NF-kB激活導(dǎo)致增加的TLRs系列的表達(dá)用鼠傷寒沙門(mén)氏菌或純化的鞭毛蛋白刺激小腸上皮細(xì)胞導(dǎo)致促炎癥基因的激活(圖6C)。我們希望檢測(cè)在鞭毛蛋白刺激的細(xì)胞中TLR基因表達(dá)是否也被改變。用純化的鞭毛蛋白(0.5μg/ml)處理HT29細(xì)胞，從未處理的和刺激三小時(shí)后的處理細(xì)胞分離總RNA，用于合成第一鏈cDNA。使用每種TLR的特定的基因特異性引物進(jìn)行半定量RT-PCR，用從未刺激的和鞭毛蛋白刺激的細(xì)胞中制備第一鏈cDNA，用于合成DNA產(chǎn)物，在含有溴化二氨乙苯啡啶的1.2％瓊脂糖凝膠上分離該DNA產(chǎn)物。在鞭毛蛋白刺激后TLRs 2、3、7的表達(dá)增加(圖9)。其它TLRs的表達(dá)模式不變，β肌動(dòng)蛋白用于內(nèi)部對(duì)照。
TLR5在對(duì)鞭毛蛋白反應(yīng)不好的細(xì)胞中表達(dá)。此研究和其他(22，33)鑒別出TLR5可能與TLR一樣通過(guò)鞭毛蛋白激活NF-kB。先前的報(bào)道并沒(méi)有確定細(xì)胞中TLR5的存在或量，以用于確定他的功能(22，23)。我們希望確定在不能對(duì)鞭毛蛋白的激發(fā)產(chǎn)生反應(yīng)或反應(yīng)弱的細(xì)胞中TLR5蛋白是不存在還是大大降低。在許多細(xì)胞系中用免疫印跡分析檢測(cè)TLR5充分度，使用TLR5特異性抗體并與純化鞭毛蛋白誘導(dǎo)的從其制備的WCEs的NF-kB DNA結(jié)合活性相比較。小腸上皮細(xì)胞系T84和HT29被用作肺腺癌癥細(xì)胞系A(chǔ)549，人宮頸腺癌癥細(xì)胞系HeLa，表達(dá)大T抗原的人胚胎腎細(xì)胞系HEK293，和膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G。用TLR5特異的抗體通過(guò)免疫印跡在所有的細(xì)胞中檢測(cè)TLR5蛋白(圖10A)。T84細(xì)胞系表現(xiàn)出最高度富含，而其他細(xì)胞系的表達(dá)水平相似，區(qū)別不超過(guò)2倍(圖10A)。從每種細(xì)胞系制備的WCEs中通過(guò)EMSA分析在未刺激細(xì)胞、TNFα和鞭毛蛋白刺激的細(xì)胞中的NF-kB DNA結(jié)合活性(圖10B)。HT29和A549細(xì)胞對(duì)鞭毛蛋白和TNFα刺激反應(yīng)強(qiáng)烈，而HeLa、293T和T98G細(xì)胞對(duì)鞭毛蛋白刺激反應(yīng)弱(HeLa，293T)或沒(méi)反應(yīng)(T98G)。NF-kB DNA結(jié)合復(fù)合物的確實(shí)性用p65特異的抗體對(duì)超遷移NF-kB DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物檢測(cè)。令人感興趣的是表達(dá)TLR5的一些細(xì)胞完全不反應(yīng)或反應(yīng)非常弱。這可能是由于缺乏胞膜或胞內(nèi)受體、這些細(xì)胞系中的TLR5基因的失活或有害的突變或所需的聯(lián)合受體或轉(zhuǎn)接器蛋白的缺乏或量少(如在一些細(xì)胞中的TLR4和它的聯(lián)合受體/轉(zhuǎn)接器MD2(30，56，57))。在所有檢測(cè)的細(xì)胞系中IL-1能激活NF-kB DNA結(jié)合活性，MyD88下游至NF-kB的信號(hào)器好像是完整的。
實(shí)施例8
重組鞭毛蛋白的分離為了確定重組鞭毛蛋白能誘導(dǎo)NF-kB，用攜帶NF-kB反應(yīng)熒光素酶(luc)的報(bào)告細(xì)胞檢測(cè)其活性。報(bào)告構(gòu)建含有3個(gè)來(lái)自結(jié)合Hsp70最小啟動(dòng)子的E-選擇子啟動(dòng)子的NF-kB結(jié)合位點(diǎn)，通常被用于檢測(cè)NF-kB。向介質(zhì)中加入鞭毛蛋白6小時(shí)后在細(xì)胞裂解液中檢測(cè)熒光素酶活性。用TNFα作陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果分別在圖13中顯示，表明重組鞭毛蛋白能夠激活NF-kB。
實(shí)施例9鞭毛蛋白延遲IR誘導(dǎo)的GI癥狀引起的小鼠死亡如上所述，鞭毛蛋白是NF-kB潛伏的激活劑，推斷其能作為凋亡死亡抑制劑發(fā)揮作用。由于能誘導(dǎo)NF-kB的細(xì)胞因子可作為輻射防護(hù)劑發(fā)揮作用，我們檢測(cè)了鞭毛蛋白能否作輻射防護(hù)劑。
小鼠全身受輻射15Gyγ射線(xiàn)輻射可導(dǎo)致8天內(nèi)死于腸道癥狀(見(jiàn)上)，提供一個(gè)常規(guī)的輻射誘導(dǎo)腸道損傷的模型中。為了檢測(cè)鞭毛蛋白能否防護(hù)IR的GI癥狀，我們檢測(cè)了受輻射15Gy后小鼠死亡的動(dòng)力學(xué)中靜脈注射鞭毛蛋白的作用。我們用了各種計(jì)量的鞭毛蛋白，其明顯低于文獻(xiàn)報(bào)道的最大耐受量(300μg/小鼠，Eaves-Pyles，T.等，2001b)。處理4小時(shí)后照射。結(jié)果分別在圖14中表示。如所預(yù)期的，對(duì)照受輻射小鼠(靜脈注射PBS)處理后5-8天死亡，而接受鞭毛蛋白的動(dòng)物存活明顯延長(zhǎng)；存活的延長(zhǎng)與鞭毛蛋白的劑量有關(guān)。照射7天后小腸的病理形態(tài)學(xué)分析表明鞭毛蛋白處理組與對(duì)照組的顯著差異(圖15)。靜脈、腹腔、和皮下注射0.2mg/kg的鞭毛蛋白后受13Gy輻射提供了相似的防護(hù)作用，導(dǎo)致小鼠30天的生存率為85-90％(數(shù)據(jù)未顯示)。如上所示用13Gy的射線(xiàn)和各種給藥途徑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)計(jì)量。
實(shí)施例10鞭毛蛋白拯救了IR誘導(dǎo)的造血癥狀致死的小鼠下一步我們檢測(cè)了鞭毛蛋白對(duì)由于HP癥狀導(dǎo)致的IR誘導(dǎo)的死亡是否有效，輻射通過(guò)較低的實(shí)驗(yàn)性輻射劑量引起的(通常最多11Gy)，其不能引起致死的GI毒性。實(shí)驗(yàn)與上述的相似(圖14和15)，只是沒(méi)用15Gy，小鼠接受了10Gy的照射，此劑量在對(duì)照組中第13天100％殺死小鼠(圖16)。鞭毛蛋白處理組(5μg/小鼠)顯示出對(duì)此劑量IR的完全的防護(hù)，表明鞭毛蛋白介導(dǎo)的射線(xiàn)防護(hù)不僅抗GI，也抗IR誘導(dǎo)的HP癥狀。
實(shí)施例11鞭毛蛋白防護(hù)作用的時(shí)間依賴(lài)為了評(píng)估鞭毛蛋白射線(xiàn)防護(hù)活性在治療時(shí)間上的依賴(lài)性，在13Gyγ射線(xiàn)照射前不同時(shí)間注射小鼠。其中的一個(gè)結(jié)果在圖17中表示。得到的結(jié)果表明照射前1-4小時(shí)注射對(duì)13Gy的射線(xiàn)防護(hù)有效，如果照射前24小時(shí)注射則無(wú)效。
為了評(píng)估鞭毛蛋白射線(xiàn)防護(hù)活性在治療時(shí)間上的依賴(lài)性，在相對(duì)γ射線(xiàn)的不同時(shí)間點(diǎn)上注射。如上所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每只小鼠腹腔注射5μg/小鼠(0.2mg/kg)的CBLB501或?qū)φ招∈?，注?μg/小鼠(0.2mg/ml)的細(xì)菌RNA多聚酶。在NIH瑞士株小鼠上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明如果在處理前1-2小時(shí)注射，鞭毛蛋白501可在13Gy照射后提供大約90％的生存(圖17)。為了清楚僅做了-1小時(shí)的曲線(xiàn)，可是，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)(-1和-2小時(shí))提供相似的生存率和動(dòng)力學(xué)。4小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)顯示一些防護(hù)的下降。放射24小時(shí)前注射鞭毛蛋白對(duì)13Gy誘導(dǎo)的死亡沒(méi)有防護(hù)作用。
有趣的是，10Gyγ射線(xiàn)照射前24小時(shí)投藥鞭毛蛋白提供100％的防護(hù)。而13Gy照射在小鼠中主要由GI癥狀誘導(dǎo)死亡，10Gy誘導(dǎo)的死亡多數(shù)是由造血癥狀介導(dǎo)的。從而，這種對(duì)10Gy照射的長(zhǎng)期的保護(hù)可能是通過(guò)鞭毛蛋白和/或長(zhǎng)期二級(jí)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的增強(qiáng)的造血干細(xì)胞的增殖或生存介導(dǎo)的。
實(shí)施例12確定鞭毛蛋白的LD50/30、LD50/7和DMF我們得到了鞭毛蛋白的放射劑量依賴(lài)防護(hù)評(píng)估。如上所示(圖17)，用鞭毛蛋白處理的能夠100％防護(hù)10Gyγ射線(xiàn)(此劑量引起造血癥狀的死亡)，對(duì)13Gy 30天的生存為90％(造血和GI綜合癥)。如上所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，放射1小時(shí)前用鞭毛蛋白5μg/小鼠(0.2mg/kg)腹腔注射。
可是，在15Gy，7天生存率為100％，死亡延遲到13天之后，(30天的生存率為0％)，而對(duì)照組第7天全部死于GI綜合癥。

圖8，CBLB501在小鼠對(duì)全身γ射線(xiàn)量10、13、15Gy的敏感性上的效果(詳見(jiàn)本文)。
(圖18)15Gy照射后CBLB-501處理組的死亡的動(dòng)力學(xué)治療組死亡率為使人想起對(duì)照組在10Gy的死亡率，暗示死亡由造血綜合癥引起。此結(jié)果提供了鞭毛蛋白LD50/30在大約13.5-14Gy和大約1.75-1.8的DMF30的評(píng)估。此放射防護(hù)水平顯著高于報(bào)道的任何天然化合物。
表1TLR5對(duì)鞭毛蛋白反應(yīng)并激活NF-kB用空載體(pCDNA3.1)或獨(dú)自列出的野生型TLR等位基因在6孔平板中轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，重復(fù)三次。細(xì)胞未處理(未刺激)、TNFα(10ng/ml)或鞭毛蛋白(1μg/ml)處理。通過(guò)將相對(duì)于到對(duì)照Renilla熒光素酶活性表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化調(diào)整NF-kB報(bào)告活性，通過(guò)處理細(xì)胞的報(bào)告基因活性/未刺激細(xì)胞的報(bào)告基因活性計(jì)算誘導(dǎo)倍數(shù)。ND為未測(cè)定。


權(quán)利要求
1.從輻射作用中防護(hù)哺乳動(dòng)物的方法，其包括向所述哺乳動(dòng)物投藥含有藥學(xué)有效劑量的鞭毛蛋白的組合物。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物與輻射防護(hù)劑聯(lián)合給藥。
3.如權(quán)利要求2的方法，其中所述輻射防護(hù)劑是抗氧化劑。
4.如權(quán)利要求3的方法，其中所述抗氧化劑選自amifostine或維生素E。
5.如權(quán)利要求2的方法，其中所述輻射防護(hù)劑是細(xì)胞因子。
6.如權(quán)利要求6的方法，其中所述細(xì)胞因子是干細(xì)胞因子。
7.從一種或多種誘發(fā)凋亡的治療或狀態(tài)中保護(hù)患者的方法，其包括向所述患者投藥含有藥學(xué)有效劑量的鞭毛蛋白的組合物。
8.如權(quán)利要求7的方法，其中所述治療是腫瘤治療。
9.如權(quán)利要求8的方法，其中所述治療是化療或放療。
10.如權(quán)利要求7的方法，其中所述治療是壓力，其選自輻射、創(chuàng)傷、中毒、感染或高溫應(yīng)激。
11.如權(quán)利要求1-10任何一項(xiàng)的方法，其中所述鞭毛蛋白衍生自沙門(mén)氏菌種。
全文摘要
本發(fā)明描述了鞭毛蛋白在防止哺乳動(dòng)物凋亡效果中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K38/19GK1913915SQ200480041259
公開(kāi)日2007年2月14日 申請(qǐng)日期2004年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月2日
發(fā)明者A·V·古德克夫 申請(qǐng)人:克里夫蘭臨床基金會(huì)