專利名稱：降低應(yīng)激對皮膚調(diào)理的作用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及降低長期心理應(yīng)激對皮膚調(diào)理的作用的方法。本發(fā)明還涉及用于該方法的化合物和鑒定合適的化合物的實驗方法。
背景技術(shù)：
經(jīng)縱向研究表明，因日常生活導(dǎo)致的神經(jīng)內(nèi)分泌應(yīng)激是年齡相關(guān)病癥的主要內(nèi)驅(qū)力。另外，多項消費者研究表明，心理應(yīng)激對個人健康狀況至關(guān)重要。但對于這種應(yīng)激對皮膚外觀的影響及其根本的生物學(xué)機制卻知之甚少。
發(fā)明概述我們開發(fā)出一種模擬慢性應(yīng)激作用的模型系統(tǒng)，并用這個系統(tǒng)研究了慢性應(yīng)激對皮膚的作用。我們運用該模型，發(fā)現(xiàn)用糖皮質(zhì)激素對皮膚細胞進行慢性處理所代表的慢性應(yīng)激，會導(dǎo)致皮膚對急性應(yīng)激做出有利反應(yīng)的能力降低。具體地說，我們發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激細胞中，表達基質(zhì)降解和基質(zhì)合成所需蛋白質(zhì)的能力降低，基質(zhì)降解和基質(zhì)合成過程是皮膚修復(fù)和維持所必需的。換言之，我們發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激導(dǎo)致與皮膚調(diào)理明顯有關(guān)的皮膚基質(zhì)的重建受到損害。
我們還發(fā)現(xiàn)，正如與皮膚炎癥反應(yīng)有關(guān)的蛋白質(zhì)的表達增加所顯示的一樣，慢性應(yīng)激皮膚細胞顯示對急性應(yīng)激的敏感性顯著增加。
這些發(fā)現(xiàn)使我們能夠開發(fā)出一種鑒定能夠降低心理誘導(dǎo)應(yīng)激等神經(jīng)內(nèi)分泌介導(dǎo)應(yīng)激對皮膚調(diào)理的作用的化合物的實驗方法。運用這一實驗方法，我們鑒定出許多降低慢性糖皮質(zhì)激素暴露對皮膚細胞對急性應(yīng)激反應(yīng)能力的有害作用的藥物。
因此，第一方面，本發(fā)明提供降低心理介導(dǎo)的應(yīng)激對人或動物皮膚的作用的方法，該方法包括給予個體能夠抑制真皮細胞或與皮膚炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激的組合物。
在一個相關(guān)方面，本發(fā)明提供能夠抑制真皮細胞或與皮膚炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激的組合物在制備用于降低心理介導(dǎo)的應(yīng)激對人或動物皮膚的作用的組合物中的用途。
優(yōu)選所述組合物經(jīng)口服或局部給藥。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述組合物包含第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)，其中第一種物質(zhì)能夠抑制與皮膚炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激，第二種物質(zhì)能夠抑制真皮細胞的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激，條件是所述第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)是不同的。
優(yōu)選所述組合物包含第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)，其中第一種物質(zhì)選自人參Rb1、人參Rc、姜黃素、22-OH-膽甾醇、環(huán)格列酮、洛伐他汀(mevinolin)、沒藥酸(commipheric acid)、岡田酸、甘草提取物及其混合物；第二種物質(zhì)選自枸杞(wolfberry)提取物、香菇提取物、激活素(activin)、人參Rb1、人參Rc、姜黃素、環(huán)格列酮、沒藥酸、乳香(boswellia)提取物及其混合物，條件是所述第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)是不同的。
第二方面，本發(fā)明提供包含第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)的組合物，其中第一種物質(zhì)能夠抑制與皮膚炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激，第二種物質(zhì)能夠抑制真皮細胞的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激，條件是所述第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)是不同的。
在一個相關(guān)方面，本發(fā)明提供包含第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)的組合物，其中第一種物質(zhì)選自人參Rb1、人參Rc、姜黃素、22-OH-膽甾醇、環(huán)格列酮、洛伐他汀、沒藥酸、岡田酸、甘草提取物及其混合物；第二種物質(zhì)選自枸杞提取物、香菇提取物、激活素、人參Rb1、人參Rc、姜黃素、環(huán)格列酮、沒藥酸、乳香提取物及其混合物，條件是所述第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)是不同的。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述組合物的形式為營養(yǎng)補充劑(nutritional supplement)或化妝品組合物。
第三方面，本發(fā)明提供用于能夠降低心理介導(dǎo)的應(yīng)激對人或動物皮膚的作用的化合物的鑒定方法，該方法包括(i)在糖皮質(zhì)激素受體激動劑存在下，在無候選化合物時將會導(dǎo)致細胞經(jīng)受慢性應(yīng)激的條件和時間內(nèi)，使真皮細胞或與皮膚炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞與候選化合物接觸；(ii)使細胞經(jīng)受急性應(yīng)激；(iii)分析細胞中的一種或多種細胞標(biāo)記，所述標(biāo)記選自炎性細胞募集標(biāo)記，其中所述細胞是與皮膚炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞；基質(zhì)降解標(biāo)記，其中所述細胞是真皮細胞；和/或基質(zhì)合成標(biāo)記，其中所述細胞是真皮細胞；和(iv)確定候選化合物是否影響所述的一種或多種細胞標(biāo)記的狀態(tài)。
優(yōu)選步驟(iv)包括將所述標(biāo)記在有候選化合物時的狀態(tài)與所述標(biāo)記在無候選化合物時的狀態(tài)進行比較。
優(yōu)選炎性細胞募集標(biāo)記是ICAM-1和/或vCAM-1的表達水平。
優(yōu)選基質(zhì)降解標(biāo)記選自MMP-1、MMP-2和/或MMP-9的表達水平。
優(yōu)選基質(zhì)合成標(biāo)記選自前膠原-1、膠原I和/或膠原III的表達水平。
本發(fā)明還提供用于降低心理介導(dǎo)的應(yīng)激對人或動物皮膚的作用的組合物的制備方法，該方法包括(i)在糖皮質(zhì)激素受體激動劑存在下，在無候選化合物時將會導(dǎo)致細胞經(jīng)受慢性應(yīng)激的條件和時間內(nèi)，使真皮細胞或與皮膚炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞與候選化合物接觸；(ii)使細胞經(jīng)受急性應(yīng)激；
(iii)分析細胞中的一種或多種細胞標(biāo)記，所述標(biāo)記選自炎性細胞募集標(biāo)記，其中所述細胞是與皮膚炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞；基質(zhì)降解標(biāo)記，其中所述細胞是真皮細胞；和/或基質(zhì)合成標(biāo)記，其中所述細胞是真皮細胞；(iv)確定候選化合物是否影響所述的一種或多種細胞標(biāo)記的狀態(tài)；(v)選擇出步驟(iv)中所鑒定的影響所述的一種或多種細胞標(biāo)記狀態(tài)的候選化合物；和(vi)將所述化合物與化妝品或藥物可接受的載體或稀釋劑混合。
發(fā)明詳述本文所用的所有科技術(shù)語與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同，除非另有說明。
實驗方法本發(fā)明的實驗方法可用于鑒定緩解慢性應(yīng)激對皮膚的作用的化合物。使用體外模型，測試藥物降低或防止對下述細胞的作用的能力經(jīng)受慢性應(yīng)激的真皮細胞、與皮膚炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞或源自糖皮質(zhì)激素等糖皮質(zhì)激素(GC)受體激動劑處理的細胞。缺乏試驗藥物時，將細胞暴露于GC受體激動劑一段時間，在細胞對急性應(yīng)激(例如氧化應(yīng)激)的反應(yīng)上產(chǎn)生有害作用。因此，經(jīng)過預(yù)處理期后，使細胞經(jīng)受急性應(yīng)激，檢測關(guān)鍵標(biāo)記的狀態(tài)，特別是炎癥/炎性細胞募集標(biāo)記、基質(zhì)合成標(biāo)記和/或基質(zhì)降解標(biāo)記的狀態(tài)，以測定GC受體激動劑介導(dǎo)的應(yīng)激的作用。
用于本實驗方法中合適的細胞分為兩類(1)與炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞和(2)真皮細胞。
皮膚中與炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞包括內(nèi)皮細胞、脂肪細胞、免疫細胞、肥大細胞、朗格漢斯細胞(Langerhans′cells)和造血源(haemopoietic origin)的細胞，例如T淋巴細胞、巨噬細胞、白細胞和嗜中性粒細胞及其衍生細胞。優(yōu)選的細胞是內(nèi)皮細胞。
真皮細胞包括真皮濾泡細胞(真皮乳頭和結(jié)締組織鞘)、真皮成纖維細胞、毛囊角質(zhì)形成細胞和黑素細胞、皮脂腺細胞，例如皮脂細胞(sebocytes)及其衍生細胞。優(yōu)選的細胞是成纖維細胞和黑素細胞。細胞通常來源于哺乳動物。
測定炎癥狀態(tài)的標(biāo)記時，優(yōu)選的細胞類型包括內(nèi)皮細胞，測定基質(zhì)更新(matrix turnover)的標(biāo)記時，優(yōu)選的細胞類型包括真皮成纖維細胞，更優(yōu)選新生兒真皮成纖維細胞。
另一優(yōu)選的細胞類型是毛囊黑素細胞，因為這些細胞負(fù)責(zé)提供毛發(fā)色素。因此，這些細胞可用于本發(fā)明的實驗方法，以鑒定可用于降低心理應(yīng)激對毛發(fā)脫色/毛發(fā)變白的作用的藥物。
細胞可以是僅在細胞培養(yǎng)物中進行為數(shù)有限的傳代的原代細胞，或是無限增殖化細胞系。術(shù)語“從其衍生的”是指從原代細胞培養(yǎng)物獲得的無限增殖化細胞系。
用本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)細胞培養(yǎng)技術(shù)使細胞生長和傳代。培養(yǎng)基通常補充了特定細胞類型所需的動物源性血清制品和生長因子。
在實驗的第一階段，細胞用一種或多種糖皮質(zhì)激素等糖皮質(zhì)激素(GC)受體激動劑進行預(yù)處理，該GC受體激動劑與GC受體結(jié)合并激活GC受體。GC受體激動劑具體的實例包括地塞米松、氫化可的松、皮質(zhì)醇、潑尼松龍和倍他米松。
用一種或多種GC受體激動劑進行預(yù)處理，包括有可能在細胞對給予的其它化合物(例如促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素(CRH)做出反應(yīng)時，產(chǎn)生該激動劑。然而，優(yōu)選的是預(yù)處理包括向培養(yǎng)基中添加GC受體激動劑，即直接處理，而不是刺激細胞原位產(chǎn)生糖皮質(zhì)激素。
通常在培養(yǎng)基中加入濃度為1nM-10μM的GC受體激動劑。
細胞優(yōu)選用GC受體激動劑預(yù)處理至少2天，更優(yōu)選至少3天或4天，最優(yōu)選至少5天。通常，定期(例如每日)給予GC受體激動劑，因為這很可能更近似地模擬慢性應(yīng)激的持續(xù)作用。
由于本發(fā)明的目的是為了確定藥物是否能夠拮抗GC受體激動劑的作用，因此在預(yù)處理階段，一般是在開始時，便向培養(yǎng)基中加入候選藥物。這可方便的在加入GC受體激動劑的同時進行。再者，通常候選藥物也是定期(例如每日)給予的。
預(yù)處理之后，對細胞施加急性應(yīng)激，檢測細胞對急性應(yīng)激的反應(yīng)。急性應(yīng)激包括氧化應(yīng)激(例如乙酸肉豆蔻佛波醇)、其它形式的化學(xué)應(yīng)激、機械應(yīng)激或電磁應(yīng)激例如UV輻射。
在一個或多個合適的時間點，收獲組織培養(yǎng)上清液和/或細胞沉淀，并進行測試，以檢測目標(biāo)標(biāo)記的狀態(tài)。例如，可用基于核酸的檢測技術(shù)，例如PCR或雜交，或者基于蛋白質(zhì)的檢測技術(shù)，例如免疫測定，檢測目標(biāo)基因的表達水平。
合適的炎癥狀態(tài)標(biāo)記包括胞間黏著分子(ICAM)如ICAM-1和vCAM等。合適的基質(zhì)合成標(biāo)記包括前膠原-1、膠原I和膠原III，合適的基質(zhì)降解標(biāo)記包括MMP-1、MMP-2和MMP-9(金屬基質(zhì)蛋白酶)。
用于本發(fā)明方法中的下述合適的藥物，與僅有GC受體激動劑的對照相比，將降低炎癥狀態(tài)/炎性細胞募集標(biāo)記的水平，優(yōu)選至僅有溶媒的對照的至少+20％或+10％。
用于本發(fā)明方法中的下述合適的藥物，與GC受體激動劑對照相比，將增加基質(zhì)合成標(biāo)記和/或基質(zhì)降解標(biāo)記的水平，優(yōu)選至僅有溶媒的對照的至少約-50％或約-20％。
測試目標(biāo)標(biāo)記狀態(tài)的合適的時間點，通常隨具體標(biāo)記而變化。例如，在急性應(yīng)激后3小時至7小時間內(nèi)，優(yōu)選對ICAM-1表達進行至少一次測定。相比之下，在急性應(yīng)激后18小時至36小時內(nèi)，優(yōu)選對MMP-1表達進行至少一次測定。
候選藥物可包括糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑、PPAR-γ受體激動劑、AP-1/NF-κB抑制劑、PXR激動劑、LXR激動劑、皮質(zhì)醇抑制劑和磷酸酶抑制劑。一般地講，可從組合文庫、肽和肽模擬物、確定的化學(xué)實體(defined chemical entities)和天然產(chǎn)物文庫中，篩選出作為GC介導(dǎo)的慢性應(yīng)激抑制劑的活性成分。
用于本發(fā)明方法的藥物直接靶向糖皮質(zhì)激素對皮膚的慢性作用。因此，可能需要證實，試驗藥物在急性應(yīng)激處理步驟中，不直接影響目標(biāo)細胞標(biāo)記的表達，而是在預(yù)處理步驟中影響GC受體激動劑的作用。例如，這可通過在預(yù)處理步驟中，使用包括試驗藥物但無GC受體激動劑的對照加以證實。
降低心理介導(dǎo)的應(yīng)激對皮膚的作用的方法本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，即皮膚細胞或與皮膚炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞慢性暴露于糖皮質(zhì)激素時，能夠使皮膚對付急性應(yīng)激的機制遭到破壞。這一發(fā)現(xiàn)提示，阻斷糖皮質(zhì)激素對皮膚細胞的有害作用，將降低心理介導(dǎo)的應(yīng)激對人和其它動物皮膚的作用。進而，將降低或改善心理應(yīng)激對皮膚調(diào)理的作用。
因此，本發(fā)明提供降低心理介導(dǎo)的應(yīng)激對人或動物皮膚的作用的方法，該方法包括給予個體能夠抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激對皮膚的作用的組合物，尤其是給予抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激在皮膚對急性應(yīng)激(例如氧化應(yīng)激和/或暴露在UV下)反應(yīng)中的作用的組合物。因為我們已確定，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激對皮膚的作用包括降低皮膚的基質(zhì)更新，增強對急性應(yīng)激的炎癥反應(yīng)，在一個優(yōu)選的實施方案中，所述組合物能夠降低這兩種不同的作用。這可通過單一活性成分或分別靶向各個作用的兩種單獨的成分得以實現(xiàn)。
因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，所述組合物包含第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)，其中第一種物質(zhì)抑制與皮膚炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激，第二種物質(zhì)抑制真皮細胞的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激，條件是所述第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)是不同的。優(yōu)選與皮膚炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞是內(nèi)皮細胞。優(yōu)選真皮細胞是成纖維細胞。
基質(zhì)更新進而可分為兩個過程——基質(zhì)降解和基質(zhì)合成。優(yōu)選組合物包含降低慢性GC介導(dǎo)的應(yīng)激對這兩個過程的有害作用的物質(zhì)。
另一方面，本發(fā)明提供降低心理介導(dǎo)的應(yīng)激對人或動物毛發(fā)顏色的作用的方法，該方法包括給予個體組合物，所述組合物抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激對黑素細胞的作用，尤其是抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激在細胞對急性應(yīng)激反應(yīng)中的作用。
可通過多種途徑給予組合物，例如局部給予或系統(tǒng)給予如口服給予。組合物通常以每日三次或每周兩次的頻率給藥。
組合物本發(fā)明的組合物和用于本發(fā)明方法的組合物，優(yōu)選包含第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)，其中第一種物質(zhì)能夠抑制與皮膚炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激，第二種物質(zhì)能夠抑制真皮細胞的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激，條件是所述第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)是不同的。
這類物質(zhì)包括PPAR-γ激動劑、AP-1/NF-κB抑制劑、PXR激動劑、LXR激動劑、皮質(zhì)醇抑制劑和磷酸酶抑制劑。具體實例包括人參Rb1、人參Rc、姜黃素、22-OH-膽甾醇、環(huán)格列酮、洛伐他汀、沒藥酸、岡田酸、甘草提取物、枸杞提取物、香菇提取物、激活素、人參Rb1、人參Rc和乳香提取物。
可用本發(fā)明的上述實驗方法對其它活性劑進行鑒定。特別是可運用本發(fā)明中使用與炎癥反應(yīng)有關(guān)細胞的實驗，檢測炎性細胞募集標(biāo)記(例如ICAM-1表達或vCAM表達)，對活性劑進行鑒定，所述活性劑降低慢性GC介導(dǎo)的應(yīng)激在皮膚對急性應(yīng)激的炎癥反應(yīng)中的作用?？蛇\用本發(fā)明使用真皮細胞的實驗，檢測基質(zhì)降解和/或基質(zhì)合成反應(yīng)的標(biāo)記(例如MMP-1和/或前膠原-1的表達)，對活性劑進行鑒定，所述活性劑降低慢性GC介導(dǎo)的應(yīng)激對皮膚基質(zhì)更新過程(即基質(zhì)降解和/或基質(zhì)合成)的作用。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述組合物包含第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)，其中第一種物質(zhì)選自人參Rb1、人參Rc、姜黃素、22-OH-膽甾醇、環(huán)格列酮、洛伐他汀、沒藥酸、岡田酸、甘草提取物及其混合物；第二種物質(zhì)選自枸杞提取物、香菇提取物、激活素、人參Rb1、人參Rc、姜黃素、環(huán)格列酮、沒藥酸、乳香提取物及其混合物，條件是所述第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)是不同的。
局部用組合物本發(fā)明的組合物可局部給予受治療者，即直接將組合物涂抹或涂敷在包括頭皮的皮膚上?？赏ㄟ^將安全有效量的上述活性物質(zhì)與藥物可接受的局部用載體混合，制備此類組合物。
用于本發(fā)明的局部用組合物可制成多種多樣的產(chǎn)品類型。這些類型包括但不限于洗劑、乳膏劑、凝膠劑、棒狀制劑(stick)、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、精油、摩絲和化妝品。這些產(chǎn)品類型可含有幾種類型的載體系統(tǒng)，包括但不限于溶液、乳液、凝膠、貼皮劑和固體。
用于本發(fā)明的配制成溶液劑的局部用組合物，通常包括藥物可接受的水溶劑或有機溶劑。術(shù)語“藥物可接受的水溶劑”和“藥物可接受的有機溶劑”是指能夠使活性物質(zhì)分散或溶解于其中的溶劑，且具備可接受的安全性能(例如刺激特征和致敏特征)。合適的有機溶劑的實例包括丙二醇、聚乙二醇(200-600)、聚丙二醇(425-2025)、聚乙烯吡咯烷、丙二醇-14丁基醚、甘油、1，2，4-丁三醇、山梨醇酯、1，2，6-己三醇、乙醇、異丙醇、丁二醇及其混合物。這些用于本發(fā)明的溶液劑優(yōu)選含有約0.001％至約10％、更優(yōu)選約0.01％至約8％、再更優(yōu)選約0.1％至約5％、也優(yōu)選約0.5％至約3％的活性物質(zhì)，和優(yōu)選約50％至約99.99％、更優(yōu)選約90％至約99％可接受的水溶劑或有機溶劑。
如果將用于本發(fā)明的局部用組合物制成氣霧劑，以噴射的方式施用于皮膚，需向溶液組合物中加入推進劑。
局部用組合物可制成含有潤膚劑的溶液劑，潤膚劑即用于防止或減緩干燥以及保護皮膚的材料。已知各種各樣合適的潤膚劑，并可用于本文(參見Sagarin，Cosmetics，Science and Technology(化妝品科學(xué)與技術(shù))第二版，第一冊，第32-43頁(1972))。這類組合物優(yōu)選含有約2％至約50％局部用藥物可接受的潤膚劑。
如果將載體制成乳劑，優(yōu)選約1％至約10％、更優(yōu)選約2％至約5％的載體系統(tǒng)含有乳化劑。乳化劑可以是非離子乳化劑、陰離子乳化劑或陽離子乳化劑。例如McCutcheon′s Detergents and Emulsifiers(McCutcheon洗滌劑和乳化劑)，北美版(North American Edition)，第317-324頁(1986)公開了合適的乳化劑。
單相乳化護膚制劑，例如水包油型和油包水型的洗劑和乳膏劑，在化妝品領(lǐng)域是眾所周知的。此類乳劑可穩(wěn)定和增強活性物質(zhì)的滲透性。也可使用水包油包水型等多相乳劑組合物。一般地講，此類單相或多相乳劑含有作為必需成分的水、潤膚劑和乳化劑。
可使用的另一個乳化載體系統(tǒng)是微乳載體系統(tǒng)。此類系統(tǒng)含有約9％至約15％角鯊?fù)?、約25％至約40％硅油、約8％至約20％脂肪醇、約15％至約30％聚氧乙烯失水山梨糖醇單脂肪酸(以商品名吐溫(Tweens)出售)或其它非離子表面活性劑和約7％至約20％水。
還可使用脂質(zhì)體制劑。該制劑可穩(wěn)定活性物質(zhì)，也可改進不能充分滲透的活性物質(zhì)的釋放?？筛鶕?jù)Mezei和Gulasekharam，Journal ofPharmaceutics and Pharmacology，第34冊(1982)，第473-474頁所述方法或其修改方法，先將活性物質(zhì)與二棕櫚?；字Ｄ憠A等磷脂、膽甾醇和水混合，制備此類組合物。用于形成脂質(zhì)體的合適的組合物的表皮脂質(zhì)可以代替磷脂。然后將脂質(zhì)體制劑摻入上述的一種局部用載體系統(tǒng)(例如凝膠或水包油乳液)中，以制備脂質(zhì)體制劑。Mezei，M.，“Liposomes as a Skin Drug Delivery System(作為皮膚遞藥系統(tǒng)的脂質(zhì)體)”，Topics in Pharmaceutical Sciences(制藥科學(xué)專題(D.D.Breimer和P.Speiser主編)，Elsevier Science Publishers B.V.，NewYork，N.Y.，1985，第345-358頁中，描述了局部使用脂質(zhì)體的其它組合物及其化妝品/藥物用途。
如果將局部用組合物制成棒狀凝膠或棒狀化妝品，可按前述文獻的方法，在乳膏劑或洗劑中加入適量的增稠劑，制備這類組合物。
局部用組合物也可制成化妝品，例如粉底化妝品。粉底化妝品是以適量增稠劑、色素和日用香料為基礎(chǔ)的溶液或洗液。
局部用組合物除包括上述組分外，還可包括其它各種各樣的油溶性原料和/或水溶性原料，這些原料以其領(lǐng)域規(guī)定的水平，按常規(guī)用于局部用組合物中。
組合物中還存在各種水溶性原料。這些原料包括保濕劑、蛋白質(zhì)和多肽及防腐劑。另外，本文所用的局部用組合物可包含常規(guī)化妝品輔助劑，例如染料、遮光劑(例如二氧化鈦)、色素和香料。
用于本發(fā)明的局部用組合物還可包括安全有效量的滲透增強劑。優(yōu)選的滲透增強劑的量占組合物的約1％至約5％。美國專利6,068,834中描述了可用滲透增強劑的實例。組合物中也可包括其它常規(guī)的護膚品添加劑。例如可使用膠原、透明質(zhì)酸、彈性蛋白、水解產(chǎn)物、櫻草油、霍霍巴油、表皮生長因子、大豆皂苷(soybeansaponins)、粘多糖及其混合物。
組合物中還可包括各種維生素。例如可使用維生素A及其衍生物、維生素B2、生物素、泛酸、維生素D及其混合物。
本發(fā)明的組合物中，可能需要包括一種或多種防曬劑。例如Cosmetics，Science and Technology第二版(1972)，第1冊，第VIII章，第189頁及其后的參考文獻，描述了各種各樣的常用防曬劑。還可參見美國專利6,068,834。
防曬劑必須與活性物質(zhì)相容。組合物優(yōu)選含約1％至約20％、更優(yōu)選約2％至約10％的防曬劑。準(zhǔn)確的用量隨所選擇的防曬劑和所需要的防曬因子(Sun Protection Factor，SPF)而變化。
本發(fā)明的任何組合物中還可加入改善組合物的皮膚直接性，尤其是增強組合物的耐水沖洗性或耐擦除性的成分。提供此益處優(yōu)選的成分是乙烯和丙烯酸的共聚物。美國專利4,663,157公開了含有這一共聚物的組合物。
本發(fā)明涉及降低心理介導(dǎo)的應(yīng)激對人或動物皮膚的作用的方法。此方法包括在皮膚或皮膚部位，例如頭皮或面部，給予安全有效量的本發(fā)明組合物?；钚詣┑挠昧亢褪褂妙l率將隨皮膚的最初狀態(tài)而變化。
可使用任何不超過毒性水平的劑量，因此，設(shè)計出一些劑型，尤其是局部用劑型，“劑量”為提供所需效果的任何用量，該用量由于使用頻率和使用量可能非常之大，以致于最大有效量是不切實際的。
在局部用組合物中使用的安全有效量的活性物質(zhì)，通常每次使用約1μg/cm2皮膚至約1mg/cm2皮膚，優(yōu)選每次使用約2μg/cm2皮膚至約800μg/cm2皮膚，更優(yōu)選約30μg/cm2皮膚至約700μg/cm2皮膚，最優(yōu)選約75μg/cm2皮膚至約250μg/cm2皮膚。使用頻率范圍一般約每天四次至約每周兩次，更優(yōu)選約每天三次至約隔天一次，更優(yōu)選至少每天兩次。
藥物組合物本發(fā)明的組合物可與藥物可接受的載體或稀釋劑聯(lián)用以制備藥物組合物。適用于此類組合物的藥物可接受的稀釋劑或載體，在制藥領(lǐng)域廣為人知。本發(fā)明的組合物通常含1-90％(重量)活性物質(zhì)，例如1-50％(重量)活性物質(zhì)。
藥物組合物可由固體劑型組成，例如片劑、硬明膠膠囊劑、軟明膠膠囊劑、整裝粉劑和藥物微膠囊劑?；蛘?，藥物組合物可由液體劑型組成，例如水或非水溶液劑、乳劑或混懸劑。
用于口服給藥的固體組合物為本發(fā)明優(yōu)選的組合物。本發(fā)明的固體組合物優(yōu)選按單位劑型制備，例如片劑劑型和膠囊劑型?？筛鶕?jù)已知方法，在存在崩解劑(例如玉米淀粉)和潤滑劑(例如硬脂酸鎂)時，將活性化合物與惰性稀釋劑(例如磷酸鈣)混合，壓片，制備合適的片劑。如果需要，可通過已知方法給此片劑包腸溶衣，例如使用鄰苯二甲酸醋酸纖維素。同樣，可通過常規(guī)方法，或以小珠粒的形式，加入或不加入賦形劑，制備含有活性化合物的膠囊劑，例如硬明膠膠囊劑或軟明膠膠囊劑等，如果需要，按已知方法給此片劑包腸溶衣。可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備片劑，以便提供控制釋放的本發(fā)明化合物。
本發(fā)明藥物組合物的控釋劑型包括速釋制劑(例如可溶性顆粒劑或熔融充填速釋膠囊劑(melt filled fast release capsules))、延釋制劑(例如用諸如鄰苯二甲酸醋酸纖維素的腸溶包衣提供的片劑)，尤其是緩釋制劑。許多緩釋制劑的類型為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。通常，可將活性化合物裝入用纖維素醚/丙烯酸酯共聚物等緩釋包衣(releaseretarding coating)制成的膠囊內(nèi)，或者可將活性化合物結(jié)合到離子交換樹脂珠粒等小顆粒上?；蛘撸蓪⒒钚曰衔飺饺牒芯忈寗?release retarding agent)的骨架中，所述緩釋劑為例如黃原膠等親水樹膠、羥丙基甲基纖維素等纖維素衍生物、或多糖、蠟或塑料材料。
還可將活性化合物制成固體劑型，其中的兩種活性藥物被分隔開。例如劑型可以是雙層片劑，其中活性藥物含在不同片層中?？芍瞥刹煌钠瑢樱员闾峁└魉幬锏淖罴厌尫盘匦?。
黏性液體充填劑(viscous liquid fill)、液體糊狀充填劑或觸變液體充填劑等液體充填劑組合物也適用于口服給藥?？赏ㄟ^將活性化合物與某些天然植物油脂肪酸的酯(例如GelucireTM，由Gattefosse公司出售，可提供不同釋藥速率)混合，得到熔融充填組合物。合適的熔融充填膠囊劑含有10-80％活性物質(zhì)和20-90％脂肪酸酯賦形劑，該賦形劑含有一種或多種多元醇酯和天然植物油脂肪酸的甘油三酯。
優(yōu)選口服液體組合物包含1-10％(重量)的活性物質(zhì)與1-50％(重量)的稀釋劑，其余用無菌水補足。組合物可任選含有懸浮劑、增稠劑、醇等助溶劑和/或防腐劑。合適的稀釋劑包括山梨醇、木糖醇或蔗糖等甜味劑。合適的懸浮劑或增稠劑包括纖維素膠、瓊脂或天然樹膠如黃原膠。還可加入本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的矯味劑或其它掩味劑，例如糖精、糖精鈉、乙酰舒泛鉀或天冬甜素。
適于胃腸外給藥的本發(fā)明組合物，可通過將活性物質(zhì)與用于該給藥形式的已知的藥物聯(lián)合制備，例如由活性物質(zhì)加上合適溶劑(例如鹽水)制成的無菌混懸劑或無菌溶液劑。
優(yōu)選的給藥方式為口服、局部和胃腸外(例如皮下注射、肌內(nèi)注射、關(guān)節(jié)內(nèi)注射、靜脈注射等)。因此，具體的給藥方式包括但不限于口服、經(jīng)皮、黏膜、舌下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下給藥，以及局部用藥。最優(yōu)選的使用方法為局部或口服。
化合物的給藥量取決于藥物組合物中化合物的生物利用度，特別是口服給藥時。然而一般情況下，本發(fā)明化合物的給藥量約0.01mg/kg體重至約100mg/kg體重，優(yōu)選約0.1mg/kg體重至約30mg/kg體重。藥物組合物的量(為每劑所需化合物量的函數(shù))取決于配方中化合物的百分比、穩(wěn)定性、釋藥特征和其它制藥參數(shù)。
優(yōu)選的注射給藥方法取決于所使用的特定活性物質(zhì)的溶解度和穩(wěn)定性。
給藥途徑和處方劑量僅作為指導(dǎo)，因為熟練的從業(yè)人員能夠容易地確定用于任何具體患者和病癥的最佳給藥途徑和劑量。
另一種系統(tǒng)給藥方式包括在食品中給予前述的任何組合物，因此沒有必要使用任何藥理上可接受的載體。
本文所用術(shù)語“食品”包括食品本身和飲料。合適的食品本身包括抹醬、乳制品(包括牛奶和酸牛奶)、點心、方便食品/零食、早餐谷物食品和壓塊干糧、熟食、面包和冷凍甜點食品例如冰淇淋、冰糕和果汁飲料及酸牛奶冰淇淋。食品還包括膳食/營養(yǎng)補充劑。合適的飲料包括茶、茶味飲料、咖啡、軟飲料(例如果汁汽水等)和果汁。
食品中特別補充了本發(fā)明的活性成分，使得其中活性成分的含量高于正常含量。
下面將參照下述實施例對本發(fā)明作進一步說明，所述實施例僅用于說明而非限制。
實施例參照以下


圖1表示HUVEC中ICAM-1表達水平的曲線圖。
圖2表示HMVEC-d細胞中ICAM-1表達水平的曲線圖。
圖3表示HUVEC中ICAM-1表達水平的曲線圖。
圖4表示HUVEC中ICAM-1表達水平的曲線圖。
圖5表示新生兒真皮成纖維細胞中MMP-1表達水平的曲線圖。
圖6表示得自成人的真皮成纖維細胞中MMP-1表達水平的曲線圖。
圖7表示新生兒真皮成纖維細胞中MMP-9表達水平的曲線圖。
圖8表示新生兒真皮成纖維細胞中前膠原-1表達水平的曲線圖。
圖9-13表示HUVEC中ICAM-1表達水平的曲線圖。
實施例實施例1慢性應(yīng)激對內(nèi)皮細胞炎癥狀態(tài)的作用實驗方法概要已開發(fā)出一種體外模型以研究慢性應(yīng)激對內(nèi)皮細胞炎癥狀態(tài)的影響。
a.讓細胞在6孔(9.5cm2)板中生長。
b.5天內(nèi)每天加入合成的糖皮質(zhì)激素(地塞米松)進行預(yù)處理，使細胞經(jīng)受“慢性應(yīng)激”。
c.在時間點T0時，收獲組織培養(yǎng)上清液和細胞沉淀。
d.用1μM乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)使細胞經(jīng)受氧化應(yīng)激。
e.在PMA處理后的6小時、24小時和48小時(分別為T6、T24和T48)，收獲組織培養(yǎng)上清液和細胞沉淀。
f.檢測所有組織培養(yǎng)上清液的乳酸脫氫酶(LDH)，以衡量細胞毒性以及白介素-6的合成。
g.所有細胞經(jīng)計數(shù)(Beckman Coulter Counter)，沉淀，檢測細胞裂解液中ICAM-1(胞內(nèi)黏著分子-1)的表達水平。
材料與方法內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)將HUVEC細胞(人臍靜脈內(nèi)皮細胞，TCS Biologicals)在EGM-2(內(nèi)皮生長培養(yǎng)基，Biowhittaker)中進行培養(yǎng)和傳代，該EGM-2補充了肝素、VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)、硫酸慶大霉素、抗壞血酸、HEGF(人內(nèi)皮生長因子)、氫化可的松、HFGF-B(人成纖維細胞生長因子B)、R3-IGF-1(長R胰島素樣生長因子-1(long R insulin-like growth factor)和FBS(胎牛血清)。
將HMVEC-d細胞(人真皮微血管內(nèi)皮細胞，Clonetics)在EGM-2MV(微血管內(nèi)皮生長培養(yǎng)基，Biowhittaker)中進行培養(yǎng)和傳代，該EGM-2MV補充了VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)、硫酸慶大霉素、抗壞血酸、氫化可的松、HFGF-B(人成纖維細胞生長因子B)、R3-IGF-1(長R胰島素樣生長因子-1)和FBS(胎牛血清)。
通常在實驗開始前48小時，將細胞接種于6孔組織培養(yǎng)皿中，接種密度為每孔2ml完全培養(yǎng)基中約5000細胞/cm2，然后于37℃、5％CO2下孵育。
附加實驗方案在含有除氫化可的松外所有補充成分的EGM-2中進行預(yù)處理，并配制實驗溶液。
五日內(nèi)，每天用1μM地塞米松(合成的糖皮質(zhì)激素，Sigma D8893)或1-100nM CRH(促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素，Calbiochem 05-23-0050)對內(nèi)皮細胞進行預(yù)處理。預(yù)處理后，使用1μM PMA(Sigma P8139)使細胞經(jīng)受氧化應(yīng)激24小時。
在預(yù)處理過程中，向細胞中加入受體拮抗劑。這些拮抗劑包括糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑、2μM米非司酮(Sigma M8046)和兩種CRH受體拮抗劑、200nM Astressin(Sigma A4933)和200nMα-螺旋CRF肽拮抗劑(Sigma C2917)。
五日內(nèi)，每天用0.1％乙醇溶媒預(yù)處理內(nèi)皮細胞，再加入PMA及糖皮質(zhì)激素或CRH，研究急性地塞米松和重組CRH的作用。
收獲樣品和細胞計數(shù)收獲細胞前，留意任何細胞形態(tài)的變化。在5天預(yù)處理期后(T0)、加入PMA后6小時和24小時(T6和T24)、以及除去PMA后24小時(T48)，收獲組織培養(yǎng)上清液和內(nèi)皮細胞。將所有組織培養(yǎng)上清液貯藏在-20℃下。
向各孔中加入1ml胰蛋白酶/EDTA溶液(Invitrogen 25300-054)，將該板于37℃孵育直到細胞脫離。在accuvette中，將50μl細胞懸液加入到9.95ml等中子素II(Isoton II，Beckman Coulter)中，在CoulterParticle Counter Z1中用140μm孔徑對0.5ml該細胞懸液進行兩次計數(shù)。
用微量離心機，將剩余的950μl原細胞懸液以13000rpm離心10分鐘。棄去上清液，細胞沉淀用500μl Dulbecco PBS溶液洗滌，按前法離心。按前法棄去上清液，細胞裂解前將細胞沉淀貯藏于-20℃下。根據(jù)Coulter Counter數(shù)據(jù)估計細胞數(shù)/沉淀。
細胞毒性實驗(Promega)用Promega CytoTox 96非放射性細胞毒性實驗，檢測所有組織培養(yǎng)上清液的細胞毒性。本實驗定量測定了細胞裂解所釋放的乳酸脫氫酶(LDH，為細胞活力的良好指標(biāo))。向96孔微量滴定板的各孔中加入50μl組織培養(yǎng)上清液或?qū)φ张囵B(yǎng)基，做兩個重復(fù)。加入50μlCytoTox試劑，充分混合。在室溫下，將該板避光孵育30分鐘。30分鐘后，向各孔中加入50μl終止溶液，讀取該板在492nm下的吸光度。吸光度數(shù)值是對照培養(yǎng)基兩倍以上的任何試驗樣品都被視為有細胞毒性。各樣品所得到的結(jié)果均未表現(xiàn)出任何細胞毒性的跡象。
細胞裂解液的制備將所有細胞沉淀按每2.5×106細胞1ml細胞裂解緩沖液在冰上裂解30分鐘。裂解緩沖液含有1％NP-40、0.1％脫氧膽酸鈉、0.1％SDS、6mM氯化鈉和0.05M Tris，pH 7.6。使用前，加入蛋白酶抑制劑混合物(1000X；Sigma P8340)，裂解緩沖液的濃度為10μl/ml。用沉淀研杵使部分裂解的細胞沉淀充分勻漿，于4℃以20,000g離心20分鐘，除去不需要的細胞碎片。澄清的細胞裂解液于-80℃冷藏備用?？偟鞍踪|(zhì)測定(Pierce)用Pierce BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒，測定各細胞裂解液的總蛋白質(zhì)濃度。由所提供的2mg/ml BSA母液制備一套0-1200μg/ml蛋白質(zhì)范圍的8種標(biāo)準(zhǔn)溶液。向96孔平底微量滴定板的各孔中加入10μl標(biāo)準(zhǔn)溶液或細胞裂解液，做兩個重復(fù)。按照試劑盒的使用說明，用50份A試劑和1份B試劑制備試劑溶液。向微量滴定板的各孔中加入200μl的終試劑。將該板混勻，加蓋，于37℃孵育30分鐘，讀出562nm下的吸光度。繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于確定各細胞裂解液中的蛋白質(zhì)濃度。
ICAM-1的ELISA(R&D Systems)按照生產(chǎn)商的使用說明，用人sICAM-1DuoSet ELISA試劑盒(R&D Systems DY720)，估計各細胞裂解液中的ICAM-1蛋白質(zhì)。
在室溫下，捕捉抗體用PBS稀釋至終濃度為4μg/ml，用100μl包被96孔微量滴定板的各孔過夜。然后，該板用洗滌緩沖液(0.05％吐溫20的PBS溶液)洗滌3次。向各孔中加入300μl封閉緩沖液(1％BSA、5％蔗糖和0.05％疊氮化鈉的PBS溶液)，將該板在室溫下孵育1小時，然后按前述方法進行洗滌。然后，各細胞裂解液用試劑稀釋液(1％BSA的PBS溶液)按1/200進行稀釋，將100μl加入到抗體包被板的各孔中，做兩個重復(fù)。用試劑稀釋液制備濃度范圍為0-1000pg/ml的8個ICAM-1標(biāo)準(zhǔn)液，將100μl標(biāo)準(zhǔn)液加入到該板的適當(dāng)孔中，做兩個重復(fù)。每一板通常使用一套獨立的標(biāo)準(zhǔn)液。將該板在室溫下孵育2小時后，再次進行洗滌。將檢測抗體稀釋至終濃度為100ng/ml，向各孔中加入100μl檢測抗體，將該板在室溫下孵育2小時。按前法洗板。向各孔中加入100μl用試劑稀釋液按1/200稀釋的鏈霉抗生物素-HRP綴合物，將該板在室溫下避光孵育20分鐘。最后一次洗板后，向各孔中加入100μl底物溶液(1∶1的顯色試劑A和顯色試劑B混合物，R&D Systems DY999)。于室溫避光孵育20分鐘后，加入50μl 2N硫酸使顯色反應(yīng)終止。使用570nm校正波長測量該板在450nm下的吸光度。
將平均吸光度對ICAM-1濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過回歸分析計算出最佳擬合曲線。考慮裂解液的稀釋倍數(shù)，由此計算出樣品中未知的ICAM-1濃度。
為使細胞數(shù)目和總蛋白質(zhì)濃度的差異標(biāo)準(zhǔn)化，最終結(jié)果用ngICAM-1/mg總蛋白質(zhì)表示。
白介素6的ELISA(R&D Systems)按照生產(chǎn)商的使用說明，用QuantiGlo Q6000人IL-6實驗(R&DSystems)測試各組織培養(yǎng)上清液的IL-6蛋白質(zhì)濃度。
用校準(zhǔn)稀釋液配制6個IL-6標(biāo)準(zhǔn)液，濃度范圍為0-3000pg/ml。向各孔中加入50μl實驗稀釋液和150μl組織培養(yǎng)上清液或標(biāo)準(zhǔn)液，做兩個重復(fù)。將該板放在水平定軌板振蕩器(horizontal orbital plateshaker)上，室溫下孵育2小時，隨后用洗滌緩沖液洗板4次。向各孔中加入200μl IL-6綴合物，將該板放在水平定軌板振蕩器(約500rpm)上，室溫下孵育3小時。按前法洗板。向各孔中加入200μl底物溶液，將該板放在桌面上，室溫下孵育40分鐘。用設(shè)置為1分鐘滯后時間、每孔1秒讀數(shù)時間、總和法和自動放大(gain on)的發(fā)光計，測定各孔的相對光單位(relative light unit，RLU)。
將平均RLU對IL-6濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過回歸分析計算出最佳擬合曲線。由此估計所有樣品中未知的IL-6濃度。
結(jié)果1μM糖皮質(zhì)激素慢性處理后再加1μM PMA氧化應(yīng)激對HUVEC中ICAM-1合成的影響使經(jīng)受了慢性應(yīng)激的內(nèi)皮細胞再經(jīng)受1μM PMA氧化應(yīng)激(按方法與材料中所述方法)，在指定時間點(t0、t6、t24和t48)，收獲細胞以測定ICAM-1表達的變化。使用此額外的急性應(yīng)激(24小時)模擬皮膚損傷和/或損害(例如UV輻射)。直接與未處理細胞對照相比時，觀察到誘導(dǎo)的ICAM-1合成與分泌顯著較高(參見圖1)。此外，氧化應(yīng)激前經(jīng)過糖皮質(zhì)激素處理的細胞中誘導(dǎo)的ICAM-1合成，顯著高于氧化應(yīng)激前未進行糖皮質(zhì)激素處理細胞中誘導(dǎo)的ICAM-1合成。
相信ICAM-1的誘導(dǎo)反映出皮膚中有較高程度的炎性細胞募集。
用HMVEC-d細胞重復(fù)這些實驗。得到類似結(jié)果。
1μM PMA氧化應(yīng)激過程中，1μM糖皮質(zhì)激素急性處理對HUVEC中ICAM-1合成的影響我們研究了“急性應(yīng)激”在內(nèi)皮細胞模型中的作用。重要的是，向僅用溶媒預(yù)處理(5天)的內(nèi)皮細胞中加入PMA的同時，加入合成的糖皮質(zhì)激素。急性GC處理有效地抑制了氧化應(yīng)激后誘導(dǎo)的ICAM-1表達，因此減輕了內(nèi)皮細胞的炎癥狀態(tài)。
用HMVEC-d細胞重復(fù)這些實驗。得到類似結(jié)果。
1μM糖皮質(zhì)激素慢性處理HUVEC后再加1μM PMA氧化應(yīng)激的過程中，GC受體拮抗劑(2μM米非司酮)對ICAM-1合成的影響慢性GC預(yù)處理步驟中，向細胞中加入GC受體拮抗劑(米非司酮)，再用PMA處理后，氧化應(yīng)激所誘導(dǎo)的ICAM-1表達的增加顯著降低，低于未接受慢性GC處理細胞中的情況(圖3)。這些觀測結(jié)果表明，應(yīng)激所誘導(dǎo)的ICAM-1表達的增加是通過GC受體介導(dǎo)的。
用HMVEC-d細胞重復(fù)這些實驗。得到類似結(jié)果。
在1μM PMA氧化應(yīng)激過程中，促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素處理對HUVEC中ICAM-1合成的影響經(jīng)POMC及其所有糖皮質(zhì)激素的肽衍生物誘導(dǎo)后，應(yīng)激導(dǎo)致有效激活皮膚促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素(CRH)。CRH是皮膚中控制誘導(dǎo)和啟動下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸的一種關(guān)鍵、主要的肽。我們研究了用CRH慢性處理HUVEC是否會導(dǎo)致與經(jīng)慢性GC處理的細胞中所觀察到的類似的ICAM-1水平的激劇變化。
5天內(nèi)，每天向內(nèi)皮細胞中加入重組CRH。然后，如前所述，使經(jīng)處理的細胞和未經(jīng)處理的細胞經(jīng)受氧化應(yīng)激，24小時內(nèi)，在各時間點收獲細胞。
用重組CRH慢性處理內(nèi)皮細胞，導(dǎo)致ICAM-1分泌顯著增加，表明炎癥程度較高(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，觀察到在經(jīng)GC處理的細胞中，ICAM-1的合成增加，并且始終高于經(jīng)CRH處理細胞中ICAM-1的合成。
在CRH預(yù)處理步驟中，加入CRH受體拮抗劑(astressin、α-螺旋CRF肽拮抗劑)，僅部分阻斷用CRH慢性處理的內(nèi)皮細胞在氧化應(yīng)激后ICAM-1誘導(dǎo)的增加(數(shù)據(jù)未顯示)。這些細胞合成的ICAM-1水平大約降低到用CRH預(yù)處理5天后，經(jīng)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ICAM-1水平的一半。令人驚奇的是，使用糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑(米非司酮)，ICAM-1的合成不會恢復(fù)到之前所觀察到的基礎(chǔ)水平。在用GC慢性處理內(nèi)的內(nèi)皮細胞中，米非司酮完全阻斷用PMA氧化應(yīng)激所誘導(dǎo)的ICAM-1分泌的增加(參見圖3)。這種部分阻斷作用可能是因為無效受體拮抗劑所致，或者，事實上，是因為CRH受體并不主要負(fù)責(zé)誘導(dǎo)ICAM-1所致。有可能是重組CRH通過刺激GC，引起CRH/GC聯(lián)合反應(yīng)。GC受體拮抗劑的滴定可能進一步抑制ICAM-1的水平。
人臍靜脈內(nèi)皮細胞中IL-6表達的變化我們觀察到，與經(jīng)溶媒處理后再用PMA氧化應(yīng)激的細胞相比時，GC處理的慢性應(yīng)激的內(nèi)皮細胞中，白介素6的合成與分泌增加。溶媒或糖皮質(zhì)激素本身并不引起IL-6分泌增加。
討論我們已經(jīng)清楚地證實，在內(nèi)皮細胞中加入重組糖皮質(zhì)激素對PMA所刺激的ICAM-1表達表現(xiàn)出顯著的趨異作用。我們的結(jié)果首次說明，與未處理細胞對照相比時，用GC慢性處理的內(nèi)皮細胞，如何顯著地增加炎癥狀態(tài)。然而，對比之下，急性劑量的GC顯著抑制炎癥狀態(tài)。我們提出，內(nèi)皮細胞對急性GC處理和慢性GC處理截然不同的反應(yīng)，可能是由于皮膚內(nèi)局部HPA軸形成日趨嚴(yán)重的功能異常所造成的。皮膚內(nèi)特別高的炎癥水平可能導(dǎo)致產(chǎn)生并刺激促炎細胞因子和蛋白酶，而促炎細胞因子和蛋白酶都可能使皮膚病惡化。從經(jīng)急性和慢性CRH處理內(nèi)皮細胞后得到相似的觀測結(jié)果，進一步證實了此工作假設(shè)。
IL-6是免疫系統(tǒng)的眾多介質(zhì)之一，有助于調(diào)節(jié)HPA軸的功能。IL-6通常是作為級聯(lián)式產(chǎn)生IL-1α和TNF-α的結(jié)果而被釋放的。令人驚奇的是，我們無法在GC處理內(nèi)皮細胞或未處理內(nèi)皮細胞的上清液中檢出這些促炎細胞因子(數(shù)據(jù)未顯示)。本報告所提供的數(shù)據(jù)提示，可通過增加CRH的分泌(及最終的GC水平)，以依賴劑量的方式，通過激活I(lǐng)L-6(所述級聯(lián)反應(yīng)的終產(chǎn)物)，使得免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用以影響HPA軸活性。本報告中，我們證明了與未處理細胞對照相比，慢性GC處理的內(nèi)皮細胞的IL-6水平顯著較高。這一數(shù)據(jù)符合我們的設(shè)想，即這些受慢性應(yīng)激的內(nèi)皮細胞具有缺陷HPA軸，在此反饋環(huán)的反應(yīng)性變化，可能阻礙IL-6的負(fù)調(diào)節(jié)(通過GC和AP-1間的相互作用)。
總之，我們相信該炎癥模型對我們理解在慢性損害有關(guān)皮膚中的局部HPA軸的變化，將證明具有無法估量的意義。我們正在進行的研究表明，慢性GC處理導(dǎo)致GC受體水平的負(fù)調(diào)節(jié)，因此，在皮膚內(nèi)形成缺陷反饋環(huán)。我們在此模型中，繼續(xù)測試了一系列的營養(yǎng)劑，以觀察是否可以減少炎性細胞募集的誘導(dǎo)，如實施例3中所述。
實施例2慢性應(yīng)激對真皮基質(zhì)重建的影響皮膚的真皮基質(zhì)組分主要由彈性纖維、膠原纖維、蛋白質(zhì)多糖和其它糖蛋白組成。這一結(jié)締組織復(fù)合體作為真皮的支架，使細胞(如成纖維細胞)可以在上面附著。這類組織的主要蛋白質(zhì)組分為膠原，即一種非均質(zhì)性質(zhì)的纖維狀蛋白。I型膠原是皮膚中占優(yōu)勢的結(jié)構(gòu)蛋白，衰老的皮膚外觀主要歸咎于I型膠原的破壞。正常的原纖維生成需要多種翻譯后修飾，其中包括前體前膠原經(jīng)蛋白酶解轉(zhuǎn)化為膠原。因此，前膠原I的估計量可以反映出即將合成的膠原I分子的量。事實上，受損的衰老皮膚的組織學(xué)特征典型地包括壓扁、變硬、紊亂的膠原纖維束。年輕健康的皮膚保持降解和清除這種無序基質(zhì)致密固體團的能力。
因此，基質(zhì)降解在皮膚基質(zhì)重建中是值得考慮的因素，基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)等真皮蛋白酶的釋放，可有助于從皮膚上除去堆集的、雜亂的膠原纖維。MMP為成員超過25個的大家族，負(fù)責(zé)降解結(jié)締組織(有關(guān)綜述參見Woessner，1994，Ann N Y Acad Sci 73211-21)。它們是結(jié)構(gòu)上相關(guān)的內(nèi)肽酶，介導(dǎo)胞外基質(zhì)和基底膜不同的大分子組分的降解，可分為4個不同的亞家族膠原酶、明膠酶、溶基質(zhì)蛋白酶和膜MMP。人類皮膚表達各種MMP，但僅MMP-1(膠原酶)顯示出能夠攻擊天然原纖維膠原。此外，還顯示出MMP-1由角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞進行表達，因此，傷口愈合過程中，MMP-1在維持正常的膠原更新和基質(zhì)重建中發(fā)揮重要作用。
另外，還證實了暴露在紫外輻射(UVR)下，在體內(nèi)誘導(dǎo)人皮膚的MMP-1。因此，長期以來，MMP-1被認(rèn)為是皮膚膠原分解的主要起始因子。也顯示UVR誘導(dǎo)MMP-2(明膠酶A)和MMP-9(明膠酶B)；以及能夠進一步降解由溶膠原酶所形成片段的酶?？傊琈MP-1的釋放可將天然膠原纖維切割成較小的片段，該片段然后由明膠酶、MMP-2和MMP-9進一步降解。相信皮膚暴露在UVR下在受損的結(jié)締組織中，MMP作為主要介質(zhì)發(fā)揮作用。
本研究中，為了更好地理解慢性應(yīng)激對皮膚中真皮基質(zhì)重建的影響，因此我們在糖皮質(zhì)激素慢性處理原代人真皮成纖維細胞，再經(jīng)受PMA急性應(yīng)激后，測定了真皮基質(zhì)降解標(biāo)記(MMP-1)和真皮基質(zhì)合成標(biāo)記(前膠原I)的變化。實驗方法類似于實施例1所述方法，只是所測試的細胞是真皮成纖維細胞，以及細胞用于測試原膠原-1、MMP-1和MMP-9的表達。
材料與方法(不同于實施例1)真皮細胞的培養(yǎng)將原代人真皮成纖維細胞在補充了10％FBS(胎牛血清)的DMEM(Gibco)中進行培養(yǎng)和傳代。按常規(guī)將細胞接種于6孔組織培養(yǎng)皿中，接種密度為每孔2ml完全培養(yǎng)基中約5000細胞/m2，并于37℃、5％CO2下孵育24小時。處理前24小時，棄培養(yǎng)基，讓細胞在加有1％FBS的DMEM中生長。
附加實驗方案用含低血清(1％FBS)的DMEM配制預(yù)處理溶液和實驗溶液。5天內(nèi)，每天用1μM地塞米松(一種合成的糖皮質(zhì)激素；Sigma D8893)對真皮成纖維細胞進行預(yù)處理。隨后，細胞用1μM PMA(Sigma P8139)進行氧化應(yīng)激24小時。
人活性MMP-1和MMP-9的ELISA(R&D Systems)按照生產(chǎn)商的使用說明，用人活性MMP-1和MMP-9 Fluorokine酶試劑盒(分別為R&D Systems F1M00和F9M00)，估計各細胞上清液中的MMP-1蛋白和MMP-9蛋白。
用校準(zhǔn)稀釋液配制6個MMP-1標(biāo)準(zhǔn)液和MMP-9標(biāo)準(zhǔn)液，濃度范圍分別為0.39-12.5ng/ml和0.25-16ng/ml。向各孔中加入100μl實驗稀釋液和150μl組織培養(yǎng)上清液或標(biāo)準(zhǔn)液，做兩個重復(fù)。將該板放在水平定軌板振蕩器上，于室溫孵育3小時，然后用洗滌緩沖液洗滌4次。向各孔中加入200μl APMA，在濕潤環(huán)境下，將該板于37℃避光孵育2小時。按前述方法洗板。向各孔中加入200μl底物溶液，并在濕潤環(huán)境下，將該板于37℃避光孵育17-20小時。用設(shè)置為1×20mS積分時間(integration time)、板速約6的熒光板，激發(fā)波長定為320nm，發(fā)射波長定為405nm，測定各孔的相對熒光單位(RFU)。
分別將平均RFU對MMP-1濃度和MMP-9濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過回歸分析計算出最佳擬合曲線。由此估計所有樣品中未知的活性MMP-1蛋白濃度或活性MMP-9蛋白濃度。
前膠原IC-肽的EIA試劑盒(Takara Bio Inc.)膠原I是由前體分子原膠原I合成的。因此，游離前肽的量，化學(xué)計量上反映出所合成的膠原I的量。I型前膠原C肽酶免疫測定(EIA)試劑盒可定量測定I型前膠原C肽(PIP)。
用樣品稀釋液配制8個PIP標(biāo)準(zhǔn)液，濃度范圍為0-640ng/ml。向各孔中加入100μl抗體-過氧化物酶綴合物溶液和20μl細胞裂解液(1μg蛋白質(zhì))或標(biāo)準(zhǔn)液，做兩個重復(fù)。將該板密封，于37℃孵育3小時，然后用400μl PBS洗滌4次。然后向各孔中加入100μl底物溶液，將該板放在桌面上，室溫下孵育15分鐘。該時間過后，向各孔中加入100μl終止溶液，用讀板儀讀出450nm下的吸光度。
將平均吸光度對PIP濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過回歸分析計算出最佳擬合曲線。由此估計所有樣品中未知的PIP濃度。
結(jié)果來源于新生兒的人真皮成纖維細胞中MMP-1表達的變化經(jīng)受慢性應(yīng)激的新生兒真皮成纖維細胞用1μM PMA進行氧化應(yīng)激(如方法與材料中所述)，在指定時間點(T0、T6、T24和T48)收獲細胞以測定MMP-1表達的變化。這一額外的急性應(yīng)激(時間僅為24小時)用于模擬皮膚的損傷和/或損害(例如UVR)。直接與未處理細胞對照相比時，觀察到MMP-1的合成和分泌受到顯著抑制和阻抑(T6約60％、T24約80％、T48約70％)——參見圖5。
對MMP-1的這種抑制可能反映出皮膚中缺乏降解真皮基質(zhì)(特別是膠原I型原纖維)的能力。
來源于成人的人真皮成纖維細胞中MMP-1表達的變化經(jīng)受慢性應(yīng)激的成人真皮成纖維細胞也用1μM PMA進行氧化應(yīng)激，在指定時間點(T0、T6、T24和T48)收獲細胞以測定MMP-1表達的變化。如在來源于新生兒的成纖維細胞中所觀察到的一樣，直接與未處理細胞對照相比時，MMP-1合成受到的抑制和阻抑是顯著的(T6約85％、T24約10％、T48約80％)——參見圖6。
已知皮膚中MMP-1的水平是隨實足年齡而增加的，因此，與在GC處理的來源于新生兒的成纖維細胞中所觀察到的活性MMP-1的水平相比，在GC處理的來源于成人的成纖維細胞中所觀察的活性MMP-1水平顯著較高并不足為奇(GC處理的成人成纖維細胞中約25ng/ml，而GC處理的新生兒成纖維細胞中為15ng/ml)。此外，似乎在未處理的成人真皮成纖維細胞對照中，活性MMP-1的總水平可使Fluorokine MMP-1 ELISA中的單克隆抗體飽和(注意在整個研究中，所示[MMP-1]的ELISA數(shù)據(jù)都不大于～35ng/ml)。
完成這些觀察后，用來源于新生兒的成纖維細胞進行所有隨后的實驗。
來源于新生兒的人真皮成纖維細胞中MMP-9表達的變化前面表明MMP-9是最高效的蛋白酶之一，有助于清除皮膚中由MMP-1所產(chǎn)生的膠原片段。因此，我們測定了該模型中MMP-9合成的變化。觀察到與MMP-1相同的模式即直接與未處理細胞對照相比時，在經(jīng)受慢性應(yīng)激的真皮成纖維細胞中，檢測到MMP-9合成和分泌受到顯著抑制和阻抑(圖7)。而MMP-9的水平經(jīng)證明，顯著地低于MMP-1的水平，連續(xù)觀察到相似的表達模式。
來源于新生兒的人真皮成纖維細胞中IL-6表達的變化我們觀察到與經(jīng)溶媒處理后再加PMA氧化應(yīng)激的細胞相比時，GC處理的經(jīng)慢性應(yīng)激的真皮成纖維細胞中，白介素6的合成和分泌受到顯著的抑制(在T6和T24時合成減少～80％)——數(shù)據(jù)未顯示。
來源于新生兒的人真皮成纖維細胞中前膠原I合成的變化I型膠原，一種皮膚中重要的結(jié)構(gòu)組分，由稱作前膠原I的前體分子合成，其中被稱為前肽的大型額外結(jié)構(gòu)域經(jīng)酶切除。因此，我們檢測了I型前膠原的變化，進而化學(xué)計量上反映出膠原合成水平的變化。
經(jīng)受慢性應(yīng)激的人類新生兒真皮成纖維細胞用1μM PMA進行氧化應(yīng)激，在指定時間點(T0、T6、T24、T48和T72)收獲細胞以測定前膠原-1表達的變化。直接與未處理細胞對照相比時，觀察到前膠原-1的合成受到了顯著抑制(特別在T6時，～50％)——參見圖8。
前膠原1合成的這種抑制很可能反映出皮膚中缺乏合成新的真皮基質(zhì)纖維的能力。
討論為了測定慢性應(yīng)激對皮膚的影響，我們將真皮成纖維細胞用糖皮質(zhì)激素進行處理，再進行急性氧化應(yīng)激，然后測定MMP-1和MMP-9的變化，其中MMP-1是與皮膚衰老有關(guān)的最突出的真皮蛋白酶之一，MMP-9是急性劑量的UVR后皮膚所釋放的一種關(guān)鍵的明膠酶。我們還測定了I型前膠原C肽的水平(膠原I合成量的良好指標(biāo))。我們的結(jié)果首次證明，在經(jīng)受慢性應(yīng)激的皮膚中，基質(zhì)清除(MMP-1、MMP-9)和基質(zhì)修復(fù)(前膠原I)均被顯著抑制。因此，基質(zhì)降解和基質(zhì)合成都被抑制。
這些數(shù)據(jù)加上我們之前所描述的在經(jīng)受慢性應(yīng)激的皮膚中炎癥顯著惡化的觀測結(jié)果(參見實施例1)，表明慢性應(yīng)激在造成結(jié)締組織損傷(因變性膠原纖維和異常彈性組織清除削弱所致)時發(fā)揮了重要作用。
總之，對有關(guān)基質(zhì)重建和慢性應(yīng)激的此類皮膚相關(guān)標(biāo)記的鑒定，為我們提供了一種極好的體外模型，從而確定新的干擾途徑，以降低應(yīng)激對皮膚調(diào)理的作用。我們已經(jīng)運用該模型鑒定出抑制慢性糖皮質(zhì)激素暴露對皮膚細胞的有害作用的藥物，正如下面在實施例3中所描述的一樣。
實施例3鑒定抑制糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的對皮膚細胞—炎癥的作用的藥物材料與方法采用與實施例1所述相同的方法，只是在預(yù)處理期間向細胞中加入各種試驗藥物(見表1)。
表1在經(jīng)受慢性應(yīng)激的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中所選試驗藥物一覽表
各實驗中包括溶媒對照和地塞米松對照。
沒藥酸的提取方法用330g guggul脂質(zhì)作為原料，得到128g產(chǎn)物(收率42.6％)。該產(chǎn)物經(jīng)氣相色譜測定含28.2％沒藥酸。用適于分離的己烷/乙酸乙酯比率，通過硅膠處理，進一步加工100g該產(chǎn)物。用80/20(體積/體積)己烷/乙酸乙酯，在750g硅膠60柱中進行硅膠處理。雖然皂化產(chǎn)物不完全溶于該混合物中，但仍可將該混合物加到柱上。再加入80/20溶劑時，柱被阻塞，但是，當(dāng)60/40比率的溶劑流過時，柱被疏通。
60/40流分的薄層色譜(TLC)板顯示，在沒藥酸斑點和溶劑前沿間的組分(高洗脫組分)的濃度高于標(biāo)準(zhǔn)液中所觀察到的濃度，為前述所得到的富含沒藥酸的流分，已知純度70％。50/50樣品含有更接近基線的高水平組分(低洗脫組分)，將其棄去。在60/40溶劑中，第一次硅膠處理的總產(chǎn)量為34.7g(14.7％)，50/50溶劑中為3.2％。
第一次硅膠處理的60/40提取液，再經(jīng)過第二輪硅膠處理進行純化，不過這次使用150g硅膠柱。在這次硅膠柱處理過程中，未遇到不溶性情況。樣品經(jīng)蒸發(fā)，收集流分并進行分析。TLC板顯示60/40流分比70％沒藥酸標(biāo)準(zhǔn)液含有較多的洗脫物質(zhì)。這是因為其移動需要80/20溶劑。TLC板還顯示出50/50流分更是如此，柱遺留物含有較少的洗脫物質(zhì)。第二次硅膠處理后，收集到加入柱中濃縮物的92％，其中23.5g或10％(總的)來自60/40流分，8.3g或3.4％來自80/20流分。另外，對60/40流分進行分析，通過GC發(fā)現(xiàn)含77.9％沒藥酸，80/20流分含49％沒藥酸。
結(jié)果經(jīng)過用合成的糖皮質(zhì)激素(1μM地塞米松)進行5天慢性應(yīng)激的內(nèi)皮細胞，用1μM PMA進行氧化應(yīng)激24小時。此期間，檢測衡量炎癥反應(yīng)的ICAM-1合成。在預(yù)處理期間，向細胞中加入可能的活性物質(zhì)(見表1)。
放棄本研究中任何顯示出LDH顯著增加(即有細胞毒性)的藥物。在整個研究中，未觀察到細胞形態(tài)或細胞數(shù)目的顯著變化。
結(jié)果見表2。在經(jīng)受慢性應(yīng)激的內(nèi)皮細胞中抑制ICAM-1合成的藥物將在下文作更詳細的討論。在此階段并不能完全忽略在所示濃度下不抑制ICAM-1合成的藥物，因為沒有進行劑量反應(yīng)研究。整個研究中主要使用的是最高的上限濃度(無毒性跡象)。
表2
洛伐他汀在地塞米松存在下，向HUVEC中按常規(guī)加入該藥物時，觀察到ICAM-1表達被顯著抑制。ICAM-1抑制水平幾乎與未處理細胞對照完全相同，僅低于只用溶媒預(yù)處理的細胞中，由PMA誘導(dǎo)的ICAM-1水平——參見圖9。
環(huán)格列酮和沒藥酸，兩者皆為PPARγ激動劑，在用地塞米松慢性處理的內(nèi)皮細胞中，抑制由PMA氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ICAM-1合成的增加。由GC處理的細胞所分泌的ICAM-1水平，幾乎降到僅用溶媒預(yù)處理的細胞中，由PMA誘導(dǎo)的ICAM-1水平——參見圖10和圖11。
人參Rc和人參Rb1流分這兩個流分在用地塞米松慢性處理的內(nèi)皮細胞中，均抑制由PMA氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ICAM-1合成的增加。證明人參皂苷Rc比人參Rb1更有效——數(shù)據(jù)未顯示。
姜黃素在用地塞米松慢性處理的內(nèi)皮細胞中，這一JNK/AP-1抑制劑顯示抑制由PMA氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ICAM-1合成的增加。由經(jīng)處理的細胞所分泌的ICAM-1水平，幾乎降到僅用溶媒預(yù)處理的細胞中，由PMA誘導(dǎo)的ICAM-1水平——數(shù)據(jù)未顯示。
22-(R)-羥基膽甾醇在用地塞米松慢性處理的內(nèi)皮細胞中，該氧甾醇類LXR配體表明由PMA氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ICAM-1合成的增加被顯著抑制。由經(jīng)處理的細胞所分泌的ICAM-1水平，幾乎降到僅用溶媒預(yù)處理的細胞中，由PMA誘導(dǎo)的ICAM-1水平——參見圖12。
岡田酸該天然海洋聚醚產(chǎn)品是強效絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶抑制劑。在本研究中，我們在地塞米松存在下加入岡田酸，觀察到在用地塞米松慢性處理的內(nèi)皮細胞中，顯著地抑制由PMA氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ICAM-1合成的增加。由經(jīng)處理的細胞所分泌的ICAM-1水平，幾乎降到僅用溶媒預(yù)處理的細胞中，由PMA誘導(dǎo)的ICAM-1水平——參見圖13。
討論本研究中，最有效的干涉劑包括具有抗炎性質(zhì)的許多核孤獨受體(PXR、LXR、PPAR-γ)的選擇性激活劑。另外，主動抑制關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(如NF-κB和AP-1)的營養(yǎng)化合物，被證明是良好的ICAM-1表達抑制劑。在該體外篩選模型中，所采用的一種其它決定性類型的抑制劑為天然海洋聚醚產(chǎn)品，即岡田酸，顯示抑制絲氨酸/蘇氨酸類磷酸酶。該作用方式中的主動抑制可提供新的干擾途徑，以防止應(yīng)激所誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性糖皮質(zhì)激素的累積。
實施例4鑒定抑制糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的對皮膚細胞—基質(zhì)重建的作用的藥物采用實施例2所述的相同方法，只是在預(yù)處理階段向細胞中加入各種試驗藥物。
枸杞的提取方法將干粉狀植物材料(～10g)放入套筒(thimble)中，向筒中加入200ml丙酮，并加熱該裝置。使該溶液與沸石(boiling chips)一起回流16小時，然后在氮氣下使丙酮蒸發(fā)。將最終殘余物在氮氣中貯藏于-20℃。
結(jié)果觀察到環(huán)格列酮、激活素(Powerherbs，Power Health Product Ltd.，York，UK)、香菇提取物(Bio-Support，Worcester，UK)、枸杞提取物(K.Hunter，Unilever Research Colworth，UK——參見上文)、乳香提取物(Alchem International Ltd.，New Delhi，India)、姜黃素、沒藥酸、人參Rb1流分和人參Rc流分，在用PMA誘導(dǎo)的急性應(yīng)激后，全都抑制糖皮質(zhì)激素對MMP-1表達水平和前膠原表達水平的作用。
有關(guān)上述各個部分的本發(fā)明的各種特征和實施方案，做必要的修正后，適當(dāng)?shù)赜糜谄渌糠?。因此，適當(dāng)時，可將某部分所具體說明的特征和其它部分所具體說明的特征合在一起。
上述說明書中所提及的所有出版物的內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。本發(fā)明所述的方法和產(chǎn)品的各種修改和變化，在不偏離本發(fā)明的范圍時，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。雖然本發(fā)明對于有關(guān)特定優(yōu)選的實施方案進行了描述，但應(yīng)理解為所要求保護的發(fā)明不應(yīng)過多地局限于這些具體的實施方案。事實上，對實施本發(fā)明所述方法的各種修改，如果對所屬相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的，則落入所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種能夠抑制真皮細胞或與皮膚炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激的組合物在制備用于降低心理介導(dǎo)的應(yīng)激對人或動物皮膚的作用的組合物中的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述組合物經(jīng)口服給藥。
3.權(quán)利要求1的用途，其中所述組合物經(jīng)局部給藥。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的用途，其中所述組合物包含第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)，其中第一種物質(zhì)能夠抑制與皮膚炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激，第二種物質(zhì)能夠抑制真皮細胞的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激，條件是所述第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)是不同的。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的用途，其中所述組合物包含第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)，其中第一種物質(zhì)選自人參Rb1、人參Rc、姜黃素、22-OH-膽甾醇、環(huán)格列酮、洛伐他汀、沒藥酸、岡田酸、甘草提取物及其混合物；第二種物質(zhì)選自枸杞提取物、香菇提取物、激活素、人參Rb1、人參Rc、姜黃素、環(huán)格列酮、沒藥酸、乳香提取物及其混合物，條件是所述第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)是不同的。
6.一種降低心理介導(dǎo)的應(yīng)激對人或動物皮膚的作用的方法，該方法包括給予個體能夠抑制真皮細胞或與皮膚炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激的組合物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述組合物經(jīng)口服給藥。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述組合物經(jīng)局部給藥。
9.權(quán)利要求6-8中任一項的方法，其中所述組合物包含第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)，其中第一種物質(zhì)能夠抑制與皮膚炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激，第二種物質(zhì)能夠抑制真皮細胞的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激，條件是所述第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)是不同的。
10.權(quán)利要求6-8中任一項的方法，其中所述組合物包含第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)，其中第一種物質(zhì)選自人參Rb1、人參Rc、姜黃素、22-OH-膽甾醇、環(huán)格列酮、洛伐他汀、沒藥酸、岡田酸、甘草提取物及其混合物；第二種物質(zhì)選自枸杞提取物、香菇提取物、激活素、人參Rb1、人參Rc、姜黃素、環(huán)格列酮、沒藥酸、乳香提取物及其混合物，條件是所述第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)是不同的。
11.一種包含第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)的組合物，其中第一種物質(zhì)選自人參Rb1、人參Rc、姜黃素、22-OH-膽甾醇、環(huán)格列酮、洛伐他汀、沒藥酸、岡田酸、甘草提取物及其混合物；第二種物質(zhì)選自枸杞提取物、香菇提取物、激活素、人參Rb1、人參Rc、姜黃素、環(huán)格列酮、沒藥酸、乳香提取物及其混合物，條件是所述第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)是不同的。
12.一種包含第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)的營養(yǎng)補充劑，其中第一種物質(zhì)選自人參Rb1、人參Rc、姜黃素、22-OH-膽甾醇、環(huán)格列酮、洛伐他汀、沒藥酸、岡田酸、甘草提取物及其混合物；第二種物質(zhì)選自枸杞提取物、香菇提取物、激活素、人參Rb1、人參Rc、姜黃素、環(huán)格列酮、沒藥酸、乳香提取物及其混合物，條件是所述第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)是不同的。
13.一種包含或補充了第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)的化妝品組合物，其中第一種物質(zhì)選自人參Rb1、人參Rc、姜黃素、22-OH-膽甾醇、環(huán)格列酮、洛伐他汀、沒藥酸、岡田酸、甘草提取物及其混合物；第二種物質(zhì)選自枸杞提取物、香菇提取物、激活素、人參Rb1、人參Rc、姜黃素、環(huán)格列酮、沒藥酸、乳香提取物及其混合物，條件是所述第一種物質(zhì)和第二種物質(zhì)是不同的。
14.一種能夠降低心理介導(dǎo)的應(yīng)激對人或動物皮膚的作用的化合物的鑒定方法，該方法包括(i)在糖皮質(zhì)激素受體激動劑存在下，在無候選化合物時將會導(dǎo)致細胞經(jīng)受慢性應(yīng)激的條件和時間內(nèi)，使真皮細胞或與皮膚炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞與候選化合物接觸；(ii)使細胞經(jīng)受急性應(yīng)激；(iii)分析細胞中的一種或多種細胞標(biāo)記，所述標(biāo)記選自炎性細胞募集標(biāo)記，其中所述細胞是與皮膚炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞；基質(zhì)降解標(biāo)記，其中所述細胞是真皮細胞；和/或基質(zhì)合成標(biāo)記，其中所述細胞是真皮細胞；和(iv)確定候選化合物是否影響所述的一種或多種細胞標(biāo)記的狀態(tài)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中步驟(iv)包括將所述標(biāo)記在有候選化合物時的狀態(tài)與所述標(biāo)記在無候選化合物時的狀態(tài)進行比較。
16.權(quán)利要求14或權(quán)利要求15的方法，其中所述炎性細胞募集標(biāo)記是ICAM-1的表達水平。
17.權(quán)利要求14-16中任一項的方法，其中所述基質(zhì)降解標(biāo)記是MMP-1和/或MMP-9的表達水平。
18.權(quán)利要求14-17中任一項的方法，其中所述基質(zhì)合成標(biāo)記是前膠原-1的表達水平。
19.權(quán)利要求14-18中任一項的方法，其中所述急性應(yīng)激是氧化應(yīng)激。
20.權(quán)利要求14-19中任一項的方法，其中步驟(i)所述的時間是至少4天。
21.一種用于降低心理介導(dǎo)的應(yīng)激對人或動物皮膚的作用的組合物的制備方法，該方法包括(i)在糖皮質(zhì)激素受體激動劑存在下，在無候選化合物時將會導(dǎo)致細胞經(jīng)受慢性應(yīng)激的條件和時間內(nèi)，使真皮細胞或與皮膚炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞與候選化合物接觸；(ii)使細胞經(jīng)受急性應(yīng)激；(iii)分析細胞中的一種或多種細胞標(biāo)記，所述標(biāo)記選自炎性細胞募集標(biāo)記，其中所述細胞是與皮膚炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞；基質(zhì)降解標(biāo)記，其中所述細胞是真皮細胞；和/或基質(zhì)合成標(biāo)記，其中所述細胞是真皮細胞；和(iv)確定候選化合物是否影響所述的一種或多種細胞標(biāo)記的狀態(tài)；(v)選擇出步驟(iv)所鑒定的影響所述的一種或多種細胞標(biāo)記狀態(tài)的候選化合物；和(vi)將所述化合物與化妝品或藥物可接受的載體或稀釋劑混合。
全文摘要
提供一種降低心理介導(dǎo)的應(yīng)激對人或動物皮膚的作用的方法，該方法包括給予個體能夠抑制真皮細胞或與皮膚炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激的組合物。還提供用于該方法的組合物和鑒定合適的組合物的實驗方法。
文檔編號A61K31/366GK1913888SQ200480041658
公開日2007年2月14日 申請日期2004年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月18日
發(fā)明者K·E·巴雷特, S·P·格蘭杰, G·詹金斯, L·J·溫賴特 申請人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司