專利名稱：胡蜂抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胡蜂抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自從青霉素的發(fā)現(xiàn)使人們對由病原微生物感染而引發(fā)的各類疾病不再束手無策，并由此發(fā)展了大量的β-內(nèi)酰胺類抗生素，對保護(hù)人類健康作出了巨大貢獻(xiàn)。但隨著上述“傳統(tǒng)抗生素”的廣泛使用，不斷產(chǎn)生出諸多新問題。如長期使用導(dǎo)致抗藥菌株的產(chǎn)生。有時甚至發(fā)展到某些病原菌感染已沒有藥物用于臨床治療。于是新一代抗菌劑的研制成為當(dāng)務(wù)之急。近期的研究發(fā)現(xiàn)，多肽抗生素具有廣譜的抗菌活性，同時具有“傳統(tǒng)抗生素”無法比擬的優(yōu)越性不會誘導(dǎo)抗藥菌株的產(chǎn)生，有希望成為新一代抗菌劑。
蜂產(chǎn)品廣泛用于醫(yī)藥歷史悠久，扎根民間和傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)之中。其主要有蜂蜜、蜂蠟、蜂花粉、蜂毒、蜂膠、蜂王漿、蜂王幼蟲、雄蜂蛹、蜂王臺、蜂巢等。其中蜂毒應(yīng)用最為廣泛，其成分有多肽、酶類、生物胺、碳水化合物和其他物質(zhì)組成。已被報道藥理作用有親神經(jīng)特性、抗細(xì)菌活性、細(xì)胞毒性及對內(nèi)分泌、心血管系統(tǒng)、抗輻射、機(jī)體的免疫功能等方面都有顯著作用。
20世紀(jì)30年代初，德國等從活蜂中取出蜂毒制成針劑、軟膏等劑型作臨床應(yīng)用，50年代蜂毒療法在前蘇聯(lián)的許多醫(yī)院得到廣泛應(yīng)用，對治療高血壓、風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、畸形脊椎炎、外周神經(jīng)炎、肌肉炎、神經(jīng)痛、偏頭痛、外周血管粥樣硬化等均取得明顯的療效。北美的查利斯·麥拉茲采集純蜂毒制成的蜂毒針劑治療多發(fā)性硬化癥，療效顯著。但蜂毒混合物直接用于治療時有不少的副作用和不良反應(yīng)，如極少數(shù)患者出現(xiàn)過敏，少數(shù)患者出現(xiàn)蛋白尿、腎臟損傷等不良反應(yīng)。大胡蜂(Vespa magnifica Smith)是胡蜂科胡蜂屬成員，主要分布于我國四川、云南、西藏和臺灣，是我國的特色資源動物之一，且已被人工飼養(yǎng)，另外，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其毒液的抗菌成分不具有溶血活性和細(xì)胞毒性等缺點(diǎn)。
發(fā)明人將本發(fā)明的胡蜂抗菌肽全序列結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索比較未發(fā)現(xiàn)有任何相同的多肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的具有廣譜抗微生物(包括革蘭氏陰、陽性細(xì)菌，真菌，病毒)、抗腫瘤活性的胡蜂抗菌肽及其制備方法和在制藥中的應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案
胡蜂抗菌肽為我們首次從中國節(jié)肢類動物胡蜂毒液中分離得到的一種單鏈多肽，分子量1316.6道爾頓，等電點(diǎn)8.59，多肽全序列為異亮氨酸-天冬氨酸-色氨酸-賴氨酸-甘氨酸-異亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-蛋氨酸-丙氨酸-賴氨酸-異亮氨酸(NH2-IDWKGIAAMAKI-COOH)。
胡蜂抗菌肽的制備方法本方法包括電刺激胡蜂收集的蜂毒離心去除沉淀，冷凍干燥后經(jīng)凝膠過濾柱層析、離子交換柱層析和反相高壓液相色譜分離純化；其中凝膠過濾柱層析為將收集的胡蜂毒液凍干粉溶于純凈水后上樣于SephadexG-50凝膠過濾柱，凝膠過濾柱長1000mm，直徑26mm，用0.1MNa2HPO4-NaH2PO4pH6.0緩沖液洗脫，收集第III峰；離子交換柱層析為凝膠過濾柱層析得到的活性成分峰III上樣于0.1MNa2HPO4-NaH2PO4pH 6.0緩沖液平衡的CM Sephadex C-25陽離子交換柱，交換柱長300mm，直徑26mm，用含Nacl的0.1M Na2HPO4-NaH2PO4pH 6.0緩沖液梯度洗脫，收集第V峰；反相高壓液相色譜為離子交換柱層析得到的活性成分峰V上樣于經(jīng)含1‰三氟乙酸的超純水平衡的C18反相柱，柱長300mm、直徑5mm，用含1‰三氟乙酸的乙晴緩沖液從15％至65％的梯度洗脫，收集時間為45.4min處的峰。
本發(fā)明采用飛行時間質(zhì)譜法測定分子量，等電聚焦測定等電點(diǎn)，自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
胡蜂抗菌肽作為制備病原微生物感染疾病的治療藥物和腫瘤治療藥物的應(yīng)用。
下面用本發(fā)明的胡蜂抗菌肽的藥理實(shí)驗結(jié)果來說明本發(fā)明的藥效作用和有益效果1.胡蜂抗菌肽抑制細(xì)菌生長的作用抗菌活性檢測采用杯碟法，培養(yǎng)基為普通瓊脂培養(yǎng)基。分別注入加熱溶化的培養(yǎng)基20ml于平皿中作為底層，使其在皿底均勻攤布，凝固后另取培養(yǎng)基適量加熱溶化，分別向每皿中加入5ml菌懸液，搖勻使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻后，在平皿中等距離放入已消毒的不銹鋼杯6個。第一個鋼杯加入0.3mg/ml濃度的待測化合物溶液0.1ml，其余鋼杯采用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養(yǎng)，24h后測量抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上作為最小抑菌濃度(minimalinhibitory concentration，MIC)。細(xì)菌菌株來源于昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，此實(shí)驗做四個平行，取幾何平均值，結(jié)果如表1。
表1.胡蜂抗菌肽抑制細(xì)菌生長的作用

由表1可見，胡蜂毒液與胡蜂抗菌肽的純品均具有顯著的抑制細(xì)菌生長作用。
2.胡蜂抗菌肽抑制真菌生長的作用抗真菌活性檢測采用杯碟法，培養(yǎng)基為改良沙保氏(Sabousand)培養(yǎng)基。分別注入加熱溶化的培養(yǎng)基20ml于平皿中作為底層，使其在皿底均勻攤布，凝固后另取培養(yǎng)基適量加熱溶化，分別向每皿中加入5ml菌懸液，搖勻，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻后，在平皿中等距離放入已消毒的不銹鋼杯5個。第一個鋼杯加入0.3mg/ml濃度的待測化合物溶液0.1ml，其余鋼杯采用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養(yǎng)，24h-48h后測量抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上作為最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。細(xì)菌菌株來源于云南大學(xué)微生物研究所，此實(shí)驗做三個平行，取幾何平均值，結(jié)果如表2。
表2.胡蜂抗菌肽抑制真菌生長的作用


由表2可見，胡蜂毒液與胡蜂抗菌肽的純品均具有顯著的抑制真菌生長作用。
3.胡蜂抗菌肽抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用在96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板上將待測樣品用完全培養(yǎng)基進(jìn)行5倍或2倍倍比稀釋，共6個滴度，每個稀釋度3個重復(fù)，每孔100ul，同時設(shè)正常細(xì)胞對照。每孔滴加3×105/ml的HeP3B細(xì)胞或Molt-4細(xì)胞100ul，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48h后用MTT法測定樣品對細(xì)胞的毒性作用。EC50是對50％細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用時的藥物濃度。結(jié)果見表3。
目前臨床上所運(yùn)用的大部分抗生素藥物不具有抑制腫瘤作用，從表3可見，胡蜂毒液與胡蜂抗菌肽均具有體外顯著的抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。
表3.胡蜂抗菌肽抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用

4.胡蜂抗菌肽抑制HIV-1繁殖的作用將細(xì)胞瓶中的JC53-BL細(xì)胞以每孔20000個的濃度接入到無菌96孔板，在sDMEM培養(yǎng)基中37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)18h，接入最終濃度為0.1、1.25、2.5、5、10、20ug/ml的陽品，同樣條件培養(yǎng)3 h后分別接入用含40ug EAE-dextran的sDMEM稀釋的HIV-1 LAI株和BAL株(MOI0.009-0.65)并使每孔最終為200ul，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后用X-Gal染色數(shù)蘭斑計算抑制百分率和50％的抑制濃度IC50，實(shí)驗設(shè)空白對照，陽性對照劑及加肽而不接毒的對照，做四次重復(fù)求幾何平均。
表4.胡蜂抗菌肽抑制HIV-1繁殖的作用

由表4可見，胡蜂毒液與胡蜂抗菌肽的純品均具有顯著的抑制HIV-1繁殖作用。
胡蜂毒液和胡蜂抗菌肽均具有顯著的抑制細(xì)菌、真菌和病毒生長的作用，所有微生物菌/毒株包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎球菌、巨大芽孢桿菌、枯草桿菌、白色念珠菌、黃曲霉、青霉、微小毛霉、啤酒酵母、HIV-1的LAI株和BAL株等，結(jié)果表明胡蜂抗菌肽具有廣譜抗微生物活性(包括革蘭氏陰、陽性細(xì)菌，真菌和病毒，MIC和IC50分別在3.5-25ug/ml與7ug/ml-15ug/ml的范圍內(nèi))。同時胡蜂抗菌肽具有顯著的抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用，胡蜂抗菌肽對HeP3B細(xì)胞和Molt-4細(xì)胞的抑制率的EC50值分別為3.1ug/m，20.7ug/ml，與文獻(xiàn)報道的同時具有腫瘤細(xì)胞抑制活性的其他來源抗菌肽相比，胡蜂抗菌肽的腫瘤細(xì)胞抑制活性高10-15倍。因此，本發(fā)明的胡蜂抗菌肽是一種首次從中國特色藥用生物資源中研制的具有抗微生物，腫瘤活性的多肽。


圖1為本發(fā)明胡蜂抗菌肽的Sephadex G-50凝膠過濾柱層析圖。
圖2為本發(fā)明胡蜂抗菌肽的CM Sephadex C-25陽離子交換柱層析圖。
圖3為本發(fā)明胡蜂抗菌肽反相高壓液相色譜圖。
圖4為本發(fā)明胡蜂抗菌肽的飛行時間質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
1、制備胡蜂抗菌肽電刺激胡蜂收集的蜂毒離心(10000rpm，10min)去除沉淀，冷凍干燥后低溫保存。
第一步，Sephadex G-50凝膠過濾柱層析，按上述方法獲得的原材料胡蜂毒凍干粉300mg溶解于5ml純凈水，10000rpm 4℃離心10min去除沉淀。SephadexG-50凝膠過濾柱(長1000mm，直徑26mm)用0.1M Na2HPO4-NaH2PO4pH 6.0緩沖液平衡，充分后將樣品上于該柱。用同樣緩沖液洗脫，收集第III峰。
第二步，離子交換柱層析凝膠過濾柱層析得到的活性成分峰III上樣于0.1MNa2HPO4-NaH2PO4pH 6.0緩沖液充分平衡的CM Sephadex C-25陽離子交換柱，交換柱長300mm，直徑26mm，經(jīng)兩個半個柱體積同樣緩沖液洗至穿透峰被完全洗脫，用含Nacl的0.1M Na2HPO4-NaH2PO4pH 6.0緩沖液梯度洗脫，收集第V峰；第三步，反相高壓液相色譜為離子交換柱層析得到的活性成分峰V上樣于經(jīng)含1‰三氟乙酸的超純水充分平衡的C18反相柱(長300mm，直徑5mm)用含1‰三氟乙酸的乙晴緩沖液從15％至65％的梯度洗脫。收集時間為45.4min處的峰(圖中第二大洗脫樣品峰)。
2.純化的胡蜂抗菌肽分子量測定采用飛行時間質(zhì)譜(Flight of time massspectrometry，TOF-MS)，等電點(diǎn)采用等電聚焦測定，用自動氨基酸序列測定儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
通過上述方法制備的胡蜂抗菌肽是我們首次從中國節(jié)肢類動物胡蜂毒液中分離得到的一種單鏈多肽，分子量1316.6道爾頓，等電點(diǎn)8.59，多肽全序列為異亮氨酸-天冬氨酸-色氨酸-賴氨酸-甘氨酸-異亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-蛋氨酸-丙氨酸-賴氨酸-異亮氨酸(NH2-IDWKGIAAMAKI-COOH)。
實(shí)驗結(jié)果表明，胡蜂抗菌肽具有對細(xì)菌、真菌、病毒及腫瘤細(xì)胞生長強(qiáng)烈活性抑制作用，并且還具有無溶血活性、血漿凝固活性等優(yōu)點(diǎn)，可作為制備病原微生物感染疾病的治療藥物和腫瘤治療藥物的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種胡蜂抗菌肽，其特征在于該抗菌肽是從胡蜂中分離得到的一種單鏈多肽，分子量1316.6道爾頓，等電點(diǎn)8.59，多肽全序列為異亮氨酸-天冬氨酸-色氨酸-賴氨酸-甘氨酸-異亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-蛋氨酸-丙氨酸-賴氨酸-異亮氨酸。
2.權(quán)利要求1所說胡蜂抗菌肽的制備方法，其特征在于方法包括電刺激胡蜂收集的蜂毒離心去除沉淀，冷凍干燥后經(jīng)凝膠過濾柱層析、離子交換柱層析和反相高壓液相色譜分離純化；其中2.1凝膠過濾柱層析為將收集的胡蜂毒液凍干粉溶于純凈水后上樣于Sephadex G-50凝膠過濾柱，凝膠過濾柱長1000mm，直徑26mm，用0.1MNa2HPO4-NaH2PO4pH6.0緩沖液洗脫，收集第III峰；2.2離子交換柱層析為凝膠過濾柱層析得到的活性成分峰III上樣于0.1MNa2HPO4-NaH2PO4pH6.0緩沖液平衡的CM Sephadex C-25陽離子交換柱，交換柱長300mm，直徑26mm，用含Nacl的0.1M Na2HPO4-NaH2PO4pH6.0緩沖液梯度洗脫，收集第V峰；2.3反相高壓液相色譜為離子交換柱層析得到的活性成分峰V上樣于經(jīng)含1‰三氟乙酸的超純水平衡的C18反相柱，柱長300mm、直徑5mm，用含1‰三氟乙酸的乙晴緩沖液從15％至65％的梯度洗脫，收集時間為45.4min處的峰。
3.權(quán)利要求1所說的胡蜂抗菌肽，作為制備病原微生物感染疾病的治療藥物和腫瘤治療藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種胡蜂抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。胡蜂抗菌肽是從中國節(jié)肢類動物胡蜂毒液中分離得到的一種單鏈多肽，分子量1316.6道爾頓，等電點(diǎn)8.59，多肽全序列為NH
文檔編號A61P35/00GK1683399SQ20051001066
公開日2005年10月19日 申請日期2005年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月23日
發(fā)明者賴仞, 徐學(xué)清 申請人:中國科學(xué)院昆明動物研究所