專利名稱：梔子提取物通過特異性抑制ucp2提高胰島素分泌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子內(nèi)分泌學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及梔子提取物體外培養(yǎng)小鼠胰島細(xì)胞，通過特異性抑制解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)的表達，從而刺激胰島素分泌的方法。
二、技術(shù)背景胰島細(xì)胞的功能異常以及胰島素抵抗，常導(dǎo)致II型糖尿病。胰島細(xì)胞功能異常是一種復(fù)雜的現(xiàn)象，包括對葡萄糖感應(yīng)的喪失，導(dǎo)致GSIS(glucose-stimulated insulinsecretion)損害。
UCP2是胰島素分泌的負(fù)調(diào)節(jié)分子。首先，它介導(dǎo)了線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子滲漏，這已被一系列的研究所證明，這些研究的對象涵蓋了原脂質(zhì)體、線粒體以及完整細(xì)胞(Krauss S，et a1.Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.99118-122，2002)。在胰島β細(xì)胞中，UCP2介導(dǎo)的質(zhì)子滲漏使得糖生成的ATP數(shù)量降低，從而負(fù)調(diào)節(jié)GSIS。ob/ob小鼠是肥胖導(dǎo)致的糖尿病動物模型，在該小鼠胰島中，UCP2表達顯著升高。另外，高血糖也能導(dǎo)致胰島內(nèi)UCP2表達升高。更重要的是，在ob/ob小鼠中敲除UCP2，胰島素分泌的第一相能得到恢復(fù)，并且血清中胰島素含量升高，高血糖癥狀也得到改善(Zhang CY，et.al.Cell 105745-755，2001)。這些結(jié)果充分說明，UCP2在高血糖以及肥胖導(dǎo)致的胰島功能異常中發(fā)揮了重要作用。因此，設(shè)法抑制UCP2在胰島細(xì)胞中的表達在糖尿病的治療中具有廣闊的前景。
在祖國的醫(yī)學(xué)寶典中，梔子是一味治療糖尿病的良藥。中醫(yī)講究的是“陰陽調(diào)和”，認(rèn)為疾病是由于寒熱失調(diào)所引起的，這些理論體系顯得過于虛幻，缺少現(xiàn)代分子生物學(xué)研究支持。因此，我們想以梔子提取物為研究對象，充分運用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的實驗手段，試圖揭示梔子治療糖尿病的分子機制。并且我們推測，UCP2很有可能是中醫(yī)寒熱理論的其中一個重要效應(yīng)分子，并成為梔子作用的靶位點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種梔子提取物，通過特異性抑制UCP2蛋白的表達而提高胰島素分泌的方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案一種梔子提取物通過特異性抑制UCP2蛋白的表達，從而提高胰島素分泌的實驗方法，其特征在于a.梔子的提取和濃縮過程1.0kg的梔子加入10kg的蒸餾水，煎煮1.5h。經(jīng)過D101大孔樹脂的吸附萃取，用蒸餾水過柱洗去雜質(zhì)，再用60％乙醇洗脫，并在70℃低溫下減壓干燥成粉末。最后用蒸餾水重溶，得到1L梔子提取物溶液；b.梔子提取物特異性抑制UCP2蛋白的表達，提高體外培養(yǎng)的胰島細(xì)胞的胰島素分泌量用5.5mM葡萄糖常規(guī)培養(yǎng)胰島細(xì)胞，然后加入梔子提取物，發(fā)現(xiàn)對于野生型胰島，胰島素的分泌量從3.5025提高到11.81625(n＝8，單位ng/islet/h)。而對UCP2表達缺失的胰島細(xì)胞，梔子提取物不能刺激胰島素分泌(對照組15.386，加藥組9.72，n＝5，單位ng/islet/h)。
所述梔子的提取和濃縮過程，其特征在于梔子的用量、煎煮時間、大孔樹脂的萃取、乙醇洗脫以及減壓干燥的過程。
所述梔子提取物通過特異性抑制UCP2蛋白的表達，提高胰島素分泌量的過程，其特征在于梔子提取物能提高野生型胰島細(xì)胞的胰島素分泌量，但對UCP2表達缺失的胰島細(xì)胞沒有此種效果，說明UCP2是梔子提取物作用的靶位點。
本發(fā)明首次闡明了梔子提取物具有刺激胰島素分泌的效應(yīng)，更重要的是，該效應(yīng)是通過特異性抑制UCP2的表達實現(xiàn)的。目前中醫(yī)和現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究還沒有很好的結(jié)合起來，中藥作用的特異性靶位點更是知之甚少。本研究室首次提出UCP2是胰島素分泌的負(fù)調(diào)控因子(Zhang CY，et.al.Cell 105745-755，2001)，在肥胖導(dǎo)致的胰島功能異常中扮演了重要角色。在此基礎(chǔ)上，又進一步發(fā)現(xiàn)梔子提取物作用的靶位點就是UCP2，通過特異性抑制UCP2的表達來提高胰島素分泌。本發(fā)明所述梔子提取物可在制備治療II型糖尿病藥物中應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果是為中醫(yī)治療II型糖尿病提供了現(xiàn)代分子生物學(xué)的理論依據(jù)，揭示了梔子治療糖尿病的分子機制；證實UCP2是中醫(yī)寒熱理論中的一個重要效應(yīng)分子。
四

圖1為純化后的小鼠胰島細(xì)胞。
圖2為梔子提取物分別刺激野生型和UCP2表達缺失的胰島細(xì)胞，胰島素分泌量的測定數(shù)據(jù)圖。
五具體實施例方式
本發(fā)明把梔子經(jīng)過水煎煮、大孔樹脂吸附萃取、乙醇稀釋及減壓干燥等一系列步驟，得到梔子提取物。從野生型小鼠和UCP2基因敲除小鼠中分別分離純化胰島細(xì)胞，再施加梔子提取物刺激，然后測定胰島素的分泌量。結(jié)果證實梔子提取物提高了野生型胰島細(xì)胞的胰島素分泌量，而對于UCP2表達缺失的胰島細(xì)胞，梔子提取物不具有該效應(yīng)。
材料與來源試劑D101大孔樹脂購自Sigma公司；Liberase RI酶購自Roche公司(Cat.No.11815032001)；Ficoll 400購自Pharmacia公司；RPMI 1640培養(yǎng)液(含11mM D-葡萄糖)和低糖DMEM培養(yǎng)液(含5.5mM D-葡萄糖)購自Invitrogen公司；PBS緩沖液自配。
手術(shù)器械剪刀，止血鉗，彎頭小鑷，動脈夾，輸液皮管以及10ml無菌注射器購自江蘇思來科技有限公司。
其它器材減壓干燥器；UCP2基因敲除小鼠；小鼠胰島素測定試劑盒購自美國Crystal公司實施例1.梔子的提取和濃縮1.0kg的梔子加入10kg的蒸餾水，煎煮1.5h。經(jīng)過D101大孔樹脂的吸附萃取，用蒸餾水過柱洗去雜質(zhì)，再用60％乙醇洗脫，并在70℃低溫下減壓干燥成粉末。最后用蒸餾水重溶，得到1L梔子提取物溶液；2.小鼠胰島的分離與純化實驗用小鼠為SPF級的野生型小鼠和UCP2基因敲除小鼠，品系c57/B6，體重15-20g，本室保存。小鼠頸椎脫臼法處死，開腹，用動脈夾夾住膽總管入十二指腸端。肝臟上翻，游離膽總管。通過膽總管往胰腺灌注預(yù)冷的Liberase RI酶工作液(0.167mg/ml)約2ml，使胰腺充分膨脹。鈍性分離完整的胰腺，置于37℃水浴靜止消化27.5min。消化結(jié)束后，用漩渦振蕩器上劇烈振蕩10s，此時胰腺已被分解成糜狀的組織，加入預(yù)冷PBS終止消化。用PBS洗消化物兩次，每次1000rpm 15s。往組織沉淀加入4ml 25％(w/v)Ficoll，振蕩混勻，再依次小心加入23％，21％，11％的Ficoll各2ml，形成界面清晰的密度梯度分離液。把離心管放入吊桶式的轉(zhuǎn)頭，1000rpm離心10min。離心結(jié)束后，取出管子，可以看見在21％和11％的界面上散在分布著一層沙狀的白色小顆粒，此即為初步純化的胰島細(xì)胞。用巴氏吸管小心的吸出細(xì)胞團，用PBS洗兩次，每次1000rpm 15s，然后用含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(含11mM D-葡萄糖)，在95％air+5％CO2的環(huán)境下培養(yǎng)過夜。純化后的胰島見圖1。
3.胰島素分泌量的測定胰島培養(yǎng)過夜后，用小號槍頭逐一挑出，置于低糖DMEM培養(yǎng)液中(含5.5mM D-葡萄糖)，并隨機分成四組，即野生型胰島正常培養(yǎng)組；野生型胰島施加梔子提取物刺激組；UCP2基因敲除胰島正常培養(yǎng)組；UCP2基因敲除胰島施加梔子提取物刺激組。梔子提取物的用量是40μg/ml，培養(yǎng)時間72h。實驗結(jié)束后，把胰島挑出置于Eppendorf管中，每3個大小均一，直徑約為150μm的胰島歸于一管，管中已加入1ml低糖DMEM培養(yǎng)液。把管子放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h，簡短離心，取上清，用小鼠胰島素ELISA試劑盒測定胰島素釋放量(圖2)。
權(quán)利要求
1.一種梔子提取物通過特異性抑制UCP2蛋白的表達，從而提高胰島素分泌的方法，其特征在于梔子的提取和濃縮過程梔子加入蒸餾水，煎煮1.5h；經(jīng)過D101大孔樹脂的吸附萃取，用蒸餾水過柱洗去雜質(zhì)，再用60％乙醇洗脫，并在70℃低溫下減壓干燥成粉末；最后用蒸餾水重溶，得到梔子提取物溶液；用5.5mM葡萄糖常規(guī)培養(yǎng)胰島細(xì)胞，然后加入梔子提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的梔子提取物提高胰島素分泌的方法，其特征在于梔子提取物能提高野生型胰島細(xì)胞的胰島素分泌量，但對UCP2表達缺失的胰島細(xì)胞沒有此種效果，說明UCP2是梔子提取物作用的靶位點。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述梔子提取物在制備治療II型糖尿病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子內(nèi)分泌學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，是具體涉及用梔子提取物體外培養(yǎng)小鼠胰島細(xì)胞，通過特異性抑制解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)的表達，從而刺激胰島素分泌的方法。本發(fā)明將梔子經(jīng)過水煎煮，大孔樹脂萃取，乙醇稀釋以及減壓凍干，得到濃縮提取物。用該提取物培養(yǎng)小鼠胰島細(xì)胞，能顯著刺激野生型胰島細(xì)胞的胰島素分泌量，但對UCP2表達缺失的胰島細(xì)胞沒有此種效應(yīng)。本發(fā)明闡明了梔子提取物通過特異性抑制UCP2蛋白的表達，提高胰島素分泌的重要生物學(xué)現(xiàn)象，揭示了梔子治療糖尿病的分子機制；為中醫(yī)治療II型糖尿病提供了現(xiàn)代分子生物學(xué)的理論依據(jù)。
文檔編號A61P3/00GK1823964SQ200510022659
公開日2006年8月30日 申請日期2005年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月27日
發(fā)明者項陽, 張燕, 張紅杰, 張辰宇, 劉暢, 孫國勛 申請人:南京大學(xué)