專利名稱：一種促進(jìn)脂質(zhì)體淋巴吸收和減少正常淋巴結(jié)蓄積的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬制藥和臨床藥學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種促進(jìn)局部注射的脂質(zhì)體淋巴吸收而減少局部殘留量問題的方法，同時也涉及飽和淋巴結(jié)中巨噬細(xì)胞攝取而減少正常淋巴結(jié)蓄積脂質(zhì)體的方法。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是威脅人類生命的嚴(yán)重疾病，目前在我國發(fā)病率也越來越高，除腦腫瘤外，任何系統(tǒng)的腫瘤幾乎均可發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤患者死亡的主要原因之一，據(jù)統(tǒng)計，60％初診患者就診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移。淋巴系統(tǒng)全身分布廣泛，并且具有其特殊性，淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤的治療始終是一個難題。由于淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤的特殊性，使得手術(shù)治療的效果往往較差，靜注化療藥物的淋巴聚集量少而全身毒副作用較大。因此，將抗腫瘤藥物導(dǎo)向到淋巴系統(tǒng)、靶向腫瘤細(xì)胞，對惡性腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的治療具有極為重要的意義。
毛細(xì)淋巴管與毛細(xì)血管并行于全身各個部位，但兩者在微結(jié)構(gòu)上存有差異。毛細(xì)血管壁由緊密排列的內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞間隙較小，一般只有8～10nm左右。毛細(xì)淋巴管壁很薄，由一層連續(xù)的扁平內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，從超微結(jié)構(gòu)看，相鄰內(nèi)皮細(xì)胞呈疊瓦狀連接，彼此可重疊幾個微米，在重疊的細(xì)胞間可出現(xiàn)約30～120nm的孔隙。細(xì)胞邊緣游離內(nèi)垂形成瓣狀結(jié)構(gòu)，只允許液體從組織間隙單方向流入毛細(xì)淋巴管。因此，在組織間隙注射具有一定粒徑的粒子，當(dāng)其粒徑小于毛細(xì)淋巴管壁孔隙而大于毛細(xì)血管壁孔徑時，粒子將會被動導(dǎo)向毛細(xì)淋巴管而進(jìn)入淋巴系統(tǒng)。此外，在組織間隙中，由粘多糖膠原作為基質(zhì)構(gòu)成的凝聚態(tài)親水性通道在生理pH條件下帶負(fù)電，其可使帶正電物質(zhì)較長時間滯留在組織間隙內(nèi)[The physiology of the lymphatic system.AdvancedDrug Delivery Reviews.2001.503-20；Targeting of colloids to lymph nodesinfluence oflymphatic physiology and colloidal characteristics.Advanced Drug Delivery Reviews.1995，17129-148]。
脂質(zhì)體是一種磷脂類化合物在水溶液中形成的具有雙層封閉結(jié)構(gòu)的泡囊，由于其具有較大的載藥空間，加之脂質(zhì)體的制備工藝逐步完善，體內(nèi)易降解、無毒、無免疫原性，已廣泛用作包載各類藥物尤其是抗腫瘤藥物的載體。采用一定的技術(shù)將脂質(zhì)體的粒徑控制在一定的范圍內(nèi)，局部注射(如肌肉或皮下注射)后，可以使其具有淋巴趨向性。
早在上世紀(jì)80年代就有學(xué)者開始了脂質(zhì)體作為淋巴系統(tǒng)靶向載體的研究[Lymphatic targeting with nanoparticulate system.Advanced Drug Delivery Reviews.2001，4755-64；Liposomes to target the lymphatics by subcutaneous administration.AdvancedDrug Delivery Reviews.2001，50143-156；Targeting of colloids to lymph nodesinfluenceof lymphatic physiology and colloidal characteristics.Advanced Drug Delivery Reviews.1995，17129-148；Lymphatic uptake and biodistribution of liposomes after subcutaneousinjection.II.Influence of liposomal size，lipid composition and lipid dose.Biochim.Biophys.Acta 1997，1328261-272]，但鑒于存在如下兩個主要問題未獲得解決，至今在脂質(zhì)體局部給藥的淋巴轉(zhuǎn)移性腫瘤治療方面未見突破[The influence of the route ofadministration and liposome composition on the potential of liposomes to protect tissueagainst local toxicity of two antitumor drugs.Biochim.Biophys.Acta.1998，1369159-172；Role of macrophages in the localization of liposomes in lymph nodes after subcutaneousadministration.International Journal of Pharmaceutics.1999，18337-41]。其一，脂質(zhì)體在注射部位的殘留問題。組織間隙中脂質(zhì)體淋巴吸收的動力來自于組織間隙液體與淋巴液之間的靜壓力差。注射初期，注射部位的靜壓力較大，脂質(zhì)體被動吸收進(jìn)入毛細(xì)淋巴管。隨著組織間隙脂質(zhì)體量的減少，注射部位與淋巴液之間的靜壓力差逐漸減小，導(dǎo)致在吸收后相有一定量脂質(zhì)體殘留在組織間隙。由于導(dǎo)向淋巴系統(tǒng)的脂質(zhì)體包載的抗腫瘤藥物毒性很大，因此較多殘留藥物將會造成給藥部位的組織壞死。其二，脂質(zhì)體進(jìn)入淋巴循環(huán)系統(tǒng)后，由于淋巴引流方向上的前級淋巴結(jié)中巨噬細(xì)胞吞噬作用，造成對正常淋巴結(jié)的毒副作用，同時也使藥物不能完全靶向至攜帶有腫瘤細(xì)胞的后級淋巴結(jié)中，從而影響淋巴轉(zhuǎn)移性或原發(fā)性腫瘤的療效。
因此，提高脂質(zhì)體在注射部位的吸收效率、減少其殘留，同時降低正常淋巴結(jié)對脂質(zhì)體在正常淋巴系統(tǒng)中的蓄積，將有利于更好地實現(xiàn)載抗腫瘤藥物的脂質(zhì)體對轉(zhuǎn)移性和原發(fā)性淋巴系統(tǒng)腫瘤的治療。
某些大顆粒的物質(zhì)，例如脂質(zhì)體、納米粒、膠束等，其混懸液具有一定的膠體滲透壓，在注射局部可以形成一定的滲透壓。如果注射的脂質(zhì)體、納米粒、膠束等的粒徑足夠大(如大于毛細(xì)淋巴管壁的孔徑)，則其很少被淋巴系統(tǒng)吸收[Preparation ofbiodegradsble，surface engineered PLGA nanospheres with enhanced lymphatic drainageand Lymph Node Uptake.Pharmaceutical Research.1997，145；Lymphatic targeting withnanoparticulate system.Advanced Drug Delivery Reviews.2001，4755-64；Liposomes totarget the lymphatics by subcutaneous administration.Advanced Drug Delivery Reviews.2001，50143-156；Targeting of colloids to lymph nodesinfluence of lymphaticphysiology and colloidal characteristics.Advanced Drug Delivery Reviews.1995.17129-148；Lymphatic uptake and biodistribution of liposomes after subcutaneous injection.II.Influence of liposomal size，lipid composition and lipid dose.Biochim.Biophys.Acta1997，1328261-272]，使毛細(xì)血管和組織間隙中的組織液向注射部位滲透，有利于在注射部位維持一定的靜壓力。
某些高分子物質(zhì)，如右旋糖酐、殼多糖、海藻酸、透明質(zhì)酸和聚乙二醇等及其衍生物，其一定濃度水溶液或生理鹽水溶液在注射局部也可以形成一定的滲透壓，并在一定時間內(nèi)維持注射部位的靜壓力，同時自身還可以導(dǎo)向淋巴系統(tǒng)并被淋巴結(jié)攝取[99m锝-葡聚糖淋巴系統(tǒng)顯像劑研制及其初步臨床應(yīng)用.上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報1991，18(4)246-251；99mTc-右旋糖酐-105在家兔淋巴系統(tǒng)的導(dǎo)向和定位作用.上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報1996，23(suppl)3-5；Interstitial MR and CT lymphography withGd-dTPA-co-alpha，omega-diaminoPEG(1450)and Gd-dTPA-co-1，6-diaminohexanepolymerspreliminary experience.Academic Radiology.1999，6(2)112-118]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種局部注射后促進(jìn)脂質(zhì)體淋巴吸收的方法，以減少脂質(zhì)體在給藥部位的殘留量；本發(fā)明的目的還在于，提供一種飽和淋巴結(jié)攝取的方法，以降低正常淋巴結(jié)蓄積脂質(zhì)體量。本方法可以顯著減少局部注射脂質(zhì)體在給藥部位的殘留量，并降低脂質(zhì)體在正常淋巴系統(tǒng)的蓄積。
本方法的技術(shù)方案特征在于，采用相關(guān)物質(zhì)維持注射部位靜壓力，加速脂質(zhì)體淋巴吸收、減少脂質(zhì)體局部殘留。包括選用一類脂質(zhì)體及其粒徑范圍、脂質(zhì)體膜材料及其配比，選擇維持注射部位靜壓力的物質(zhì)及其與脂質(zhì)體的濃度比，以及給藥方法。
本發(fā)明所述的維持注射部位靜壓力相關(guān)物質(zhì)是空白顆粒性物質(zhì)或高分子物質(zhì)。
本發(fā)明所述的脂質(zhì)體為膠體性混懸液，其粒徑范圍在10～100納米之間。
本發(fā)明所述脂質(zhì)體所用的膜材料主要包括下述三種成分a、天然大豆卵磷脂、合成的不飽和磷脂和飽和磷脂；b、膽固醇；c、合成的帶有長鏈單甲氧基聚乙二醇分子(分子量范圍2000～6000)的磷脂類衍生物。其中三種成分之間的摩爾比分別為a∶b為5∶1～1∶2，a∶e為100∶1～100∶10。
本發(fā)明選用的維持注射部位靜壓力物質(zhì)包括下述兩大類(1)空白脂質(zhì)體的粒徑范圍為100～300納米。空白脂質(zhì)體所用的脂質(zhì)材料主要包括三種成分a、天然大豆卵磷脂、合成的不飽和磷脂和飽和磷脂；b、膽固醇；c、合成的帶有長鏈單甲氧基聚乙二醇分子(分子量范圍2000～6000)的磷脂類衍生物。其中三種成分之間的摩爾比分別為a∶b在5∶1～1∶2，a∶c在100∶1～100∶10。(2)高分子物質(zhì)，其包括右旋糖酐、羧甲基右旋糖酐、DEAE-右旋糖酐和右旋糖酐硫酸酯，殼多糖和脫乙酰殼多糖，海藻酸及其鈉鹽，透明質(zhì)酸及其鈉鹽，聚乙二醇和單甲氧基聚乙二醇、單氨基聚乙二醇和雙氨基聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇單氨等，除聚乙二醇及其衍生物分子量下限可達(dá)0.2萬外，其余高分子分子量范圍為4～100萬。
本發(fā)明選用的維持注射部位靜壓力的物質(zhì)與脂質(zhì)體的濃度比為(1)對于空白脂質(zhì)體而言，單位體積內(nèi)脂質(zhì)體與空白脂質(zhì)體的摩爾比為1∶1～3∶1。(2)對于高分子物質(zhì)而言，單位體積內(nèi)脂質(zhì)體中磷脂與高分子的摩爾比為2∶1～200∶1。
本發(fā)明的具體給藥方法是，將給藥前單獨制備好的脂質(zhì)體混懸液、空白脂質(zhì)體混懸液或高分子溶液，以單位體積內(nèi)脂質(zhì)體與后者按上述摩爾比混合后進(jìn)行局部給藥(如肌肉注射或皮下注射)。
本發(fā)明針對局部注射脂質(zhì)體在給藥部位的殘留問題，采用“滲透壓補償”策略，其包括(1)多粒徑壓力補償將小粒徑脂質(zhì)體與空白大粒徑脂質(zhì)體混合給藥。所述小粒徑脂質(zhì)體既可進(jìn)入淋巴系統(tǒng)又規(guī)避淋巴結(jié)竇狀網(wǎng)絡(luò)組織機械截留，所述空白大粒徑脂質(zhì)體其粒徑大于毛細(xì)淋巴管壁孔隙，不能或很少進(jìn)入淋巴循環(huán)而為組織間隙提供膠體滲透壓。由于粒徑的差異，小粒徑脂質(zhì)體將先期進(jìn)入毛細(xì)淋巴管，大粒徑空白脂質(zhì)體則通過其固有的膠體滲透壓吸引毛細(xì)血管內(nèi)的液體進(jìn)入組織間隙，從而有利于維持吸收后期的組織間隙靜壓力，繼續(xù)促使小粒徑脂質(zhì)體進(jìn)入淋巴系統(tǒng)。(2)高分子壓力補償將高分子物質(zhì)與小粒徑脂質(zhì)體混合給藥。在組織間隙中，高分子物質(zhì)在一定時間內(nèi)的較高滲透性，使毛細(xì)血管內(nèi)的液體較快進(jìn)入組織間隙而促進(jìn)局部脂質(zhì)體的淋巴吸收。通過局部注射脂質(zhì)體的同時給予大粒徑空白脂質(zhì)體或高分子物質(zhì)，增加吸收后期給藥部位的靜壓力，達(dá)到促進(jìn)脂質(zhì)體淋巴導(dǎo)向和減少注射部位殘留的目的。所述高分子物質(zhì)包括右旋糖酐、羧甲基右旋糖酐、DEAE-右旋糖酐和右旋糖酐硫酸酯，殼多糖和脫乙酰殼多糖，海藻酸及其鈉鹽，透明質(zhì)酸及其鈉鹽，聚乙二醇和單甲氧基聚乙二醇、單氨基聚乙二醇和雙氨基聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇單氨。
本發(fā)明針對正常淋巴結(jié)蓄積脂質(zhì)體問題，采用“飽和巨噬細(xì)胞”策略，利用巨噬細(xì)胞對多糖類高分子物質(zhì)具有較強吞噬作用的特點，在脂質(zhì)體中加入多糖高分子以飽和巨噬細(xì)胞的吞噬作用。
動物體內(nèi)和體外細(xì)胞試驗結(jié)果表明在給予脂質(zhì)體的同時給予空白脂質(zhì)體或高分子物質(zhì)，脂質(zhì)體在注射部位的殘留量顯著少于單獨注射脂質(zhì)體組；在正常淋巴結(jié)和巨噬細(xì)胞攝取量顯著低于單獨注射脂質(zhì)體組。
1、在注射脂質(zhì)體的同時給予空白脂質(zhì)體以99mTc標(biāo)記脂質(zhì)體而不標(biāo)記空白脂質(zhì)體。SD大鼠(體重200～220g)隨機分成兩組，一組在大鼠足背部注射脂質(zhì)體，另一組注射按一定比例混合的脂質(zhì)體與空白脂質(zhì)體的混合物。分別于注射后0.5、4和24小時處死大鼠，檢測注射部位放射性計數(shù)，計算各時間點脂質(zhì)體在給藥部位的殘留百分率。表1是空白脂質(zhì)體對脂質(zhì)體在注射部位殘留率的影響結(jié)果(X±SD％，n＝6注射部位)。
表1時間 0.5小時4小時 24小時單獨脂質(zhì)體組 88.95±5.6437.48±9.1611.40±1.61脂質(zhì)體與空白脂質(zhì)體81.34±5.1721.07±4.519.74±1.38混合物組P值(與單獨組比較)p＜0.05p＜0.01p＜0.01其中脂質(zhì)體粒徑50nm，空白脂質(zhì)體粒徑100nm，脂質(zhì)體與空白脂質(zhì)體摩爾比例2∶12、在注射脂質(zhì)體的同時給予高分子物質(zhì)以99mTc標(biāo)記脂質(zhì)體。SD大鼠(體重200～220g)隨機分成兩組，一組大鼠在足背部注射脂質(zhì)體，另一組注射按一定比例混合的脂質(zhì)體與高分子溶液的混合物。分別于注射后0.5、4和、24小時處死大鼠，檢測注射部位放射性計數(shù)，計算各時間點脂質(zhì)體在給藥部位的殘留百分率。表2是高分子物質(zhì)對脂質(zhì)體在注射部位殘留率的影響結(jié)果(X±SD％，n＝6注射部位)。
表2時間0.5小時4小時 24小時單獨脂質(zhì)體組89.43±5.0637.68±8.2318.43±2.78脂質(zhì)體與右旋糖酐溶液66.35±6.0726.02±3.7513.66±2.13混合物組脂質(zhì)體與羧甲基右旋糖酐溶液77.03±2.2424.45±1.9011.56±1.78混合物組脂質(zhì)體與DEAE-右旋糖酐溶液61.00±7.6017.26±1.933.13±0.56混合物組P值(與單獨組比較) p＜0.01p＜0.01p＜0.01其中脂質(zhì)體粒徑50nm，高分子濃度25mg/ml，脂質(zhì)體與高分子摩爾比例1∶503、飽和巨噬細(xì)胞策略以99mTc標(biāo)記脂質(zhì)體的體內(nèi)外試驗。
(1)體內(nèi)淋巴結(jié)攝取試驗SD大鼠(體重200～220g)隨機分成兩組，一組大鼠在足背部注射脂質(zhì)體，另一組注射按一定比例混合的脂質(zhì)體與高分子溶液的混合物。分別于注射后0.5、4和、24小時處死大鼠，檢測腘淋巴結(jié)中放射性計數(shù)，計算各時間點脂質(zhì)體在腘淋巴結(jié)的蓄積量。表3是多糖類高分子物質(zhì)對脂質(zhì)體在腘淋巴結(jié)中蓄積量的影響結(jié)果(X±SD％/g，n＝6腘淋巴結(jié))。
表3時間 0.5小時4小時 24小時單獨脂質(zhì)體組29.14±2.5241.62±8.2247.38±8.83脂質(zhì)體與右旋糖酐溶液8.62±1.82 13.26±3.7533.33±7.99混合物組脂質(zhì)體與羧甲基右旋糖酐溶液12.77±5.6939.42±5.6944.99±7.42混合物組脂質(zhì)體與DEAE-右旋糖酐溶液6.164±2.3810.23±2.2612.68±3.02混合物組P值(與單獨組比較) p＜0.01p＜0.01p＜0.01其中脂質(zhì)體粒徑50nm，多糖類高分子濃度25mg/ml，脂質(zhì)體與多糖類高分子摩爾比例1∶50(2)體外巨噬細(xì)胞試驗RAW-264.7細(xì)胞(一種巨噬細(xì)胞)分成兩組，一組只給脂質(zhì)體，另一組在給予高分子物質(zhì)5分鐘后再加脂質(zhì)體。分別于時間點檢測RAW-264.7細(xì)胞攝取放射性的計數(shù)，并計算各時間點脂質(zhì)體被RAW-264.7細(xì)胞吞噬量。表4是多聚糖物質(zhì)DEAE-右旋糖酐對巨噬細(xì)胞攝取脂質(zhì)體的影響結(jié)果(脂質(zhì)體總量80μmol；X±SD％/，n＝3復(fù)孔)。
表4加入DEAE-右旋糖酐量(mg/ml) 0 0.25 0.500.751.001.251.50RAW-264.7細(xì)胞吞噬量(％) 100 88.0±5.1 74.9±6.5 69.5±4.8 61.0±3.0 52.8±6.0 46.0±10.

圖1是右旋糖酐(◇Mw＝110,000；+Mw＝500,000)、羧甲基右旋糖酐(×Mw＝110,000)和DEAE-右旋糖酐(△Mw＝500,000)對脂質(zhì)體粒徑的影響。
圖2是右旋糖酐(◇Mw＝110,000；+Mw＝500,000)、羧甲基右旋糖酐(×Mw＝110,000)和DEAE-右旋糖酐(△Mw＝500,000)對脂質(zhì)體包封率的影響。
圖3是右旋糖酐及其衍生物與脂質(zhì)體(含DTPA)競爭99mTc的曲線。(A)脂質(zhì)體加入標(biāo)記有99mTc的右旋糖酐溶液中；(B)右旋糖酐加入99mTc標(biāo)記的脂質(zhì)體混懸液中；(C)羧甲基右旋糖酐加入99mTc標(biāo)記的脂質(zhì)體混懸液中；(D)DEAE-右旋糖酐加入99mTc標(biāo)記的脂質(zhì)體混懸液中。
圖4是高分子分子量和荷電性對脂質(zhì)體在大鼠給藥部位殘留量的影響。
圖5是高分子分子量和荷電性對脂質(zhì)體在大鼠腘淋巴結(jié)蓄積量的影響。
圖6是5×105個RAW-264.7細(xì)胞攝取脂質(zhì)體量隨溫育時間的變化(脂質(zhì)體總量160μmol)。
圖7是在DEAE-右旋糖酐存在下5×105個RAW-264.7細(xì)胞攝取脂質(zhì)體量隨溫育時間的變化(DEAE-右旋糖酐濃度0.5mg/ml，脂質(zhì)體總量160μmol)。
圖8是溫育2小時后5×105個RAW-264.7細(xì)胞攝取脂質(zhì)體量隨加入脂質(zhì)體量的變化。
圖9是溫育2小時后5×105個RAW-264.7細(xì)胞攝取脂質(zhì)體量隨加入DEAE-右旋糖酐量的變化(脂質(zhì)體總量80μmol)。
具體實施例方式
以下結(jié)合實施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明并不僅限制于下述實施例范圍。
實施例1 脂質(zhì)體的制備阿霉素脂質(zhì)體的制備分別稱取氫化磷脂100mg、膽固醇50mg、單甲氧基聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺15mg于500ml圓底燒瓶中，加入氯仿50ml，在水浴30℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，真空干燥24小時。于圓底燒瓶中加入0.155mM硫酸銨水溶液10ml，水浴60℃下振搖1小時獲脂質(zhì)體粗混懸液。在N2氣壓下，將脂質(zhì)體粗混懸液擠過50nm微孔濾膜，反復(fù)擠壓6次后得50nm脂質(zhì)體。將空白脂質(zhì)體通過Sepherose CL-4B凝膠柱，以0.9％NaCl洗脫更換外水相，并將過柱后脂質(zhì)體稀釋到20mM。加入4mM的阿霉素水溶液，60℃水浴震蕩15分鐘，通過Sepherose CL-4B凝膠柱，以0.9％NaCl洗脫除去游離藥物，即得50nm的阿霉素脂質(zhì)體。
空白脂質(zhì)體的制備分別稱取氫化磷脂100mg、膽固醇50mg、單甲氧基聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺15mg于500ml圓底燒瓶中，加入氯仿50ml，在水浴30℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，真空干燥24小時。于圓底燒瓶中加入10ml 0.9％NaCl溶液10ml，水浴60℃下振搖1小時后得脂質(zhì)體粗混懸液。在N2氣壓下，將脂質(zhì)體粗混懸液擠過100nm微孔濾膜，反復(fù)擠壓6次，即得100nm的空白脂質(zhì)體。
實施例2 空白脂質(zhì)體和高分子物質(zhì)對脂質(zhì)體穩(wěn)定性的影響空白脂質(zhì)體對脂質(zhì)體穩(wěn)定性的影響由于空白脂質(zhì)體和脂質(zhì)體的粒徑存在差異，將兩者混合后，有可能引起脂質(zhì)體膜之間的融合或者脂質(zhì)體中藥物泄漏，為此，采用熒光分析法考察粒徑為100nm大粒徑空白脂質(zhì)體與粒徑為50nm小粒徑脂質(zhì)體混合后的穩(wěn)定性。分別將熒光染料DPA和TbCl3包封于100nm和50nm的脂質(zhì)體中，若大小粒徑脂質(zhì)體在混合后發(fā)生脂質(zhì)體膜融合或脂質(zhì)體內(nèi)容物均泄漏，兩種熒光染料分子接觸將會導(dǎo)致強熒光的產(chǎn)生。表5是脂質(zhì)體膜材料對不同粒徑脂質(zhì)體混合物的穩(wěn)定性影響，其中列出了不同脂質(zhì)體膜材料和粒徑的脂質(zhì)體相互混合后熒光強度的變化。結(jié)果表明，加入穩(wěn)定材料的100nm脂質(zhì)體與50nm脂質(zhì)體混合后穩(wěn)定性好。
表5

+熒光強度增大(表明脂質(zhì)體之間不穩(wěn)定)；-熒光強度不變化(表明脂質(zhì)體之間穩(wěn)定)高分子物質(zhì)對脂質(zhì)體穩(wěn)定性的影響用高分子物質(zhì)促進(jìn)脂質(zhì)體在給藥部位的淋巴吸收和減少淋巴引流方向上正常淋巴結(jié)脂質(zhì)體蓄積的前提條件是，脂質(zhì)體在高分子溶液中穩(wěn)定，其主要表現(xiàn)為粒徑不增大、藥物不泄漏。將50nm脂質(zhì)體分別與25mg/ml右旋糖酐(Mw＝40,000～500,000)、羧甲基化右旋糖酐(Mw＝110,000)和DEAE-化右旋糖酐(Mw＝500,000)溶液混合，水浴37℃放置，在一定時間點取樣檢測包封率和粒徑。圖1、圖2分別表示粒徑及包封率的變化。結(jié)果表明，在25mg/ml的右旋糖酐和DEAE-右旋糖酐溶液中脂質(zhì)體可以穩(wěn)定存在，在25mg/ml羧甲基化右旋糖酐溶液中脂質(zhì)體在12小時內(nèi)可以穩(wěn)定存在。
實施例3 脂質(zhì)體的99mTc標(biāo)記及其穩(wěn)定性脂質(zhì)體在體內(nèi)的行為是通過99mTc標(biāo)記來反映的，由于多糖類高分子化合物為多羥基化合物，其對99mTc有一定的爭奪能力，為此對脂質(zhì)體99mTc標(biāo)記的穩(wěn)定性進(jìn)行了檢測。
DTPA-HSPE的合成在三頸瓶中加入二乙基三胺五醋酸(DTPA)14g、吡啶27ml、醋酐37ml、油浴65℃攪拌反應(yīng)24小時后，抽濾，濾餅用30ml醋酐洗滌，30ml無水乙醚洗滌，干燥后得DTPA酸酐。將DTPA酸酐200mg溶于8ml吡啶中，另取磷脂酰乙醇胺(如HSPE)50mg溶于8ml吡啶中，60℃時將磷脂酰乙醇胺溶液加入到DTPA酸酐溶液中，反應(yīng)2小時。結(jié)束后蒸干溶劑，沉淀以硅膠柱分離并收集DTPA-磷脂酰乙醇胺的流分。
脂質(zhì)體99mTc標(biāo)記分別稱取氫化磷脂100mg、膽固醇50mg、聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺15mg，DTPA-磷脂酰乙醇胺36mg于500ml圓底燒瓶中，加入氯仿50ml，在水浴30℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，真空干燥24小時。于圓底燒瓶中加入0.9％NaCl溶液10ml，水浴60℃下振搖1小時獲脂質(zhì)體粗混懸液。在N2氣壓下，將脂質(zhì)體粗混懸液擠過50nm微孔濾膜，反復(fù)擠壓6次后得50nm脂質(zhì)體混懸液。脂質(zhì)體混懸液中加入氯化亞錫100μg，再加入Na99mTcO4 0.9％NaCl淋洗液(20mCi/ml)0.1ml，混勻后，室溫放置10分鐘，即得99mTc標(biāo)記的脂質(zhì)體[99m锝-葡聚糖淋巴系統(tǒng)顯像劑研制及其初步臨床應(yīng)用。
右旋糖酐99mTc標(biāo)記稱取右旋糖酐250mg，加入0.9％NaCl溶液10ml，配成濃度為25mg/ml的溶液。右旋糖酐溶液中加入氯化亞錫100μg，再加入Na99mTcO40.9％NaCl淋洗液(20mCi/ml)0.1ml，混勻后，室溫放置10分鐘，即得99mTc標(biāo)記的右旋糖酐溶液[99m锝-葡聚糖淋巴系統(tǒng)顯像劑研制及其初步臨床應(yīng)用。
99mTc標(biāo)記脂質(zhì)體的穩(wěn)定性在99mTc標(biāo)記的脂質(zhì)體混懸液中加入右旋糖酐，分別于0.5、4和24小時將混合樣品點樣展開，并對展開條帶進(jìn)行放射性檢測，結(jié)果表明放射性均處在脂質(zhì)體上；在99mTc標(biāo)記的右旋糖酐溶液中加入脂質(zhì)體混懸液，分別在0.5、4和24小時將混合樣品點樣展開，并對展開條帶進(jìn)行放射性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨時間延長放射性逐漸向脂質(zhì)體上轉(zhuǎn)移；在99mTc標(biāo)記的脂質(zhì)體混懸液中加入羧甲基右旋糖酐、DEAE-右旋糖酐，分別于0.5、4和24小時將混合樣品點樣展開，并對展開條帶進(jìn)行放射性檢測，放射性仍處在脂質(zhì)體上。上述結(jié)果均提示，標(biāo)記在脂質(zhì)體上的99mTc有良好的穩(wěn)定性。
實施例4 動物體內(nèi)試驗(1)空白脂質(zhì)體策略按實施1和3分別制備100nm空白脂質(zhì)體和50nm脂質(zhì)體，并只對后者進(jìn)行99mTc標(biāo)記。50nm脂質(zhì)體與100nm空白脂質(zhì)體按摩爾比2∶1混合。取SD大鼠18只(體重200～220g)，隨機分成兩組，一組在大鼠足背部只注射50nm脂質(zhì)體，另一組注射50nm脂質(zhì)體與100nm空白脂質(zhì)體按摩爾比2∶1混合物。分別于注射后0.5、4和24小時各處死3只大鼠，檢測注射部位放射性計數(shù)，計算各時間點50nm脂質(zhì)體在給藥部位的殘留百分率，結(jié)果見表1。
(2)高分子策略按實施例1和3制備并用99mTc標(biāo)記50nm脂質(zhì)體，備用。
高分子溶液配置分別稱取右旋糖酐(Mw＝40,000～500,000)、羧甲基右旋糖酐(Mw＝110,000)和DEAE-右旋糖酐(Mw＝500,000)或脫乙酰殼多糖(Mw＝40,000～500,000)各1g，各以0.9％NaCl配制成濃度為75mg/ml的溶液。
混合方法臨給藥前將脂質(zhì)體分別與右旋糖酐、羧甲基右旋糖酐和DEAE-右旋糖酐或脫乙酰殼多糖溶液按體積比2∶1混合。
動物試驗取SD大鼠(體重200～220g)45只，隨機分成五組。一組大鼠在足背部只注射脂質(zhì)體，其余四組分別注射脂質(zhì)體與不同高分子溶液的混合物。分別于注射后0.5、4和、24小時每組各處死3只大鼠，檢測注射部位和腘淋巴結(jié)的放射性計數(shù)，計算各時間點脂質(zhì)體在腘淋巴結(jié)的蓄積量和注射部位殘留量(結(jié)果見圖4、表2和圖5、表3)。由圖表可見，在注射脂質(zhì)體的同時給予高分子后，不同分子量和不同荷電性高分子可以顯著將少脂質(zhì)體在注射部位的殘留量；除荷負(fù)電高分子外，荷正電和中性高分子均能顯著減少脂質(zhì)體在正常淋巴結(jié)的蓄積。
實施例5 體外巨噬細(xì)胞試驗RAW-264.7細(xì)胞培養(yǎng)及處理用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃、5％CO2、飽和濕度)連續(xù)培養(yǎng)RAW-264.7細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)。用前將處于對數(shù)生長期貼壁細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)液洗滌3次，將貼壁細(xì)胞消化呈懸浮狀態(tài)，收集細(xì)胞、計數(shù)、調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度至所需濃度，備用。
RAW-264.7細(xì)胞吞噬試驗每個5ml樣品管中加入0.5ml RAW-264.7細(xì)胞懸液(5×105個)，37℃溫育。不加或加入DEAE-右旋糖酐或脫乙酰殼多糖或右旋糖酐5min后，將99mTc標(biāo)記的脂質(zhì)體加入繼續(xù)溫育一定時間，4000rpm離心棄去上清液，加入0.9％NaCl溶液2ml洗滌，再離心棄去上清液，重復(fù)操作3次。檢測細(xì)胞沉淀中放射性計數(shù)，計算占加入總放射性計數(shù)的百分?jǐn)?shù)，考察多糖類高分子物質(zhì)對巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)體的影響。結(jié)果表明，無論有無多糖類物質(zhì)存在，37℃溫育2小時后，RAW-264.7細(xì)胞吞噬脂質(zhì)體基本達(dá)到平衡(圖6、圖7)，且吞噬量隨加入脂質(zhì)體量增加而呈線性增加(圖8)，隨加入多糖類物質(zhì)量增加而呈線性下降(圖9和表4)。
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)脂質(zhì)體淋巴吸收和減少正常淋巴結(jié)蓄積的方法，其特征在于，采用相關(guān)物質(zhì)維持注射部位靜壓力，加速脂質(zhì)體淋巴吸收、減少脂質(zhì)體局部殘留，同時采用相關(guān)物質(zhì)飽和淋巴結(jié)中巨噬細(xì)胞攝取，減少正常淋巴結(jié)中脂質(zhì)體蓄積，包括選用脂質(zhì)體及其粒徑范圍，脂質(zhì)體膜材料及其配比，選擇維持注射部位靜壓力的物質(zhì)及其與脂質(zhì)體的濃度比以及給藥方法。
2.按權(quán)利要求1所述的促進(jìn)脂質(zhì)體淋巴吸收和減少正常淋巴結(jié)蓄積的方法，其特征是所述的維持注射部位靜壓力相關(guān)物質(zhì)是空白顆粒性物質(zhì)或高分子物質(zhì)。
3.按權(quán)利要求1所述的促進(jìn)脂質(zhì)體淋巴吸收和減少正常淋巴結(jié)蓄積的方法，其特征是所述的脂質(zhì)體粒徑范圍在10～100納米之間。
4.按權(quán)利要求1所述的促進(jìn)脂質(zhì)體淋巴吸收和減少正常淋巴結(jié)蓄積的方法，其特征是所述的脂質(zhì)體膜材料包括a、天然大豆卵磷脂、合成的不飽和磷脂和飽和磷脂；b、膽固醇；c、合成的帶有長鏈的甲氧基聚乙二醇基團(tuán)的磷脂類衍生物，其分子量為2000～6000；所述脂質(zhì)體膜材料的摩爾比為a∶b＝5∶1～1∶2，a∶c＝100∶1～100∶10。
5.按權(quán)利要求2的方法，其中所述的空白顆粒性物質(zhì)選自空白脂質(zhì)體、空白納米?；蚩瞻拙酆衔锬z束，粒徑為100納米～300納米。
6.按權(quán)利要求5所述的促進(jìn)脂質(zhì)體淋巴吸收和減少正常淋巴結(jié)蓄積的方法，其特征是所述的空白脂質(zhì)體膜材料包括a、天然大豆卵磷脂、合成的不飽和磷脂和飽和磷脂；b、膽固醇；c、合成的帶有長鏈的甲氧基聚乙二醇基團(tuán)的磷脂類衍生物，其分子量為2000～6000；所述空白脂質(zhì)體膜材料的摩爾比為a∶b＝5∶1～1∶2，a∶c＝100∶1～100∶10。。
7.按權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是所述維持注射部位靜壓力物質(zhì)的空白顆粒性物質(zhì)與脂質(zhì)體的單位體積內(nèi)摩爾比為1∶1～1∶3。
8.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的維持注射部位靜壓力物質(zhì)是高分子物質(zhì)，分子量為0.2萬～100萬。
9.按權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的維持注射部位靜壓力的高分子物質(zhì)是右旋糖酐及其衍生物，殼多糖和脫乙酰殼多糖，海藻酸及其鈉鹽，透明質(zhì)酸及其鈉鹽，聚乙二醇和單甲氧基聚乙二醇，單氨基聚乙二醇和雙氨基聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇單氨。
10.按權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的右旋糖酐及其衍生物是右旋糖酐、DEAE-右旋糖酐、羧甲基右旋糖酐和右旋糖酐硫酸酯。
11.按權(quán)利要求1或權(quán)利要求8的方法，其特征是所述維持注射部位靜壓力的高分子物質(zhì)與脂質(zhì)體的單位體積內(nèi)摩爾比為1∶2～1∶200。
12.按權(quán)利要求1或5所述的方法，其特征是將所述的脂質(zhì)體與空白脂質(zhì)體按單位體積內(nèi)摩爾比為1∶1～3∶1混合，進(jìn)行肌肉注射給藥或皮下注射給藥。
13.按權(quán)利要求1或8所述的方法，其特征是將脂質(zhì)體與高分子物質(zhì)按單位體積內(nèi)摩爾比為2∶1～200∶1混合，進(jìn)行肌肉注射給藥或皮下注射給藥。
14.按權(quán)利要求1所述的促進(jìn)脂質(zhì)體淋巴吸收和減少正常淋巴結(jié)蓄積的方法，其特征在于，采用多聚糖類高分子物質(zhì)飽和巨噬細(xì)胞，減少正常淋巴結(jié)對脂質(zhì)體的蓄積，其包括脂質(zhì)體及其粒徑、膜材料；多聚糖類高分子物質(zhì)及其與脂質(zhì)體的濃度比及其給藥方法。
15.按權(quán)利要求14的方法，其特征是所述脂質(zhì)體粒徑為10納米～100納米。
16.按權(quán)利要求14的方法，其中所述的脂質(zhì)體膜材料包括a、天然大豆卵磷脂、合成的不飽和磷脂和飽和磷脂；b、膽固醇；c、合成的帶有長鏈的甲氧基聚乙二醇基團(tuán)的磷脂類衍生物，分子量范圍2000～6000；所述的脂質(zhì)體膜材料間的摩爾比為a∶b＝5∶1～1∶2，a∶c＝100∶1～100∶10。。
17.按權(quán)利要求14的方法，其中所述的多聚糖類高分子是右旋糖酐及其衍生物、殼多糖及其衍生物。
18.按權(quán)利要求17的方法，其中所述的右旋糖酐及其衍生物是右旋糖酐、DEAE-右旋糖酐、羧甲基右旋糖酐或右旋糖酐硫酸酯，所述的殼多糖衍生物是殼多糖和脫乙酰殼多糖。。
19.按權(quán)利要求14所述的方法，其特征是所述飽和淋巴結(jié)巨噬細(xì)胞所采用的多聚糖類高分子物質(zhì)與脂質(zhì)體的單位體積內(nèi)摩爾比為1∶2～1∶200。
20.按權(quán)利要求14所述的方法，其特征是，將脂質(zhì)體與多糖類高分子按單位體積內(nèi)摩爾比為2∶1～200∶1混合，進(jìn)行肌肉注射給藥或皮下注射給藥。
全文摘要
本發(fā)明屬制藥領(lǐng)域，涉及促進(jìn)局部注射脂質(zhì)體淋巴吸收和減少脂質(zhì)體在注射部位殘留量及減少脂質(zhì)體在正常淋巴結(jié)中蓄積量的方法，本發(fā)明采用“壓力補償”策略，通過大粒徑空白脂質(zhì)體、中性或荷電高分子物質(zhì)以維持注射部位的靜壓力，顯著促進(jìn)脂質(zhì)體淋巴吸收和減少局部殘留量。本發(fā)明還采用“飽和巨噬細(xì)胞”策略，通過中性或荷電高分子物質(zhì)與脂質(zhì)體按一定比例混合后給藥，顯著降低正常淋巴結(jié)對脂質(zhì)體的攝取量，且具有明顯減少巨噬細(xì)胞攝取脂質(zhì)體的作用。
文檔編號A61K47/36GK1682695SQ20051002404
公開日2005年10月19日 申請日期2005年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月24日
發(fā)明者陸偉躍, 張磊, 鐘高仁, 潘弘, 張靜, 潘俊, 劉敏 申請人:復(fù)旦大學(xué), 上海復(fù)康醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司