專利名稱：喹諾里西啶類生物堿在制備抗乙肝病毒藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬中藥制藥領(lǐng)域，涉及喹諾里西啶類生物堿在制備抗乙肝病毒藥物中的新用途。
背景技術(shù)：
乙肝病毒(HBV)感染是全球性的影響人類健康的主要疾病之一，全世界大約有3億多人為慢性HBV攜帶者，我國約占半數(shù)。由于HBV感染可以導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝癌，因此已成為影響人類壽命的九大疾病之一。由于慢性HBV感染者較非攜帶者發(fā)生肝癌的相對危險(xiǎn)率為217，因此在全世界每年大約有200萬人死于乙肝引起的肝硬化和肝癌，而我國又是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，每年約有25萬人死于與乙肝相關(guān)的慢性肝病(肝硬化與肝癌)。這給人民健康和國民經(jīng)濟(jì)帶來巨大損失。因此，尋求高效低毒的抗HBV藥物已成為刻不容緩的問題。
盡管藥物化學(xué)工作者在篩選抗HBV藥物的過程中進(jìn)行了不懈的努力，但到目前為止人們還沒有找到一種特效藥來治愈HBV感染。臨床上已獲得FDA正式批準(zhǔn)使用的α-干擾素和核苷類藥物拉米呋啶只能在某種程度上獲得治療效果，對大多數(shù)病人還達(dá)不到治愈的目的，停止治療后的“反跳”現(xiàn)象是醫(yī)藥工作者最感棘手的問題，所以開發(fā)研制高效、低毒、不“反跳”的抗HBV新藥向藥物化學(xué)工作者提出了挑戰(zhàn)。在篩選抗HBV新藥的過程中，越來越多的藥物化學(xué)工作者把注意力轉(zhuǎn)向了植物來源豐富，價(jià)廉易得，毒副作用小，分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的天然化合物。
中藥山豆根(Radix Sophorae tonkinensis)和苦參(RadixSophorae flavescentis)都是我國歷史悠久的傳統(tǒng)中藥，為豆科(Leguminosae)槐屬(Sophora L.)。從古至今，對其化學(xué)成分、藥理作用和臨床應(yīng)用的研究一直十分活躍。山豆根始載于《開寶本草》，為中醫(yī)喉科要藥，具有瀉火解毒、消腫利咽、止痛殺蟲的功效，主治火毒蘊(yùn)結(jié)、咽喉腫痛、齒齦腫痛等癥?？鄥⑹驾d于我國最早的醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，具有清腸燥濕、祛風(fēng)殺蟲的功效，主治濕熱瀉痢、腸風(fēng)便血、黃疸、小便不利、水腫以及帶下、陰癢、疥癬、麻風(fēng)、皮膚瘙癢、濕毒瘡瘍等癥。已知兩種藥材都含有喹諾里西啶類生物堿、異戊烯基類黃酮和齊墩果烯型三萜等成分，其中喹諾里西啶(quinolizidine)類生物堿是兩種藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。這類生物堿具有抗腫瘤、抗心律失常、抗微生物、抗?jié)?、升白?xì)胞等多方面的藥理作用，另外還呈現(xiàn)出值得重視的抗病毒活性。藥理實(shí)驗(yàn)表明山豆根總堿對咽喉部常見病毒CB，Adv，RSV有抑制作用，最小抑病毒濃度為24.41μg/mL，對流感、副流感病毒也有一定抑制作用。山豆根水煎劑和苦參粗提液在體內(nèi)、外對柯薩奇病毒B(CVB)都有顯著的抗病毒作用。另外氧化苦參堿有保肝降酶以及促進(jìn)肝細(xì)胞再生和修復(fù)的作用，腹腔注射能降低HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟內(nèi)HBsAg和HBeAg的含量，并有抗HBV作用?？鄥A能降低脂多糖/D-氨基半乳糖(LPS/D-GalN)和脂多糖/痤瘡丙酸桿菌(LPS/PA)引起的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性升高及小鼠對LPS/D-GalN和LPS/PA致死毒性敏感性，并抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(PMφ)釋放腫瘤壞死因子(TNF)。目前，臨床上除了廣泛應(yīng)用藥材的單方和復(fù)方制劑外，還出現(xiàn)了采用其總堿和單一生物堿制備的各種新劑型，用于治療肝炎、腦炎等傳染性疾病。如臨床采用苦黃注射液、苦參素注射液(主要含氧化苦參堿)和肝炎靈注射液(山豆根總堿)等治療急性黃疸型肝炎和慢性乙型肝炎均取得良好療效。但至今未見其他喹諾里西啶類生物堿單體對抗HBV的作用及用于治療乙肝的報(bào)導(dǎo)。
綜觀國內(nèi)外的報(bào)導(dǎo)，均未見除苦參堿和氧化苦參堿之外的喹諾里西啶類生物堿的抗HBV藥效及用其制備的抗HBV藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供喹諾里西啶類生物堿在制備治療乙肝藥物中的應(yīng)用。尤其是化合物槐果堿、氧化槐果堿、萊蔓堿或13，14-去氫槐定堿在抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用及其制備方法。
本發(fā)明根據(jù)多年的臨床用藥經(jīng)驗(yàn)和“祛邪扶正”原則，應(yīng)用現(xiàn)代藥理篩選方法，對植物藥中抑制HBV的活性物質(zhì)進(jìn)行研究，從豆科槐屬(Sophora)植物苦參(S.flavescens)和山豆根(S.tonkinensis)中提取喹諾里西啶類生物堿并證實(shí)其抗HBV病毒活性。
本發(fā)明所述的活性生物堿類化合物具有如下式I的化學(xué)結(jié)構(gòu)

其中各取代基及化合物1-11的情況如表1所示表1

本發(fā)明涉及的喹諾里西啶類生物堿包括化合物(+)-槐花醇(1)、(-)-14β-羥基苦參堿(2)、(-)-槐果堿(3)、(-)-5α-羥基槐果堿(4)、(+)-別苦參堿(5)、(-)-9α-羥基苦參堿(6)、(+)-氧化槐果堿(7)、(+)-萊蔓堿(8)、(-)-13，14-去氫槐定堿(9)、(-)-9α-羥基槐果堿(10)和(+)-12α-羥基槐果堿(11)。
本發(fā)明的化合物通過下述方法制備
所述山豆根為豆科槐屬植物越南槐Sophora tonkinensisGapnep.的干燥根及根莖，主產(chǎn)于廣西、貴州、云南、廣東、江西等地，藥用根和根莖，其味苦、性寒、有毒，具有清熱解毒、消腫利咽的功效。取山豆根粗粉9kg，用1％硫酸(v/v)室溫冷浸(15L×4次)至酸水液不呈生物堿反應(yīng)，合并酸水提取液，經(jīng)Na2CO3堿化至pH10~11后以氯仿等體積多次萃取完全，減壓回收氯仿得總提取物135g，再經(jīng)酸-堿法如上處理凈化總堿得浸膏120g(提取率1.33％)?？倝A浸膏120g干法上樣進(jìn)行硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯-乙醇-氨水梯度洗脫，所得流分以不同洗脫劑進(jìn)行反復(fù)硅膠柱層析，分離得到(+)-苦參堿、(+)-氧化苦參堿、(+)-槐花醇(1)、(-)-14β-羥基苦參堿(2)、(-)-槐果堿(3)和(-)-5α-羥基槐果堿(4)。
其中，(+)-槐花醇((+)-sophoranol)(1)C15H24N2O2(264)，白色方晶(乙酸乙酯)，m.p.157-158℃，[α]24D+55.3°(c0.10，MeOH)。UV(MeOH)λmax(logε)nm207(3.97)；IR(KBr)νmaxcm-13233，2936，2866，2809，2763，1630，1462，1441，1418，1333，1293，1257，1116，1087，1031；1H-NMR(CDCl3，400MHz)δppm4.33(1H，br d，J＝13.4 Hz，H-17α)，3.80(1H，m，H-11)，3.23(1H，d，J＝3.4Hz，H-17β)，2.88(1H，dt，J＝11.3，1.8Hz，H-10β)，2.76(1H，br d，J＝11.5Hz，H-2β)，2.63(1H，br s)，2.43(1H，ddt，J＝17.2，8.4Hz，H-14β)，2.28(1H，ddd，J＝17.2Hz，H-14α)，1.80～2.13(8H，m)，1.30～1.67(8H，m)；13C-NMR(CDCl3，100MHz)δppm(表2)；EI-MS m/z(％)264([M]+，59)，248(12)，247(100)，245(45)，235(6)，222(12)，221(29)，208(5)，193(12)，178(3)，166(16)，153(6)，152(10)，148(12)，125(6)，112(30)，96(36)，55(20)，41(18)。
其中，(-)-14β-羥基苦參堿((-)-14β-hydroxymatrine)(2)C15H24N2O2(264)，淡黃色油狀物，[α]27D-7.8°(0.66，MeOH)。UV(MeOH)λmax(logε)nm207(3.94)；IR(CH2Cl2)νmaxcm-13441，2934，2858，2807，2767，1634，1445，1336，1284，1281，1110，1069；1H-NMR(CDCl3，400MHz)δppm4.26(1H，dd，J＝12.8，4.0Hz，H-17α)，3.92(1H，dd，J＝11.5，5.1Hz，H-14α)，3.81(1H，m，H-11)，3.15(1H，t，J＝12.8Hz，H-17β)，2.83(1H，dm，J＝13.1Hz，H-10β)，2.79(1H，dm，J＝13.1Hz，H-2β)，2.17～2.25(2H，m)，2.07(1H，br s)，1.88～2.00(3H，m)，1.50～1.72(6H，m)，1.26～1.46(6H，m)；13C-NMR(CDCl3，75MHz)δppm(表2)；EI-MSm/z(％)265(19)，264([M]+，100)，263(72)，247(3)，246(4)，235(13)，222(48)，221(55)，218(30)，193(57)，192(26)，178(20)，177(19)，162(10)，150(29)，149(15)，148(17)，137(14)，136(21)，122(12)，109(8)，98(12)，96(33)，80(8)，55(9)，41(11)；ESI-MS m/z265.2([M+H]+)，287.2([M+Na]+)。
其中，(-)-槐果堿((-)-sophocarpine)(3)C15H22N2O(246)，白色針晶(石油醚)，m.p.53-54℃，[α]24D-16.0°(c0.10，MeOH)。UV(MeOH)λmax(logε)nm260(3.40)，207(4.02)；IR(KBr)νmaxcm-13444，3304，2944，2925，2860，2805，2778，1660，1595，1436，1335，1124，1095，822；1H-NMR(CDCl3，400MHz)δppm6.45(1H，ddd，J＝9.8，5.0，3.8Hz，H-13)，5.89(1H，dt，J＝9.8，2.2Hz，H-14)，4.14(1H，dd，J＝12.9，4.7Hz，H-17α)，3.98(1H，dd，J＝16.9，9.6Hz，H-11)，3.17(1H，t，J＝12.9Hz，H-17β)，2.81(2H，m，H-2β，10β)，2.60(1H，m，H-6)，2.20(1H，m)，2.10(1H，br s)，1.36～2.00(12H，m)；13C-NMR(CDCl3，100MHz)δppm(表2)；EI-MS m/z(％)247(13)，246([M]+，73)，245(100)，217(8)，203(18)，177(16)，160(7)，159(7)，150(28)，149(7)，148(10)，138(27)，137(10)，136(16)，134(7)，122(11)，110(8)，109(6)，98(11)，96(32)，80(7)，68(13)，41(15)；ESI-MS m/z247.3([M+H]+)，269.2([M+Na]+)。
其中，(-)-5α-羥基槐果堿((-)-5α-hydroxysophocarpine)(4)C15H22N2O2(262)，白色細(xì)針晶(乙醚-正己烷)，m.p.178-180℃，[α]20D-19.7°(c 0.10，MeOH)。UV(MeOH)λmax(logε)nm259(3.49)，207(4.08)；IR(KBr)νmaxcm-13218，2939，2919，2869，2810，2764，1666，1612，1422，1294，1116，1091，1045，830；1H-NMR(CDCl3，300MHz)δppm6.49(1H，ddd，J＝9.8，4.8，3.9Hz，H-13)，5.92(1H，dt，J＝9.8，1.9Hz，H-14)，4.15(1H，br d，J＝13.7Hz，H-17α)，3.97(1H，dd，J＝18.1，8.3Hz，H-11)，3.34(1H，d，J＝13.7Hz，H-17β)，2.87(1H，brd，J＝11.4Hz，H-10β)，2.76(1H，br d，J＝11.4Hz，H-2β)，2.63(1H，dt，J＝18.3，5.1Hz，H-12α)，2.46(1H，br s)，2.27(2H，m)，1.99(1H，m)，1.89(1H，br s)，1.85(2H，m)，1.60(5H，m)，1.43(2H，m)；13C-NMR(CDCl3，75MHz)δppm(表2)；EI-MS m/z(％)263(16)，262([M]+，100)，261(83)，245(61)，244(21)，243(31)，233(2)，219(15)，217(2)，203(2)，193(22)，166(17)，153(9)，152(14)，150(9)，136(23)，125(5)，124(23)，122(11)，112(14)，110(34)，109(22)，97(20)，96(89)，82(17)，68(26)，55(15)，41(32)；ESI-MS m/z263.1([M+H]+)，285.2([M+Na]+)。
苦參為豆科槐屬植物苦參Sophora flavescens Ait.的干燥根，全國各地均產(chǎn)，藥用根，其味苦、性寒，具有清熱燥濕、殺蟲利尿的功效。取苦參粗粉14kg，用1％硫酸(v/v)室溫冷浸(24L×4次)至酸水液不呈生物堿反應(yīng)，合并酸水提取液，經(jīng)Na2CO3堿化至pH10～11后以氯仿等體積多次萃取完全，減壓回收氯仿得總提取物280g，再經(jīng)酸-堿法如上處理凈化總堿得浸膏250g(提取率1.8％)。總堿浸膏240g用少量氯仿(約200mL)溶解，加入10倍量體積的乙醚(2L)，輕輕搖晃2min，靜置后析出淡黃色的顆粒狀結(jié)晶。抽濾，濾液濃縮后再如上反復(fù)操作4次，合并粗晶(A)共70g，濾液濃縮得浸膏(B)165g。取粗晶(A)1.2g，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-氨水(10∶2∶1∶0.1)進(jìn)行硅膠柱層析，得(+)-氧化苦參堿和(+)-氧化槐果堿(7)。將浸膏(B)150g干法上樣進(jìn)行硅膠柱層析，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-氨水梯度洗脫，所得流分以不同的洗脫劑進(jìn)行反復(fù)的硅膠柱層析和薄層色譜制備，分離得到(-)-槐果堿(3)、(+)-別苦參堿(5)、(-)-9α-羥基苦參堿(6)、(+)-萊蔓堿(8)、(-)-13，1 4-去氫槐定堿(9)、(-)-9α-羥基槐果堿(10)和(+)-12α-羥基槐果堿(11)。
其中，(+)-別苦參堿((+)-allomatrine)(5)C15H24N2O(248)，白色針簇晶(正己烷)，m.p.102-104℃，[α]24D+73.5°(c0.10，MeOH)。UV(MeOH)λmax(logε)nm207(3.93)；IR(KBr)νmaxcm-13436，3255，2931，2881，2851，2805，2751，1632，1439，1418，1354，1307，1240，1163，1118，1073，1019；1H-NMR(CDCl3，500MHz)δppm4.72(1H，dd，J＝12.5，3.8Hz，H-17α)，3.02(1H，dt，J＝9.6，5.4Hz，H-11)，2.90(1H，br d，J＝13.3Hz，H-10β)，2.87(1H，br d，J＝13.7Hz，H-2β)，2.44(1H，br d，J＝17.2Hz，H-14β)，2.29(1H，ddd，J＝17.2，5.8，5.7Hz，H-14α)，2.18(1H，t，J＝12.5Hz，H-17β)，1.96～2.10(3H，m)，1.83～1.89(2H，m)，1.68～1.74(5H，m)，1.60(1H，m)，1.49(2H，m)，1.39(1H，t，J＝9.5Hz)，1.31(1H，m)，0.88～1.00(2H，m)；13C-NMR(CDCl3，125MHz)δppm(表2)；EI-MS m/z(％)249(8)，248([M]+，51)，247(100)，219(2)，205(4)，192(1)，177(37)，162(3)，150(28)，149(10)，148(9)，137(5)，136(15)，122(5)，109(2)，98(3)，96(7)，55(5)，41(4)。
其中，(-)-9α-羥基苦參堿((-)-9α-hydroxymatrine)(6)C15H24N2O2(264)，白色細(xì)針晶(石油醚-丙酮)，m.p.158-159℃，[α]24D+62.0°(c 0.10，MeOH)。UV(MeOH)λmax(logε)nm206(3.96)；IR(KBr)νmaxcm-13251，2936，2890，2849，2811，2762，1605，1484，1441，1341，1286，1134，1068；1H-NMR(CDCl3，400MHz)δppm4.39(1H，dd，J＝12.8，4.3Hz，H-17α)，3.84(1H，m，H-9β)，3.65(1H，m，H-11)，3.05(1H，m，H-10β)，2.98(1H，t，J＝12.8Hz，H-17β)，2.83(1H，br d，J＝10.7Hz，H-2β)，2.43(1H，br dt，J＝17.2，4.4Hz，H-14β)，2.25(1H，m，H-14α)，2.16(2H，m)，2.07(2H，m)，1.42～1.85(10H，m)，1.30(1H，dt，J＝12.4，4.7Hz)；13C-NMR(CDCl3，100MHz)δppm(表2)；EI-MS m/z(％)264([M]+，100)，263(67)，247(16)，246(5)，235(9)，222(10)，221(13)，219(21)，208(15)，205(84)，193(19)，178(8)，166(35)，164(22)，153(10)，152(10)，114(11)，112(18)，98(9)，96(43)，55(28)，41(24)。
其中，(+)-氧化槐果堿((+)-oxysophocarpine)(7)C15H22N2O2(262)，白色棱晶(丙酮)，m.p.202-204℃，[α]24D+61.5°(c0.10,MeOH)。UV(MeOH)λmax(logε)nm257(3.34)，207(3.91)；IR(KBr)νmaxcm-13526，3386，3052，2966，2934，2906，2871，2192，1656，1596，1424，1321，942，823；1H-NMR(CDCl3，400MHz)δppm6.47(1H，ddd，J＝9.7，6.0，3.0Hz，H-13)，5.91(1H，dt，J＝9.7，1.2Hz，H-14)，5.09(1H，dt，J＝10.6，6.2Hz，H-11)，4.18(1H，t，J＝12.3Hz，H-17β)，4.07(1H，dd，J＝12.3，5.9Hz，H-17α)，3.07～3.26(5H，m，H-2α，2β，6，10α，10β)，2.60～2.81(3H，m)，2.10(1H，m)，1.96(2H，m)，1.50～1.86(6H，m)；13C-NMR(CDCl3，100MHz)δppm(表2)；EI-MS m/z(％)262([M]+，2)，261(2)，246(51)，245(100)，243(28)，221(29)，217(6)，203(15)，177(15)，150(28)，148(19)，138(29)，137(10)，136(27)，122(16)，109(9)，98(12)，96(44)，41(33)。
其中，(+)-萊蔓堿((+)-lehmannine)(8)C15H22N2O(246)，白色針簇晶(石油醚)，m.p.93-94℃，[α]24D+87.0°(c 0.10，MeOH)。UV(MeOH)λmax(logε)nm206(3.84)；IR(KBr)νmaxcm-13536，3414，3255，3047，2934，2887，2864，2800，2767，2738，1641，1472，1440，1332，1281，1127，1087，701；1H-NMR(CDCl3，400MHz)δppm5.87(1H，dm，J＝10.5Hz，H-12)，5.77(1H，dm，J＝10.5Hz，H-13)，4.48(1H，dd，J＝10.5，4.2Hz，H-11)，4.45(1H，dd，J＝12.5，4.4Hz，H-17α)，3.12(1H，t，J＝12.5Hz，H-17β)，2.94(2H，m，H-14α，14β)，2.79～2.87(2H，m，H-2β，10β)，2.13(1H，br s，H-10α)，1.94～2.03(3H，m)，1.69～1.78(4H，m)，1.35～1.60(5H，m)；13C-NMR(CDCl3，75MHz)δppm(表2)；EI-MS m/z(％)247(16)，246([M]+，100)，245(70)，218(5)，217(11)，204(19)，203(53)，177(5)，160(11)，159(13)，150(22)，148(12)，137(10)，136(17)，122(12)，109(5)，98(9)，96(31)，80(13)，67(12)，41(16)；ESI-MSm/z247.3([M+H]+)，269.2([M+Na]+)。
其中，(-)-13，14-去氫槐定堿((-)-13，14-dehydrosophoridine)(9)C15H22N2O(246)，白色片晶(石油醚)，m.p.83-84℃，[α]24D-39.0°(c 0.10，MeOH)。UV(MeOH)λmax(logε)nm256(3.18)，206(3.78)；IR(KBr)νmaxcm-13452，3244，3047，2961，2928，2879，2860，2820，2756，1660，1594，1448，1125，1111，824；1H-NMR(CDCl3，500MHz)δppm6.44(1H，dt，J＝9.7，4.8Hz，H-13)，5.94(1H，d，J＝9.7Hz，H-14)，3.74(1H，dd，J＝12.3，4.7Hz，H-17β)，3.57(1H，dd，J＝16.4，9.8Hz，H-11)，3.18(1H，t，J＝12.3Hz，H-17α)，2.88(1H，br d，J＝11.9Hz，H-2β)，2.79(1H，m，H-10β)，2.55(1H，dt，J＝17.7，5.7Hz，H-6)，2.19(4H，m)，2.06(1H，t，J＝9.8Hz)，1.99(1H，m)，1.85(3H，m)，1.70(1H，m)，1.48～1.61(4H，m)，1.12(1H，m)；1H-NMR(C6D6，500MHz)δppm6.10(1H，d，J＝9.8Hz，H-14)，5.84(1H，ddd，J＝9.8，4.8，3.7Hz，H-13)，3.74(1H，dd，J＝13.0，5.3Hz，H-17β)，3.29(1H，dd，J＝13.0，11.7Hz，H-17α)，3.09(1H，dt，J＝9.9，6.5Hz，H-11)，2.62(1H，dt，J＝11.4，2.0Hz)，2.50(1H，m)，1.90(3H，m)，1.71(1H，t，J＝10.3Hz)，1.64(1H，m)，1.42～1.57(5H，m)，1.25(3H，m)，0.99(1H，m)，0.82(1H，m)；13C-NMR(CDCl3，125MHz)δppm(表2)；EI-MS m/z(％)247(13)，246([M]+，78)，245(100)，217(7)，203(12)，178(13)，177(95)，160(7)，150(41)，148(12)，138(18)，137(8)，136(21)，122(12)，110(7)，109(5)，98(7)，96(44)，80(6)，68(13)，55(5)，41(12)。
其中，(-)-9α-羥基槐果堿((-)-9α-hydroxysophocarpine)(10)C15H22N2O2(262)，白色細(xì)針晶(丙酮)，m.p.120-121℃，[α]24D-48.3°(c 0.10，MeOH)。UV(MeOH)λmax(logε)nm259(3.40)，207(4.02)；IR(KBr)νmaxcm-13251，2932，2882，2844，2810，2767，1659，1588，1473，1433，1299，1275，1133，1073，1056，822；1H-NMR(CDCl3，400MHz)δppm6.47(1H，dt，J＝9.8Hz，H-13)，5.90(1H，d，J＝9.8Hz，H-14)，4.14(1H，dd，J＝13.0，4.5Hz，H-17α)，3.83(2H，m，H-9β，11)，3.10(1H，t，J＝13.0Hz，H-17β)，3.05(1H，br d，H-10β)，2.84(1H，br d，H-2β)，2.67(1H，dt，J＝18.0，5.2Hz，H-12α)，2.26(1H，m)，1.69～2.13(8H，m)，1.44～1.57(2H，m)，1.34(1H，m)；13C-NMR(CDCl3，125MHz)δppm(表2)；EI-MS m/s(％)262([M]+，77)，261(100)，245(12)，233(5)，219(6)，217(10)，203(25)，193(19)，166(30)，154(19)，153(6)，152(11)，136(15)，122(9)，114(6)，112(14)，110(18)，109(8)，98(3)，96(37)，92(2)，68(23)，41(24)。
其中，(+)-12α-羥基槐果堿((+)-12α-hydroxysophocarpine)(11)C15H22N2O2(262)，白色片晶(丙酮-石油醚)，m.p.90-92℃，[α]24D+137.3°(c0.10，MeOH)。UV(MeOH)λmax(logε)nm258(3.37)，206(3.86)；IR(KBr)νmaxcm-13419，3311，2931，2891，2870，2833，2811，2783，1665，1598，1446，1354，1340，1295，1097，1057，823；1H-NMR(CDC13，500MHz)δppm6.74(1H，dd，J＝9.6，6.0Hz，H-13)，5.99(1H，d，J＝9.6 Hz，H-14)，4.17(1H，m，H-12β)，3.98(1H，dd，J＝13.2，4.6Hz，H-17α)，3.73(1H，br d，J＝10.4Hz，H-11)，3.22(1H，t，J＝13.2Hz，H-17β)，2.84(1H，br d，J＝10.8Hz，H-2β)，2.80(1H，br d，J＝10.9Hz，H-10β)，2.29(1H，br d，J＝11.0Hz，H-7)，2.13(1H，br s，H-6)，1.94～2.00(3H，m，H-2α，8β，10α)，1.78(3H，m，H-3β，5，9β)，1.62(3H，m，H-4α，4β，8α)，1.48(2H，m，H-3α，9α)；13C-NMR(CDCl3，125MHz)δppm(表2)；EI-MS m/z(％)262([M]+，1)，261(2)，246(20)，245(100)，244(8)，243(3)，215(1)，177(4)，160(1)，150(5)，149(2)，148(4)，138(2)，137(1)，136(5)，134(2)，122(3)，109(1)，98(1)，96(9)，94(2)，84(2)，80(2)，68(3)，55(3)，41(4)；HRESIMS m/z263.1761([M+H]+，calcd for C15H23N2O2，263.1760)。晶體數(shù)據(jù)分子式為C15H24N2O3，分子量280.36。供試晶體呈白色透明板塊狀結(jié)晶，衍射實(shí)驗(yàn)用晶體大小為0.15×0.10×0.04mm，屬斜方晶系，空間群為P212121。晶胞參數(shù)α＝7.936(3)_，α＝90°，b＝12.128(4)_，β＝90°，c＝14.834(5)_，γ＝90°，晶胞體積V＝1427.7(8)_3，晶胞內(nèi)分子數(shù)Z＝4，計(jì)算密度Dx＝1.304mg/m3。MoKα(λ＝0.71073_)，F(xiàn)(000)＝608，T＝298(2)K。
表2是化合物1-11的碳譜(13C-NMR)數(shù)據(jù)(δin ppm)。
表2

*in CDCl3，100MHz#in CDCl3，125MHz_in CDCl3，75MHz本發(fā)明所述的喹諾里西啶類生物堿經(jīng)藥理試驗(yàn)，結(jié)果證明具有顯著的抗HBV作用，且有效濃度低，細(xì)胞毒性較小(表3)。所測生物堿對HBsAg和HBeAg均顯示一定的抑制作用，且對HBsAg的作用高于HBeAg。其中槐花醇、槐果堿、氧化槐果堿、萊蔓堿、9α-羥基苦參堿、13，14-去氫槐定堿和12α-羥基槐果堿在0.2μmol/mL時(shí)對HBsAg的抑制率高于陽性對照拉米呋啶(1.0μmol/mL時(shí)抑制率為29.6％)，其中槐果堿、萊蔓堿、13，14-去氫槐定堿抑制作用較明顯，在0.2μmol/mL時(shí)抑制率均大于50％?；惫麎A在0.2μmol/mL時(shí)對HBeAg亦有一定的抑制作用，抑制率為34.6％，和拉米呋啶相當(dāng)(1.0μmol/mL時(shí)為35.4％)。另外，槐果堿、氧化槐果堿、萊蔓堿和13，14-去氫槐定堿對HBsAg和HBeAg的抑制率均較目前臨床用于治療乙肝疾病的藥物苦參堿和氧化苦參堿的相應(yīng)抑制率高。
本發(fā)明所述的化合物喹諾里西啶類生物堿，可進(jìn)一步作為活性成分，制成治療乙肝疾病的藥物。


圖1是山豆根生物堿部位提取分離流程圖。
圖2是苦參生物堿部位提取分離流程圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 制備山豆根生物堿山豆根粗粉9kg，用1％硫酸(v/v)室溫冷浸(15L×4次)至酸水液不呈生物堿反應(yīng)，合并酸水提取液，經(jīng)Na2CO3堿化至pH10～11后以氯仿等體積多次萃取完全，減壓回收氯仿得總提取物135g，再經(jīng)酸-堿法如上處理凈化總堿得浸膏120g(提取率1.33％)?？倝A浸膏120g干法上樣進(jìn)行硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯-乙醇-氨水梯度洗脫，所得流分以不同洗脫劑進(jìn)行反復(fù)硅膠柱層析，分離得到化合物1-4。
實(shí)施例2制備苦參生物堿苦參粗粉14kg，用1％硫酸(v/v)室溫冷浸(24L×4次)至酸水液不呈生物堿反應(yīng)，合并酸水提取液，經(jīng)Na2CO3堿化至pH10～11后以氯仿等體積多次萃取完全，減壓回收氯仿得總提取物280g，再經(jīng)酸-堿法如上處理凈化總堿得浸膏250g(提取率1.8％)?？倝A浸膏240g用少量氯仿(約200mL)溶解，加入10倍量體積的乙醚(2L)，輕輕搖晃2min，靜置后析出淡黃色的顆粒狀結(jié)晶。抽濾，濾液濃縮后再如上反復(fù)操作4次，合并粗晶(A)共70g，濾液濃縮得浸膏(B)165g。取粗晶(A)1.2g，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-氨水(10∶2∶1∶0.1)進(jìn)行硅膠柱層析，得到化合物7。將浸膏(B)150g干法上樣進(jìn)行硅膠柱層析，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-氨水梯度洗脫，所得流分以不同的洗脫劑進(jìn)行反復(fù)的硅膠柱層析和薄層色譜制備，分離得到化合物3，5，6，8-11。
實(shí)施例3 體外抗HBV試驗(yàn)應(yīng)用Hep G2的2.2.15細(xì)胞株(教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海)，以每孔10×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔板，培養(yǎng)基為DMEM，生長液含10％胎牛血清，380μg/ml G418，0.03％谷胺酰胺，青霉素、鏈霉素各100μg/ml，在5％CO2孵箱中37℃培養(yǎng)，48小時(shí)后，換成二甲基亞砜助溶的含藥物的培養(yǎng)液，每種藥物設(shè)3～5個(gè)濃度，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)9天(每3天換液一次)，收集上清液用ELISA檢測HBsAg及HBeAg含量。同樣條件下以不含藥物的培養(yǎng)液上清液作為對照組。同時(shí)用上述細(xì)胞株，用MTT法測定藥物的細(xì)胞毒性。陽性對照為拉米呋啶(3TC)、苦參堿和氧化苦參堿。結(jié)果證實(shí)本發(fā)明化合物具有顯著的抗HBV作用，且有效濃度低，細(xì)胞毒性較小。
表3是喹諾里西啶類生物堿對HepG2 2.2.15細(xì)胞的毒性情況及對HBsAg和HBeAg的抑制效果。
表3

(續(xù)表3)


(續(xù)表3)


-“未見明顯毒性”系指用MTT法檢測細(xì)胞存活率≥75％；+“顯示毒性”指細(xì)胞存活率＜75％。
權(quán)利要求
1.喹諾里西啶類生物堿在制備抗乙肝病毒藥物中的用途。
2.按權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的喹諾里西啶類生物堿具有式I的化學(xué)結(jié)構(gòu)
其中各取代基及化合物1-11如表1，表1
3.按權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的喹諾里西啶類生物堿是化合物槐果堿。
4.按權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的喹諾里西啶類生物堿是化合物氧化槐果堿。
5.按權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的喹諾里西啶類生物堿是化合物萊蔓堿。
6.按權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的喹諾里西啶類生物堿是化合物13，14-去氫槐定堿。
全文摘要
本發(fā)明屬中藥制藥領(lǐng)域，涉及喹諾里西啶類生物堿在制備抗乙肝病毒藥物中的新用途。本發(fā)明從豆科槐屬(Sophora)植物苦參(S.flavescens)和山豆根(S.tonkinensis)中提取喹諾里西啶類生物堿并證實(shí)其抗HBV病毒活性。所述的喹諾里西啶類生物堿經(jīng)與陽性對照拉米呋啶和目前臨床用于治療乙肝疾病的藥物苦參堿和氧化苦參堿藥理試驗(yàn)比較，結(jié)果證實(shí)具有顯著的抗HBV作用，且有效濃度低，細(xì)胞毒性較小，本發(fā)明所述的化合物喹諾里西啶類生物堿，可進(jìn)一步作為活性成分，制成新型治療乙肝疾病的藥物。
文檔編號(hào)A61K31/4375GK1698606SQ20051002657
公開日2005年11月23日 申請日期2005年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月8日
發(fā)明者陳道峰, 丁佩蘭, 周佩, 黃海 申請人:復(fù)旦大學(xué)