專(zhuān)利名稱(chēng)：一種hpv多肽疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，特別地，涉及一種宮頸癌治療性疫苗——HPV多肽疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
宮頸癌的發(fā)生率為婦科惡性腫瘤之首，死亡率居?jì)D科惡性腫瘤第二位。即使對(duì)低危型的早期病例經(jīng)理想的初次治療后，仍有15％的復(fù)發(fā)率，而對(duì)那些復(fù)發(fā)病例的治療效果相對(duì)較差，因此，醫(yī)學(xué)界一直在尋求新的治療手段。
以免疫治療為代表的生物治療已成為腫瘤治療的第四模式。婦科惡性腫瘤常規(guī)療法即手術(shù)、放療和化療均是通過(guò)外源手段殺傷腫瘤，對(duì)晚期患者的痊愈難以奏效，且常有明顯的損傷和毒副作用。而腫瘤疫苗通過(guò)提高機(jī)體免疫識(shí)別能力或提高腫瘤抗原的免疫原性和免疫介導(dǎo)的腫瘤殺傷能力，可打破患者的免疫耐受和免疫抑制狀態(tài)，以內(nèi)源途徑達(dá)到治療或預(yù)防的目的。
大量流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)宮頸癌與HPV(人乳頭狀瘤病毒)感染密切相關(guān)，并以HPV16最為常見(jiàn)，占50％。因此，HPV16成為宮頸癌疫苗的主要靶標(biāo)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)宿主的免疫應(yīng)答在HPV相關(guān)的宮頸疾病發(fā)生中有重要作用，為發(fā)展針對(duì)HPV的免疫治療提供了急迫性和合理性。HPVE6和E7持續(xù)表達(dá)于宮頸癌細(xì)胞，具有免疫原性，是免疫治療理想的靶抗原。HPV16 E6和E7原癌蛋白在細(xì)胞內(nèi)降解，其產(chǎn)物多肽能誘發(fā)強(qiáng)大的抗腫瘤免疫應(yīng)答，這些激勵(lì)了基于多肽疫苗的發(fā)展并用以治療晚期宮頸癌患者，成為疫苗治療腫瘤的典范。研究和開(kāi)發(fā)HPV的預(yù)防性和治療性疫苗，有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種宮頸癌治療性疫苗——HPV多肽疫苗及其制備方法。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種HPV多肽疫苗，它主要由1份HPV16E711-20，1份HPV16E786-93，1份破傷風(fēng)類(lèi)毒素tt830-843和1～4份的不完全佐劑IFA組成。
一種HPV多肽疫苗的制備方法，包括以下步驟(1)多肽合成由多功能多肽合成儀分別一次合成HPV16E711-20、HPV16E786-93和破傷風(fēng)類(lèi)毒素tt830-843；(2)疫苗制備將1份HPV16E711-20、1份HPV16E786-93、1份破傷風(fēng)類(lèi)毒素tt830-843和1～4份的不完全佐劑IFA制成疫苗。
本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下技術(shù)效果(1)本發(fā)明的多肽疫苗能刺激人免疫重建荷人HPV16陽(yáng)性宮頸癌SCID小鼠體內(nèi)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并在一定程度上能減輕免疫抑制狀態(tài)。
(2)本發(fā)明的疫苗制備方法操作簡(jiǎn)單，可以在注射前臨時(shí)制備。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。其中，HPV16E711-20表示人乳頭瘤病毒16型E7蛋白的11-20肽段，tt830-843表示破傷風(fēng)類(lèi)毒素的830-843肽段，IFA是弗式不完全佐劑。PBS是磷酸鹽緩沖液，hu-PBL是人外周血淋巴細(xì)胞，SiHa細(xì)胞是人宮頸癌HPV16陽(yáng)性細(xì)胞系，均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)特征。
實(shí)施例11.多肽合成HPV16E711-20序列為YMLDLQPETT，用P1表示；HPV16E786-93序列為T(mén)LGIVCPI，用P2表示；P1、P2代表了2個(gè)CTL免疫表位。tt830-843序列為QYIKANSKFIGITE，用T表示。P1、P2、RP、T分別由多功能多肽合成儀一次合成，純度均大于95％。
2.疫苗制備臨用前配制，多肽治療組疫苗組成為P1(50μg)+P2(50μg)+T(50μg)+IFA(50μg)。
實(shí)施例21.多肽合成與實(shí)施例1相同。
2.疫苗制備臨用前配制，多肽治療組疫苗組成為P1(50μg)+P2(50μg)+T(50μg)+IFA(100μg)。
實(shí)施例31.多肽合成與實(shí)施例1相同。
2.疫苗制備臨用前配制，多肽治療組疫苗組成為P1(50μg)+P2(50μg)+T(50μg)+IFA(200μg)。
用本發(fā)明的宮頸癌治療性疫苗——HPV多肽疫苗接種人免疫重建荷人HPV16陽(yáng)性宮頸癌SCID鼠模型，觀察其對(duì)人免疫重建荷SiHa細(xì)胞SCID鼠免疫功能的影響1.實(shí)驗(yàn)分組無(wú)免疫滲漏SCID鼠30只，隨機(jī)分為4組。第一組6只，每只腹腔注射0.5ml細(xì)胞密度為8×107hu-PBL/ml的PBS，疫苗成份僅為IFA，作為空白組；第二組8只，每只腹腔注射0.5ml細(xì)胞密度為8×107hu-PBL/ml的PBS，24小時(shí)后每只皮下接種左右腋窩和背部，共3點(diǎn)，每點(diǎn)接種0.2ml細(xì)胞密度為5×107SiHa細(xì)胞/ml的PBS，疫苗成份為RP+T+IFA，作為隨機(jī)多肽組，其中，RP表示HPV16E712-20，序列為MLDLQPETT，；第三組8只，每只腹腔注射0.5ml細(xì)胞密度為8×107hu-PBL/ml的PBS，進(jìn)行免疫重建，24小時(shí)后皮下接種SiHa細(xì)胞，方法同第二組，疫苗成份為T(mén)+IFA，作為T(mén)輔助多肽組；第四組8只，每只腹腔注射0.5ml細(xì)胞密度為8×107hu-PBL/ml的PBS，進(jìn)行免疫重建，24小時(shí)后皮下接種SiHa細(xì)胞，方法同第二組，疫苗成份為作P1+P2+T+IFA，作為多肽治療組。
2.疫苗制備臨用前配制，多肽治療組疫苗組成為P1(50μg)+P2(50μg)+T(50μg)+IFA，隨機(jī)多肽組為RP(50μg)+T(50μg)+IFA，T輔助多肽組為T(mén)(50μg)+IFA，空白組為IFA。
3.接種疫苗當(dāng)腫瘤體積約為100mm3時(shí)，三次于背部皮下接種疫苗，每次接種間隔二周。當(dāng)腫瘤體積約為1000mm3時(shí)處死SCID鼠，第二、三、四組分別隨機(jī)留3只觀察自然生存時(shí)間。
4.生物學(xué)特性觀察荷瘤鼠一般特征觀察每天觀察精神狀態(tài)、活動(dòng)力、反應(yīng)、飲食、體重、毛色、毛順滑度及背部和腹部瘤組織的生長(zhǎng)情況。大體檢查荷瘤第105天處死SCID鼠解剖，觀察移植瘤形態(tài)、直徑、質(zhì)地、活動(dòng)度及臟器轉(zhuǎn)移等情況。組織學(xué)觀察移植瘤及肝、脾、肺、腎、子宮、附件、大網(wǎng)膜等各臟器經(jīng)10％福爾馬林固定，石蠟包埋、切片、HE染色、鏡檢。
5.免疫學(xué)特性檢測(cè)
5.1鼠血漿人IgG測(cè)定各組每2周斷尾取血100μl，采血6次連同第105天處死共7次，采用磁酶免法測(cè)定人IgG含量。
5.2流式細(xì)胞測(cè)定CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞眼球取血的SCID鼠的外周血，淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離后的淋巴細(xì)胞，用流式細(xì)胞試劑盒檢測(cè)CD3、CD4、CD8陽(yáng)性T細(xì)胞數(shù)。
5.3脾重處死后各組小鼠解剖取脾稱(chēng)重。
5.4免疫組化檢測(cè)脾和腫瘤組織中人CD8+T細(xì)胞取各組鼠脾臟和皮下移植瘤組織，以SP免疫組化染色檢測(cè)人CD8+T細(xì)胞。
5.5脾細(xì)胞毒殺傷功能(CTL)測(cè)定用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法。將培養(yǎng)24-48小時(shí)的K562細(xì)胞(1×104/孔)置于96孔板內(nèi)；每組中檢測(cè)免疫學(xué)指標(biāo)的小鼠，在第105天摘眼球處死取脾，制成脾單細(xì)胞懸液，按效靶比例(E∶T)50∶1，100∶1加樣于96孔板中，每份標(biāo)本設(shè)2復(fù)孔，設(shè)自然釋放對(duì)照(加入PBS100μl)及最大釋放對(duì)照(加入1％NP-40100μl)，37℃，5％CO2孵育4小時(shí)，吸取上清100μl，加入另一培養(yǎng)板中，37℃預(yù)溫10min，每孔加入新鮮配制的底物溶液(NBT 4mg，NAD+10mg，PMS1mg，加蒸餾水2ml溶解，混勻后取上液1.6ml加1mol/l乳酸鈉0.4ml，然后加入0.1mol/lpH7.4的磷酸緩沖液至10ml)0.1ml，室溫避光15min，每孔加入1mol/L檸檬酸30l終止。490nm波長(zhǎng)下讀取各孔吸光度(A)值。CTL的殺傷活性按下列公式計(jì)算殺傷活性(％)＝(實(shí)驗(yàn)孔A值-自然釋放孔A值)/(最大釋放孔A值-自然釋放孔A值)×100％。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下1.荷瘤鼠一般特征荷瘤鼠開(kāi)始時(shí)腫瘤生長(zhǎng)緩慢，50天后才迅速生長(zhǎng)，各組生長(zhǎng)速度無(wú)顯著差異。多肽治療組生存期(140.00±34.64天)顯著長(zhǎng)于隨機(jī)多肽組(107.67±17.79天)和T輔助多肽組(72.33±11.37)(X2＝6.31，p＝0.043)。
大體檢查原位移植瘤球狀、質(zhì)實(shí)，基本都有含豐富血管的完整包膜。多肽治療組、隨機(jī)多肽組和T輔助多肽組，各有2只SCID鼠見(jiàn)腹腔內(nèi)多臟器腫瘤轉(zhuǎn)移。空白組小鼠未見(jiàn)腫瘤征象。荷瘤鼠皮下移植瘤鏡下表現(xiàn)鱗癌特征，各組腫瘤浸潤(rùn)及異型性無(wú)顯著差異。其它各臟器均未見(jiàn)轉(zhuǎn)移灶。
2.小鼠血漿中人IgG水平各組均可以檢測(cè)到人IgG，8周內(nèi)隨重建時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，此后呈下降趨勢(shì)，但各組間IgG水平無(wú)顯著性差異(p＞0.05)，僅多肽治療組于15周時(shí)明顯上升。
3.荷瘤鼠外周血中的人CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞第105天時(shí)各組外周血中均檢測(cè)到人CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞。
4.脾重荷瘤105天后處死SCID鼠，多肽治療組、隨機(jī)多肽組和T輔助多肽組脾重較空白組都有顯著增加(p＜0.05)，但前三組間比較脾重?zé)o顯著差異(p＞0.05)。
5.脾細(xì)胞毒殺傷功能效靶比為50∶1(自然釋放率8.44％)和100∶1時(shí)(自然釋放率14.36％)，與空白組比較，多肽治療組、隨機(jī)多肽組和T輔助多肽組的脾細(xì)胞殺傷活性均顯著降低(p＜0.05)。
6.脾組織中人CD8+細(xì)胞在空白組SCID小鼠脾內(nèi)可見(jiàn)人CD8+細(xì)胞，隨機(jī)多肽組、T輔助多肽組與多肽治療組SCID小鼠脾內(nèi)均未見(jiàn)人CD8+細(xì)胞。
7.移植瘤組織局部腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)情況各組移植瘤局部均可見(jiàn)TIL浸潤(rùn)、腫瘤出血和壞死，但免疫組化均未見(jiàn)人CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)。
上述實(shí)施例用來(lái)解釋說(shuō)明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種HPV多肽疫苗，其特征在于，它主要由1份HPV16E711-20，1份HPV16E786-93，1份破傷風(fēng)類(lèi)毒素tt830-843和1～4份的不完全佐劑IFA組成。
2.一種權(quán)利要求1所述的HPV多肽疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)多肽合成由多功能多肽合成儀分別一次合成HPV16E711-20、HPV16E786-93和破傷風(fēng)類(lèi)毒素tt830-843。(2)疫苗制備將1份HPV16E711-20、1份HPV16E786-93、1份破傷風(fēng)類(lèi)毒素tt830-843和1～4份的不完全佐劑IFA配制成疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種HPV多肽疫苗及其制備方法，HPV多肽疫苗主要由1份HPV16E文檔編號(hào)A61K39/12GK1686539SQ20051004948
公開(kāi)日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月28日
發(fā)明者謝幸, 葉楓, 呂衛(wèi)國(guó), 梁朝霞, 陳懷增, 周堅(jiān)紅 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院