專利名稱：防治小鵝瘟病的異源抗小鵝瘟蛋黃抗體的制備方法與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于預防和治療小鵝瘟疾病的異源抗小鵝瘟蛋黃抗體的制備方法與應用。
背景技術(shù)：
小鵝瘟病是由鵝細小病毒引起的主要侵害雛鵝的急性、敗血性、接觸性傳染病。本病多發(fā)于3-7日齡的雛鵝，發(fā)病后往往為急性經(jīng)過，發(fā)病率可達100％，死亡率高達60-80％。10-30齡以上的鵝也可感染發(fā)病，一般發(fā)病率不高，但一旦感染發(fā)病，則往往以死亡告終。本病給養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，是養(yǎng)鵝生產(chǎn)中危害最大的疫病。
我國于1956年首次在揚州發(fā)現(xiàn)并確認本病。1965年以后，本病在世界各地迅速蔓延流行。由于10日齡以下仔鵝對小鵝瘟疫苗免疫不產(chǎn)生免疫應答，給小鵝瘟疾病的防制工作帶來了很大的難度。通過國內(nèi)外的分離毒株的血清學鑒定表明，從各地分離到的小鵝瘟毒株，抗原性基本相同，僅有一種血清型。基于這種原因，制備特異性的高免血清和高免蛋黃抗體預防和控制雛鵝小鵝瘟疾病，成為控制本病暴發(fā)流行的最經(jīng)濟有效的辦法。
80年代末，小鵝瘟高免抗血清和特異性蛋黃抗體制劑在我國開始廣泛推廣應用。由于蛋黃抗體療效顯著、制作方法簡便，深受廣大養(yǎng)殖戶的歡迎。但在我國，均使用鵝源蛋黃抗體或家畜高免血清用于本病的防治。由于鵝產(chǎn)蛋率低，血清生產(chǎn)成本過高且有較高的過敏反應，因此鵝源蛋黃抗體或家畜高免血清用于本病的防治，在生產(chǎn)實際中有一定的推廣難度。
眾所周知，在蛋黃存在著垂直傳播的細菌、病毒污染。在我國推廣應用的小鵝瘟高免蛋黃抗體均采用免疫產(chǎn)蛋鵝提取同源蛋黃抗體進行制備，某些垂直傳播的疾病隨著蛋黃抗體的大量應用迅速流行，給養(yǎng)鵝業(yè)造成了難以估量的損失。
結(jié)合這種實際情況，我們使用免疫產(chǎn)蛋雞或鴨的方法生產(chǎn)異源抗小鵝瘟高免蛋黃抗體，用于預防和治療小鵝瘟，通過這種方式，有效的解決了生產(chǎn)實際中存在的上述問題。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種用于預防和治療小鵝瘟疾病的異源抗小鵝瘟蛋黃抗體的制備方法與應用。使用異源動物雞和鴨進行抗小鵝瘟蛋黃抗體的生產(chǎn)，主要是通過小鵝瘟滅活油乳劑疫苗加強免疫健康產(chǎn)蛋雞和鴨，待蛋黃抗體效價合格后，收集高免蛋，從蛋黃中提取免疫球蛋白。
用本方法生產(chǎn)的抗小鵝瘟蛋黃抗體，解決了本動物垂直傳播疾病的危險和血清的高過敏原性，同時降低了生產(chǎn)成本和使用成本。
根據(jù)本方法所制備的蛋黃抗體，用于預防和治療小鵝瘟疾病，經(jīng)臨床試驗證實，效果確實，與用常規(guī)方法生產(chǎn)的鵝的蛋黃抗體具有相同的治療效果。
在提取蛋黃抗體的過程中，蛋黃用3倍體積的生理鹽水稀釋后，充分攪拌均勻，用三氯甲烷進行提取精制，制備蛋黃抗體進行注射使用。
在分離的上清液中加入終濃度為0.05％的甲醛溶液，充分攪拌混勻，37℃保溫密封8-12小時，以殺滅蛋黃抗體中可能污染或垂直傳播的微生物，從而確保產(chǎn)品的安全性。
提取蛋黃抗體的性質(zhì)穩(wěn)定，可在室溫下保存18個月以上，對于用戶在運輸、使用上具有獨特的優(yōu)勢。
具體實施例方式
本方案主要包括以下步驟小鵝瘟種毒的制取及增殖、免疫抗原的制備、蛋雞或蛋鴨的免疫、蛋黃抗體的提取。其具體方法為1、種毒準備及增殖1.1將冷凍保存的患小鵝瘟疾病死亡的小鵝腸道病料按照1∶5加滅菌生理搗碎，凍融2次后，形成混合組織懸液。
1.2將混合組織懸液進行4000rpm離心，收集上清液。
1.3取離心上清液，經(jīng)56℃水浴處理30分鐘，每毫升加入青霉素和鏈霉素1000單位，4℃處理2小時。
1.4將青、鏈霉素處理后的種毒液用滅菌生理鹽水稀釋100倍，經(jīng)0.22um微孔濾膜過濾除菌，以0.1ml/只的劑量接種13-15日齡非免疫鵝胚尿囊腔，在37℃的恒溫箱中孵育，棄去48小時內(nèi)的死亡鵝胚，收集48-120小時內(nèi)死亡的胚，置4-8℃冰箱保存過夜。
1.5無菌采集尿囊液及羊水。死亡胚胚體應出現(xiàn)典型的肝臟出血、水腫以及尿囊膜水腫等病理變化。
2、配制油乳劑抗原將收獲的尿囊毒液中加入0.1％甲醛溶液，37℃密閉滅活48小時。期間每4-6小時振搖一次。滅活完成后，按滅活毒液96份，滅菌吐溫-804份配制，即為制苗用抗原。同時按照常規(guī)方法制備油相。按油相3份、水相1份的比例進行乳化配制。即按比例取油相、水相攪拌均勻，加入高壓均質(zhì)機中，調(diào)節(jié)壓力為35mpa，乳化制備成小鵝瘟滅活油乳劑疫苗。按量分裝，加入1％硫柳汞溶液使之終濃度為萬分之一，備用。
按照油乳佐劑疫苗的相關(guān)檢驗項目進行檢驗，檢驗合格后，即為免疫用油乳劑抗原。置4℃避光保存，6個月內(nèi)有效。
3、產(chǎn)蛋雞或鴨免疫3.1基礎(chǔ)免疫以制備的小鵝瘟滅活油乳劑抗原頸部皮下注射0.5ml/只。
3.2強化免疫2周后，以制備的小鵝瘟滅活油乳劑抗原頸部皮下注射1.0ml/只，進行強化免疫。間隔2周后用滅活油乳劑抗原再次強化免疫一次，頸部皮下注射2.0ml/只。
3.3以后間隔8周進行一次強化免疫，每次頸部皮下注射2.0ml/只。
4、小鵝瘟蛋黃抗體制備4.1高免蛋收集從第二次強化免疫后第7天開始，每隔三天抽樣用瓊脂擴散方法測定高免蛋黃中抗小鵝瘟特異抗體效價。蛋黃與生理鹽水按1∶3(V/V)稀釋后，加與蛋黃等體積三氯甲烷進行萃提，用瓊擴方法檢測萃提上清液中抗小鵝瘟特異抗體效價，若上清液瓊擴抗體效價達到1∶64以上即可集蛋，用于制備小鵝瘟蛋黃抗體。高免蛋在15℃-25℃可貯存3天，4-10℃貯存期不得超過10天。
4.2蛋殼消毒 將高免蛋浸入加熱至42℃的0.1％新潔爾滅水溶液中消毒15分鐘。蛋殼污染嚴重的，應事先選出，單獨消毒并用清水沖洗干凈后，再浸泡消毒一次。然后將新潔爾滅消毒后的高免蛋浸入水溫為90-95℃的水浴中消毒5秒鐘，取出后晾干或吹干備用。
4.3蛋黃分離 采取手工或機械打蛋。打蛋時應充分除去蛋清(白)、胚盤和系帶，收集蛋黃。
4.4萃提 于蛋黃中加入3倍體積的生理鹽水，充分攪拌均勻，然后在蛋黃液中加入與蛋黃等體積的三氯甲烷，充分振蕩混合均勻，室溫作用60分鐘，以3500-4000rpm離心30分鐘，收集上層清液備用。
4.5加入滅活劑 在分離的上清液中加入終濃度為0.05％的甲醛溶液，充分攪拌混勻，37℃保溫密封8-12小時。
4.6除菌過濾 用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，定量分裝，即為抗小鵝瘟蛋黃抗體。
5、產(chǎn)品檢驗5.1無菌檢驗 應無菌生長。
5.2物理性狀 本品為微黃色或淡黃色的透明液體。久置后瓶底有少許細小的白色沉淀。pH值5.5-6.5。
5.3安全檢驗 18-22g健康小鼠5只，各皮下注射本品0.5ml；3日齡易感雛鵝10只，各皮下注射本品3.0ml。觀察10天，小鼠和雛鵝均應全部健活。
5.4抗體效價測定 瓊擴抗體效價應達到1∶32及以上。
5.5效力檢驗 用鵝效檢 3-5日齡易感雛鵝30只，隨機分為三組。第一組為健康對照組，不注射任何藥品，隔離飼養(yǎng)。第二和三組每只雛鵝皮下接種小鵝瘟強毒SCG99株腸道病料毒lOOLD50。于攻毒后24小時分別給第二組皮下注射本品2.0ml，第三組皮下注射生理鹽水2.0ml。觀察每組雛鵝發(fā)病、死亡情況至第10天。
結(jié)果判定第一組為健康對照組，試驗期間全部雛鵝應健康無病。第三組為攻毒對照組，應于攻毒后3-7天發(fā)病，96小時后開始死亡，10天內(nèi)應死亡8只以上。第二組為早期感染治療組，注射本品后48小時，即攻毒后3天后，試驗雛鵝開始發(fā)病，但發(fā)病率不得超過30％，至觀察結(jié)束時試驗雛鵝應存活8只及以上。該制品判為合格。
使用油乳劑滅活疫苗免疫產(chǎn)蛋母雞或母鴨，從蛋黃中提取免疫球蛋白，該免疫球蛋白對小鵝瘟疾病具有特異性的預防和治療作用，且用藥后動物體內(nèi)不存在藥物殘留，同時藥效期長達5-7天，是一種高效、特效、無殘留的新型獸藥。
異源抗小鵝瘟蛋黃抗體對小鵝瘟疾病的預防和治療實驗情況實驗一雞抗小鵝瘟蛋黃抗體對小鵝瘟疾病的預防和治療實驗情況250只1日齡小鵝，隨機分成五組，每組50只，分別為第一、二、三、四、五組。其中第一組作為對照，再隨機分成兩組，每組25只，分別為對照一組和對照二組。各組按照常規(guī)飼養(yǎng)方法進行隔離飼養(yǎng)。
預防試驗
2日齡時，取第二、第三組，每只注射雞源抗小鵝瘟蛋黃抗體1.0ml。第二組和對照一組于48小時后，在實驗室條件下人工感染小鵝瘟。第三組試驗鵝于120小時后，在實驗室條件下人工感染小鵝瘟。觀察各組試驗鵝的發(fā)病及死亡情況并記錄直至攻毒后10天。預防試驗結(jié)果表明實驗鵝在注射抗體48小時后攻毒，預防保護率達到100％(50/50)，在注射抗體120小時后攻毒，預防保護率達到88％(44/50)，而對照一組實驗鵝存活率為44％(11/25)。結(jié)果詳見表一表一雞抗小鵝瘟蛋黃抗體對小鵝瘟疾病的預防結(jié)果

治療試驗2日齡時，取第四、第五組和對照二組在實驗室條件下人工感染小鵝瘟。第四組試驗鵝于感染后24小時每只鵝腿部肌肉注射雞源抗小鵝瘟蛋黃抗體1.0ml進行治療。第五組實驗鵝于感染后96小時每只鵝腿部肌肉注射雞源抗小鵝瘟蛋黃抗體1.0ml進行治療。對照二組不注射藥品，觀察各組的發(fā)病及死亡情況并記錄直至攻毒后10天。治療試驗結(jié)果表明實驗鵝在攻毒后24小時、96小時的保護率分別為100％(50/50)、74％(37/50)。而對照二組實驗鵝存活率為36％(9/25)。結(jié)果詳見下表二表二攻毒后不同時間雞抗小鵝瘟蛋黃抗體的治療效果

實驗二鴨抗小鵝瘟蛋黃抗體對小鵝瘟疾病的預防和治療實驗情況250只1日齡小鵝，隨機分成五組，每組50只，分別為第一、二、三、四、五組。其中第一組作為對照，再隨機分成兩組，每組25只，分別為對照一組和對照二組。各組按照常規(guī)飼養(yǎng)方法進行隔離飼養(yǎng)。
預防試驗2日齡時，取第二、第三組，每只注射鴨源抗小鵝瘟蛋黃抗體1.0ml。第二組和對照一組于48小時后，在實驗室條件下人工感染小鵝瘟。第三組試驗鵝于120小時后，在實驗室條件下人工感染小鵝瘟。觀察各組試驗鵝的發(fā)病及死亡情況并記錄直至攻毒后10天。預防試驗結(jié)果表明實驗鵝在注射抗體48小時后攻毒，預防保護率達到100％(50/50)，在注射抗體120小時后攻毒，預防保護率達到86％(43/50)，而對照一組實驗鵝存活率為44％(11/25)。結(jié)果詳見下表三表三注射鴨抗小鵝瘟蛋黃抗體后不同時間的攻毒保護結(jié)果

治療試驗2日齡時，取第四、第五組和對照二組在實驗室條件下人工感染小鵝瘟。第四組試驗鵝于感染后24小時每只鵝腿部肌肉注射鴨源抗小鵝瘟蛋黃抗體1.0ml進行治療。第五組實驗鵝于感染后96小時每只鵝腿部肌肉注射鴨源抗小鵝瘟蛋黃抗體1.0ml進行治療。對照二組不注射藥品，觀察各組的發(fā)病及死亡情況并記錄直至攻毒后10天。治療試驗結(jié)果表明實驗鵝在攻毒后24小時、96小時的保護率分別為100％(50/50)、68％(34/50)。而對照二組實驗鵝存活率為36％(9/25)。結(jié)果詳見下表四表四攻毒后不同時間鴨抗小鵝瘟蛋黃抗體的治療效果


從上述結(jié)果可以看出，異源抗小鵝瘟蛋黃抗體對雛鵝小鵝瘟疾病具有良好的預防和治療效果。
雖然本文參照優(yōu)選的實施例說明了本發(fā)明的各方面和特征，但上述實施例只是說明性的，并不限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍僅由權(quán)利要求書來限制。在不背離權(quán)利要求書的實質(zhì)和范圍的條件下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員易于對本發(fā)明進行適當?shù)母膭踊蚋淖?，因此這些改動或改變也應屬于本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種抗小鵝瘟異源蛋黃抗體制備方法，包括下列步驟(a)將冷凍保存的患小鵝瘟疾病死亡的小鵝腸道病料按照1∶5加滅菌生理鹽水搗碎，凍融2次后，形成混合組織懸液；將混合組織懸液進行4000rpm離心，收集上清液并于56℃處理30分鐘，每毫升加入青霉素和鏈霉素1000單位，4℃處理2小時；將青、鏈霉素處理后的種毒液用滅菌生理鹽水稀釋100倍，經(jīng)0.22um微孔濾膜過濾除菌，以0.1ml/只的劑量接種13-15日齡非免疫鵝胚尿囊腔，37℃孵育，棄去48小時內(nèi)的死亡鵝胚，收集48-120小時內(nèi)死亡的胚；無菌采集尿囊液及羊水；(b)將收獲的尿囊毒液中加入0.1％甲醛溶液，37℃密閉滅活48小時；滅活完成后，按滅活毒液96份，滅菌吐溫-80 4份配制，即為制苗用抗原；按油相3份、水相1份的比例取油相、水相攪拌均勻，加入高壓均質(zhì)機中，調(diào)節(jié)壓力為35mpa，乳化制備成小鵝瘟滅活油乳劑疫苗，并加入1％硫柳汞溶液使之終濃度為萬分之一；(c)以制備的小鵝瘟滅活油乳劑抗原頸部皮下注射0.5ml/只；2周后，以制備的小鵝瘟滅活油乳劑抗原頸部皮下注射1.0ml/只，進行強化免疫；間隔2周后用滅活油乳劑抗原再次強化免疫一次，頸部皮下注射2.0ml/只；以后間隔8周進行一次強化免疫，每次頸部皮下注射2.0ml/只；(d)從第二次強化免疫后第7天開始，每隔三天抽樣用瓊脂擴散方法測定高免蛋黃中抗小鵝瘟特異抗體效價；蛋黃與生理鹽水按1∶3(V/V)稀釋后，加與蛋黃等體積三氯甲烷進行萃提，用瓊擴方法檢測萃提上清液中抗小鵝瘟特異抗體效價，若上清液瓊擴抗體效價達到1∶64以上即可集蛋，用于制備小鵝瘟蛋黃抗體；(e)將蛋殼消毒，打蛋并充分除去蛋清、胚盤和系帶，收集蛋黃；于蛋黃中加入3倍體積的生理鹽水，充分攪拌均勻，然后在蛋黃液中加入與蛋黃等體積的三氯甲烷，充分振蕩混合均勻，室溫作用60分鐘，以3500-4000rpm離心30分鐘，收集上層清液備用；(f)在分離的上清液中加入終濃度為0.05％的甲醛溶液，充分攪拌混勻，37℃保溫密封8-12小時；用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，即得瓊擴抗體效價達到1∶32及以上異源抗小鵝瘟蛋黃抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異源抗小鵝瘟蛋黃抗體的制備方法，其特征在于使用異源動物雞和鴨進行抗小鵝瘟蛋黃抗體的生產(chǎn)，主要是通過小鵝瘟滅活油乳劑疫苗加強免疫健康產(chǎn)蛋雞和鴨，待蛋黃抗體效價合格后，收集高免蛋，從蛋黃中提取免疫球蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異源抗小鵝瘟蛋黃抗體的制備方法，其特征在于用本方法生產(chǎn)的抗小鵝瘟蛋黃抗體，解決了本動物垂直傳播疾病的危險和血清的高過敏原性，同時降低了生產(chǎn)成本和使用成本。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異源抗小鵝瘟蛋黃抗體的制備方法，其特征在于根據(jù)本方法所制備的蛋黃抗體，用于預防和治療小鵝瘟疾病，經(jīng)臨床試驗證實，效果確實，與用常規(guī)方法生產(chǎn)的鵝的蛋黃抗體具有相同的治療效果。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異源抗小鵝瘟蛋黃抗體的制備方法，其特征在于在提取蛋黃抗體的過程中，蛋黃用3倍體積的生理鹽水稀釋后，充分攪拌均勻，用三氯甲烷進行提取精制，制備蛋黃抗體進行注射使用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異源抗小鵝瘟蛋黃抗體的制備方法，其特征在于在分離的上清液中加入終濃度為0.05％的甲醛溶液，充分攪拌混勻，37℃保溫密封8-12小時，以殺滅蛋黃抗體中可能污染或垂直傳播的微生物，從而確保產(chǎn)品的安全性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異源抗小鵝瘟蛋黃抗體的制備方法，其特征在于提取蛋黃抗體的性質(zhì)穩(wěn)定，可在室溫下保存18個月以上，對于用戶在運輸、使用上具有獨特的優(yōu)勢。
全文摘要
本發(fā)明為一種用于雛鵝小鵝瘟疾病的預防和治療的蛋黃抗體的制備方法。它改變了使用母鵝進行高免用于制備抗小鵝瘟蛋黃抗體的先例，而改用鴨和雞用于抗小鵝瘟蛋黃抗體的制備，包括小鵝瘟種毒的制取，高免抗原的制取，蛋黃抗體的制取。經(jīng)臨床試驗和使用結(jié)果表明用本方法制備的異源小鵝瘟蛋黃抗體用于預防和治療雛鵝小鵝瘟疾病，預防率和治愈率高、藥效期長，藥物效果顯著，其預防率為95％以上，早期治愈率達80％以上。用該方法制成的高免抗體，成本明顯低于同源的鵝蛋黃抗體和其它血清，且可預防由同源蛋黃抗體所致的垂直傳播疾病的影響。
文檔編號A61P31/00GK1927886SQ20051009836
公開日2007年3月14日 申請日期2005年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月9日
發(fā)明者何洪章 申請人:重慶永健生物技術(shù)有限責任公司