專(zhuān)利名稱(chēng)：新穎嗜乳酸菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及一種新穎的嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)及其應(yīng)用。特別是，本發(fā)明的嗜酸乳桿菌具有優(yōu)良的耐動(dòng)物消化液的特性，可在動(dòng)物腸胃道中存活并抑制病原菌的生長(zhǎng)。本發(fā)明的嗜酸乳桿菌可應(yīng)用于酸奶、生菌劑、飼料添加劑產(chǎn)品中，具有調(diào)整動(dòng)物腸胃功能的優(yōu)良效果。
背景技術(shù)：
乳酸菌為人類(lèi)和動(dòng)物腸道主要菌群，常用于人和動(dòng)物益生菌產(chǎn)品。其增進(jìn)健康的主要方式之一，為抑制腸內(nèi)病原菌(如沙門(mén)氏菌或大腸桿菌等)的生長(zhǎng)(Lehto et al.，1997)；也有研究顯示乳酸菌可預(yù)防病原菌的入侵，如可防止沙門(mén)氏菌屬的傷寒桿菌(Salmonella typhimurium)侵入上皮細(xì)胞(Jinet al.，1996)。但若乳酸菌要能在動(dòng)物體內(nèi)中發(fā)揮上述功能，必須考慮兩個(gè)基本特性第一是乳酸菌能否忍受動(dòng)物腸胃道消化系統(tǒng)所分泌的胃酸和膽鹽，而到達(dá)腸道存活；第二為乳酸菌對(duì)動(dòng)物宿主的腸道上皮細(xì)胞的吸附能力。乳酸菌吸附黏膜表面的能力，是其能在人類(lèi)腸胃道與病原菌競(jìng)爭(zhēng)吸附的條件(Rammelsberg and Radler，1990)，因?yàn)椴≡斐筛腥镜南葲Q條件，亦是吸附于腸道細(xì)胞(Chou and Weimer，1999)。一般此吸附特性是應(yīng)用體外模式研究菌體與腸道細(xì)胞株之間的吸附情形(Marteau et al.，1997)，如Int-407(Leung and Finlay，1991)及Caco-2(Conway et al.，1987；Marteau etal.，1997)細(xì)胞株，進(jìn)行乳酸菌吸附及競(jìng)爭(zhēng)排除病原菌的研究。
沙門(mén)氏菌屬，如傷寒桿菌會(huì)造成食物中毒(Boonmar et al.，1998)，近年來(lái)，具多重抗藥性的傷寒桿菌菌株已逐年增加(Boonmar et al.，1998；Gross et al.，1998)，并且也出現(xiàn)了對(duì)新一代氟喹諾酮類(lèi)(fluoroquinolones)與第三代廣效頭芽孢素(cephalosporins)等第三代抗微生物劑具抗藥性的菌株，成為沙門(mén)氏菌感染時(shí)，臨床治療上的一大問(wèn)題(Herikstad et al.，1997；Amyes and Gemmell，1997；Piddock，1998)。因此，學(xué)者將治療病原菌感染轉(zhuǎn)為使用益生菌，強(qiáng)化腸黏膜防御機(jī)制，保護(hù)腸道免于沙門(mén)氏菌等病原菌的感染(Nird and Edlund.1990)。
目前已有許多乳酸菌可抑制病原菌的相關(guān)研究，披露于專(zhuān)利文獻(xiàn)或?qū)W術(shù)期刊中。例如美國(guó)專(zhuān)利第5,603,930號(hào)中披露約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)菌株CNCM I-1225可吸附Caco-2細(xì)胞，并抑制腸毒素及腸侵入病原菌的吸附；美國(guó)專(zhuān)利第3,953,609號(hào)披露乳酸乳桿菌(Lactobacilluslactis)菌株NRRL B-5628可抑制其它消化系統(tǒng)(如嘴或胃)中細(xì)菌的生長(zhǎng)，特別可用在小豬及其它新出生動(dòng)物的腹瀉或腸絞痛的治療，減少大腸桿菌(Escherichia coli)或大腸桿菌群的生長(zhǎng)；美國(guó)專(zhuān)利第6,491,956號(hào)披露嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)菌株HY2177及干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)菌株HY2743可預(yù)防及治療幽門(mén)桿菌感染所造成的胃炎與十二指腸及胃潰瘍；美國(guó)專(zhuān)利第4,874,704號(hào)披露乳桿菌可產(chǎn)生一種抗菌物質(zhì)，可抑制在冷藏溫度下病原菌及食品中的腐敗菌(如李氏特菌及沙門(mén)氏菌)的生長(zhǎng)；美國(guó)專(zhuān)利第5,340,577及5,604,127號(hào)披露乳桿菌、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、佛氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)、腸球菌(Enterococcus)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)及丙酸菌(Propionibacterium)可以抑制沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)；美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)第20020018770號(hào)披露洛德乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、約氏乳桿菌及枯草桿菌(Bacillus subtilis)可以應(yīng)用于雞飼料中抑制病原菌生長(zhǎng)，并促進(jìn)家禽的生長(zhǎng)，進(jìn)而減少抗生素或藥劑的使用量；美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)第20040028665號(hào)披露乳桿菌及費(fèi)氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)同時(shí)使用，可以抑制大腸桿菌O157:H7型及其它致病性細(xì)菌的生長(zhǎng)；美國(guó)公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)第20040029127號(hào)披露一種干酪乳桿菌可以增強(qiáng)免疫力，進(jìn)而抑制病原菌的生長(zhǎng)；美國(guó)公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)第20040038379號(hào)披露一種唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)，其具有類(lèi)似抑菌素的特性，可抑制李斯特菌及葡萄球菌，包括抗甲氧苯青霉素金黃色葡萄球菌(MRSA)及芽孢桿菌屬，且不會(huì)抑制其它的乳桿菌；美國(guó)公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)第20040151708號(hào)披露發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)菌株ME-3，為一種具抗菌性及抗氧化的益生菌，可抑制大腸桿菌、宋內(nèi)志賀氏菌(Shigella sonnei)、金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌及幽門(mén)螺旋桿菌(Helicobacter pylori)。
學(xué)術(shù)期刊對(duì)于乳酸菌的相關(guān)研究及其功效亦見(jiàn)諸多，例如雙叉乳桿菌在老鼠試驗(yàn)中可以防止產(chǎn)生志賀毒素(shiga toxin-producing)的大腸桿菌O157:H7型感染(Asahara et al.，Infect.Immun.722240-2247)；鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)可減少出血性大腸桿菌的感染(Hirano，et al.，Microbiol Immunol.47405-409)；乳桿菌及乳糖可以抑制沙門(mén)氏菌增殖(Johannsen et al.，Avian Dis.48279-286)；洛德乳桿菌可抑制單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)及沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)(Kuleasan et al.，Nahrung.，46408-410)；青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)菌株1027所產(chǎn)生的吸附素，可以競(jìng)爭(zhēng)抑制腸毒性大腸桿菌、腸病原性大腸桿菌及梭狀芽胞桿菌(Clostridium difficile)附著于腸道上皮細(xì)胞株Lovo(Zhonget al.，World J.Gastroenterol.，101630-1633)；德氏乳酸菌(Lactobacillusdelbrueckii subsp.lactis)在肉制品中可抑制致病菌和腐敗菌的生長(zhǎng)(Senne etal.，J.Food Prot.，66418-425)；乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis)ATCC 11454株具有抗菌能力(Millette et al.，J.Food Prot.，671184-1189)；乳桿菌LB的上清液明顯降低了沙門(mén)氏菌對(duì)腸道細(xì)胞Caco-2/TC-7的侵入(Coconnier et al.，Appl.Environ.Microbiol.，661152-1157)；干酪乳桿菌的菌液及其廢棄培養(yǎng)物上清液均可抑制沙門(mén)氏菌侵入腸道細(xì)胞Caco-2，但在pH 7時(shí)即失去其效用，而小鼠經(jīng)連續(xù)喂食L.casei GG 7天，可在感染沙門(mén)氏菌后維持100％的存活率，并減少了肝臟和脾臟內(nèi)的菌數(shù)(Hudault et al.，Appl.Enviro.Microbiol.，63513-518)；喂食干酪乳桿菌可為小鼠對(duì)沙門(mén)氏菌的侵入及感染提供保護(hù)，并認(rèn)為此保護(hù)作用和腸道分泌的IgA有關(guān)(Perdigon et al.，Journal of Dairy Research，57255-264)；在次致死量的沙門(mén)氏菌感染小鼠試驗(yàn)中，整個(gè)感染過(guò)程可分為三個(gè)時(shí)期，第一個(gè)時(shí)期為沙門(mén)氏菌侵入后在肝和脾等臟器增殖時(shí)期，經(jīng)過(guò)一周后，進(jìn)入第二時(shí)期，沙門(mén)氏菌增殖停止，達(dá)到最高菌數(shù)的高峰期，此時(shí)期亦持續(xù)一周，在第三時(shí)期，沙門(mén)氏菌在肝和脾內(nèi)的菌數(shù)逐漸下降(Nauciel et al.，Infection and Immunity，60450-454)。
此外，亦已有許多報(bào)告研究乳酸菌抑制沙門(mén)氏菌的機(jī)制。Fuller(1986)曾提出利用不具吸附能力的菌種，如干鏈球菌(Streptococcus faecium)，由于其增殖的速率超過(guò)食糜的排出速率，而能生存于腸道內(nèi)，因此具有此特性的菌種能停留于大腸粘膜層，而不必吸附在上皮細(xì)胞上。另外有學(xué)者(Hormaeche et al.，1980；Van Dissel et al.，1985)提出宿主體內(nèi)感染的沙門(mén)氏菌的增殖，初期是通過(guò)巨噬細(xì)胞及其活化后的功能發(fā)揮抑制的效用。乳酸菌抑制腸道微生物感染的機(jī)制為競(jìng)爭(zhēng)性排除，包括對(duì)養(yǎng)分和腸道細(xì)胞吸附位置的競(jìng)爭(zhēng)、分泌抑菌物質(zhì)(Hudault et al.，Applied and EnvironmentalMicrobiology，63513-518；Chauviere et al.，F(xiàn)EMS Microbiology Letters，91213-218)及活化腸道免疫系統(tǒng)，可提高宿主抑制病原菌的能力(Perdigonet al.，Journal of Dairy Research，57255-264；Schiffrin et al.，AmericanJournal of Clinical Nutrition，66515S-520S)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明自豬腸道篩選并分離一株嗜酸乳桿菌，其具有上述人類(lèi)及動(dòng)物益生菌的基本特性，并可對(duì)抗病原菌，如沙門(mén)氏菌侵入并感染腸黏膜及肝、脾器官的功效。本發(fā)明的嗜酸乳桿菌菌株可應(yīng)用于酸奶及家畜家禽的飼料添加劑中，作為生菌劑使用，增進(jìn)動(dòng)物的腸胃道功能。
因此，本發(fā)明一方面是提供一種嗜酸乳桿菌LASW，保藏號(hào)為CCTCCNOM204083，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
本發(fā)明再一方面是提供一種益生菌組合物，其包括上述的嗜酸乳桿菌LASW。
本發(fā)明又一方面是提供一種飼料組合物，其包括上述的嗜酸乳桿菌LASW。
本發(fā)明又一方面是提供一種用于預(yù)防或治療病原菌感染的醫(yī)藥組合物，其包括上述的嗜酸乳桿菌LASW。


圖1顯示大腸桿菌受本發(fā)明嗜酸乳桿菌上清液(SCS)的抑制生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果。
圖2顯示豬霍亂沙門(mén)氏菌受本發(fā)明的嗜酸乳桿菌抑制侵入試驗(yàn)結(jié)果。
圖3顯示LASW和空白組的小鼠經(jīng)喂食沙門(mén)氏菌后第三和第六天的全身性血清IL-6變化。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明主要涉及一種新穎的嗜酸乳桿菌LASW，于2004年11月17日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NOM204083。該嗜酸乳桿菌具有下列特色1.從臺(tái)灣本土豬腸道所篩選出；2.具優(yōu)良的耐酸及耐膽鹽的能力，能在人類(lèi)及動(dòng)物體內(nèi)通過(guò)胃腸消化液后而存活于腸道中；3.具有優(yōu)良的人類(lèi)及動(dòng)物腸道表皮細(xì)胞吸附能力；4.可與腸致病菌競(jìng)爭(zhēng)對(duì)腸道細(xì)胞的吸附，進(jìn)而抑制腸致病菌，如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌及其它葡萄球菌的吸附生長(zhǎng)與侵入腸道細(xì)胞及侵入轉(zhuǎn)移至肝與脾臟的功效。
基于上述特性，本發(fā)明的嗜酸乳桿菌菌株LASW可應(yīng)用于酸奶及家畜家禽之的飼料添加物中，作為生菌劑使用，增進(jìn)動(dòng)物的腸胃道功能。此外，本發(fā)明的嗜酸乳桿菌亦可應(yīng)用于醫(yī)藥組合物中，用以預(yù)防或治療病原菌感染。
下列實(shí)施例是用以舉例說(shuō)明本發(fā)明的功效，而非用以限定本發(fā)明的范疇。
實(shí)施例一、耐酸及耐膽鹽試驗(yàn)參照Conway et al.，Journal of Dairy Science，701-12所述的方法進(jìn)行耐酸試驗(yàn)。將100μl經(jīng)培養(yǎng)的LASW乳酸菌菌液(108～109CFU/毫升)，加入至經(jīng)0.1N HCl調(diào)整至pH 2.0、2.5及3.2的磷酸鹽緩沖溶液，或豬胃液(pH 3.2)，并于37℃下培養(yǎng)3小時(shí)。乳酸菌液加入相同條件的pH 7.2磷酸鹽緩沖溶液作為對(duì)照組。培養(yǎng)后經(jīng)系列稀釋后，分別培養(yǎng)于MRS瓊脂，計(jì)算存活的乳酸菌菌數(shù)。
參照Gilliland et al.，Journal of Dairy Science，73905-911中所述的方法進(jìn)行耐膽鹽試驗(yàn)。將上述經(jīng)耐酸試驗(yàn)存活的乳酸菌，以5,000rpm離心5分鐘后，以磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.2)清洗，再將乳酸菌移至9毫升的MRS培養(yǎng)液中(分別含及不含0.3％w/v的膽鹽(Sigma)，培養(yǎng)3、12及24小時(shí)，培養(yǎng)后經(jīng)系列稀釋?zhuān)瑑A倒法培養(yǎng)于MRS瓊脂計(jì)數(shù)存活的乳酸菌數(shù)。
試驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明的嗜酸乳桿菌LASW，其菌數(shù)于pH 2.0環(huán)境下培養(yǎng)3小時(shí)后降低2個(gè)對(duì)數(shù)值(從10.5降為8.5)；在pH 2.5和3.2環(huán)境下則穩(wěn)定生長(zhǎng)。在豬胃液(pH3.2)培養(yǎng)3小時(shí)后，僅降低0.6個(gè)對(duì)數(shù)值。在含有膽鹽的環(huán)境中培養(yǎng)，仍能穩(wěn)定成長(zhǎng)。顯示其具有良好的酸及膽鹽耐受性。
二、腸道細(xì)胞株吸附試驗(yàn)取一24孔多孔平板，每孔中放入一片蓋玻片。將培養(yǎng)完全的Int-407和Caco-2的個(gè)別細(xì)胞角形培養(yǎng)皿，倒掉舊的培養(yǎng)液，以1×PBS緩沖液清洗角形培養(yǎng)皿兩次后倒掉，加入1％胰蛋白酶/EDTA約1毫升進(jìn)行消化，輕拍角形培養(yǎng)皿數(shù)下，使細(xì)胞懸浮。加入40毫升新鮮BME(Int-407)或MEM(Caco-2)(皆含F(xiàn)BS及青霉素-鏈霉素)培養(yǎng)液(即稀釋4倍)，搖勻后，每孔加入0.5毫升細(xì)胞懸浮液，于37℃、CO2氣體中培養(yǎng)，使細(xì)胞能夠分裂生長(zhǎng)附著蓋玻片。再將舊培養(yǎng)液吸出，每孔加入0.5毫升、1×PBS緩沖液清洗，洗除舊的培養(yǎng)液及去除未附著的細(xì)胞，重復(fù)清洗兩次。加入0.5毫升新鮮適合個(gè)別不同細(xì)胞的培養(yǎng)液(不含青霉素-鏈霉素)，以及100μl乳酸菌菌液，于37℃、CO2氣體中培養(yǎng)2小時(shí)。
吸出舊培養(yǎng)液，每孔加入0.5毫升、1×PBS緩沖液清洗三次，每次以100rpm轉(zhuǎn)速搖晃清洗5分鐘，以滴管吸出。加入10％福爾馬林200毫升后，以100rpm轉(zhuǎn)速搖晃固定30分鐘，使菌體和細(xì)胞固定于孔內(nèi)蓋玻片上，并以滴管吸出福爾馬林。加入0.5毫升、1×PBS緩沖液清洗三次，每次以100rpm轉(zhuǎn)速搖晃清洗5分鐘。加入經(jīng)濾紙粗過(guò)濾的結(jié)晶紫200μl染色，在24-孔多孔培養(yǎng)皿外包一層鋁箔紙，以100rpm轉(zhuǎn)速搖晃染色5分鐘，加入0.5毫升、1×PBS緩沖液清洗去除多余染劑。滴一滴1×PBS緩沖液于載玻片上，以鑷子取出蓋玻片放置其上，避免干燥，以倒立式熒光顯微鏡(Olympus IMT-2)下觀察，并且計(jì)數(shù)每一細(xì)胞上吸附的乳酸菌數(shù)(Gopalet al.，2001)。
試驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明的嗜酸乳桿菌對(duì)人類(lèi)腸道表皮細(xì)胞Int-407及Caco-2細(xì)胞，及豬、雞、兔的腸道表皮細(xì)胞，其吸附能力均至少為每個(gè)細(xì)胞大于15個(gè)乳酸菌數(shù)。
三、對(duì)不同病原菌的抑制生長(zhǎng)作用試驗(yàn)將本發(fā)明的嗜酸乳桿菌于MRS中培養(yǎng)24小時(shí)，菌液的pH值降至3.7，對(duì)金黃色葡萄球菌、其它葡萄球菌、大腸桿菌及志賀氏菌進(jìn)行敏感性測(cè)試。結(jié)果顯示，本發(fā)明的嗜酸乳桿菌，對(duì)這些病原性細(xì)菌均形成大小不等的抑制圈，確具有抑制病原菌生長(zhǎng)的作用。另外，在本試驗(yàn)中以LASW乳酸菌株的SCS作用4小時(shí)；對(duì)大腸桿菌的抑制生長(zhǎng)作用效果顯著，可降低菌數(shù)102-104CFU/毫升(圖1)。
四、抑制豬霍亂沙門(mén)氏菌侵入腸道細(xì)胞株Int 407的試驗(yàn)豬霍亂沙門(mén)氏菌(Salmonella Choleraesuis)為侵入性很強(qiáng)的人畜共患病原菌，因此，選擇其作為乳酸菌LASW的抑制細(xì)菌侵入作用的探討。本試驗(yàn)方法主要是參考Hudault等(1997)所述的方法。
(1)乳酸菌的制備將測(cè)試乳酸菌菌株自冷凍甘油瓶取出，以MRS培養(yǎng)基連續(xù)活化兩次，于37℃下隔夜培養(yǎng)后，將部份菌液于4℃以6000rpm離心10分鐘，取出上清液(spent culture supernatant，SCS)，利用過(guò)濾滅菌的1N NaOH中和乳酸菌菌液(bacterial culture)以及上清液，準(zhǔn)備上述未調(diào)整與經(jīng)調(diào)整至中性pH值的乳酸菌菌液及上清液以進(jìn)行試驗(yàn)。
(2)豬霍亂沙門(mén)氏菌的制備豬霍亂沙門(mén)氏菌(菌株SCV2a、SCV26a)培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基中，經(jīng)二次活化培養(yǎng)后離心10分鐘收集菌體，并以無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液清洗后，懸浮于同體積的磷酸鹽緩沖溶液中。菌液經(jīng)系列稀釋?zhuān)云桨逵?jì)數(shù)法于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，進(jìn)行活菌數(shù)的計(jì)數(shù)。
(3)乳酸菌于Int 407腸道細(xì)胞株抑制豬霍亂沙門(mén)氏菌侵入試驗(yàn)將75T培養(yǎng)瓶中的腸道細(xì)胞Int 407以1毫升的胰蛋白酶-EDTA消化處理后，輕拍培養(yǎng)瓶將細(xì)胞拍下，分裝于96-孔洞微量培養(yǎng)盤(pán)，每個(gè)孔洞中加入1×105細(xì)胞/毫升，經(jīng)培養(yǎng)隔夜，使形成單層細(xì)胞后，除去舊有的細(xì)胞培養(yǎng)基，加入90μl無(wú)抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基。取10μl上述(1)中制備的乳酸菌菌液及上清液(SCS)，加入細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)的各孔洞中，置于37℃，5％CO2中培養(yǎng)1小時(shí)。以(2)所述的豬霍亂沙門(mén)氏菌懸浮液，經(jīng)適當(dāng)稀釋后取出10μl，加入各孔洞內(nèi)使終濃度約為106CFU/孔，以1000rpm低速離心10分鐘使細(xì)菌沉降，細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1小時(shí)及2小時(shí)后，以磷酸鹽緩沖溶液清洗各孔洞五次，以洗去殘存于細(xì)胞外的E.coli及豬霍亂沙門(mén)氏菌菌體后，每個(gè)孔洞加入100μl含頭孢曲松(ceftriaxone)(100微克/毫升)的BME細(xì)胞培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置1小時(shí)，以殺滅Int 407細(xì)胞胞外的豬霍亂沙門(mén)氏菌細(xì)菌。再以0.01M PBS清洗各孔洞5次，加入100μl無(wú)菌triton X-100(1％)進(jìn)行10分鐘的細(xì)胞裂解作用后，以微量吸管劇烈混和各孔洞內(nèi)的混和液，取出混和液以0.01M PBS進(jìn)行系列稀釋?zhuān)誀I(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)法，經(jīng)培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)侵入Int 407細(xì)胞內(nèi)的豬霍亂沙門(mén)氏菌菌數(shù)。
由結(jié)果可得知，本發(fā)明的嗜酸乳桿菌對(duì)于豬霍亂沙門(mén)氏菌的抑制侵入作用，于一小時(shí)作用后，可達(dá)102～103CFU/毫升；于2個(gè)小時(shí)的豬霍亂沙門(mén)氏菌侵入作用后，可抑制超過(guò)103CFU/毫升(圖2)。
五、以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)定TNF-α及IL-6濃度小鼠受沙門(mén)氏菌侵入感染時(shí)，第一個(gè)反應(yīng)的細(xì)胞為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞除吞噬作用外，也會(huì)分泌一些細(xì)胞激素，主要有TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和IL-12，這些細(xì)胞激素可以在局部感染組織作用或全身性作用。巨噬細(xì)胞在未被激活時(shí)，TNF-α的產(chǎn)量極少(Beutler et al.，1986)，革蘭氏陰性菌通常以脂多醣(LPS)刺激巨噬細(xì)胞(Balkwill et al.，2000)，因此，TNF-α能作為受到沙門(mén)氏菌初期感染的重要指標(biāo)(Nauciel and Espinasse-Maes，1992)，產(chǎn)生的TNF-α在局部作用可以活化血管內(nèi)皮細(xì)胞，增加血管通透性、IgG、補(bǔ)體和細(xì)胞的進(jìn)入，若引起肝臟和脾臟巨噬細(xì)胞釋放TNF-α至全身，則會(huì)造成敗血癥，這是一種全身性的血管擴(kuò)張?jiān)斐纱罅矿w液流至組織，造成正常血液無(wú)法供應(yīng)，導(dǎo)致器官衰竭，稱(chēng)為敗血性休克。IL-6在局部感染時(shí)，可活化淋巴細(xì)胞和增加抗體制造，若釋放至全身則會(huì)發(fā)燒和誘導(dǎo)急性期蛋白質(zhì)的制造，引起系統(tǒng)性的發(fā)炎(Hirano，1992)。在發(fā)炎反應(yīng)中，TNF-α在受刺激后15-30分鐘內(nèi)便增加其mRNA的量，而IL-6產(chǎn)生的時(shí)間則較晚，因此，測(cè)定TNF-α及IL-6的產(chǎn)量可了解整個(gè)發(fā)炎反應(yīng)的嚴(yán)重程度。
(一)以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定TNF-α的濃度1.根據(jù)Endogen(Woburn，MA.，USA)公司所提供的標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行取100μl的抗老鼠TNF-α單克隆抗體(1.03微克/毫升于吸附緩沖液中)加至ELISA平底盤(pán)孔洞內(nèi)，在室溫下靜置隔夜(約14至16小時(shí))使其附著(coating)至盤(pán)底。去除吸附緩沖液后，每個(gè)孔洞加入200μl的阻斷緩沖液(以分析緩沖液填塞)，室溫下靜置1小時(shí)后，除去阻斷緩沖液，再以清洗緩沖液輕輕沖洗三次。取抗老鼠TNF-α生物素-標(biāo)記的單克隆抗體(0.25微克/毫升)50μl于孔洞內(nèi)，再加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品(小鼠肝臟磨碎后的血清)，于室溫下靜置2小時(shí)后，倒除孔洞內(nèi)的混和液，以清洗緩沖液清洗三次后，每個(gè)孔洞加入100μl的HRP-共軛化鏈霉菌抗生物素蛋白(streptavidin)(0.125微克/毫升)，室溫下作用30分鐘后，以清洗緩沖液清洗五次，以上清洗步驟于完畢后皆必須將96孔洞微量平底盤(pán)倒扣于紙巾上，吸去殘存液體。最后每個(gè)孔洞加入100μl的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)基質(zhì)溶液，室溫下避光作用30分鐘使的進(jìn)行顯色反應(yīng)，最后加入100μl的0.18M硫酸溶液，終止顯色反應(yīng)。以ELISA讀計(jì)于波長(zhǎng)450nm下讀取吸光值，并依標(biāo)準(zhǔn)曲線換算TNF-α的濃度。
2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作依Endogen公司提供的說(shuō)明書(shū)所建議，以400μl分析緩沖液溶解TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品(老鼠TNF-αELISA標(biāo)準(zhǔn)品)(TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品于復(fù)溶后1小時(shí)內(nèi)使用)，使其濃度為2450pg/毫升，再以分析緩沖液進(jìn)行2倍連續(xù)稀釋?zhuān)郎鲜龇治龇椒y(cè)定各濃度TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品波長(zhǎng)450nm下的吸光值，將結(jié)果制作成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(二)以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定IL-6濃度1.根據(jù)Endogen(Woburn，MA.，USA)公司提供的標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行取100μl的抗老鼠IL-6單克隆抗體(2.5微克/毫升)加入ELISA平底盤(pán)孔洞內(nèi)，在室溫下靜置隔夜(約14至16小時(shí))，使初級(jí)抗體吸附至盤(pán)底。去除吸附緩沖液后，每個(gè)孔洞加入200μl的分析(阻斷)緩沖液(4％BSA于PBS中)，室溫下靜置1小時(shí)后，除去阻斷緩沖液，以200μl清洗緩沖液(50mM Tris，0.2％Tween-20，pH8.0)輕輕沖洗三次。取50μl的抗老鼠IL-6生物素標(biāo)記的單克隆抗體(0.25微克/毫升于分析緩沖液中)于孔洞內(nèi)，再加50μl的標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品(小鼠心臟采血的血清)，于室溫下靜置2小時(shí)后，倒除孔洞內(nèi)的混和液，以清洗緩沖液清洗三次后，每個(gè)孔洞加入100μl的HRP-共軛化鏈霉菌抗生物素蛋白(0.125微克/毫升于分析緩沖液中)，室溫下作用30分鐘后，以清洗緩沖液清洗五次，以上清洗步驟在完畢后皆必須將96孔洞微量平底盤(pán)倒扣于紙巾上，吸去殘存液體。最后每個(gè)孔洞加入100μl的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)基質(zhì)溶液，室溫下避光作用30分鐘使之進(jìn)行顯色反應(yīng)，最后加入100μl的0.18M硫酸溶液，終止顯色反應(yīng)。以ELISA讀計(jì)于波長(zhǎng)490nm下讀取吸光值，并依標(biāo)準(zhǔn)曲線換算IL-6的濃度。
2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作依Endogen公司提供的說(shuō)明書(shū)所建議，以400μl分析緩沖液溶解IL-6標(biāo)準(zhǔn)品(老鼠IL-6ELISA標(biāo)準(zhǔn)品)，使其濃度為2450pg/毫升，再以分析緩沖液進(jìn)行2.5倍連續(xù)稀釋至38.4pg/毫升，依上述分析方法測(cè)定各濃度IL-6標(biāo)準(zhǔn)品于波長(zhǎng)490nm下的吸光值，將結(jié)果制作成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
本研究針對(duì)小鼠抑制沙門(mén)氏菌較佳的動(dòng)物來(lái)源乳酸菌，將感染3和6天后的肝臟組織的血清檢測(cè)TNF-α含量，結(jié)果顯示只喂PBS的小鼠，無(wú)法抑制沙門(mén)氏菌侵入，所以其發(fā)炎指標(biāo)的TNF-α產(chǎn)量在感染6天后明顯增加。LASW抑制沙門(mén)氏菌侵入能力最佳，所以其感染6天后的TNF-α含量最低；IL-6的檢測(cè)亦有相同的結(jié)果(圖3)。
經(jīng)上述實(shí)施例及參考附圖后，應(yīng)明了本發(fā)明并非限于上述這些實(shí)施例中。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在不悖離本發(fā)明說(shuō)明書(shū)及權(quán)利要求所定義的范圍及精神的情況下，當(dāng)可進(jìn)行不同變化及改進(jìn)，亦屬本發(fā)明的范疇中。
權(quán)利要求
1.一種嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)LASW，其特征是保藏號(hào)為CCTCC NOM204083，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嗜酸乳桿菌LASW，其特征是具有耐酸性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嗜酸乳桿菌LASW，其特征是具有耐膽鹽性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嗜酸乳桿菌LASW，其特征是具有腸道吸附性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嗜酸乳桿菌LASW，其特征是具有抑制病原菌的功效。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嗜酸乳桿菌，其特征是該病原菌選自包括沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌及葡萄球菌屬所組成的群組。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嗜酸乳桿菌LASW，其特征是具有抑制侵入性病原菌對(duì)腸道細(xì)胞的吸附及抑制侵入轉(zhuǎn)移至肝與脾臟的功效。
8.一種生菌劑組合物，其特征是包括權(quán)利要求1所述的嗜酸乳桿菌LASW。
9.一種飼料組合物，其特征是包括權(quán)利要求1所述的嗜酸乳桿菌LASW。
10.一種預(yù)防或治療病原菌感染的醫(yī)藥組合物，其特征是包括權(quán)利要求1所述的嗜酸乳桿菌LASW。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新穎的嗜酸乳桿菌LASW，其具有優(yōu)良的耐動(dòng)物消化液的特性，并對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和其它葡萄球菌具抑制作用。此外，其對(duì)人類(lèi)及動(dòng)物的腸道上皮細(xì)胞均具有良好的吸附性，并可抑制細(xì)菌侵入動(dòng)物腸道上皮細(xì)胞中，因而降低細(xì)菌移轉(zhuǎn)至肝及脾臟造成的感染。本發(fā)明的嗜酸乳桿菌可適用于酸奶、生菌劑、飼料添加劑產(chǎn)品中，具有調(diào)整動(dòng)物腸胃功能的優(yōu)良效果。
文檔編號(hào)A61K35/74GK1940060SQ200510105459
公開(kāi)日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2005年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月28日
發(fā)明者曾浩洋, 余碧, 蔡政志, 蔡筱琪, 林文鑫 申請(qǐng)人:曾浩洋