專利名稱：厚殼貽貝的提取物、制造方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于含有來自哺乳動物或鳥類之外的動物的原材料或其與不明結(jié)構(gòu)之反應(yīng)產(chǎn)物的提取物的醫(yī)用配制品領(lǐng)域，具體屬于厚殼貽貝的提取物、制造方法及其在制藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
海洋是一個巨大的藥源寶庫。至今，從海洋動物、植物中獲得的新型化合物1000多種，其中1/2以上具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等藥理活性。海洋藥物的研究目前已成為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究趨勢。貽貝與其它貝類相比，產(chǎn)量高且價格低。貽貝，異名殼菜、海紅、紅蛤等，拉丁名Mytilus edulis；英文名mussel。主要品種有1.紫貽貝(Mytilus galloprovincilis Linaeus)，生活于近岸、內(nèi)灣淺海的巖礁上，一年性成熟，山東、遼寧沿岸產(chǎn)量最大；2.厚殼貽貝(Mytiluscorusis Lischke)，貝殼比紫貽貝長而厚，生活在較開闊的海中巖石上，浙江一帶多在8-10米深處，浙江舟山地區(qū)產(chǎn)量最高；3.翡翠貽貝(Pema viridis Linnaeus)，生活于干潮線至水深5-6米水流通暢處的巖石上，分布于我國東海和南海，以海南島產(chǎn)量最高。
貽貝性味溫咸，無毒，入肝、腎經(jīng)。具有補肝腎，益精血，消癭瘤，止痢的功用，自古就有藥用記載。如《本草拾遺》記載貽貝“主虛嬴勞損，因產(chǎn)瘦瘠，血氣結(jié)積，腹冷，腸鳴，下痢腰疼，帶下等癥”?！度杖A子本草》記載“煮熟食之，能補五臟，益陽事，理腰腳氣，消宿食，除腹中冷氣，痃癖等”。貽貝還可治療風(fēng)濕、頭暈及盜汗，有潤肺化痰之功效。
流行性感冒簡稱“流感”，是由流感病毒引起的具有高度傳染性的急性呼吸道傳染病，也是人類至今尚不能有效控制的世界性公共衛(wèi)生問題。流感病毒為RNA病毒，傳染性強，傳播迅速。對流感病毒目前還未有特效藥。主要是對癥治療，包括解熱止痛和防治繼發(fā)細菌感染。對付流感最經(jīng)濟、有效的方法是采取積極的預(yù)防措施。但流感病毒變異快，疫苗的保護范圍小，時間短，每年都需接種。因此，開發(fā)能預(yù)防和治療流感病毒新藥成為目前當(dāng)務(wù)之急。PCT專利文獻報道(WO81/03124，
公開日期1981年11月12日)，從貽貝(blue mussel，翡翠貽貝)中提取分離得到的多肽類物質(zhì)具有廣譜抗病毒、抗細菌感染、促進傷口愈合等生物活性。俄羅斯專利(RU2043109，
公開日期1995年9月10日和RU2165264，
公開日期2001年4月20日)公開了貽貝科(Mytilidae family)動物提取物具有抗病毒功能，作為食品添加劑使用。
我國對貽貝的開發(fā)利用，附加值還較低，目前市場上只有貽貝制成的干貨、罐頭、調(diào)味料、保健食品等。國內(nèi)有關(guān)文獻報道，一種從貽貝生產(chǎn)加工剩余物中制取的糖類和蛋白質(zhì)復(fù)合物稱為米季蘭—新型免疫調(diào)節(jié)劑(保健食品)。沒有毒性并無刺激性和過敏性作用，具有顯著的消炎和抗壞死作用。目前，國內(nèi)外尚無貽貝類物質(zhì)用于新藥的報道。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人經(jīng)過廣泛研究，對比了四種不同的貽貝原料，研究了幾十種水解和提取工藝方法，對本發(fā)明的提取物進行了廣泛的體外活性測定和動物體內(nèi)藥效試驗，從而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一是提供厚殼貽貝的提取物，可以用于制備藥物。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二是提供厚殼貽貝提取物的制造方法。
本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供厚殼貽貝提取物的醫(yī)藥用途。
本發(fā)明公開了厚殼貽貝的提取物，其特征在于總氮12-16mg/mL、蛋白質(zhì)濃度15-20mg/mL、氨基氮含量8.5-15mg/mL，其pH5.0-6.0。
優(yōu)選地厚殼貽貝的提取物，總氮12.5-14mg/mL、蛋白質(zhì)濃度15-18mg/mL、氨基氮含量10-13mg/mL，其pH5.3-5.8。
更優(yōu)選地厚殼貽貝的提取物，包括天冬氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸，氨基酸總量為11-14g/100mL提取物。
總氮用常用的凱氏定氮法測定，蛋白質(zhì)濃度用常用的考馬斯亮藍法測定，氨基氮用常用的滴定法測定，氨基酸含量的測定采用商品化的氨基酸自動分析儀并按照廠家提供的方法操作或按照本領(lǐng)域常用OPA法或者PTC-AA法或茚三酮法測定。
厚殼貽貝的提取物的制備方法，包括如下步驟(a)厚殼貽貝，清洗，去殼；(b)厚殼貽貝肉勻漿；(c)水解；(d)用弱堿性樹脂脫酸、去雜；(e)對去雜后溶液進行濃縮。
優(yōu)選地，還包括將濃縮液進行滅菌的步驟。
本發(fā)明厚殼貽貝的提取物的制備方法所采用的貽貝原料是新鮮采集的厚殼貽貝或者是冷凍的厚殼貽貝。
本發(fā)明厚殼貽貝的提取物的制備方法，其中水解步驟的條件是厚殼貽貝的勻漿液pH調(diào)至6.0-7.5，添加0.1％-1.0％(重量百分比)的Flavourzyme酶，45-55℃，攪拌反應(yīng)3h-20h，獲得水解液。
優(yōu)選地，在Flavourzyme酶水解前將勻漿液pH調(diào)至6.0-7.0，加入0.1％-1.0％(重量百分比)的Neutrase酶，40-50℃，攪拌反應(yīng)3h-4h；然后將勻漿液pH調(diào)至6.0-7.5，添加0.1％-1.0％(重量百分比)的Flavourzyme酶，50℃，攪拌反應(yīng)3h-20h，獲得水解液。
本發(fā)明厚殼貽貝的提取物的制備方法的水解步驟也可以如下進行在Flavourzyme酶水解前將勻漿液pH調(diào)至7.0-8.0，加入0.1％-1.0％(重量百分比)的Protamax酶，50-60℃，攪拌反應(yīng)3h-5h；然后將勻漿液pH調(diào)至6.0-7.5，添加0.5％-1.0％(重量百分比)的Flavourzyme酶，50℃，攪拌反應(yīng)5h-10h，獲得水解液。
更優(yōu)選地，水解步驟還包括鹽酸水解步驟，例如厚殼貽貝的勻漿液用1.2N～6N鹽酸水解6-15h，優(yōu)選地用1.2N～3N或者用3N～6N鹽酸水解6-15h，然后進行前述的酶水解操作。
在本發(fā)明的說明中提及的Flavourzyme酶、Protamax酶、Neutrase酶均有商品化產(chǎn)品，Novozyme產(chǎn)品。酶用量重量百分比的含義表示酶與厚殼貽貝肉的重量百分比。
其中純化步驟為將獲得的水解液分別稀釋3-20倍，用弱堿性離子交換樹脂脫酸、去雜，樹脂∶水解液＝1∶2.8-1∶5.6，獲得厚殼貽貝的提取物。所說的弱堿性離子交換樹脂在本領(lǐng)域是已知的，例如弱堿性樹脂D303或弱堿性樹脂701，脫酸操作或分批操作、或者采用本領(lǐng)域常用的層析柱進行。
濃縮的方法在本領(lǐng)域是已知的，如真空濃縮等。滅菌的方法是高壓滅菌或過濾滅菌。
本發(fā)明厚殼貽貝提取物中總氮12-16mg/mL、蛋白質(zhì)濃度15-20mg/mL、氨基氮含量8.5-15mg/mL，其pH5.0-6.0，重金屬含量符合中華人民共和國藥典要求。體外活性檢測最大無毒濃度(TC0)20％，最小有效抑制濃度(IC0)5％，TI值4。并測定提取物中至少有17種氨基酸，包括天冬氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸，氨基酸總量為11-14g/100mL。
本發(fā)明厚殼貽貝提取物的制備方法利用我國產(chǎn)量高，價格低的海洋生物厚殼貽貝為原料，開發(fā)出工藝簡單，成本低廉，制備工藝易于大生產(chǎn)的技術(shù)路線。
抗流感病毒的藥效試驗證明本發(fā)明厚殼貽貝提取物比俄羅斯專利產(chǎn)品顯示了更強的體內(nèi)外活性。體外模型試驗顯示，本發(fā)明厚殼貽貝提取物具明顯的抗SARS病毒、保護被感染細胞的活性作用。
動物實驗顯示本發(fā)明厚殼貽貝的提取物大、中劑量對小鼠巨噬細胞免疫應(yīng)答的形成有一定增強作用，可在一定程度上增強機體的體液免疫功能，恢復(fù)免疫低下鼠的抗體形成能力。本發(fā)明厚殼貽貝的提取物具有增強免疫低下鼠B淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力的作用。對免疫低下鼠T淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力有升高的趨勢。
本發(fā)明厚殼貽貝的提取物開發(fā)成劑型簡單的提取物，可用于臨床上治療或預(yù)防流行感冒，服用方法每天3次，口服，劑量為20mL/次。
本發(fā)明厚殼貽貝的提取物開發(fā)成劑型簡單的提取物，可用于免疫調(diào)節(jié)。
以下結(jié)合具體的實施方式詳細說明本發(fā)明。在詳細說明了這些具體的實施方式后，本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員結(jié)合上述說明會充分知曉如何設(shè)計其他可靠方法，從而通過應(yīng)用本發(fā)明的成果來獲得同樣的信息。因此，無論這些具體的實施方式記載的如何詳細具體，都不得理解為對本發(fā)明的范圍的任何限制。本發(fā)明的范圍僅僅由權(quán)利要求的法律結(jié)構(gòu)所限定。
具體實施例方式
實施例1 厚殼貽貝的提取物的制備從我國浙江舟山群島采集鮮活、外殼鮮亮，個體大小和重量基本相等的厚殼貽貝，清洗，去殼，洗去泥沙。存入-20℃冰箱保藏。取出保存的厚殼貽貝冷凍品，解凍，煮沸1-2h，濾出干物質(zhì)，勻漿。將原料漿液pH調(diào)至6.0，添加0.1％(與原料比)丹麥Novozymes生產(chǎn)的Neutrase酶，45℃，攪拌反應(yīng)3h；然后煮沸，pH調(diào)至6.8，添加1％(與原料比)Flavourzyme酶，50℃，攪拌反應(yīng)3h，煮沸。獲得水解液。將獲得的水解液稀釋10倍，用裝有弱堿性樹脂D303的離子交換柱去雜，獲得pH為5.0左右的粗產(chǎn)品。將獲得的粗產(chǎn)品在50℃的旋轉(zhuǎn)真空濃縮儀中濃縮至產(chǎn)品含氮量為10-15mg/ml的提取物。
實施例2 貽貝原材料的選擇分別在不同產(chǎn)地購回了原料。制備成凍干粉，或去殼后冰凍保藏。用已確定的生產(chǎn)工藝制備成樣品，測定其氨基N、總N和體內(nèi)活性。比較各原料優(yōu)劣，如表1。
表1 貽貝原材料的選擇

注出肉率＝鮮貝肉重量/帶殼鮮貝重量。干物質(zhì)含量＝干物質(zhì)重量/鮮貝肉重量。60℃恒溫烘干鮮貝肉，恒重三次，稱重。
干物質(zhì)和酸解液中總氮含量，厚殼貽貝明顯要高。對干貽貝、翡翠貽貝和厚殼貽貝制備樣品進行了老鼠流感病毒模型體內(nèi)活性測試，統(tǒng)計鼠的平均生活天數(shù)，厚殼貽貝與陽性對照物雙黃連(9.61天)的接近為9.33天，比空白病毒對照(6.17天)高3.16天。故用厚殼貽貝作原料。
實施例3 測定樣品中氨基酸含量取實施例1的提取物，按照本領(lǐng)域常用的RP-HPLC、OPA法測定測定氨基酸含量(夏其昌主編，《蛋白質(zhì)化學(xué)研究技術(shù)與進展》，北京科學(xué)出版社，1999年30-32。)，結(jié)果為氨基酸12.5g/100mL提取物。
實施例4 本發(fā)明厚殼貽貝的提取物與俄羅斯商品各項檢測指標比較將本發(fā)明產(chǎn)品與俄羅斯商品分別檢測各項質(zhì)控指標，數(shù)據(jù)如表2顯示本發(fā)明各項指標如總氮、蛋白質(zhì)濃度、氨基氮含量等均與俄羅斯商品接近，但水解轉(zhuǎn)化率較高。體外對狗腎細胞毒性較低，產(chǎn)品體外抗流感活性很高。
表2 本發(fā)明與俄羅斯商品各項檢測指標比較

注1)水解率＝氨基氮/總氮2)細胞毒性以狗腎細胞為模型，樣品對狗腎細胞最大無毒濃度。
3)體外活性以狗腎細胞為模型，樣品抑制狗腎細胞病變率。
實施例5 本發(fā)明厚殼貽貝的提取物體外藥效試驗說明1#樣品為本發(fā)明產(chǎn)品，2#樣品為俄羅斯專利保健品米其-K試驗?zāi)康?
觀察樣品體外對流感病毒(A3/京科/30/95)的藥效作用。
試驗材料1#、2#樣品由本發(fā)明申請人提供；陽性對照藥物—利巴韋林原料藥，主要用于呼吸道合胞病毒引起的病毒性肺炎與支氣管炎，用量為一日三次，每次75mg/kg；為廣東肇慶星湖制藥廠產(chǎn)品，批號為10638。利巴韋林供試液1mg/ml利巴韋林溶液稱取利巴韋林原料10mg，加入細胞培養(yǎng)液溶解，配成1mg/ml溶液，濾膜過濾。毒株流感病毒(A3/京科/30/95)，由上海市衛(wèi)生防疫站提供，傳代保存。細胞模型狗腎細胞MDCK細胞。
藥物細胞毒性試驗MDCK細胞在96孔培養(yǎng)板單層培養(yǎng)37℃，5％CO2培養(yǎng)24小時，分別加入不同濃度藥液(40、20、10、5、2.5％)，經(jīng)72小時觀察毒性及用MTT法測定OD值，計算藥物致細胞毒性TC0細胞病變抑制試驗MDCK細胞在96孔培養(yǎng)板單層培養(yǎng)37℃，5％CO2培養(yǎng)24小時，加入30TCID50病毒液，37℃，5％CO2吸附2小時，吸去病毒，加入最大無毒濃度下藥液，經(jīng)37℃，5％CO2培養(yǎng)72小時，觀察CPE(病變)，設(shè)細胞對照組，病毒對照組，陽性對照組(利巴韋林)及藥物組，與實驗組同時觀察CPE，測定OD值，確定樣品有效抑制病變濃度(IC0)及治療指數(shù)TI值。
結(jié)論經(jīng)體外試驗結(jié)果(表3)顯示1#樣品對MDCK細胞最大無毒濃度(TC0)為20％，在5％濃度下能抑制(IC0)流感A3病毒，TI值為4，抑制效果與250μg/ml利巴韋林相接近。而俄羅斯樣品2#對MDCK細胞最大無毒濃度(TC0)為2.5％，無明顯抑制流感A3病毒作用。
表3 樣品對流感病毒致細胞病變的抑制作用

注+表示抑制病變(≥50％)，-表示未見抑制，±表示略見抑制(≤25％)。未見毒性表示細胞存活≥90％，略見毒性表示細胞存活≥80％，明顯毒性表示細胞存活≤50％實施例6本發(fā)明與俄羅斯專利商品體內(nèi)藥效試驗對比說明1#樣品為本發(fā)明產(chǎn)品，2#樣品為俄羅斯專利保健品米其-K試驗?zāi)康挠^察樣品體內(nèi)預(yù)防和治療A1型(H1N1)流感病毒的藥效作用。
試驗材料受試藥物由本發(fā)明申請人提供；陽性對照藥物利巴韋林原料藥，主要用于呼吸道合胞病毒引起的病毒性肺炎與支氣管炎，用量為一日三次，每次75mg/kg；為廣東肇慶星湖制藥廠產(chǎn)品，批號為10638。75mg/kg利巴韋林提取物稱取利巴韋林原料300mg，加入0.5％CMC溶液100ml，配成0.3％懸浮液，每次給藥0.5ml/20g小鼠，一日一次。毒株流感病毒A1型(H1N1)鼠肺適應(yīng)株FM1感染鼠肺懸液，由北京中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所提供，經(jīng)傳代保存。動物昆明小鼠，體重17～21克，雌雄兼用。復(fù)旦大學(xué)實驗動物科學(xué)部提供，許可證號scxk滬2002-0002。
樣品體內(nèi)抗流感病毒藥效試驗1#樣品對小鼠死亡日期的影響方法取小鼠，隨機分組，每組16只，雌雄各半，分組與給藥次數(shù)及感染病毒量同上試驗。感染后開始觀察小鼠死亡情況，記錄死亡數(shù)。
試驗結(jié)果見表4樣品對小鼠死亡日期的影響，采用計算死亡中位數(shù)法進行數(shù)據(jù)處理。
樣品對小鼠流感后，生命延長試驗方法取小鼠(17-21g)，隨機分組，每組16只，雌雄各半，實驗設(shè)(1)、病毒對照組(2)、陽性對照組(利巴韋林)75mg/kg(3)、2#藥，口服，0.5ml/20g鼠(4)、1#藥，口服，1ml/20g鼠(5)、1#藥，口服，0.5ml/20g鼠(6)、1#藥，口服，0.25ml/20g鼠(7)、正常對照組生理鹽水，0.2m1/10g/d×6口服給藥，每日一次，共給藥7天。病毒感染10-2，55-60μL/只。繼續(xù)給藥三天，共觀察一周，記錄死亡數(shù)，作統(tǒng)計學(xué)處理，計算死亡中位數(shù)和死亡日期范圍及平均生活日和生命延長％，并計算P值。
試驗結(jié)果見表5、6
樣品對小鼠存活天數(shù)的影響，采用Stat View Ver 5.01 SAS Institute Inc軟件進行Mann-Whitney檢驗和統(tǒng)計學(xué)處理。經(jīng)試驗，結(jié)果顯示與病毒對照組比較，給藥50ml/kg、25ml/kg、12.5ml/kg，1#藥生命延長60.1％、52.8％、47.2％，小鼠口服給藥25ml/kg，2#藥生命延長46.0％。
表4 樣品對小鼠死亡日期的影響

結(jié)論根據(jù)以上試驗可見樣品經(jīng)小鼠模型試驗，其對小鼠存活天數(shù)的影響，采用Stat Vie Ver 5.01 SAS Institute Inc軟件進行Mann-Whitney檢驗和統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果顯示與病毒對照組比較，給藥50ml/kg、25ml/kg、12.5ml/kg，1#藥生命延長60.1％、52.8％、47.2％，小鼠口服給藥25ml/kg，2#藥生命延長46.0％。預(yù)防和治療流感病毒A1型(H1N1)，經(jīng)小鼠模型試驗顯示相同濃度下，1#藥比2#藥效果好。
表5 樣品對小鼠流感抑制試驗(X±SD)平均生活時間(天)

注*P＞0.05**P＜0.05***P＜0.01表6 樣品對小鼠生存時間延長試驗

實施例7 本發(fā)明與抗流感中藥雙黃連藥效比較及給藥劑量試驗試驗?zāi)康挠^察樣品體內(nèi)預(yù)防A1型(H1N1)流感病毒的藥效作用。
試驗試藥物由本發(fā)明申請人提供，為1#藥。
陽性對照藥物雙黃連提取物毒株流感病毒(A3/京科/30/95)，由上海市衛(wèi)生防疫站提供，傳代保存。流感病毒A1型(H1N1)鼠肺適應(yīng)株FM1感染鼠肺懸液，由北京中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所提供，經(jīng)傳代保存。
動物昆明小鼠，體重13～15克，雌雄兼用。許可證號scxk滬2002-0002實驗取小鼠，隨機分組，每組18只，雌雄各半，(1)病毒對照組；(2)陽性對照組(雙黃連)0.24ml/鼠?？诜o藥7天，病毒感染10-2，30μL/只，繼續(xù)給藥6天，共觀察14天。每天記錄死亡數(shù)，作統(tǒng)計學(xué)處理，計算死亡中位數(shù)和死亡日期范圍及平均生活日和生命延長％，并計算P值。試驗結(jié)果見表7、表8。藥品1#對小鼠存活天數(shù)的影響，采用SPSS For Windows11.5軟件進行T檢驗和統(tǒng)計學(xué)處理。經(jīng)試驗，結(jié)果顯示與病毒對照組比較，1#藥口服給藥0.3ml/鼠、0.55ml/鼠、0.8ml/鼠，生命延長51.22％、22.37％、16.21％。
表7 樣品對小鼠死亡日期的影響

結(jié)論本次實驗結(jié)果1#藥劑量0.3ml/鼠與以前老鼠體內(nèi)藥效試驗結(jié)果相同。1#藥劑量0.3ml/鼠與雙黃連的效果接近。
表8 樣品對小鼠流感抑制試驗(X±SD)

實施例8 本發(fā)明提取物抗SARS病毒測試結(jié)果測試原理以Vero-E6細胞作為病毒宿主細胞(易感細胞)，測試樣品抵抗病毒感染細胞的作用，檢測指標為細胞變性反應(yīng)(CPE)以及感染細胞保護率。
測試材料和方法病毒株BJ-01，來源于北京軍科院微生物流行病研究所實驗場所上海疾病預(yù)防控制中心P3實驗室樣品處理樣品溶于培養(yǎng)液或DMSO，配成適宜的初始濃度，5倍稀釋，3個稀釋度。
測試方法把Vero-E6細胞在96孔培養(yǎng)板于37℃，5％CO2單層培養(yǎng)，SARS病毒感染細胞后，分別加入不同濃度藥液，設(shè)細胞對照組，病毒對照組，及藥物組，每日鏡下觀察結(jié)果，記錄CPE，并用中性紅染色測定OD值，參照對照進行樣品抗SARS病毒活性作用的計算和評價。
表9 本發(fā)明提取物抗SARS病毒測試

細胞病變法(CPE)以“-”表示細胞附著形態(tài)完整，未見明顯脫離，但不比較細胞數(shù)量的多少，以“+”表示細胞病變程度，＜25％+，25％～50％++，50％～75％+++，＞75％++++。
被感染細胞保護率通過比較病毒對照、細胞對照和樣品對照的OD值，計算樣品對病毒感染細胞的保護活性，保護率＞EC20初步被認為樣品對被病毒感染的細胞具有一定的保護作用，有抗病毒活性。
樣品細胞毒性如果樣品的細胞毒性與細胞對照比大于50(＞CC50)時，不給CEP評價和保護率計算。
結(jié)論試驗結(jié)果見表9。所檢測樣品在體外篩選模型中，在6.25％濃度時有明顯抗SARS病毒、保護被感染細胞作用。
實施例9 特異性細胞免疫應(yīng)答遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)動物 昆明種小鼠，雌雄各半，19-23g。
試劑與藥品2.4-二硝基氟苯(DNFB)于實驗當(dāng)天新鮮稱取DNFB 50mg，置清潔青瓶中，加入預(yù)先配制好的溶液(丙酮∶麻油＝1∶1)5ml混勻，加塞膠布密封，配成1％DNFB。
鹽酸左旋咪唑[(-)-Tetramisole hydrochloride minimum]sigma公司，批號L9756-5G。取一定量40mg鹽酸左旋咪唑加入0.5％CMC研磨混勻至定體積20ml(0.1ml/10g，2mg/ml)4℃貯存，備用。給藥劑量20mg/kg。
實驗方法取小鼠(19-23g)，隨機分組，每組10只，雌雄各半，實驗設(shè)(1)、正常對照組生理鹽水，0.5ml/20g；(2)、模型組0.5％CMC，0.5ml/20g；(3)、陽性對照組(左旋咪唑)20mg/kg；(4)、實施例1厚殼貽貝的提取物大劑量，1ml/20g；(5)、實施例1厚殼貽貝的提取物中劑量，0.5ml/20g；(6)、實施例1厚殼貽貝的提取物小劑量，0.25ml/20g；口服給藥，0天開始給藥，每日一次(實施例1厚殼貽貝的提取物大劑量組每日劑量分二次給予)，共給藥6天。d1除正常對照組外，每鼠腹部去毛3cm×3cm，將1％DNFB溶液50ul均勻涂于去毛處。d6將1％DNFB溶液10ul均勻涂抹于小鼠右耳(兩面)進行攻擊，正常組同樣涂耳但未腹部致敏。攻擊后24h，頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳片，用打孔器取下直徑7mm的耳片，稱重。以左右耳片重量之差為腫脹度，同時取小鼠胸腺及脾臟稱重。分別以每10g小鼠的脾重(mg)和胸腺重(mg)作為脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。比較各組間差異，用SAS公司的statview軟件作檢驗ANOVA和Fisher’s PLSD檢驗。
結(jié)果與正常組比較，模型組小鼠右耳經(jīng)致敏原2.4-二硝基氟苯再次攻擊后24h，耳廓水腫、充血明顯。脾及胸腺指數(shù)無明顯變化，左旋咪唑20mg/kg增強右耳腫脹度，脾及胸腺指數(shù)無明顯變化(見表10)。
與模型組小鼠相比，口服實施例1厚殼貽貝的提取物大劑量(1ml/20g)，右耳腫脹度有一定的增加，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義；口服實施例1厚殼貽貝的提取物中劑量(0.5ml/20g)右耳腫脹度明顯的增加，有統(tǒng)計學(xué)意義。實施例1厚殼貽貝的提取物小劑量(0.25ml/20g)無作用。
結(jié)果說明實施例1厚殼貽貝的提取物中劑量和左旋咪唑20mg/kg明顯增強了小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。實施例1厚殼貽貝的提取物大劑量可能因兩次給藥，小鼠受刺激較多，對小鼠免疫應(yīng)答的形成有一定影響，增強耳腫作用僅有一定趨勢而無統(tǒng)計上顯著性差異。
結(jié)論實施例1厚殼貽貝的提取物中劑量(0.5ml/20g)和左旋咪唑20mg/kg可增強2.4-二硝基氟苯誘發(fā)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)；實施例1厚殼貽貝的提取物大劑量(1ml/20g)有一定的增強作用。
表10.實施例1厚殼貽貝的提取物對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

注藥物po qd×6，n＝10，x±s.與正常對照比較aP＜0.05，bP＜0.01，cP＜0.001；與模型組比較dP＜0.05，eP＜0.01，fP＜0.001.
實施例10 厚殼貽貝的提取物非特異性細胞免疫小鼠巨噬細胞吞噬中性紅試驗動物 昆明種小鼠，雄性，22-24g。
試劑與藥品1.環(huán)磷酰胺200mg/瓶，上海華聯(lián)制藥有限公司，批號050115。臨用前，用無菌生理鹽水5ml溶解，配制至50ml(4mg/ml)0.2ml/10g，供腹腔注射用。小鼠給藥劑量80mg/kg2.鹽酸左旋咪唑[(-)-Tetramisole hydrochloride minimum]sigma公司，批號L9756-5G。取一定量40mg鹽酸左旋咪唑加入0.5％CMC研磨混勻至定體積20ml(0.1ml/10g，2mg/ml)4℃貯存，備用。給藥劑量20mg/kg。
3.0.1％中性紅0.05g中性紅+50mlNS加熱至溶解，過濾，用前高壓滅菌。
實驗方法取小鼠，隨機分組，每組10只，實驗設(shè)(1)、正常對照組生理鹽水，0.5ml/20g(2)、環(huán)磷酰胺對照0.5％CMC，80mg/kg(3)、陽性對照組(左旋咪唑)+環(huán)磷酰胺預(yù)處理20mg/kg(4)、實施例1厚殼貽貝的提取物大劑量+環(huán)磷酰胺預(yù)處理，1ml/20g(5)、實施例1厚殼貽貝的提取物中劑量+環(huán)磷酰胺預(yù)處理，0.5ml/20g(6)、實施例1厚殼貽貝的提取物小劑量+環(huán)磷酰胺預(yù)處理，0.25ml/20g小鼠隨機分組，每組10只，包括正常組、環(huán)磷酰胺預(yù)處理的陰性對照組、環(huán)磷酰胺預(yù)處理+左旋咪唑組、環(huán)磷酰胺預(yù)處理+試藥各劑量組，左旋咪唑及試藥po qd×6，除正常組外，各組d2ip 5％巰乙醇酸鈉0.5ml/只；各組在d3ip環(huán)磷酰胺80mg/kg。D6將6組小鼠鼠脫頸處死，立即向腹腔內(nèi)注射1640 5ml，輕揉腹部50次，然后緩慢抽取腹腔液3ml于離心管中，(冰塊)4℃1000rpm，離心10分鐘，用1640洗細胞1次，1640-10％Fcs重懸細胞于培養(yǎng)液中。計數(shù)調(diào)節(jié)細胞數(shù)。吞噬功能的測定取0.2ml 2×106/ml腹腔巨噬細胞加入24孔板內(nèi)，置37℃、5％CO2條件下貼壁2小時，取出棄上清，NS漂洗，再加入0.1％中性紅生理鹽水液0.1ml，置37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)20分鐘，取出，棄上清，NS沖盡余液漂洗，加入0.1ml細胞溶解液(乙醇∶乙酸＝1∶1)，充分溶解后于540nm波長處比色。
結(jié)果與正常組比較，ip環(huán)磷酰胺80mg/kg，抑制了巨噬細胞吞噬中性紅；左旋咪唑20mg/kg可提高免疫抑制小鼠巨噬細胞吞噬作用。(見表11)與環(huán)磷酰胺組小鼠相比，口服實施例1厚殼貽貝的提取物大劑量(1ml/20g)，中劑量(0.5ml/20g)有一定的增強巨噬細胞吞噬的作用，具有統(tǒng)計學(xué)意義；口服實施例1厚殼貽貝的提取物小劑量(0.25ml/20g)無作用。
結(jié)果說明實施例1厚殼貽貝的提取物大、中劑量和左旋咪唑20mg/kg，對小鼠巨噬細胞免疫應(yīng)答的形成有一定增強作用。
結(jié)論結(jié)果說明實施例1厚殼貽貝的提取物大、中劑量和左旋咪唑20mg/kg，對小鼠巨噬細胞免疫應(yīng)答的形成有一定增強作用。
表11.實施例1厚殼貽貝的提取物對巨噬細胞吞噬中性紅的影響

注藥物po qd×6，n＝10，x±s.與正常對照比較aP＜0.05，bP＜0.01，cP＜0.001；環(huán)磷酰胺對照比較dP＜0.05，eP＜0.01，fP＜0.001.
實施例11 厚殼貽貝的提取物特異性體液免疫血清溶血素試驗動物昆明種小鼠，雄性，22-24g。
試劑與藥品
1.環(huán)磷酰胺200mg/瓶，上海華聯(lián)制藥有限公司，批號050115。臨用前，用無菌生理鹽水5ml溶解，配制至50ml(4mg/ml)0.2ml/10g，供腹腔注射用。小鼠給藥劑量80mg/kg2.鹽酸左旋咪唑[(-)-Tetramisole hydrochloride minimum]sigma公司，批號L9756-5G。取一定量40mg鹽酸左旋咪唑加入0.5％CMC研磨混勻至定體積20ml(0.1ml/10g，2mg/ml)4℃貯存，備用。給藥劑量20mg/kg。
3.動物羊血(SRBC)制備取保存羊血，8-10倍生理鹽水，輕混勻，2000rpm*10min*2，取SRBC壓積于一定體積生理鹽水配制懸液，小鼠ip2％懸液，0.2ml/只。
4.制備補體動脈放血，至少5只豚鼠血清混合，離心取上清，分裝，-70度保存。
5.待測血清眼球取血，室溫1小時分離，分裝，-20℃下凍存。
實驗方法取小鼠，隨機分組，每組10只，實驗設(shè)(1)、正常對照組生理鹽水，0.5ml/20g(2)、環(huán)磷酰胺對照ip 80mg/kg，口服0.5％CMC(3)、陽性對照組(左旋咪唑)+環(huán)磷酰胺預(yù)處理20mg/kg(4)、實施例1厚殼貽貝的提取物大劑量+環(huán)磷酰胺預(yù)處理，1ml/20g(5)、實施例1厚殼貽貝的提取物中劑量+環(huán)磷酰胺預(yù)處理，0.5ml/20g(6)、實施例1厚殼貽貝的提取物小劑量+環(huán)磷酰胺預(yù)處理，0.25ml/20g小鼠隨機分組，每組10只，包括正常組、環(huán)磷酰胺預(yù)處理的陰性對照組、環(huán)磷酰胺預(yù)處理+左旋咪唑組、環(huán)磷酰胺預(yù)處理+試藥各劑量組，左旋咪唑及試藥po qd×6，除正常組外各組d2ip 2％SRBC 0.5ml/只，d3，d5ip環(huán)磷酰胺80mg/kg，d6摘除眼球取血，收于塑料小管。取血1h后2000r/min×10min。收集血清，按1∶100稀釋血清，取稀釋血清0.2ml，10％0.1ml SRBC，補體0.2ml(1∶10稀釋)；對照管不加血清，37℃水浴30min，冰浴中止，5000r/min×10min，取上清0.2ml，405nm波長比色。50％溶血標準管10％SRBC 0.5ml溶于1.5ml蒸餾水中，為100％溶血，用NS對倍稀釋(2ml)后為50％溶血，混勻。取上清0.2ml，405nm波長比色。
CH50(u/ml)＝(測定管A/50％溶血管A)*稀釋血清倍數(shù)U/ml結(jié)果見表12.，環(huán)磷酰胺80mg/kg顯著抑制小鼠血清溶血素的產(chǎn)生，左旋咪唑顯示了其促免疫恢復(fù)作用。實施例1厚殼貽貝的提取物可部分對抗環(huán)磷酰胺的抑制作用，使血清溶血素產(chǎn)生量較環(huán)磷酰胺鼠有一定的升高(p＝0.018)；但僅大劑量實施例1厚殼貽貝的提取物(1ml/20g)升高血清溶血素的作用有統(tǒng)計學(xué)意義(p＝0.045)表12.實施例1厚殼貽貝的提取物對血清溶血素的影響

注藥物po qd×6，n＝10，x±s.與正常對照比較aP＜0.05，bP＜0.01，cP＜0.001；與環(huán)磷酰胺對照組比較dP＜0.05，eP＜0.01，fP＜0.001.
結(jié)論大劑量實施例1厚殼貽貝的提取物可在一定程度上增強機體的體液免疫功能，恢復(fù)免疫低下鼠的抗體形成能力。
實施例12 特異性細胞免疫淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗動物 昆明種小鼠，雄性，22-23g。
試劑與藥品環(huán)磷酰胺200mg/瓶，上海華聯(lián)制藥有限公司，批號050115。臨用前，用無菌生理鹽水5ml溶解，配制至50ml(4mg/ml)0.2ml/10g，供腹腔注射用。小鼠給藥劑量80mg/kg。
鹽酸左旋咪唑[(-)-Tetramisole hydrochloride minimum]sigma公司，批號L9756-5G。取一定量40mg鹽酸左旋咪唑加入0.5％CMC研磨混勻至定體積20ml(0.1ml/10g，2mg/ml)4℃貯存，備用。給藥劑量20mg/kg。
實驗方法(1)、正常對照組生理鹽水，0.5ml/20g(2)、環(huán)磷酰胺對照0.5％CMC，0.5ml/20g(3)、陽性對照組(左旋咪唑)+環(huán)磷酰胺預(yù)處理20mg/kg(4)、實施例1厚殼貽貝的提取物大劑量+環(huán)磷酰胺預(yù)處理，1ml/20g(5)、實施例1厚殼貽貝的提取物中劑量+環(huán)磷酰胺預(yù)處理，0.5ml/20g(6)、實施例1厚殼貽貝的提取物小劑量+環(huán)磷酰胺預(yù)處理，0.25ml/20g小鼠隨機分組，每組10只，包括正常組、環(huán)磷酰胺預(yù)處理對照組、左旋咪唑組、環(huán)磷酰胺預(yù)處理+試藥各劑量組，左旋咪唑及po試藥qd×6，除正常組外各組d3，d5 ip環(huán)磷酰胺80mg/kg，d6放血處死，每組小鼠脾臟混合后，釋放脾細胞，破壞紅細胞，洗二次，調(diào)各脾細胞濃度至1×107/ml。取該濃度的細胞懸液100μl及100μl ConA或LPS加至96孔培養(yǎng)板，(脾細胞1×107/ml 0.1ml，ConA 6μg/ml 0.1ml/孔，或LPS 20ug/ml 0.1ml/孔)，每個樣品加ConA或LPS的4復(fù)孔，不加刺激劑的8復(fù)孔，培養(yǎng)48h，加5mg/mlMTT 25ul(終濃度2mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4h后，取出培養(yǎng)板(可2000rpm×10min)離心取上清，結(jié)束前4小時，每孔加MTT 2mg/ml。結(jié)束培養(yǎng)后，加DMSO溶解液，使紫色結(jié)晶完全溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀(λ＝570nm)上比色。以光密度值代表淋巴細胞增殖能力。
結(jié)果1.結(jié)果見表13.，環(huán)磷酰胺使小鼠淋巴細胞的轉(zhuǎn)化能力顯著受抑，無論有否多克隆刺激劑的存在，左旋咪唑和實施例1厚殼貽貝的提取物大、中劑量對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫抑制小鼠的降低的淋巴細胞增殖能力，均有一定程度上的恢復(fù)。與環(huán)磷酰胺處理模型鼠相比，其升高均具有統(tǒng)計學(xué)意義。
表13.對淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗的影響

注藥物po qd×6，n＝10，x±s.與正常對照比較aP＜0.05，bP＜0.01，cP＜0.001；環(huán)磷酰胺對照比較dP＜0.05，eP＜0.01，fP＜0.001。
2.在LPS存在時，左旋咪唑和實施例1厚殼貽貝的提取物大、中劑量呈顯明顯協(xié)同刺激作用，對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫抑制小鼠的降低的淋巴細胞增殖能力，均有一定程度上的恢復(fù)。在ConA存在時，左旋咪唑和實施例1厚殼貽貝的提取物大、中劑量對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫抑制小鼠的降低的淋巴細胞增殖能力，均有一定程度上的恢復(fù)，但僅見左旋咪唑有統(tǒng)計學(xué)上意義(P＝0.0502)結(jié)論左旋咪唑和實施例1厚殼貽貝的提取物大、中劑量具有增強免疫低下鼠B淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力的作用。對免疫低下鼠T淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力有升高的趨勢。
權(quán)利要求
1厚殼貽貝的提取物，其特征在于總氮12-16mg/mL、蛋白質(zhì)濃度15-20mg/mL、氨基氮含量8.5-15mg/mL，pH5.0-6.0。
2根據(jù)權(quán)利要求1的厚殼貽貝的提取物，其特征在于總氮12.5-14mg/mL、蛋白質(zhì)濃度15-18mg/mL、氨基氮含量10-13mg/mL，其pH5.3-5.8。
3根據(jù)權(quán)利要求2的厚殼貽貝的提取物，其特征在于包括天冬氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸，總氨基酸含量為11-14g/100mL提取物。
4根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的厚殼貽貝的提取物的制造方法，包括如下步驟(a)厚殼貽貝，清洗，去殼；(b)厚殼貽貝肉勻漿；(c)水解；(d)用弱堿性樹脂脫酸、去雜；(e)對去雜后溶液進行濃縮。其特征在于，其中水解步驟的條件是厚殼貽貝的勻漿液pH調(diào)至6.0-7.5，添加0.1％-1.0％(重量百分比)的Flavourzyme酶，45-55℃，攪拌反應(yīng)3h-20h，獲得水解液。
5根據(jù)權(quán)利要求4的厚殼貽貝的提取物的制造方法，其特征在于在Flavourzyme酶水解前將勻漿液pH調(diào)至6.0-7.0，加入0.1％-1.0％(重量百分比)的Neutrase酶，40-50℃，攪拌反應(yīng)3h-4h；然后將勻漿液pH調(diào)至6.0-7.5，添加0.1％-1.0％(重量百分比)的Flavourzyme酶，50℃，攪拌反應(yīng)3h-20h，獲得水解液；將獲得的水解液分別稀釋3-20倍，用弱堿性離子交換樹脂去雜，樹脂∶水解液＝1∶2.8-1∶5.6，獲得厚殼貽貝的提取物。
6根據(jù)權(quán)利要求4的厚殼貽貝的提取物的制造方法，其特征在于在Flavourzyme酶水解前將勻漿液pH調(diào)至7.0-8.0，加入0.1％-1.0％(重量百分比)的Protamax酶，50-60℃，攪拌反應(yīng)3h-5h；然后將勻漿液pH調(diào)至6.0-7.5，添加0.5％-1.0％(重量百分比)的Flavourzyme酶，50℃，攪拌反應(yīng)5h-10h，獲得水解液；將獲得的水解液稀釋3-20倍，用弱堿性離子交換樹脂去雜，樹脂∶水解液＝1∶2.8-1∶5.6，獲得厚殼貽貝的提取物。
7根據(jù)權(quán)利要求4的厚殼貽貝的提取物的制造方法，其特征在于厚殼貽貝的勻漿液用1.2N～6N鹽酸水解6-15h，然后進行酶解。
8根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的厚殼貽貝的提取物在制備抗流感藥物中的應(yīng)用。
9根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的厚殼貽貝的提取物在制備抗SARS藥物中的應(yīng)用。
10根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的厚殼貽貝的提取物在制備免疫調(diào)節(jié)的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明厚殼貽貝的提取物、制造方法及其用途屬于含有來自哺乳動物或鳥類之外的動物的原材料或其與不明結(jié)構(gòu)之反應(yīng)產(chǎn)物的提取物的醫(yī)用配制品領(lǐng)域，具體屬于厚殼貽貝的提取物及其在制藥中的應(yīng)用。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供厚殼貽貝的提取物、其制造方法及其醫(yī)藥用途。本發(fā)明公開了厚殼貽貝的提取物，其特征在于總氮12－16mg/mL、蛋白質(zhì)濃度15－20mg/mL、氨基氮含量8.5－15mg/mL，pH5.0－6.0。其制造方法包括將厚殼貽貝，清洗，去殼；厚殼貽貝肉勻漿；水解；用弱堿性樹脂脫酸、去雜；濃縮等步驟。本發(fā)明厚殼貽貝的提取物可用于制備抗流感、抗SARS及免疫調(diào)節(jié)藥物。
文檔編號A61P43/00GK1771997SQ20051011009
公開日2006年5月17日 申請日期2005年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月7日
發(fā)明者唐軍, 汪蘭英, 張靈霞, 楊秀珍 申請人:上海新藥研究開發(fā)中心