專(zhuān)利名稱(chēng)：一種可透血腦屏障的脂質(zhì)體和以該脂質(zhì)體為載體的藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種可以透過(guò)血腦屏障的脂質(zhì)體，還涉及一種以該脂質(zhì)體為載體的藥物組合物及其制備方法。具體涉及一種含血腦屏障錨點(diǎn)的脂質(zhì)體，和一種以該脂質(zhì)體為載體包被有治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)有效量的藥物的藥物組合物及其制備方法。該藥物組合物具有較長(zhǎng)的血循環(huán)時(shí)間并能主動(dòng)透過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)達(dá)到治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用。
背景技術(shù)：
血腦屏障(blood-brain barrier，簡(jiǎn)稱(chēng)BBB)是由毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成的血液與腦組織間的屏障。它為腦組織提供了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，保障了腦袋正常功能。但是由于BBB的存在使得95％的藥物無(wú)法從血液進(jìn)入腦組織，特別是一些親水性，大分子藥物，因此多數(shù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物都難以透過(guò)血腦屏障達(dá)到理想的治療效果，一些脂溶性小分子(Mw小于500D)雖然容易透過(guò)BBB，但很快又被細(xì)胞膜上的高效外排泵攝入血液中(Begley DJ.The blood-brain barrierprinciples for targeting peptides and drugs to the central nervous system[J].J Pharm Pharmacol.1996，48(2)136-146.)。因此，對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)現(xiàn)一種能透過(guò)BBB的有效藥物傳遞方法與發(fā)現(xiàn)一種新藥同等重要。
為了克服BBB，已報(bào)道了不少方法，如(1)通過(guò)造成血液高滲而使腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接瞬時(shí)開(kāi)放，屏障作用消失；(2)將藥物做成適宜的親脂性前體藥物；(3)使用聚氰基丙烯酸酯(PACA)、聚乳酸(PLA)、乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)等材料的納米粒作為載體將藥物送入腦內(nèi)；(4)以免疫脂質(zhì)體為載體，脂質(zhì)體表面的單克隆抗體與BBB上相應(yīng)的受體發(fā)生特異性結(jié)合，啟動(dòng)受體介導(dǎo)的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)，從而使藥物透過(guò)BBB；(5)改變給藥途徑，例如通過(guò)鼻腔給藥等。但是方法(1)可能使一些有毒有害物質(zhì)在緊密連接瞬時(shí)開(kāi)放期間入腦，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，方法(2)由于高效外排泵的存在作用不大，方法(3)尚處于研究階段，且制備工藝復(fù)雜，設(shè)備條件要求高，而方法(4)則因脂質(zhì)體穩(wěn)定性較差和成本昂貴而不適合進(jìn)行普遍應(yīng)用(KREUTER J，ALYAUTDIN RN，KHARKEVICH DA，et al.Passage of peptides through theblood-brain barrier with colloidal polymer particles(nanoparticles)[J].Brain Res，1995，647(1)171-174.；SCHRODER U，SABEL BA..Nanoparticles，a drug carrier system to pass the blood-brain barrier，permit central analgesic effects of iv dalargin injections[J].BrainRes，1996，710(122)121-124.)。研究發(fā)現(xiàn)，在BBB中存在有吸收膠體類(lèi)物質(zhì)的運(yùn)輸系統(tǒng)，因此有研究者據(jù)此設(shè)計(jì)了一些藥物的膠體載體，如納米粒和脂質(zhì)體等，希望能通過(guò)該膠體載體使藥物透BBB而入腦(A.Prokop.Bioartificial organs in the twenty-first centurynanobiological devices.Ann.NY Acad.Sci.2001，944472-490.)。然而，此類(lèi)膠體載體經(jīng)注射入血后會(huì)被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)當(dāng)作異源物質(zhì)迅速清除，主要是被肝、脾的巨噬細(xì)胞吞噬。如普通脂質(zhì)體在血液中半衰期僅5～15min，帶負(fù)電脂質(zhì)體半衰期更短。
綜上結(jié)論，藥物載體為了能實(shí)現(xiàn)把藥物透BBB入腦，就必須滿足這幾個(gè)要求第一，增強(qiáng)載體在血液中的穩(wěn)定性，防止被血清蛋白等吸附和破壞；第二，避免RES的清除作用，延長(zhǎng)載體在血液循環(huán)時(shí)間；第三，具有和BBB特異結(jié)合作用并主動(dòng)滲透入腦；第四，入腦后能迅速和中樞神經(jīng)細(xì)胞融合而釋放藥物分子產(chǎn)生治療作用。脂質(zhì)體是一種首選的傳遞系統(tǒng)，普通脂質(zhì)體的優(yōu)勢(shì)是血漿中較穩(wěn)定，可全身用藥。同時(shí)也發(fā)展出長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，可明顯延長(zhǎng)全身循環(huán)時(shí)間，如美國(guó)專(zhuān)利US4837028公開(kāi)的聚乙二醇化脂質(zhì)體等。由此可見(jiàn)，可在普通脂質(zhì)體基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)一種可滿足上述要求的可透BBB的中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物載體。
GM1是迄今為止被證明能透過(guò)BBB的少數(shù)糖脂分子之一，它已被用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和修復(fù)，是一種重要的神經(jīng)修復(fù)因子(WellsJM，Ventura RF，Eisenhauer PB，McKenna DC，F(xiàn)ine RE，Ullman MD.Transportof GM1 and GM1 inner ester across an in vitro model of the blood-brainbarrier.Neurosci Lett.1996.217121-1244.)。同時(shí)GM1也是一種可用于制備脂質(zhì)體的重要脂類(lèi)(Shoko Yokoyama，Tadahiro Takeda，Masahiko Abe，Preparation of ganglioside GM1 liposomes and their membrane properties.Colloids Surf.BBiointerfaces.2002，27181-187.)。同時(shí)還有研究表明，紅細(xì)胞、血小板和淋巴細(xì)胞能在血液中穩(wěn)定存在而不被當(dāng)作異源物質(zhì)被RES清除，其膜表面神經(jīng)節(jié)苷脂的唾液酸和糖蛋白等起到了重要作用，去除唾液酸基團(tuán)的紅細(xì)胞、血小板和淋巴細(xì)胞會(huì)被肝臟迅速清除，因此唾液酸分子在RES清除過(guò)程中具有明顯抗識(shí)別作用(Durocher JR，Payne RC，Conrad ME.Role of sialic acid in erythrocytesurvival.Blood.1975，45(1)11-20.)，因此含唾液酸的GM1的脂質(zhì)體也能夠有效地減少RES的清除作用而延長(zhǎng)血循環(huán)時(shí)間，同時(shí)在血清中很穩(wěn)定。
現(xiàn)在已有不少文獻(xiàn)報(bào)道了一種可促進(jìn)細(xì)胞間融合的脂類(lèi)物質(zhì)，即N-乙酰磷脂酰乙醇胺。研究表明，在脂質(zhì)體中參入N-棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(NPPE)或N-硬脂酰磷脂酰乙醇胺(NSPE)不僅能增加脂質(zhì)體膜穩(wěn)定性，更能促進(jìn)脂質(zhì)體與細(xì)胞融合，從而把脂質(zhì)體內(nèi)藥物釋放到細(xì)胞內(nèi)(J.C.Domingo，M.Mora，and M.A.De Madariaga.Incorporationof N-acylethanolamine pohospholipids into egg phosphatidylcholinevesiclescharacterization and permeability properties of the binarysystems.Biochim.Biophys.Acta.1993.1148308-316)。
常見(jiàn)的脂質(zhì)體制備方法，包括薄膜水化法、有機(jī)溶劑置換法、去垢劑去除法和乙醇注射法等。有些方法已用于工業(yè)化生產(chǎn)。但這些方法所得的脂質(zhì)體大部分不適合過(guò)濾、不穩(wěn)定、不能很好去除殘留有機(jī)溶劑，同時(shí)也很難獲得適合注射和具有較好生物利用度的均勻脂質(zhì)體。因此迫切需要建立可放大、穩(wěn)定、便于無(wú)菌處理同時(shí)粒徑均勻和費(fèi)用低廉的脂質(zhì)體制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提出一種可透血腦屏障的脂質(zhì)體，使其能作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物載體，具有明顯透過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用，以滿足醫(yī)療領(lǐng)域的需要；本發(fā)明的目的之二是提出一種以上述可透血腦屏障的脂質(zhì)體為載體的藥物組合物，使其能透過(guò)血腦屏障入腦達(dá)到治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用；本發(fā)明的目的之三是提出上述藥物組合物的制備方法。
本發(fā)明的發(fā)明目的之一是通過(guò)選用一種含有5～15％摩爾含量血腦屏障錨點(diǎn)的脂質(zhì)體實(shí)現(xiàn)的。
進(jìn)一步說(shuō)，上述脂質(zhì)體中含有高相變溫度磷脂 50～70％(摩爾含量)膽固醇 10～30％(摩爾含量)血腦屏障錨點(diǎn)5～15％(摩爾含量)
助融劑15～25％(摩爾含量)所述的高相變溫度磷脂為神經(jīng)鞘磷脂(簡(jiǎn)稱(chēng)SM，下同)和中性合成磷脂。其中所述的中性合成磷脂可以為二棕櫚酰磷脂酰膽堿(簡(jiǎn)稱(chēng)DPPC，下同)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(簡(jiǎn)稱(chēng)DSPC，下同)或二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(簡(jiǎn)稱(chēng)DMPC，下同)，均為符合cGMP要求的產(chǎn)品，可采用Lipoid公司的產(chǎn)品；所述膽固醇為符合cGMP的產(chǎn)品，可采用Lipoid公司產(chǎn)品；所述血腦屏障錨點(diǎn)為單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(簡(jiǎn)稱(chēng)GM1，下同)和GM1金屬鹽，為一個(gè)低聚糖與神經(jīng)鞘胺醇和一個(gè)唾液酸分子通過(guò)葡萄糖苷鍵相連得到的化合物，可采用Folch，J.，Lees，M.B.，and Sloane Stanley，G.H.等在(1957)J.Biol.Chem.226，497-509.文獻(xiàn)報(bào)道方法制備，GM1的結(jié)構(gòu)式為 本發(fā)明優(yōu)選GM1鈉鹽作為血腦屏障錨點(diǎn)。GM1鈉為糖脂類(lèi)分子，可作為脂類(lèi)材料參入脂質(zhì)體膜中，通過(guò)與血腦屏障上特異性GM1受體結(jié)合而主動(dòng)透過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。
所說(shuō)的助融劑為N-乙酰磷脂酰乙醇胺。
所說(shuō)的N-乙酰磷脂酰乙醇胺可以為N-棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(簡(jiǎn)稱(chēng)NPPE，下同)或N-硬脂酰磷脂酰乙醇胺(簡(jiǎn)稱(chēng)NSPE，下同)，本發(fā)明優(yōu)選NPPE作為助融劑。
上述脂質(zhì)體粒徑范圍為0.05～0.5μm。
本發(fā)明的發(fā)明目的之二是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，一種利用上述可以透過(guò)血腦屏障的脂質(zhì)體為載體的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物中含有治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)有效量的藥物。
進(jìn)一步說(shuō)，上述作為載體的脂質(zhì)體，包被了治療有效量的中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物。
所述治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)有效量的藥物可以為甲鈷胺、胞磷膽堿鈉或神經(jīng)生長(zhǎng)因子(簡(jiǎn)稱(chēng)NGF)。
目前，超過(guò)95％的神經(jīng)系統(tǒng)藥物不能通過(guò)血腦屏障直接進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，因此不能達(dá)到很好的治療作用，諸如NGF類(lèi)蛋白大分子就更不易進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)了。本發(fā)明所述的含血腦屏障錨點(diǎn)的脂質(zhì)體具有以下優(yōu)勢(shì)(以血腦屏障錨點(diǎn)為GM1舉例)1.延長(zhǎng)在血液中循環(huán)時(shí)間，這是因?yàn)镚M1中唾液酸分子在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(簡(jiǎn)稱(chēng)RES，下同)清除過(guò)程中具有明顯抗識(shí)別作用，因此在血液中具有更長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間，這就增加了脂質(zhì)體透過(guò)血腦屏障的機(jī)會(huì)，達(dá)到一種長(zhǎng)效的作用。
2.增加了血腦屏障的靶向性，這是因?yàn)橹|(zhì)體表面參入的GM1可與血腦屏障特殊受體結(jié)合而主動(dòng)通過(guò)血腦屏障。
3.促進(jìn)細(xì)胞對(duì)藥物分子的利用，這是因?yàn)橹趧┛纱龠M(jìn)脂質(zhì)體與細(xì)胞融合，從而使藥物分子迅速釋放入細(xì)胞中。
這些關(guān)鍵優(yōu)點(diǎn)可以對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病產(chǎn)生更好的治療效果，提高藥物的生物利用度和臨床適應(yīng)癥范圍。
本發(fā)明所述利用可以透過(guò)血腦屏障的脂質(zhì)體為載體的藥物組合物制劑可采用逆相蒸發(fā)法結(jié)合高壓過(guò)濾法進(jìn)行制備，包括如下步驟(1)按脂質(zhì)體摩爾含量百分比稱(chēng)取各種脂類(lèi)，高相變溫度磷脂50～70％，膽固醇10～30％，血腦屏障錨點(diǎn)5～15％，助融劑15～25％，用脂質(zhì)體5～10倍體積的溶劑將上述脂類(lèi)溶解為清澈溶液，所述溶劑為氯仿、甲醇或二者混合；(2)上述溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，減壓蒸發(fā)蒸干溶劑，得一層附著在蒸發(fā)燒瓶壁的脂膜；(3)取上述步驟(2)含脂膜燒瓶，充氮，以下至步驟(6)操作一直保持充氮，加入有機(jī)溶劑溶解脂類(lèi)至脂類(lèi)終濃度為100μm/ml，成為有機(jī)相溶液，所述有機(jī)溶劑為乙醚、二乙醚、氯仿、四氫呋喃或異丙醚；(4)取治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)有效量的藥物配為藥物濃度為0.05～50mg/ml水相溶液；(5)混合有機(jī)相溶液和水相溶液，有機(jī)相溶液和水相溶液混合時(shí)體積比為2∶1～6∶1，超聲處理；(6)將步驟(5)中的混合溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，室溫減壓蒸干至凝膠狀；再加等體積水相減壓蒸發(fā)至樣品為懸液，結(jié)束充氮；(7)所得樣品置高壓勻漿擠壓器處理并通過(guò)微孔濾膜過(guò)濾得均勻粒徑脂質(zhì)體。
(8)脂質(zhì)體樣品采用離子交換色譜法、凝膠過(guò)濾色譜法或超速離心法進(jìn)行分離純化，使游離主藥和脂質(zhì)體分離。
(9)純化脂質(zhì)體保持與內(nèi)水相等滲條件，于等滲緩沖中進(jìn)行制劑，制備成注射液或凍干劑。
其中，步驟(7)中微孔濾膜孔徑優(yōu)選為0.2～0.5μm，高壓勻漿壓力優(yōu)選為50～500psi。
經(jīng)體外血腦屏障模型試驗(yàn)驗(yàn)證和體內(nèi)血清和腦組織分布試驗(yàn)驗(yàn)證，與未包被藥物相比，經(jīng)本發(fā)明所述脂質(zhì)體包被的中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物具有明顯透過(guò)血腦屏障的作用，而且在血液中循環(huán)時(shí)間明顯延長(zhǎng)。


圖1是NGF脂質(zhì)體用1ml含1％Triton X-100的溶液溶解后取20ul樣品測(cè)定所得色譜圖。
圖2是NGF脂質(zhì)體用1m注射用水溶解并高速離心后取上清樣品20ul測(cè)定所得色譜圖。
圖3是NGF脂質(zhì)體血漿中考察趨勢(shì)曲線。
圖4是NGF和NGF脂質(zhì)體在體外血腦屏障模型中通透性比較。
圖5是125I-NGF組在體內(nèi)血清、肝脾和腦組織分布比較圖。
圖6是125I-NGF脂質(zhì)體組在體內(nèi)血清、肝脾和腦組織分布比較圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1含GM1鈉鹽的脂質(zhì)體為載體，包被NGF的藥物組合物按脂質(zhì)體摩爾含量百分比稱(chēng)取各種脂類(lèi)，DMPC 50％，CH 20％，GM1鈉鹽10％，NPPE 20％，其中，DMPC、NPPE和CH購(gòu)至Lipoid公司，GM1鈉鹽為自己純化所得。用脂質(zhì)體5倍體積的溶劑(氯仿∶甲醇，體積比2∶1)溶解為清澈溶液。上述溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，減壓蒸發(fā)蒸干溶劑，為一層附著在蒸發(fā)燒瓶壁的脂膜。取含脂膜燒瓶，充氮(以下操作一直保持充氮)，加入有機(jī)溶劑(乙醚)至脂類(lèi)終濃度為100μm/ml，溶解清澈后為有機(jī)相溶液。取神經(jīng)生長(zhǎng)因子，溶解在10mMNaCL，10mM Tris-Cl，pH 7.4的緩沖液中，終濃度為0.1mg/ml即為水相溶液。按有機(jī)相∶水相，體積比4∶1比例混合二者，超聲處理，5min/4℃。將上述混合溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，20℃/10～50mmHg至凝膠狀；再加等體積水相30℃/10～50mmHg/15min蒸發(fā)至樣品為懸液，結(jié)束充氮。上述脂質(zhì)體樣品置高壓勻漿擠壓器處理，濾膜選用0.45μm，壓力100psi，循環(huán)3次。上述樣品根據(jù)過(guò)CM SepharoseFast Flow陽(yáng)離子交換層析介質(zhì)，讓脂質(zhì)體樣品在該條件下通過(guò)層析介質(zhì)，脂質(zhì)體透過(guò)，游離NGF吸附在介質(zhì)上，達(dá)到游離主藥和脂質(zhì)體分離。純化脂質(zhì)體樣品用10mM NaCL，10mM Tris-Cl，pH 7.4懸浮稀釋至合適濃度，加入4％甘露醇后分裝凍干，得凍干劑。
實(shí)施例2含GM1鈉鹽的脂質(zhì)體為載體，包被甲鈷胺的藥物組合物按脂質(zhì)體摩爾含量百分比稱(chēng)取各種脂類(lèi)，DMPC 50％，CH 30％，GM1鈉鹽5％，NPPE 15％，其中，DMPC、NPPE和CH購(gòu)至Lipoid公司，GM1鈉鹽為自己純化所得。用脂質(zhì)體7.5倍體積的溶劑(氯仿∶甲醇，體積比1∶1)溶解為清澈溶液。上述溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，減壓蒸發(fā)蒸干溶劑，為一層附著在蒸發(fā)燒瓶壁的脂膜。取含脂膜燒瓶，充氮(以下操作一直保持充氮)，加入有機(jī)溶劑(二乙醚)至脂類(lèi)終濃度為100μm/ml，溶解清澈后為有機(jī)相溶液。取甲鈷胺，溶解在注射用水中，終濃度為10mg/ml即為水相溶液。按有機(jī)相∶水相，體積比6∶1比例混合二者，超聲處理，5min/4℃。將上述混合溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，20℃/10～50mmHg至凝膠狀；再加等體積水相30℃/10～50mmHg/15min蒸發(fā)至樣品為懸液，結(jié)束充氮。上述脂質(zhì)體樣品置高壓勻漿擠壓器處理，濾膜選用0.5μm，壓力50psi，循環(huán)3次。上述樣品過(guò)凝膠過(guò)濾色譜柱，達(dá)到游離主藥和脂質(zhì)體分離。純化脂質(zhì)體樣品用10mMNaCL，10mM PB，pH 6.8懸浮稀釋至合適濃度，加入5％甘露醇后分裝，得注射液。
實(shí)施例3含GM1鈉鹽的脂質(zhì)體為載體，包被胞磷膽堿鈉的藥物組合物按脂質(zhì)體摩爾含量百分比稱(chēng)取各種脂類(lèi)，DMPC 60％，CH 10％，GM1鈉鹽5％，NPPE 25％，其中，DMPC、NPPE和CH購(gòu)至Lipoid公司，GM1鈉鹽為自己純化所得，用脂質(zhì)體10倍體積的溶劑(氯仿)溶解為清澈溶液。上述溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，減壓蒸發(fā)蒸干溶劑，為一層附著在蒸發(fā)燒瓶壁的脂膜。取含脂膜燒瓶，充氮(以下操作一直保持充氮)，加入有機(jī)溶劑(四氫呋喃)至脂類(lèi)終濃度為100μm/ml，溶解清澈后為有機(jī)相溶液。取胞磷膽堿鈉，溶解在注射用水中，終濃度為2.5mg/ml即為水相溶液。按有機(jī)相∶水相，體積比2∶1比例混合二者，超聲處理，5min/4℃。將上述混合溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，20℃/10～50mmHg至凝膠狀；再加等體積水相30℃/10～50mmHg/15min蒸發(fā)至樣品為懸液，結(jié)束充氮。上述脂質(zhì)體樣品置高壓勻漿擠壓器處理，濾膜選用0.2μm，壓力500psi，循環(huán)3次。上述樣品經(jīng)超速離心，達(dá)到游離主藥和脂質(zhì)體分離。純化脂質(zhì)體樣品用10mM NaCL，10mM PB，pH 6.8懸浮稀釋至合適濃度，加入5％甘露醇后分裝，得注射液。
實(shí)施例4含GM1鈉鹽的脂質(zhì)體為載體，包被NGF的藥物組合物按脂質(zhì)體摩爾含量百分比稱(chēng)取各種脂類(lèi)，DMPC 60％，CH 15％，GM1鈉鹽15％，NPPE 10％，其中，DMPC、NPPE和CH購(gòu)至Lipoid公司，GM1鈉鹽為自己純化所得。用脂質(zhì)體5倍體積的溶劑(甲醇)溶解為清澈溶液。上述溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，減壓蒸發(fā)蒸干溶劑，為一層附著在蒸發(fā)燒瓶壁的脂膜。取含脂膜燒瓶，充氮(以下操作一直保持充氮)，加入有機(jī)溶劑(異丙醚)至脂類(lèi)終濃度為100μm/ml，溶解清澈后為有機(jī)相溶液。取神經(jīng)生長(zhǎng)因子，溶解在10mM NaCL，10mM Tris-Cl，pH7.4的緩沖液中，終濃度為0.8mg/ml即為水相溶液。按有機(jī)相∶水相，體積比6∶1比例混合二者，超聲處理，5min/4℃。將上述混合溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，20℃/10～50mmHg至凝膠狀；再加等體積水相30℃/10～50mmHg/15min蒸發(fā)至樣品為懸液，結(jié)束充氮。上述脂質(zhì)體樣品置高壓勻漿擠壓器處理，濾膜選用0.2μm，壓力300psi，循環(huán)3次。上述樣品根據(jù)過(guò)CM Sepharose Fast Flow陽(yáng)離子交換層析介質(zhì)，讓脂質(zhì)體樣品在該條件下通過(guò)層析介質(zhì)，脂質(zhì)體透過(guò)，游離NGF吸附在介質(zhì)上，達(dá)到游離主藥和脂質(zhì)體分離。純化脂質(zhì)體樣品用10mM NaCL，10mM Tris-Cl，pH 7.4懸浮稀釋至合適濃度，加入4％甘露醇后分裝凍干，得凍干劑。
實(shí)施例5含GM1鈉鹽的脂質(zhì)體為載體，包被胞磷膽堿鈉的藥物組合物按脂質(zhì)體摩爾含量百分比稱(chēng)取各種脂類(lèi)，DMPC 70％，CH 10％，GM1鈉鹽5％，NPPE 15％，其中，DMPC、NPPE和CH購(gòu)至Lipoid公司，GM1鈉鹽為自己純化所得。用脂質(zhì)體10倍體積的溶劑(氯仿∶甲醇，體積比1∶1)溶解為清澈溶液。上述溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，減壓蒸發(fā)蒸干溶劑，為一層附著在蒸發(fā)燒瓶壁的脂膜。取含脂膜燒瓶，充氮(以下操作一直保持充氮)，加入有機(jī)溶劑(氯仿)至脂類(lèi)終濃度為100μm/ml，溶解清澈后為有機(jī)相溶液。取胞磷膽堿鈉，溶解在注射用水中，終濃度為4mg/ml即為水相溶液。按有機(jī)相∶水相，體積比4∶1比例混合二者，超聲處理，5min/4℃。將上述混合溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，20℃/10～50mmHg至凝膠狀；再加等體積水相30℃/10～50mmHg/15min蒸發(fā)至樣品為懸液，結(jié)束充氮。上述脂質(zhì)體樣品置高壓勻漿擠壓器處理，濾膜選用0.2μm，壓力250psi，循環(huán)3次。上述樣品經(jīng)超速離心，達(dá)到游離主藥和脂質(zhì)體分離。純化脂質(zhì)體樣品用10mM NaCL，10mM PB，pH 6.8懸浮稀釋至合適濃度，加入5％甘露醇后分裝，凍干，得凍干劑。
本申請(qǐng)人對(duì)本發(fā)明所述包被NGF的藥物組合物(NGF脂質(zhì)體)作了如下性質(zhì)研究和效果驗(yàn)證1、性質(zhì)研究(1)NGF含量測(cè)定取1支NGF脂質(zhì)體凍干粉，加0.9ml注射用水溶解，再加入0.1ml10％Triton X-100，振蕩混勻后離心取上清液作為含量測(cè)定樣品溶液。取NGF原液，配制成不同濃度的NGF標(biāo)準(zhǔn)溶液。用Shodex PROTEINKW-82.5凝膠色譜柱對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液進(jìn)行分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜結(jié)果計(jì)算樣品溶液中NGF濃度。結(jié)果如表1，峰面積與蛋白濃度線形回歸方程為“C(μg/ml)＝0.0004A-1.2691，R2＝0.9984”，經(jīng)計(jì)算，NGF主藥含量為77.8μg/ml。
表1高效液相法測(cè)定NGF脂質(zhì)體主藥含量結(jié)果

(2)形態(tài)和粒度分布測(cè)定取少量脂質(zhì)體，用1％磷鎢酸負(fù)染，透射電鏡觀察?？梢?jiàn)參入GM1和NPPE的脂質(zhì)體包被NGF后形態(tài)未改變，且分布均勻，呈典型的指紋結(jié)構(gòu)。經(jīng)激光粒度散射儀測(cè)定脂質(zhì)體平均粒徑為97.3±10.4nm。
(3)包封率測(cè)定取2支NGF脂質(zhì)體凍干粉，其中1支照“含量測(cè)定”方法測(cè)定NGF總量；另1支加1.0ml注射用水溶解，高速離心后取上清液同法測(cè)定NGF含量，計(jì)算脂質(zhì)體的包封率。經(jīng)計(jì)算，NGF含量為77.36μg/ml，離心上清中NGF含量為2.55μg/ml，NGF脂質(zhì)體包封率為96.7％。圖1和圖2分別為NGF脂質(zhì)體含量測(cè)定樣品和高速離心后上清樣品HPLC色譜圖。
(4)滲漏率測(cè)定取NGF脂質(zhì)體，分別于4℃和37℃放置，然后在不同時(shí)間點(diǎn)取樣進(jìn)行滲漏率測(cè)定，根據(jù)滲漏率確定NGF脂質(zhì)體穩(wěn)定性和存放條件，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2和表3。結(jié)果顯示，在4℃條件下，NGF脂質(zhì)體穩(wěn)定性很好，放置12個(gè)月時(shí)滲漏率低于5％。但在37℃條件下不能長(zhǎng)期保存，放置1個(gè)月滲漏率就超過(guò)5％，放置3個(gè)月達(dá)到17.5％。
表2NGF脂質(zhì)體滲漏率測(cè)定結(jié)果(4℃)

表3NGF脂質(zhì)體滲漏率測(cè)定結(jié)果(37℃)

(5)相變溫度測(cè)定取NGF脂質(zhì)體，用注射用水溶解后用電導(dǎo)法測(cè)定脂質(zhì)體相變溫度，結(jié)果為38.3±0.9℃。
(6)血漿中穩(wěn)定性測(cè)定取NGF脂質(zhì)體，加入1.0ml人血漿后于透析管37℃孵育，測(cè)定24小時(shí)內(nèi)滲漏情況，測(cè)定方法為在不同時(shí)間點(diǎn)取樣高速離心后取上清進(jìn)行凝膠高效液相分析，測(cè)定NGF脂質(zhì)體滲漏率。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示，NGF脂質(zhì)體在血漿中穩(wěn)定性很好，24小時(shí)內(nèi)滲漏率低于5％。圖2為NGF脂質(zhì)體血漿中穩(wěn)定性趨勢(shì)曲線。
表4NGF脂質(zhì)體血漿中滲漏率考察測(cè)定結(jié)果(37℃)

(7)有機(jī)溶劑殘留取NGF脂質(zhì)體，用氣相色譜法測(cè)定樣品溶液中氯仿、甲醇、乙醚殘留量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果顯示，NGF脂質(zhì)體有機(jī)溶劑殘留量很低，符合中國(guó)藥典相關(guān)規(guī)定。
表5NGF脂質(zhì)體有機(jī)溶劑殘留量測(cè)定結(jié)果

2、NGF脂質(zhì)體在血腦屏障體外模型中通透性測(cè)定根據(jù)參考文獻(xiàn)(Wells JM，Ventura RF，Eisenhauer PB，McKennaDC，F(xiàn)ine RE，Ullman MD.Transport of GM1 and GM1 inner esteracross an in vitro model of the blood-brain barrier.NeurosciLett.1996.217121-1244.)方法培養(yǎng)牛腦內(nèi)皮細(xì)胞形成血腦屏障體外模型。細(xì)胞培養(yǎng)至匯合后取NGF脂質(zhì)體和NGF原液，分別用試驗(yàn)用培養(yǎng)基稀釋為1.0μg/ml，各取1ml加入1個(gè)供試池，受試池中加入試驗(yàn)用培養(yǎng)基2ml，使細(xì)胞插入器內(nèi)外液面相平，以消除液面差產(chǎn)生的靜壓力對(duì)通透性的影響。然后在24小時(shí)內(nèi)于不同時(shí)間點(diǎn)從受試池取樣50μl，取樣結(jié)束后用NGF酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定所取樣品NGF含量。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果顯示，與NGF原液相比，NGF脂質(zhì)體具有明顯透過(guò)血腦屏障的作用。圖4顯示NGF溶液和NGF脂質(zhì)體透過(guò)血腦屏障模型的趨勢(shì)。
表6體外血腦屏障模型對(duì)NGF溶液和NGF脂質(zhì)體通透性測(cè)定結(jié)果

3、NGF脂質(zhì)體在體內(nèi)血清、肝脾和腦組織中分布測(cè)定取NGF原液，根據(jù)參考文獻(xiàn)(Poduslo JF，Curran GL，Dyck PJ.Increase in albumin，IgG，and IgM blood-nerve barrier indices in human diabeticneuropathy[J].Proc Natl Acad Sci USA，1988，85(13)4879-4883.)敘述方法，采用氯胺T法標(biāo)記NGF制備125I-NGF，。按實(shí)施例2方法制備125I-NGF脂質(zhì)體。
取SD雄性大鼠40只，均分為兩組，即125I-NGF溶液組和125I-NGF脂質(zhì)體組。用15％烏拉坦麻醉后分離其單側(cè)頸動(dòng)脈和股靜脈，頸動(dòng)脈近心端結(jié)扎，遠(yuǎn)心端做頸動(dòng)脈插管。股靜脈給藥，劑量為125I-NGF 0.5μg/g。分別于給藥后15，30和60min從插管處取血1mL，然后用蠕動(dòng)泵灌注生理鹽水20min，最后剪斷對(duì)側(cè)頸動(dòng)脈，繼續(xù)灌流15min，以此消除腦毛細(xì)血管中殘留的藥物對(duì)腦組織分布的影響。血樣3000×g離心5min得到血清，用γ-計(jì)數(shù)儀測(cè)定放射活性；同時(shí)也于給藥后15，30和60min處死大鼠，取肝脾和腦組織用0.5％Triton X-100勻漿后經(jīng)10,000×g離心10min，取上清液測(cè)定放射活性。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果顯示，125I-NGF組放射活性主要分布于血液和肝脾中，腦組織含量甚微，血藥濃度迅速下降，主要被肝脾吸收；而125I-NGF脂質(zhì)體組一直維持較高的血藥濃度，肝脾吸收甚微，主要被腦組織吸收。由此可明顯反映125I-NGF脂質(zhì)體具有較長(zhǎng)血循環(huán)時(shí)間和透血腦屏障入腦的作用。
表7NGF和NGF脂質(zhì)體體內(nèi)血清、肝脾和腦組織分布測(cè)定結(jié)果

權(quán)利要求
1.一種可以透過(guò)血腦屏障的脂質(zhì)體，其特征在于，該脂質(zhì)體含有5～15％摩爾含量的血腦屏障錨點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種可以透過(guò)血腦屏障的脂質(zhì)體，其特征在于，所述脂質(zhì)體含有高相變溫度磷脂 50～70％(摩爾含量)膽固醇 10～30％(摩爾含量)血腦屏障錨點(diǎn)5～15％(摩爾含量)助融劑 15～25％(摩爾含量)
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種可以透過(guò)血腦屏障的脂質(zhì)體，其特征在于，所述高相變溫度磷脂為神經(jīng)鞘磷脂和合成中性磷脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種可以透過(guò)血腦屏障的脂質(zhì)體，其特征在于，所述合成中性磷脂為二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿或二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種可以透過(guò)血腦屏障的脂質(zhì)體，其特征在于，所述血腦屏障錨點(diǎn)為單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂GM1和GM1的金屬鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種可以透過(guò)血腦屏障的脂質(zhì)體，其特征在于，所述GM1金屬鹽為GM1鈉鹽。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種可以透過(guò)血腦屏障的脂質(zhì)體，其特征在于，所述助融劑為N-乙酰磷脂酰乙醇胺。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種可以透過(guò)血腦屏障的脂質(zhì)體，其特征在于，所述N-乙酰磷脂酰乙醇胺為N-棕櫚酰磷脂酰乙醇胺或N-硬脂酰磷脂酰乙醇胺。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8所述一種可以透過(guò)血腦屏障的脂質(zhì)體，其特征在于，所述脂質(zhì)體粒徑范圍為0.05～0.5μm。
10.一種利用權(quán)利要求1或2所述可以透過(guò)血腦屏障的脂質(zhì)體為載體的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物中含有治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)有效量的藥物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述藥物組合物，其特征在于，所述治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)有效量的藥物被所述脂質(zhì)體包被。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述藥物組合物，其特征在于，所述治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物為甲鈷胺、胞磷膽堿鈉或神經(jīng)生長(zhǎng)因子。
13.一種制備權(quán)利要求10所述藥物組合物的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)按脂質(zhì)體摩爾含量百分比稱(chēng)取各種脂類(lèi)，高相變溫度磷脂50～70％，膽固醇10～30％，血腦屏障錨點(diǎn)5～15％，助融劑15～25％，用脂質(zhì)體5～10倍體積的溶劑將上述脂類(lèi)溶解為清澈溶液，所述溶劑為氯仿、甲醇或二者混合；(2)上述溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，減壓蒸發(fā)蒸干溶劑，得一層附著在蒸發(fā)燒瓶壁的脂膜；(3)取上述步驟(2)含脂膜燒瓶，充氮，以下至步驟(6)操作一直保持充氮，加入有機(jī)溶劑溶解脂類(lèi)至脂類(lèi)終濃度為100μm/ml，成為有機(jī)相溶液，所述有機(jī)溶劑為乙醚、二乙醚、氯仿、四氫呋喃或異丙醚；(4)取治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)有效量的藥物配為藥物濃度為0.05～50mg/ml水相溶液；(5)混合有機(jī)相溶液和水相溶液，有機(jī)相溶液和水相溶液混合時(shí)體積比為2∶1～6∶1，超聲處理；(6)將步驟(5)中的混合溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中，室溫減壓蒸干至凝膠狀；再加等體積水相減壓蒸發(fā)至樣品為懸液，結(jié)束充氮；(7)所得樣品置高壓勻漿擠壓器處理并通過(guò)微孔濾膜過(guò)濾得均勻粒徑脂質(zhì)體。(8)脂質(zhì)體樣品采用離子交換色譜法、凝膠過(guò)濾色譜法或超速離心法進(jìn)行分離純化，使游離主藥和脂質(zhì)體分離。(9)純化脂質(zhì)體樣品保持與內(nèi)水相等滲條件，于等滲緩沖中進(jìn)行制劑，制備成注射液或凍干劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述藥物組合物的制備方法，其特征在于，所述步驟(7)中微孔濾膜孔徑為0.2～0.5μm，高壓勻漿壓力為50～500psi。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種可透血腦屏障的脂質(zhì)體和以該脂質(zhì)體為載體的藥物組合物及其制備方法。該脂質(zhì)體脂質(zhì)體含有5～15％摩爾含量的血腦屏障錨點(diǎn)，還包含高相變溫度磷脂、膽固醇和助融劑，脂質(zhì)體粒徑范圍為0.05～0.5μm。該脂質(zhì)體藥物組合物包被有治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)有效量的藥物，具有較長(zhǎng)的血循環(huán)時(shí)間，并且能攜帶所包被藥物透過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)達(dá)到治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用。
文檔編號(hào)A61K47/24GK1833633SQ200510120550
公開(kāi)日2006年9月20日 申請(qǐng)日期2005年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月29日
發(fā)明者陳亞, 李汝霖, 湯華東, 陳煌 申請(qǐng)人:武漢海特生物制藥股份有限公司