專利名稱：一種cb1受體拮抗劑在制備有益于肝疾治療的組合物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及CB1受體拮抗劑在制備有益于肝病治療的組合物的一種新用途。
背景技術(shù)：
肝纖維化是慢性肝損害的常見反應(yīng)，最終導(dǎo)致肝硬化及其并發(fā)癥，門靜脈高壓，肝衰竭和肝細(xì)胞癌。纖維化的進(jìn)程是合成肌纖維組分和基質(zhì)降解抑制劑的肝成肌纖維細(xì)胞的加強(qiáng)增殖和積聚的結(jié)果(見Fredman，.S.L.，生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)2000年卷275，2247-50頁)。
?？浦参锎舐?Cannabis Sativa)包括六十多種化學(xué)成分，其最主要的有效成分是(-)Δ9-四氫大麻酚(THC)。內(nèi)源性的天然大麻素也得到了鑒定花生四烯酸乙醇胺(anandamide)和2-花生四烯酸甘油(2-arachidonyl glycerol)，它們是花生四烯酸的衍生酯(Piomelli，D等，當(dāng)代藥物科學(xué)(Trends Pharmacol Sci)2000年卷21，218-24頁)。大麻素和兩個G蛋白偶聯(lián)受體CB1和CB2結(jié)合，CB1和CB2同樣結(jié)合THC(見Pertwee，R.G.，當(dāng)代醫(yī)學(xué)化學(xué)(Curr MedChem)1999年卷6，635-64頁)。因此CB1是兩個已知大麻素細(xì)胞受體之一。眾所周知，作為G蛋白偶聯(lián)跨膜受體的該受體在腦和血管中表達(dá)(Pertwee，R.G.，當(dāng)代醫(yī)學(xué)化學(xué)(Curr Med Chem)1999年卷6，635-64頁)而不在肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(見Guzman，M和& Sanchez，C.，生命科學(xué)(Life Sci)1999年卷65，657-64頁)。CB1介導(dǎo)大麻的精神作用效應(yīng)。與此不同的是CB2受體主要在免疫系統(tǒng)表達(dá)并缺乏精神作用效應(yīng)(見Friedman，S.L.，生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)2000年卷275，2247-50頁)。除精神效應(yīng)以外，大麻素還顯示出鎮(zhèn)痛、止吐以及增進(jìn)食欲的中樞效應(yīng)(見Harrold，J.A.和Williams，G.英國營養(yǎng)學(xué)雜志(Br J Nutr)2003年卷90，729-34頁)。此外，大麻素還引起抗炎和血管舒張?zhí)匦?見Kumar，R.N.，Chambers，W.A.和Pertwee.麻醉學(xué)(Anaesthesia)2001年卷56，1059-68頁)。幾個研究也指出，由于大麻素誘導(dǎo)包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤和皮膚癌在內(nèi)不同類型的的實(shí)驗性腫瘤退化的能力，其可能是潛在的抗腫瘤劑。這些抗腫瘤效應(yīng)主要?dú)w因于它們的抗增殖和細(xì)胞凋亡特性(Bifulco，M.等，美國實(shí)驗生物學(xué)學(xué)會聯(lián)盟雜志(Faseb J)2001年卷29，29頁；Casanova，M.L.等，臨床調(diào)查雜志(J Clin Invest)2003年卷111，43-50頁；Sanchez，C.等，腫瘤研究(Cancer Res)2001年卷61，5784-9頁)。
只有很少的資料涉及大麻素對肝的作用。CB1和CB2受體不在肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(Guzman，M.和Sanchez，C.生命科學(xué)(Life Sci)1999年卷65，657-64頁)。但是分離于肝動脈的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)有CB1受體的存在，并且在肝硬化時其表達(dá)增強(qiáng)(Batkai，S.等自然醫(yī)學(xué)(Nat Med)2001年卷7，827-32頁)。
CB1受體的兩種同源異構(gòu)體已經(jīng)被分離到長同源異構(gòu)體(序列1(SEQ ID NO1))和在NH2端截短的相當(dāng)于一個剪接變異體的短同源異構(gòu)體(序列2(SEQ ID NO2))，兩者的區(qū)別在于對其配體的親和性不同(Shire等，生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)，1995年；Rinaldi-Carmona等，藥理學(xué)和實(shí)驗治療學(xué)(J Pharmacol Exp Ther)1996年)。在CB1受體基因的編碼區(qū)存在5處單個的核苷酸多態(tài)性。在其中，只有3處導(dǎo)致了CB1受體的單個氨基酸的變化(即在序列1中，在200位氨基酸殘基處，苯丙氨酸取代了亮氨酸，216位異亮氨酸取代了纈氨酸，246位纈氨酸取代了丙氨酸，序列2的變化也在相對應(yīng)的位置)。有一個CB1受體的7區(qū)共有序列，其在脊椎動物中高度保守但卻不出現(xiàn)在其他大麻素受體中。(見Attwood，T.K.和Findlay，J.B.C在“蛋白質(zhì)工程”(Protein Eng)1994年卷7(2)195-203頁；Attwood，T.K.和Findlay，J.B.C.，在“7次跨膜”(7TM)1993年卷2，G.Vriend和B.Bywater編輯；Birnbaumer，L.在“藥理學(xué)和毒物學(xué)年度綜述”(Ann.Rev Pha rmacol Toxicol)1990年卷30，675-705頁，Casey，P.J.和Gilman，A.G在“生物化學(xué)雜志”(J.Biol.Chem.)1988年卷263(6)2577-2580頁；5.Attwood，T.K.和Findlay，J.B.C在“蛋白質(zhì)工程”(Protein Eng)1993年卷6(2)167-176頁；Watson，S.和Arkinsall，S，G蛋白偶聯(lián)受體綱要(“The G Protein-Linked Receptor Factsbook”)學(xué)術(shù)出版社(Academic press)，1994年P(guān)P 80-83頁)。該氨基酸的共有序列包括序列3到9的共7個蛋白區(qū)。
CB1受體的拮抗劑，包括逆向或反轉(zhuǎn)激動劑，先前已被描述。包括WO 03/077847中描述的取代酰胺，WO 03/087037中描述的取代芳基酰胺，W0 03/063781中描述的取代咪唑，WO 03/086288所描述的雙環(huán)酰胺，WO 03/084943中描述的三聯(lián)苯衍生物，EP-B-656354描述的N-哌啶酮(piperidono)-3-吡唑甲酰胺和N-哌啶-5-(4-對氯苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-甲基吡唑-3-甲酰胺，US 5596106和US5747524分別描述的芳基苯并[b]噻吩和苯并[b]呋喃化合物，F(xiàn)R2805817所描述的氮雜環(huán)丁烷衍生物，F(xiàn)R2805810所描述的3-氨基-氮雜環(huán)丁烷，或FR2805818所描述的3-取代或3，3-雙取代1-(雙-((雜)芳基)-甲基)-氮雜環(huán)丁烷。這些文獻(xiàn)在此都被收入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)。其他的拮抗劑可以通過商業(yè)途徑獲得，例如N-(哌啶-1-基)-1-(2，4-二氯苯基)-5-(4-碘苯基)-4-甲基-1H-吡唑-3-甲酰胺，即商業(yè)上所謂的AM251，和被稱為LY-320135的化合物。
CB1受體拮抗劑應(yīng)用于治療性功能障礙(專利申請WO03/082256)，或腹瀉(專利申請書WO 01/85092)，或神經(jīng)炎癥性疾病或藥物濫用疾病、肥胖、哮喘、便秘(專利申請書WO 03/087037)。
文獻(xiàn)US 5,939,429、WO 03/077847，WO 03/084930，WO 03/084943，WO03/063781和WO 03/087037公開了CB1拮抗劑可以逆轉(zhuǎn)肝硬化門靜脈高壓大鼠的全身血液動力學(xué)改變。

發(fā)明內(nèi)容
但是，以上文獻(xiàn)從未公開CB1拮抗劑可以降低任何病因(酒精、病毒、毒素)導(dǎo)致的肝病中的纖維化。此外，尚未了解到CB1受體或CB1拮抗劑效應(yīng)與非酒精性脂肪性肝炎和肝癌變有關(guān)聯(lián)。
發(fā)明人令人驚訝地證實(shí)，CB1拮抗劑具有潛在的抗肝纖維化特性，可以用于肝病治療，優(yōu)選的是導(dǎo)致肝纖維化的肝病。
因此，本發(fā)明，基于發(fā)現(xiàn)了CB1受體的失活可以降低與肝損傷和疾病相關(guān)的肝纖維化，提供了治療肝病，優(yōu)選的是導(dǎo)致肝纖維化的肝病的多種方法和組合物。本發(fā)明因此涉及到1.一種CB1受體的拮抗劑在制備治療肝病的組合物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)第1項所述的應(yīng)用，其中所述CB1受體拮抗劑是一種特殊的CB1受體拮抗劑。
3.根據(jù)第1或2項所述的應(yīng)用，其中所述肝病導(dǎo)致肝纖維化。
4.根據(jù)第1-3項所述的應(yīng)用，其中所述肝病是酒精性肝硬化。
5.根據(jù)第1-3項的所述應(yīng)用，其中所述肝病是慢性病毒性肝炎。
6.根據(jù)第1-3項所述的應(yīng)用，其中所述肝病是非酒精性的脂肪性肝炎。
7.根據(jù)1-3項所述的應(yīng)用，其中所述肝病是原發(fā)性肝癌。
8.根據(jù)1-7項所述的應(yīng)用，其中所述拮抗劑是一種為結(jié)構(gòu)式II的化合物或其在制藥學(xué)上可以接受的鹽之一，其中，g2、g3、g4、g5和g6以及w2、w3、w4、w5和w6是等同或不同的，并且分別是氫、一個氯原子或溴原子、一個(C1-C3)烷基、一個(C1-C3)烷氧基、一個三氟甲基或一個硝基基團(tuán)，g4可以選擇性地為一個苯基基團(tuán)；R4是氫或一個(C1-C3)烷基；X可以是一個直接鍵或是一個-(CH2)x-N(R3)-基團(tuán)，其中R3是氫或一個(C1-C3)烷基，x是0或1；R是一個-NR1R2基團(tuán)，其中R1和R2各自是一個(C1-C6)烷基；一個被選擇性地取代的非芳香族的(C3-C15)碳環(huán)基，所述的取代基不是取代羰基；一個氨基(C1-C4)烷基基團(tuán)，其中氨基可以被一個(C1-C3)烷基選擇性地雙取代；一個環(huán)烷基(C1-C3)烷基，其中環(huán)烷基是C3-C12；一個非取代的或被一個鹵素、一個(C1-C5)烷基或一個(C1-C5)烷氧基單取代或多取代的苯基；一個苯基(C1-C3)烷基；一個雙苯基(C1-C3)烷基；一個萘基；一個蒽基；一個不被取代的或被一個(C1-C3)烷基、一個羥基或一個芐基取代的飽和的5到8個原子數(shù)的雜環(huán)基，一個1-金剛烷甲基；一個不被取代的或被一個鹵素、一個(C1-C5)烷基或一個(C1-C5)烷氧基單取代或多取代的芳香族雜環(huán)；被一個芳香族雜環(huán)取代的(C1-C3)烷基，其中的芳香族雜環(huán)不被取代或被一個鹵素、一個(C1-C5)烷基或一個(C1-C5)烷氧基單取代或多取代；或者，R1是氫，R2如上所定義；或者，R1和R2與它們結(jié)合的氮原子形成一個飽和的5到8個原子數(shù)的雜環(huán)基，當(dāng)w2、w3、w4、w5、w6、g2、g3、g4、g5和g6都是氫時，所述的雜環(huán)基不是嗎啉；當(dāng)X是-(CH2)XN(R3)-時，如上所定義的一個R2基；一個R5基，當(dāng)X是一個直接鍵時，R5是一個(C1-C3)烷基；一個不被取代或被一個(C1-C5)烷基取代的(C3-C12)環(huán)烷基；一個不被取代或被一個鹵素或一個(C1-C5)烷基所取代的苯基(C1-C3)烷基；一個環(huán)烷基(C1-C3)烷基，其中環(huán)烷基是C3-C12，其不被取代或被一個(C1-C5)烷基所取代；或者一個2-降莰基甲基。
9.根據(jù)第1-7項所述的應(yīng)用，其中所述拮抗劑是N-哌啶酮-3-吡唑甲酰胺或是其在藥物學(xué)上可接受的一種鹽。
10.根據(jù)第1-7項所述的應(yīng)用，其中所述拮抗劑是N-哌啶-5-(4-溴苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-乙基吡唑-3-甲酰胺或是其在藥物學(xué)上可接受的一種鹽。
11.根據(jù)第1-7項所述的應(yīng)用，其中的拮抗劑是N-哌啶-5-(4-氯苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-甲基吡唑-3-甲酰胺或是其在藥物學(xué)上可接受的一種鹽。
12.根據(jù)上述任何一項應(yīng)用，其中CB1受體選自由下述組成的組a)具有包括序列1或序列1一部分的氨基酸序列，具有G蛋白偶聯(lián)細(xì)胞受體的生物學(xué)功能，能夠結(jié)合THC并傳導(dǎo)細(xì)胞信號的蛋白；b)具有包括序列2或序列2一部分的氨基酸序列，具有G蛋白偶聯(lián)細(xì)胞受體的生物學(xué)功能，能夠結(jié)合THC并傳導(dǎo)細(xì)胞信號的蛋白；c)具有序列1或序列2的氨基酸序列，具有G蛋白偶聯(lián)細(xì)胞受體的生物學(xué)功能，能夠結(jié)合THC并傳導(dǎo)細(xì)胞信號的由等位基因編碼的蛋白質(zhì)；d)具有序列1的氨基酸序列，在200位有一個苯丙氨酸對亮氨酸的替代；和/或在216位一個異亮氨酸對纈氨酸的替代；和/或在246位纈氨酸對丙胺酸的替代的蛋白；e)具有序列2的氨基酸序列，在139位有一個苯丙氨酸對亮氨酸的替代；和/或在155位一個異亮氨酸對纈氨酸的替代；和/或在185位纈氨酸對丙胺酸的替代的蛋白；以及f)具有包括序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8和序列9的氨基酸序列或與它們80％同源的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有G蛋白偶聯(lián)細(xì)胞受體的生物學(xué)功能，能夠結(jié)合THC并傳導(dǎo)細(xì)胞信號的蛋白。
13.根據(jù)第1-11項所述的應(yīng)用，其中CB1受體是一個與序列1在氨基酸水平上同源性至少為45％，具有G蛋白偶聯(lián)細(xì)胞受體的生物學(xué)功能，能夠結(jié)合THC并傳導(dǎo)細(xì)胞信號的蛋白質(zhì)。
14.根據(jù)前項所述的應(yīng)用，其中同源性至少為60％，優(yōu)選70％，更為優(yōu)選的是80％，又更為優(yōu)選的是90％，更為優(yōu)選的是95％。
15.如上述任何一項的應(yīng)用，其中CB1受體拮抗劑的每日劑量從0.01mg到500mg，優(yōu)選為1mg到100mg。
16.編碼包括序列1或序列2或序列1的一部分或序列2的一部分的蛋白的核苷酸，在制備通過下調(diào)或抑制CB1受體來治療肝病的組合物的應(yīng)用。
17.一種治療哺乳動物肝病的方法，包括將治療有效劑量的至少其中的一種CB1受體拮抗劑給藥于需要的患者。
18.根據(jù)第17項所述的治療肝病的方法，其中，CB1受體拮抗劑是具有結(jié)構(gòu)式II的化合物或其在藥物學(xué)上可接受的鹽之一，其中，g2、g3、g4、g5和g6以及w2、w3、w4、w5和w6是等同或不同的，并且分別是氫、一個氯原子或溴原子、一個(C1-C3)烷基、一個C1-C3)烷氧基、一個三氟甲基或一個硝基基團(tuán)，g4可以選擇性地為一個苯基基團(tuán)；R4是氫或一個(C1-C3)烷基；X可以是一個直接鍵或是一個-(CH2)x-N(R3)-基團(tuán)，其中R3是氫或一個(C1-C3)烷基，x是0或1；R是一個-NR1R2基團(tuán)，其中R1和R2各自是一個(C1-C6)烷基；一個被選擇性地取代的非芳香族的(C3-C15)碳環(huán)基，所述的取代物不是取代羰基；一個氨基(C1-C4)烷基基團(tuán)，其中氨基可以被一個(C1-C3)烷基選擇性地雙取代；一個環(huán)烷基(C1-C3)烷基，其中環(huán)烷基是C3-C12；一個非取代的或被一個鹵素、一個(C1-C5)烷基或一個(C1-C5)烷氧基單取代或多取代的苯基；一個苯基(C1-C3)烷基；一個雙苯基(C1-C3)烷基；一個萘基；一個蒽基；一個不被取代的或被一個(C1-C3)烷基、一個羥基或一個芐基取代的飽和的5到8個原子數(shù)的雜環(huán)基，一個1-金剛烷甲基；一個不被取代的或被一個鹵素、一個(C1-C5)烷基或一個(C1-C5)烷氧基單取代或多取代的芳香族雜環(huán)；被一個芳香族雜環(huán)取代的(C1-C3)烷基，其中的芳香族雜環(huán)不被取代或被一個鹵素、一個(C1-C5)烷基或一個(C1-C5)烷氧基單取代或多取代；或者，R1是氫，R2如上所定義；或者，R1和R2與它們結(jié)合的雜原子形成一個飽和的5到8個原子數(shù)的雜環(huán)基，當(dāng)w2、w3、w4、w5、w6、g2、g3、g4、g5和g6都是氫時，所述的雜環(huán)基不是嗎啉；當(dāng)X是-(CH2)xN(R3)-時，如上所定義的一個R2基；一個R5基，當(dāng)X是一個直接鍵時，R5是一個(C1-C3)烷基；一個不被取代或被一個(C1-C5)烷基取代的(C3-C12)環(huán)烷基；一個不被取代或被一個鹵素或一個(C1-C5)烷基所取代的苯基；一個環(huán)烷基(C1-C3)烷基，其中環(huán)烷基是C3-C12，其不被取代或被一個(C1-C5)烷基所取代；或者一個2-降莰基甲基。
19.根據(jù)第17項所述的治療肝病的方法，其中所述CB1受體拮抗劑是N-哌啶酮-3-吡唑甲酰胺或是其在藥物學(xué)上可接受的一種鹽。
20.根據(jù)第17項所述的治療肝病的方法，其中所述CB1受體拮抗劑是N-哌啶-5-(4-對溴苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-乙基吡唑-3-甲酰胺或是其在藥物學(xué)上可接受的一種鹽。
21.根據(jù)第17項所述的治療肝病的方法，其中所述CB1受體拮抗劑是N-哌啶-5-(4-對氯苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-甲基吡唑-3-甲酰胺或是其在藥物學(xué)上可接受的一種鹽。
22.根據(jù)第17-21項所述的治療肝病的方法，其中所述肝病是肝纖維化。
23.根據(jù)第17-21項所述的治療肝病的方法，其中所述肝病是酒精性肝硬化。
24.根據(jù)第17-21項所述的治療肝病的方法，其中所述肝病是慢性病毒性肝炎。
25.根據(jù)第17-21項所述的治療肝病的方法，其中所述肝病是非酒精性的脂肪性肝炎。
26.根據(jù)第17-21項所述的治療肝病的方法，其中所述肝病是原發(fā)性肝癌。
27.根據(jù)第17-26項所述的治療肝病的方法，其中所述CB1受體拮抗劑的每日劑量從0.01mg到500mg，優(yōu)選為1mg到100mg。


圖1柱圖顯示了每mg可溶性蛋白中肝TGFβ-1的以pg計的含量(A組)和肝平滑肌α肌動蛋白表達(dá)量占截面表面積染色總量的百分比(B組)。兩者都以野生型小鼠(用WT表示)和CB1缺陷型小鼠(用CB1-/-表示)分組。00表示只接受橄欖油的小鼠組，CC14則顯示CC14中毒小鼠的結(jié)果。
對肝TGFβ-1的產(chǎn)量進(jìn)行了測定(統(tǒng)計學(xué)意義p＜0.05)。為評價平滑肌α肌動蛋白，對每個動物4-5個肝組織切片的染色進(jìn)行了定量(統(tǒng)計學(xué)意義p＜0.05)。
圖2柱圖分別顯示了在野生型小鼠(用WT表示)和CB1缺陷型小鼠(用CB1KO表示)中肝成肌纖維細(xì)胞的初始存活力和血清撤除48小時后的存活力(A組)以及半胱氨酰-天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)樣的初始活性及血清撤除48小時后的活性(B組)。通過血清撤除48小時誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。肝成肌纖維細(xì)胞的存活力被表示為存活細(xì)胞的平均百分比±SEM，結(jié)果來自根據(jù)3只WT和2只CB1-/-小鼠肝臟的細(xì)胞分離株進(jìn)行的6-9個實(shí)驗(CB1-/-的統(tǒng)計學(xué)意義p＜0.05)。半胱氨酰-天冬氨酸蛋白酶-3樣活性被表示為從第0天起測定的活性的倍數(shù)(根據(jù)3只WT和3只CB1-/-小鼠肝臟的細(xì)胞分離株進(jìn)行的6-9個實(shí)驗獲得平均值±SEM)。統(tǒng)計學(xué)上p＜0.05。
圖3顯示了CB1受體拮抗劑SR141716增大劑量對人(A組)和野生型小鼠(表示為WT)和CB1缺陷型小鼠(表示為CB1KO)(B組)肝成肌纖維細(xì)胞DNA合成的效應(yīng)。DNA合成被表示為細(xì)胞經(jīng)SR141716的賦形劑(vehicle)處理后根據(jù)SR141716的以nM計增高的濃度作圖得出的DNA合成百分比。在存在20ng/ml的PDGF-BB的情況下，人肝成肌纖維細(xì)胞經(jīng)不同濃度的CB1受體拮抗劑SR141716刺激30個小時。通過測量3-6個實(shí)驗的摻入DNA的[3H]胸腺嘧啶脫氧核苷(以平均值±SEM計)，以對照的百分比表示(p＜0.05)。圖中顯示均值相關(guān)區(qū)間。小鼠肝成肌纖維細(xì)胞(圖中野生型小鼠表示為圓圈，CB1缺陷型小鼠表示為菱形)，在存在20ng/ml的PDGF-BB的情況下，經(jīng)不同濃度的CB1受體拮抗劑SR141716刺激30個小時。根據(jù)3-6個來自于3只WT和3只CB-/-小鼠肝的細(xì)胞分離株實(shí)驗的數(shù)據(jù)對摻入DNA的[3H]胸腺嘧啶脫氧核苷進(jìn)行測定，以平均值±SEM計，以對照的百分比表示(p＜0.05)。圖中顯示了均值相關(guān)區(qū)間。
圖4顯示了SR141716或其賦形劑對經(jīng)四氯化碳引起的小鼠的死亡率的效應(yīng)。根據(jù)以天計的時間給出了用CCl4伴SR141716(虛線)或不伴SR141716(實(shí)線表示只有賦形劑沒有CB1拮抗劑的操作)處理的小鼠的存活率。CCl4給藥的時間以箭頭表示。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了治療包括肝纖維化在內(nèi)的肝病的方法和組合物(例如藥物組合物)。肝病還包括但不限于，酒精性肝硬化、慢性病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎和原發(fā)性肝癌。
申請人顯示了CB1受體的下調(diào)和拮抗劑的應(yīng)用或CB1受體的反向激動劑構(gòu)成了不同類型肝纖維化的治療。通過幾個實(shí)驗得到了證明。
首先，在被實(shí)施CB1受體敲除而缺少CB1受體表達(dá)的小鼠(CB1KO，n＝15)和與其對應(yīng)野生型小鼠(WT，n＝12)的慢性四氯化碳中毒導(dǎo)致肝纖維化的模型中，研究了CB1受體在肝纖維化進(jìn)程中的角色。用METAVIR產(chǎn)生的評分(METAVIR-derived score)對纖維化和壞死性炎癥進(jìn)行評估。CB1KO小鼠與WT小鼠相比顯示出纖維化程度降低(纖維化評分2.59±0.13對3.33±0.13，p＜0.05)。因此，CB1KO小鼠與WT小鼠相比，以羥脯氨酸測定評估，肝臟膠原質(zhì)下降了40％(0.46±0.06對0.73±0.11mg/mg組織，p＜0.05)。壞死性炎癥評分在兩組中近似。該CB1受體失活與通過藥物學(xué)方法完全的拮抗阻斷CB1受體具有相同的表現(xiàn)。根據(jù)肝臟組織學(xué)分析和羥脯氨酸，即一種膠原質(zhì)沉積的生化標(biāo)記物的含量測定，與對照組相比，CB1小鼠的肝纖維化顯著降低。另外還可以觀察到，當(dāng)用四氯化碳處理時，與野生型小鼠相比，CB1缺陷型小鼠TGF-β1和平滑肌α肌動蛋白表達(dá)減少。最后觀察到，CB1失活增加了小鼠肝成肌纖維細(xì)胞的凋亡。因此，CB1受體的失活降低了肝纖維化。
第二，對正常人、硬化肝臟和培養(yǎng)的肝成肌纖維細(xì)胞進(jìn)行免疫化學(xué)標(biāo)記。免疫化學(xué)顯示，正常人肝臟中(n＝3)CB1受體微弱表達(dá)，與此相對照的是，各種原因的肝硬化標(biāo)本(n＝13)CB1受體顯著上調(diào)，以纖維間隔內(nèi)的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)和纖維間隔邊緣的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞占優(yōu)勢。經(jīng)雙免疫組織化學(xué)鑒定，成肌纖維細(xì)胞是CB1受體的主要來源，因此，CB1受體在培養(yǎng)的人肝成肌纖維細(xì)胞中也有表達(dá)。CB1受體在正常肝臟竇內(nèi)細(xì)胞中微弱表達(dá)，在慢性肝病中顯著上調(diào)。雙免疫組織化學(xué)顯示，肝成肌纖維細(xì)胞在硬化肝臟中是表達(dá)CB1受體的優(yōu)勢細(xì)胞型。因此，CB1受體表達(dá)和激活與肝纖維化相關(guān)。
第三，對一組慢性丙肝患者進(jìn)行了流行病學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)每天吸入大麻對于慢性丙肝的纖維化進(jìn)程是一個危險因素，因為，這些病人的纖維化速度大于非大麻吸入者。研究表明大麻素信號傳導(dǎo)參與了肝纖維化。因此，大麻信號途徑與肝纖維化相關(guān)。
第四，進(jìn)行了商業(yè)上稱為SR141716(或SR141716A)的CB1受體拮抗劑N-哌啶-5-(4-對氯苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-甲基吡唑-3-甲酰胺或利莫那班(rimonabant)對人和小鼠的肝成肌纖維細(xì)胞培養(yǎng)物體外效應(yīng)的研究，結(jié)果顯示CB1拮抗劑可以抑制肝成肌纖維細(xì)胞的生長。歐洲專利申請EP656354-A1描述了該化合物及其制劑，并提出了結(jié)構(gòu)式I 該CB1拮抗劑及其在藥物學(xué)上可接受的鹽可以按照歐洲專利申請EP656354制備，同樣地藥物組合物可以根據(jù)同一專利的說明書進(jìn)行制備。
第五，對小鼠的體內(nèi)研究顯示，CB1拮抗劑SR141716可以減少作為肝纖維化誘發(fā)模型的四氯化碳誘發(fā)的致死率。
CB1受體拮抗劑在這里被定義為能夠限制CB1受體活化或表達(dá)的化合物。
能夠限制CB1受體活化的化合物包括尤其是能夠與CB1受體激動劑相互作用的化合物，限制所述的激動劑的結(jié)合，或限制所述的結(jié)合導(dǎo)致的CB1受體的活化。
特別是，合適的CB1受體拮抗劑可以特別地針對CB1或者不是針對CB1，并且包括反向激動劑。這些拮抗劑也包括WO 03/077847中描述的取代酰胺，WO 03/087037中描述的取代芳基酰胺，WO 03/063781中描述的取代咪唑，W0 03/086288所描述的雙環(huán)酰胺，WO 03/084943中描述的三聯(lián)苯衍生物，EP-B-656354描述的N-哌啶酮-3-吡唑甲酰胺和N-哌啶-5-(4-對氯苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-甲基吡唑-3-甲酰胺，US5596106和US5747524分別描述的芳基苯并[b]噻吩和苯并[b]呋喃化合物，F(xiàn)R2805817所描述的氮雜環(huán)丁烷衍生物，F(xiàn)R2805810所描述的3-氨基-氮雜環(huán)丁烷，或FR2805818所描述的3-取代或3，3-雙取代1-(雙-((雜)芳基)-甲基)-氮雜環(huán)丁烷，N-(哌啶-1-基)-1-(2，4-二氯苯基)-5-(4-碘苯基)-4-甲基-1H-吡唑-3-甲酰胺(所謂的AM251)以及商業(yè)上所謂的化合物L(fēng)Y-320135。合適的CB1受體拮抗劑也包括專利EP1150961所描述的N-哌啶-5-(4-對溴苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-乙基吡唑-3-甲酰胺。
專利EP576357描述了其他合適的CB1拮抗劑，包括結(jié)構(gòu)式II的化合物，其中，g2、g3、g4、g5和g6以及w2、w3、w4、w5和w6是等同或不同的，并且分別是氫、一個氯原子或溴原子、一個(C1-C3)烷基、一個(C1-C3)烷氧基、一個三氟甲基或一個硝基基團(tuán)，g4可以選擇性地為一個苯基基團(tuán)；R4是氫或一個(C1-C3)烷基；X可以是一個直接鍵或是一個-(CH2)x-N(R3)-基團(tuán)，其中R3是氫或一個(C1-C3)烷基，x是0或1；R是一個-NR1R2基團(tuán)，其中R1和R2各自是一個(C1-C6)烷基；一個被選擇性地取代的非芳香族的(C3-C15)碳環(huán)基，所述的取代基不是取代羰基；一個氨基(C1-C4)烷基基團(tuán)，其中氨基可以被一個(C1-C3)烷基選擇性地雙取代；一個環(huán)烷基(C1-C3)烷基，其中環(huán)烷基是C3-C12；一個非取代的或被一個鹵素、一個(C1-C5)烷基或一個(C1-C5)烷氧基單取代或多取代的苯基；一個苯基(C1-C3)烷基；一個雙苯基(C1-C3)烷基；一個萘基；一個蒽基；一個不被取代的或被一個(C1-C3)烷基、一個羥基或一個芐基取代的飽和的5到8個原子數(shù)的雜環(huán)基，一個1-金剛烷甲基；一個不被取代的或被一個鹵素、一個(C1-C5)烷基或一個(C1-C5)烷氧基單取代或多取代的芳香族雜環(huán)；被一個芳香族雜環(huán)取代的(C1-C3)烷基，其中的芳香族雜環(huán)不被取代或被一個鹵素、一個(C1-C5)烷基或一個(C1-C5)烷氧基單取代或多取代；或者，R1是氫，R2如上所定義；或者，R1和R2與它們結(jié)合的氮原子組成一個飽和的5到8個原子數(shù)的雜環(huán)基，當(dāng)w2、w3、w4、w5、w6、g2、g3、g4、g5和g6都是氫時，所述的雜環(huán)基不是嗎啉；當(dāng)X是-(CH2)XN(R3)-時，如上所定義的一個R2基；一個R5基，當(dāng)X是一個直接鍵時，R5是一個(C1-C3)烷基；一個不被取代或被一個(C1-C5)烷基取代的(C3-C12)環(huán)烷基；一個不被取代或被一個鹵素或一個(C1-C5)烷基所取代的苯基(C1-C3)烷基；一個環(huán)烷基(C1-C3)烷基，其中環(huán)烷基是C3-C12，其不被取代或被一個(C1-C5)烷基所取代；或者一個2-降莰基甲基。
這些結(jié)果不只限定在人類，通?？梢詰?yīng)用到哺乳動物。
包括CB1拮抗劑的組合物可以用于預(yù)防性治療和/或治療。藥物組合物中的活性組分(例如，CB1受體拮抗劑)以“有效劑量”存在。藥物組合物的“有效劑量”是指充足的但非毒性的以提供理想效果的試劑劑量。該術(shù)語是指治療一個受治療對象(例如一個哺乳動物，特別是一個人)所需的充足劑量。因此術(shù)語“治療量”是指通過預(yù)防、阻礙、延遲、或逆轉(zhuǎn)疾病或任何其他不適癥狀的進(jìn)程來治愈一種疾病狀態(tài)或癥狀的充足劑量。術(shù)語“預(yù)防性有效”劑量是指給予還未患病的受治療對象的劑量，因此是一種預(yù)防、阻礙或延遲疾病發(fā)作的有效劑量。
在治療應(yīng)用上，組合物以所述的治愈或至少部分阻止疾病的癥狀及其并發(fā)癥出現(xiàn)的充足劑量應(yīng)用于已經(jīng)患病的患者。根據(jù)幾個已經(jīng)建立起來的方案，可以容易地確定藥物組合物的合適劑量。例如，動物研究(例如小鼠或大鼠)通常被用于確定每公斤體重生物活性劑的最大耐受劑量。通常，至少有一種被測試動物是哺乳動物。從動物研究獲得的結(jié)果可以外推確定其他物種的應(yīng)用劑量，例如人。有效劑量的制定也依賴于疾病或狀態(tài)的屬性和嚴(yán)重性，以及病人一般健康狀況。
在預(yù)防性應(yīng)用上，包括例如CB1受體拮抗劑的組合物應(yīng)用于肝病的易感患者或具有肝病風(fēng)險的其他人。這樣一種量被定義為“治療有效”量或劑量。在該應(yīng)用中，精確的量依賴于病人的健康狀況或體重。
在治療和預(yù)防性治療中，藥物組合物中所包括的拮抗劑可以以幾種劑量或單一劑量應(yīng)用直到達(dá)到理想反應(yīng)。對治療進(jìn)行特征性的監(jiān)控，根據(jù)需要可以給予重復(fù)劑量。一旦需要滅活CB1受體，可以根據(jù)建立起的劑量配方來應(yīng)用本發(fā)明的化合物。
本產(chǎn)品的每日劑量可以在每個成人每天0.01到1,000mg的范圍內(nèi)變動。優(yōu)選的是，組合物包括0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、250和500mg的活性成分，以用于待治療病人的劑量的癥狀調(diào)節(jié)。一種藥物典型性地包括從約0.01到約500mg的活性成分，優(yōu)選是從1mg到約100mg的活性成分。藥物的有效量通常從0.0002mg/kg體重到約20mg/kg體重每天的劑量水平來提供，尤其是從0.001mg/kg體重每天到約10mg/kg體重每天。但是，可以理解的是，對于任何一個具體病人的具體劑量水平和用藥頻率可以變化，并依賴多種因素，其中包括具體所應(yīng)用化合物的活性、代謝穩(wěn)定性、化合物的作用時間、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、應(yīng)用的方式和時間、排泄速率、藥物結(jié)合、具體狀態(tài)的嚴(yán)重性和宿主經(jīng)歷的治療。
在用于口服、舌下、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、局部或直腸給藥的本發(fā)明藥物組合物中，有效成分，單獨(dú)或與其他有效成分結(jié)合，可以以一個單位應(yīng)用形式與常規(guī)的藥物載體組成混合物，對動物和人進(jìn)行應(yīng)用。合適的單位應(yīng)用形式包括經(jīng)口途徑的形式例如片劑、膠囊、粉劑、顆粒和口服的懸浮液或溶液，舌下和口腔的應(yīng)用形式，氣溶膠、植入物、皮下、經(jīng)皮、局部、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、真皮下、經(jīng)皮、鞘內(nèi)、和鼻內(nèi)的應(yīng)用形式和直腸應(yīng)用形式。
適當(dāng)?shù)膽?yīng)用單位形式包括口服應(yīng)用形式，例如片劑、明膠膠囊、粉劑、顆粒和口服的溶液或懸浮液，舌下和口腔的應(yīng)用形式，氣溶膠、植入物，皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)和眼內(nèi)的應(yīng)用形式和直腸應(yīng)用形式。
在本發(fā)明的藥物組合物中，有效成分通常制備成每劑量單位含0.5到1000mg，優(yōu)選的是從1到500mg，更為優(yōu)選的是從2到200mg的所述有效成分的劑量單位，作為每天一次的用量單位。
當(dāng)制備片劑形式的固體組合物時，可以將潤濕劑例如月桂硫酸鈉加入到選擇性微粉化的有效成分，有效成分與藥物載體例如硅土、明膠、淀粉、乳糖、硬脂酸鎂、滑石粉、阿拉伯膠或類似物混合。片劑可以包被有蔗糖、各種聚合物或其他適合的物質(zhì)，或者其可以通過加工使活性得到延長或滯后以持續(xù)釋放設(shè)定劑量的有效成分。
將有效成分與諸如乙二醇或甘油酯的稀釋劑混合并將混合物灌注進(jìn)軟或硬的明膠膠囊內(nèi)制備成明膠膠囊形式的制劑。
糖漿或酏劑形式的制劑可以包括有效成分與甜味劑，優(yōu)選是不含熱量的甜味劑，作為防腐劑的羥苯甲酯或羥苯丙酯，調(diào)味品和適當(dāng)?shù)闹珓?br> 水分散性粉末和顆?？梢园ㄅc分散劑或潤濕劑，或諸如聚乙烯吡咯烷酮的懸浮劑相混合的有效成分，同時混合有甜味劑或矯味劑。
和在直腸溫度融化的粘合劑，例如，可可油脂和聚乙二醇，一起制備成的栓劑進(jìn)行直腸用藥是有效的。
應(yīng)用含有藥理學(xué)上兼容的分散劑和/或潤濕劑，例如丙二醇、丁二醇、或聚乙二醇的水懸浮液、等滲鹽溶液或無菌的注射液進(jìn)行非腸胃、鼻內(nèi)或眼內(nèi)用藥是有效的。
因此，一種助溶劑，例如諸如乙醇的醇類或諸如聚乙二醇或丙二醇的二醇類，以及諸如吐溫.RTM.80(Tween.RTM.80)的親水表面活性劑可以用于制備經(jīng)靜脈內(nèi)途徑可注射的水溶液。通過甘油三酯或甘油酯可以溶解有效成分并制備成通過肌內(nèi)途徑的油性注射液。
應(yīng)用含有有效成分的醇溶液的多層片或貯存器進(jìn)行經(jīng)皮用藥是有效的。
含諸如三油酸山梨坦或油酸并伴有三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或其他生物學(xué)上兼容的推進(jìn)氣相混合的氣溶膠進(jìn)行吸入給藥是有效的。
有效成分也可以制備成選擇性地伴有一種或多種載體或添加劑的微膠囊或微球。
在用于慢性治療的延長釋放形式中，可以應(yīng)用植入物。可以制備成等滲介質(zhì)中的油性懸浮液或微球的懸浮液的形式。
有效成分也可以與環(huán)糊精混合物的形式存在，例如，α-、β-或γ-環(huán)糊精，2-羥丙基-β-環(huán)糊精或甲基-β-環(huán)糊精。
另外一個合適的CB1受體拮抗劑可以存在于直接針對CB1受體的，阻礙CB1受體與拮抗劑結(jié)合的抗體中。
有多種的同工型和其他變異型的CB1受體。因此，對任何這些變異CB1受體的拮抗劑的應(yīng)用都將不會位于本發(fā)明領(lǐng)域之外。通常，并且除了蛋白質(zhì)序列一致性或同源性之外，CB1受體的生物學(xué)功能可以定義作為G蛋白偶聯(lián)細(xì)胞受體，能夠結(jié)合THC并傳遞細(xì)胞信號。技術(shù)人員能夠通過已知的標(biāo)準(zhǔn)程序來檢測CB1受體功能。其可以包括CHO細(xì)胞中假定的CB1 cDNA的表達(dá)，其后應(yīng)用CB1配體的檢測和被激活的假定的CB1受體的細(xì)胞信號傳導(dǎo)活性的測量，例如測量環(huán)磷酸腺苷的產(chǎn)量。
降低大麻素通過CB1受體的信號傳導(dǎo)的可供選擇的藥理學(xué)手段包括下調(diào)或抑制該受體。有多種技術(shù)人員能夠?qū)嵤┑囊阎夹g(shù)來下調(diào)或抑制基因的表達(dá)。一個非窮盡目錄包括同源重組失活(Gossen，當(dāng)代遺傳學(xué)雜志(J，trends Genet).1993年卷927-31頁)，RNA干預(yù)(ElbashirS.M.，自然(Nature)，2001年5月24日411卷(6836)428-9頁)，顯性失活受體的表達(dá)(Dosil，M.等，分子和細(xì)胞生物學(xué)(Mol Cell Biol)1998年10月，卷18(10)5981-91頁)和抑制性轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
根據(jù)先前的報道(Li，L.等，胃腸病學(xué)(Gastroenterology)2003年卷125，460-9頁，Davaille J等，生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)2002年)，可以通過外科技術(shù)從正常人肝臟中取得樣品，用所述樣品制備移植物，應(yīng)用從移植物的生長物中獲得的成肌纖維細(xì)胞培養(yǎng)物來篩選出具有選擇性抗纖維化特性的CB1拮抗劑。篩選具有選擇性抗纖維化特性的CB1拮抗劑的方法具體包括以下步驟
a)制備多份成肌纖維細(xì)胞培養(yǎng)物，b)將每一個細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于一種待檢測的化合物，c)通過評估所述化合物對細(xì)胞存活和生長方面的作用來評價其在成肌纖維細(xì)胞纖維化特性方面的作用，d)選擇被檢測的化合物中的一種。
一個可選擇的方法是如上所述的方法，在步驟c)中，通過評估化合物在合成細(xì)胞外基質(zhì)和防止其降解的組分的能力方面的作用來評價其在成肌纖維細(xì)胞纖維化特性方面的作用。
一個可選擇的方法是如上所述的方法，在步驟c)中，通過評估細(xì)胞因子的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移來評價化合物在成肌纖維細(xì)胞纖維化特性方面的作用。
技術(shù)人員可以通過眾所周知的操作來實(shí)施這些特定的步驟，例如Li，L.等在胃腸病學(xué)(Gastroenterology)2003年卷125，460-9頁的報道，Davaille J等在生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)2002年的報道，Li，L.等在生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)2001年的報道，以及Davaille J等在生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)2000年卷275，34628-33頁的報道。
通過這些方法分離到的化合物可以用于制備治療肝病的組合物。
實(shí)施例實(shí)施例1人硬化肝的CB1受體的上調(diào)材料細(xì)胞培養(yǎng)基和試劑來自Gibco(Invitrogen，法國)。胎牛血清來自JBio Laboratories(法國)。人混合AB陽性血清由國家輸血中心(National Transfusion Center)提供。兔抗CB1受體抗血清(抗人CB1受體第1-14位氨基酸殘基)和CB1阻斷肽(人CB1受體第1-14位氨基酸殘基)來自Cayman(Spibio，法國)。
RNA制備和反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)應(yīng)用RNA提取試劑盒(RNeasy試劑盒，Qiagen，法國)，從100mm培養(yǎng)皿中融合的靜止期細(xì)胞提取總RNA。使用200單位的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，法國)，20μl的反應(yīng)混合物包括0.05ug/μl的寡聚(dT)12-18引物(Invitrogen，法國)，0.5mM的脫氧核苷三磷酸(dNTPs)(Promega，法國)和在第一鏈緩沖液中的10mM二硫蘇糖醇(Invitrogen，法國)，以2μg總RNA為模板通過37℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)1小時，合成cDNA。為檢驗最終的基因組DNA的污染，設(shè)置不含反轉(zhuǎn)錄酶的相同條件為對照。進(jìn)行多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用2μl的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，1.25單位的AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems，法國)和相應(yīng)的緩沖液，其中緩沖液補(bǔ)充有2mM MgCl2，0.2mM dNTPs，和各25pmol的每條引物，總體積為50μl。在GeneAmp 2700熱循環(huán)儀(AppliedBiosystems，法國)中進(jìn)行40個PCR循環(huán)，每個循環(huán)包括變性95℃45秒，退火58℃45秒，延伸72℃30秒，第一個循環(huán)中包括一個延長的變性期(10分鐘)以激活聚合酶，最后一個循環(huán)包括一個延長的延伸期(10分鐘)。CB1的寡聚核苷酸引物(MWG Biotech，法國)如下CB1正義引物5′-TTTGGCTACACAATTGGAAGTCTAAGAACCC-3′，CB1反義引物5′-GCACACATTGACACGTATCCACTGCTTG-3′，預(yù)期的PCR產(chǎn)物長度為287bp。應(yīng)用1.5％瓊脂糖凝膠分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并轉(zhuǎn)印至Hybond-N+膜(Amersham Pharmacia Biotech，法國)上，在包括6×SSC，5mM EDTApH 8，5×denhardt，0.1％SDS和0.1mg/ml ssDNA的緩沖液中進(jìn)行42℃2小時的預(yù)雜交，之后，在含50ng的用T4激酶(Invitrogen，法國)標(biāo)記上[γ-32P]三磷酸腺苷的CB1寡核苷酸探針5’-CCTGTGAGATGTGTATCAGTGTTTATGTGC-3’的相同緩沖液中，所述膜進(jìn)行42℃過夜的雜交反應(yīng)。雜交后在室溫下，用0.1％SDS，1×SSC溶液沖洗印膜兩次30分鐘，應(yīng)用phospho-imager(Molecular Dynamics，法國)分析結(jié)果。
人肝標(biāo)本對來自13名病人(男性8名，女性5名，平均年齡55，年齡范圍39-72)的快速冷凍手術(shù)肝切除術(shù)進(jìn)行了回顧性研究。從因結(jié)腸直腸轉(zhuǎn)移病灶而進(jìn)行肝切除術(shù)的3名女性病人采集了正常肝標(biāo)本(n＝3)，從進(jìn)行了肝移植的病人的8個肝臟和2名因肝細(xì)胞癌而經(jīng)歷肝切除術(shù)的病人采集到了硬化標(biāo)本。硬化繼發(fā)于慢性丙肝(n＝1)或乙肝(n＝2)感染、原發(fā)性膽管肝硬化(n＝1)、酒精性肝病(n＝4)或Wilson病(n＝1)和病因仍然不明的1個病例。
正常和硬化肝CB1受體的免疫組織化學(xué)檢測冷凍切片(5-7μm)經(jīng)空氣干燥并經(jīng)-20℃10分鐘的冰凍丙酮固定。用含20％人血清的pH為7.6的50mM TBS緩沖液(Tris-bufferedsaline)在室溫下預(yù)孵育1小時以阻斷非特異結(jié)合。用抗體稀釋液(Dakopatts，法國)將兔抗人CB1受體的多克隆抗血清(Cayman，Spibio，法國)1/2000稀釋，將切片在4℃進(jìn)一步孵育過夜。用TBS沖洗3次，用1/50稀釋的鼠單克隆抗兔免疫球蛋白G抗體(Dakopatts，法國)在室溫下進(jìn)一步孵育切片45分鐘，用TBS沖洗3次，用1/50稀釋的兔抗鼠免疫球蛋白抗體(Dakopatts，法國)進(jìn)一步孵育切片30分鐘，然后，用出版物L(fēng)i，L.等2003年胃腸病學(xué)(Gastroenterology)卷125，460-9頁報道的堿性磷酸酶-抗堿性磷酸(APAAP)復(fù)合免疫酶法處理切片。為確定一抗的特異性，設(shè)置包括了用相應(yīng)的合成肽(100μg/ml，室溫1小時)預(yù)吸附一抗或省略一抗的對照。為了確定肝成肌纖維細(xì)胞是否表達(dá)CB1蛋白，進(jìn)行CB1和平滑肌α肌動蛋白的免疫雙重染色。為進(jìn)行CB1免疫染色，首先用標(biāo)準(zhǔn)的3階段生物素-鏈霉親和素(biotin-streptavidin)免疫過氧化物酶方法對切片進(jìn)行處理。簡而言之，通過在TBS/0.3％H2O2中進(jìn)行丙酮固定切片的30分鐘孵育將內(nèi)源性過氧化物酶滅活，再用TBS沖洗。通過與TBS/20％人血清預(yù)孵育切片30分鐘阻斷非特異性結(jié)合。切片在抗生物素蛋白(avidin)中孵育15分鐘，然后在生物素中孵育15分鐘(Vector Laboratories，抗生物素蛋白/生物素阻斷試劑盒)，與抗CB1抗血清進(jìn)一步4℃孵育過夜。隨后，切片用TBS沖洗，再與生物素?；难蚩雇枚?Dakopatts，法國)(1/500)和鏈霉親和素-辣根過氧化物酶復(fù)合物(1/50)(Pierce，Perbio，Interchim，法國)分別孵育30分鐘。通過金屬增強(qiáng)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物(Pierce，Interchim，法國)揭示過氧化物酶的活性。除另有提示外，所有的步驟都在室溫下進(jìn)行。平滑肌α肌動蛋白的免疫染色用上述的APAAP方法處理，其中抗平滑肌α肌動蛋白的單克隆抗體(Sigma，法國)按1/5000稀釋。用蘇木精水溶液對載玻片進(jìn)行對比染色。通過裝配有數(shù)碼影像系統(tǒng)(Hamamatsu 3CCD彩色攝影機(jī)，HamamatsuPhotonics，法國)的Axioplan亮視野光學(xué)顯微鏡(Zeiss，Oberkochen，德國)可以觀察到單染色或雙染色。
人肝成肌纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng)可通過Davaille，J.等在生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)2000年卷275，34628-33頁所描述的方法，從良性或惡性肝腫瘤的外科手術(shù)中獲得正常肝臟的手術(shù)標(biāo)本，從由其制備的移植物的培養(yǎng)物中獲得人肝成肌纖維細(xì)胞。細(xì)胞在含10％血清(5％胎牛血清和5％人血清，DMEM5/5)的Dulbecco′s改良Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)，并采用第三代到第七代之間的培養(yǎng)細(xì)胞。除特別提示外，實(shí)驗所應(yīng)用的細(xì)胞是通過在無血清的Waymouth培養(yǎng)基中孵育48小時獲得的靜止期細(xì)胞。按照Davaille，J.等在生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)2000年卷275第34628-33頁中所述的方法，對這些細(xì)胞的成肌纖維的屬性進(jìn)行了評價，這些顯示了在肝纖維化過程中原位發(fā)現(xiàn)的促纖維化細(xì)胞的表型和功能特征(Win，K.M.等，肝臟病學(xué)(Hepatology)1993年卷18，137-45頁)。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)物表達(dá)平滑肌α肌動蛋白和肝成肌纖維細(xì)胞的2個標(biāo)記，錨定素-2(fibulin-2)和白細(xì)胞介素-6(Davaille，J.等，生物化學(xué)雜志(JBiol Chem)2000年卷275，34628-33頁)。
培養(yǎng)的人肝成肌纖維細(xì)胞中CB1受體的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測人肝成肌纖維細(xì)胞被接種(10,000/cm2)到35個培養(yǎng)皿中，在含血清培養(yǎng)基中生長24小時，血清撤除48小時，用TBS沖洗，用4％的多聚甲醛固定10分鐘。用TBS沖洗一次后，細(xì)胞在含20％人血清的TBS室溫下孵育30分鐘，進(jìn)一步和抗CB1抗血清(用TBS/20％人血清按1/500的比例稀釋)室溫下孵育3小時，并在保濕箱中4℃過夜。細(xì)胞在TBS中反復(fù)沖洗，與熒光素Cy3-共軛的(Cy3-conjugated)羊抗兔IgG(Sigma，法國)(用TBS/20％人血清按1/50的比例稀釋)在室溫下、避光孵育30分鐘，沖洗，用VECTASHIELD Mounting培養(yǎng)基包覆(VectorLaboratories，Burlingame，CA)，并在熒光顯微鏡下觀察。為確定一抗的特異性，設(shè)置包括了用相應(yīng)的合成肽(100μg/ml，室溫1小時)預(yù)吸附一抗或省略一抗的對照。
用直接抗人CB1受體的多克隆抗體在冰凍組織切片上通過免疫組織化學(xué)法研究CB1受體的表達(dá)，所述冰凍組織切片從正常肝的手術(shù)標(biāo)本(n＝3)，不同病因的肝硬化手術(shù)標(biāo)本(n＝10)(慢性丙肝(n＝1)或乙肝(n＝2)感染、原發(fā)性膽管肝硬化(n＝1)、酒精性肝病(n＝4)或Wilson病(n＝1)和病因不明1例)制備。在正常肝臟中，沿著竇狀小管壁可以檢測到離散的、間斷的CB1免疫反應(yīng)性，在硬化肝中，CB1免疫染色總強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，與肝硬化的病因無關(guān)。沿著纖維化間隔分布的大量紡錘形細(xì)胞中CB1是非常明顯的。在其他非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了CB1受體的表達(dá)，包括炎癥細(xì)胞和沿著纖維間隔分布的膽管增生細(xì)胞。在孵育時存在CB1阻斷肽或缺少一抗時切片沒有信號，證明了抗體的特異性。
雙免疫組織化學(xué)法，用抗CB1受體抗體和抗平滑肌α肌動蛋白抗體，清楚地鑒定出在纖維化間隔內(nèi)作為表達(dá)CB1受體的主要細(xì)胞類型的肝成肌纖維細(xì)胞。因此，通過RT-PCR分析和免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)，培養(yǎng)的人肝成肌纖維細(xì)胞也表達(dá)CB1受體。
實(shí)施例2CB1缺陷型小鼠纖維化反應(yīng)的降低動物和實(shí)驗設(shè)計根據(jù)Ledent，C.等在科學(xué)(Science)1999年卷283，401-4頁報道的方法產(chǎn)生CB1受體失活的雄性CD1小鼠和野生型同窩小鼠。在產(chǎn)生用于本研究的野生型和突變型小鼠之前，將雜交小鼠在CD1背景下飼育到15代以上。采用40只雄性鼠WT(n＝20)和CB1-/-(n＝20)，8-10周齡。動物分組如下WT空白對照組(橄欖油n＝8)；WT CCl4組(n＝12)；CB1-/-空白對照組(橄欖油n＝5)；CB1-/-CCl4組(n＝15)。動物被放置于控制溫度和濕度的房間內(nèi)，保持12小時光亮和黑暗的循環(huán)，不限制食物和水的供應(yīng)，除非另有提示。施予四氯化碳(CCl4)(Sigma，St Quentin-Fallavier，法國)和橄欖油的混合物(1∶10體積比)，按0.5ml/公斤體重的量腹膜內(nèi)注射，一周兩次誘導(dǎo)纖維化，與等體積的酒精與聚氧乙烯氫化蓖麻油(Cremophor)和PBS的混合物(5/5/90)一周三次交替。CCl4的空白對照動物給予橄欖油。4周后，動物禁食過夜，在接受最后一次CCl4注射48小時后被處死。肝臟標(biāo)本取自幾個肝葉并且進(jìn)行1)用液氮快速冷凍并在RNA提取液中均質(zhì)化，或2)在水中均質(zhì)化，用液氮快速冷凍用于羥脯氨酸測定，或3)固定在福爾馬林緩沖液中?？焖倮鋬鰳?biāo)本保存在-80℃待用。血液標(biāo)本也采集到含惰性膠屏障和促凝劑盤(clot activator disc)的硅樹脂管內(nèi)(Venoject，Terumo，法國)，通過離心分離血清，在-20℃保存待用。
肝功能檢測在自動化分析儀上進(jìn)行常規(guī)的肝功能血液檢測(膽紅素、堿性磷酸酶和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)。
纖維化、炎癥和壞死的評價肝臟標(biāo)本在10％福爾馬林中固定，石蠟包埋。組織切片(4μm厚)用蘇木精-伊紅染色(H&E)以用于常規(guī)檢測，或用Picro-Sirius紅染色以用于觀察肝臟膠原質(zhì)沉積。組織學(xué)分級(壞死和炎性浸潤)和分階段(纖維化)通過一位獨(dú)立的病理解剖學(xué)家對來自每個肝臟的不同區(qū)域的至少4個片段進(jìn)行盲法評價。根據(jù)半定量的改良METAVIR評分系統(tǒng)將纖維化分成0到4個階段無纖維化＝0，門靜脈處纖維化但不包括間隔＝1，幾個間隔＝2，大量的間隔但沒有硬化＝3，以及硬化＝4。通過估算相應(yīng)于每個片段中個體得分水平的面積百分比和結(jié)合每一肝臟的數(shù)據(jù)資料來考慮所存在的纖維化在整個肝臟中的不均勻性。壞死，通過嗜酸小體、氣球樣變性和/或肝細(xì)胞壞死的分散性病灶來定義，其被分級為無＝0，輕微＝1(包括1/3肝葉或小結(jié))，中等(包括1/3-2/3肝葉或小結(jié))＝2，顯著(包括2/3以上肝葉或小結(jié))。炎性浸潤被分為0-3無＝0，輕微(門靜脈和/或肝小葉)的少于1/3肝小葉或小結(jié)的炎性浸潤＝1，中等(門靜脈和/或肝小葉)的1/3-2/3的肝小葉或小結(jié)的炎性浸潤＝2，顯著(門靜脈和/或肝小葉)的大于2/3的肝小葉或小結(jié)的炎性浸潤＝3。所有的標(biāo)本本同時評分。
羥脯氨酸含量根據(jù)Grenard，P.等在肝臟病學(xué)雜志(J Hepatol)1997年卷26，1356-62頁的報道進(jìn)行羥脯氨酸含量測定。匯集每個肝臟的3個小片段，在蒸餾水中均質(zhì)化，凍干并在6N HCl中在110℃過夜水解(10mg肝臟干粉/ml HCl 6N)。水解物用活性碳處理，過濾，蒸發(fā)脫水，重懸于蒸餾水中。根據(jù)Woessner，J.F.在生物化學(xué)與生物物理文獻(xiàn)(Arch Biochem Biophys)1961年卷93，440-7頁報道的并經(jīng)Creemers，L.B等在生物技術(shù)雜志(Biotechniques)1997年卷22，656-8頁報道加以改進(jìn)的方法，用等份水解物與Ehrlich′s試劑反應(yīng)通過分光光度計測定羥脯氨酸(HP)含量。肝羥脯氨酸含量用每毫克組織(干重)中的微克數(shù)表示。
小鼠肝成肌纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng)根據(jù)Vrochides，D.等在肝臟病學(xué)雜志(Hepatology)1996年卷23(6)1650-5頁的報道，通過膠原酶灌注和在Nicodenz內(nèi)進(jìn)行密度梯度純化分離小鼠成肌纖維細(xì)胞。分離后，在含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。第1天，通過沖洗去除細(xì)胞碎片和非粘附細(xì)胞，然后繼續(xù)在含10％胎牛血清(FCS)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。采用第3到第9代的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)有表達(dá)平滑肌α肌動蛋白、錨定素-1和白介素-6。
Caspase-3樣活性的測定對貼壁過夜生長于含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，在指定時間內(nèi)實(shí)施血清饑餓的非融合細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。根據(jù)Davaille，J.等在生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)2002年卷277(40)37323-30頁；Li，L.等在生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)2001年卷276(41)38152-8頁報道的方法，以AC-DEVD-AFC為底物，分析細(xì)胞溶解物的Caspase-3樣活性。
細(xì)胞存活力的評價鼠肝成肌纖維細(xì)胞(96孔板中7,000個細(xì)胞/孔)貼壁過夜生長于DMEM10％培養(yǎng)基，在指定時間內(nèi)實(shí)施血清饑餓。每孔內(nèi)加CellTiter96 AQueous One Solution試劑，記錄在490nm處的吸收值。
肝TGF-β1的測定在酸激活全肝組織勻漿中測定TGF-β1的含量。冰凍肝標(biāo)本在裂解緩沖液(25mM HEPES pH7.4，1％NP40，5mM MgCl2，1.3mM EDTA，1mMEGTA，磷酸酶和蛋白酶抑制劑)中4℃30分鐘被均質(zhì)化。12,000g4℃10分鐘離心，收集裂解上清液保存于-80℃待分析。用BCA蛋白分析法(Pierce)以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品確定蛋白濃度。為將隱性TGF-β1激活為免疫反應(yīng)性形式，組織裂解液在等體積的2.5N乙酸，10M尿素內(nèi)室溫10分鐘酸化，再在1M HEPES中用2.7M NaOH中和。用鼠TGF-β1 Quantikine(R&D Systems，法國)根據(jù)廠商說明書，進(jìn)行ELISA檢測，以鼠TGF-β1重組蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品。結(jié)果以TGF-β1的pg數(shù)/mg可溶性蛋白計。
平滑肌α肌動蛋白的免疫組織化學(xué)染色肝組織在福爾馬林中固定，在石蠟中包埋。應(yīng)用Vector M.O.M.免疫檢測試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商(Vector Laboratories)的詳細(xì)說明書，進(jìn)行平滑肌α肌動蛋白的免疫組織化學(xué)染色。簡而言之，石蠟包埋的切片進(jìn)行脫蠟處理，通過二甲苯和乙醇進(jìn)入TBS(50mM Tris，150mMNaCI，pH7.6)進(jìn)行再水化作用。每個載玻片在枸櫞酸鹽緩沖液中以700W的功率被微波加熱2次，每次5分鐘。在含0.3％H2O2的TBS中孵育1小時以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。切片在含1.5％馬血清的TBS內(nèi)預(yù)孵育1小時以阻斷非特異結(jié)合，之后，切片在抗生物素蛋白中孵育15分鐘，接著在生物素中孵育15分鐘(Avidin/Biotin blocking試劑盒，Vector Laboratories)，進(jìn)一步與MOM Mouse Ig Blocking溶液孵育1小時。然后用TBS沖洗切片，接著依次與MOM稀釋液孵育5分鐘，與抗平滑肌α肌動蛋白的單克隆抗體的1∶1000稀釋液孵育30分鐘(Sigma，法國)，與MOM生物素?；目故驣gG試劑孵育10分鐘，最后與Vectastain ABC Reagent孵育5分鐘。通過金屬增強(qiáng)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物(Pierce，Interchim，法國)得出過氧化物酶的活性。所有的步驟都在室溫下進(jìn)行。與替代一抗的MOM稀釋液一起染色的對照載玻片不顯示任何的陽性染色。用帶有Image-Pro Plus軟件(MediaCybernetics，MicroMecanique，法國)的形態(tài)學(xué)分析系統(tǒng)對每個動物的4-5個肝片段進(jìn)行陽性染色區(qū)域的測定。
統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果以n個實(shí)驗的平均數(shù)±SEM表示。對結(jié)果進(jìn)行雙向方差分析(two-way analysis of variance，ANOVA)，再根據(jù)Student-Newmann-Keuls方法進(jìn)行配對對比校正。最小統(tǒng)計學(xué)意義設(shè)為p＜0.05。
CB1受體缺陷型小鼠(CB1-/-)及其同窩出生的野生型小鼠(WT)暴露于長期CCl4的處理下?？瞻讓φ招∈?CB1-/-和WT)給予橄欖油。如表1所列的4個實(shí)驗組之間的體重、肝重和肝重/體重比的平均數(shù)無明顯差別。
表1.野生型小鼠(WT)和CB1缺陷型小鼠經(jīng)4周CCl4的處理后生命指征和肝功檢測

結(jié)果表示為平均數(shù)±SEM。*P＜0.05對WT橄欖油；#P＜0.05對CB1-/-橄欖油經(jīng)PicroSirius紅染色的肝組織切片的組織學(xué)分析顯示，CCl4處理4周后WT小鼠發(fā)生了肝纖維化。CCl4處理的WT小鼠肝臟顯示大量的伴有節(jié)結(jié)的間隔形成。顯著的是，CCl4處理的CB1-/-小鼠顯示出較弱的纖維化反應(yīng)，纖維化間隔的形成減少。因此，CCl4處理的CB1-/-小鼠的纖維化得分比CCl4處理的WT小鼠明顯低(分別為2.59±0.13和3.33±0.13，p＜0.05)。而且，根據(jù)羥脯氨酸定量估算的肝膠原質(zhì)含量，CCl4處理的CB1-缺陷小鼠與WT對照組相比，大幅降低了40％(分別為0.45±0.06和0.73±0.11mg/組織mg數(shù)(干重)p＜0.05)。最后，如表2所示，壞死和炎癥在CCl4處理的WT和CB1-/-小鼠之間無顯著差別。
表2.野生型(WT)和CB1-/-小鼠經(jīng)4周CCl4的處理4周后的壞死和炎癥

結(jié)果表示為平均數(shù)±SEM對肝內(nèi)纖維化細(xì)胞因子TGF-β1的含量進(jìn)行測定，并對平滑肌α肌動蛋白的表達(dá)進(jìn)行估計，其是肝成肌纖維細(xì)胞和活化的肝星形細(xì)胞的標(biāo)志。在CCl4處理的動物中，CB1缺陷鼠與野生型對照組比，TGF-β1生成降低(圖1A)。另外，與CCl4處理的WT小鼠比較，CCl4處理的CB1-/-小鼠的平滑肌α肌動蛋白明顯降低(1.23±0.09對2.58±0.23；p＜0.05)(圖1B)。
最后，為評價CB1的失活是否通過降低肝成肌纖維細(xì)胞的增生和/或凋亡而降低其積聚，利用了分離于WT和CB1-/-小鼠的肝成肌纖維細(xì)胞。用血清撤除刺激凋亡的發(fā)生。血清剝奪幾乎不影響分離于野生型小鼠(WT)的肝成肌纖維細(xì)胞的存活能力(圖2)。與此相對照的是，血清饑餓對分離于CB1-/-動物的肝成肌纖維細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞毒性效應(yīng)，即所顯示的細(xì)胞圓形化(cell rounding)，萎縮、分離及存活力降低(圖2A)。與WT細(xì)胞相比，血清撤除也加強(qiáng)刺激了CB1-/-細(xì)胞的caspase-3樣活性(圖2B)。因此，CB1-/-小鼠的肝成肌纖維細(xì)胞與WT小鼠的相比，顯示出更高的凋亡率。
結(jié)果說明CB1受體的失活使肝成肌纖維細(xì)胞對凋亡變得敏感。
實(shí)施例3每天吸入大麻是慢性丙型肝炎纖維化進(jìn)程中得一個危險因素。
包含了長期暴露于危險因素的195名連續(xù)未經(jīng)過治療的病人(男性/女性140/55，年齡42±10)。收集的數(shù)據(jù)包括病程持續(xù)階段的大麻，酒精和煙草的消耗量，接觸年齡、性別、傳播途徑、基因型、體重指數(shù)(BMI)、脂肪變性、活性和纖維化(METAVIR分期)，以及纖維化進(jìn)程速度(中值為每年0.08)。
通過單變量分析，大于每年0.08的纖維化進(jìn)程速度與如表3顯示的大麻吸入量，酒精攝入量≥30g/天(64％，p＝0.03)，中等或顯著脂肪變性(65％，p＝0.004)，接觸年齡≥25(63％，p＜0.01)，組織學(xué)活性≥A2(65％，p＜0.001)相關(guān)。在多變量分析中，纖維化進(jìn)程速度＞0.08獨(dú)立與日大麻吸入量(OR＝3.8；95％可信限(1.7-8.7))，酒精攝入量≥30g/天(OR＝2.1；95％可信限(1.0-4.6))，接觸年齡≥25(OR＝4.0；95％可信限(1.9-8.4))，活性≥A2(OR＝7.5；95％可信限(3.5-16.1))相關(guān)。因此在日大麻吸入量與纖維化進(jìn)程存在因果聯(lián)系。
表3大麻消耗量對纖維化進(jìn)程的影響。

實(shí)施例4在CB1受體拮抗劑存在時肝成肌纖維細(xì)胞培養(yǎng)人肝成肌纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng)根據(jù)先前的報道，從良性或惡性肝腫瘤的外科手術(shù)中獲得正常肝臟的手術(shù)標(biāo)本，從由其制備的外植物的培養(yǎng)物中獲得人肝成肌纖維細(xì)胞。本操作的實(shí)施符合法國立法的倫理準(zhǔn)則。細(xì)胞在含10％血清(5％胎牛血清和5％人血清，DMEM5/5)的Dulbecco′s改良Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)，并采用第三代到第七代之間的培養(yǎng)細(xì)胞。除特別提示外，實(shí)驗所應(yīng)用的細(xì)胞是通過在無血清的Waymouth培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時獲得的靜止期細(xì)胞。
小鼠肝成肌纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng)根據(jù)報道，通過膠原酶灌注和在Nicodenz內(nèi)進(jìn)行密度梯度純化分離小鼠成肌纖維細(xì)胞。分離后，在含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。第1天，通過沖洗去除細(xì)胞碎片和非粘附細(xì)胞，然后繼續(xù)在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。采用第3到第9代的細(xì)胞。
細(xì)胞凋亡檢測根據(jù)Davaille，J.等在生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)2002年卷277(40)37323-30頁和Li，L.等在生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)2001年卷276(41)38152-8頁報道的方法，對貼壁過夜生長于DMEM5/5培養(yǎng)基，血清饑餓48小時的非融合細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。用DAP1染色進(jìn)行核形態(tài)學(xué)分析，以AC-DEVD-AFC為底物，分析細(xì)胞溶解物的Caspase-3樣活性。應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA梯度片段(DNA laddering)，總DNA用Apoptotic DNA Ladder試劑盒提取。
細(xì)胞存活能力細(xì)胞(96孔板中7,000個細(xì)胞/孔)貼壁過夜生長于DMEM5/5培養(yǎng)基，在不含酚紅的DMEM中血清饑餓48小時，用效應(yīng)指示物處理16小時。每孔內(nèi)加CellTiter 96 AQueous One Solution試劑，記錄在490nm處的吸收值。
DNA合成的測定根據(jù)先前報道(Tao，J.等，生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)，1999年卷274(34)23761-23769頁)，用[3H]胸腺嘧啶摻入法在一式三份的孔中測定DNA合成。融合的人肝成肌纖維細(xì)胞血清饑餓48小時，用20ng/ml PDGF-BB進(jìn)一步刺激30小時。融合的鼠肝成肌纖維細(xì)胞在0.1％BSA存在的情況下血清饑餓24小時，在0.01％BSA存在的情況下用20ng/ml PDGF-BB進(jìn)一步刺激30小時。在孵育的最后24小時加入[3H]胸腺嘧啶(0.5μCi/孔)。
按照實(shí)施例1所描述的方法處理細(xì)胞培養(yǎng)物。人和小鼠的肝成肌纖維細(xì)胞都暴露在CB1受體拮抗劑SR141716增高劑量下，并測定肝成肌纖維細(xì)胞的DNA合成。
在人肝成肌纖維細(xì)胞中，20ng/ml的PDGF-BB引起SR141716劑量依賴性抑制的DNA合成(圖3A)。當(dāng)化合物的濃度在300-400nM時，出現(xiàn)最大半數(shù)抑制。
在分離于野生型小鼠的肝成肌纖維細(xì)胞中，SR141716也抑制由20ng/ml的PDGF-BB引起的DNA的合成，但是，其只輕微影響CB1-/-細(xì)胞的增殖(圖3B)。
這些結(jié)果說明CB1拮抗劑SR141716導(dǎo)致人和小鼠的肝成肌纖維細(xì)胞生長受限，并且是通過CB1受體起作用的。
實(shí)施例5SR141716對被誘導(dǎo)的肝硬化的治療效果評價對CB1受體拮抗劑SR141716在通過四氯化碳的慢性中毒誘導(dǎo)出的肝纖維化實(shí)驗?zāi)Ｐ蜕系目估w維化潛力進(jìn)行了評估。
施藥SR141716(10mg/每kg體重)用前溶解在賦形劑溶液里(含10％二甲亞砜和5％乙醇的PBS10ml中加入2滴Tween 80)并做超聲處理。
動物和實(shí)驗設(shè)計CD1小鼠來自Janvier(法國)。所有的實(shí)驗都根據(jù)倫理準(zhǔn)則進(jìn)行操作。采用36只10-12周大的雄性小鼠，動物分為以下各組賦形劑治療的橄欖油組(n＝3)；賦形劑治療的四氯化碳組(n＝14)；SR141716治療的橄欖油組(n＝3)；SR141716治療的四氯化碳組(n＝16)。動物被放置于控制溫度和濕度的房間內(nèi)，保持12小時光亮和黑暗的循環(huán)，不限制食物和水的供應(yīng)，除非另有提示。施予四氯化碳(CCl4)(Sigma，St Quentin-Fallavier，法國)和橄欖油的混合物(1∶10體積比)按0.5ml/公斤體重，一周兩次腹膜內(nèi)注射1個月，誘導(dǎo)纖維化。SR141716或賦形劑每天通過腹膜內(nèi)注射施藥。在四氯化碳(CCl4)注射前7天開始治療并一直持續(xù)貫穿于CCl4處理的過程。
CCl4和賦形劑(包括10％DMSO，5％乙醇，0.1％Tween 80的PBS)聯(lián)合施藥在1個月后引起大量的達(dá)到組群的50％的死亡率(圖4)。與此相對照的是，CCl4和10mg/kg的SR141716聯(lián)合施藥在1個月時卻有更高的存活率(83％)?？瞻讓φ談游餂]有死亡，不論是用SR141716或賦形劑進(jìn)行處理。
因此，這些結(jié)果都表明了CB1受體拮抗劑SR141716的肝保護(hù)的作用。
實(shí)施例6在治療肝纖維化中SR141716口服給藥的最優(yōu)療法的評價為了確定SR141716長期治療的最優(yōu)條件，實(shí)施了以下研究。
40只雄性CD1小鼠分為以下各組空白組(橄欖油，n＝3)；CCl4組(n＝12)；SR141716治療的空白組(橄欖油，n＝3)；2組SR141716治療的CCl4組(n＝2×12)。動物被放置于控制溫度和濕度的房間內(nèi)，保持12小時光亮和黑暗的循環(huán)，不限制食物和水的供應(yīng)，除非另有提示。施予四氯化碳(CCl4)(Sigma，St Quentin-Fallavier，法國)和橄欖油的混合物(1∶10體積比)按0.5ml/公斤體重，腹膜內(nèi)注射(IP)，一周兩次誘導(dǎo)纖維化。CCl4空白組的動物給予橄欖油。SR141716以65mg/kg的濃度包含在RM1鼠食中(DIETEX，法國)，施予SR141716治療組。假定一只30g的小鼠每天吃5g的食物，SR141716施藥的最后期望劑量是10mg/kg。SR141716的治療既可在四氯化碳(CCl4)注射前的7天開始(12只小鼠)，也可在第一次注射四氯化碳(CCl4)后開始(12只小鼠)，且持續(xù)貫穿整個四氯化碳處理過程。5周后，動物禁食過夜，在接受最后一次CCl4注射48小時后被處死。肝臟標(biāo)本取自幾個肝葉并且進(jìn)行1)在液氮中快速冷凍并在RNA提取液中均質(zhì)化，或2)在水中均質(zhì)化，在液氮中快速冷凍用于羥脯氨酸測定，或3)用福爾馬林緩沖液固定?？焖倮鋬鰳?biāo)本保存在-80℃待用。血液標(biāo)本也采集到含惰性膠屏障和促凝劑盤的硅樹脂管內(nèi)(Venoject，Terumo，法國)，通過離心分離血清，保存在-20℃待用。結(jié)果用于評估治療上可接受毒性的濃度。
序列表<110>因瑟姆公司薩諾飛阿文蒂斯公司<120>一種CB1受體拮抗劑在制備有益于肝疾治療的組合物中的應(yīng)用<130>CB1<150>EP04290633<151>2004-03-09<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>472<212>PRT<213>人<400>1Met Lys Ser Ile leu Asp Gly Leu Ala Asp Thr Thr Phe Arg Thr Ile1 5 10 15Thr Thr Asp Leu Leu Tyr Val Gly Ser Asn Asp Ile Gln Tyr Glu Asp20 25 30Ile Lys Gly Asp Met Ala Ser Lys Leu Gly Tyr Phe Pro Gln Lys Phe35 40 45Pro Leu Thr Ser Phe Arg Gly Ser Pro Phe Gln Glu Lys Met Thr Ala50 55 60Gly Asp Asn Pro Gln Leu Val Pro Ala Asp Gln Val Asn Ile Thr Glu65 70 75 80Phe Tyr Asn Lys Ser Leu Ser Ser Phe Lys Glu Asn Glu Glu Asn Ile85 90 95Gln Cys Gly Glu Asn Phe Met Asp Ile Glu Cys Phe Met Val Leu Asn100 105 110Pro Ser Gln Gln Leu Ala Ile Ala Val Leu Ser Leu Thr Leu Gly Thr115 120 125
Phe Thr Val Leu Glu Asn Leu Leu Val Leu Cys Val Ile Leu His Ser130 135 140Arg Ser Leu Arg Cys Arg Pro Ser Tyr His Phe Ile Gly Ser Leu Ala145 150 155 160Val Ala Asp Leu Leu Gly Ser Val Ile Phe Val Tyr Ser Phe Ile Asp165 170 175Phe His Val Phe His Arg Lys Asp Ser Arg Asn Val Phe Leu Phe Lys180 185 190Leu Gly Gly Val Thr Ala Ser Phe Thr Ala Ser Val Gly Ser Leu Phe195 200 205Leu Thr Ala Ile Asp Arg Tyr Ile Ser Ile His Arg Pro Leu Ala Tyr210 215 220Lys Arg Ile Val Thr Arg Pro Lys Ala Val Val Ala Phe Cys Leu Met225 230 235 240Trp Thr Ile Ala Ile Val Ile Ala Val Leu Pro Leu Leu Gly Trp Asn245 250 255Cys Glu Lys Leu Gln Ser Val Cys Ser Asp Ile Phe Pro His Ile Asp260 265 270Glu Thr Tyr Leu Met Phe Trp Ile Gly Val Thr Ser Val Leu Leu Leu275 280 285Phe Ile Val Tyr Ala Tyr Met Tyr Ile Leu Trp Lys Ala His Ser His290 295 300Ala Val Arg Met Ile Gln Arg Gly Thr Gln Lys Ser Ile Ile Ile His305 310 315 320Thr Ser Glu Asp Gly Lys Val Gln Val Thr Arg Pro Asp Gln Ala Arg325 330 335Met Asp Ile Arg Leu Ala Lys Thr Leu Val Leu Ile Leu Val Val Leu340 345 350Ile Ile Cys Trp Gly Pro Leu Leu Ala Ile Met Val Tyr Asp Val Phe355 360 365Gly Lys Met Asn Lys Leu Ile Lys Thr Val Phe Ala Phe Cys Ser Met370 375 380Leu Cys Leu Leu Asn Ser Thr Val Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Leu Arg385 390 395 400
Ser Lys Asp Leu Arg His Ala Phe Arg Ser Met Phe Pro Ser Cys Glu405 410 415Gly Thr Ala Gln Pro Leu Asp Asn Ser Met Gly Asp Ser Asp Cys Leu420 425 430His Lys His Ala Asn Asn Ala Ala Ser Val His Arg Ala Ala Glu Ser435 440 445Cys Ile Lys Ser Thr Val Lys Ile Ala Lys Val Thr Met Ser Val Ser450 455 460Thr Asp Thr Ser Ala Glu Ala Leu465 470<210>2<211>411<212>PRT<213>人<400>2Met Ala Leu Gln Ile Pro Pro Ser Ala Pro Ser Pro Leu Thr Ser Cys1 5 10 15Thr Trp Ala Gln Met Thr Phe Ser Thr Lys Thr Ser Lys Glu Asn Glu20 25 30Glu Asn Ile Gln Cys Gly Glu Asn Phe Met Asp Ile Glu Cys Phe Met35 40 45Val Leu Asn Pro Ser Gln Gln Leu Ala Ile Ala Val Leu Ser Leu Thr50 55 60Leu Gly Thr Phe Thr Val Leu Glu Asn Leu Leu Val Leu Cys Val Ile65 70 75 80Leu His Ser Arg Ser Leu Arg Cys Arg Pro Ser Tyr His Phe Ile Gly85 90 95Ser Leu Ala Val Ala Asp Leu Leu Gly Ser Val Ile Phe Val Tyr Ser100 105 110Phe Ile Asp Phe His Val Phe His Arg Lys Asp Ser Arg Asn Val Phe115 120 125Leu Phe Lys Leu Gly Gly Val Thr Ala Ser Phe Thr Ala Ser Val Gly130 135 140
Ser Leu Phe Leu Thr Ala Ile Asp Arg Tyr Ile Ser Ile His Arg Pro145 150 155 160Leu Ala Tyr Lys Arg Ile Val Thr Arg Pro Lys Ala Val Val Ala Phe165 170 175Cys Leu Met Trp Thr Ile Ala Ile Val Ile Ala Val Leu Pro Leu Leu180 185 190Gly Trp Asn Cys Glu Lys Leu Gln Ser Val Cys Ser Asp Ile Phe Pro195 200 205His Ile Asp Glu Thr Tyr Leu Met Phe Trp Ile Gly Val Thr Ser Val210 215 220Leu Leu Leu Phe Ile Val Tyr Ala Tyr Met Tyr Ile Leu Trp Lys Ala225 230 235 240His Ser His Ala Val Arg Met Ile Gln Arg Gly Thr Gln Lys Ser Ile245 250 255Ile Ile His Thr Ser Glu Asp Gly Lys Val Gln Val Thr Arg Pro Asp260 265 270Gln Ala Arg Met Asp Ile Arg Leu Ala Lys Thr Leu Val Leu Ile Leu275 280 285Val Val Leu Ile Ile Cys Trp Gly Pro Leu Leu Ala Ile Met Val Tyr290 295 300Asp Val Phe Gly Lys Met Asn Lys Leu Ile Lys Thr Val Phe Ala Phe305 310 315 320Cys Ser Met Leu Cys Leu Leu Asn Ser Thr Val Asn Pro Ile Ile Tyr325 330 335Ala Leu Arg Ser Lys Asp Leu Arg His Ala Phe Arg Ser Met Phe Pro340 345 350Ser Cys Glu Gly Thr Ala Gln Pro Leu Asp Asn Ser Met Gly Asp Ser355 360 365Asp Cys Leu His Lys His Ala Asn Asn Ala Ala Ser Val His Arg Ala370 375 380Ala Glu Ser Cys Ile Lys Ser Thr Val Lys Ile Ala Lys Val Thr Met385 390 395 400Ser Val Ser Thr Asp Thr Ser Ala Glu Ala Leu405 410
<210>3<211>20<212>PRT<213>人<400>3Phe Arg Thr Ile Thr Thr Asp Leu Leu Tyr Val Gly Ser Asn Asp Ile1 5 10 15Gln Tyr Glu Asp20<210>4<211>23<212>PRT<213>人<400>4Asp Met Ala Ser Lys Leu Gly Tyr Phe Pro Gln Lys Phe Pro Leu Thr1 5 10 15Ser Phe Arg Gly Ser Pro Phe20<210>5<211>20<212>PRT<213>人<400>5Thr Glu Phe Tyr Asn Lys Ser Leu Ser Ser Phe Lys Glu Asn Glu Glu1 5 10 15Asn Ile Gln Cys20
<210>6<211>20<212>PRT<213>人<400>6Arg Met Ile Gln Arg Gly Thr Gln Lys Ser Ile Ile Ile His Thr Ser1 5 10 15Glu Asp Gly Lys20<210>7<211>12<212>PRT<213>人<400>7Val Tyr Asp Val Phe Gly Lys Met Asn Lys Leu Ile1 5 10<210>8<211>20<212>PRT<213>人<400>8His Lys His Ala Asn Asn Ala Ala Ser Val His Arg Ala Ala Glu Ser1 5 10 15Cys Ile Lys Ser20
<210>9<211>20<212>PRT<213>人<400>9His Lys His Ala Asn Asn Thr Ala Ser Met His Arg Ala Ala Glu Ser1 5 10 15Cys Ile Lys Ser20
權(quán)利要求
1.一種CB1受體的拮抗劑在制備治療肝病的組合物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于CB1受體拮抗劑是一種特殊的CB1受體拮抗劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述肝病導(dǎo)致肝纖維化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的應(yīng)用，其特征在于所述肝病是酒精性肝硬化。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3的所述應(yīng)用，其特征在于所述肝病是慢性病毒性肝炎。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的應(yīng)用，其特征在于所述肝病是非酒精性的脂肪性肝炎。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的應(yīng)用，其特征在于所述肝病是原發(fā)性肝癌。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的應(yīng)用，其特征在于拮抗劑是一種結(jié)構(gòu)式II的化合物或其在制藥學(xué)上可以接受的鹽之一，其中，g2、g3、g4、g5和g6以及w2、w3、w4、w5和w6是等同或不同的，并且分別是氫、一個氯原子或溴原子、一個(C1-C3)烷基、一個(C1-C3)烷氧基、一個三氟甲基或一個硝基基團(tuán)，g4可以選擇性地為一個苯基基團(tuán)；R4是氫或一個(C1-C3)烷基；X可以是一個直接鍵或是一個-(CH2)x-N(R3)-基團(tuán)，其中R3是氫或一個(C1-C3)烷基，x是0或1；R是一個-NR1R2基團(tuán)，其中R1和R2各自是一個(C1-C6)烷基；一個被選擇性地取代的非芳香族的(C3-C15)碳環(huán)基，所述的取代物不是取代羰基；一個氨基(C1-C4)烷基基團(tuán)，其中氨基可以被一個(C1-C3)烷基選擇性地雙取代；一個環(huán)烷基(C1-C3)烷基，其中環(huán)烷基是C3-C12；一個非取代的或被一個鹵素、一個(C1-C5)烷基或一個(C1-C5)烷氧基單取代或多取代的苯基；一個苯基(C1-C3)烷基；一個雙苯基(C1-C3)烷基；一個萘基；一個蒽基；一個不被取代的或被一個(C1-C3)烷基、一個羥基或一個芐基取代的飽和的5到8個原子數(shù)的雜環(huán)基，一個1-金剛烷甲基；一個不被取代的或被一個鹵素、一個(C1-C5)烷基或一個(C1-C5)烷氧基單取代或多取代的芳香族雜環(huán)；被一個芳香族雜環(huán)取代的(C1-C3)烷基，其中的芳香族雜環(huán)不被取代或被一個鹵素、一個(C1-C5)烷基或一個(C1-C5)烷氧基單取代或多取代；或者，R1是氫，R2如上所定義；或者，R1和R2與它們結(jié)合的氮原子組成一個飽和的5到8個原子數(shù)的雜環(huán)基，當(dāng)w2、w3、w4、w5、w6、g2、g3、g4、g5和g6都是氫時，所述的雜環(huán)基不是嗎啉；當(dāng)X是-(CH2)XN(R3)-時，一個如上所定義的R2基；一個R5基，當(dāng)X是一個直接鍵時，R5是一個(C1-C3)烷基；一個不被取代或被一個(C1-C5)烷基取代的(C3-C12)環(huán)烷基；一個不被取代或被一個鹵素或一個(C1-C5)烷基所取代的苯基(C1-C3)烷基；一個環(huán)烷基(C1-C3)烷基，其中環(huán)烷基是C3-C12，其不被取代或被一個(C1-C5)烷基所取代；或者一個2-降莰基甲基。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的應(yīng)用，其特征在于所述拮抗劑是N-哌啶酮-3-吡唑甲酰胺或是其在藥物學(xué)上可接受的一種鹽。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的應(yīng)用，其特征在于所述拮抗劑是N-哌啶-5-(4-對溴苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-乙基吡唑-3-甲酰胺或是其在藥物學(xué)上可接受的一種鹽。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的應(yīng)用，其特征在于所述拮抗劑是N-哌啶-5-(4-對氯苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-甲基吡唑-3-甲酰胺或是其在藥物學(xué)上可接受的一種鹽。
12.根據(jù)上述任何一權(quán)利要求的應(yīng)用，其特征在于所述CB1受體選自由下述組成的組a)具有包括序列1或序列1一部分的氨基酸序列，具有G蛋白偶聯(lián)細(xì)胞受體的生物學(xué)功能，能夠結(jié)合THC并傳導(dǎo)細(xì)胞信號的蛋白；b)具有包括序列2或序列2一部分的氨基酸序列，具有G蛋白偶聯(lián)細(xì)胞受體的生物學(xué)功能，能夠結(jié)合THC并傳導(dǎo)細(xì)胞信號的蛋白；c)具有序列1或序列2的氨基酸序列，具有G蛋白偶聯(lián)細(xì)胞受體的生物學(xué)功能，能夠結(jié)合THC并傳導(dǎo)細(xì)胞信號的由等位基因編碼的蛋白；d)具有序列1的氨基酸序列，在200位有一個苯丙氨酸對亮氨酸的替代；和/或在216位一個異亮氨酸對纈氨酸的替代；和/或在246位纈氨酸對丙胺酸的替代的蛋白；e)具有序列2的氨基酸序列，在139位有一個苯丙氨酸對亮氨酸的替代；和/或在155位一個異亮氨酸對纈氨酸的替代；和/或在185位纈氨酸對丙胺酸的替代的蛋白；以及f)具有包括序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8和序列9的氨基酸序列或與它們80％同源的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有G蛋白偶聯(lián)細(xì)胞受體的生物學(xué)功能，能夠結(jié)合THC并傳導(dǎo)細(xì)胞信號的蛋白質(zhì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-11項所述的應(yīng)用，其特征在于所述CB1受體是一個與序列1在氨基酸水平上同源性至少為45％，具有G蛋白偶聯(lián)細(xì)胞受體的生物學(xué)功能，能夠結(jié)合THC并傳導(dǎo)細(xì)胞信號的蛋白質(zhì)。
14.根據(jù)前一項權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于同源性至少為60％，優(yōu)選70％，更為優(yōu)選的是80％，又更為優(yōu)選的是90％，更為優(yōu)選的是95％。
15.根據(jù)上述任何一權(quán)利要求的應(yīng)用，其特征在于CB1受體拮抗劑的每日劑量從0.01mg到500mg，優(yōu)選為1mg到100mg。
16.編碼包括序列1或序列2或序列1的一部分或序列2的一部分的蛋白的核苷酸在制備通過下調(diào)或抑制CB1受體來治療肝病的組合物中的應(yīng)用。
17.一種治療哺乳動物肝病的方法，包括將治療有效劑量的至少其中的一種CB1受體拮抗劑給藥于需要的哺乳動物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的治療肝病的方法，其特征在于CB1受體拮抗劑是具有結(jié)構(gòu)式II的化合物或其在藥物學(xué)上可接受的鹽之一，其中，g2、g3、g4、g5和g6以及w2、w3、w4、w5和w6是等同或不同的，并且分別是氫、一個氯原子或溴原子、一個(C1-C3)烷基、一個C1-C3)烷氧基、一個三氟甲基或一個硝基基團(tuán)，g4可以選擇性地為一個苯基基團(tuán)；R4是氫或一個(C1-C3)烷基；X可以是一個直接鍵或是一個-(CH2)x-N(R3)-基團(tuán)，其中R3是氫或一個(C1-C3)烷基，x是0或1；R是一個-NR1R2基團(tuán)，其中R1和R2各自是一個(C1-C6)烷基；一個被選擇性地取代的非芳香族的(C3-C15)碳環(huán)基，所述的取代基不是取代羰基；一個氨基(C1-C4)烷基基團(tuán)，其中氨基可以被一個(C1-C3)烷基選擇性地雙取代；一個環(huán)烷基(C1-C3)烷基其中環(huán)烷基是C3-C12；一個非取代的或被一個鹵素、一個(C1-C5)烷基或一個(C1-C5)烷氧基單取代或多取代的苯基；一個苯基(C1-C3)烷基；一個雙苯基(C1-C3)烷基；一個萘基；一個蒽基；一個不被取代的或被一個(C1-C3)烷基、一個羥基或一個芐基取代的飽和的5到8個原子數(shù)的雜環(huán)基，一個1-金剛烷甲基；一個不被取代的或被一個鹵素、一個(C1-C5)烷基或一個(C1-C5)烷氧基單取代或多取代的芳香族雜環(huán)；被一個芳香族雜環(huán)取代的(C1-C3)烷基，其中的芳香族雜環(huán)不被取代或被一個鹵素、一個(C1-C5)烷基或一個(C1-C5)烷氧基單取代或多取代；或者，R1是氫，R2如上所定義；或者，R1和R2與它們結(jié)合的氮原子組成一個飽和的5到8個原子數(shù)的雜環(huán)基，當(dāng)w2、w3、w4、w5、w6、g2、g3、g4、g5和g6都是氫時，所述的雜環(huán)基不是嗎啉；當(dāng)X是-(CH2)xN(R3)-時，一個如上所定義的R2基；一個R5基，當(dāng)X是一個直接鍵時，R5是一個(C1-C3)烷基；一個不被取代或被一個(C1-C5)烷基取代的(C3-C12)環(huán)烷基；一個不被取代或被一個鹵素或一個(C1-C5)烷基所取代的苯基；一個環(huán)烷基(C1-C3)烷基，其中環(huán)烷基是C3-C12，其不被取代或被一個(C1-C5)烷基所取代；或者一個2-降莰基甲基。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的治療肝病的方法，其特征在于所述CB1受體拮抗劑是N-哌啶酮-3-吡唑甲酰胺或是其在藥物學(xué)上可接受的一種鹽。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的治療肝病的方法，其特征在于所述CB1受體拮抗劑是N-哌啶-5-(4-對溴苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-乙基吡唑-3-甲酰胺或是其在藥物學(xué)上可接受的一種鹽。
21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的治療肝病的方法，其特征在于所述CB1受體拮抗劑是N-哌啶-5-(4-對氯苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-甲基吡唑-3-甲酰胺或是其在藥物學(xué)上可接受的一種鹽。
22.根據(jù)權(quán)利要求17-21所述的治療肝病的方法，其特征在于所述肝病是肝纖維化。
23.根據(jù)權(quán)利要求17-21所述的治療肝病的方法，其特征在于所述肝病是酒精性肝硬化。
24.根據(jù)權(quán)利要求17-21所述的治療肝病的方法，其特征在于所述肝病是慢性病毒性肝炎。
25.根據(jù)權(quán)利要求17-21所述的治療肝病的方法，其特征在于所述肝病是非酒精性的脂肪性肝炎。
26.根據(jù)權(quán)利要求17-21所述的治療肝病的方法，其特征在于所述肝病是原發(fā)性肝癌。
27.根據(jù)權(quán)利要求17-26所述的治療肝病的方法，其特征在于所述CB1受體拮抗劑的每日劑量從0.01mg到500mg，優(yōu)選為1mg到100mg。
全文摘要
一種CB1受體拮抗劑在制備治療肝臟疾病的組合物中的應(yīng)用，優(yōu)選是N－哌啶－5－(4－對氯苯基)－1－(2，4－二氯苯基)－4－甲基吡唑－3－甲酰胺的應(yīng)用。
文檔編號A61K31/454GK1929828SQ200580007516
公開日2007年3月14日 申請日期2005年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月9日
發(fā)明者索菲·洛特斯塔恩, 阿里亞納·馬拉特, 帕斯卡萊·格勒納爾, 鮑里斯·朱利安, 讓娜·德蘭·范·涅 申請人:因瑟姆公司, 薩諾飛阿文蒂斯公司